特開2018-157776(P2018-157776A)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2015.5.11 β版

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  • 特開2018157776-代謝疾患の遺伝的リスク検出法 図000128
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2018-157776(P2018-157776A)
(43)【公開日】2018年10月11日
(54)【発明の名称】代謝疾患の遺伝的リスク検出法
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/09 20060101AFI20180914BHJP
   C12Q 1/68 20180101ALI20180914BHJP
【FI】
   C12N15/00 A
   C12Q1/68 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】OL
【全頁数】156
(21)【出願番号】特願2017-56544(P2017-56544)
(22)【出願日】2017年3月22日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】(出願人による申告)平成25年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業「エクソン全領域関連解析による心筋梗塞発症に関連する機能的遺伝子多型の同定」委託研究、産業技術力強化法第19条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】304026696
【氏名又は名称】国立大学法人三重大学
【住所又は居所】三重県津市栗真町屋町1577
(71)【出願人】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
【住所又は居所】茨城県つくば市天王台一丁目1番1
(71)【出願人】
【識別番号】304021277
【氏名又は名称】国立大学法人 名古屋工業大学
【住所又は居所】愛知県名古屋市昭和区御器所町字木市29番
(71)【出願人】
【識別番号】509111744
【氏名又は名称】地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター
【住所又は居所】東京都板橋区栄町35番2号
(74)【代理人】
【識別番号】100108280
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 洋平
(72)【発明者】
【氏名】山田 芳司
【住所又は居所】三重県津市栗真町屋町1577番地 国立大学法人三重大学内
(72)【発明者】
【氏名】佐久間 淳
【住所又は居所】茨城県つくば市天王台一丁目1番1 国立大学法人筑波大学内
(72)【発明者】
【氏名】竹内 一郎
【住所又は居所】愛知県名古屋市昭和区御器所町字木市29番 国立大学法人名古屋工業大学内
(72)【発明者】
【氏名】田中 雅嗣
【住所又は居所】東京都板橋区栄町35番2号 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター内
【テーマコード(参考)】
4B063
【Fターム(参考)】
4B063QA07
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ58
4B063QR55
4B063QS34
(57)【要約】      (修正有)
【課題】代謝疾患(例えば、肥満・メタボリック症候群、2型糖尿病、脂質代謝異常(高中性脂肪血症、低HDLコレステロール血症、高LDLコレステロール血症など)の遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法を提供すること。
【解決手段】BMIとの関連性を検討することにより代謝疾患に関連すると思われる少なくとも1個の遺伝子多型(SNP)を決定し、日本人における代謝疾患の遺伝的リスク検出法を提供する。
【選択図】図1
【特許請求の範囲】
【請求項1】
(1)rs633715、rs543874、FTOのrs1421085、FTOのrs1558902、FTOのrs8050136、FTOのrs9939609、TRIM36のrs3749745、PDIA5のrs2292661、OR10P1のrs7970885、CROTのrs7808249、CROTのrs2068204、DAW1のrs10191097、TRIM40のrs757259、TSC1のrs1076160、RIN3のrs8018360、HYOU1のrs144079825、ECE2のrs145491613、SLC4A5のrs10177833、TAP2のrs2071544、MYPNのrs7916821、PSMD9のrs14259、ANKK1のrs1800497、ZNF700のrs75607624、PLEKHG1のrs17348890、DEPDC7のrs34161108、ARHGEF28のrs536568、IGSF22のrs7125943、PKD1L1のrs147417448、TICRRのrs79501973、GBF1のrs143872476、ZNF804Bのrs1406503、GON4Lのrs183379906、rs962040、rs365488、CATSPERDのrs73544757、rs1507493、MCEEのrs6748672、MAP1Aのrs3803335、NXPE2のrs11215158、TRAT1のrs79029897、CCDC13のrs75893579、OR10W1のrs56302613、rs3135365、ACAD10のrs192237004、CSRNP3のrs1007732、TEFMのrs2433、B4GALNT2のrs7224888、BCAS3のrs2643103、PPARGC1Bのrs143268818、rs56150213、ZNF597のrs140727539、GPR179のrs201149338、TENM2のrs9313396、PDP2のrs141108875、SLC15A1のrs12853441、rs7350481、rs9500989、
(2)OR4F6のrs141569282、SLC35F3のrs140011243、RUFY1のrs138313632、KARSのrs201151665、IFITM5のrs146230729、CADM1のrs561567580、PPP1R9Bのrs113281588、MUC17のrs78010183、CCDC166のrs75368383、SCAMP4のrs150715312、PLECのrs201654895、LGR5のrs117324318、CCDC114のrs140189114、NLRC3のrs116433328、CECR2のrs201989565、DUS2のrs202069030、SIGLEC1のrs201950990、ALKBH1のrs200168197、TNFRSF4のrs150516264、LOC100505549のrs139012426、ADAD2のrs149894736、YBEYのrs200145138、PRKCDBPのrs11544766、MYLIPのrs201021082、MGAT3のrs201417286、B3GNT6のrs559157215、KNDC1のrs146093427、TNXBのrs141190850、PCDHAC1のrs185216314、CSPG4のrs137981794、DNAJB2のrs148615702、FGD3のrs116496123、AK8のrs150636539、LAMB3のrs202068754、GDPD3のrs200801803、CATのrs139421991、OAS3のrs62623451、NOTCH1のrs201053795、PDCL2のrs189305583、SYNMのrs200549249、SNTB1のrs145615160、PTCHD3のrs77473776、C21orf59のrs76974938、TNCのrs138406927、KRR1のrs17115182、ZNF43のrs149604219、PRCPのrs2229437、CYP4F12のrs609636、rs1917321、LGALS14のrs72480733、ANKRD26のrs12572862、CATのrs139421991、ZKSCAN3のrs13201752、rs10451497、OR8H3のrs61751933、PDCL2のrs189305583、HIVEP1のrs200286173、RSL24D1のrs200023487、TMC5のrs150481868、DNHD1のrs2344828、PHLDB1のrs145947849、LSM14Bのrs200803813、ARHGAP27のrs2959953、ZC3H3のrs150994390、NXPE2のrs149918157、AOAHのrs2228410、CDCA2のrs116429520、FMO4のrs190463354、BARD1のrs2070094、ESPNLのrs184614603、LRP2のrs143822500、C14orf180のrs150513093、NRDE2のrs117406130、CD86のrs2681417、FBXL7のrs257747、HRGのrs10770、PYCR2のrs201142342、TTC3のrs1053966、CA3のrs20571、C12orf50のrs4454801、URB1のrs200312105、RPS6KA5のrs8018102、CTR9のrs75206030、のrs1419138、PRRC2Cのrs760644、DUS3Lのrs200981144、MOGのrs29234、OR6T1のrs150534954、PSORS1C1のrs3130977、rs12614237、GATA2のrs78245253、PEX1のrs144825021、DIS3のrs144957541、AMOTL2のrs1353776、CPNE9のrs139476663、ATXN2のrs191400641、MINAのrs2172257、rs11177192、LOC101929951のrs7081678、EML2のrs12151009、LOC101928766のrs1078485、SHBGのrs13894、rs4702982、rs11645831、BRPF3のrs3748045、rs11977526、LY9のrs509749、RUFY1のrs138313632、rs2155378、UBXN11のrs138559558、TJP2のrs144396411、rs947211、TTNのrs55675869、OPLAHのrs7004867、C21orf59のrs76974938、rs967417、HMGXB3のrs2241698、rs1992660、rs892666、EIF6のrs78127944、ADAM33のrs41453444、TULP2のrs34378208、SERPINA6のrs2228541、BTNL2のrs9268507、IRGMのrs72553867、GRIP2のrs61731939、rs6536541、MEIG1のrs7919322、SPATS2のrs191343457、PRMT3のrs10741838、NBEAL1のrs2351524、SLC25A32のrs141856398、TRIB3のrs35051116、ZNF683のrs10794531、LINC01492のrs10820412、SPIDRのrs2306928、LINC01006のrs849084、KIF7のrs12906938、rs668853、OR8D4のrs61907183、LOC100505549のrs139012426、rs7807771、rs12068912、TRABD2Bのrs147317864、ADAMTS17のrs4246302、
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9のrs1536690、rs17316633、CPNE9のrs139476663、rs8059612、LOC101929380のrs2032794、FSIP2のrs992822、TMPOのrs17028450、rs1980889、ZC3HC1のrs1464890、rs2324027、rs7667636、PHIPのrs10943613、MYO7Aのrs948962、CEP126のrs76022391、rs7913069、ARHGEF19のrs200330080、MYO7Bのrs111765932、GSNのrs141510612、AP3S1のrs74844425、rs12229654、PLEKHA4のrs145141779、KCNN2のrs13188074、PIK3R4のrs56369596、FSTL1のrs874478、ELFN2のrs202021460、rs179075、DLGAP3のrs6699355、rs2125904、ARHGAP27のrs2959953、TTC22のrs12144325、FREM2のrs2496425、rs10097386、OR4X2のrs7120775、UBXN11のrs138559558、rs7532317、AKT3のrs4132509、ACSM3のrs5716、rs7771335、COL18A1のrs79980197、KMT2Dのrs201078160、HRGのrs10770、C21orf59のrs76974938、UBR7のrs76828246、MOGのrs2071653、C12orf42のrs10778257、PITRM1のrs6901、PTPN13のrs200400344、WBSCR17のrs7793970、PEAK1のrs56133554、ATXN7L1のrs150412190、SEC31Aのrs3797036、rs60312980、DCAF4L2のrs146243553、TNCのrs1757106、ZDHHC5のrs117135042、TUBD1のrs1292053、PIGBのrs151252589、OGDHLのrs11101224、rs2853969、TTC3のrs2835655、MICAL3のrs202169174、AIM1Lのrs151324745、LEMD2のrs2395402、CPEB1のrs783540、CCT5のrs147989324、WBSCR27のrs11543598、PTPRJのrs7124275、PVRL3のrs6801425、PSEN2のrs200636353、KCNJ15のrs3746875、SLC7A9のrs1007160、OR9K2のrs7305779、FANCAのrs17232910、C14orf105のrs1152522、OSCP1のrs61308377、WDR19のrs144335584、SLC2A9のrs3775948、PRSS37のrs12669721、TULP3のrs3944066、SP1のrs144134358、SEC14L5のrs199905767、IFIT2のrs41284134、SHANK1のrs201453898、PPP1R18のrs2269704、SERAC1のrs115387731、NRMのrs2269703、DDR1のrs1264318、TMCO4のrs10917536、IL22RA1のrs148768286、rs7442317、FBXO42のrs12069239、LY6G6Dのrs9469042、rs618662、rs8133766、SUOXのrs117778870、PADI1のrs140750531、NCKAP5のrs4953863、EFCAB5のrs74546291、TNIP3のrs10000692、ADALのrs2278857、DNAH11のrs72655988、ALDH1L1のrs2276724、LY75-CD302のrs1549579、rs495089、CUBNのrs1801232、TSACCのrs151057154、FAM180Aのrs59178195、OR9G1のrs79060400、CPT1Bのrs5770917、GLT6D1のrs138281407、AARSのrs2070203、WWP2のrs4275849、SNRNP200のrs3171927、OR1J2のrs112619503、rs3108919、rs1412115、MDC1のrs2269702、TTYH2のrs35999669、rs4711319、ERAP2のrs2549782、WFS1のrs1805070、PIK3R5のrs714407、FNDC1のrs192084699、FAM221Aのrs35928055、ANKIB1のrs2374563、TTNのrs55675869、IBSPのrs1054629、rs6566532、ADNP2のrs141645766、rs2523638、FAM208Bのrs2254067、HPS4のrs146303784、TTBK2のrs34348991、rs12511469、INADLのrs146406799、TTC7Bのrs61742122、TTC5のrs3742945、CCM2のrs2289367、OR4C46のrs77689730、rs1233399、QRICH2のrs73996306のうちの少なくとも1個の遺伝子多型(SNP)を決定することを特徴とする日本人集団における代謝疾患の遺伝的リスク検出法。
【請求項2】
前記代謝疾患が、肥満・メタボリック症候群であり、前記(1)に記載のSNPのうちの少なくとも1個を決定することを特徴とする請求項1に記載の日本人集団における代謝疾患の遺伝的リスク検出法。
【請求項3】
前記代謝疾患が、2型糖尿病であり、前記(2)に記載のSNPのうちの少なくとも1個を決定することを特徴とする請求項1に記載の日本人集団における代謝疾患の遺伝的リスク検出法。
【請求項4】
前記代謝疾患が、脂質代謝異常であり、前記(3)に記載のSNPのうちの少なくとも1個を決定することを特徴とする請求項1に記載の日本人集団における代謝疾患の遺伝的リスク検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、代謝疾患の遺伝的リスク検出法に関する。
【背景技術】
【0002】
人間が生きていくためには、エネルギーや体の構成成分を絶え間なく製造・分解・廃棄していく必要がある。代謝とは、糖分・脂質・タンパク質などの栄養素を体外から取り入れたり、体内で製造・分解・廃棄する工程を総合したものを意味する。代謝工程の一部に変調を来した場合には、各種の代謝疾患を患う可能性がある。そのような代謝疾患として、肥満症、メタボリック症候群、2型糖尿病、脂質代謝異常症などが知られている。
このうち、肥満症・メタボリック症候群については、罹患者が非常に多い疾患であり、米国では約4人に1人程度の成人が罹患していると言われている。この症候群は、肥満、血中中性脂肪値の上昇、血中HDLコレステロール値の減少、高血圧、及び空腹時血糖値の上昇の重複等として定義されており、糖尿病や心臓病の危険因子とされるメタボリック症候群の病因は、遺伝因子と環境因子の相互作用によって決定されるため複雑である。このうち、遺伝的な因子が存在することが明らかとなってきており、本発明者もその成果の一部を開示している(特許文献1:先行技術文献については、明細書の末尾にまとめて示した。)。しかしながら、肥満・メタボリック症候群の遺伝要因については、未だ十分に解明されていない。
【0003】
また、糖尿病患者は非常な勢いで増加しており、全世界では2億人以上の患者がいると言われている。糖尿病患者の90%以上は、2型糖尿病であり、この疾患の特徴は、インスリン分泌不全は比較的軽度でインスリン抵抗性が主体である、インスリン抵抗性は比較的軽度でインスリン分泌不全が主体であるものまで様々である。デスクワーク中心のライフスタイルや栄養過多の食事も糖尿病発症の誘引になっているが、2型糖尿病の家族歴があると発症率が2.4倍高いことから、遺伝的要因も関与していることが分かってきた(特許文献2)。2型糖尿病は、多数の遺伝子が関与する多因子疾患である。そのため、遺伝子の組合せによって、ある集団の耐糖能のレベルが変化し、2型糖尿病の罹患率に影響を与えるとされている。しかしながら、2型糖尿病の遺伝的要因については、未だ十分に解明されていない。
また、脂質代謝異常は、遺伝的要因および環境的要因の相互作用によって起こる多因子性疾患である。環境的要因としては、高脂肪および高カロリーの食事、運動不足などがある。遺伝子連鎖解析によって、脂質代謝異常との連鎖が示唆されるいくつかの染色体領域および候補遺伝子が特定されている(特許文献3)。しかしながら、脂質代謝異常の遺伝要因については、未だ十分に解明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、代謝疾患の遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記目的を達成するための発明に係る日本人における代謝疾患の遺伝的リスク検出法は、(1)rs633715、rs543874、FTOのrs1421085、FTOのrs1558902、FTOのrs8050136、FTOのrs9939609、TRIM36のrs3749745、PDIA5のrs2292661、OR10P1のrs7970885、CROTのrs7808249、CROTのrs2068204、DAW1のrs10191097、TRIM40のrs757259、TSC1のrs1076160、RIN3のrs8018360、HYOU1のrs144079825、ECE2のrs145491613、SLC4A5のrs10177833、TAP2のrs2071544、MYPNのrs7916821、PSMD9のrs14259、ANKK1のrs1800497、ZNF700のrs75607624、PLEKHG1のrs17348890、DEPDC7のrs34161108、ARHGEF28のrs536568、IGSF22のrs7125943、PKD1L1のrs147417448、TICRRのrs79501973、GBF1のrs143872476、ZNF804Bのrs1406503、GON4Lのrs183379906、rs962040、rs365488、CATSPERDのrs73544757、rs1507493、MCEEのrs6748672、MAP1Aのrs3803335、NXPE2のrs11215158、TRAT1のrs79029897、CCDC13のrs75893579、OR10W1のrs56302613、rs3135365、ACAD10のrs192237004、CSRNP3のrs1007732、TEFMのrs2433、B4GALNT2のrs7224888、BCAS3のrs2643103、PPARGC1Bのrs143268818、rs56150213、ZNF597のrs140727539、GPR179のrs201149338、TENM2のrs9313396、PDP2のrs141108875、SLC15A1のrs12853441、rs7350481、rs9500989、
【0006】
(2)OR4F6のrs141569282、SLC35F3のrs140011243、RUFY1のrs138313632、KARSのrs201151665、IFITM5のrs146230729、CADM1のrs561567580、PPP1R9Bのrs113281588、MUC17のrs78010183、CCDC166のrs75368383、SCAMP4のrs150715312、PLECのrs201654895、LGR5のrs117324318、CCDC114のrs140189114、NLRC3のrs116433328、CECR2のrs201989565、DUS2のrs202069030、SIGLEC1のrs201950990、ALKBH1のrs200168197、TNFRSF4のrs150516264、LOC100505549のrs139012426、ADAD2のrs149894736、YBEYのrs200145138、PRKCDBPのrs11544766、MYLIPのrs201021082、MGAT3のrs201417286、B3GNT6のrs559157215、KNDC1のrs146093427、TNXBのrs141190850、PCDHAC1のrs185216314、CSPG4のrs137981794、DNAJB2のrs148615702、FGD3のrs116496123、AK8のrs150636539、LAMB3のrs202068754、GDPD3のrs200801803、CATのrs139421991、OAS3のrs62623451、NOTCH1のrs201053795、PDCL2のrs189305583、SYNMのrs200549249、SNTB1のrs145615160、PTCHD3のrs77473776、C21orf59のrs76974938、TNCのrs138406927、KRR1のrs17115182、ZNF43のrs149604219、PRCPのrs2229437、CYP4F12のrs609636、rs1917321、LGALS14のrs72480733、ANKRD26のrs12572862、CATのrs139421991、ZKSCAN3のrs13201752、rs10451497、OR8H3のrs61751933、PDCL2のrs189305583、HIVEP1のrs200286173、RSL24D1のrs200023487、TMC5のrs150481868、DNHD1のrs2344828、PHLDB1のrs145947849、LSM14Bのrs200803813、ARHGAP27のrs2959953、ZC3H3のrs150994390、NXPE2のrs149918157、AOAHのrs2228410、CDCA2のrs116429520、FMO4のrs190463354、BARD1のrs2070094、ESPNLのrs184614603、LRP2のrs143822500、C14orf180のrs150513093、NRDE2のrs117406130、CD86のrs2681417、FBXL7のrs257747、HRGのrs10770、PYCR2のrs201142342、TTC3のrs1053966、CA3のrs20571、C12orf50のrs4454801、URB1のrs200312105、RPS6KA5のrs8018102、CTR9のrs75206030、のrs1419138、PRRC2Cのrs760644、DUS3Lのrs200981144、MOGのrs29234、OR6T1のrs150534954、PSORS1C1のrs3130977、rs12614237、GATA2のrs78245253、PEX1のrs144825021、DIS3のrs144957541、AMOTL2のrs1353776、CPNE9のrs139476663、ATXN2のrs191400641、MINAのrs2172257、rs11177192、LOC101929951のrs7081678、EML2のrs12151009、LOC101928766のrs1078485、SHBGのrs13894、rs4702982、rs11645831、BRPF3のrs3748045、rs11977526、LY9のrs509749、RUFY1のrs138313632、rs2155378、UBXN11のrs138559558、TJP2のrs144396411、rs947211、TTNのrs55675869、OPLAHのrs7004867、C21orf59のrs76974938、rs967417、HMGXB3のrs2241698、rs1992660、rs892666、EIF6のrs78127944、ADAM33のrs41453444、TULP2のrs34378208、SERPINA6のrs2228541、BTNL2のrs9268507、IRGMのrs72553867、GRIP2のrs61731939、rs6536541、MEIG1のrs7919322、SPATS2のrs191343457、PRMT3のrs10741838、NBEAL1のrs2351524、SLC25A32のrs141856398、TRIB3のrs35051116、ZNF683のrs10794531、LINC01492のrs10820412、SPIDRのrs2306928、LINC01006のrs849084、KIF7のrs12906938、rs668853、OR8D4のrs61907183、LOC100505549のrs139012426、rs7807771、rs12068912、TRABD2Bのrs147317864、ADAMTS17のrs4246302、
【0007】
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9のrs1536690、rs17316633、CPNE9のrs139476663、rs8059612、LOC101929380のrs2032794、FSIP2のrs992822、TMPOのrs17028450、rs1980889、ZC3HC1のrs1464890、rs2324027、rs7667636、PHIPのrs10943613、MYO7Aのrs948962、CEP126のrs76022391、rs7913069、ARHGEF19のrs200330080、MYO7Bのrs111765932、GSNのrs141510612、AP3S1のrs74844425、rs12229654、PLEKHA4のrs145141779、KCNN2のrs13188074、PIK3R4のrs56369596、FSTL1のrs874478、ELFN2のrs202021460、rs179075、DLGAP3のrs6699355、rs2125904、ARHGAP27のrs2959953、TTC22のrs12144325、FREM2のrs2496425、rs10097386、OR4X2のrs7120775、UBXN11のrs138559558、rs7532317、AKT3のrs4132509、ACSM3のrs5716、rs7771335、COL18A1のrs79980197、KMT2Dのrs201078160、HRGのrs10770、C21orf59のrs76974938、UBR7のrs76828246、MOGのrs2071653、C12orf42のrs10778257、PITRM1のrs6901、PTPN13のrs200400344、WBSCR17のrs7793970、PEAK1のrs56133554、ATXN7L1のrs150412190、SEC31Aのrs3797036、rs60312980、DCAF4L2のrs146243553、TNCのrs1757106、ZDHHC5のrs117135042、TUBD1のrs1292053、PIGBのrs151252589、OGDHLのrs11101224、rs2853969、TTC3のrs2835655、MICAL3のrs202169174、AIM1Lのrs151324745、LEMD2のrs2395402、CPEB1のrs783540、CCT5のrs147989324、WBSCR27のrs11543598、PTPRJのrs7124275、PVRL3のrs6801425、PSEN2のrs200636353、KCNJ15のrs3746875、SLC7A9のrs1007160、OR9K2のrs7305779、FANCAのrs17232910、C14orf105のrs1152522、OSCP1のrs61308377、WDR19のrs144335584、SLC2A9のrs3775948、PRSS37のrs12669721、TULP3のrs3944066、SP1のrs144134358、SEC14L5のrs199905767、IFIT2のrs41284134、SHANK1のrs201453898、PPP1R18のrs2269704、SERAC1のrs115387731、NRMのrs2269703、DDR1のrs1264318、TMCO4のrs10917536、IL22RA1のrs148768286、rs7442317、FBXO42のrs12069239、LY6G6Dのrs9469042、rs618662、rs8133766、SUOXのrs117778870、PADI1のrs140750531、NCKAP5のrs4953863、EFCAB5のrs74546291、TNIP3のrs10000692、ADALのrs2278857、DNAH11のrs72655988、ALDH1L1のrs2276724、LY75-CD302のrs1549579、rs495089、CUBNのrs1801232、TSACCのrs151057154、FAM180Aのrs59178195、OR9G1のrs79060400、CPT1Bのrs5770917、GLT6D1のrs138281407、AARSのrs2070203、WWP2のrs4275849、SNRNP200のrs3171927、OR1J2のrs112619503、rs3108919、rs1412115、MDC1のrs2269702、TTYH2のrs35999669、rs4711319、ERAP2のrs2549782、WFS1のrs1805070、PIK3R5のrs714407、FNDC1のrs192084699、FAM221Aのrs35928055、ANKIB1のrs2374563、TTNのrs55675869、IBSPのrs1054629、rs6566532、ADNP2のrs141645766、rs2523638、FAM208Bのrs2254067、HPS4のrs146303784、TTBK2のrs34348991、rs12511469、INADLのrs146406799、TTC7Bのrs61742122、TTC5のrs3742945、CCM2のrs2289367、OR4C46のrs77689730、rs1233399、QRICH2のrs73996306のうちの少なくとも1個の遺伝子多型(SNP)を決定することを特徴とする。
【0008】
上記(1)に記載のSNPは、肥満・メタボリック症候群に関するEWASで特定されたものであり、日本人集団において、代謝疾患との関連が明らかとなった。このため、上記(1)に記載のものの少なくとも1個のSNPを決定することにより、肥満・メタボリック症候群に関する遺伝的リスク検出法となる。
また、上記(2)に記載のSNPは、2型糖尿病に関するEWASで特定されたものであり、日本人集団において、代謝疾患との関連が明らかとなった。このため、上記(2)に記載のものの少なくとも1個のSNPを決定することにより、2型糖尿病に関する遺伝的リスク検出法となる。
また、上記(3)に記載のSNPは、脂質代謝異常に関するEWASで特定されたものであり、日本人集団において、代謝疾患との関連が明らかとなった。このため、上記(3)に記載のものの少なくとも1個のSNPを決定することにより、脂質代謝異常に関する遺伝的リスク検出法となる。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、代謝疾患の遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法を提供できる。この発明を用いることにより、代謝疾患に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命の延長、生活の質の向上、寝たきりの防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
図1】BMI(A)、肥満(B)、メタボリック症候群(C)のEWASにおけるP値のマンハッタンプロットである。P値(y軸)を-log10(P)とし、対応するSNP(x軸)の物理的な染色体位置に対してプロットした。関連が確認されたSNPまたは遺伝子を図中に示した。
図2】BMI(A)、肥満(B)、メタボリック症候群(C)のEWASにおけるP値のQ-Qプロットである。測定されたP値(y軸)と、帰無仮説の下で予測されたP値(x軸)とを比較し、値は-log10(P)としてプロットした。
図3】空腹時血糖値(A)もしくは糖化ヘモグロビン値(B)に関するEWASでの遺伝子型のP値、及び2型糖尿病(C)に関するEWASでのアレル頻度のP値のQ-Qプロットである。測定されたP値(y軸)と、帰無仮説の下で予測されたP値(x軸)とを比較し、値は-log10(P)としてプロットした。
図4】空腹時血糖値(A)、糖化ヘモグロビン値(B)及び2型糖尿病(C)のEWASにおけるP値を示すマンハッタンプロットである。P値(y軸)を-log10(P)とし、対応するSNP(x軸)の物理的な染色体位置に対してプロットした。空腹時血糖値と糖化ヘモグロビン値または2型糖尿病のいずれかに関連する遺伝子を(A)に、糖化ヘモグロビンと空腹時血糖値または2型糖尿病のいずれかに関連するものを(B)に、2型糖尿病に関連するものを(C)に示した。
図5】脂質代謝異常に関するEWASにおいて、集団層別化に関する主成分分析によって評価されたサンプルの分布を示すグラフである。サンプルは、EIGENSTRAT法を用いた主成分分析により評価し、第1成分(水平軸)及び第2成分(垂直軸)に従ってプロットした。
図6】血中中性脂肪値(A)、HDLコレステロール値(B)及びLDLコレステロール値(C)のEWASにおける遺伝子分布のP値のQ-Qプロットである。測定されたP値(y軸)と、帰無仮説の下で予測されたP値(x軸)とを比較し、値は-log10(P)としてプロットした。
図7】血中中性脂肪値(A)、HDLコレステロール値(B)及びLDLコレステロール値(C)のEWASにおけるアレル頻度のP値のQ-Qプロットである。測定されたP値(y軸)と、帰無仮説の下で予測されたP値(x軸)とを比較し、値は-log10(P)としてプロットした。
図8】血中中性脂肪値(A)、HDLコレステロール値(B)及びLDLコレステロール値(C)のEWASにおけるP値を示すマンハッタンプロットである。P値(y軸)を-log10(P)とし、対応するSNP(x軸)の物理的な染色体位置に対してプロットした。血中中性脂肪値、HDLコレステロール値及びLDLコレステロール値に関連するSNPまたは遺伝子を(A)、(B)、(C)の順に示した。
図9】高中性脂肪血症(A)、低HDLコレステロール血症(B)及び高LDLコレステロール血症(C)のEWASにおけるP値を示すマンハッタンプロットである。P値(y軸)を-log10(P)とし、対応するSNP(x軸)の物理的な染色体位置に対してプロットした。高中性脂肪血症、低HDLコレステロール血症及び高LDLコレステロール血症に関連するSNPまたは遺伝子を(A)、(B)、(C)の順に示した。
【発明を実施するための形態】
【0011】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく、様々な形態で実施できる。
<A.肥満・メタボリック症候群>
<試験方法>
1.被験者集団
BMIに関しては12890人の被験者集団について、肥満に関しては12968人の被験者集団について、メタボリック症候群に関しては6817人の被験者集団について調べた。この集団は、(i)岐阜県立多治見病院、岐阜県総合医療センター、名古屋第一赤十字病院、いなべ総合病院及び弘前脳卒中・リハビリテーションセンターの5ヶ所の病院に2002年〜2014年の間に種々の症状を訴えて来院し、本試験の参加に同意したか、健康診断に訪れ、本試験の参加に同意した者、(ii)2010年〜2014年の間にいなべ市において、2011年〜2015年の間に東京若しくは草津において、集団ベース・コホート研究に参加した者、または(iii)1995年〜2012年の間に、東京都老人病院において部検を実施された者であった。
最近、日本人および他のアジア人の肥満のBMI基準を変更する必要性が認識されたことから、肥満の定義として、25kg/m2以上のBMIとした。この定義より、3954人の肥満者と9014人の対照者について、評価を行った。一次性遺伝子障害、代謝性疾患または内分泌性疾患に関する肥満者、二次的肥満を引き起こす可能性のある薬物療法を受けている者については、研究から除外した。対象者の多くは、BMIに関する研究の対象者と重複していた。
【0012】
メタボリック症候群の診断は、国際糖尿病連合の疫学と予防に関するタスクフォース、国立心肺および血液研究所、アメリカ心臓協会、世界心臓連盟、国際アテローム性動脈硬化症学会、肥満研究のための国際協会によって提案された定義の修正版に基づいた。腰回り長さの閾値として、男性は90cm以上、女性は80cm以上とした。3998人のメタボリック症候群者は、次の5項目のうち3項目以上の数値を満たしていた。すなわち、(i)腰回り長さが、男性90cm以上、女性80cm以上、(ii)血中中性脂肪濃度が1.65nmol/L以上(150mg/dL以上)または中性脂肪低下薬を服用している、(iii)血中HDLコレステロール濃度が1.04mmol/L未満(40mg/dL未満)、(iv)収縮期血圧が130mmHg以上、拡張期血圧が85mmHg以上または高血圧薬を服用している、(v)空腹時血糖が5.50mmol/L(100mg/Dl)以上または血糖値低下薬を服用している。肥満、異常脂質血症、高血圧または糖尿病の病歴を詳細なアンケートで評価した。対照者は、メタボリック症候群の上記5項目のいずれも含まない2819人を含んでいた。剖検例は、肥満およびメタボリック症候群の両方の対照から除外した。
研究計画は、ヘルシンキ宣言を遵守し、三重大学医学研究科、弘前大学大学院医学研究科、東京都老人医学研究所および参加病院の人間倫理委員会の承認を得た。死亡した被験者のすべての被験者または家族から、インフォームド・コンセントを得た。
【0013】
2.BMI、肥満及びメタボリック症候群のEWAS
(1)DNAサンプルとSNP解析用アレイ
50mmol/Lのエチレンジアミン四酢酸(2ナトリウム塩)を含有するチューブに静脈血(5mlまたは7mL)を採取し、末梢血白血球を単離した後、ゲノムDNAをDNA抽出キット(ゲノミックス(タレント社、イタリア)、SMITEST EX-R&D(医学生物学研究社))または標準的なフェノール・クロロホルム抽出法とスピンカラムを用いて、精製した。部検者の場合には、腎臓からゲノムDNAを抽出した。EWASは、ヒト・エクソーム12 v1.2 若しくはv1.2 DNA解析ビーズチップ、またはインフィニウム・エクソーム24 v1.0ビーズチップ(イルミナ社、アメリカ)を用いて行った。これらのエクソーム・アレイは、個々のエクソームと全ゲノム配列から選択された12000を超える推定上の機能的エクソン変異体を含んでいる。エキソンの内容には、欧州人種、アフリカ人種、中国人及びヒスパニック人種を含む広範囲な集団を代表する約244000個のSNPが含まれる。一種類のみのエクソーム・アレイに含まれるSNP(全SNPの3.6%程度)は、解析から除いた。
【0014】
(2)クオリティ・コントロール
解析のクオリティ・コントロールとして、次の方法を用いた:(i)97%未満のコール率を示した遺伝子型のデータは廃棄した。残りのデータの平均コール率は99.9%であった。(ii)各サンプルについて、性別の特性を確認し、臨床記録の性表現と遺伝子型が矛盾するものデータは廃棄した。(iii)重複したサンプル及び潜在的な関連性については、IBD(identity by descent)による計算で確認した。IBD数が0.1875よりも大きいDNAサンプルの全対について検査を行い、各対から一つのサンプルを除いた。(iv)全サンプルについて、SNPのヘテロ接合性の頻度を計算し、ヘテロ接合性が非常に低いものまたは非常に高いもの(平均から3よりも大きな標準偏差を示すもの)については廃棄した。(v)性染色体またはミトコンドリアDNAのSNP、非多核性SNP及びマイナーアレル頻度(MAF)が0.1%未満のSNPについては、解析から除いた。(vi)対照群と比較して、遺伝子型分布がハーディ・ワインバーグ平衡から有意に(P<0.001)外れたSNPは除外した。(vii)各EWASの遺伝子型データを主成分分析を用いて階層化し、異常値を示す集団は解析から除いた。
(3)統計解析に用いたSNP
上記解析によってクオリティ・コントロールをクリアした41327個のSNPについてBMI及び肥満の統計解析に、41675個のSNについてメタボリック症候群の統計解析に、それぞれ使用した。
【0015】
3.統計解析
被験者の特徴を分析するため、肥満者・メタボリック症候群者と対照者との間で定量的なデータについて、スチューデントt検定によって比較した。カテゴリーデータは、フィッシャーの正確確率検定(Fisher's exact test)を用いて、2群間で比較した。対立遺伝子頻度は、遺伝子計数法により推定し、フィッシャーの正確確率検定により、ハーディー・ワインバーグ平衡からのずれを同定した。BMIと、各SNPの遺伝子型との関係を線形回帰モデルを用いて解析した。アレル頻度は、遺伝子係数法によって推定し、フィッシャーの正確確率検定によって、ハーディ・ワインバーグ平衡からのずれを調べた。EWASによって肥満またはメタボリック症候群に関連したSNPのアレル頻度の関係をフィッシャーの正確確率検定によって調べた。BMI・肥満・メタボリック症候群について、複数の遺伝子型の比較を行うために、ボンフェローニ補正を加えて、関連性の統計的有意性を調べた。41327個または41675個のSNPを分析し、各EWASについて有意水準をP<1.21×10-6(0.05/41327)またはP<1.20×10-6(0.05/41657)とした。BMIのEWASにおける遺伝子型のP値に関するQ-Qプロット(quantile-quantileプロット)、肥満・メタボリック症候群のEWASにおける遺伝子頻度のP値に関するQ-Qプロットを図2に示した。インフレーション・ファクター(λ)は、BMIでは1.03、肥満では1.22、メタボリック症候群では1.13であった。
【0016】
年齢、性別(女性が0、男性が1)及び各SNPの遺伝子型を独立変数とし、肥満またはメタボリック症候群の有無を従属変数とする多重ロジスティック回帰分析を行った。各SNPの遺伝子型は、Aをメジャーアレル、Bをマイナーアレルとし、優性モデル(0、AA;1、AB + BB)、劣性モデル(0、AA + AB; 1、BB)、相加的遺伝子モデル、P値、オッズ比および95%信頼区間について計算した。相加的モデルには、相加1モデル(0、AA; 1、AB; 0、BB)と相加2モデル(0、AA; 0、AB; 1 BB)とを含み、両者は単一の統計モデルで同時に分析した。特定されたSNPの遺伝子型と、BMIまたはメタボリック症候群の5個の判断項目との関連を一元配置分散分析(ANOVA)によって調べた。上記の通り、別の解析については、ボンフェローニ補正を行った。統計解析には、JMPゲノミックス・バージョン6.0ソフトウエア(SAS Institute, Cary, NC, USA)を用いた。
【0017】
<試験結果>
1.BMIについてのEWAS
41327個のSNPの遺伝子型とBMIとの関係を線形回帰モデルを用いて調べた。EWASのマンハッタンプロットを図1(A)に示した。ボンフェローニ補正を加えた結果、BMIについて6個のSNPが、有意にBMIに(P<1.21×10-6)関連した(表1)。
【0018】
【表1】
【0019】
2.肥満に関するEWAS
肥満に関するEWASを行ったときの被験者の特徴を表2に示した。肥満者群と対照者群との間で、男性の割合、喫煙割合、糖尿病の罹患率、異常脂質血症の割合、高尿酸血症の割合、BMI、腰回り長、収縮期血圧、拡張期血圧、空腹時血糖、糖化ヘモグロビン(hemoglobin A1c)量、血中中性脂肪濃度、血中LDLコレステロール濃度及び尿酸値は肥満者群が高く、年齢及び血中HDL濃度は肥満者群が低かった。
41327個のSNPについて、肥満に関連するアレル頻度をフィッシャーの正確確率検定によって調べた。EWASのマンハッタンプロットを図1(B)に示した。ボンフェローニ補正を加えた結果、11個のSNPが肥満に有意に(P<1.21×10-6)関連した(表3)。これらのSNPの遺伝子型分布は、肥満者群及び対照群のいずれにおいても、有意に(P>0.001)ハーディ・ワインバーグ平衡に従った(表4)。
上記11個のSNPについて、年齢と性別を調整した多重ロジスティック回帰分析によって、更に解析を行った(表5)。その結果、3個のSNP(CROTの rs7808249 (G/A)、TSC1の rs1076160 (A/G)、RIN3のrs8018360 (C/T))が有意に(いずれか一つの遺伝モデルについて、P<0.05)肥満との関連を示した。しかし、いずれのSNPも有意には(P<0.0011(0.05/44))関連を示さなかった(表6)。rs7808249のマイナーAアレル及びrs8018360のマイナーTアレルは、肥満の危険因子であった。また、rs1076160のマイナーGアレルは、肥満の保護因子であった。
【0020】
【表2】
【0021】
【表3】
【0022】
【表4】
【0023】
【表5】
【0024】
【表6】
【0025】
3.9個のSNPとBMIとの関係
次に、一元配置分散分析によって、BMIと9個のSNPの遺伝子型の関連を調べた。BMIのEWASによって特定された6個のSNP(rs633715, rs543874, rs1421085, rs1558902, rs8050136, rs9939609)は、全てBMIと有意に(P<0.0056 (0.05/9))関連した。肥満との関連を特定された3個のSNPのうち、rs7808249 とrs1076160は、BMIと有意に関連したが、rs8018360は関連がなかった(表7)。
【0026】
【表7】
【0027】
4.メタボリック症候群に関するEWAS
メタボリック症候群に関するEWASを行ったときの被験者の特徴を表8に示した。メタボリック症候群者と対照者との間で、年齢、男性の割合、BMI、腰回り長、収縮期血圧、拡張期血圧、空腹時血糖、糖化ヘモグロビン(hemoglobin A1c)量、血中中性脂肪濃度、血中LDLコレステロール濃度及び尿酸値はメタボリック症候群の方が高く、血中HDL濃度と推定糸球体濾過率(egfr)は、メタボリック症候群の方が低かった。
41675個のSNPについて、メタボリック症候群に関連するアレル頻度をフィッシャーの正確確率検定によって調べた。EWASのマンハッタンプロットを図1(C)に示した。ボンフェローニ補正を加えた結果、40個のSNPがメタボリック症候群に有意に(P<1.20×10-6(0.05/41,675))関連した(表9,10)。これらのSNPの遺伝子型分布は、メタボリック症候群及び対照群のいずれにおいても、ハーディ・ワインバーグ平衡に従った(P>0.001、表11〜表13)。
上記40個のSNPについて、年齢と性別を調整した多重ロジスティック回帰分析によって、解析を行った(表14,15)。その結果、5個のSNP(rs1800497, rs1406503, rs1007732, rs56150213, rs7350481)が有意に(いずれか一つの遺伝モデルについて、P<0.05)メタボリック症候群との関連を示した。これらのSNPのうち、遺伝子領域11q23.3のrs7350481(C/T)は有意に(P <3.13 × 10-4 (0.05/160))メタボリック症候群に関連し、マイナーTアレルはメタボリック症候群の危険因子であった(表16)。
【0028】
【表8】
【0029】
【表9】
【0030】
【表10】
【0031】
【表11】
【0032】
【表12】
【0033】
【表13】
【0034】
【表14】
【0035】
【表15】
【0036】
【表16】
【0037】
5.5個のSNPとメタボリック症候群との関係
次に、メタボリック症候群の各評価パラメータ(腰回り長、血中中性脂肪濃度、血中HDLコレステロール値、血圧、空腹時血糖値)と、5個のSNPとの関連を一元配置分散分析によって調べた(表17)。rs7350481(C/T)は、男性において、有意に(P<0.0013 (0.05/40))血中中性脂肪濃度及びHDLコレステロール値に関連したが、残りの4個のSNPは各パラメータとの間で有意性を示さなかった。
【0038】
【表17】
【0039】
6.従来のGWASによって調べられた表現型と、今回の研究で特定されたSNPとの関係
従来のGWASによって、肥満・メタボリック症候群との関連が特定され、公開されている遺伝子・遺伝子座位(GWAS Catalog (http://www.ebi.ac.uk/gwas))と、今回特定されたSNPとの関係を調べた。BMI及び肥満に関する研究によって、染色体領域1q25がBMI(非特許文献1,2)、肥満(非特許文献1)、体脂肪率(非特許文献3)との関係が指摘されていた。FTOについては、BMI(非特許文献4)、肥満(非特許文献1)、体脂肪率(非特許文献3)、脂肪過多(非特許文献5)、循環レプチン濃度(非特許文献6)との関係が特定されていた。残りの3個の遺伝子(CROT, TSC1, RIN3)については、BMIまたは肥満との関連を示す既報は認められなかった(表18,19)。メタボリック症候群に関する研究では、5個の特定された遺伝子・遺伝子座位(ANKK1, ZNF804B, CSRNP3, 17p11.2, 11q23.3)については、メタボリック症候群との関係性を示す既報は認められなかった。ZNF804B及び染色体領域11q23.3は、女性におけるBMIとの関係(非特許文献7)と、血中中性脂肪濃度及びHDLコレステロール値との関係(非特許文献8)が指摘されていた。
【0040】
【表18】
【0041】
【表19】
【0042】
<B.2型糖尿病>
<試験方法>
1.被験者集団
3573人の2型糖尿病患者と10450人の対照者からなる14023人の日本人集団を被験者集団とした。この集団は、(i)岐阜県立多治見病院、岐阜県総合医療センター、名古屋第一赤十字病院、いなべ総合病院、弘前大学病院及び弘前脳卒中・リハビリテーションセンターに2002年〜2014年の間に種々の症状を訴えて来院したか、(ii)2010年〜2014年の間にいなべ市において、2011年〜2015年の間に東京若しくは草津において、集団ベース・コホート研究に参加した者、または(iii)1995年〜2012年の間に、東京都老人病院において部検を実施された者であった。
2型糖尿病患者は、世界保健機構により承認された基準に従って定義した。すなわち、空腹時血糖値が6.93mmol/L(126mg/dL)以上もしくは糖化ヘモグロビン(Glycosylated hemoglobin HbA1c)濃度が6.5%以上の者、または抗糖尿病薬を服用中の者とした。1型糖尿病患者、若年性の成人発症型糖尿病患者、ミトコンドリア病または単一遺伝子の障害による糖尿病患者、膵臓疾患患者、または他の代謝性または内分泌性疾患を有する患者は、研究対象から除外した。二次性の糖尿病を発症する可能性がある薬剤を服用している者も除外した。対照者は、空腹時血糖値が6.05mmol/L(110mg/dL)未満、糖化ヘモグロビンが6.2%未満であり、糖尿病の既往歴及び糖尿病薬を服用した経験が無い者であった。部検例は、対照者群から除いた。
【0043】
2.EWAS
(1)DNAサンプルとSNP解析用アレイ
上記<A.肥満・メタボリック症候群>「2.BMI、肥満及びメタボリック症候群のEWAS」中、「(1)DNAサンプルとSNP解析用アレイ」の記載に従った。
(2)クオリティ・コントロール
上記<A.肥満・メタボリック症候群>「2.BMI、肥満及びメタボリック症候群のEWAS」中、「(2)クオリティ・コントロール」の記載に従った。
(3)統計解析に用いたSNP
上記クオリティ・コントロールをクリアした41265個のSNPについて、統計解析に用いた。
【0044】
3.統計解析
空腹時血糖値または糖化ヘモグロビンと、SNPの遺伝子型との関係を線形回帰モデルを用いて解析した。被験者の特徴を分析するため、2型糖尿病患者と対照者との間で定量的なデータについて、スチューデントt検定によって比較した。カテゴリーデータは、フィッシャーの正確確率検定(Fisher's exact test)を用いて、2群間で比較した。アレル頻度は、遺伝子計数法により推定し、フィッシャーの正確確率検定により、ハーディー・ワインバーグ平衡からのずれを同定した。EWASによって2型糖尿病に関連したSNPのアレル頻度の関係をフィッシャーの正確確率検定によって調べた。遺伝子型または表現型が不明なデータについては、解析から除外した。空腹時血糖値または糖化ヘモグロビンについて複数の遺伝子型の比較を行うために、ボンフェローニ補正を加えて、関連性の統計的有意性を調べた。2型糖尿病に関連するアレル頻度の複数の遺伝子型の比較を行うためにも同様の処理を行った。41265個のSNPを分析し、EWASについて、有意水準をP<1.21×10-6(0.05/41265)とした。空腹時血糖値または糖化ヘモグロビンのEWASにおける遺伝子型のP値に関するQ-Qプロット(quantile-quantileプロット)、2型糖尿病のEWASにおけるアレル頻度のP値に関するQ-Qプロットを図3に示した。インフレーション・ファクター(λ)は、空腹時血糖値では1.02、糖化ヘモグロビンでは1.03、2型糖尿病では1.26であった。
年齢、性別(女性が0、男性が1)及び各SNPの遺伝子型を独立変数とし、2型糖尿病の有無を従属変数とする多重ロジスティック回帰分析を行った。各SNPの遺伝子型は、Aをメジャーアレル、Bをマイナーアレルとし、優性モデル(0、AA;1、AB + BB)、劣性モデル(0、AA + AB; 1、BB)、相加的遺伝子モデル、P値、オッズ比および95%信頼区間について計算した。相加的モデルには、相加1モデル(0、AA; 1、AB; 0、BB)と相加2モデル(0、AA; 0、AB; 1 BB)とを含み、両者は単一の統計モデルで同時に分析した。特定されたSNPの遺伝子型と、空腹時血糖値または糖化ヘモグロビンとの関連を一元配置分散分析(ANOVA)によって調べた。上記の通り、別の解析については、ボンフェローニ補正を行った。統計解析には、JMPゲノミックス・バージョン6.0ソフトウエア(SAS Institute, Cary, NC, USA)を用いた。
【0045】
<試験結果>
1.空腹時血糖値についてのEWAS
11729人の被験者集団について、41265個のSNPの遺伝子型と空腹時血糖値との関係を線形回帰モデルを用いて調べた。EWASのマンハッタンプロットを図4(A)に示した。ボンフェローニ補正を加えた結果、空腹時血糖値について、41個のSNPが、有意に(P<1.21×10-6)関連した(表20,21)。
【0046】
【表20】
【0047】
【表21】
【0048】
2.糖化ヘモグロビンに関するEWAS
8635人の被験者集団について、41265個のSNPの遺伝子型と糖化ヘモグロビンとの関係を線形回帰モデルを用いて調べた。EWASのマンハッタンプロットを図4(B)に示した。ボンフェローニ補正を加えた結果、糖化ヘモグロビンについて17個のSNPが有意に(P<1.21×10-6)関連した(表22)。CATのrs139421991(G/A(R320Q))及びPDCL2のrs189305583(C/T(V69I))は、空腹時血糖値及び糖化ヘモグロビン]の両方に有意に関連した。
【0049】
【表22】
【0050】
3.2型糖尿病に関するEWAS
3573人の2型糖尿病患者と10450人の対照者とを含む14023人について、2型糖尿病に関するEWASを実施した。このときの被験者の特徴を表23に示した。2型糖尿病患者群と対照者群との間で、年齢、男性の割合、BMI、高血圧の割合、異常脂質血症の割合、慢性腎疾患の割合、高尿酸血症の割合、収縮期血圧、拡張期血圧、血中中性脂肪濃度、血中クレアチニン濃度、尿酸値、空腹時血糖値、糖化ヘモグロビン濃度は2型糖尿病患者群が高く、推定糸球体濾過率、血中HDL濃度は2型糖尿病患者群が低かった。
41265個のSNPについて、2型糖尿病に関連するアレル頻度をフィッシャーの正確確率検定によって調べた。EWASのマンハッタンプロットを図4(C)に示した。ボンフェローニ補正を加えた結果、87個のSNPが2型糖尿病に有意に(P<1.21×10-6)関連した(表24,25)。これらのSNPの遺伝子型分布は、ハーディ・ワインバーグ平衡に従った(P>0.001)(表26〜表31)。
【0051】
【表23】
【0052】
【表24】
【0053】
【表25】
【0054】
【表26】
【0055】
【表27】
【0056】
【表28】
【0057】
【表29】
【0058】
【表30】
【0059】
【表31】
【0060】
上記87個のSNPと2型糖尿病との関係について、年齢と性別を調整した多重ロジスティック回帰分析によって、更に解析を行った(表32〜表35)。その結果、4個のSNP(RUFY1のrs138313632(T/G(S705A))、C21orf59のrs76974938(C/T(D67N))、LOC100505549のrs139012426(G/C(S1242T))、TRABD2Bのrs147317864(C/T(A262T))が有意に(P<1.44×10-4(0.05/348))2型糖尿病と関連した(表36)。rs138313632のマイナーGアレル、rs76974938のマイナーTアレル、rs139012426のマイナーCアレルは、2型糖尿病の保護因子であり、rs147317864のマイナーTアレルは、2型糖尿病の危険因子であった。RUFY1のrs138313632とLOC100505549のrs139012426は、空腹時血糖値及び2型糖尿病のいずれにも関連した。C21orf59のrs76974938は、糖化ヘモグロビン値及び2型糖尿病のいずれにも関連した。
【0061】
【表32】
【0062】
【表33】
【0063】
【表34】
【0064】
【表35】
【0065】
【表36】
【0066】
4.空腹時血糖値または糖化ヘモグロビン濃度とSNPとの関係
次に、一元配置分散分析によって、空腹時血糖値または糖化ヘモグロビン濃度と特定されたSNPの遺伝子型の関連を調べた。空腹時血糖値のEWASによって特定された41個のSNP(2型糖尿病に関連した2個のSNP(rs138313632, rs139012426)を含む)は、全て空腹時血糖値と有意に(P <0.0012(0.05/43))関連した。2型糖尿病に関連した2個のSNP(rs76974938, rs147317864)は、空腹時血糖値に有意な関連を示さなかった(表37,38)。
糖化ヘモグロビンに関するEWASで特定された17個のSNP(2型糖尿病に関連した1個のSNP(rs76974938)を含む)は、一元配置分析によって、全て糖化ヘモグロビン濃度と有意に(P <0.0025(0.05/20))関連した。2型糖尿病に関連した残り3個のSNP(rs138313632, rs139012426, rs147317864)は、糖化ヘモグロビン濃度に有意な関連を示さなかった(表39)。
【0067】
【表37】
【0068】
【表38】
【0069】
【表39】
【0070】
5.従来のGWASによって調べられた表現型と、今回の研究で特定されたSNPとの関係
従来のGWASによって、糖尿病との関連が特定され、公開されている遺伝子・遺伝子座位(GWAS Catalog (http://www.ebi.ac.uk/gwas))と、今回特定されたSNPとの関係を調べた。LGR5のrs117324318は、2型糖尿病との関連が指摘されており(非特許文献9、10)、TNXB のrs141190850は、1型糖尿病との関連が指摘されていた(非特許文献11)。PTCHD3のrs77473776とTNCのrs138406927は、空腹時インスリン濃度(非特許文献12)及びグルコース恒常性(非特許文献13)に関連する指摘が認められた(表40〜表44)。残りの53個のSNPについては、糖尿病との関連を指摘する既報は認められなかった。
今回の研究で特定された56個のSNPについて、マイナーアレル頻度と影響の大きさをまとめたものを表45〜表47に示した。
【0071】
【表40】
【0072】
【表41】
【0073】
【表42】
【0074】
【表43】
【0075】
【表44】
【0076】
【表45】
【0077】
【表46】
【0078】
【表47】
【0079】
<C.脂質代謝異常>
<試験方法>
1.被験者集団
8354人の脂質代謝異常者(dyslipidemia)と5983人の対照者とを含む14337人の日本人集団について、試験を実施した。この集団は、(i)岐阜県立多治見病院、岐阜県総合医療センター、名古屋第一赤十字病院、いなべ総合病院、弘前大学病院及び弘前脳卒中・リハビリテーションセンターに2002年〜2014年の間に種々の症状を訴えて来院したか、(ii)2010年〜2014年の間にいなべ市において、2011年〜2015年の間に東京若しくは草津において、集団ベース・コホート研究に参加した者、または(iii)1995年〜2012年の間に、東京都老人病院において部検を実施された者であった。
一晩絶食した被験者について、早朝に静脈血を採取した。血液を4℃、1600×gにて15分間遠心し、上清を血清として回収した。血清中の中性脂肪、HDLコレステロール、LDLコレステロールを各病院の検査室にて測定した。中性脂肪値は、4742人の高中性脂肪者では1.69mmol/L以上(実測値として、1.69〜20.14mmol/L)、8672人の対照者では1.69mmol/L未満(実測値として、0.14〜1.68mmol/L)であった。血清中HDLコレステロール値は、低HDLコレステロール者では1.03mmol/L(実測値として、0.26〜1.01mmol/L)、対照者では1.03mmol/L(実測値として、1.03〜4.73mmol/L)であった。血清中LDLコレステロール値は、高LDLコレステロール者では3.62mmol/L(実測値として、3.62〜12.31mmol/L)、対照者では3.62mmol/L未満(実測値として、0.26〜3.59mmol/L)であった。脂質代謝異常者として、高中性脂肪値・低HDLコレステロール値・高LDLコレステロール値のうちのいずれか一つ以上を持つ者、または抗脂質代謝異常薬を服用する者とした。高中性脂肪及び低HDLコレステロールを持つ1300人の被験者と、7844人の対照者とは、各統計解析において、オーバーラップした。高中性脂肪及び高LDLコレステロールを持つ2002人の被験者と、6326人の対照者についても同様であった。また、低HDLコレステロールと高LDLコレステロールを持つ712人の被験者と、7776人の対照者についても同様であった。部検例については、対照者群から除外した。
研究計画は、ヘルシンキ宣言を遵守し、三重大学医学研究科、弘前大学大学院医学研究科、東京都老人医学研究所および参加病院の人間倫理委員会の承認を得た。死亡した被験者のすべての被験者または家族から、インフォームド・コンセントを得た。
【0080】
2.EWAS
(1)DNAサンプルとSNP解析用アレイ
50mmol/Lのエチレンジアミン四酢酸(2ナトリウム塩)を含有するチューブに静脈血を採取し、末梢血白血球を単離した後、ゲノムDNAをDNA抽出キット(ゲノミックス(タレント社、イタリア)、SMITEST EX-R&D(医学生物学研究社))または標準的なフェノール・クロロホルム抽出法とスピンカラムを用いて、精製した。部検者の場合には、腎臓からゲノムDNAを抽出した。血清中中性脂肪値(13414人の被験者)、HDLコレステロール値(14119人の被験者)、LDLコレステロール値(13577人の被験者)、高中性脂肪値(4742人の異常値群と8672人の対照者群)、低HDLコレステロール値(2646人の異常値群と11473人の対照者群)、高LDLコレステロール値(4489人の異常値群と9088人の対照者群)に関するEWASは、ヒト・エクソーム12 v1.2 若しくはv1.2 DNA解析ビーズチップ、またはインフィニウム・エクソーム24 v1.0ビーズチップ(イルミナ社、アメリカ)を用いて行った。これらのエクソーム・アレイは、個々のエクソームと全ゲノム配列から選択された12000を超える推定上の機能的エクソン変異体を含んでいる。エキソンの内容には、欧州人種、アフリカ人種、中国人及びヒスパニック人種を含む広範囲な集団を代表する約244000個のSNPが含まれる。一種類のみのエクソーム・アレイに含まれるSNP(全SNPの3.6%程度)は、解析から除いた。
【0081】
(2)クオリティ・コントロール
上記<A.肥満・メタボリック症候群>「2.肥満・メタボリック症候群患者のEWAS」中、「(2)クオリティ・コントロール」の記載に従った。
(3)統計解析に用いたSNP
各解析について、評価したサンプルの2次元解析図を図5に示した。クオリティ・コントロールをクリアした41371個(高中性脂肪値)、41225個(低HDLコレステロール値)及び41347個(高LDLコレステロール値)の各SNPについて統計解析を行った。
【0082】
3.統計解析
中性脂肪値・HDLコレステロール値・LDLコレステロール値と、各SNPの遺伝子型とのEWASを線形回帰モデルを用いて解析した。被験者の特徴を分析するため、各数値の異常者群と対照者群との間で定量的なデータについて、スチューデントt検定によって比較した。カテゴリーデータは、フィッシャーの正確確率検定(Fisher's exact test)を用いて、2群間で比較した。対立遺伝子頻度は、遺伝子計数法により推定し、フィッシャーの正確確率検定により、ハーディー・ワインバーグ平衡からのずれを同定した。中性脂肪値・HDLコレステロール値・LDLコレステロール値に関するEWASにおいて、SNPのアレル頻度との関係をフィッシャーの正確確率検定により評価した。脂質濃度または異常脂質代謝について、複数の遺伝子型またはアレル頻度の比較を行うために、ボンフェローニ補正を加えて、関連性の統計的有意性を調べた。クオリティコントロールをクリアした41225個から41371個のSNPを分析し、各EWASについて有意水準をP<1.21×10-6(0.05/41225から41371)とした。EWASにおける遺伝子型またはアレル頻度のP値に関するQ-Qプロット(quantile-quantileプロット)を図6,7に示した。
【0083】
インフレーション・ファクター(λ)は、血清中性脂肪値では1.05、血清HDLコレステロール値では0.97、血清LDLコレステロール値では1.06、高中性脂肪血症では1.20、低HDLコレステロール血症では1.29、高LDLコレステロール血症では1.20であった。年齢、性別(女性が0、男性が1)及び各SNPの遺伝子型を独立変数とし、高中性脂肪血症・低HDLコレステロール血症・高LDLコレステロール血症の有無を従属変数とする多重ロジスティック回帰分析を行った。各SNPの遺伝子型は、Aをメジャーアレル、Bをマイナーアレルとし、優性モデル(0、AA;1、AB + BB)、劣性モデル(0、AA + AB; 1、BB)、相加的遺伝子モデル、P値、オッズ比および95%信頼区間について計算した。相加的モデルは、相加1(0、AA; 1、AB; 0、BB)と相加2(0、AA; 0、AB; 1 BB)とを含み、両者は単一の統計モデルで同時に分析した。染色体6p22.1-p21.3の8個のSNPの連鎖不平衡と、高LDLコレステロール血症とハプロタイプの関連について、カイ二乗検定及び順列検定によって調べた。血中中性脂肪値、HDLコレステロール値、LDLコレステロール値と特定されたSNPの遺伝子型との関係は、一元配置分散分析(ANOVA)によって検定した。他の統計解析については、ボンフェローニ補正を加えた。統計解析には、JMPゲノミックス・バージョン6.0ソフトウエア(SAS Institute, Cary, NC, USA)を用いた。
【0084】
<試験結果>
1.血中中性脂肪値・HDLコレステロール値・LDLコレステロール値に関するEWAS
(i)13414人の被験者集団について、41371個のSNPの遺伝子型と血中中性脂肪値との関係を、(ii)14119人の被験者集団について、41225個のSNPの遺伝子型と血中HDLコレステロール値との関係を、(iii)13577人の被験者集団について、41347個のSNPの遺伝子型と血中LDLコレステロール値との関係を、それぞれ線形回帰モデルを用いて解析した。EWASのマンハッタンプロットを図8に示した。ボンフェローニの補正後に、(i)46個、(ii)104個または(iii)40個のSNPが有意に(P<1.21×10-6)、血中中性脂肪値(表48,49)、血中HDLコレステロール値(表50〜表52)、血中LDLコレステロール値(表53)に、それぞれ関連した。
【0085】
【表48】
【0086】
【表49】
【0087】
【表50】
【0088】
【表51】
【0089】
【表52】
【0090】
【表53】
【0091】
2.高中性脂肪血症・低HDLコレステロール血症・高LDLコレステロール血症に関するEWAS
(i)13414人の被験者集団(4742人の高中性脂肪血症者、8672人の対照者)について高中性脂肪血症に関するEWASを、(ii)14119人の被験者集団(2646人の低HDLコレステロール血症者、11473人の対照者)について低HDLコレステロール血症に関するEWASを、(iii)13577人の被験者集団(4489人の高LDLコレステロール血症者、9088人の対照者)について高LDLコレステロール血症に関するEWASを、それぞれ実施した。被験者の特徴を表54に示した。高中性脂肪血症の解析については、年齢、男性割合、BMI、喫煙割合、高血圧の割合、糖尿病罹患率、慢性腎疾患、高尿酸血症、血中中性脂肪値、LDLコレステロール値、LDL/HDL比は、高中性脂肪血症者群が高く、HDLコレステロール値は対象者群が高かった。低HDLコレステロール血症の解析については、年齢、男性割合、BMI、喫煙割合、高血圧の割合、糖尿病罹患率、慢性腎疾患、高尿酸血症、血中中性脂肪値、LDL/HDL比は、低HDLコレステロール血症者群が高く、HDLコレステロール値は対象者群が高かった。高LDLコレステロール血症の解析については、BMI、喫煙割合、血中中性脂肪値、LDLコレステロール値、LDL/HDL比は、高LDLコレステロール血症者群が高く、年齢、慢性腎疾患、血中HDLコレステロール値は対象者群が高かった。
【0092】
(i)高中性脂肪血症については41371個のSNPについて、(ii)低HDLコレステロール血症については41225個のSNPについて、(iii)高LDLコレステロール血症については41347個のSNPについて、アレル頻度の関係をフィッシャーの正確確率検定によって調べた。EWASのマンハッタンプロットを図9に示した。ボンフェローニ補正を加えた結果、(i)73個、(ii)87個及び(iii)114個のSNPが、それぞれ有意に(P<1.21×10-6)、高中性脂肪血症(表55,56)、低HDLコレステロール血症(表57,58)及び高LDLコレステロール血症(表59〜表61)に関連した。これらのSNPの遺伝子型分布は、高中性脂肪血症群と対照群(表62〜表66)、低HDLコレステロール血症群と対照群(表67〜表72)、高LDLコレステロール血症群と対照群(表73〜表79)のいずれにおいても、ハーディ・ワインバーグ平衡に従った(P>0.001)。
【0093】
【表54】
【0094】
【表55】
【0095】
【表56】
【0096】
【表57】
【0097】
【表58】
【0098】
【表59】
【0099】
【表60】
【0100】
【表61】
【0101】
【表62】
【0102】
【表63】
【0103】
【表64】
【0104】
【表65】
【0105】
【表66】
【0106】
【表67】
【0107】
【表68】
【0108】
【表69】
【0109】
【表70】
【0110】
【表71】
【0111】
【表72】
【0112】
【表73】
【0113】
【表74】
【0114】
【表75】
【0115】
【表76】
【0116】
【表77】
【0117】
【表78】
【0118】
【表79】
【0119】
3.高中性脂肪血症・低HDLコレステロール血症・高LDLコレステロール血症に関連するSNPの多重ロジスティック回帰分析
上記73、87及び114個のSNPについて、年齢と性別を調整した多重ロジスティック回帰分析によって、更に解析を行った。その結果、2個のSNP(BUD13のrs10790162(G/A)及び11q23.3のrs7350481(C/T))が有意に(P<1.71×10-4(0.05/292))高中性脂肪値と(表80〜表83)、3個のSNP(USP4のrs146515657(T/C(N650S))、TRABD2Bのrs147317864(C/T(A262T))及び12q24.1のrs12229654(T/G))が有意に(P<1.44×10-4(0.05/348))低HDLコレステロール血症と(表80,表84〜表86)、9個のSNP(6p22.1のrs7771335(A/G)、C21orf59のrs76974938(C/T(D67N))、MOGのrs2071653(C/T)、6p21.3のrs2853969(C/T)、PPP1R18のrs2269704(C/T)、NRMのrs2269703(G/A)、6p21.3のrs495089(T/C)、MDC1のrs2269702(A/G)、6p22.1のrs1233399(C/T))が有意に(P<1.10×10-4(0.05/456))高LDLコレステロール血症と(表80,表87〜表90)、それぞれ関連した。
【0120】
【表80】
【0121】
【表81】
【0122】
【表82】
【0123】
【表83】
【0124】
【表84】
【0125】
【表85】
【0126】
【表86】
【0127】
【表87】
【0128】
【表88】
【0129】
【表89】
【0130】
【表90】
【0131】
4.連鎖不平衡とハプロタイプ解析
高LDLコレステロール血症に関連した8個のSNP(rs7771335, rs2071653, rs2853969, rs2269704, rs2269703, rs495089, rs2269702, rs1233399)は、全て染色体6p22.1-p21.3に位置していたので、これらのSNPの連鎖不平衡と、ハプロタイプについて調べた。その結果、これら8個のSNPは、強い連鎖不平衡の関係にあった(表91)。ハプロタイプ解析によれば、ハプロタイプA(rs7771335)−C(rs2071653)−C(rs2853969)−C(rs2269704)−G(rs2269703)−T(rs495089)−A(rs2269702)−T(rs1233399)と、ハプロタイプG(rs7771335)−T(rs2071653)−T(rs2853969)−T(rs2269704)−A(rs2269703)−C(rs495089)−G(rs2269702)−C (rs1233399)は、有意に(P<4.31×10-4)高LDLコレステロール血症に関連し、前者のハプロタイプが保護因子、後者のハプロタイプが危険因子であった(表92)。
【0132】
【表91】
【0133】
【表92】
【0134】
5.今回特定されたSNPと、血中中性脂肪値・HDLコレステロール値・LDLコレステロール値との関係
次に、一元配置分散分析によって、血中中性脂肪値・HDLコレステロール値・LDLコレステロール値との関連を特定されたSNPについて、遺伝子型の関連を調べた。EWASによって血中中性脂肪値と関連するとして特定された46個のSNP(高中性脂肪血症に関連するとして特定された2個のSNP(BUD13のrs10790162、11q23.3のrs7350481)を含む)は、全て有意に(P<0.0011(0.05/46))血中中性脂肪値に関連した(表93,94)。EWASによって血中HDLコレステロール値と関連するとして特定された104個のSNP(低HDLコレステロール血症に関連するとして特定された3個のSNPのうちの2個のSNP(USP4のrs146515657、12q24.1のrs12229654)を含む)は、全て有意に(P<4.76×10-4(0.05/105))血中HDLコレステロール値に関連し、1個のSNP(TRABD2Bのrs147317864)が低HDLコレステロール血症に関連した(表95〜表99)。EWASによってLDLコレステロール値との関連を特定された40個のSNP(低LDLコレステロール血症と関連するとして特定された1個のSNP(rs2853969 at 6p21.3)を含む)は、全て有意に(P<0.0010(0.05/48))血中LDLコレステロール値に関連し、高LDLコレステロール血症と関連するとして特定された8個のSNPのうち5個のSNP(6p22.1のrs7771335、MOGのrs2071653、PPP1R18のrs2269704、NRMのrs2269703、MDC1のrs2269702)が血中LDLコレステロール値に関連した(表100〜表102)。
【0135】
【表93】
【0136】
【表94】
【0137】
【表95】
【0138】
【表96】
【0139】
【表97】
【0140】
【表98】
【0141】
【表99】
【0142】
【表100】
【0143】
【表101】
【0144】
【表102】
【0145】
6.従来のGWASによって調べられた表現型と、今回の研究で特定された染色体座位、遺伝子及びSNPと脂質代謝異常との関係
次に、今回の研究によって特定された遺伝子、染色体座位中またはSNPと、従来のGWASによって特定され、公開されている表現型(GWAS Catalog, http://www.ebi.ac.uk/gwas)との関係を調べた。中性脂肪代謝に関連するとして特定された24個の染色体座位のうち、13個の座位(BUD13(非特許文献13)、11q23.3(非特許文献14)、APOA5(非特許文献1314)、 ZPR1(非特許文献14)、APOA4(非特許文献13、15)、LPL(非特許文献13、15)、 8p21.3(非特許文献13、16)、SIK3(非特許文献17、18)、GCKR(非特許文献14)、 2p23(非特許文献15,19)、C2orf16(非特許文献20)、 8q24.1(非特許文献21)、LOC101929011(非特許文献19))については、血中中性脂肪値または高中性脂肪血症との関連を指摘されていた(表103〜表105)。HDLコレステロールの代謝に関連するとして特定された69個の染色体座位のうち、16個(12q24.1(非特許文献22)、16q13(非特許文献13,14)、CETP(非特許文献13、14)、APOA5(非特許文献14)、LIPC(非特許文献14,15)、 HECTD4(非特許文献22)、LILRB2(非特許文献23)、LPL(非特許文献13,14)、 8p21.3(非特許文献13,14)、LOC101928635(非特許文献15,24)、BUD13(非特許文献14)、 ZPR1(非特許文献21)、ABCA1(非特許文献14、24)、11q23.3(非特許文献14)、OAS3(非特許文献22)、CD36(非特許文献25)については、血中HDLコレステロール値または低HDLコレステロール血症との関連を指摘されていた(表106〜表113)。LDLコレステロールの代謝に関連するとして特定された32個の染色体座位のうち、9個(APOE(非特許文献26)、APOC1(非特許文献27)、APOB(非特許文献14,15)、 PCSK9(非特許文献15)、 PSRC1(非特許文献28,29)、CELSR2(非特許文献14,24)、1p13.3(非特許文献14)、 ABO(非特許文献15)、9q34.2(非特許文献15,23)については、血中LDLコレステロール値または高LDLコレステロール血症との関連を指摘されていた(表114〜表118)。
今回の研究で特定された各SNPについて、マイナーアレル頻度と影響の大きさを血中中性脂肪値(表119,120)、血中HDLコレステロール値(表121〜表123)及び血中LDLコレステロール値(表124,125)についてまとめたものをそれぞれ表に示した。
【0146】
【表103】
【0147】
【表104】
【0148】
【表105】
【0149】
【表106】
【0150】
【表107】
【0151】
【表108】
【0152】
【表109】
【0153】
【表110】
【0154】
【表111】
【0155】
【表112】
【0156】
【表113】
【0157】
【表114】
【0158】
【表115】
【0159】
【表116】
【0160】
【表117】
【0161】
【表118】
【0162】
【表119】
【0163】
【表120】
【0164】
【表121】
【0165】
【表122】
【0166】
【表123】
【0167】
【表124】
【0168】
【表125】
【0169】
このように本実施形態によれば、代謝疾患について、遺伝的リスクを予測するための検出法を提供することができた。この実施形態を用いることにより、代謝疾患の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・生活の質の向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0170】
【特許文献1】特開2007−209297号公報
【特許文献2】特開2007−267728号公報
【特許文献3】特開2009−247263号公報
【非特許文献】
【0171】
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図1
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