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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6902528
(24)【登録日】2021年6月23日
(45)【発行日】2021年7月14日
(54)【発明の名称】細胞収容チップ
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20210701BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20210701BHJP
C08F 246/00 20060101ALI20210701BHJP
C08F 220/28 20060101ALI20210701BHJP
C08F 220/30 20060101ALI20210701BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12M1/34 B
C08F246/00
C08F220/28
C08F220/30
【請求項の数】5
【全頁数】26
(21)【出願番号】特願2018-509650(P2018-509650)
(86)(22)【出願日】2017年3月31日
(86)【国際出願番号】JP2017013561
(87)【国際公開番号】WO2017170994
(87)【国際公開日】20171005
【審査請求日】2019年12月19日
(31)【優先権主張番号】特願2016-70969(P2016-70969)
(32)【優先日】2016年3月31日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000005290
【氏名又は名称】古河電気工業株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】000002141
【氏名又は名称】住友ベークライト株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100135633
【弁理士】
【氏名又は名称】二宮 浩康
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(74)【代理人】
【識別番号】100143959
【弁理士】
【氏名又は名称】住吉 秀一
(72)【発明者】
【氏名】松永 真理子
(72)【発明者】
【氏名】月井 健
(72)【発明者】
【氏名】木村 健一
(72)【発明者】
【氏名】高橋 亨
(72)【発明者】
【氏名】徐 杰
(72)【発明者】
【氏名】松元 孝行
(72)【発明者】
【氏名】五十嵐 幸太
【審査官】
西垣 歩美
(56)【参考文献】
【文献】
特開２０１２−０５２８４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１５／１３３３３７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１５／１５１８８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０１２−０９３２９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００６−１７６７２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００６−２９９０４５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０
Ｃ０８Ｆ ２２０／２８
Ｃ０８Ｆ ２２０／３０
Ｃ０８Ｆ ２４６／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞収容チップ上の物質から発する光情報に基づいて所定の細胞を探索し、探索された細胞を選択的に回収するためのスクリーニング装置で使用される、複数の細胞を収容する細胞収容チップであって、
光透過性材料からなる基体と、
前記基体の少なくとも一方の主面に、細胞を収容可能な複数のウェルとを有し、
前記複数のウェルを含む前記細胞収容チップの表面は、架橋構造を有し、下記一般式［１］で表されるモノマーに由来する構造単位と、下記一般式［２］で表されるモノマーに由来する構造単位と、下記一般式［３］で表されるモノマーに由来する構造単位とを含むポリマーで被覆されており、
前記細胞収容チップの素材が熱可塑性樹脂であることを特徴とする細胞収容チップ。
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数の場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
（式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙはアルキル基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
（式中、Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
光透過性材料からなる基体と、
前記基体の少なくとも一方の主面に、細胞を収容可能な複数のウェルとを有し、
前記複数のウェルを含む前記細胞収容チップの表面は、架橋構造を有し、下記一般式［１］で表されるモノマーに由来する構造単位と、下記一般式［２］で表されるモノマーに由来する構造単位と、下記一般式［３］で表されるモノマーに由来する構造単位とを含むポリマーで被覆されており、
前記細胞収容チップの素材が熱可塑性樹脂であることを特徴とする細胞収容チップ。
【化1】
【化2】
【化3】
【請求項2】
前記一般式［１］で表されるモノマーに由来する構造単位は、メトキシポリエチレングリコールアクリレート又はメトキシポリエチレングリコールメタクリレートである、請求項１に記載の細胞収容チップ。
【請求項3】
前記メトキシポリエチレングリコールアクリレート及び／又はメトキシポリエチレングリコールメタクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である、請求項２に記載の細胞収容チップ。
【請求項4】
前記一般式［２］で表されるモノマーに由来する構造単位に含まれる活性エステル基が、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞収容チップ。
【請求項5】
前記熱可塑性樹脂が、直鎖状ポリオレフィン、ポリスチレン、環状ポリオレフィン及び含フッ素樹脂からなる群から選択された少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞収容チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、目的検体をスクリーニングする際に複数の細胞を収容する細胞収容チップに関し、特に、ウェルと細胞に対して光を照射し、細胞収容チップ上に結合した物質が発する蛍光に基づいて目的検体となる細胞を検知して、当該細胞を選択的に吸引して回収するための細胞収容チップに関する。【背景技術】
【0002】
従来、スクリーニング装置は、細胞などの微小物検体を識別、分取するための装置として、医療分野の研究・検査などで広く使用されている。そして近年、研究・検査機関において、検体破壊を伴わない識別、分取を実現すると共に、これらの処理をより正確に行うことで研究・検査の効率を高めたいとの要望がある。特に、所定分野においては、多数の細胞の中から特定の細胞を一細胞単位で識別・分取したいとの要望が高まっていることから、このような一細胞単位での識別・分取処理においても、正確性の向上や高効率化が求められている。【0003】
非破壊方式で行う細胞の識別・分取処理においては、目的検体と非目的検体とを明確に区別できるように、多数の微細粒子を含む培地を細胞収容チップ上に保持するのが望ましい。そこで従来、例えば、チップ上面の一部に抗免疫グロブリン（Ｉｇ）抗体を結合させてなる被覆層を有するマイクロウェルアレイチップを用い、該マイクロウェルアレイチップの各ウェルに抗体分泌細胞を分注し、ウェル中に収容された細胞の少なくとも一部から分泌される抗体と、上記被覆層の抗Ｉｇ抗体とを結合させ、当該分泌抗体を蛍光標識抗原で検出することによって目的検体を特定する方法が開示されている（特許文献１）。【0004】
また、所望の目的検体を外部環境から選択的に結びつけるために、或いは非目的検体を表面からまとめて除去するために、プレート状の支持体に、該支持体上に固定された低い非特異的結合性のマトリックスと、非特異的結合性マトリックス内で物理的に絡み合って共有結合している活性成分とを供給してなる機能性コーティングが開示されている（特許文献２）。【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特許第４１４８３６７号公報
【特許文献2】特表２００４−５３１３９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、特許文献１の技術では、チップ上面の一部に抗Ｉｇ抗体を結合させてから目的検体を特定するまでの間、チップ上面を湿潤状態で保持しなければならず、抗Ｉｇ抗体を長持ちさせることができない。また、細胞の抗体分泌中に当該細胞がウェルの内表面に付着する場合があるため、当該細胞を回収し難くなり、回収できたとしても目的検体である細胞にダメージを与える可能性が高い。【0007】
また、特許文献２では、プレート状の支持体上面に設けられた機能性コーティングに目的検体を選択的に結びつける構成ではあるが、各ウェル内に一つの細胞を保持する構成ではなく、特定の細胞を細胞単位で識別・分取する精度や効率が高いとは言えない。【0008】
本発明の目的は、目的検体を高精度且つ高効率で識別・分取することができ、また、取扱が簡単で、細胞にダメージを与えること無く容易な回収を可能とする細胞収容チップを提供することにある。【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的を達成するために、本発明の細胞収容チップは、細胞収容チップ上の物質から発する光情報に基づいて所定の細胞を探索し、探索された細胞を選択的に回収するためのスクリーニング装置で使用される、複数の細胞を収容する細胞収容チップであって、光透過性材料からなる基体と、前記基体の少なくとも一方の主面に、細胞を収容可能な複数のウェルとを有し、前記複数のウェルを含む前記細胞収容チップの表面は、架橋構造を有し、下記一般式［１］で表されるモノマーに由来する構造単位と、下記一般式［２］で表されるモノマーに由来する構造単位と、下記一般式［３］で表されるモノマーに由来する構造単位とを含むポリマーで被覆されていることを特徴とする。【0010】
【化1】
【化2】
【化3】
【0011】
前記一般式［１］で表されるモノマーに由来する構造単位は、メトキシポリエチレングリコールアクリレート又はメトキシポリエチレングリコールメタクリレートであることが好ましい。【0012】
前記メトキシポリエチレングリコールアクリレート及び／又はメトキシポリエチレングリコールメタクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数は、３〜１００であることが好ましい。【0013】
前記一般式［２］で表されるモノマーに由来する構造単位に含まれる活性エステル基は、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基であることが好ましい。【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、複数のウェルを含む細胞収容チップの表面が、特定のポリマーで被覆されている。これにより、チップ表面が細胞低接着性を有すると共に、ウェルに収容される細胞が産生する被産生物質との結合性を有する特異的結合材料に対して結合性を有する。従来のチップでは、被産生物質と結合性を有する物質をチップ上に予め結合させた構成であるため、当該チップの長期間の保存が難しく、乾燥等により精度が低下する可能性がある。一方、本発明によれば、細胞収容チップの表面が上記特異的結合材料との結合性を有することにより、被産生物質と結合性を有する特異的結合材料を細胞収容チップ上に予め結合させる必要が無く、乾燥等による精度低下を防止することができる。【0015】
また、細胞収容チップ表面の上記特異的結合材料との結合性により、上記特異的結合材料がウェルを含む細胞収容チップの表面と結合し、また、ウェル内の細胞から産生される被産生物質が当該特異的結合材料と結合する。このため、当該ウェル自体を目的検体識別の際の標識部位とすることができ、細胞にダメージを与えること無く目的検体を識別することができる。更に、細胞収容チップの表面が細胞低接着性を有することにより、ウェル内の細胞が細胞収容チップ表面に接着するのを防止することができ、ブロッキング剤等を用いたコーティング処理を要すること無く、目的検体である細胞を高効率で回収でき、更に細胞回収時に当該細胞にダメージを与えること無く回収することができる。【図面の簡単な説明】
【0016】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【0017】
【図1】本発明の実施形態に係る細胞収容チップを用いるスクリーニング装置の構成を概略的に示す側面図である。
【図5】細胞収容チップと該細胞収容チップの固定部材の構成を示す拡大断面図である。
【図10】種々の細胞収容チップと蒸留水との接触角を測定、比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明の実施形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。【0019】
（スクリーニング装置の構成）図１は、本実施形態に係る細胞収容チップを用いるスクリーニング装置の構成を概略的に示す側面図であり、図２は、図１のスクリーニング装置の斜視図である。図１及び図２のスクリーニング装置は、その一例を示すものであり、スクリーニング装置の実施形態は、図１及び図２のものに限られない。なお、説明の便宜上、図１の紙面垂直方向をＸ方向、左右方向をＹ方向、Ｚ方向を、Ｘ方向とＹ方向に対して垂直な方向とする。
【0020】
図１及び図２において、スクリーニング装置１は、細胞収容チップ６０内の複数の微細粒子（例えば生体の細胞など）が発する光情報に基づいて目的検体となる所定の細胞を探索し、回収条件を満たした細胞が収容されたウェル内の細胞を選択的に吸引、取得して、収容プレート５０に回収する装置である。【0021】
具体的には、スクリーニング装置１は、ベース１１と、支持部１２（図２参照）と、回収部１３と、計測部１４と、画像解析部１５と、移動部１６とを備え、図２に示すように、外部からの光や異物の進入を防止するために、上記の各部がカバー１９により覆われている。【0022】
ベース１１は、スクリーニング装置１の各要素を保持するための本体フレームである。このベース１１は、略水平に配されたプレート部材１１１，１１２，１１３を有しており、これらプレート材を介して、回収部１３と、計測部１４と、移動部１６とを保持している。プレート部材１１１，１１２は、複数の垂直部材１１４により平行に固定されており、プレート部材１１２，１１３は、複数の垂直部材１１５により平行に固定されている。この垂直部材１１４は、振動を遮断する材質からなり、高さ調整可能に構成されている。【0023】
上記複数のプレート材のうち最上に位置するプレート部材１１３の上には、支持部１２と支持台３０が固定されている。支持部１２は、プレート部材１１３の上においてＺ方向に沿って垂直に延出して配置されている。支持台３０は、脚部３０ａと支持板３０ｂを有している。プレート部材１１１，１１２，１１３及び支持板３０ｂは、Ｚ方向に関して相互に所定間隔をおいて配置されている。【0024】
支持台３０の支持板３０ｂ上には、移動部１６が載置固定されている。移動部１６上には、搭載用テーブル４０、収容プレート５０および細胞収容チップ６０が搭載されている。移動部１６は、搭載用テーブル４０、すなわち該搭載用テーブル４０に搭載された収容プレート５０及び細胞収容チップ６０を、Ｘ方向および／又はＹ方向に沿って移動して位置決めすることが可能となっている。【0026】
図３に示すように、移動部１６は、テーブル１６１と、該テーブル上に配置されたテーブル１６２を有している。テーブル１６１は、支持台３０に固定されており、テーブル１６２をＸ方向に沿って移動して位置決め可能に搭載している。テーブル１６２は、搭載用テーブル４０をＹ方向に沿って移動して位置決め可能に搭載している。【0027】
テーブル１６１の上面には、ガイドレール１６３，１６３とモータ１６４が設けられている。テーブル１６２の下面には、断面Ｕ字型の係合部材１６５，１６５とナット１６６が設けられている。係合部材１６５，１６５は、それぞれガイドレール１６３，１６３と移動可能に係合している。モータ１６４の送りねじ１６７は、ナット１６６と螺合している。【0028】
モータ１６４は、制御部１００と電気的に接続されており、制御部１００からの指令に応じてモータ１６４を作動して送りねじ１６７を回転すると、テーブル１６２がＸ方向に沿って移動して位置決めされる。【0029】
テーブル１６２の上面には、ガイドレール１６８，１６８とモータ１６９が設けられている。搭載用テーブル４０の下面には、断面Ｕ字型の係合部材１７０，１７０とナット１７１が設けられている。係合部材１７０，１７０は、それぞれガイドレール１６８，１６８と移動可能に係合している。また、モータ１６９の送りねじ１７２は、ナット１７１と螺合している。【0030】
モータ１６４は制御部１００と電気的に接続されており、制御部１００からの指令に応じてモータ１６４を作動して送りねじ１７２を回転することで、搭載用テーブル４０がＹ方向に沿って移動して位置決めされる。【0031】
また、テーブル１６１は開口部１７３を、テーブル１６２は開口部１７４をそれぞれ有しており、さらに搭載用テーブル４０は開口部１７５を有している。これら開口部１７３，１７４，１７５は、テーブル１６２がＸ方向に移動し、搭載用テーブル４０がＹ方向に移動しても常に重なるような大きさを有している。これら開口部１７３，１７４，１７５を介して、計測部１４の対物レンズ１１０側からの光Ｌが、搭載用テーブル４０上の細胞収容チップ６０の細胞に照射される。【0032】
また、テーブル１６２がＸ方向に移動しかつ搭載用テーブル４０がＹ方向に移動した場合にも、対物レンズ１１０側からの光Ｌは、開口部１７３，１７４，１７５を通過して、搭載用テーブル４０上の細胞収容チップ６０の細胞に照射される。すなわち、テーブル１６１，１６２および搭載用テーブル４０がいずれの相対位置にあった場合でも、細胞及び／又は細胞を収容するウェルから蛍光を発生させることが可能となっている。【0034】
搭載用テーブル４０は、例えば長方形状の板状部材であり、この搭載用テーブル４０の搭載面４０ａ上に、収容プレート５０と細胞収容チップ６０がそれぞれ着脱可能にＹ方向に並べて搭載されている。【0035】
収容プレート５０は、板状部材であり、収容プレート５０には多数のウェル５１がＸ方向とＹ方向に沿って等間隔でマトリックス状に配列されている。これらのウェル５１は、目的検体である細胞が吸引・吐出キャピラリ１４０から順次排出されてくるときに、当該細胞を別々に回収して格納することができる回収格納部となっている。収容プレート５０のウェル５１は、例えば鉛直方向断面略Ｕ字型の凹部、あるいはカップ型の凹部である。【0036】
細胞収容チップ６０は、固定部材１２０により搭載用テーブル４０の搭載面４０ａ上に固定されており、この固定部材１２０は、搭載用テーブル４０の所定位置に位置決めして固定されている。【0037】
図５は、細胞収容チップ６０と固定部材１２０との構成を示す拡大断面図である。同図に示すように、固定部材１２０は、細胞収容チップ６０を搭載用テーブル４０の搭載面４０ａに対して一定の高さの基準面ＣＬの位置で固定して保持できるように構成されている。具体的には、固定部材１２０は、細胞収容チップ６０の端部を囲うように配置された枠体１２１，１２２を有しており、これら部材によって細胞収容チップ６０を協働して保持する。【0038】
細胞収容チップ６０は、Ｚ方向に関して枠体１２１，１２２の間に配置されており、枠体１２１，１２２に挟持されることで、枠体１２１，１２２とそれぞれ圧接している。これにより、細胞収容チップ６０と枠体１２１の間のシール性が確保される。【0039】
そして、細胞収容チップ６０と枠体１２１が圧接した状態で、細胞収容チップ６０の上面６０ｂが枠体１２２を介して基準面ＣＬに位置決めされる。これにより、細胞収容チップ６０の上面６０ｂと、計測部１４の対物レンズ１１０および収容プレート５０とのＺ方向に関する距離を正確に管理することが可能となっている。換言すれば、細胞収容チップ６０のウェル６１内の細胞Ｍの位置と、計測部１４の対物レンズ１１０と収容プレート５０との距離を正確に管理することが可能となっている。【0040】
また、枠体１２１は、その平面方向中央部かつ細胞収容チップ６０の上方に設けられ、液体Ａを保持する液体保持部１２９を有しており、培地、試薬液、反応液等の各種液体を保持することが可能に構成されている。すなわち液体保持部１２９は、枠体１２１の内部空間に形成されている。なお枠体１２１は、枠体１２２に対して例えば不図示のヒンジ機構部を用いて開閉することができ、これにより、固定部材１２０内の細胞収容チップ６０を取り出して、新たな細胞収容チップと交換することができる。細胞収容チップ６０は、複数の細胞Ｍを収容する板状部材である。細胞収容チップ６０の詳細構成については後述する。【0041】
回収部１３は、識別された細胞Ｍを目的検体として分取する吸引・吐出キャピラリ１４０を備えている。吸引・吐出キャピラリ１４０は、Ｚ２方向（下方向）に沿って縮径する先細り状の中空部材であり、その内部には管路１４１が形成されている。【0042】
図１に戻り、計測部１４は、細胞収容チップ６０の複数のウェル６１が含まれる領域に対して光Ｌを照射することで、その領域内の細胞Ｍ及び／又は細胞を収容するウェル６１或いはその近傍から蛍光を発生させて、その蛍光を受光する。受光した細胞Ｍ及び／又は細胞を収容するウェル６１或いはその近傍からの蛍光は、画像解析部１５により画像解析される。【0043】
具体的には、計測部１４は、細胞収容チップ６０および細胞収容チップ６０に収容された細胞Ｍに少なくとも１つ以上の光源より導かれる光を照射することによって、透過光、反射光もしくは蛍光による形状および位置情報、並びに蛍光・化学発光等の輝度情報を個々の微細粒子の平均サイズより細かい分解能で取得すると共に、細胞収容チップ６０自体の形状や、細胞収容チップ６０上に配置されたウェル６１の位置座標や大きさ等の情報を取得する。【0044】
また、計測部１４は、対物レンズ１１０を有しており、対物レンズ１１０は細胞収容チップ６０に対して光を導く。対物レンズ１１０は、細胞収容チップ６０と移動部１６の下方に配置されており、吸引・吐出キャピラリ１４０は、細胞収容チップ６０と移動部１６の上方に配置されている。すなわち、細胞収容チップ６０及び移動部１６が、Ｚ方向に関して対物レンズ１１０と吸引・吐出キャピラリ１４０の間に配置される。【0045】
また、計測部１４は、光源としての励起光源１８１と、励起光源１８１より照射される光のうち所望の励起波長帯域のみを選択するための光学フィルタ（励起フィルタ）１８４と、細胞収容チップ６０からの光情報の所望の波長帯域のみを選択するための光学フィルタ（蛍光フィルタ）１８５と、励起光と光情報との波長帯域の差によって光路を切り替えるためのダイクロイックミラー１８６から構成される蛍光フィルタユニット１８３と、励起光源１８１から出射された光を細胞収容チップ６０に導くとともに細胞収容チップ６０から得られる光情報を収集するための対物レンズ１１０と、対物レンズ１１０を光軸方向に可動させるオートフォーカス機能を持つフォーカスユニット１８７と、計測対象からの光情報を検出するための光検出部としての受光部１８８とを有している。蛍光フィルタユニット１８３と受光部１８８は、蛍光落射ユニット１９０に固定されている。【0046】
励起光源１８１は、例えばレーザ光源や水銀ランプで構成される。シャッターユニット１８２は、励起光源１８１と蛍光フィルタユニット１８３の間に配置されており、シャッターユニット１８２は細胞収容チップ６０の細胞Ｍに対して光Ｌを照射しない場合には、励起光源１８１の発生する光Ｌを蛍光フィルタユニット１８３の手前で遮断することが可能となっている。【0047】
さらに、計測部１４は不図示のハーフミラーを有しており、ハーフミラーと蛍光フィルタユニット１８３とを切り替えることで、励起光源１８１からの光の一部を観察対象に照射すると同時に、観察対象からの反射光の一部を受光部１８８に導くことによって、細胞収容チップ６０の上面６０ｂおよび該上面に形成されたウェル６１の形状および位置情報を計測することができる。【0048】
また、この計測部１４では、複数の対物レンズ１１０ａ，１１０ｂ・・・が、例えばレボルバー式で回転することで、必要な倍率の対物レンズを細胞収容チップ６０の下方位置に位置決めすることができる。フォーカスユニット１８７は、例えば制御部１００からの指令によりモータ１８９を作動することで、細胞収容チップ６０の下方位置に配置された例えば対物レンズ１１０をＺ方向に沿って移動して位置決めすることで、細胞収容チップ６０の微細粒子Ｍに対する対物レンズ１１０のフォーカス調整を行うことができる。【0049】
画像解析部１５は、各ウェル６１内の複数の細胞Ｍ及び／又は細胞を収容するウェル６１内或いはその近傍の、少なくとも最大強度の蛍光を発する細胞Ｍ及び／又は細胞を収容するウェル６１或いはその近傍の蛍光輝度を算出する。【0050】
具体的には、画像解析部１５は、計測された形状情報および光情報を解析することで、少なくとも各ウェル６１内に、測定者によって設定できる輝度条件を満たす細胞Ｍが存在することを確認するためのデータを取得する。そして、画像解析部１５は、透過光もしくは反射光によるウェル６１の位置座標情報と蛍光・化学発光の光情報とを合わせ照合することにより細胞Ｍ及び／又は細胞を収容するウェル６１内或いはその近傍からの光情報を抽出する。また、計測部１４はオートフォーカス機能を有しており、所定位置で合焦した状態で計測を行なうとともに、吸引・吐出キャピラリ１４０の先端部と細胞収容チップ６０上面との位置関係を、両者に対するオートフォーカスの実施により判断することができる。【0051】
制御部１００は、Ｘ−Ｙ平面内において、回収条件を満たした輝度の蛍光を発するウェル６１の位置を検知する。そして制御部１００は、図３のモータ１６４，１６９に対して制御駆動信号を与えることで、移動部１６上の細胞収容チップ６０のウェル６１を、吸引・吐出キャピラリ１４０の真下に位置させることができる。すなわち、吸引・吐出キャピラリ１４０は、特定のウェルをターゲットとして、当該ウェル内の細胞を吸引することが可能に構成されている。また、吸引・吐出キャピラリ１４０は、複数のウェルの内の選択されたウェル、すなわち所定の回収条件を満たした細胞の入っているウェル内から一又は複数の細胞を吸引することが可能となっている。さらに、吸引・吐出キャピラリ１４０は、上記吸引された一又は複数の細胞を、収容プレート５０の所定のウェル５１に吐出することが可能となっている。【0052】
（細胞収容チップの構成）図６は、図５の細胞収容チップ６０の詳細構成を示す部分断面図である。同図に示すように、細胞収容チップ６０は、光透過性材料からなる基体６０ａと、該基体の上面６０ｂ（少なくとも一方の主面）に設けられ、複数の細胞Ｍを一対一で収容可能な複数のウェル６１，６１，・・・とを有する。
【0053】
細胞収容チップ６０は、該複数のウェル６１，６１，・・・を構成する各ウェルの内表面６１ａ及び基体６０ａの上面６０ｂ（細胞収容チップの表面）に形成された被覆層６２を有する。被覆層６２は、ウェル６１の内表面６１ａのみに形成されてもよいし、ウェル６１の内表面６１ａ及び基体６０ａの上面６０ｂの双方に形成されてもよい。つまり、図６では、被覆層６２は、内表面６１ａと上面６０ｂとを全面的に被覆しているように描かれているが、本発明の効果を奏する限りにおいて、被覆層６２は必ずしも内表面６１ａと上面６０ｂとを全面的に被覆していなくてもよい。【0054】
細胞収容チップ６０は、例えばガラス、プラスチック、或いはこれらのいずれかを主成分とする材料からなり、その上面６０ｂには、多数のウェル６１が例えばマトリックス状に配列されている。各ウェル６１は、例えば鉛直方向断面略台形、あるいは略カップ型の凹部であり、ウェル６１の水平方向断面形状は、好ましくは略円形である。ウェル６１は、細胞収容チップ６０上に細胞Ｍが分注もしくは一括注入されたとき、１つの細胞Ｍの収容に相当する大きさを有しており、例えば、ウェル６１の水平方向断面形状が円形である場合、細胞Ｍの直径が１５μｍであるとき、ウェルの内径及び深さは、細胞の直径よりも若干大きい２０μｍ程度が好ましい。また、ウェル６１は、１つの細胞Ｍに相当する大きさを有するのが好ましく、１つの細胞Ｍのみが入る大きさを有することがより好ましい。【0055】
被覆層６２は、架橋構造を有し、上述の一般式［１］で表されるモノマーに由来する構造単位と、上述の一般式［２］で表されるモノマーに由来する構造単位と、上述の一般式［３］で表されるモノマーに由来する構造単位とを含むポリマーからなる（以下、このポリマーを、単に「ポリマー」とも表記する）。ここで、架橋構造は、典型的には、一般式［３］で表されるモノマーに由来する構造単位が関与して形成される。これについてより詳しくは後述する。【0056】
上述の一般式［１］において、「アルキレングリコール残基」とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る「アルキレンオキシ基」（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）を意味する。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の「アルキレングリコール残基」はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ）の「アルキレングリコール残基」はエチレンオキシ基（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）である。【0057】
一般式［１］において、Ｒ１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基である。また、アルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基の繰り返し数ｐは、１〜１００の整数であり、好ましくは２〜１００の整数であり、より好ましくは３〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数ｐが２以上１００以下の場合は、鎖中で繰り返されるアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。【0058】
一般式［１］で表されるモノマーとしては、例えば、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類；グリセロールモノ（メタ）アクリレート；ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート；２−メトキシエチル（メタ）アクリレート；２−エトキシエチル（メタ）アクリレート；メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート；エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート；エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。「（メタ）アクリレート」とは、メタクリレート又はアクリレートを意味する。これらは、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。【0059】
ポリマー中、一般式［１］で表されるモノマーに由来する構造単位の比率は、ポリマーの全構成単位を基準として、通常３０〜９８ｍｏｌ％、好ましくは５０〜９７ｍｏｌ％、より好ましくは６０〜９７ｍｏｌ％である。【0060】
前述の一般式［２］において、Ｒ３は水素原子またはメチル基であり、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは１〜２０の整数であり、より好ましくは２〜１８の整数であり、更に好ましくは３〜１６の整数であり、最も好ましくは４〜１４の整数である。繰り返し数ｑが２以上２０以下の場合は、鎖中繰り返されるアルキレングリコール残基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。【0061】
「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。【0062】
このような活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。【0063】
ポリマー中、一般式［２］で表されるモノマーに由来する構造単位の比率は、ポリマーの全構成単位を基準として、通常１〜５０ｍｏｌ％、好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。また、一般式［２］で表されるモノマーは、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。【0064】
一般式［３］において、Ｒ４は水素原子またはメチル基であり、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基である。また、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基である。加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。中でも、ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、中でもシラノール基を生成し易い点からアルコキシシリル基が最も好ましい。【0065】
一般式［３］で表されるモノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。中でも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン或いは３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランが、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらは、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。【0066】
ポリマー中、一般式［３］で表されるモノマーに由来する構造単位の比率は、ポリマーの全構成単位を基準として、通常１〜２０ｍｏｌ％、好ましくは２〜１５ｍｏｌ％、より好ましくは２〜１０ｍｏｌ％である。【0067】
ポリマーは、上述の一般式［１］〜［３］のモノマーに由来する構造単位以外の構造単位を含んでいてもよい。例えば、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）に由来する構造単位が共重合されていてもよい。このようなモノマー（ｄ）の具体例としては、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート又はｎ−オクチルメタクリレートが好ましく挙げられる。ポリマーが、モノマー（ｄ）に由来する構造単位を含む場合、その含有量は、通常０〜６０ｍｏｌ％、好ましくは０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは０〜４０ｍｏｌ％である。【0068】
ポリマーの合成方法は、特に限定されない。例えば、前述の一般式［１］〜［３］で表される構造のモノマーを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。【0069】
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基材を変性させないため好ましい。【0070】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。【0071】
ポリマーの化学構造は、上述の一般式［１］〜［３］で表されるモノマーに由来する構造単位を含む限り、ランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもよい。また、本実施形態のポリマーの数平均分子量は、ポリマーと未反応モノマーの分離精製が容易になることから、５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。【0072】
ポリマーは、内表面６１ａと上面６０ｂとを被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。さらに、ポリマーは架橋構造を有している（つまり、ポリマー鎖同士が架橋している）から、不溶性であり、細胞収容チップ６０の洗浄や滅菌処理による信号低下を低減することができる。【0073】
内表面６１ａおよび上面６０ｂへのポリマーの被覆は、例えば、（ｉ）有機溶剤にポリマーを０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した溶液を調製し、（ｉｉ）その溶液を浸漬、吹き付け等の公知の方法で内表面６１ａおよび上面６０ｂに塗布した後、（ｉｉｉ）塗布した溶液を室温下または加温下にて乾燥させることにより行われる。なお、（ｉ）の溶液の調製において、溶液は、ポリマーと有機溶剤以外の成分を含んでいてもよい。例えば、均一に塗布するための界面活性剤、密着性をさらに高めるための密着助剤、等を含んでいてもよい。【0074】
その後、適当な方法でポリマー同士を架橋させる。特に本実施形態においては、ポリマーが、加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有しているため、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いることが一法である。すなわち、含有される水により、加水分解によりシラノール基を生成する官能基が加水分解し、ポリマー中にシラノール基が生成する。その後、加熱等により、シラノール基同士、またはシラノール基と他の官能基とが脱水反応し、ポリマー同士が結合する。結果、ポリマーが不溶になる。溶液の調製の容易さを考えると、含水量は０．０１〜１５重量％程度とすることが好ましい。【0075】
有機溶剤としては、エタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールは、細胞収容チップ６０を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、エタノール、メタノールは、ポリマーを加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。【0076】
本実施形態のポリマーを溶解した溶液を、内表面６１ａおよび上面６０ｂに塗布した後、乾燥させる工程において、あるポリマー中のシラノール基は、別のポリマー中のシラノール基、水酸基、アミノ基等と脱水縮合して架橋を形成する。さらに内表面６１ａおよび／または上面６０ｂに水酸基、カルボニル基、アミノ基などがある場合も同様に脱水縮合し、基材表面と化学的に結合することができる。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基材表面に被覆されたポリマー（被覆層６２）は容易に溶解したり剥がれたりすることはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。ポリマーが熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。【0077】
本実施形態に係る細胞収容チップ６０の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。【0078】
熱可塑性樹脂としては、特に限定はされないが、透明性を確保するために、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；ポリスチレン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂等を用いることが好ましい。【0079】
被覆されたポリマー（被覆層６２）と、内表面６１ａおよび上面６０ｂとの密着性を高めるために、内表面６１ａおよび／または上面６０ｂを活性化することが好ましい。活性化する手段としては、酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ＡｒＦ、ＫｒＦなどのエキシマレーザーで処理する方法がある。これらの中では、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。【0080】
ポリマーを内表面６１ａおよび／または上面６０ｂに塗布することで、容易に生理活性物質の非特異的吸着が抑制されたバイオチップ基板を作製できる。さらに、ポリマーが架橋構造を有することで、被覆層６２を不溶性とすることができる。【0081】
本実施形態に係る細胞収容チップを使用すると、各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質は核酸、アプタマー、蛋白質、オリゴペプチド、糖鎖、糖蛋白質などがある。例えば核酸を固定化する場合は、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入することが好ましい。アミノ基の導入位置はポリマー鎖末端あるいは側鎖（「ブランチ」ともいう）であってもよいが、分子鎖末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。【0082】
本実施形態において生理活性物質をバイオチップ基板上に固定化する際には、生理活性物質を溶解又は分散した液体を点着する方法が好ましい。【0083】
点着後、静置することにより、生理活性物質が表面に固定化される。例えばアミノ化された核酸を用いた場合は、室温から８０℃において１時間静置することにより、アミノ化された核酸の固定化が可能である。処理温度は高いほうが好ましい。生理活性物質を溶解または分散させる液体としてはアルカリ性であることが好ましい。【0084】
洗浄後は生理活性物質を固定化した部分以外の基板表面の部分の官能基を不活性化処理する。活性エステルやアルデヒド基の場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。【0085】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。【0086】
一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。【0088】
先ず、ウェル６１の内表面６１ａに形成された被覆層６２において（図８（ａ））、該被覆層に含有される官能基含有材料の所定官能基６２ａ、例えば活性エステル基を、一次抗体などの特異的結合材料８１と結合する（図８（ｂ））。このとき、所定官能基６２ａとウェル６１に収容される細胞Ｍが産生する被産生物質ｍとを結合する特異的結合材料８１を含有する固定液を用い、該固定液を細胞収容チップ６０上に導入することで、所定官能基６２ａと特異的結合材料８１とが結合される。【0089】
所定官能基６２ａとして活性エステル又はその誘導体を使用した場合、上記固定液は、アルカリ性が好ましく、具体的にはｐＨ７〜１０であることが好ましい。上記のような固定液を使用することにより、緩衝作用による自然状態を保持することができ、特異的結合材料８１（タンパクなど）の変質等によるダメージを防止し、所定官能基６２ａと被産生物質ｍとの良好な結合を得ることができる。【0090】
また、特異的結合材料８１は、被産生物質と特異的に結合する結合性物質である。この特異的結合材料８１は、一次抗体に限らず、抗原であってもよく、また、タンパク以外の物質でもよい。本発明で使用される特異的結合材料８１は、例えば、サイトカイン、免疫グロブリン、抗免疫グロブリン、ホルモンを含むタンパクの様な化学物資である。【0091】
ウェル６１内を洗浄後、細胞Ｍを含む培養液をウェル６１に収容し、細胞Ｍをウェル６１内で培養する（図７（ｃ））。本培養により、細胞Ｍが被産生抗体などの被産生物質ｍを産生し、被産生物質ｍがウェル６１内で特異的結合材料８１と結合する（図７（ｄ））。その結果、所定官能基６２ａが、特異的結合材料８１を介して被産生物質ｍと結合する。本発明は全細胞種の識別に適用することができ、細胞種は、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞等の免疫細胞系、ＣＴＣ細胞等の癌細胞系、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などの幹細胞系、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞、酵母細胞等であり、被産生物質は、サイトカイン、免疫グロブリン、抗免疫グロブリン、ホルモンを含むタンパクや、ビタミンの様な化学物資である。【0092】
そして、ウェル６１内を洗浄後、被産生物質ｍまたは特異的結合材料８１に特異的に結合する蛍光分子（例えば蛍光付き二次抗体）などの光情報保有物質８３を結合する（図７（ｅ））。このように、細胞Ｍが産生する被産生物質ｍを当該細胞Ｍが収容されたウェル６１内の被覆層６２上に結合させた特異的結合材料８１に結合し、また、被産生物質ｍ又は特異的結合材料８１に光情報保有物質８３を結合して、その光情報保有物質８３の光情報を検出することで、湿潤状態のウェル６１内に細胞Ｍ及び被産生物質ｍを保持したまま、当該ウェル６１を標識として、目的検体の正確な識別を行うことが可能となっている。【0093】
（スクリーニング方法）上記のように構成されるスクリーニング装置１は、上記の細胞収容チップ６０を用いて、以下のように目的検体を回収する。
図８は、図７の細胞収容チップ６０を用いたスクリーニング方法を示すフローチャートであり、図９（ａ）〜（ｄ）は、図８の各ステップを説明するための模式図である。
【0094】
図８に示すように、上記のように構成される細胞収容チップ６０を準備して（ステップＳ１）、被覆層６２に含まれる所定官能基６２ａ（図７参照）と、ウェル６１に収容される細胞が産生する被産生物質ｍとの結合性を有する特異的結合材料８１を結合する（ステップＳ２）（図９（ａ））。例えば、ウェル６１内の被覆層６２上に一次抗体含有固定液を滴下或いは塗布し、一次抗体を結合させる。【0095】
その後、細胞収容チップ６０上及びウェル６１内を洗浄して、被覆層６２と結合しなかった特異的結合材料を除去する。洗浄後、細胞収容チップ６０をスクリーニング装置１の固定部材１２０に装着する（ステップＳ３）。また、ステップＳ３を上記ステップＳ１とステップＳ２の間に実行してもよい。【0096】
次に、複数の細胞Ｍを含む液体（例えば、培養液）を細胞収容チップ６０上のウェル６１に導入し、複数の細胞Ｍを細胞単位で複数のウェル６１に収容する（ステップＳ４）（図９（ｂ））。このとき、液体導入後に所定時間放置して、各細胞が沈降して１つずつ各ウェル内に入るのを待つ。そして、ウェル６１に収容されなかった細胞Ｍを洗浄して除去する。【0097】
洗浄後、ウェル６１に収容された細胞Ｍを培養して被産生物質ｍの産生を促し、細胞Ｍから産生した被産生物質ｍと特異的結合材料８１を結合する（ステップＳ５）。細胞培養条件（温度、ガス種、濃度等）は、細胞種や用途等に応じて選択し得る。このとき、必要に応じて、ウェル６１に収容された細胞Ｍの培養時間を変更することができる。その後、被産生物質ｍと、特異的に結合する蛍光分子などの光情報を有する光情報保有物質８３を結合する（ステップＳ６）（図９（ｃ））。例えば、蛍光付き二次抗体含有溶液を細胞収容チップ６０上に滴下し、この蛍光付き二次抗体を被産生物質ｍに結合する。光情報保有物質８３は、上記蛍光付き二次抗体の他に、官能基付蛍光色素、ビオチン化抗体＋アビジン化蛍光色素、蛍光ビーズ付二次抗体などであってもよい。また、ステップＳ６の処理は、ステップＳ５の処理と同時に行ってもよい。その後、細胞収容チップ６０上及びウェル６１内を洗浄して、被産生物質ｍ又は特異的結合材料８１と結合しなかった光情報保有物質８３を除去する。【0098】
次に、細胞収容チップ６０の配置情報として、該細胞収容チップの基準位置の情報や補正パラメータ等を取得し（ステップＳ７）、画像解析を行って各ウェルの中心位置座標情報を取得する（ステップＳ８）。その後、細胞収容チップ６０に光を照射し、光情報保有物質８３の光情報を取得して、輝度解析を行う（ステップＳ９）。このとき、ステップＳ９における光照射に基づいて蛍光する光情報保有物質８３の光情報を取得してもよいし、予め蛍光した光情報保有物質８３の光情報を取得してもよい。輝度解析としては、光情報保有物質８３から得られる蛍光情報の時間変化を測定してもよい。
【0099】
次いで、取得された輝度情報に基づいて、ユーザが所望する微細粒子の回収条件、例えばある蛍光の輝度が所定の閾値を超えたもの、あるいは、複数の蛍光（例えば、蛍光の色が異なる）を使用した場合に、少なくとも一つの蛍光の輝度が所定の閾値を越えたものや、これらの任意の組み合わせを回収条件とする。また、任意の蛍光の輝度につき、回収から除外したもの（閾値より低いもの）を組み合わせてもよい。このようにして決定された幾つかの条件を入力し（ステップＳ１０）、上記回収条件に基づいて細胞Ｍを目的検体として特定する（ステップＳ１１）。例えば、上記回収条件を満たした輝度の光を放っているウェル６１に収容されている細胞Ｍを目的検体として特定する。【0100】
その後、吸引・吐出キャピラリ１４０の中心位置を画像解析等により取得し、その中心位置あるいは該中心位置に対して所定距離ずらした位置を、細胞回収の際の各ウェルの中心位置（位置情報）として設定する（ステップＳ１２）。そして目的検体が収容されたウェル６１の中心位置を、ステップＳ１２で設定されたウェルの中心位置に合わせるように移動し、ステップＳ１１で特定された目的検体を順次回収する（ステップＳ１３）（図９（ｄ））。回収された目的検体は、ユーザが予め設定した収容プレート５０上の所定のウェル５１に収容される。【0101】
（細胞収容チップの親水性の評価）図１０は、種々の細胞収容チップと蒸留水との接触角を測定、比較した結果を示すグラフである。
本評価では、発明例サンプル１として、親水性及びタンパク低吸着性の双方を有する第１材料と、官能基含有材料である第２材料と、架橋成分である第３材料とを含む被覆層（図７ａ）参照）を用いた。また、比較例サンプル１として官能基含有材料のみを含む被覆層、比較例サンプル２として親水性材料のみを含む被覆層、及び比較例サンプル３として被覆層を有さない未処理の細胞収容チップを用いた。また、全てのサンプルにおける基体の材質及び形状、並びに基体の製法を同一とした。以下に、発明例サンプルについて具体的に記載する。
【0102】
（発明例サンプルに用いた高分子化合物の合成例）第１材料としてポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量Ｍｎ＝４６８、新中村化学株式会社製）、第２材料としてｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ、株式会社ナード研究所製）、第３材料として３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ、ＧＥＬＥＳＴ，ＩＮＣ．製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、和光純薬工業株式会社製）を添加し、均一になるまで該モノマー混合溶液を撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．７ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＭＳのＳｉに結合したメチレンに帰属されるピーク、３．４ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．４ｐｐｍおよび８．３ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示す。
【0103】
【表1】
【0104】
（発明例サンプルの作製方法）基体に対し、酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基体表面に酸化処理を施した。この基体を高分子化合物の合成例にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬した後に、６０℃にて１８時間加熱乾燥することにより、基体表面にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、活性エステル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーからなる高分子化合物を含む層を導入した。
【0105】
接触角の測定は、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠し、以下に示すような静的法で算出した。１μＬの蒸留水を細胞収容チップ上に滴下した際の、半径ｒ（ｍｍ）及び高さｈ（ｍｍ）から接触角θ（°）を求めた。ここで、半径ｒは、水滴のチップ表面に接している面の半径、高さｈは、チップ表面から水滴の頂点までの高さである。そして、１試料につき６点測定した際の平均値を算出した。【0106】
図１０に示すように、被覆層が官能基含有材料のみを含む場合（比較例サンプル１）、被覆層と蒸留水との接触角は６９°〜７５°で平均値が７２°である。これに対し、本実施形態の被覆層（発明例サンプル１）は、親水性及びタンパク低吸着性の双方を有する材料と官能基含有材料を含んでおり、接触角が５７°〜５９°で平均値が５９°であり、親水性が大きく改善されていることが分かる。被覆層が親水性材料のみを含む場合には（比較例サンプル２）、細胞収容チップと細胞を含む液体との接触角は１４°〜１７°で平均値が１５°であるが、被産生物質と結合性を有する特異的結合材料を結合することが困難であり、かつ、ウェル内に収容された細胞や被産生物質等のタンパクが被覆層に吸着する懸念がある。また、未処理の細胞収容チップの場合（比較例サンプル３）、接触角が７８°〜８６°で平均値が８３°であり、明らかに濡れ性が悪い。これらの測定結果から、本実施形態の被覆層は、被産生物質と結合性を有する特異的結合材料を結合可能としつつ、タンパクの吸着を抑制し、良好な親水性を実現できることが分かる。【0107】
（ウェルの気泡率に基づく親水性の評価）細胞収容チップに形成されたウェルは微細であるため、ウェルを含む細胞収容チップの親水性は、細胞を含む液体のウェル内への流入に大きな影響を及ぼす。そこで、親水性の指標である細胞収容チップの接触角が、ウェルに発生する気泡率に与える影響を確認、評価するため、以下のような試験を行った。
【0108】
先ず、各細胞収容チップを固定部材にセットし、該細胞収容チップ上に、常温のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を導入し、チップ上の任意の５００ウェル中、内部に気泡が入っているウェルの個数の割合を気泡率として求めた。気泡率は、緩衝液の導入直後（気泡率（１））、緩衝液の導入から時間t（ｔ＝５分）経過後（気泡率（２））、及び緩衝液の導入から時間２ｔ（１０分）経過後（気泡率（３））、のそれぞれについて求めた。本評価では、上記親水性の評価と同じ発明例サンプル及び比較例サンプルを用いた。結果を表２に示す。【0109】
【表2】
【0110】
表２の結果から、本実施形態の被覆層（発明例サンプル１）の場合、ウェルの気泡率（１）〜（３）はそれぞれ１００％、０％、０％であり、ＰＢＳ導入直後に多くのウェル内に気泡が発見されたものの、速やかに気泡が抜け、一定時間後にはほぼ全てのウェルから気泡が抜けていることが分かる。一方、官能基含有材料のみを含む被覆層の場合（比較例サンプル１）、ウェルの気泡率（１）〜（３）は、それぞれ１００％、１００％、９６％であり、ＰＢＳ導入直後にほぼ全てのウェルに気泡が入り、一定時間経過後でもほぼ全てのウェルに気泡が残留した。また、親水性材料のみを含む被覆層の場合（比較例サンプル２）、ウェルの気泡率（１）〜（３）はいずれも０％であり、ＰＢＳ導入直後及び一定時間経過後のいずれでも、気泡が入っているウェルは発見されなかった。また、未処理の細胞収容チップの場合（比較例サンプル３）、ウェルの気泡率（１）〜（３）は、それぞれ１００％であり、ＰＢＳ導入直後に全てのウェルに気泡が入り、一定時間経過後でも全てのウェルに気泡が残留した。【0111】
細胞をウェルに収容する場合、細胞を含む液体（細胞懸濁液ともいう）を細胞収容チップ上に導入し、静置することで、細胞が液体中でゆっくりと沈降し、ウェル内に収容される。しかし、細胞収容チップの表面やウェルの表面の濡れ性が悪いと、ウェル内に気泡が発生し、細胞が沈降する際にウェル内の気泡によってその進行が妨げられ、ウェル内に細胞を収容することができない。よって、細胞が液体中で沈降する前にウェル内の気泡が抜けるだけの親水性が細胞収容チップの表面に必要である。本実施形態によれば、細胞収容チップの表面の接触角が６０°以下であれば、ウェル内での気泡の発生を防止するのに十分な親水性を有しており、微細なウェル内に細胞を確実に収容できることが確認された。【0112】
（細胞収容チップの細胞低接着性の評価）次に、図１０に示す評価で使用したサンプルと同様の被覆層に対する細胞の接着率を測定、比較した。
細胞の接着率の測定と評価には、以下のように実施した。まず図８に示すように、各細胞収容チップ上に一次抗体含有固定液を滴下し、一次抗体を結合させた。その後、該細胞収容チップ表面を洗浄して、結合しなかった一次抗体及び固定液の成分を除去した。洗浄後、各細胞収容チップを固定部材にセットし、複数の２９３Ｔ細胞を含む培養液を該細胞収容チップ上に導入し、複数の該細胞を細胞単位で複数のウェルに収容した。その後、ウェルに収容されなかった該細胞を洗浄して除去した。洗浄後、該細胞収容チップとウェルに収容された該細胞を６０分培養し、回収機構を含む細胞のスクリーニング装置で、該細胞収容チップ上のウェルに格納された該細胞を４８個回収しようとした際に、該細胞収容チップ表面に接着して回収できなかった該細胞の割合を接着率とした。測定点数ｎ＝４８とした。
【0113】
本評価では、上記親水性の評価と同じ発明例サンプル１及び比較例サンプル１、２を用いた。結果を表３に示す。【0114】
【表3】
【0115】
表３に示すように、本実施形態の被覆層（発明例サンプル１）の場合、２９３Ｔ細胞の接着率は約８％（４個）であり、大半の２９３Ｔ細胞が被覆層に接着していないことが分かる。一方、官能基含有材料のみを含む被覆層の場合（比較例サンプル１）、２９３Ｔ細胞の接着率は約９６％（４６個）であり、ほぼ全ての細胞が被覆層に接着したことが分かる。また、親水性材料のみを含む被覆層の場合（比較例サンプル２）、接着率は約８３％（４０個）であり、ほぼ全ての細胞が被覆層に接着したことが分かる。この結果から、本実施形態の被覆層によれば、被覆層に対する細胞の接着率が格段に低く、ウェル内の被覆層が当該ウェルに収容される細胞と接着し難く、良好な細胞低接着性を実現できることが分かった。【0116】
（特異的結合材料に対する結合性評価）細胞が産生する被産生物質との結合性を有する特異的結合材料に対する活性エステル基の結合性を評価する為に、基体表面に固定化したビオチンと、アビジンとの相互作用解析を行った。発明例サンプル２として、上記「（発明例サンプルに用いた高分子化合物の合成例）」で合成した高分子からなる被覆層を有する環状ポリオレフィン基板を作製した。比較例サンプル４として、被覆層を有さない環状ポリオレフィン基板を用いた。
【0117】
（ビオチンの固定化とアビジンとの相互作用）発明例サンプル２、比較例サンプル４に対し、pH9.0の炭酸バッファーで1mMに調製したビオチンヒドラジド溶液を点着し、37℃で1時間静置する事で、基板表面にビオチン分子を固定化した。基板を純水で洗浄後、0.1% Tween20を含むPBSで2μg/mLに調製したCy3標識Streptavidin溶液に基板を浸漬し、室温で1時間反応させる事で、ビオチンとアビジンとを結合させた。
【0118】
（ビオチンとアビジンとの相互作用解析）0.1% Tween20を含むPBSで基板を洗浄後、市販のマイクロアレイ用スキャナで、ビオチンヒドラジド溶液を点着した部分のCy3色素の蛍光シグナル（S）と、点着しなかった部分のCy3色素の蛍光シグナル（N）を検出し、S/N比として記載した結果を表４に示す。発明例サンプル２と比較例サンプル４とのＳ／Ｎ比の比較により、細胞が産生する被産生物質に見立てたアビジン分子との結合性を有するビオチン分子を、活性エステル基を有する発明例サンプル２を用いることで簡便に基板表面に固定化することが可能であることが示された。
【0119】
【表4】
【0120】
（架橋による効果の確認）次に、ポリマーの架橋が洗浄によるシグナル低減を防止する効果を示す目的で、エタノールによる洗浄前後でのタンパク質の吸着量変化を確認した。発明例サンプル３として、上記「（発明例サンプルに用いた高分子化合物の合成例）」で合成した高分子からなる被覆層を有するポリスチレン基板を作製した。比較例５として、親水性及びタンパク低吸着性の双方を有する第１材料と、官能基含有材料である第２材料のみで構成された被覆層を有するポリスチレン基板を作製した。比較例サンプル６として、被覆層を有さないポリスチレン基板を用いた。ポリスチレン基板として、96ウェルプレートを用いた。
【0121】
（タンパク質の吸着）発明例サンプル３、比較例サンプル５、比較例サンプル６の一部のウェルにエタノールを分注して30分静置した後、エタノールを除いて室温で風乾した。PBSで0.5μg/mLに調製したペルオキシダーゼ標識アビジン溶液を各サンプルに分注し、室温で1時間静置し、基板表面にアビジンを吸着させた。0.1% Tween20を含むPBSで基板を洗浄後、市販のHRP用発色液（住友ベークライト社製）を用いて各ウェルを発色させ、市販のプレートリーダーで450nmの吸光度を測定する事で、アビジンの吸着量を測定した。
【0122】
（タンパク質の吸着量変化の測定）発明例サンプル３、比較例サンプル５、比較例サンプル６について、エタノールで洗浄したウェルと洗浄しなかったウェルとの吸光度を表５に示す。吸光度は、波長６７０ｎｍの吸光度をリファレンスとし、波長４５０ｎｍの吸光度との差を求めた。発明例サンプル３では洗浄前後で吸光度に大きな変化はないが、比較例サンプル５では洗浄後に吸光度の上昇が見られた。このことから、発明例サンプル３の架橋構造の効果により、エタノール洗浄による被覆層への影響を回避できたことが分かる。また被覆層を持たない比較例サンプル６では、洗浄前後に関係なく高い吸光度が観測されており、発明例サンプル３との比較において第１材料による低吸着性が確認できる。
【0123】
【表5】
【0124】
上述したように、本実施形態によれば、複数のウェル６１内の被覆層６２の表面が、細胞低接着性を有すると共に、ウェル６１に収容される細胞Ｍが産生する被産生物質ｍとの結合性を有する特異的結合材料８１に対して結合性を有する。この被覆層６２の親水性材料により、細胞Ｍを含む液体が微細なウェル６１内に入り易く、各ウェルに単一細胞を収容する精度を高めることができ、目的検体を識別・分取する精度や効率を向上することができる。また、従来のチップでは、被産生物質との結合性を有する物質（Ｉｇ抗体など）をチップ上に予め結合させた構成であるため、当該チップの長期間の保存が難しく、乾燥等により精度が低下する可能性がある。一方、本実施形態によれば、被覆層６２の表面が特異的結合材料８１との結合性を有することにより、被産生物質ｍとの結合性を有する特異的結合材料８１を細胞収容チップ６０上に予め結合させる必要が無く、乾燥等による精度低下を防止することができる。また、被覆層６２の親水性によってウェル６１内が従来よりも乾燥し難くなるため、特異的結合材料８１の結合後もウェル６１内を湿潤状態で保持することができ、特異的結合材料８１の乾燥等による精度の低下を防止することができる。また、被覆層６２表面の特異的結合材料８１との結合性により、特異的結合材料８１が所定官能基６２ａと結合し、また、被覆層６２のウェル６１内の細胞Ｍから産生される被産生物質ｍが特異的結合材料８１と結合するため、当該ウェル６１自体を目的検体識別の際の標識部位とすることができ、細胞Ｍにダメージを与えること無く目的検体を識別することができる。更に、被覆層６２の表面が細胞低接着性を有することにより、ウェル内の細胞Ｍがウェル６１の内表面や基体６０ａの上面６０ｂに接着するのを防止することができ、ブロッキング剤等を用いたコーティング処理を要すること無く、目的検体である細胞Ｍを高効率で回収でき、更に細胞回収時に当該細胞Ｍにダメージを与えること無く回収することができる。また、被覆層６２がタンパク低吸着性材料を有するため、被産生物質ｍがタンパクである場合、細胞収容チップ表面への被産生物質ｍの非特異的な吸着を防止し、ブロッキング剤等を用いたコーティング処理を要すること無く良好な検出感度を維持することができる。【0125】
また、本実施形態によれば、細胞低接着性及びウェル６１に収容される細胞Ｍが産生する被産生物質ｍとの結合性を有する特異的結合材料８１に対して結合性を持つ表面を有する被覆層６２を備えた細胞収容チップ６０を準備し、被覆層６２の表面に特異的結合材料８１を結合し、複数の細胞Ｍを含む液体を細胞収容チップ６０に導入して、複数の細胞Ｍを細胞単位で複数のウェル６１に収容し、ウェル６１に収容された細胞Ｍからの被産生物質ｍと、上記特異的結合材料８１を結合し、被産生物質ｍ又は特異的結合材料８１と、光情報を有する光情報保有物質８３を結合するので、目的検体を高精度且つ高効率で識別・分取することができる。また、取扱が簡単で、細胞回収時に細胞Ｍにダメージを与えること無く容易な回収を実現することができる。【0126】
以上、本実施形態に係る細胞収容チップ、及び該細胞収容チップを用いたスクリーニング方法について述べたが、本発明は記述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術思想に基づいて各種の変形および変更が可能である。【0127】
例えば、図８、９では、上記回収条件を満たした輝度の光を放っているウェル６１に収容されている細胞Ｍを目的検体として特定している（ステップＳ１１）。すなわち、図８、９では、細胞Ｍから分泌される被産生物質ｍ（図９の白色のＹ）と特異的に結合する光情報保有物質８３を用いており、細胞Ｍから産生される被産生物質ｍは、当該細胞Ｍが収容されたウェル６１に結合する。よって、上述のように、光情報保有物質８３を特異的結合材料８１に結合させるタイミング（ステップＳ６）は、ステップＳ５の後か、或いはステップＳ５と同時に行うことができる。【0128】
これに対し、上記回収条件で用いた閾値以上の輝度の光を放っているウェル以外のウェル６１に収容されている細胞Ｍを、目的検体として特定するスクリーニング方法を用いてもよい。以下、図８のフローチャートと同一の部分については説明を省略し、異なる部分を説明する。【0129】
図１１に示すように、先ず、複数の細胞Ｍを細胞単位で複数のウェル６１に収容した後（ステップＳ４）、各細胞を培養して被産生物質ｍの産生を促し、細胞Ｍから産生した被産生物質ｍとウェル６１内の特異的結合材料８１を結合する（ステップＳ５）。これにより、目的検体となる細胞Ｍが収容されたウェル６１内の特異的結合材料８１が被産生物質ｍによって覆われ、目的検体となる細胞Ｍが収容されていないウェル６１内の特異的結合材料８１は被産生物質ｍによって覆われない。そして本変形例では、被産生物質ｍと特異的に結合せず、特異的結合材料８１と特異的に結合する他の光情報保有物質を用い、当該他の光情報保有物質を特異的結合材料８１と結合させる（ステップＳ６’）。これにより、被産生物質ｍを産生した細胞Ｍが収容されたウェル６１は光を放たず、被産生物質ｍを産生していない細胞Ｍが収容されたウェル６１が光を放つ。よって本方法では、ステップＳ５とステップＳ６’を同時に行わず、ステップＳ５の後にステップＳ６’を行う。【0130】
その後、光情報保有物質８３の光情報を取得して、輝度解析を行い（ステップＳ９）。取得された輝度情報に基づいて、ユーザが所望する微細粒子の回収条件を入力し（ステップＳ１０）、上記回収条件に基づいて細胞Ｍを目的検体として特定する（ステップＳ１１）。このとき、光を放っていないこと、或いは輝度が所定の閾値以下であることを回収条件とし、該回収条件を満たしたウェル６１に収容されている細胞Ｍを目的検体として特定する。本方法によっても、所望の目的検体を回収することができる。【0131】
この出願は、２０１６年３月３１日に出願された特願２０１６−０７０９６９号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。