特許 6961713 タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6961713

(24)【登録日】2021年10月15日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/61 20060101AFI20211025BHJP

   C12N 9/90 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20211025BHJP

   C12P 19/02 20060101ALI20211025BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/61ZNA

   C12N9/90

   C12N9/12

   C12N15/54

   C12P19/02

【請求項の数】6

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2019-552866(P2019-552866)

(86)(22)【出願日】2018年3月30日

(65)【公表番号】特表2020-511974(P2020-511974A)

(43)【公表日】2020年4月23日

(86)【国際出願番号】KR2018003769

(87)【国際公開番号】WO2018182355

(87)【国際公開日】20181004

【審査請求日】2019年9月30日

(31)【優先権主張番号】10-2017-0042166

(32)【優先日】2017年3月31日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2017-0111494

(32)【優先日】2017年8月31日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2017-0158766

(32)【優先日】2017年11月24日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11996P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12093P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12109P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12232P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12235P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12236P

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】512088051

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＣＪ ＣｈｅｉｌＪｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(74)【代理人】

【識別番号】100165526

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 寛

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， スンジェ

(72)【発明者】

【氏名】リー， ヤン ミ

(72)【発明者】

【氏名】パク， イル ヒャン

(72)【発明者】

【氏名】チョ， ヒュン ク

(72)【発明者】

【氏名】キム， ソン ボ

(72)【発明者】

【氏名】リー， チャン−ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ， エウン ジュン

(72)【発明者】

【氏名】シン， サン ミ

【審査官】 玉井 真人

(56)【参考文献】

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１５−００４２３９１（ＫＲ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／０１８６１６２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2015, Vol.290, pp.28963-28976

【文献】 J. Appl. Glycosci., 2010, Vol.57, pp.1-6

【文献】 "Tagatose 6-phosphate kinase," 2017.1.18, retrieved on the Internet, retrieved on 2020.9.29, URL: https://www.uniprot.org/uniprot/A9CES6.txt?version=51

【文献】 "Tagatose 6-phosphate kinase," 2013.12.11, retrieved on the Internet, retrieved on 2020.9.29, URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/217335896

【文献】 "Putative tagatose-6-phosphate kinase," 2017.1.18, retrieved on the Internet, retrieved on 2020.9.28, URL: https://www.uniprot.org/uniprot/E8N0N6.txt?version=29

【文献】 "Tagatose-6-phosphate kinase," 2017.1.18, retrieved on the Internet, retrieved on 2020.9.28, URL: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0B3BKZ0.txt?version=15

【文献】 "Uncharacterized protein," 2016.5.11, retrieved on the Internet, retrieved on 2020.9.29, URL: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0S8BRR6.txt?version=4

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

Ｃ１２Ｐ １９／００ー１９／６４

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

タガトース−６−リン酸キナーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含む、前記タガトース−６−リン酸キナーゼによって基質である果糖を変換するための、タガトース生産用組成物。

【請求項2】

前記組成物が、果糖をさらに含む、請求項１に記載のタガトース生産用組成物。

【請求項3】

前記組成物が、配列番号１、３、５、７、９または１１のアミノ酸配列からなるタガトース−６−リン酸キナーゼを１つ以上含むものである、請求項１に記載のタガトース生産用組成物。

【請求項4】

前記タガトース−６−リン酸キナーゼが、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体である、請求項１に記載のタガトース生産用組成物。

【請求項5】

果糖を、タガトース−６−リン酸キナーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物と接触させて、前記果糖をタガトースに転換させる段階を含み、前記タガトース−６−リン酸キナーゼは基質である果糖を変換するために用いられる、タガトースの製造方法。

【請求項6】

前記接触が、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の条件で、３０℃〜８０℃の温度条件で、または０．５時間〜４８時間行われる、請求項５に記載のタガトースの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、果糖−４−エピマー化酵素を含むタガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タガトースは、牛乳、チーズ、カカオなどの食品、リンゴやみかんなどの甘味が出る天然果実に少量存在する天然甘味料であり、物理的性質も砂糖と類似である。タガトースのカロリーは１．５ｋｃａｌ／ｇで砂糖の１／３水準であり、ＧＩ（Ｇｌｙｃｅｍｉｃ ｉｎｄｅｘ、血糖指数）は３で砂糖の５％水準であるのに対し、砂糖と同様の甘味を出しながら、様々な健康機能性を有するため、様々な製品に適用すると健康と味を同時に満足できる代替甘味料として用いられる。

【0003】

従来公知されたタガトースの製造方法は、ガラクトースを主原料とした化学的（触媒反応）方法と生物学的（異性化酵素反応）方法がある（特許文献１〜３を参照）。しかし、前記従来の製造方法でガラクトースの基礎原料となる乳糖は、国際市場での原乳及び乳糖の生産量、需要及び供給量などに応じて価格の不安定性が存在し、タガトース生産原料の安定的な需給に限界がある。したがって、普遍化された糖（砂糖、ブドウ糖、果糖など）を原料としてタガトースを製造しうる新しい方法が必要で研究されたところ、前記文献は、グルコースとガラクトース及び果糖からそれぞれガラクトース、プシコース及びタガトースを生産する方法を開示している（特許文献４〜６）。

【0004】

一方、タガトース−６−リン酸キナーゼ（Ｔａｇａｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ：ＥＣ２．７．１．１４４）は、下記［反応式１］のようにＡＴＰとＤ−タガトース６−リン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質にしてＡＤＰとＤ−タガトース１，６二リン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ １，６−ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生産すると知られていたが、前記タガトース−６−リン酸キナーゼが果糖（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）をタガトースに転換させる活性を有するかについての報告はない。

【0005】

［反応式１］
ＡＴＰ＋Ｄ−タガトース６−リン酸 ＜＝＞ ＡＤＰ＋Ｄ−タガトース１，６二リン酸

【0006】

このような背景下で、本発明者らは、果糖をタガトースに転換させる活性を有する酵素を開発するために鋭意研究努力した結果、タガトース−６−リン酸キナーゼ（Ｔａｇａｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ：ＥＣ２．７．１．１４４）が果糖をタガトースに転換させる活性があることを確認することにより、本出願を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際特許公報ＷＯ２００６／０５８０９２

【特許文献2】韓国登録特許第１０−０９６４０９１号

【特許文献3】韓国登録特許第１０−１３６８７３１号

【特許文献4】韓国登録特許第１０−７４４４７９号

【特許文献5】韓国登録特許第１０−１０５７８７３号

【特許文献6】韓国登録特許第１０−１５５０７９６号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，９．５０−９．５１，１１．７−１１．８

【非特許文献2】Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）

【非特許文献3】Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）

【非特許文献4】Ｉｚｓｖａｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３０２：９３−１０２（２０００）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本出願の一つの目的は、タガトースの製造に有用な組成物を提供することにあって、前記組成物はタガトース−６−リン酸キナーゼ、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を含む。

【0010】

本出願の他の目的は、本願の果糖−４−エピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を果糖と接触させて果糖をタガトースに転換させる段階を含むタガトースの製造方法を提供することにある。

【0011】

以下、本出願の他の目的及び利点は、添付した請求範囲及び図面と共に下記の詳細な説明によってより明確になる。本明細書に記載されない内容は、本出願の技術分野または類似の分野で熟練された者であれば、十分に認識かつ類推できるため、その説明を省略する。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本出願の目的を達成するために、本出願は一様態として、タガトース−６−リン酸キナーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含むタガトース生産用組成物を提供する。
前記タガトース−６−リン酸キナーゼ（Ｔａｇａｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ， ＥＣ ２．７．１．１４４）は、ＡＴＰとＤ−タガトース−６−リン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質としてＡＤＰとＤ−タガトース１，６−二リン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ １，６−ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生産すると知られているもの。
具体的には、前記組成物は、配列番号１、３、５、７、９または１１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく。
本願に至って「タガトース−６−リン酸キナーゼ」が果糖の４番炭素位置をエピマー化して果糖をタガトースに転換させる果糖−４−エピマー化活性を示すことを明らかにし、したがって、本願では「果糖−４−エピマー化酵素」と互換的に用いられてもよい。
一具現例として、本出願の果糖−４−エピマー化酵素は、耐熱性微生物由来の酵素であってもよく、例えば、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｓｐ．由来の酵素、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、またはその変異体、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体であってもよく、具体的には、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、 Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓまたはＤｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ由来の酵素またはその変異体であってもよいが、これに制限されるものではない。
本願の果糖−４−エピマー化酵素またはその変異体は、Ｄ−フルクトース（果糖）の４番炭素位置をエピマー化してＤ−タガトースに転換させる特徴があるもので本願でタガトース−６−リン酸キナーゼ（Ｔａｇａｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）が果糖−４−エピマー化酵素としての活性を有することを明らかにした。タガトース−６−リン酸キナーゼはＤ−タガトース６−リン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質としてＤ−タガトース１，６−二リン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ １，６−ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生産することが知られていた。つまり、タガトース−６−リン酸キナーゼが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを新たに明らかにすることによって、本出願の一具現例は果糖からタガトースを製造するに当たり、タガトース−６−リン酸キナーゼを果糖−４−エピマー化酵素として用いることを含むタガトース−６−リン酸キナーゼの新規用途に関する。
一具現例として、本出願の果糖−４−エピマー化酵素は、耐熱性の高い酵素であってもよい。具体的には、本出願の果糖−４−エピマー化酵素は、５０℃〜７０℃で最大活性の５０％〜１００％の活性を示しうる。
さらに、これに制限されるものではないが、前記配列番号１からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列によって；配列番号３からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号４のヌクレオチド配列によって；配列番号５からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号６のヌクレオチド配列によって；配列番号７からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号８のヌクレオチド配列によって；配列番号９からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号１０のヌクレオチド配列によって；配列番号１１からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号１２のヌクレオチド配列によってそれぞれ暗号化されるものであってもよい。
本出願の果糖−４−エピマー化酵素またはその変異体は、本出願の前記酵素またはその変異体を発現するＤＮＡ、例えば、配列番号２、４、６、８、１０または１２のヌクレオチドでＥ． ｃｏｌｉなどの菌株に形質転換させた後、これを培養して培養物を収得し、前記培養物を破砕して、カラムなどを介して精製して得られたものであってもよい。前記形質転換用菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ などがある。
具体例では、これらの形質転換された菌株としてＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ（これの別名はＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ａｎ１である）、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅ、またはＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅであり、これらはそれぞれ順にブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託番号ＫＣＣＭ１１９９６Ｐ（寄託日：２０１７年３月２０日）、ＫＣＣＭ１２０９３Ｐ（寄託日：２０１７年８月１１日）、ＫＣＣＭ１２１０９Ｐ（寄託日：２０１７年９月１３日）、ＫＣＣＭ１２２３２Ｐ（寄託日：２０１８年３月２３日）、ＫＣＣＭ１２２３５Ｐ（寄託日：２０１８年３月２３日）及びＫＣＣＭ１２２３６Ｐ（寄託日：２０１８年３月２３日）として寄託した。
前記ベクターを形質転換させる方法は熱ショック法などが含まれてもよいが、これに制限されない。
前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。

【0013】

本出願の微生物は、本出願の核酸または本出願の組換えベクターを含み、本出願の果糖−４−エピマー化酵素を生産しうる微生物であれば、原核微生物及び真核微生物いずれも含まれてもよい。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物菌株が含まれてもよく、具体的には、Ｅ． ｃｏｌｉまたはｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであってもよいが、これに制限されない。このような微生物の例としては、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４ＥまたはＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅがある。

【0014】

本出願の微生物は、前記核酸またはベクター導入の他にも、様々な公知の方法により本出願の果糖−４−エピマー化酵素を発現しうる微生物をすべて含んでもよい。

【0015】

本出願の微生物の培養物は、本出願のタガトース−６−リン酸キナーゼを発現する微生物を培地で培養して製造したものであってもよい。

【0016】

本出願において、用語、「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は当業界に公知の適当な培地と培養条件に応じて行われてもよい。このような培養過程は選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して用いてもよい。前記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。この時、培養条件は特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ７〜９）を調節してもよい。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよく、また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気の状態を維持するために気体を注入せず、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養温度は、２５℃〜４０℃、具体的には、３０℃〜３７℃を維持してもよいが、これに制限されない。培養期間は、所望の有用物質の生産量が収得できるまで続けてもよく、具体的には、約０．５時間〜６０時間培養してもよいが、これに制限されない。また、用いられる培養用培地は炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でん粉及びセルロース）、 油 脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたりまたは混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたりまたは混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたりまたは混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。

【0017】

本出願のタガトース生産用組成物は、さらに果糖を含んでもよい。

【0018】

本出願のタガトース生産用組成物は、果糖を直接タガトースに転換させる果糖−４−エピマー化活性を有するタガトース−６−リン酸キナーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含むものであって、基質である果糖以外の他の酵素を含まないことを特徴としてもよい。

【0019】

例えば、α−グルカンホスホリラーゼ（α−ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、デンプンホスホリラーゼ（ｓｔａｒｃｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、マルトデキストリンホスホリラーゼ（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）またはスクロースホスホリラーゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、これを発現する微生物または前記微生物の培養物；
グルコキナーゼ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）、これを発現する微生物または前記微生物の培養物；
タガトース−６−リン酸脱リン酸化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物；及び／または
α−アミラーゼ（α−ａｍｙｌａｓｅ）、プルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）、グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）、スクラーゼ（ｓｕｃｒａｓｅ）またはイソアミラーゼ（ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ）；前記アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物；または前記アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物の培養物を含まないことを特徴としてもよい。

【0020】

本出願のタガトース生産用組成物は、当該タガトース生産用組成物に通常用いられる任意の適切な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0021】

本出願のタガトース生産用組成物は、金属をさらに含んでもよい。一具現例では、本出願の金属は２価陽イオンを含む金属であってもよい。具体的には、本出願の金属はマグネシウム、ニッケル、またはマンガン（Ｍｎ）であってもよい。より具体的には、本出願の金属は金属イオンまたは金属塩であってもよく、より具体的には、前記金属塩は、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＮｉＳＯ_４、ＮｉＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２またはＭｎＳＯ_４であってもよい。

【0022】

本出願は別の様態として、果糖（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を本出願の果糖−４−エピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物と接触させて前記果糖をタガトースに転換する段階を含むタガトースの製造方法を提供する。

【0023】

本出願の一具現例として、前記接触はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０、温度は、３０℃〜８０℃の温度条件で、及び／または０．５時間〜４８時間行ってもよい。

【0024】

具体的には、本出願の接触はｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の条件またはｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の条件で行ってもよい。また、本出願の接触は３５℃〜８０℃、４０℃〜８０℃、４５℃〜８０℃、５０℃〜８０℃、５５℃〜８０℃、６０℃〜８０℃、３０℃〜７０℃、３５℃〜７０℃、４０℃〜７０℃、４５℃〜７０℃、５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、６０℃〜７０℃、３０℃〜６５℃、３５℃〜６５℃、４０℃〜６５℃、４５℃〜６５℃、５０℃〜６５℃、５５℃〜６５℃、３０℃〜６０℃、３５℃〜６０℃、４０℃〜６０℃、４５℃〜６０℃、５０℃〜６０℃または５５℃〜６０℃の温度条件で行ってもよい。また、本出願の接触は０．５時間〜３６時間、０．５時間〜２４時間、０．５時間〜１２時間、０．５時間〜６時間、１時間〜４８時間、１時間〜３６時間、１時間〜２４時間、１時間〜１２時間、１時間〜６時間、３時間〜４８時間、３時間〜３６時間、３時間〜２４時間、３時間〜１２時間、３時間〜６時間、６時間〜４８時間、６時間〜３６時間、６時間〜２４時間、６時間〜１２時間、９時間〜４８時間、９時間〜３６時間、９時間〜２４時間、９時間〜１２時間行ってもよい。

【0025】

一具現例として、本出願の接触は金属の存在下で行ってもよい。

【0026】

本出願のタガトース製造方法において、本出願の果糖−４−エピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物、前記微生物の培養物、金属、金属イオン及び金属塩は他の様態で前述したとおりである。

【0027】

本出願の製造方法は、製造されたタガトースを分離及び／または精製する段階をさらに含んでもよい。前記分離及び／または精製は、本出願の技術分野で通常用いられる方法を用いてもよく、非限定的な例として、透析、沈殿、吸着、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー及び分別結晶などを用いてもよい。前記精製は一つの方法だけ行ってもよく、２つ以上の方法を一緒に行ってもよい。

【0028】

また、本出願の製造方法は、前記分離及び／または精製する段階の前後に脱色及び／または脱塩を行う段階をさらに含んでもよい。前記脱色及び／または脱塩を行うことにより、より品質に優れたタガトースを得ることができる。

【0029】

他の具現例として、本出願の製造方法は、本出願のタガトースに転換する段階、分離及び／または精製する段階、または脱色及び／または脱塩段階の後にタガトースを結晶化する段階をさらに含んでもよい。前記結晶化は通常用いる結晶化方法を用いて行ってもよい。例えば、冷却結晶化方法を用いて結晶化を行ってもよい。

【0030】

別の具現例として、本出願の製造方法は、前記結晶化する段階の前にタガトースを濃縮する段階をさらに含んでもよい。前記濃縮は結晶化の効率を高めうる。

【0031】

別の具現例として、本出願の製造方法は、本出願の分離及び／または精製する段階の後、未反応の果糖を本出願の酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物と接触させる段階、本出願の結晶化する段階の後に結晶が分離された母液を前記分離及び／または精製段階に再利用する段階、またはその組み合わせをさらに含んでもよい。前記追加段階を介してタガトースをさらに高収率で得ることができ、捨てられる果糖の量を削減することができて経済的利点がある。

【発明の効果】

【0032】

本出願の果糖−４−エピマー化酵素は、耐熱性に優れて産業的にタガトース生産が可能であり、普遍化された糖である果糖をタガトースに高収率で転換する経済性が高い効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】本出願の一実施例に係る形質転換体で生成されて分離されたタガトース−６−リン酸キナーゼ（ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ）の分子量をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した結果を示す。

【図2】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ（ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ）が果糖−４−エピマー化酵素の活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果である。

【図3】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ（ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ）の果糖−４−エピマー化活性における温度変化による活性の程度を示すグラフである。

【図4】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素の活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーのグラフである。

【図5】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅの温度変化に係る果糖−４−エピマー化の活性を示すグラフである。

【図6】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅの金属添加に係る果糖−４−エピマー化の活性を示すグラフである。

【図7】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素の活性を示すＨＰＬＣクロマトグラフィーのグラフである。

【図8】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅの温度変化に係る果糖−４−エピマー化の活性を示すグラフである。

【図9】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅの金属添加に係る果糖−４−エピマー化の活性を示すグラフである。

【図10】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ（ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅ）が果糖−４−エピマー化酵素の活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果である。

【図11】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ（ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅ）が果糖−４−エピマー化酵素の活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果である。

【図12】本出願の一実施例で製造したタガトース−６−リン酸キナーゼ（ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅ）が果糖−４−エピマー化酵素の活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、本出願にかかる実施例を記述することにより本出願をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本出願の一例示に過ぎず、本出願の内容がこれに限定されるものと解釈されてはならない。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのもので、添付された請求項に記載された本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかである。

【0035】

実施例１：タガトース−６−リン酸キナーゼの製造及びその活性の評価

【0036】

実施例１−１：タガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換体の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を提供するために、２種のＡｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅに由来したタガトース−６−リン酸キナーゼの遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物（形質転換体）を製造した。

【0037】

具体的には、 ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）に登録されたＡｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅの遺伝子配列を対象にタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子配列を選抜し、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅのアミノ酸配列（配列番号１）と塩基配列（配列番号２）及びアミノ酸配列（配列番号７）と塩基配列（配列番号８）を基に、大腸菌発現可能ベクターであるｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓに挿入して製作された組換え発現ベクターをバイオニアに合成依頼した。組換え発現ベクターを用いるために、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅのゲノミックＤＮＡを用いて、プライマー１：
ＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＧＧＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号１３）とプライマー２：
ＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＴＣＣＡＧ（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で２分の伸長を３５回繰り返した後、７２℃で５分間伸長反応を行った。

【0038】

タンパク質の発現を誘導するために大腸菌発現用菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅと命名した。ブダペスト条約下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅは２０１７年３月２０日に寄託番号ＫＣＣＭ１１９９６Ｐとして寄託され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅは２０１８年３月２３日に寄託番号ＫＣＣＭ１２２３２Ｐとして寄託された。

【0039】

実施例１−２：組換え酵素の製造及び精製
組換え酵素を製造するために、前記実施例１−１で製造した形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅをアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢ液体培地５ｍｌを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）とタンパク質発現調節因子であるラクトースが含有された液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記培養過程中の撹拌速度は１８０ｒｐｍであり、培養温度は３７℃が維持されるようした。培養液は８，０００ｒｐｍで、４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭ イミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）及び３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に再懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物は１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液はＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製し、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。最終的に２５０ｍＭ イミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝液を流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析した後、酵素特性解析のための酵素２種（ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ、ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅ）を確保した。その結果、精製された組換え果糖−４−エピマー化酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介してＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅが約４７ｋＤａであることを確認した（図１）。

【0040】

実施例１−３：果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例１−２から得られた酵素の活性を測定するために、３０重量％果糖を用い、ここに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＣｏＳＯ_４、前記実施例１−２で分離された２０ｍｇ／ｍｌの精製酵素を添加して、温度６０℃で２時間反応した。果糖−４−エピマー化酵素ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ、ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅによって転換されたタガトースの濃度及び果糖からタガトースに転換された転換率を確認した結果、ＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅの転換率は１６．１％、ＣＪ＿ＡＮＴＡ＿Ｆ４Ｅの転換率は２１．９％であった。前記換算率は次の式で計算された：転換率＝タガトース生成量／果糖基質濃度×１００

【0041】

また、反応後に残存する果糖と生成物であるタガトースの場合、ＨＰＬＣを用いて定量した。用いたカラムはＳｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０であり、カラム温度を８０℃にし、移動相である水の流速は１ｍｌ／分で流した。図２及び図１０にＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて果糖を基質とする前記酵素の反応を示すピークを検出し定量した。

【0042】

実施例１−４：果糖−４−エピマー化活性に対する温度の影響
本出願の酵素のエピマー化活性に対する温度の影響性を調査するために、果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に、前記実施例１−２で製造した１ｍｇ／ｍｌの精製酵素を添加して、５０℃〜８０℃で３時間反応し、反応終了液はＨＰＬＣを用いてタガトースを定量分析した。その結果、本出願のＣＪ＿ＡＮＴ＿Ｆ４Ｅ酵素は７０℃で最大活性を示した（図３）。

【0043】

実施例２：タガトース−６−リン酸キナーゼの製造及びその活性の評価

【0044】

実施例２−１：タガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換体の製造
本発明者らは、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔａｘｏｎ ＩＤ：２６５４５８８０９８由来のタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能な組換えベクター及び形質転換微生物を製造した。

【0045】

より具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）及びＥＮＡ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｃｈｉｖｅ）に登録されたＡｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子配列を対象にタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子配列を選抜して、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のタガトース−６−リン酸キナーゼＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅのアミノ酸配列（配列番号３）及び塩基配列（配列番号４）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換え発現ベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを製造した（（株）バイオニア、韓国）。

【0046】

前記それぞれの各組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記形質転換菌株をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１７年０８月１１日付けで寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２０９３Ｐを付与された。

【0047】

実施例２−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例２−１に従って製造した形質転換菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅ由来のＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅから本出願換え酵素を収得するために、前記それぞれの形質転換微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。続いて、前記培養液を８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に再懸濁した。前記再懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して、酵素特性解析のための精製酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0048】

実施例２−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例２−２で確保した本出願組換え酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅの活性を測定するために、３０重量％果糖に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＮｉＳＯ_４、及び各２０ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを添加して、６０℃で１０時間反応させた。

【0049】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースはＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬＣ分析は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した（図４）。

【0050】

実験の結果、前記酵素によって果糖からタガトースに転換された転換率は５．１％であることを確認した。

【0051】

実施例２−４：組換え酵素の温度変化による活性の確認
前記実施例２−２で得られた組換え酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性に対する温度の影響力を調査するために１０重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に１ｍｇ／ｍｌ ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを添加して４５℃、５０℃、５５℃、６０℃及び７０℃の様々な温度で３時間反応させた。反応が完了した後、反応液内のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0052】

実験の結果、ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅ酵素は６５℃で最大活性を示し、ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅは５０℃〜７０℃で最大活性の５０％以上を維持することが確認できた（図５）。

【0053】

実施例２−５：金属イオンの添加による組換え酵素活性の確認
従来公知の異性化酵素、例えば、グルコース異性化酵素及びアラビノース異性化酵素及びエピマー酵素、例えば、プシコース３−エピマー化酵素は、金属イオンを必要とすることが知られていた。したがって、前記実施例２−２で得られた本出願の組換え酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅも金属イオンが果糖−４−エピマー化活性に影響を与えるかどうかを確認した。

【0054】

より具体的には、１０重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に、２ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを添加し、様々な金属イオンＮｉＳＯ_４、ＣａＣｌ_２、ＺｎＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＭｎＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４、ＣｕＳＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を各１ｍＭずつ添加して酵素活性を測定した。金属イオンを処理しない場合を対照群として設定した。前記反応が完了した後、反応液内のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0055】

実験の結果、ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅ酵素は、ＭｎＳＯ_４、またはＮｉＳＯ_４の添加によって活性が増加することが示され、マンガンイオンやニッケルイオンなどの金属イオンの要求性があることが分かった。特に、ＮｉＳＯ_４を添加した場合、最大活性を示すことが確認された（図６）。

【0056】

実施例３：タガトース−６−リン酸キナーゼの製造及びその活性の評価

【0057】

実施例３−１：タガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換体の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を発掘するために、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ ３９６０由来のタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能組換えベクター及び形質転換された微生物を製造した。

【0058】

具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）に登録されたＤｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ遺伝子配列を対象にタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子配列を選抜して、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ由来のタガトース−６−リン酸キナーゼＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅのアミノ酸配列（配列番号５）及び塩基配列（配列番号６）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換え発現ベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ −ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅを合成した（（株）バイオニア、韓国）。

【0059】

前記各組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して組換え微生物を製造した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記組換え微生物をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１７年９月１３日付で寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２１０９Ｐを与えられた。

【0060】

実施例３−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例３−１で製造した遺伝子組換え微生物菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅから組換え酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅを製造するために、それぞれの形質転換微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。その後、前記培養液を８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0061】

実施例３−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例３−２で確保した組換え酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅの活性を測定するために、３０重量％果糖に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び５ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅを添加して、６０℃で１０時間反応させた。

【0062】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースはＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬＣ分析はＳｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した（図７）。

【0063】

その結果、組換え酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅにより果糖からタガトースへの転換された転換率は、２％であることを確認した。

【0064】

実施例３−４：温度による組換え酵素活性の確認
前記実施例３−２で得られた組換え酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性に対する温度の影響を調査するために、５重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に５ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅを添加し、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃及び７０℃で５時間反応させた。反応完了液内のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0065】

その結果、ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅは６０℃で最大活性を示し、５０℃〜７０℃で最大活性の８０％以上、５５℃〜７０℃で最大活性の９５％以上の活性を維持することを確認した（表１及び図８）。

【0066】

【表1】

【0067】

実施例３−５：金属添加による組換え酵素活性の確認
前記実施例３−２で得られた組換え酵素ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性に金属が影響を与えるかどうかを確認した。

【0068】

具体的には、５重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に５ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅを添加し、金属イオンＭｇＳＯ_４、ＭｎＳＯ_４を１ｍＭずつ添加して酵素活性を測定した。金属イオンを処理しない場合を対照群（ｗ／ｏ）と設定した。前記反応完了液内のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0069】

その結果、ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４ＥはＭｎＳＯ_４及びＭｇＳＯ_４の添加によって活性が増加し、マンガンまたはマグネシウムイオン（または、その塩）がＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性を増加させうることを確認した（図９）。特に、ＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅは ＭｎＳＯ_４を添加した結果、対照群に比べて２．５倍以上の活性増加を確認した。（図９）。

【0070】

実施例４：タガトース−６−リン酸キナーゼの製造及びその活性の評価

【0071】

実施例４−１：タガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換体の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を発掘するために、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来のタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能組換えベクター及び形質転換された組換え微生物を製造した。

【0072】

具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）に登録されたＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ遺伝子配列を対象にタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子配列を選抜して、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来のタガトース−６−リン酸キナーゼＣＪ＿ＤＴ＿Ｆ４Ｅのアミノ酸配列（配列番号９）及び塩基配列（配列番号１０）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換え発現ベクターｐＥＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅを合成した（（株）バイオニア、韓国）。

【0073】

前記各組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して組換え微生物を製造した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記組換え微生物をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１８年３月２３日付で寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２２３５Ｐを与えられた。

【0074】

実施例４−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例４−１で製造した組換え微生物菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅから組換え酵素ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅを製造するために、それぞれの形質転換微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。その後、前記培養液を８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0075】

実施例４−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例４−２で確保した組換え酵素ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅの活性を測定するために、１重量％果糖に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び４ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅを添加して、５５℃で４時間反応させた。

【0076】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースはＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬＣ分析は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した（図１１）。

【0077】

その結果、組換え酵素ＣＪ＿ＴＨ＿Ｆ４Ｅにより果糖からタガトースへの転換された転換率は０．１％であることを確認した。

【0078】

実施例５：タガトース−６−リン酸キナーゼの製造及びその活性の評価

【0079】

実施例５−１：タガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換体の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を発掘するために、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ由来のタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能組換えベクター及び形質転換された組換え微生物を製造した。

【0080】

具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）に登録されたＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ遺伝子配列を対象にタガトース−６−リン酸キナーゼ遺伝子配列を選抜して、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ由来のタガトース６−リン酸キナーゼＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅのアミノ酸配列（配列番号１１）及び塩基配列（配列番号１２）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換え発現ベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅを合成した（（株）バイオニア、韓国）。

【0081】

前記各組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して組換え微生物を製造した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記組換え微生物をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１８年３月２３日付で寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２２３６Ｐを付与された。

【0082】

実施例５−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例５−１で製造した組換え微生物菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅから組換え酵素ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅを製造するために、それぞれの形質転換微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。その後、前記培養液を８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれている５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0083】

実施例５−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例５−２で確保した組換え酵素ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅの活性を測定するために、５重量％果糖に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び５ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅを添加して、５５℃で１０時間反応させた。

【0084】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースはＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬＣ分析は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した（図１２）。

【0085】

その結果、組換え酵素ＣＪ＿ＴＡＩ＿Ｆ４Ｅにより果糖からタガトースに転換された転換率は８．７％であることを確認した。

【0086】

【表2】

【0087】

【表3】

【0088】

【表4】

【0089】

【表5】

【0090】

【表6】

【0091】

【表7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]