特許 6241537 磁性体粒子の操作方法および磁性体粒子操作用デバイス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6241537

(24)【登録日】2017年11月17日

(45)【発行日】2017年12月6日

(54)【発明の名称】磁性体粒子の操作方法および磁性体粒子操作用デバイス

(51)【国際特許分類】

   B03C 1/00 20060101AFI20171127BHJP

   B03C 1/02 20060101ALI20171127BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20171127BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20171127BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20171127BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20171127BHJP

【ＦＩ】

   B03C1/00 B

   B03C1/02 Z

   G01N33/53 D

   G01N33/553

   C12N15/00 A

   C07K1/14

【請求項の数】10

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2016-507225(P2016-507225)

(86)(22)【出願日】2014年3月14日

(86)【国際出願番号】JP2014056905

(87)【国際公開番号】WO2015136689

(87)【国際公開日】20150917

【審査請求日】2016年9月13日

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100152571

【弁理士】

【氏名又は名称】新宅 将人

(74)【代理人】

【識別番号】100141852

【弁理士】

【氏名又は名称】吉本 力

(72)【発明者】

【氏名】大橋 鉄雄

(72)【発明者】

【氏名】老川 幸夫

【審査官】 中村 泰三

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０５９０７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０８６２４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−１８６３５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１７０６７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０３Ｃ １／００

Ｂ０３Ｃ １／０２

Ｃ０７Ｋ １／１４

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｇ０１Ｎ ３３／５５３

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

磁性体粒子を操作する方法であって、
容器内に装填された液体層内に、磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを共存させ、
磁場操作によって、前記磁性固体を前記容器の内壁面に沿って前記液体層内で移動させ、前記磁性固体の容器内壁面に沿った移動に伴う磁性固体の微振動により、磁性固体の周辺および磁性固体と容器内壁面との間に存在する前記磁性体粒子が前記液体層内で分散する、磁性体粒子の操作方法。

【請求項2】

前記磁性固体は、粒径が５０μｍ以上である、請求項１に記載の磁性体粒子の操作方法。

【請求項3】

前記磁性固体の粒径が、前記磁性体粒子の粒径の１０倍以上である、請求項１または２に記載の磁性体粒子の操作方法。

【請求項4】

前記磁性固体は、金属の表面に、前記液体層内での腐食を防止するためのコーティング層を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の磁性体粒子の操作方法。

【請求項5】

前記磁性体粒子は、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンドおよび細胞からなる群から選択される１以上の目的物質を選択的に固定し得る粒子であり、
前記磁性体粒子に前記目的物質が固定された状態で、磁場操作によって、前記磁性固体を前記容器の内壁面に沿って前記液体層内を移動させ、前記磁性固体の移動に伴って、前記磁性体粒子が前記液体層内で分散する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の磁性体粒子の操作方法。

【請求項6】

前記液体層内で、前記磁性固体の移動に伴って前記磁性体粒子が分散することにより、前記磁性体粒子に固定された前記目的物質の溶出が行われる、または、前記磁性体粒子に前記目的物質が固定された状態を保持したまま洗浄が行われる、請求項５に記載の磁性体粒子の操作方法。

【請求項7】

磁場操作によって、前記磁性固体が、前記液体層内で前記容器の内壁面に沿って往復運動させられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の磁性体粒子の操作方法。

【請求項8】

容器内にゲル状媒体層と液体層とが交互に配置され、第一の液体層と第二の液体層とがゲル状媒体層により隔てられたデバイス内において、第一の液体層内に、磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とが共存しており、
磁場操作により、第一の液体層内の前記磁性体粒子および前記磁性固体が、ゲル状媒体内へ移動させられるステップ；
磁場操作により、ゲル状媒体層の内部に存在する前記磁性体粒子および前記磁性固体が、第二の液体層内へ移動させられるステップ；および
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により、前記磁性体粒子が前記第二の液体層内で分散するステップ、
を有する、磁性体粒子の操作方法。

【請求項9】

請求項８に記載の磁性体粒子の操作に用いるためのデバイスであって、
容器内に、ゲル状媒体層と液体層とが交互に配置されており、
さらに、前記容器内において移動されるべき磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを有する、磁性体粒子操作用デバイス。

【請求項10】

請求項９に記載の粒子操作用デバイスを作製するためのキットであって、
液体；ゲル状媒体；磁性体粒子；および前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体、を含む、磁性体粒子操作デバイス作製用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、目的物質の分離、抽出、精製、反応等の化学操作を行うための磁性体粒子の操作方法、およびそれに用いられる磁性体粒子操作用デバイスに関する。

【背景技術】

【0002】

医学的検査、食品安全衛生上の管理、環境保全のためのモニタリング等では、多種多様な夾雑物を含む試料から、目的物質を抽出して、検出や反応に供することが求められる。例えば、医学的検査では、動植物から分離取得される血液、血清、細胞、尿、糞便等の生体試料中に含まれる、核酸、タンパク質、糖、脂質、細菌、ウィルス、放射性物質等を検出、同定、定量する必要がある。これらの検査に際しては、夾雑物に起因するバックグランド等の悪影響を排除するために、目的物質を分離・精製することが必要となる場合がある。

【0003】

試料中の目的物質を分離・精製するために、目的物質を特異的に吸着可能な磁性体粒子を用いる方法が開発され、実用化されている。磁性体粒子を用いた分離・精製では、まず、粒径数μｍ程度の磁性体粒子の表面に目的物質を吸着させ、粒子表面に付着した夾雑物を洗浄操作により除去した後、粒子表面から目的物質が脱着される。例えば、血液から核酸を抽出する場合は、まず、血液中の細胞から核酸を遊離させる。この際、グアニジウム塩等の強力なタンパク質変成剤により、細胞中のタンパク質の変性が行われる。細胞から遊離させた核酸は、シリカコーティングされた磁性体粒子に特異的に吸着される。その後、磁性体粒子に付着した夾雑成分等を洗浄液で洗い流し、最後に磁性体粒子から核酸を溶出させて、回収する。

【0004】

このような磁性体粒子を用いた分離・精製操作では、液相中の磁性体粒子を磁場操作により液相から分離・回収する工程と、回収された磁性体粒子を洗浄液や溶出（遊離）液等の液相に分散させる工程とが繰り返し行われる。磁性体粒子の液相への分散は、一般には、ピペット操作やボルテックスミキサー等による振動撹拌により行われる。磁性体粒子は、磁石等を用いた磁場操作によって、液相から分離できるため、遠心分離等による固液分離の操作が不要となり、自動化も容易になし得る。

【0005】

例えば、液相中の磁性体粒子の回収と磁性体粒子の液相中への分散とを、いずれもピペット操作により行い、試料中の目的物質の磁性体粒子への吸着から、洗浄および溶出までの分離・精製の一連の操作を全て自動化する装置も開発されている（例えば特許文献１）。また、特許文献２では、磁性体粒子の分散液の上清の電気伝導率を３００μＳ／ｃｍ以下として、ゼータ電位の斥力によって、磁性体粒子の凝縮を抑制する方法が提案されている。

【0006】

磁性体粒子を用いた目的物質の分離・精製方法として、細胞溶解液、洗浄液、溶出液等の液体（水相）とオイル等の油相とを交互に重層したデバイス内で、磁性体粒子を移動させる方法も提案されている。この方法によれば、完全密閉系で目的物質の分離精製が可能であり、コンタミネーションの発生を抑制できる。また、分離・精製に引き続いて密閉状態を保ちながら同一のデバイス内で、分析等の操作も行い得る。

【0007】

例えば、特許文献３では、水相と油相とを交互に重層した分離・精製用デバイスにおいて、油相にゲル状媒体を用いることが提案されている。この方法では、水相内に存在する磁性体粒子が、磁場操作によりゲル状媒体層内に移動させられる。ゲルはチクソトロピックな性質を有しているため、磁性体粒子はゲル状媒体層を破壊することなくゲル状媒体層内を移動できる。一方、磁性体粒子に付着した水系液体は、ゲル状媒体層内へは移動できない。このように、油相をゲル化することにより、夾雑物を液体内に残存させ、目的物質を吸着した磁性体粒子をゲル状媒体層の内部に移動させることにより固液分離（Ｂ／Ｆ分離）が実現され、目的物質の分離・精製および回収を高効率化できる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】ＷＯ９７／４４６７１号国際公開パンフレット

【特許文献2】特開２０１０−１２３９８４号公報

【特許文献3】ＷＯ２０１２／０８６２４３号国際公開パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

磁性体粒子を用いる目的物質の分離・精製では、磁場操作により、液体中の磁性体粒子の回収や移動が行われるため、磁石に引き寄せられた磁性体粒子同士が凝集を生じやすい。磁性体粒子が凝集すると、凝集体の内部（粒子間）に取り込まれた夾雑物が洗浄されず、目的物質の精製が不十分となったり、回収率が低下する等の不具合を生じる場合がある。そのため、洗浄や溶出の際に凝集体となった磁性体粒子を、洗浄液や溶出液中に十分に分散させることが重要である。

【0010】

特に、血液からの核酸抽出を行う場合、グアニジウム塩等の変性剤によって変性されたタンパク質が試料液体中に大量に存在し、磁性体粒子同士を付着させる作用を有する。そのため、凝集した磁性体粒子の再分散が困難であり、夾雑成分の除去や、核酸の溶出の障害となって、目的物質の純度や回収率を低下させる原因となる。

【0011】

特許文献１のようなピペット操作の場合は、磁性体粒子の凝集を抑制し、凝集した粒子を液中に分散させるために、過剰の試薬を必要とする。また、細胞を溶解させるためには、高濃度のグアニジウム塩等の変性剤存在下タンパク質を変性させる必要があるため、特許文献２で提案されているような低電気伝導率環境を維持することは現実的ではない。

【0012】

また、本発明者らの検討によれば、特許文献３のようなゲルを用いた分離においても、磁性体粒子が一旦凝集すると、液体内やゲル内で磁性体粒子を再分散させることが困難であることが判明した。そのため、上記特許文献１の場合と同様に、ゲルを用いた分離操作においても、磁性体粒子の凝集体内に閉じ込められた夾雑物や夾雑物を含む液体が除去されず、洗浄不足や溶出障害によって、目的物質の成分の純度や回収率が低下する場合があった。

【0013】

上記に鑑み、本発明は、磁性体粒子を液体内に効率的に分散させ、分離、抽出、精製、反応等の化学操作を高効率化し得る磁性体粒子の操作方法の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記に鑑みて本発明者らが検討の結果、磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体の共存下で磁場操作を行うことにより、磁性固体の移動に伴って磁性体粒子が液体中に分散し、洗浄効率や回収率が高められることを見出し、本発明に至った。

【0015】

すなわち、本発明は、磁性体粒子と磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを液体層内に共存させ、磁場操作によって、磁性固体とともに磁性体粒子を液体層内で移動させる、磁性体粒子の操作方法に関する。

【0016】

本発明の一実施形態では、容器内にゲル状媒体層と液体層とが交互に配置されたデバイス内で、磁性体粒子の操作が行われる。当該形態では、磁場操作により、第一の液体層内の磁性体粒子が、ゲル状媒体内へ移動させられ；磁場操作により、ゲル状媒体層の内部に存在する磁性体粒子が、第二の液体層内へ移動させられ；第二の液体層内で、磁性固体とともに磁性体粒子が移動させられる。

【0017】

本発明では、液体層内で磁性体粒子を移動させるステップが、液体層内に磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体を共存させた状態で行われる。これにより、液体層中に、磁性体粒子が分散される。そのため、血液からの核酸抽出のように、磁性体粒子同士が付着・凝集を生じ易い環境でも、磁性体粒子を、洗浄液や溶出液等の液体層中に容易に分散させることができ、洗浄や溶出の効率を高めることができる。すなわち、液体層を構成する液体が洗浄液であれば、目的物質が磁性体粒子に固定された状態を保持したまま、洗浄液中で磁性体粒子が分散されるため、洗浄効率を高めることができる。また、液体層を構成する液体が溶出液であれば、目的物質の回収率を高めることができる。本発明の好ましい形態では、磁場操作によって、磁性固体とともに磁性体粒子が、液体層内で往復運動させられる。

【0018】

本発明において、磁性固体は、粒径が５０μｍ以上であることが好ましい。また、磁性固体の粒径は、磁性体粒子の粒径の１０倍以上であることが好ましい。磁性固体として、金属の表面に、液体層内での腐食を防止するためのコーティング層を有するものを用いることもできる。特に、ゲル状媒体層や液体層内に、磁性固体が予め装填されたデバイスやキットが提供される場合は、磁性固体は、鉄やステンレス等の金属の表面に、腐食防止のためのコーティングが施されていることが好ましい。

【0019】

磁性体粒子は、特定の物質を選択的に固定し得る粒子であることが好ましい。磁性体粒子に選択的に固定され得る物質としては、例えば、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド、細胞等の生体由来物質が挙げられる。なお、「生体由来物質」とは、必ずしも生体から採取された試料に由来する必要はなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた物質（例えば、ＰＣＲにより増幅された核酸等）も含まれる。

【0020】

本発明の一実施形態では、容器内に、２以上のゲル状媒体層と３以上の液体層とを有するデバイス内で磁性体粒子の操作が行われ、デバイス内の液体層のうち、少なくとも２つ液体層が、互いに異なる組成を有する。当該形態では、１つのデバイス内において、複数種の化学操作（分離、抽出、精製、反応等）を行い得る。例えば、液体層として洗浄液と溶出液とがゲル状媒体層で隔てられて配置されたデバイス内で、核酸等の目的物質が固定された磁性体粒子が、洗浄液層、ゲル状媒体層および溶出液層をこの順に移動させられることにより、洗浄液中で目的物質が洗浄・精製された後、溶出液内に目的物質を遊離させ回収できる。

【0021】

さらに、本発明は、上記の磁性体粒子操作に好適に用いられるデバイスに関する。本発明のデバイスは、ゲル状媒体層と液体層とが容器内に交互に配置されており、さらに、容器内において移動されるべき磁性体粒子と、磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを有する。

【0022】

また、本発明は、上記デバイスを作製するためのキットに関する。本発明のデバイス作製用キットは、液体と、ゲル状媒体と、磁性体粒子と、磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを含む。当該キットは、これらの構成要素の一部が所定の容器内に予め装填されたものでもよい。

【発明の効果】

【0023】

本発明の方法によれば、液体内に磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体を共存させた状態で、磁場操作による磁性体粒子の移動が行われる。この際、磁性体粒子を伴った状態で磁性固体を移動させることにより、磁性固体の微振動によって、磁性体粒子の凝集塊が粉砕され、液体中に分散される。そのため、本発明を核酸等の目的物質の分離・精製等に適用すれば、目的物質の洗浄効率（純度）および回収効率が向上し得る。

【0024】

また、本発明の方法では、ゲル状媒体層中で磁性体粒子を移動させることにより、固液分離が行われる。そのため、ピペット操作により、磁性体粒子と洗浄液や溶出液等の試薬との固液分離を行う場合に比して、本発明の方法では、より少ない磁性体粒子や試薬量で、目的物質を効率よく分離・回収することが可能となる上に、廃液量も大幅に抑制し得る。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】磁性体粒子の操作方法の概要を模式的に示す図である。

【図2】核酸を分離・精製する実施形態の各工程を模式的に示す図である。

【図3】実施例および比較例の磁性体粒子操作によって抽出・精製された核酸のＵＶ吸収スペクトルである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

まず、本発明の磁性体粒子の操作方法の概要および原理について説明する。図１は、本発明の磁性体粒子操作に用いられるデバイス５０の一実施形態、および当該デバイスを用いた粒子操作方法を説明するための模式図である。本発明の粒子操作用デバイスでは、容器内で、ゲル状媒体層と液体層とが交互に配置されている。図１（Ａ）において、容器１０内には、底部側から第二の液体層３２、ゲル状媒体層２１、および第一の液体層３１がこの順に装填されている。ゲル状媒体層２１内には、磁性固体６０が装填されている。

【0027】

ゲル状媒体層２１を構成するゲル状媒体は、これと隣接する液体層３１，３２と混和性を有さず、不溶または難溶であることが好ましい。例えば、液体層３１，３２が水系液体からなる場合、ゲル状媒体層２１は、水系液体に不溶または難溶の油性ゲルであることが好ましい。また、ゲル状媒体層は、化学的に不活性な物質であることが好ましい。ここで、液体に不溶性または難溶性であるとは、２５℃における液体に対する溶解度が概ね１００ｐｐｍ以下であることを意味する。化学的に不活性な物質とは、液体層との接触や磁性体粒子の操作（すなわち、ゲル状媒体中で磁性体粒子を移動させる操作）において、液体層、磁性体粒子や磁性体粒子に固定された物質に、化学的な影響を及ぼさない物質を指す。

【0028】

第一の液体層３１中には、磁性体粒子７１が含まれている。この磁性体粒子７１は、核酸等の特定の目的物質が表面に固定されたものであってもよい。磁性体粒子７１への目的物質の固定は、例えば、第一の液体層３１中で行われる。予め目的物質を表面に固定させた磁性体粒子７１が第一の液体層３１中に添加されてもよい。また、第二の液体層３２およびゲル状媒体層２１が装填された容器１０の開口部から、目的物質を表面に固定させた磁性体粒子７１を含む液体を、ゲル状媒体層２１上に注入してもよい。

【0029】

磁性体粒子７１は、磁場の作用により、容器の内壁面に引き寄せられる。磁場操作には、永久磁石（例えばフェライト磁石やネオジム磁石）や電磁石等の磁力源を用いることができる。容器の内壁面に引き寄せられた磁性体粒子７１は凝集体を形成し、第一の液体層３１を構成する液体が、磁性体粒子の凝集体内に取り込まれる場合がある。また、第一の液体層３１内に、目的物質以外の夾雑物が含まれる場合は、夾雑物も磁性体粒子の凝集体に取り込まれる場合がある。特に、変性されたタンパク質等は、磁性体粒子同士を付着させる作用を有し、これらの夾雑物も磁性体粒子の凝集体に取り込まれる。

【0030】

磁石９を第一の液体層３１の側面からゲル状媒体層２１の側面へと移動させると、磁性体粒子７１は、第一の液体層３１からゲル状媒体層２１内へと進入する。この際、磁性体粒子７１の周囲に液滴として物理的に付着している水系液体の大半は、磁性体粒子７１がゲル状媒体層２１の表面から内部に進入する際に、粒子表面から脱離して液体層３１の液分に残る。一方、磁性体粒子７１は、粒子に固定された目的物質を保持したまま、ゲル状媒体層２１内を容易に移動できる。

【0031】

ゲル状媒体層２１内への磁性体粒子７１の進入および移動により、ゲル状媒体が穿孔されるが、チクソトロピックな性質により、ゲルは自己修復する。磁場操作により、磁性体粒子がゲル内を移動する際、剪断力が付与されると、チクソトロピックな性質により、ゲルは局所的に流動化（粘性化）する。そのため、磁性体粒子は、流動化した部分を穿孔しながら、ゲル内を容易に移動できる。磁性体粒子が通過した後、剪断力から解放されたゲルはすみやかに元の弾性状態に復元する。そのため、磁性体粒子が通過した部分に貫通孔が形成されず、磁性体粒子の穿孔部分を介して、液体がゲル内へ流入することは、ほとんど生じない。

【0032】

上記のようなゲルのチクソトロピックな性質による復元力が、磁性体粒子７１に付随する液体を搾り取る作用を奏する。そのため、磁性体粒子７１が凝集体となり、その中に液滴が取り込まれた状態でゲル状媒体層２１内へ移動した場合でも、ゲルの復元力によって、磁性体粒子と液滴とが分離され得る。一方、磁性体粒子の凝集体に取り込まれた変性タンパク質等の夾雑物は、磁性体粒子同士を強固に付着させているため、ゲルの復元力によって磁性体粒子から分離することは困難である。そのため、これらの夾雑物は、磁性体粒子の凝集体内に取り込まれたままで、ゲル状媒体層内を移動する。

【0033】

磁石９を第一の液体層３１の側面からゲル状媒体層２１の側面へと移動させると、磁性体粒子７１が、第一の液体層３１からゲル状媒体層２１内へと進入するとともに、ゲル状媒体層２１内に装填されている磁性固体６０が磁石９へ引き寄せられる（図１（Ｃ））。そのため、磁性固体６０は、磁性体粒子７１の凝集体と一体となって、ゲル状媒体層内を移動する。

【0034】

ゲル状媒体層２１内を通過した磁性体粒子７１および磁性固体６０は、磁場操作により、ゲル状媒体層２１から第二の液体層３２へと移動させられる（図１（Ｄ））。上述のように、ゲル状媒体には、磁性体粒子や磁性固体が通過した部分には貫通孔が形成されないため、第一の液体層３１から、第二の液体層３２への液体の流入はほとんど生じない。

【0035】

第二の液体層３２の側面に沿って磁石９を移動させると、磁性固体６０および磁性体粒子７１も、磁石９の移動に伴って第二液体層内を移動する。この際、凝集体を形成していた磁性体粒子７１が、第二液体層内で分散される（図１（Ｅ））。このように、本発明の磁性体粒子の操作方法では、液体層内に、磁性体粒子と磁性固体とを共存させ、磁場操作によって、磁性固体とともに磁性体粒子を移動させることによって、凝集体を形成していた磁性体粒子が、液体層内で分散される。

【0036】

そのため、第二の液体層３２が洗浄液である場合には、磁性体粒子に付着していた変性タンパク質等の夾雑物を洗浄除去できる。第二の液体層３２が溶出液である場合には、磁性体粒子が分散された状態で、粒子に固定されていた核酸等の目的物質の溶出（遊離）が行われるため、目的物質の回収効率が高められる。また、第二の液体層３２が、磁性体粒子に固定化されている目的物質との反応を生じる物質を含む場合、磁性体粒子が分散された状態で、反応が行われるため、反応効率が高められる。

【0037】

液体層内で、磁性固体とともに磁性体粒子を移動させることによって、磁性体粒子が分散される原理は必ずしも明らかではない。磁性固体および磁性体粒子の動きを目視観察した範囲では、磁性固体６０が容器１０の壁面に沿って移動する際に、容器壁面と磁性固体との摩擦抵抗や、磁石の移動に対する磁性固体の追随の遅延に伴って、磁性固体が微振動していることが判明している。この磁性固体の微振動が、磁性固体周辺に存在する磁性体粒子を分散させる作用を有するか、あるいは、磁性固体の微振動が、容器壁面と磁性固体との間に存在する磁性体粒子の凝集体を粉砕させる作用を有するため、磁性体粒子が、液体層内で迅速に分散されると推定される。

【0038】

本発明の粒子操作方法は、液体層内で磁性体粒子を分散させることに特徴を有しており、ゲル状媒体内を通過させた磁性体粒子に限らず適用可能である。例えば、凝集体となった磁性体粒子を容器の開口部から液体層内に投入し、磁性固体との共存下で磁場操作を行うことによっても、本発明を実施できる。

【0039】

ゲル状媒体内を通過させた磁性体粒子に対して、本発明の粒子操作を行えば、密閉系を保持したまま、液体層内で磁性体粒子を分散可能である。すなわち、図１や図２に示すように、液体層３２，１３２，１３３，１３４は、ゲル状媒体層間やゲル状媒体層と容器との間に保持されているため、密閉系を保ったままで外部からアクセスできない。ピペット操作によりこれらの液体層中の磁性体粒子の分散を行う場合、ゲル状媒体層を貫通させてピペットの先端を液体層内に挿入する必要があり、密閉系を保持できない。これに対して、本発明の方法は、密閉系を保持したまま、液体層中に磁性体粒子を分散できるため、外部からのコンタミネーションを抑制できる。さらに、後に実施例と比較例との対比で示すように、本発明の方法は、ピペット操作よりも、磁性体粒子の分散効率が高く、目的物質の洗浄や回収を高効率化できる。

【0040】

［磁性体粒子］
本発明に用いられる磁性体粒子７１は、磁場の作用によって、液体中あるいはゲル状媒体中において、凝集、分散、移動等の操作を行い得るものである。磁性体としては、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。具体的には、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、ヘマタイト（Ｆｅ_２Ｏ_３、またはαＦｅ_２Ｏ_３）、マグヘマイト（γＦｅ_２Ｏ_３）、チタノマグネタイト（ｘＦｅ_２ＴｉＯ_４・（１−ｘ）Ｆｅ_３Ｏ_４、イルメノヘマタイト（ｘＦｅＴｉＯ_３・（１−ｘ）Ｆｅ_２Ｏ_３、ピロタイト（Ｆｅ_１−ｘＳ（ｘ＝０〜０．１３）‥Ｆｅ_７Ｓ_８（ｘ〜０．１３））、グレイガイト（Ｆｅ_３Ｓ_４）、ゲータイト（αＦｅＯＯＨ）、酸化クロム（ＣｒＯ_２）、パーマロイ、アルコニ磁石、ステンレス、サマリウム磁石、ネオジム磁石、バリウム磁石が挙げられる。

【0041】

液体中およびゲル状媒体中での粒子操作を容易とする観点から、磁性体粒子の粒径は０．１〜２０μｍ程度が好ましく、０．５〜１０μｍ程度がより好ましい。磁性体粒子の形状は、粒径が揃った球形が望ましいが、粒子操作が可能である限りにおいて、不規則な形状で、ある程度の粒径分布を持っていてもよい。磁性体粒子の構成成分は単一物質でもよく、複数の成分からなるものでも良い。

【0042】

磁性体粒子は、特定の目的物質を特異的に固定できるものが好ましい。粒子表面あるいは粒子内部に目的物質を保持できるものであれば、固定方法は特に限定されず、物理吸着、化学吸着等の各種公知の固定化メカニズムが適用可能である。例えば、ファンデルワールス力、水素結合、疎水相互作用、イオン間相互作用、π−πスタッキング等の種々の分子間力により、粒子の表面あるいは内部に目的物質が固定される。

【0043】

粒子に固定される目的物質としては、例えば核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド等の生体由来物質や細胞等が挙げられる。目的物質が生体由来物質である場合は、分子認識等により、粒子表面に目的物質が固定されてもよい。例えば、目的物質が核酸である場合は、シリカコーティングされた磁性体粒子を用いることにより、粒子表面に核酸を特異的に吸着させることができる。また、目的物質が、抗体(例えば、標識抗体)、受容体、抗原およびリガンド等である場合、粒子表面のアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アピジン、ピオチン、ジゴキシゲニン、プロテインＡ、プロテインＧ等により、目的物質を粒子表面に選択的に固定できる。

【0044】

磁性体粒子としては、上記磁性体の表面に、目的物質を特異的に固定させるための物質、例えば、各種官能基を有する化合物、シリカ、ストレプトアビジン、黄色ブドウ球菌、プロテインＡ、プロテインＧ，免疫グロブリン等が付着したもの、あるいは当該物質で被覆されたものが好適に用いられる。このような磁性体粒子は、例えば、ライフテクノロジーズから販売されているＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）や、東洋紡から販売されているＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）等の市販品を用いることもできる。

【0045】

［磁性固体］
本発明に用いられる磁性固体６０は、磁性体であればその材料は特に限定されず、上記磁性体粒子を構成する磁性体として例示したのと同様に、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。磁性固体の形状は特に限定されず、球状、多面体状、偏平形状、棒状等であってもよい。

【0046】

磁性固体は、磁性体粒子よりも粒径が大きいことが好ましい。なお、磁性固体が非球状の場合は、長径を粒径とみなす。磁性固体の粒径は、５０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましく、１５０μｍ以上がさらに好ましい。磁性体粒子が凝集体を形成している場合であっても、粒径の大きい磁性固体の共存下で、磁場操作によって移動させることにより、磁性体粒子を液体中に分散させることができる。磁性固体の粒径は、磁性体粒子の粒径の１０倍以上が好ましく、２０倍以上がより好ましく、３０倍以上がさらに好ましく、５０倍以上が特に好ましい。

【0047】

磁性固体は、容器内で移動可能なものであれば、粒径の上限は特に限定されない。例えば、容器が管状であり、磁性固体が球状である場合、磁性固体の粒径が、容器の内径よりも小さければよい。磁場による操作を容易とする観点から、磁性固体の粒径は１０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以下がより好ましく、３ｍｍ以下がさらに好ましい。また、磁性固体の粒径は、磁性体粒子の粒径の１０００００倍以下が好ましく、５００００倍以下がより好ましく、１００００倍以下がさらに好ましい。

【0048】

磁性固体としては、ボールベアリング用の鉄球やステンレス球等の市販の金属球等をそのまま用いることができる。また、磁性固体に機能性を持たせることもできる。例えば、鉄やステンレス等の金属材料の表面にコーティングを施すことにより、試薬や試料に対する耐腐食性を持たせることができる。

【0049】

特に、磁性固体が粒子操作デバイス内で、液体層やゲル状媒体に長時間接触させられる場合、磁性固体を構成する鉄等の金属が腐食しやすく、腐食成分（例えば液体層中に溶出した金属イオン）が、試薬や試料の反応（例えば酵素反応や、抗原抗体反応）や、試料の固定および溶出に影響を及ぼす場合がある。これに対して、磁性固体が金属表面に腐食を防止するためのコーティング層を有することにより、金属の腐食による影響を抑制できる。

【0050】

金属表面に耐腐食性を持たせるためのコーティングが施される場合、コーティング材料は、ゲル状媒体や液体層内での金属の腐食を防止できるものであれば、特に限定されず、金属、金属酸化物等の無機材料でも、樹脂材料でもよい。金属材料としては、金、チタン、プラチナ等が挙げられる。樹脂材料としては、テトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂やエポキシ系樹脂等が挙げられる。また、コーティング材料としては、試薬や試料との反応の阻害や、試料の固定および溶出への影響が少ないものが好ましく用いられる。

【0051】

金属表面へのコーティング層の形成方法は特に限定されない。例えば、金属表面に、耐腐食性を持たせるために、金、チタン、プラチナ等の金属コーティングが施される場合、メッキ法やドライプロセス（蒸着、スパッタ、ＣＶＤ等）が好ましく採用される。金属表面に樹脂コーティングが施される場合、ウェットコーティングが好ましく採用される。

【0052】

物理的な衝撃等によって、金属の腐食を防止するためのコーティングの剥がれや傷付きが生じると、金属が露出し、露出部分から金属の腐食を生じる場合がある。そのため、コーティング層の厚みは、数μｍ〜数百μｍ程度が好ましい。コーティング層をこのような厚みとするためには、ウェットコーティングにより、樹脂層を形成することが好ましい。樹脂材料としては、樹脂溶液や液状接着剤等を用いることができる。液状接着剤としては、金属用の接着剤として市販されているものをそのまま用いてもよい。例えば、二液硬化型のエポキシ系接着剤は、常温での硬化が可能であり、上記厚みのコーティング層を容易に形成できるため、金属の腐食を防止するためのコーティング材料として好適に用いられる。

【0053】

ウェットコーティングにより樹脂溶液の乾燥や硬化が行われる場合、コーティング層の剥がれが生じないように、乾燥条件が設定されることが好ましい。例えば、コーティング後の磁性固体を静置して乾燥あるいは硬化する場合は、樹脂材料が付着し難い材料や、コーティング液の溶媒に対する耐溶剤性を有する材料上に、コーティング後の磁性固体を静置することが好ましい。

【0054】

磁性固体の表面には、耐腐食性コーティング以外のコーティング層を設けることもできる。例えば、磁性体粒子に固定される物質とは別の物質が磁性固体表面に固定されるように、磁性固体表面を、種々の機能性分子でコートしてもよい。その他、磁性固体表面を、発光物質や蛍光物質等の光学材料でコートしてもよい。このような構成によれば、磁性固体の位置を光学的に検出可能となるため、例えば、粒子操作を自動化する際、磁性固体や磁性体粒子の位置検出や位置補正に応用できる。また、磁性固体の、材質、大きさ、形状を調整することにより、マイクロ流路系における、磁場操作によるバルブ、ポンプ動作のためのアクチュエーターとしての機能を磁性固体に兼用させることもできる。その他、磁性固体を、磁気共鳴による流体制御素子の駆動用電力の受容体とすることや、電磁誘導による発熱体として化学反応の熱源に利用することもできる。

【0055】

図１に示す実施形態では、磁性固体６０が予めゲル状媒体層２１内に装填されている形態を例示したが、磁性固体は、第二の液体層３２内に予め装填されていてもよい。また、第一の液体層３１内に磁性固体を投入してもよく、ゲル状媒体層２１上に磁性固体を載置しておき、そこへ液体を注入してもよい。また、磁性体粒子や液体とともに、容器内へ磁性固体を投入してもよい。なお、図１に示す実施形態では、１つのデバイス内で１個の磁性固体が用いられているが、複数の磁性固体を用いてもよい。

【0056】

［容器］
本発明では、容器１０内に充填された液体層内で、磁性体粒子の操作が行われる。容器内で磁性固体を移動可能であり、液体やゲル状媒体を保持できるものであれば、その材質や形状は特に限定されない。例えば内径１〜２ｍｍ程度、長さ５０ｍｍ〜２００ｍｍ程度の直管状構造体（キャピラリー）や、幅１〜２ｍｍ程度、深さ０．５〜１ｍｍ程度、長さ５０ｍｍ〜２００ｍｍ程度の直線状溝が形成された平面板材の上面に、別の平面板材を貼り合わせた構造体等が用いられる。

【0057】

容器の大きさを極力小さくすれば、微小液体操作用マイクロデバイス、または微小液体操作用チップとしても使用できる。なお、容器の形状は管状や面状に限定されず、粒子の移動経路が、十字あるいはＴ字等の分岐を有する構造であってもよい。また、エッペンドルチューブ等の錐形状の容器を用いてもよい。

【0058】

本発明では、磁場操作によって、容器１０内の磁性体粒子７１を移動可能であるため、試料投入後の容器を密閉系とすることができる。容器を密閉系とすれば、外部からのコンタミネーションを防止できる。そのため、ＲＮＡ等の分解しやすい物質を磁性体粒子に固定して操作する場合に、特に有用である。容器を密閉系とする場合、容器の開口部を熱融着する方法や、適宜の封止手段を用いて封止することができる。操作後の粒子や水系液体を容器外に取り出す必要がある場合は、樹脂栓等を用いて、取り外し可能に開口部を封止することが好ましい。

【0059】

磁場操作によって、磁性体粒子や磁性固体は、容器の内壁面に沿って移動する。すなわち、容器の内壁面は、磁性体粒子および磁性固体の搬送面となる。そのため、容器の内壁面が撥水性であれば、磁性体粒子からの液体の分離が促進され、固液分離が高効率化され得る。容器の内壁面は、２５℃における水系液体の接触角が９５°〜１３５°程度であることが好ましい。

【0060】

このような特性を備える材質としては、ポリプロピレンやポリエチレン等のポリオレフィン、テトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン等の樹脂材料が挙げられる。これらの素材の他、セラミック、ガラス、シリコーン、金属等も用いられ得る。容器内壁面の撥水性を高めるために、フッ素系樹脂やシリコーン等によるコーティングが行われてもよい。

【0061】

容器内壁面の表面粗さは特に限定されない。算術平均粗さＲａが０．１μｍ以下の平滑な内壁面を有する容器、およびＲａが１μｍ以上の粗面の内壁面を有する容器を用いて本発明者らが検討を行ったところ、いずれの容器においても、磁性体粒子が液体中に効率的に分散され、高い洗浄・回収効率で、目的物質を精製できることが確認されている。

【0062】

粒子の操作中あるいは操作後に、吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率変化等の光学的測定が行われる場合や、光照射が行われる場合は、光透過性を有する容器が好ましく用いられる。また、容器が光透過性であれば、容器内の粒子操作の状況を目視確認できることからも好ましい。一方、液体や磁性体粒子等を遮光する必要がある場合は、光透過性を有していない金属等の容器が好ましく用いられる。使用目的等によって、光透過部分と遮光部分とを有する容器を採用することもできる。

【0063】

［液体］
液体層３１，３２を構成する液体は、磁性体粒子表面に固定された目的物質の、抽出、精製、反応、分離、検出、分析等の化学操作の場を提供する。液体の種類は特に限定されないが、ゲル状媒体を溶解しないものが好ましい。そのため、液体としては、水溶液や、水と有機溶媒の混合溶液等の水系液体が好ましく用いられる。液体は、これら化学操作のための単なる媒体として機能し得る他に、化学操作に直接関与するか、あるいは当該操作に関与する化合物を成分として含んでいてもよい。液体に含まれる物質としては、磁性体粒子に固定された反応性物質と反応する物質、当該反応によって磁性体粒子の表面に固定された物質と更に反応する物質、反応試薬、蛍光物質、各種の緩衝剤、界面活性剤、塩類、およびその他の各種補助剤、並びに、アルコール等の有機溶剤等を例示することができる。水系液体は、水、水溶液、水懸濁液等の任意の態様で提供され得る。容器中に、ゲル状媒体層を間に介して複数の液体層が装填される場合、各液体層を構成する液体は同一であってもよく、異なるものでもよい。

【0064】

［ゲル状媒体］
ゲル状媒体層２１を形成するゲル状媒体は、粒子操作前においてゲル状、若しくはペースト状であればよい。前述のごとく、ゲル状媒体は、液体層３１，３２の液体に不溶性または難溶性であり、化学的に不活性な物質であることが好ましい。

【0065】

ゲル状媒体の材料や組成等は、特に限定されない。ゲル状媒体は、例えば、液体油脂、エステル油、炭化水素油、シリコーン油等の非水溶性または難水溶性の液体物質に、ゲル化剤を添加してゲル化することにより形成される。ゲル化剤によって形成されるゲル（物理ゲル）は、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用、静電的吸引力等の弱い分子間結合力により、三次元ネットワークを形成しており、熱等の外部刺激により可逆的にゾル・ゲル転移する。ゲル化剤としては、ヒドロキシ脂肪酸、デキストリン脂肪酸エステル、およびグリセリン脂肪酸エステル等が用いられる。ゲル化剤の使用量は、非水溶性または難水溶性の液体物質１００重量部に対して、例えば０．１〜５重量部の範囲で、ゲルの物理特性等を勘案して適宜に決定される。

【0066】

ゲル化の方法は特に限定されない。例えば、非水溶性または難水溶性の液体物質を加熱し、加熱された当該液体物質にゲル化剤を添加し、ゲル化剤を完全に溶解させた後、ゾル・ゲル転移温度以下に冷却することで、物理ゲルが形成される。加熱温度は、液体物質およびゲル化剤の物性を考慮して適宜に決定される。

【0067】

また、ヒドロゲル材料（例えば、ゼラチン、コラーゲン、デンプン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、あるいはこれらの誘導体等）を、液体に平衡膨潤させることによって調製されたものを、ゲル状媒体として用いることもできる。ヒドロゲルとしては、ヒドロゲル材料を化学架橋したものや、ゲル化剤（例えばリチウム、カリウム、マグネシウム等のアルカリ金属・アルカリ土類金属の塩、或いはチタン、金、銀、白金等の遷移金属の塩、さらには、シリカ、カーボン、アルミナ化合物等）によってゲル化したもの等を用いることもできる。

【0068】

［ゲル状媒体および液体の装填］
容器内へのゲル状媒体および液体の装填は、適宜の方法により行い得る。管状の容器が用いられる場合、装填に先立って容器の一端の開口が封止され、他端の開口部からゲル状媒体および水系液体が順次装填されることが好ましい。内径が１〜２ｍｍ程度のキャピラリーのような小さな構造体へ、ゲル状媒体を装填する場合、例えば、アーロック式シリンジに金属製注射針を装着して、キャピラリー内の所定位置へゲル状媒体を押し出す方法により、装填が行われる。

【0069】

容器内に装填されるゲル状媒体および液体の容量は、操作対象となる磁性体粒子の量や、操作の種類等に応じて適宜に設定され得る。容器内に複数のゲル状媒体層や液体層が設けられる場合、各層の容量は同一でも異なっていてもよい。各層の厚みも適宜に設定され得るが、操作性等を考慮した場合、層厚みは、例えば、２ｍｍ〜２０ｍｍ程度が好ましい。

【0070】

［粒子操作用デバイスおよびキット］
容器内へのゲル状媒体および液体の装填は、粒子操作の直前に行われてもよく、粒子操作前に十分な時間をおいて行われてもよい。前述のように、ゲル状媒体が液体に不溶または難溶である場合は、装填後に長時間が経過しても、両者の間での反応や吸収はほとんど生じない。本発明の磁性体粒子操作用デバイスは、液体およびゲル状媒体が予め容器内に装填された状態で提供することができる。また、デバイス内に予め磁性体粒子や磁性固体を装填した状態で提供することもできる。

【0071】

デバイス本体とは別に、磁性体粒子が単体あるいは液体中に分散された状態で、独立に提供されてもよい。この場合、磁性体粒子は、デバイスを作製するためのキットの一構成部材として提供されてもよい。

【0072】

磁性固体も、デバイス本体とは別に提供されてもよい。磁性体粒子と磁性固体とを液体中に共存させた状態で、キットの構成部材として提供されてもよい。なお、磁性固体がゲル状媒体中に装填された状態や、液体中に分散された状態で、デバイスまたはキットが提供される場合、デバイスやキットの保管状態で、磁性固体が液体層やゲル状媒体に長時間接触させられる。そのため、磁性固体の腐食や劣化を防止する目的で、前述のように、金属表面にコーティングが施された磁性固体を用いることが好ましい。

【0073】

本発明のキットは、例えば、容器、ゲル状媒体、液体等の他の構成部材とともに、磁性体粒子や磁性固体を、キットの構成要素として含めることができる。また、容器内に液体および／またはゲル状媒体が装填された状態で、さらにその上に、必要に応じて液体および／またはゲル状媒体を追加装填できるように、キットが構成されていてもよい。

【0074】

デバイス内あるいはキットに含まれる磁性体粒子の量は、対象となる化学操作の種類や、各水系液体の容量等に応じて適宜に決定される。例えば、容器として、内径１〜２ｍｍ程度の細長い円筒形のキャピラリーが用いられる場合の磁性体粒子の量は、通常、１０〜２００μｇ程度の範囲が好適である。

【0075】

［磁性体粒子の操作］
本発明では、目的物質が固定された磁性体粒子７１を、第一の液体層３１からゲル状媒体層２１内へ移動させることにより、固液分離（Ｂ／Ｆ分離）を行い得る。また、ゲル状媒体層２１中の磁性体粒子を、第二の液体層３２へ移動させることによって、目的物質の抽出、精製、反応、分離、検出、定性・定量分析等の化学操作を行い得る。このような磁性体粒子の操作は、各種分析に先立って行われる前処理や、目的物質の分取（分離）処理、溶解処理、混合処理、希釈処理、撹拌処理、温度調節（加熱あるいは冷却）処理等へも適用可能である。

【0076】

前記反応としては、無機化学反応や有機化学反応の他に、酵素反応、免疫化学反応等の生体物質の変化を伴う生物学的反応も含まれる。生物学的反応としては、例えば、核酸、タンパク質、脂質、糖等の生体物質の、合成系、代謝系および免疫系の反応が挙げられる。反応や分析の対象となる目的物質は、磁性体粒子に特異的に固定可能であれば、化学物質や生体物質に限定されず、核物質や放射化学物質等も適用可能である。

【0077】

＜核酸の分離・精製＞
以下では、図２を参照しながら、核酸の分離・精製を行う例について説明する。図２（Ａ）に示す管状デバイス１５０では、磁性体粒子１７１を移動させる方向に沿って、核酸抽出液１３１、第一の洗浄液１３２、第二の洗浄液１３３、および核酸溶出液１３４が、それぞれの間にゲル状媒体層１２１，１２２，１２３を介して、管状の容器１１０内に装填されている。

【0078】

核酸を含む試料は特に限定されず、例えば、動植物組織、体液、排泄物等の生体試料、細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等の核酸包含体を挙げることができる。体液には血液、髄液、唾液、乳等が含まれ、排泄物には糞便、尿、汗等が含まれる。また、これらの複数の組合せを用いることもできる。細胞には血液中の白血球、血小板や、口腔細胞等の粘膜細胞の剥離細胞、唾液中白血球が含まれ、これらの組合せを用いることもできる。核酸を含む試料は、例えば、細胞懸濁液、ホモジネート、細胞溶解液との混合液等の態様で調製されてもよい。

【0079】

（核酸抽出液）
核酸の抽出を行うために用いられる核酸抽出液１３１としては、カオトロピック物質、ＥＤＴＡ等のキレート剤、トリス塩酸等を含有する緩衝液が挙げられる。また、核酸抽出液には、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤を含めることもできる。オトロピック物質としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチアン酸塩、ヨウ化カリウム、尿素等が挙げられる。カオトロピック塩は強力な蛋白変性剤で細胞のタンパク質を溶解させ細胞核内の核酸を液中に遊離させる働きがある上、核酸分解酵素の働きを抑える効果がある。また、プロテアーゼＫ等のタンパク質分解酵素を用い、核酸と結合している核タンパク質の分解を行うことにより、核酸の純度および回収率を向上し得る。

【0080】

これらの物質の存在下で、核酸は、シリカ粒子（あるいはシリカ被覆粒子）の表面に特異的に吸着する。そのため、上記の核酸を含む試料とシリカコートされた磁性体粒子を、核酸抽出液１３１中に添加すれば、核酸が磁性体粒子１７１の表面に選択的に固定される。核酸を含む試料からの核酸抽出の具体的な方法は、適宜決定することができる。例えば、特開平２−２８９５９６号公報を参考に、核酸を含む試料からの磁性体粒子を用いた核酸の抽出、精製を実施できる。

【0081】

核酸を含む試料、核酸抽出液、および磁性体粒子を、容器１１０内に投入した後は、容器１１０の上部を蓋１１９で塞ぎ、デバイスを密閉系とすることにより、外部からの汚染を防止することが好ましい。

【0082】

（磁性体粒子のゲル状媒体層への移動）
核酸抽出液中で磁性体粒子を十分に分散させ、磁性体粒子の表面に目的物質である拡散を固定化した後、核酸抽出液１３１の容器側面に磁石９を近付けると、磁石９周辺の容器内壁面に、磁性体粒子１７１が引き寄せられる（図２（Ｂ））。核酸抽出液中には試料由来の変性タンパク質等が含まれているため、磁石に引き寄せられた磁性体粒子は凝集体を形成する傾向がある。

【0083】

その後、磁石９を、容器側面に沿って移動させることにより、磁性体粒子７１は、ゲル状媒体層１２１内へ移動させられる。この際、磁石９の移動速度が過度に大きいと、ゲルが物理的に破壊され、復元力が失われる場合がある。そのため、磁石の移動速度は、０．１〜５ｍｍ／秒程度とすることが好ましい。

【0084】

磁石９をゲル状媒体層１２１の側面に近づけると、ゲル状媒体層１２１内に装填されていた磁性固体１６０が磁石９に引き寄せられる。それ以降は、磁性体粒子１７１と磁性固体１６０が一体となって、ゲル状媒体内を移動し、第一の洗浄液１３２へ移動させられる（図２（Ｃ））。

【0085】

（洗浄液）
第一の洗浄液１３２および第二の洗浄液１３３は、核酸が粒子表面に固定された状態を保持したまま、試料中に含まれる核酸以外の成分（例えばタンパク質、糖質等）や、核酸抽出等の処理に用いられた試薬等を洗浄液中に遊離させ得るものであればよい。洗浄液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の高塩濃度水溶液、エタノール、イソプロパノール等のアルコール水溶液等が挙げられる。第一の洗浄液と第二の洗浄液の組成は、同一でもよく異なっていてもよい。

【0086】

第一の洗浄液１３２の側面に沿って磁石９を移動させると、磁性固体１６０とともに磁性体粒子１７１が移動し、磁性体粒子１７１は洗浄液内で分散され（図２（Ｄ））、磁性体粒子の洗浄効率が高められる。十分に洗浄を行うために、洗浄液の側面に沿って磁石を往復運動させることが好ましい。なお、磁性固体の共存下で磁場操作を行うことによって磁性体粒子が分散させられることは、前述の通りである。

【0087】

その後、磁石９を第一の洗浄液１３２の側面から、ゲル状媒体層１２２の側面に移動させる（図２（Ｅ））。さらに、磁石９を第二の洗浄液１３３の側面へ移動させた後、磁石を往復運動させることにより、磁性体粒子を十分に分散させ、第二の洗浄液１３３中で磁性体粒子の洗浄が行われる（図２（Ｆ））。

【0088】

なお、図２では、容器１１０内に、ゲル状媒体層１２２を介して、第一の洗浄液１３２と第二の洗浄液１３３とが装填された例が示されているが、洗浄液は１種のみであってもよく、３種以上が用いられてもよい。また、分離の目的や、用途における不所望の阻害が生じない範囲において、洗浄を省略することもできる。

【0089】

磁石９を第二の洗浄液１３３側面から、ゲル状媒体層１２３の側面に移動させ、磁性体粒子１７１および磁性固体１６０を、ゲル状媒体層１２３内へ移動させる（図２（Ｇ））。さらに、磁石９を、核酸溶出液１３４の側面に移動させ、磁性体粒子１７１および磁性固体１６０を、核酸溶出液１３４内へ移動させる。

【0090】

（核酸溶出液）
核酸溶出液としては、水または低濃度の塩を含む緩衝液を用いることができる。具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、蒸留水等を用いることができる。中でも、ｐＨ７〜９に調整された５〜２０ｍＭトリス緩衝液を用いることが一般的である。核酸が固定された粒子が核酸溶出液中に移動することにより、粒子表面から核酸を遊離させることができる。核酸が固定された粒子から核酸を溶出させる具体的方法は、上記溶出液中で粒子を懸濁させる方法が挙げられる。懸濁方法、懸濁のための撹拌時間、溶出時の温度等の溶出条件は、核酸の回収量を増加させ得るように適宜決定することができる。

【0091】

核酸溶出液１３４の側面に沿って磁石９を移動させると、磁性固体１６０とともに磁性体粒子１７１が移動し、磁性体粒子１７１は核酸溶出液内で分散される（図２（Ｈ））。そのため、磁性体粒子１７１に固定されていた核酸が、効率的に脱着され、核酸溶出液内に遊離され、核酸の回収率が高められる。

【0092】

その後、必要に応じて、図２（Ｉ）に示すように、磁石９を容器の側面に沿ってゲル状媒体層１２３側へ移動させ、磁性体粒子１７１および磁性固体１６０をゲル状媒体層１２３内へ再び進入させる。この操作によって、核酸溶出液１３４から磁性体粒子１７１および磁性固体１６０が除去されるため、核酸溶出液の回収が容易となる。

【0093】

核酸溶出液内に回収された核酸は、必要に応じて濃縮や乾固等の操作を行った後、分析や反応等に供することができる。

【0094】

上記では、磁性体粒子を用いて、核酸の分離・精製を行う例を示したが、前述のごとく、磁性体粒子に固定化される目的物質は核酸に限定されず、本発明は、核酸以外の各種の目的物質に対しても適用可能である。例えば、protein Gやprotein A等の抗体を特異的に固定化可能な分子で表面がコートされた磁性体粒子を用いることで、抗体の磁性体粒子操作を行うこともできる。

【0095】

その一例として、酵素免疫吸着測定法（Enzyme-linked immuno-sorbent assay）を行う場合、磁性体粒子の表面に抗体を固定化し、磁場操作により磁性体粒子および磁性固体を順次移動させることによって、磁性体粒子の表面に固定されている第一次抗体と試料中の被検抗原（被検物質）との抗原反応；洗浄処理；酵素標識第二次抗体と被検抗原との抗原抗体反応；洗浄処理；および磁性体粒子表面に固定された第二次抗体に結合している酵素と水系液体に含まれる発色物質との問で発色反応、を、ゲル状媒層で隔てられた各液体層中で順次行うことができる。各液体層中で、磁性固体の共存下で磁性体粒子を分散させることにより、ＥＬＩＳＡの定量性を高めることができる。

【0096】

このように、目的物質の種類や、目的とする操作に応じて、デバイス内に装填される液体の種類を変更すれば、本発明は、目的物質の抽出、精製、分離のみならず、各種の反応、検出、定性・定量分析等にも応用できる。

【実施例】

【0097】

以下では、磁気ビーズを用いたヒト全血からのＤＮＡ抽出に関する実施例と比較例との対比により、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

【0098】

[実施例１]
＜管状操作デバイスの作製＞
ポリプロピレン製の管状容器１１０（内径１．８ｍｍ）に、溶出液１３４（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０）２００μＬ；ゲル状媒体層１２３；第二の洗浄液１３３（０．５Ｍ ＮａＣｌ、７０％エタノール）２００μＬ、ゲル状媒体層１２２；第一の洗浄液１３２（４ｍＭ 塩酸グアニジン、３０％エタノール）２００μＬ；ゲル状媒体層１２１；および核酸抽出液１３１（４ｍＭ塩酸グアニジン、５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、）を、底部から順に装填した（図２（Ａ）参照）。

【0099】

ゲル状媒体層１２１〜１２３は、各層の厚みが約１ｃｍとなるように、ゲル（信越化学工業製、商品名「ＫＳＧ-１５」）を充填した。ゲル状媒体層１２１を管状容器へ装填する途中で、ＳＵＳ４０３製の粒径１．２ｍｍの金属球１６０をゲル状媒体層１２１内へ装填した。また、核酸抽出液１３１内には、磁気ビーズ１７１（東洋紡製の核酸抽出キット「ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ^ＴＭ−Ｇｅｎｏｍｅ」に付属の核酸抽出用シリカコート磁気ビーズ（平均粒子径３μm））を蒸留水に再懸濁したもの）を添加した。磁気ビーズ１７１の使用量は５００μｇとした。

【0100】

このようにして、図２（Ａ）に示すように、４つの水系液体層１３１，１３２，１３３，１３４と、３つのゲル状媒体層１２１，１２２，１２３とが交互に重層され、ゲル状媒体層１２１内に磁性固体である金属球１６０を備え、核酸抽出液１３１内に磁気ビーズ１７１を有する管状デバイスを作製した。

【0101】

＜ＤＮＡ抽出操作＞
抗凝固剤としてＥＤＴＡが添加されたヒト全血５０μＬを、管状デバイスの開口部から、核酸抽出液１３１内に投入した。マイクロピペットを用いて核酸抽出液内で血液および磁気ビーズを十分に撹拌することで、ＤＮＡを遊離させ、磁気ビーズの表面に吸着させた。その後、容器１１０の開口部を蓋で閉じ、容器を密閉系とした。

【0102】

次に、ネオジム磁石（直径６ｍｍ、長さ２３ｍｍの円柱形、二六製作所製 商品名「ＮＥ１２７」）を、管状デバイスの側面に近付け、核酸抽出液１３１内のＤＮＡが表面に固定された磁気ビーズ１７１を磁石９の近傍に集めた（図２（Ｂ））。その後、核酸抽出液１３１の側面から、ゲル状媒体層１２１の側面に向けて磁石９を移動させ、磁気ビーズ１７１をゲル状媒体層１２１内へ進入させた。その際、ゲル状媒体層１２１内に装填されていた金属球１６０も、磁気ビーズ１７１と一体となって、磁石９に引き寄せられた（図２（Ｃ））。

【0103】

ゲル状媒体層１２１の側面から第一の洗浄液１３２の側面に向けて磁石９を移動させ、金属球１６０を伴った状態のまま磁気ビーズ１７１を第一の洗浄液内に移動させた。第一の洗浄液１３２の側面に沿って磁石９を往復運動させると、金属球１６０が磁石９に追随するように移動し、磁気ビーズ１７１が洗浄液１３２内で分散することが目視で確認された（図２（Ｄ））。

【0104】

その後、同様の手順で、磁石９を容器の側面に沿って移動させることにより、第一の洗浄液１３２内の磁気ビーズ１７１および金属球１６０を、ゲル状媒体層１２２内へと進入させ（図２（Ｅ））、さらに第二の洗浄液１３３内で磁石を往復運動させ、洗浄液内で磁気ビーズ１７１を分散させた（図２（Ｆ））。その後、磁石９を容器の壁面に沿って移動させることにより、磁気ビーズ１７１および金属球１６０を、ゲル状媒体層１２３内へと進入させ（図２（Ｇ））、さらに核酸溶出液１３４内で磁石を往復運動させ、核酸溶出液内で磁気ビーズを分散させ、磁気ビーズ表面からＤＮＡを脱着させ、核酸溶出液内に遊離させた（図２（Ｈ））。

【0105】

最後に、磁石９を容器の側面に沿って移動させることにより、ＤＮＡを脱着後の磁気ビーズ１７１を、金属球１６０とともに、核酸溶出液１３４からゲル状媒体層１２３内へ再進入させた（図２（Ｉ））。核酸溶出液１３４のゲル状媒体層１２３との界面近傍のポリプロピレン管表面に、カッターナイフを用いて切れ込みを入れて、管を破断させ、開口部から核酸溶出液１３４を回収した。

【0106】

[比較例１]
実施例１と同様に、管状容器内に水系液体層とゲル状媒体層とが交互に重層された管状デバイスを作製した。ただし、比較例１では、ゲル状媒体層１２１内への金属球の装填が行われなかった。このデバイスを用いて、実施例１と同様に磁石を移動させることによる粒子操作を行った。比較例１でも、実施例１と同様に、洗浄液１３２，１３３および核酸溶出液１３４の側面で磁石を往復運動させたが、磁気ビーズは凝集状態を保っており、液体層内で分散されなかった。

【0107】

[比較例２]
比較例２では、ゲル状媒体層を備えるデバイスを用いずに、磁気ビーズを用いた核酸抽出キット（東洋紡製 「ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ^ＴＭ−Ｇｅｎｏｍｅ」）の標準プロトコールに従って、ピペット操作により、全血からのＤＮＡの抽出を行った。

【0108】

まず、容量１．５ｍＬのマイクロチューブにヒト全血５０μＬを分注し、溶出液３７５μＬおよび磁気ビーズ分散液２０μＬを加え、ボルテックスミキサーで約１０分間激しく混合して、ＤＮＡを遊離させ、磁気ビーズの表面に吸着させた。その後、マイクロチューブを磁気スタンドにセットして，約３０秒間放置することによって磁性ビーズを集めた後、マイクロピペットを用いて上清を除去した。

【0109】

マイクロチューブ内に、第一の洗浄液４５０μＬを加え、マイクロピペットを用いて、洗浄液内に磁気ビーズを分散させた後、マイクロチューブを磁気スタンドにセットして，約３０秒間放置することによって磁性ビーズを集めた後、マイクロピペットを用いて上清を除去した。第一の洗浄液を用いて同様の操作をもう一度行った後、今度は、第二の洗浄液４５０μＬを用いて同様の操作による洗浄を２回繰り返した。

【0110】

洗浄後の磁気ビーズを、５０μＬの溶出液に、ピペット操作によって分散させ、磁気ビーズ表面からＤＮＡを脱着させ、溶出液内に遊離させた。マイクロチューブを磁気スタンドにセットして，約３０秒間放置することによって磁性ビーズを集めた後、マイクロピペットを用いて上清の溶出液を回収した。

【0111】

[評価]
各実施例および比較例で回収した溶出液のＵＶ吸収スペクトルを、分光光度計（島津製作所製「ＢｉｏＳｐｅｃ ｎａｎｏ」）により測定した。結果を図３に示す。また、ＵＶ吸収スペクトルから求めた、波長２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍにおける吸光度の比（Ａ_２６０／Ａ_２８０、およびＡ_２６０／Ａ_２３０）を表１に示す。

【0112】

【表1】

【0113】

実施例１のＵＶスペクトルでは、ＤＮＡに特徴的な波長２６０ｎｍの吸収ピーク、および２３０ｎｍ付近のピークの谷が観察され、２６０ｎｍと２３０ｎｍの吸光度の比（Ａ_２６０／Ａ_２３０）は約１．３であった。また、ＤＮＡの精製度の指標となる２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比が約１．８であり、純度の高いＤＮＡが得られていることがわかる。

【0114】

一方、比較例１および比較例２では、純度の高いＤＮＡでは２３０ｎｍ付近に現れるピークの谷が２４０ｎｍ付近にシフトしており、夾雑成分が多く残留していることがわかる。ピペット操作により磁気ビーズの分散を行った比較例２では、目視観察では実施例１と同様に液体中に磁気ビーズが分散されていた。しかし、図３および表１の結果から、ピペット操作では、磁気ビーズの分散および洗浄が不十分であり、夾雑成分が残留していると考えられる。

【0115】

以上の結果から、血液のように磁気ビーズの凝集塊を生じやすい試料を用いる場合でも、本発明の方法によれば、従来のピペット操作による方法よりも効率的に磁気ビーズを分散させることができ、結果として、目的物質であるＤＮＡを高純度で得られることがわかる。

【0116】

［実施例２：コーティング層を有する磁性固体を用いた粒子操作］
上記実施例１で磁性固体として用いたＳＵＳ４０３製の金属球を、２Ｍ塩酸グアニジンを含む核酸抽出用の緩衝液（５０μＬ）に浸漬し、１週間後に目視観察したところ、金属球表面が腐食していた。実施例１では、管状操作デバイス内に磁性固体を装填後、直ちにＤＮＡ抽出操作を行うため、金属球をそのまま用いても問題がなかったが、金属球が高塩濃度溶液等に長時間接触する場合（例えば、デバイスを作成後、実用に供するまでに長時間保管される場合）は、金属球の腐食が懸念される。そこで、実施例２では、金属球の表面に、二液室温硬化型のエポキシ系接着剤を塗布し、１０分間室温で乾燥・硬化させたものを磁性固体として用いた。エポキシ樹脂層がコーティングされた金属球を、２Ｍ塩酸グアニジンを含む核酸抽出用の緩衝液（５０μＬ）に浸漬し、１週間後に目視にて観察したところ、浸漬前と変化がなく、腐食はみられなかった。

【0117】

＜管状操作デバイスの作製およびＤＮＡ抽出操作＞
磁性固体として、ＳＵＳ４０３製の粒径１．２ｍｍの金属球をそのまま用いる代わりに、上記のエポキシ樹脂層がコーティングされた金属球を、２Ｍ塩酸グアニジンを含む核酸抽出用の緩衝液に１週間浸漬したものを用いた。それ以外は上記実施例１と同様に、管状操作デバイスを作製し、磁場操作によりＤＮＡの抽出を行った。

【0118】

核酸溶出液のＵＶ吸収スペクトルを測定したところ、実施例１と同様に（Ａ_２６０／Ａ_２３０）が大きく、純度の高いＤＮＡが得られていることが確認された。この結果から、金属の表面に、液体層内での腐食を防止するためのコーティング層が形成された場合でも、磁気ビーズへのＤＮＡの固定や溶出が阻害されることなく、目的物質を効率的に高純度で得られることがわかる。

【符号の説明】

【0119】

５０ 磁性体粒子操作デバイス
１０ 容器
２１ ゲル状媒体層
３１，３２ 液体層
６０ 磁性固体
７１〜７３ 磁性体粒子
９ 磁石
１５０ 核酸抽出用粒子操作デバイス
１１０ 管状容器
１２１〜１２３ ゲル状媒体（シリコーンゲル）
１３１ 液体層（核酸抽出液）
１３２，１３３ 液体層（洗浄液）
１３４ 水系液体（核酸溶出液）
１６０ 磁性固体（金属球）
１７１ 磁性体粒子（磁気ビーズ）

【図1】

【図2】

【図3】