特許 6848273 細胞培養装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6848273

(24)【登録日】2021年3月8日

(45)【発行日】2021年3月24日

(54)【発明の名称】細胞培養装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20210315BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20210315BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20210315BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 C

   C12M3/00 B

   C12N5/0775

【請求項の数】4

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-171610(P2016-171610)

(22)【出願日】2016年9月2日

(65)【公開番号】特開2018-33419(P2018-33419A)

(43)【公開日】2018年3月8日

【審査請求日】2019年8月26日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(72)【発明者】

【氏名】平岡 真希子

(72)【発明者】

【氏名】山口 達哉

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−２２２０６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１４７６７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５００００４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、前記細胞培養容器と前記培養液貯留容器とを接続するための流路管をＣＯ_２インキュベーター内に設置して細胞の培養を行う細胞培養装置であって、前記培養液貯留容器の３７℃における酸素透過度が１５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、二酸化炭素透過度が７００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、および前記流路管の３７℃における酸素透過度が１５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上１０００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下であり、二酸化炭素透過度が４５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上５０００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下である、装置。

【請求項2】

前記培養液貯留容器の厚みは３０〜３００μmである、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記細胞培養容器は、中空糸膜が複数本内挿され、中空糸膜内腔側と中空糸膜外腔側が区画されたものである、請求項１または２に記載の装置。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれかに記載の装置を用いる幹細胞の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞を培養するための細胞培養装置に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞は臓器や組織を形成し得る細胞であり、成体であってもほとんどの臓器や組織に存在していると考えられている。幹細胞のうち胚細胞（ＥＳ細胞）は万能細胞であり全ての組織や臓器に分化する能力を持っている。一方、体性幹細胞は全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化する。ヒト組織から採取できる体性幹細胞は、患者自身から採取でき拒絶反応の恐れがないため再生医療に対する移植材料として注目されている。

【0003】

ヒトにおける体性幹細胞は、現在までに間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、網膜幹細胞、角膜内皮幹細胞などが知られている。しかし、幹細胞が組織に含まれる割合は極めて微量である。

【0004】

体外で培養した体性幹細胞を、同一人又は他人の治療に使用するという再生医療が発達し、一部では実用化され始めている。このような再生医療に於いては、人体から採取した少量の細胞を体外において移植に必要な細胞数にまで増やす作業が必要となる。また、体外において培養する際は、培養細胞の汚染を防止することが重要である。

【0005】

再生医療に用いる細胞の培養は現在、細胞プロセシングセンタ（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に準拠して行われている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】平成１４年度厚生労働科学研究費補助金総括・分担研究報告書「先端医療センター等における細胞治療・再生医療開発のためのＧＭＰ準拠細胞プロセッシング指針の作成に関する研究」

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

この場合の課題として、幹細胞の培養は技術者の手によって行われるために、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点と、手動で操作することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。

【0008】

そのため、再生医療の実用化には安全で低コストの幹細胞培養が求められており、インキュベーション、培地交換作業、継代操作等を細胞培養完了まで繰り返し自動で行う自動化装置の開発が急務である。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、特定の範囲のガス透過性を有する材料を用いることにより、ガス交換装置を追加することなく細胞培養を行うことができる装置を提供するものである。

【0010】

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１） 少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、前記細胞培養容器と前記培養液貯留容器とを接続するための流路管をＣＯ_２インキュベーター内に設置して細胞の培養を行う細胞培養装置であって、前記培養液貯留容器の３７℃における酸素透過度が１５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、二酸化炭素透過度が７００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、および前記流路管の３７℃における酸素透過度が１５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上１０００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下であり、二酸化炭素透過度が４５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上５０００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下である、装置。
（２） 前記培養液貯留容器の厚みは３０〜３００μmである、（１）に記載の装置。
（３） 前記細胞培養容器は、中空糸膜が複数本内挿され、中空糸膜内腔側と中空糸膜外腔側が区画されたものである、（１）または（２）に記載の装置。
（４） （１）〜（３）のいずれかに記載の装置を用いる幹細胞の培養方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明の構成により、雑多な細胞集団の中に極少数しか存在しない間葉系幹細胞などの各種細胞を、従来法と比較して、安全、簡便かつ高効率に培養することのできる細胞培養装置の提供を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本発明の細胞培養装置の構成例の一つを示す。

【図2】本発明の実施例および比較例で用いた細胞培養装置の構成を簡略化して示す。

【図3】本発明の細胞培養容器として用いられる中空糸膜モジュールの構成例を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明の装置は、少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、前記細胞培養容器と前記培養液貯留容器とを接続するための流路管をＣＯ_２インキュベーター内に設置して細胞の培養を行う細胞培養装置であって、前記培養液貯留容器および前記流路管がガス透過性であることを特徴とする。

【0014】

前記培養装置全体の大きさについては、特に制限はないが、好ましくはＣＯ_２インキュベーター内に設置可能な小型のものである。培養装置は小型のため、複数台同時にＣＯ_２インキュベーター内に設置することも可能である。また、培養装置全体の重量については、特に制限はないが、好ましくはＣＯ_２インキュベーター内に設置可能な程度の軽量なものである。

【0015】

（細胞培養容器）
本発明において、細胞培養容器に用いる培養基材の形態は特に限定されないが、好ましくは比表面積の大きい形態である。比表面積の大きい培養基材を用いることにより、市販のＣＯ_２インキュベーター内に設置することが可能な小型培養装置を実現することができる。前記比表面積の大きい形態としては、例えば、中空糸膜、不織布、ナノファイバーなどが挙げられる。

【0016】

本発明において、細胞培養容器の大きさは、必要細胞数に応じて、選択することができる。一般に、必要細胞数が多いほど大きな細胞培養容器を用いることが好ましい。また、細胞の保有量と必要量との差が大きい場合は適宜段階的にスケールアップしても良い。例えば、中空糸膜の内表面において細胞を培養する際は、細胞数は、中空糸膜の内表面積に比例するので、体性幹細胞のように初期の細胞数が少ない場合は、培養初期は比較的小型のモジュールを用い、段階的にモジュールを大きくすることにより、大量の体性幹細胞を得ることができる。

【0017】

本発明において、培養基材として中空糸膜を用いる場合、細胞を中空糸膜表面に保持でき、溶液や低分子の物質を透過させるような構造をとることができるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、セルロースアセテート、再生セルロースなどのセルロース系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリエーテルスルホン、ポリフッ化ビニリデン等が好適に利用できる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、これらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良い。例えば、使用する中空糸膜は、親水化処理されていることが好ましい。中空糸膜を親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になる。さらに、中空糸膜への細胞の接着性向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等をコートしても良い。

【0018】

本発明において、培養基材として中空糸膜を用いる場合、内径は好ましくは２０〜５００μｍ、より好ましくは５０〜３００μｍ程度のものが利用される。膜厚は、適度な強度を保ち、かつ物質の透過性が良好な範囲で設定すればよく、１０〜１００μｍ程度が好ましい。

【0019】

本発明において、中空糸膜の細孔径は、細胞は通過しないが水、塩類、蛋白質などの培養液成分は通過するものであれば、特に限定されるものでなく、１ｎｍ〜１００ｎｍ程度が好ましく、５ｎｍ〜５０ｎｍ程度がより好ましい。

【0020】

本発明において、細胞培養容器は、例えば図６に示されるように、４つの開口部（端部導管および側部導管）を有し、培養基材である中空糸膜３２の両端においてモジュールケース３１に接着固定されている。２つの端部導管３３ａ、３３ｂはそれぞれ中空糸膜の内腔（中空部）と連通しており、例えば前記端部導管３３ａから導入された流体が中空糸膜の内腔を移動して端部導管３３ｂから導出されるように構成されている。一方、側部導管３４ａ、３４ｂは、前記モジュールケース３１の内側かつ前記中空糸膜の外側である空間（以下、単に「外腔側」とも呼ぶ。）と連通しており、例えば前記側部導管３４ａから導入された流体がモジュール１７の外腔側を移動して側部導管３４ｂから導出されるように構成されている。

【0021】

前記モジュールを用いる場合、細胞培養は、中空糸膜の内腔側または外腔側のいずれにおいて行っても良いが、内腔側で培養を行う方が好ましい。例えば、内腔側にて細胞を培養する際は、細胞縣濁液を端部導管より注入して内腔側に充填することにより細胞を中空糸膜内表面に播種した後、細胞懸濁液を培地に切り換えて灌流させ、一定期間培養を行う。この間、同時に、外腔側へも、培地を側部導管より注入し灌流させることが好ましい。培養期間中、ガス交換、細胞への栄養供給および老廃物除去のため、内腔側、外腔側ともに培地を一方向に供給し続けることが好ましい。なお、内腔側および外腔側に灌流させる培地は、並流でも良いし向流でも良い。その際、後述のポンプ等を用いることにより、適切な速度で循環させたり、供給・排出したりする。

【0022】

培養容器に中空糸モジュールを用いることにより、細胞へ常に新鮮な培地を供給することができ、培養基材にシャーレや多段フラスコ等を用いる際に必要な交換作業は不要となり、作業者の拘束時間を減らすことができる。

【0023】

（液体培地貯留容器）
本発明において、液体培地貯留容器の素材は、特に限定されないが、成形加工性に優れ、ガンマ線滅菌等に耐えうるものであり、かつ内部の様子を観察することができる透明性の高い材料であることが好ましい。具体的には、液体培地貯留容器のガス透過度は、３７℃における酸素透過度が１５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、二酸化炭素透過度が７００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上であることが好ましい。このような材料としては、ポリプロピレン（ＰＰ）（酸素透過係数：２．５×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１１．３×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）（酸素透過係数：３．０×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１２．６×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、ポリスチレン（ＰＳｔ）（酸素透過係数：３．１×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１４．１×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））などが挙げられる。また、これら複数の材料を使用した積層体であってもよい。前記材料を用いて、酸素透過度および二酸化炭素透過度が所望の値になるように、大きさや厚みを調整して培養液貯留容器を作製すればよいが、強度やガス透過性を両立する上で、容器の厚みは３０〜３００μｍが好ましく、６０〜２００μｍがより好ましい。

【0024】

本発明において、液体培地貯留容器の形態は特に限定されないが、液体培地を外部に供給できる開口部を少なくとも１つ有している必要がある。前記開口部は、培地を前記細胞培養容器に供給できるように、後述の流路網に接続可能に構成されていることが好ましい。また、液体培地の蒸発を防止し、汚染の危険性を低減できるように、前記開口部は、未使用時は密栓でき、使用時は培地が外部と接触できない状態で流路に接続（例えば、無菌コネクターによる相互接続）できるよう構成されていることが好ましい。また、前記開口部以外の部分は、容器内の培地が外部と接触できないよう構成されていることが好ましい。

【0025】

（流路管）
本発明において、細胞培養容器と培養液貯留容器とを接続するための流路管は、３７℃における酸素透過度が１５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、二酸化炭素透過度が４５０×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上であることが好ましい。このような材料としては、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）（酸素透過係数：４．９×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１５×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）（酸素透過係数：６．３×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１８×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）（酸素透過係数：６．７×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１８．３×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、ポリ４メチルペンテン−１（ＰＭＰ）（酸素透過係数：２４．４×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：７２．３×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、シリコーン（酸素透過係数：６０５×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：３０００×１０^−１０ｃｍ^３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））などが挙げられる。また、これらを使用した積層体であってもよいが、これらに限定されるものではない。これらの材料を用いて、酸素透過度および二酸化炭素透過度が所望の値になるように、大きさや厚みを調整して流路管（チューブ）を作製すればよいが、強度やガス透過性を両立する上で、チューブの厚みは０．５ｍｍ〜５ｍｍが好ましい。なお、ガス透過性が高すぎる場合は、チューブ内に気泡が発生し、培養液（培地）の流れを阻害することがあるので、培養液を適度に加圧するなどして気泡の発生を抑制することが好ましい。しかし、培養液を加圧しすぎると、培地流速をコントロールできなくなるので、チューブは、３７℃における酸素透過度が１０００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下、二酸化炭素透過度が５０００×１０^−１０ｃｍ^３／（ｃｍ^２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下であることが好ましい。

【0026】

（ＣＯ_２インキュベーター）
本発明において、少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、前記細胞培養容器と前記培養液貯留容器とを接続するための流路管をＣＯ_２インキュベーター内に設置して細胞の培養を行うのが好ましい。ＣＯ_２インキュベーターは、ＣＯ_２の濃度を一定に維持する機能だけでなく、恒温機としての役割も有しており、少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、および前記流路管をＣＯ_２インキュベーター内に設置することにより、必要な培養環境を整えることができる。ＣＯ_２の濃度や温度は培養する細胞に合わせて適宜設定すればよい。このようなＣＯ_２インキュベーターとしては、例えば、Ｐａｎａｓｏｎｉｃ株式会社、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ヤマト科学株式会社などより入手可能である。

【0027】

（液体の供給、排出などを制御する手段）
細胞懸濁液や培地などの液体の供給方法の形態は、特に限定されるものではないが、流路内に設置したポンプを用いて送液する方法や、液体培地貯留容器が培養バッグなど軟質のものである場合には前記容器をローラー間に挟んで培地を絞り出す方法等を採用できる。ポンプの設置場所は特に限定されないが、液体がポンプ部分を通過する際にゴミが混入する等のリスクを避けるため、排出側に設置することが好ましい。

【0028】

（培養の対象となる細胞）
本発明において、対象となる細胞は、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、マウス、ラット等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｌ９２９細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＫＧ−１ａ細胞などの株化細胞あるいは、各種ハイブリドーマ細胞株などが挙げられる。また、神経細胞、角質化細胞、繊維芽細胞、肺上皮細胞、肝細胞、血液細胞などのプライマリー細胞などが挙げられる。さらに、ＥＳ細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、間葉系幹細胞などの幹細胞、前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子を導入した細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。

【0029】

（細胞の播種）
本発明において、細胞培養容器に細胞を播種する手段は、特に限定されない。一例として、前記液体培地貯留容器を利用する方法が挙げられる。この方法は、液体培地貯留容器に播種したい細胞を懸濁した溶液を入れ、細胞培養容器に流し込み灌流させる方法である。播種終了後、液体培地貯留容器を細胞を含まない培地が入ったものに切り換えて灌流させ培養を行えばよい。この方法は、播種したい細胞を含む溶液の液量が多いときに用いるのが好適である。液量（細胞数）が少ない場合は、前記液体培地貯留容器と細胞培養容器を接続する流路の途中にシリンジ等を用いて細胞懸濁液を注入できる手段を設けても良い。

【0030】

（細胞の培養）
本発明において、細胞培養容器として中空糸膜を内挿したモジュールを用いる場合、細胞培養容器への培地の供給は、内腔側および外腔側の２ルートが必要である。その際、培地の供給にあたり、液体培地貯留容器は内腔側および外腔側で別々のものを用いても良いし、１つの容器から内腔側および外腔側の両方に培地を供給しても良い。この場合、内腔側の培地組成と外腔側の培地組成は同一であっても異なっていても良い。また、内腔側の流速と外腔側の流速は同一であっても異なっていても良いが、外腔側の流速を早めるのが好ましい。細胞が播種された側（内腔側）に通液する培地の好ましい平均流速は、０．１〜１ｍｍ／ｍｉｎである。一方、細胞が播種されていない側（外腔側）に通液する培地の好ましい平均流速は、２〜５ｍｍ／ｍｉｎである。なお、培養に用いられる培地は、培養細胞の種類に応じて決定され、当該細胞の培地として通常用いられるものであればよい。

【0031】

細胞の播種および／または培養中は、細胞培養容器の振とうやローリング等を行っても良い。このような操作を行うことは、細胞培養容器内に均一に細胞を播種することができる、気泡が発生した場合に取り除くことができる、培養細胞に満遍なく培地の栄養が行き渡る、などの点で好ましい。

【0032】

（モニタリング装置等）
本発明の細胞培養装置は、ｐＨ、グルコース、乳酸塩、酸素等といった細胞代謝物質の成分や濃度等を経時的にモニタリングする手段や分析手段を含んでも良い。例えば、検知のためのセンサーを含むことができる。センサーは、中空糸膜内側の出入り口または中空糸膜外側の出入り口のチューブの任意の位置に取り付けることができる。また、中空糸内側や中空糸外側の出口に、フラクションコレクターを取り付けることにより、定期的に培地を採取することもできる。

【0033】

（作業コントローラー（作業パネル））
本発明において、細胞培養装置は、上記の操作や工程を行うため、またモニタリングを行うために、それらをコントロールするための作業コントローラー（作業パネル）を備えていても良い。

【0034】

（細胞の回収）
本発明において、培養した細胞を回収するための手段は、特に限定されない。例えば、培養容器として中空糸膜モジュールを用いる場合、培地の灌流を停止し、中空糸膜内側および外側に存在する培地を除去するため、二価陽イオンフリーのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を一定時間灌流させ、培地がＰＢＳに置換されたら、さらにＰＢＳを一定時間灌流した後、ＰＢＳを除去し、トリプシン等のプロテアーゼを中空糸内側と外側へ充填する。トリプシン処理により、培養細胞を中空糸膜表面から剥離させた後、培地等を用いて中空糸膜モジュールから押出し、回収する。

【0035】

（その他の構成）
本発明において、細胞培養装置は、必要により細胞回収容器、廃液回収容器を有していてもよい。細胞回収容器や廃液回収容器の形態は、特に限定されない。例えば、ガラス製ボトル、プラスチック製ボトル、培養バッグなどが挙げられる。

【0036】

本発明の細胞培養装置及びその使用方法について、図面を参照しながら以下に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。

【0037】

図１は本発明の細胞培養装置の構成例の一つを示す。図１において、１および２はそれぞれ、ガス透過性を有する液体培地貯留容器（培養バッグなど）である。液体培地貯留容器１からは、無菌接続コネクター１３およびバルブ４を経由して、細胞培養容器１７（中空糸モジュール。図６にその構成例を示す。）の端部導管３３ａに、流路が接続され、液体培地貯留容器１に入っている培地が細胞培養容器１７の内腔側に移送できるようになっている。他方、液体培地貯留容器２からは、無菌接続コネクター１４およびバルブ５を経由して、細胞培養容器（中空糸モジュール）１７の側部導管３４ａに、流路が接続され、液体培地貯留容器２に入っている培地が細胞培養容器１７の外腔側に移送できるようになっている。

【0038】

細胞培養容器１７の内腔側からは、バルブ７、バルブ１１、送液ポンプ２０、バルブ１２、無菌接続コネクター１６を経由して、廃液回収容器１８まで流路が接続され、細胞培養容器１７を通過した培地が廃棄できるようになっている。なお、前記流路に設けられた送液ポンプ２０により、液体培地貯留容器１から細胞培養容器１７への液体（培地など）の供給、前記細胞培養容器からの前記液体の排出、および前記液体の廃棄などにおける流速等を制御することができる。他方、細胞培養容器１７の外腔側からは、バルブ６、バルブ９、送液ポンプ１９、バルブ１０、無菌接続コネクター１６を経由して、廃液回収容器１８まで流路が接続され、細胞培養容器１７を通過した培地が廃棄できるようになっている。なお、前記流路に設けられた送液ポンプ１９により、液体培地貯留容器２から細胞培養容器１７への液体（培地など）の供給、前記細胞培養容器からの前記液体の排出、および前記液体の廃棄などにおける流速等を制御することができる。

【0039】

図１において、細胞回収容器３は、バルブ７、８および無菌接続コネクター１５を介して細胞培養容器１７の内腔側と連通している。必要により、この流路にさらにポンプ等を設けて、細胞を回収してもよい。なお、細胞の回収は、細胞培養容器１７を細胞培養装置から取り外して行ってもよく、その場合は、内腔側の廃棄系の流路の分岐から細胞回収容器３までの構成は無くてもよい。

【0040】

図１において、ＣＯ_２インキュベーター４１は、前記の構成のほとんどをカバーしているが、ガス透過性を有する液体培地貯留容器１、２および細胞培養容器１７がカバーされていれば、その他の部分についてはＣＯ_２インキュベーター４１の外側に配置されていても構わない。

【0041】

図１において、作業コントローラー２１（作業パネル）は、上記の操作や工程を行うため、またモニタリングを行うため等の便宜のために設定してもよい。

【実施例】

【0042】

（中空糸膜の作製）
ポリエーテルスルホン（４８００Ｐ、住友化学社製）２０質量％、ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）０．２質量％、Ｎ−メチルピロリドン３５．９１質量％、トリエチレングリコール４３．８９質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜溶液として、Ｎ−メチルピロリドン１３．５質量％、トリエチレングリコール１６．５質量％、水７０質量％水溶液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側より同時に吐出し、３０ｃｍの空走部を経て、７５℃の水中（凝固浴中）に導き中空糸膜を形成し、水洗後巻き取った。糸束は切断後、６０℃にて通風乾燥させた。中空糸膜は、概ね内径２００μｍ、外径３００μｍ、膜厚５０μｍとなるように吐出量を調整した。

【0043】

（中空糸膜モジュールの作製）
本発明において、細胞培養容器である中空糸膜モジュールは以下のように作製した。直径１ｃｍ、長さ１０ｃｍの円筒状のポリカーボネート製モジュールケース内に中空糸膜を１００本充填した後、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、図６に示すような形状のモジュールを作製した。

【0044】

（実施例１）
図２に、本実施例で用いた細胞培養装置の構成を簡略化して示す。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み７０μｍのポリエチレン製の培養バッグを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み１．５ｍｍのＰＭＰ製の流路管を使用した。

【0045】

（実施例２）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み１５０μｍのＰＥ製の培養バッグを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み１ｍｍのＰＭＰ製の流路管を使用した。

【0046】

（実施例３）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み１５０μｍのＰＳｔ製の培養バッグを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも実施例２と同様の流路管を使用した。

【0047】

（実施例４）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれも実施例１と同様の培養バッグを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み３ｍｍのシリコーン製の流路管を使用した。

【0048】

（比較例１）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれもガス不透過性のガラス製ボトルを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも実施例１と同様の流路管を使用した。

【0049】

（比較例２）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれもガス不透過性のガラス製ボトルを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれもガス不透過性の流路管（ポリウレタン製、厚み１．５ｍｍ）を使用した。

【0050】

（細胞培養実験１：一般培養液使用）
図２に、細胞培養実験に用いた細胞培養装置の構成の概略を示す。培養液貯留容器と流路管は、実施例１から５および比較例１から３に記載の組合せを使用した。
細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。細胞播種密度は、１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。培養液の流速は、中空糸内腔側は０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸外腔側は３．４６ｍｍ／ｍｉｎとした。培養液はウシ胎児血清を１０％（ｖ／ｖ）添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いた。培養液灌流用ポンプとして、中空糸内腔側灌流用と外腔側灌流用に計２台のペリスタ・バイオミニポンプ（アトー社製）（図２の２０（内腔側）および１９（外腔側））を用い、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した。培養液供給方法は、中空糸内腔側、中空糸外腔側ともに一方向とした。中空糸内腔側に間葉系幹細胞を播種し、２日間静置した後に中空糸内腔側の灌流を開始した。７日間培養後、培養液灌流を停止し、細胞培養容器内にて増殖した細胞を回収した。細胞回収時は、細胞解離試薬である０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を用いた。

【0051】

（細胞培養実験２：低血清培養液使用）
細胞培養実験１と同様の細胞培養装置を用い、細胞培養実験２を行った。細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。この実験では、培養液として、ウシ胎児血清を１％（ｖ／ｖ）添加したＭＦ−ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）を用いた。細胞播種密度は、１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。培養液の流速は、中空糸内腔側は０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸外腔側は３．４６ｍｍ／ｍｉｎとした。培養液灌流用ポンプに、中空糸内腔側灌流用と外腔側灌流用に計２台のペリスタ・バイオミニポンプ（アトー社製）（図２の２０（内腔側）および１９（外腔側））を使用した。ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した。培養液供給方法は、中空糸内腔側、中空糸外腔側ともに一方向とした。中空糸内腔側に間葉系幹細胞を播種し、２日間静置した後に中空糸内腔側の灌流を開始した。７日間培養後、培養液灌流を停止し、細胞培養容器内にて増殖した細胞を回収した。細胞回収時は、細胞解離試薬である０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を用いた。

【0052】

（細胞培養実験３：無血清培養液使用）
細胞培養実験１と同様の細胞培養装置を用い、細胞培養実験３を行った。細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。この実験では、培養液として、血清無添加のＭＦ-ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）を用いた。細胞播種密度は、１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。培養液の流速は、中空糸内腔側は０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸外腔側は３．４６ｍｍ／ｍｉｎとした。培養液灌流用ポンプに、中空糸内腔側灌流用と外腔側灌流用に計２台のペリスタ・バイオミニポンプ（アトー社製）（図２の２０（内腔側）および１９（外腔側））を使用した。ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した。培養液供給方法は、中空糸内腔側、中空糸外腔側ともに一方向とした。中空糸内腔側に間葉系幹細胞を播種し、２日間静置した後に中空糸内腔側の灌流を開始した。培養７日後、培養液灌流を停止し、細胞培養容器内にて増殖した細胞を回収した。細胞回収時は、細胞解離試薬である０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を用いた。

【0053】

細胞培養実験の結果を表１にまとめて示す。実施例の結果から明らかなように、特定の範囲のガス透過性を有する培養液貯留容器および流路管（チューブ）を用いたものでは、比較例に比較して細胞増殖率（性）が明らかに高い結果となった。ただし、実施例４においては、チューブのガス透過性が高いためか、培養中、チューブ内に少量の気泡が確認された。
一方、ガス不透過性の培養液貯留容器とガス透過性チューブを用いた場合（比較例１）には、細胞増殖率が低い結果となった。また、ガス不透過性の培養液貯留容器とガス不透過性の流路管を用いた比較例２では、細胞培養装置内への酸素および炭酸ガスの供給ができないため、さらに細胞増殖率が低い結果となった。

【0054】

【表1】

【産業上の利用可能性】

【0055】

本発明により、幹細胞をはじめとする各種細胞を、従来法と比較して、安全、簡便かつ高効率に培養することのできる細胞培養装置の提供を可能にする。

【符号の説明】

【0056】

１、２ 液体培地貯留容器
３ 細胞回収容器
４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ バルブ
１３、１４、１５、１６ 無菌接続コネクター
１７ 細胞培養容器
１８ 廃液回収容器
１９、２０ 送液ポンプ
２１ 作業コントローラー（作業パネル）
３１ モジュールケース
３２ 多孔質中空糸膜
３３ａ，ｂ 端部導管
３４ａ，ｂ 側部導管
４１ ＣＯ_２インキュベーター

【図1】

【図2】

【図3】