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特開2015-82971ACSL1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2015-82971(P2015-82971A)
(43)【公開日】2015年4月30日
(54)【発明の名称】ACSL1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/113 20100101AFI20150403BHJP
   A61K 31/7088 20060101ALI20150403BHJP
   A61P 43/00 20060101ALI20150403BHJP
   A61P 3/04 20060101ALI20150403BHJP
   A61P 3/10 20060101ALI20150403BHJP
【FI】
   C12N15/00 GZNA
   A61K31/7088
   A61P43/00
   A61P3/04
   A61P3/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】OL
【全頁数】31
(21)【出願番号】特願2012-26989(P2012-26989)
(22)【出願日】2012年2月10日
(71)【出願人】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(71)【出願人】
【識別番号】000001926
【氏名又は名称】塩野義製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100103230
【弁理士】
【氏名又は名称】高山 裕貢
(74)【代理人】
【識別番号】100113789
【弁理士】
【氏名又は名称】杉田 健一
(72)【発明者】
【氏名】小比賀 聡
(72)【発明者】
【氏名】堀 真一郎
(72)【発明者】
【氏名】藤原 孝博
(72)【発明者】
【氏名】粕谷 武史
【テーマコード(参考)】
4B024
4C086
【Fターム(参考)】
4B024AA01
4B024CA01
4B024CA11
4B024CA20
4B024HA17
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA70
4C086ZC35
4C086ZC41
(57)【要約】      (修正有)
【課題】ACSL1発現抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【解決手段】ヒトACSL1の95位〜109位、176位〜192位、467位〜484位、940位〜954位、1017位〜1032位、1102位〜1116位、1176位〜1197位、1222位〜1236位、1727位〜1743位、1858位〜1873位、1946位〜1960位、2294位〜2308位、2360位〜2377位、2449位〜2469位、2605位〜2624位、2689位〜2703位、2950位〜2964位、3424位〜3438位または3591位〜3605位の配列に相補的な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドが優れたACSL1発現抑制活性を有することを見出した。該ACSL1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む医薬組成物は、肥満症またはII型糖尿病の予防または治療に有用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ストリンジェントな条件で、配列番号1の95位〜109位、176位〜192位、467位〜484位、940位〜954位、1017位〜1032位、1102位〜1116位、1176位〜1197位、1222位〜1236位、1727位〜1743位、1858位〜1873位、1946位〜1960位、2294位〜2308位、2360位〜2377位、2449位〜2469位、2605位〜2624位、2689位〜2703位、2950位〜2964位、3424位〜3438位または3591位〜3605位からなる配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
ACSL1の発現を抑制する、請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
長さが13〜19塩基である、請求項1または2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列、または、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失もしくは置換された配列
を含む、請求項1〜3いずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列、または、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列
からなる、請求項4記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
請求項1〜5のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物。
【請求項7】
ACSL1が関連する疾患の予防または治療のために用いる、請求項6記載の医薬組成物。
【請求項8】
該疾患が、肥満症またはII型糖尿病である、請求項7記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ACSL1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。より詳細には、肥満症(肥満症における体重管理も含む)または糖尿病(特に、II型糖尿病)の予防または治療薬として有用なACSL1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【0002】
肥満は脂肪組織が全身的に増加した状態をいい、長期間にわたり摂取するエネルギー量が消費するエネルギー量よりも多いときに起きる。肥満は、内臓脂肪型肥満と皮下脂肪型肥満とに分類できる。内臓脂肪型肥満は、大網、腸間膜周囲に存在する腹腔内脂肪の蓄積量が増加する肥満で、糖尿病(特に、インスリン抵抗性を伴うII型糖尿病)、動脈硬化症、肝臓病、心臓病等を引き起こす元凶の一つとされ、現代社会において大きな問題となっている。
【0003】
糖尿病は、持続的高血糖状態を伴う疾患であり、多くの環境因子と遺伝的因子とが作用した結果に生じるとされている。体内における血糖の主要な調整因子はインスリンであり、高血糖は、インスリン欠乏、または、その作用を阻害する諸因子(例えば、遺伝的素因、運動不足、肥満、ストレス等)が過剰となって生じる。糖尿病には主として2つの種類があり、自己免疫疾患等による膵インスリン分泌機能の低下によって生じるI型糖尿病と、持続的な高インスリン分泌に伴う膵疲弊による膵インスリン分泌機能の低下が原因であるII型糖尿病とに分類される。日本人の糖尿病患者の95%以上はII型糖尿病と言われており、今日、生活様式の変化に伴う患者数の増加が問題となっている。
【0004】
アシル−CoA合成酵素ファミリーに属する酵素(以下、ACSと略記する)は、長鎖脂肪酸からアシルCoAへ変換する酵素である。アシルCoAは、細胞内脂質合成および脂肪酸分解または伸長反応における基質となることから、ACSは、細胞内の脂質代謝さらには脂質による細胞内シグナル伝達において中心的な役割を担う。またACSは、脂肪外脂肪酸の取込みにも関与する(非特許文献1参照)。
【0005】
ACSは、現在までに基質選択性や細胞内局在の異なる5つのアイソザイム(ACS1、3、4、5、6)が同定されている(非特許文献2参照)。このファミリーに属する酵素の一つであるACSL1(GenBank:NM_001995)は、主に肝臓や脂肪組織で発現しており、トリグリセリド(TG)の合成を触媒する。なお、ACSL4およびACSL5は主に肝臓で発現し、ACSL3やACSL6は主に脳で発現していることが知られている。
【0006】
ACSの阻害剤としてTriacsinCが知られており、この化合物は5つのアイソザイムのうち1、3、4を阻害することが報告されている(非特許文献3参照)。この化合物については、この他にヒト肝癌細胞株であるHuH7細胞においてTG蓄積を阻害すること(非特許文献4参照)やヒト正常皮膚繊維芽細胞であるCCD細胞でジアシルグリセロール、コレステロールエステル、リン脂質合成を阻害することが報告されている(非特許文献5参照)。
【0007】
ACSL1は、各種癌との関係が報告されており(例えば、特許文献1〜3参照)他に肝硬変や肝繊維性障害(特許文献4参照)、気管支喘息(特許文献5参照)のバイオマーカーになることも報告されている。
【0008】
また、特許文献6には、肝臓のACSL1の発現をsiRNAにより抑制することによって体重の増加の抑制および血糖値を降下させることが開示されており、ACSL1発現抑制剤は肥満症またはII型糖尿病の治療または予防に利用することができることが示唆されている。
【0009】
特許文献7には、ACSL1をターゲットとしたアンチセンス化合物について開示されている。明細書中には、3615のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されているが、標的領域との親和性に関する予測値が記載されているだけであり、ACSL1発現抑制に関するデータは記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】国際公開第07/010628号
【特許文献2】国際公開第07/117038号
【特許文献3】国際公開第03/3004989号
【特許文献4】特開2007−252366号
【特許文献5】特開2004−121218号
【特許文献6】国際公開第2010/079819号
【特許文献7】国際公開第04/016749号
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Biocheical.J、第323巻、1−12ページ、1997年
【非特許文献2】J.Nutr、第132巻、2123−2126ページ、2004年
【非特許文献3】Biochemistry、第44巻、1635−1642ページ、2005年
【非特許文献4】J.Lipid.Res第48巻、1280−1292ページ、2007年
【非特許文献5】Biochem.J、第324巻、529−534ページ、1997年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の目的は、優れたACSL1発現抑制活性を有する新規アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、鋭意研究の結果、優れたACSL1発現抑制活性(ノックダウン活性)を有する新規アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成に成功した。さらに、本発明者らは、ACSL1のmRNAの中で特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドのノックダウン活性に関連する標的領域を見出した。特許文献7には、3615のACSL1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されているが、標的領域との親和性に関する予測値が記載されているだけであり、ACSL1発現抑制に関するデータは記載されていない。高親和性を持つアンチセンスが、必ずしも高い標的遺伝子発現抑制作用を持つわけではないことは技術常識である(Antisense Drug Technology Principles, Strategies, and Applications, CRC Press; 2nd edition, 2007, page 120−122, Figure 5.3a)。よって、特許文献7の記載からは、ACSL1のmRNAのどの領域がアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的領域として有用であるかは予測できない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明者らが見出した特定の標的領域と結合し、優れたACSL1発現抑制活性を示す。
また、本発明者らは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、他のアイソザイム(ACSL3およびACSL5)に対して発現抑制作用を持たず、ACSL1特異的発現抑制作用を持つことを見出した。このように標的配列に対して特異性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬として有用である。
また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは代謝安定性および水溶性がよく、毒性が低く、医薬として使用するために十分安全である。
【0014】
すなわち、本発明は、以下に関する。
(1)ストリンジェントな条件で、配列番号1の95位〜109位、176位〜192位、467位〜484位、940位〜954位、1017位〜1032位、1102位〜1116位、1176位〜1197位、1222位〜1236位、1727位〜1743位、1858位〜1873位、1946位〜1960位、2294位〜2308位、2360位〜2377位、2449位〜2469位、2605位〜2624位、2689位〜2703位、2950位〜2964位、3424位〜3438位または3591位〜3605位からなる配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(2)ACSL1の発現を抑制する、(1)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(3)長さが13〜19塩基である、(1)または(2)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(4)配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列、または、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失もしくは置換された配列
を含む、(1)〜(3)いずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(5)配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列、または、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列
からなる、(4)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(6)(1)〜(5)のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物。
(7)ACSL1が関連する疾患の予防または治療のために用いる、(6)記載の医薬組成物。
(8)該疾患が、肥満症またはII型糖尿病である、(7)記載の医薬組成物。
(9)(1)〜(5)のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するACSL1が関連する疾患の予防または治療方法。
(10)該疾患が、肥満症またはII型糖尿病である、(9)記載の予防または治療方法。
(11)ACSL1が関連する疾患の予防または治療剤を製造するための、(1)〜(5)のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
(12)該疾患が、肥満症またはII型糖尿病である、(11)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
(13)ACSL1が関連する疾患の予防または治療するための、(1)〜(5)のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(14)該疾患が、肥満症またはII型糖尿病である、(13)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【0015】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは優れたACSL1発現抑制活性を示し、医薬品、特にACSL1の関与する疾患、例えば、肥満症(肥満症における体重管理も含む)、肥満関連疾患、糖尿病(特に、II型糖尿病)、シンドロームX、心臓血管障害または癌(乳癌、結腸癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌等)の予防または治療のための医薬として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0016】
図1】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのHepG2細胞における5nMおよび20nMでのノックダウン効率
図2】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのACSL1タンパク質に対するノックダウン効果
図3】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのACSL3およびACSL5に対する交差性の評価結果
【発明を実施するための形態】
【0017】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2003)に記載された方法等が挙げられる。
以下に本発明について詳細に説明する。
【0018】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(AON)とは、標的遺伝子のmRNA、mRNA前駆体またはncRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするmRNA、mRNA前駆体またはncRNAと二本鎖を形成することによりmRNA、mRNA前駆体またはncRNAの働きを抑制する。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」には、標的となるmRNA、mRNA前駆体またはncRNAと完全に相補的であるもののみならず、mRNA、mRNA前駆体またはncRNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、1もしくは数個のミスマッチが存在するものも含まれる。
ncRNA(ノンコーディングRNA)とは、タンパク質へ翻訳されずに機能するRNAの総称である。例えば、リボソームRNA、転移RNA、miRNA等が挙げられる。
1もしくは数個のミスマッチとは、1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1または2個のミスマッチを意味している。
【0019】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的遺伝子としては、ACSL1が挙げられる。例えば、ヒトACSL1、マウスACSL1等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0020】
「ACSL1」は公知のタンパク質である。ヒトACSL1(GenBank:NM_001995)のDNA配列を配列表の配列番号1に、アミノ酸配列を配列番号2に記載する。マウスACSL1(GenBank:NM_007981)のDNA配列を配列表の配列番号3に、アミノ酸配列を配列番号4に記載する。本発明における「ACSL1」は、これらの配列に限定されるものではなく、配列番号2または4のタンパク質の機能が保持される限り、アミノ酸やDNAの変異数や変異部位に制限はないものとする。
【0021】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、6〜50塩基、例えば、6〜30塩基、6〜19塩基、8〜19塩基、10〜19塩基、13〜19塩基、13塩基、14塩基、15塩基、16塩基、17塩基、18塩基、19塩基である。
【0022】
本発明の「アンチセンスオリゴヌクレオチド」としては、
(a)ストリンジェントな条件で、配列番号1の配列の95位〜109位、176位〜192位、467位〜484位、940位〜954位、1017位〜1032位、1102位〜1116位、1176位〜1197位、1222位〜1236位、1727位〜1743位、1858位〜1873位、1946位〜1960位、2294位〜2308位、2360位〜2377位、2449位〜2469位、2605位〜2624位、2689位〜2703位、2950位〜2964位、3424位〜3438位もしくは3591位〜3605位の配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または
(b)ストリンジェントな条件で、配列番号3の配列の183位〜197位、219位〜235位、442位〜456位、513位〜530位、593位〜607位、641位〜655位、919位〜933位、941位〜955位、959位〜973位、978位〜993位、998位〜1013位、1222位〜1243位、1268位〜1282位、1625位〜1639位、1993位〜2007位、2066位〜2081位、2409位〜2423位、2497位〜2525位、2651位〜2670位、2685位〜2700位、2738位〜2756位、2764位〜2788位、3331位〜3347位、3503位〜3517位もしくは3663位〜3684位の配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド
が挙げられる。(a)の標的領域は、それぞれ、ヒトACSL1のmRNAの中で特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドのノックダウン活性に関連する領域である。(b)の標的領域は、それぞれ、マウスACSL1のmRNAの中で特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドのノックダウン活性に関連する領域である。ストリンジェントな条件で、該標的領域にハイブリダイズ可能な配列であれば、長さやヌクレオチドの修飾の有無に関わらず、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる。
【0023】
ACSL1発現抑制活性(ノックダウン活性)は、公知の方法により測定することが可能である。例えば、後述する実施例5(1)または(3)記載の方法により測定することができる。
【0024】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、より好ましくは、
(c)ストリンジェントな条件で、配列番号1の配列の176位〜192位、467位〜484位、1176位〜1197位、2449位〜2469位もしくは2605位〜2624位の配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または
(d)ストリンジェントな条件で、配列番号3の配列の219位〜235位、513位〜530位、1222位〜1243位、2497位〜2525位、2651位〜2670位、2685位〜2700位、2738位〜2756位、2764位〜2788位もしくは3663位〜3684位の配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド
が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、具体的には、
(a)配列番号1の配列の95位〜109位、176位〜192位、467位〜484位、940位〜954位、1017位〜1032位、1102位〜1116位、1176位〜1197位、1222位〜1236位、1727位〜1743位、1858位〜1873位、1946位〜1960位、2294位〜2308位、2360位〜2377位、2449位〜2469位、2605位〜2624位、2689位〜2703位、2950位〜2964位、3424位〜3438位もしくは3591位〜3605位の配列、または
(b)配列番号3の配列の183位〜197位、219位〜235位、442位〜456位、513位〜530位、593位〜607位、641位〜655位、919位〜933位、941位〜955位、959位〜973位、978位〜993位、998位〜1013位、1222位〜1243位、1268位〜1282位、1625位〜1639位、1993位〜2007位、2066位〜2081位、2409位〜2423位、2497位〜2525位、2651位〜2670位、2685位〜2700位、2738位〜2756位、2764位〜2788位、3331位〜3347位、3503位〜3517位もしくは3663位〜3684位の配列
と少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、もっとも好ましくは95%以上の相同性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。ここで、相同性は、例えば、Altschulら(The Journal of Molecular Biology,215,403−410(1990).)の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムBLASTを用いることにより、スコアで類似度が示される。
「ストリンジェントな条件」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのみが、
(a)配列番号1の配列の95位〜109位、176位〜192位、467位〜484位、940位〜954位、1017位〜1032位、1102位〜1116位、1176位〜1197位、1222位〜1236位、1727位〜1743位、1858位〜1873位、1946位〜1960位、2294位〜2308位、2360位〜2377位、2449位〜2469位、2605位〜2624位、2689位〜2703位、2950位〜2964位、3424位〜3438位もしくは3591位〜3605位の配列、または
(b)配列番号3の配列の183位〜197位、219位〜235位、442位〜456位、513位〜530位、593位〜607位、641位〜655位、919位〜933位、941位〜955位、959位〜973位、978位〜993位、998位〜1013位、1222位〜1243位、1268位〜1282位、1625位〜1639位、1993位〜2007位、2066位〜2081位、2409位〜2423位、2497位〜2525位、2651位〜2670位、2685位〜2700位、2738位〜2756位、2764位〜2788位、3331位〜3347位、3503位〜3517位もしくは3663位〜3684位の配列
とハイブリット(いわゆる特異的ハイブリット)を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は該特定配列とハイブリット(いわゆる非特異的ハイブリット)を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、6×SSC(0.9M NaCl,0.09M クエン酸三ナトリウム)または6×SSPE(3M NaCl,0,2M NaHPO,20mM EDTA・2Na,pH7.4)中42℃でハイブリダイズさせ、さらに42℃で0.5×SSCにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の1例として挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーション方法としては、当該分野において周知慣用な手法、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることができる。具体的には、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Current Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley−Interscience)、DNA Cloning 1:Core Techniques、A Practical Approach,Second Edition(1995)(Oxford University Press)等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【0025】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列、または、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失もしくは置換された配列
を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらはそれぞれ、ヒトACSL1発現抑制活性を有する。該配列を含む限り、長さやヌクレオチドの修飾の有無に関わらず、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる。
さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、
配列番号6〜13、30、72〜75、77〜80、82〜93、95、100〜104、109、110、113、114、116〜127、129、131〜141、143〜147、151、153〜155もしくは156の配列、または
配列番号6〜13、30、72〜75、77〜80、82〜93、95、100〜104、109、110、113、114、116〜127、129、131〜141、143〜147、151、153〜155もしくは156の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失もしくは置換された配列
を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらはそれぞれ、マウスACSL1発現抑制活性を有する。該配列を含む限り、長さやヌクレオチドの修飾の有無に関わらず、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる。
【0026】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、具体的には、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列、または、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列
からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに好ましくは、
配列番号6〜11もしくは24〜28、または、
配列番号6〜11もしくは24〜28の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列
からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらはそれぞれ、ヒトACSL1発現抑制活性を有する。該配列からなる限り、ヌクレオチドの修飾の有無に関わらず、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる。
さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、具体的には、
配列番号6〜13、30、72〜75、77〜80、82〜93、95、100〜104、109、110、113、114、116〜127、129、131〜141、143〜147、151、153〜155もしくは156の配列、または、
配列番号6〜11、13〜18、20〜22、24〜30、32、35〜37、46、48、49、52〜54、57〜59、64〜68もしくは70の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列
からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらはそれぞれ、マウスACSL1発現抑制活性を有する。該配列からなる限り、ヌクレオチドの修飾の有無に関わらず、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる。
【0027】
なお、「1もしくは数個の塩基」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1または2個の塩基を意味している。欠失、置換または付加によっても、標的遺伝子(例えば、ACSL1)の発現抑制作用を有する限り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに包含される。
【0028】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ACSL1発現抑制活性のみならず、医薬としての有用性を備えており、下記いずれか、あるいは全ての優れた特徴を有している。
a)CYP酵素(例えば、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等)に対する阻害作用が弱い。
b)高いバイオアベイラビリティー、適度なクリアランス等良好な薬物動態を示す。
c)代謝安定性が高い。
d)変異原性を有さない。
e)心血管系のリスクが低い。
f)高い溶解性を示す。
g)ACSL1特異性を示す。
【0029】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチドは修飾されていてもよい。適切な修飾を施したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、無修飾のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較し、下記いずれか、あるいは全ての特徴を有している。
a) 標的遺伝子との親和性が高い。
b) ヌクレアーゼに対する抵抗性が高い。
c) 薬物動態が改善する。
d) 組織移行性が高くなる。
よって、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、無修飾のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、生体内で分解されにくくなり、より安定して標的遺伝子の発現を阻害できる。
【0030】
当該分野で公知のヌクレオチドの修飾であれば、いずれも本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに利用可能である。例えば、S−オリゴ(ホスホロチオエート)、C−5チアゾール、D−オリゴ(ホスホジエステル)、M−オリゴ(メチルフォスフォネイト)、ペプチド核酸(PNA)、リン酸ジエステル結合、C−5プロピニルピリミジン、2−O−プロピルリボース、2´−メトキシエトキシリボース(2´MOE)、LNA(Locked nucleic acid)、アミドBNA(Bridged nucleic acid)等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【0031】
当該分野で公知のヌクレオチドの修飾および修飾方法については、例えば、以下の特許文献にも開示されている。
国際公開第98/39352号、国際公開第99/014226号、国際公開2000/056748、国際公開第2005/021570号、国際公開第2003/068795号、国際公開第2011/052436号、国際公開第2004/016749号、国際公開第2005/083124号、国際公開2007/143315号、国際公開第2009/071680号等。
【0032】
以下に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに利用可能な修飾を具体的に例示するが、該修飾はこれらにより限定されるものではない。
(1)S−オリゴ(ホスホロチオエート)
ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のリン酸基部の酸素原子を硫黄原子で置換する。該修飾は公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに取り込まれる。該修飾をオリゴヌクレオチド中に1もしくは複数もつアンチセンスオリゴヌクレオチドをS−オリゴ型(ホスホロチオエート型)という。
(2)LNA(Locked nucleic acid)
ヌクレオチドの糖環の4´炭素原子から適切な架橋を介して2´−ヒドロキシル基が結合して二環式糖部分が形成される。好ましい結合は、2´酸素原子と4´炭素原子とを架橋するメチレン(−CH−)基である。LNAの具体例およびその調製方法は、国際公開第98/39352号、国際公開第2003/068795号、国際公開第2005/021570号等に記載されている。
(3)アミドBNA(Bridged nucleic acid)
ヌクレオチドの糖環の2´のアミノ基と4´から伸長したカルボニル基との間にアミド結合が形成されることにより、二環式糖部分が形成される。アミドBNAの具体例およびその調製方法は、国際公開第2011/052436号に記載されている。
(4)ヌクレオチドの糖の2´位置の修飾
ヌクレオチドの糖の2´位置のOHを−O−アルキル(例えば、−O−メチル、−O−エチル、−O−メトキシエチル等)、または−Fで置換する。該修飾は公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに取り込まれる。
【0033】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド(またはその修飾体)は常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置(例えば、AppliedBiosystems社製、(株)大日本精機製等)によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、Tetrahedron Letters 22, 1859−1862 (1981)、国際公開第2011/052436号等に開示されている。
【0034】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む動物に投与する際、生物学的に活性な代謝産物またはその残渣物を(直接的に、あるいは、間接的に)提供し得る、任意の製薬上許容される塩、エステル、もしくはかかるエステルの塩、または任意の他の同等物を包含する。つまり、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグおよび製薬上許容される塩、該プロドラッグの製薬上許容される塩、ならびに他の生物学的同等物を包含する。
【0035】
「プロドラッグ」とは、内在性酵素または他の化学物質の作用および/または状態によってその生体内または細胞内で活性形態(即ち、薬物)に変換される、不活性形態またはより低い活性形態の誘導体である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグは、国際公開第93/24510号、国際公開第94/26764号等に記載される方法に従って調製することができる。
【0036】
「製薬上許容される塩」とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生理学的におよび製薬上許容される塩、即ち、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。
【0037】
製薬上許容される塩としては、例えば、アルカリ金属(例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等)、アルカリ土類金属(例えば、カルシウム、バリウム等)、マグネシウム、遷移金属(例えば、亜鉛、鉄等)、アンモニア、有機塩基(例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メグルミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、ピリジン、ピコリン、キノリン等)およびアミノ酸との塩、または無機酸(例えば、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、臭化水素酸、リン酸、ヨウ化水素酸等)、および有機酸(例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、マンデル酸、グルタル酸、リンゴ酸、安息香酸、フタル酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等)との塩が挙げられる。特に塩酸、硫酸、リン酸、酒石酸、メタンスルホン酸との塩等が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。
【0038】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物も包含する。本発明の医薬組成物の投与方法および製剤は、当該分野で公知の投与方法および製剤であれば、いずれも利用可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与方法および製剤は、例えば、以下の文献にも開示されている。
国際公開第2004/016749号、国際公開第2005/083124号、国際公開2007/143315号、国際公開第2009/071680号等。
【0039】
本発明の医薬組成物は、局所的あるいは全身的な治療のいずれが望まれるのか、または治療すべき領域に応じて、様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的(点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む)、経口的、または、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射もしくは点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入、吸引もしくは吸入による肺投与、硬膜下腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。
【0040】
本発明の医薬組成物を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液または溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
非経口、硬膜下腔、または、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤およびその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
【0041】
本発明の医薬組成物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
【0042】
賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウムまたは結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンまたはポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末またはラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウムまたはマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴールまたはメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤または乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良い。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。
【0043】
投与は、治療される病態の重度と反応度に依存し、治療コースは、数日から数ヶ月、あるいは、治癒が実現されるまで、または、病状の減退が達成されるまで持続する。最適投与スケジュールは、生体における薬剤蓄積の測定から計算が可能である。当該分野の当業者であれば、最適用量、投与法、および、繰り返し頻度を定めることができる。最適用量は、個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変動するが、一般に、インビトロおよびインビボの動物実験におけるIC50またはEC50に基づいて計算することが可能である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子量(アンチセンスオリゴヌクレオチド配列および化学構造から導かれる)と、例えば、IC50のような効果的用量(実験的に導かれる)が与えられたならば、mg/kgで表される用量が通例に従って計算される。
【0044】
本発明の医薬組成物は、ACSL1発現抑制活性を有するため、ACSL1が関連する疾患の予防または治療のために用いることができる。
ACSL1が関連する疾患としては、肥満症(肥満症における体重管理も含む)、肥満関連疾患、糖尿病(特に、II型糖尿病)、シンドロームX、心臓血管障害または癌(乳癌、結腸癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌等)が挙げられる。
「肥満関連疾患」とは、肥満に伴うか、肥満により引き起こされるか、肥満の結果起きる疾患である。肥満関連疾患の例としては、過食症、高血圧、耐糖能異常、糖尿病、代謝症候群、脂質代謝異常、動脈硬化症、高尿酸血症、痛風、脂肪肝、蛋白尿、肥満腎症、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、変形性関節症、腰痛症、腰椎症、閉塞性睡眠時無呼吸症候群、冠動脈疾患(心筋梗塞、狭心症等の冠動脈性心疾患)、脳梗塞、脳血栓症、一過的脳虚血発作、月経異常、プラダーウィリー症候群、フレーリッヒ症候群、ピックウィック症候群等が挙げられる。本発明の医薬組成物は左心室肥大のリスクの低減等、肥満の2次的な結果のリスクの低減にも有用である。
本発明の医薬組成物は、特に、肥満症またはII型糖尿病の予防または治療のために用いることができる。
【0045】
本発明の医薬組成物を肥満症の予防または治療のために用いる場合、他の1もしくは複数の公知の抗肥満薬(抗肥満作用を有する化合物を含有する医薬組成物、肥満症や肥満症における体重管理等に用いることのできる薬剤)と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の医薬組成物の投与療法は、既知の食事療法、薬物療法、運動等と組み合わせて用いることもできる。
【0046】
例えば、以下の方法も本発明の範囲内である。
本発明の医薬組成物と併用して、公知の抗肥満薬を投与することを特徴とする、肥満もしくは肥満関連疾患の予防もしくは治療または肥満における体重管理の方法。
本発明の医薬組成物の投与による予防または治療を受けている患者に、公知の抗肥満薬を投与することを特徴とする、肥満もしくは肥満関連疾患の予防もしくは治療または肥満における体重管理の方法。
【0047】
公知の抗肥満薬としては、食欲抑制作用を有する化合物(選択的セロトニン再取り込み阻害剤等)、栄養素の消化吸収抑制作用を有する化合物(α‐グルコシダーゼ阻害剤;SGLT−2阻害剤等)、脂肪吸収抑制作用を有する化合物(リパーゼ阻害剤;胆汁酸吸着レジン等)、5HTトランスポーター阻害剤、NEトランスポーター阻害剤、CB−1アンタゴニスト/インバースアゴニスト、グレリンアンタゴニスト、H3アンタゴニスト/インバースアゴニスト、MCH R1アンタゴニスト、MCH R2アゴニスト/アンタゴニスト、NPY Y1受容体 アンタゴニスト、NPY Y2受容体アゴニスト、NPY Y4受容体アゴニスト、NPY Y5受容体アンタゴニスト、mGluR5アンタゴニスト、レプチン、レプチンアゴニスト、レプチン誘導体、オピオイドアンタゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、BRS3アゴニスト、CCK−Aアゴニスト、CNTF、CNTFアゴニスト、CNTF誘導体、GHSアゴニスト、5HT2Cアゴニスト、Mc4rアゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤、GLP−1アゴニスト、UCP−1、2および3活性剤、β3アゴニスト、甲状腺ホルモンβアゴニスト、PDE阻害剤、FAS阻害剤、DGAT1阻害剤、DGAT2阻害剤、ACC2阻害剤、グルココルチコイドアンタゴニスト、アシル−エストロゲン、脂肪酸トランスポーター阻害剤、ジカルボン酸トランスポーター阻害剤等を含有する医薬組成物が挙げられる。
【0048】
本発明の医薬組成物をII型糖尿病の予防または治療のために用いる場合、他の1もしくは複数の公知のII型糖尿病治療薬と組み合わせて用いることもできる。
【0049】
公知のII型糖尿病治療薬としては、インスリン分泌促進薬(例えば、スルホニル尿素(SU)薬)、速効型インスリン分泌促進薬(例えば、フェニルアラニン誘導体薬)、ブドウ糖吸収阻害薬(例えば、αグルコシダーゼ阻害薬(αGI薬))、インスリン抵抗性改善薬(例えば、ビグアナイド系薬剤(BG薬)、チアゾリジン系誘導体(TZD薬))、インスリン製剤、ペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)阻害薬、GLP−1受容体アゴニスト、1型ナトリウム依存性グルコース輸送体(SGLT1)阻害薬、2型ナトリウム依存性グルコース輸送体(SGLT2)阻害薬等を含有する医薬組成物が挙げられる。
【0050】
本発明の医薬組成物と他の薬剤とを組み合わせて用いる場合、投与時期は限定されず、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。さらに、本発明の医薬組成物と該他の薬剤とは、それぞれの活性成分を含む複数の製剤として投与されてもよいし、両方の活性成分を含む単一の製剤として投与されてもよい。
【実施例】
【0051】
以下に本発明の実施例および参考例、ならびに試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【0052】
実施例1:オリゴヌクレオチド合成
本発明に関連するオリゴヌクレオチドは、Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981)、国際公開第2011/052436号等に記載される方法によって合成した。
LNA、アミドBNAを含有する10mer〜20merのオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機(nS−8型、(株)大日本精機製)を用いて、0.2μmolスケールで合成した。鎖長の伸長は標準的なホスホロアミダイトプロトコール(固相担体:CPGレジン、硫化はDDT(3H−1,2−Benzodithiole−3−one, 1,1−dioxide)等を使用)にて実施し、末端の5´位の水酸基がDMTr(ジメトキシトリチル)基で保護され、かつ3´位が固相に担持されたオリゴヌクレオチドを得た。続いて、酸処理により、DMTr基を除去した後、塩基処理することにより、目的物を固相担体から切り出した。希酸にて中和後、溶媒を留去し、得られた粗生成物をゲルろ過カラムクロマト、逆相HPLCにて精製することにより目的物を得た。
また、本発明のNegative Control(NC)として、ACSL1と5塩基以上のミスマッチを持つ配列として、表1のように設計した。表1の配列中、大文字はLNAを表す。小文字はDNAを表す。ヌクレオシド間の結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。
【0053】
【表1】
【0054】
実施例2:ヒトアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)を、ヒトACSL1(GenBank:NM_001995、配列番号1)を標的とするよう設計した。オリゴヌクレオチド配列を表2〜5に示す。
表2〜5の配列中、大文字はLNAを表す。小文字はDNAを表す。ヌクレオシド間の結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。
【0055】
【表2】
【0056】
【表3】
【0057】
【表4】
【0058】
【表5】
【0059】
実施例3:マウスアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)を、マウスAcsl1(GenBank:NM_007981、配列番号:3)を標的とするよう設計した。オリゴヌクレオチド配列を表6〜10に示す。
表6〜10の配列中、大文字はLNAを表す。小文字はDNAを表す。ヌクレオシド間の結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。
【0060】
【表6】
【0061】
【表7】
【0062】
【表8】
【0063】
【表9】
【0064】
【表10】
【0065】
実施例4:インビトロモデル 細胞培養
細胞を、以下に記載される適当な培地で培養し、37℃、95〜98%湿度および5%
COで維持した。
HepG2:ヒト肝ガン由来細胞株HepG2は、DMEM High glucose(Sigma)+10%ウシ胎児血清(FBS)+Antibiotic Antimycotic Solution(10mL/L)で培養した。
Hepa1c1c7:マウス肝ガン由来細胞株Hepa1c1c7は、α−MEM(Gibco)+10% FBS+Antibiotic Antimycotic Solution(10mL/L)で培養した。
【0066】
実施例5:ACSL1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの評価
(1)mRNA発現量変化による評価
本実施例では、ヒトまたはマウスのACSL1の塩基配列をもとに設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を実証した。
実施例2および3記載の通り、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、製造し、ヒトHepG2細胞およびマウスHepa1c1c7細胞でノックダウン実験を行った。
作製したLNA型GapmerアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびNegative Control(NC、配列番号5)を用いて、ヒトHepG2細胞およびマウスHepa1c1c7細胞でのノックダウン実験を行った。ヒトHepG2細胞において、LNA型GapmerアンチセンスオリゴヌクレオチドはLipofectamine LTX試薬(invitrogen)を用いて細胞導入し、細胞培養液にアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度5nMまたは20nMとなるように添加した。マウスHepa1c1c7細胞においては、Lipofectamine RNAiMAX試薬(invitrogen)を用いて細胞導入し、細胞培養液にアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度が20nMとなるように添加した。導入24時間後にFastlane(QIAGEN)にて細胞を回収し定量的PCRを行った。内在性コントロールとしてGAPDHを使用した。
ヒトACSL1の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:GCAGCGGCATCATCAGAAAC(配列番号157);
Rvプライマー:TGTCACCATCAGCCGGACTC(配列番号158)
を用い、
ヒトGAPDHの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:GCACCGTCAAGGCTGAGAAC(配列番号159);
Rvプライマー:TGGTGAAGACGCCAGTGGA(配列番号160)
を用いた。
マウスAcsl1の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:AGGTGCTTCAGCCCACCATC(配列番号161);
Rvプライマー:AAAGTCCAACAGCCATCGCTTC(配列番号162)
を用い、
マウスGapdhの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:TGTGTCCGTCGTGGATCTGA(配列番号163);
Rvプライマー:TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG(配列番号164)
を用いた。
【0067】
結果を表11、12および図1に示す。表11には、GAPDHで正規化したマウスHepa1c1c7細胞におけるACSL1のmRNA減少量を、未処理細胞に対する割合をノックダウン効率として示した。表11中のNCはNegative Control、N.D.は、ACSL1のmRNA減少量が検出限界以下である、あるいはmRNA量を増加させており、ACSL1を抑制していないことを意味する。表12には、GAPDHで正規化したヒトHepG2細胞におけるACSL1のmRNA減少量を、未処理細胞に対する割合をノックダウン効率として示した。表12中のNCはNegative Controlを意味する。図1には、ヒトHepG2細胞における5nMおよび20nMでのノックダウン効率を示した。
この結果、本発明アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、HepG2細胞および/またはHepa1c1c7細胞に対して、優れたノックダウン活性を示した。
【0068】
HepG2細胞とHepa1c1c7細胞の両細胞において、共に未処理細胞に対して75%以上のノックダウン効率を示した配列をヒトとマウスの異種間で交差性を有する配列とすると、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)番号1、4、5、6、15、17、18、42、43、50、51、55、56、57、58、62、63、64、65、74、75、76、77、114、115、116、117は種間交差性を有することを見出した。なおアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)番号42と50、43と51、55と62、56と63、57と64、58と65、74と114、75と115、76と116、77と117はそれぞれヒトとマウスのACSL1遺伝子の同部分に対する配列として設計している。ヒトとマウスにおいて同一の配列であっても、共にノックダウン活性を示すとは限らないことから、共にノックダウン活性を示した上記配列は、創薬上非常に有用である。
【0069】
【表11】
【0070】
【表12】
【0071】
(2)他のACSLファミリーとの交差性評価
本実施例では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのノックダウン効果において、ACSL1以外のACSLファミリーであるACSL3およびACSL5との交差性を評価した。
(1)記載の方法により回収したサンプルに対して定量的PCRを行った。内在性コントロールとしてGAPDHを使用した。
ヒトACSL3の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:ATACGGGCTCACTGAATCTGCTG(配列番号165);
Rvプライマー:AGCAAACTAATGGTGCTCCCACTC(配列番号166)
を用い、
ヒトACSL5の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:GGAACTCTGAAGATCATCGACCGTA(配列番号167);
Rvプライマー:CTGTGTCAGGAACCACCACTCCTA(配列番号168)
を用いた。
マウスAcsl3の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:GCAACAACGCAGCGATTCA(配列番号169);
Rvプライマー:AGCAAACTAATGGTGCTCCCACTC(配列番号170)
を用い、
マウスAcsl5の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:CATTCGGCGGGACAGTTTG(配列番号171);
Rvプライマー:ATCCCATTGCAGCCCTGAAG(配列番号172)
を用いた。
【0072】
結果を表13および14に示す。表13には、GAPDHで正規化したマウスHepa1c1c7細胞におけるACSL3またはACSL5のmRNA減少量を、未処理細胞に対する割合をノックダウン効率として示した。表14には、GAPDHで正規化したヒトHepG2細胞におけるACSL3またはACSL5のmRNA減少量を、未処理細胞に対する割合をノックダウン効率として示した。表13または14中のN.D.は、ACSL3またはACSL5のmRNA減少量が検出限界以下である、あるいはmRNA量を増加させており、ACSL3またはACSL5を抑制していないことを意味する。
この結果、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ACSL1を抑制するが、ACSL3およびACSL5を抑制しないことが確認された。
【0073】
【表13】
【0074】
【表14】
【0075】
(3)タンパク質発現量変化による評価
本実施例では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびnegative control(配列番号5)に対して、HepG2細胞におけるACSL1タンパク質の発現量変化によるノックダウン活性評価を行った。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびNegative Control(配列番号5)に対して、HepG2細胞におけるACSLファミリー特異性の評価を行った。
(1)記載の方法により細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションし、48時間後にRIPA buffer(Sigma)にて細胞を回収し、ウェスタンブロッティング法にてタンパク質の検出を行った。コントロールとしてβ−actinの検出を行った。
ACSL1の1次抗体はrabbit anti ACSL1 antibody(Cell Signaling)、2次抗体はECLTM Peroxidase−labeled anti−rabbit antibody (GE)を用いた。
ACSL3の1次抗体はrabbit anti ACSL3 antibody (Proteintech)、2次抗体はECLTM Peroxidase−labeled anti−rabbit antibodyを用いた。
ACSL5の1次抗体はrabbit anti ACSL5 antibody (Proteintech)、2次抗体はECLTM Peroxidase−labeled anti−rabbit antibodyを用いた。
β−actinの1次抗体はmouse anti β−actin antibody(Sigma)、2次抗体はECLTM Peroxidase−labeled anti−mouse antibody (GE)を用いた。
【0076】
結果を図2図3に示す。図2には、ACSL1に対するノックダウン効果を示した。この結果、AON番号1、4、5、6、43、55、56、57は最終濃度5nMで、タンパク質レベルでもノックダウン効果を示すことを見出した。図3には、ACSL3、ACSL5に対する交差性の評価結果を示した。この結果、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質レベルでも、ACSL1を抑制するが、ACSL3およびACSL5は抑制しないことを見出した。
【産業上の利用可能性】
【0077】
以上の実施例から明らかなように、本発明アンチセンスオリゴヌクレオチドはACSL1発現抑制活性を示す。従って、本発明化合物は肥満症(肥満症における体重管理も含む)、肥満関連疾患、糖尿病(特に、II型糖尿病)、シンドロームX、心臓血管障害または癌(乳癌、結腸癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌等)の等の予防または治療のための医薬として非常に有用である。
図1
図2
図3
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]