(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022165857
(43)【公開日】2022-11-01
(54)【発明の名称】βカロテン定量用のイムノクロマト測定キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20221025BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 521
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021071407
(22)【出願日】2021-04-20
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】山口 達哉
(57)【要約】
【課題】 本発明は、肉牛の飼育現場において血液中のβカロテン濃度を迅速、簡便、安価に測定可能なイムノクロマト測定キットを提供する。
【解決手段】 本発明は、生体試料中のβカロテンを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびβカロテンを定量するためのイムノクロマトストリップを含み、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなることを特徴とする測定キットである。
【選択図】なし
【解決手段】 本発明は、生体試料中のβカロテンを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびβカロテンを定量するためのイムノクロマトストリップを含み、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなることを特徴とする測定キットである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体試料中のβカロテンを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびβカロテンを定量するためのイムノクロマトストリップを含み、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなることを特徴とする測定キット。
【請求項2】
前記競合試薬は、βカロテンと化合物との複合体を含むことを特徴とする請求項１に記載の測定キット。
【請求項3】
前記化合物は、ビオチンであることを特徴とする請求項２に記載の測定キット。
【請求項4】
前記検体希釈液は、競合試薬に対する抗体および／または高親和物質を結合した標識体を含むことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の測定キット。
【請求項5】
前記競合試薬に対する抗体は、抗ビオチン抗体であることを特徴とする請求項４に記載の測定キット。
【請求項6】
前記競合試薬に対する高親和物質は、アビジンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする請求項４または５に記載の測定キット。
【請求項7】
前記膜担体は、抗βカロテン抗体が固定されたテストラインを備えることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の測定キット。
【請求項8】
前記生体試料は、全血、血漿または血清であることを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体試料中のβカロテンを定量するためのイムノクロマト測定キットに関する。より詳しくは、生体試料（検体）を希釈するための検体希釈液、競合試薬およびイムノクロマトストリップからなる、生体試料中のβカロテンを定量するための測定キットに関する。
【背景技術】
【0002】
肉牛、とくに高品質牛肉である和牛生産においては、筋肉中の脂肪交雑を高めることにより肉の評価が上がる。このため、脂肪の分解を促進する機能を持つビタミンＡの給餌量を極端に減少させて脂肪交雑を誘導するビタミンコントロールと呼ばれる飼育管理方法が近年では主流となっている。しかしながら、ビタミンＡの極端な不足は、肝機能低下などによる健康障害を起こし、筋肉水腫や筋炎の発生による肉質低下をきたすことがあり大きな問題となる。このため、牛の栄養状態を知り、前述のような問題発生を防ぐため、血液中のビタミンＡ濃度の測定が行われている。βカロテンはこのビタミンＡの前駆体であるため、ビタミンＡ同様、その血中濃度を測定し、把握しておく必要がある。更に、近年、牛の繁殖効率の低下が世界的な問題となっているが、血中βカロテン濃度を一定以上に保つことは繁殖成績向上につながるとされている。
【0003】
血中βカロテン濃度の測定には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が一般に用いられている。しかし、獣医師等が現場で血液を採取し、持ち帰った後、検査機関に測定を依頼するケースがほとんどで検査結果が出るのは数日後であり、もしβカロテンが適切な濃度でない場合に即時的な対処が出来ないという欠点がある。
【0004】
例えば、特許文献１および特許文献２には、血清から有機溶剤で抽出したβカロテンに特定波長の光を照射することによりβカロテンを定量する方法、および測定装置が記載されている。しかしながら、この方法は、採取した血液を遠心して血清を分離した後、エタノールによる血清タンパク質の除去操作、およびヘプタンによるβカロテン成分の抽出操作が必要であり、ＨＰＬＣのような大型装置は要らないものの肉牛の飼育現場で実施するには操作が煩雑であり、時間や手間が掛かるといった問題がある。
【0005】
また、特許文献３、４には、分析対象物質をクロマト法を用いて定量する方法であって、競合反応を利用する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１０－２３０４４７号公報
【特許文献2】特開２０１５－１６９６２７号公報
【特許文献3】特許第３５１９４５１号公報
【特許文献4】特許第３５５２２７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、肉牛等の飼育現場において生体試料（血液）中のβカロテン濃度を迅速、簡便、安価に測定することができるイムノクロマト測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１） 生体試料中のβカロテンを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびβカロテンを定量するためのイムノクロマトストリップを含み、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなることを特徴とする測定キット。
（２） 前記競合試薬は、βカロテンと化合物との複合体を含むことを特徴とする（１）に記載の測定キット。
（３） 前記化合物は、ビオチンであることを特徴とする（２）に記載の測定キット。
（４） 前記検体希釈液は、競合試薬に対する抗体および／または高親和物質を結合した標識体を含むことを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の測定キット。
（５） 前記競合試薬に対する抗体は、抗ビオチン抗体であることを特徴とする（４）に記載の測定キット。
（６） 前記競合試薬に対する高親和物質は、アビジンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする（４）または（５）に記載の測定キット。
（７） 前記膜担体は、抗βカロテン抗体が固定されたテストラインを備えることを特徴とする（１）～（６）のいずれかに記載の測定キット。
（８） 前記生体試料は、全血、血漿または血清であることを特徴とする（１）～（７）のいずれかに記載の測定キット。
（１） 生体試料中のβカロテンを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびβカロテンを定量するためのイムノクロマトストリップを含み、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなることを特徴とする測定キット。
（２） 前記競合試薬は、βカロテンと化合物との複合体を含むことを特徴とする（１）に記載の測定キット。
（３） 前記化合物は、ビオチンであることを特徴とする（２）に記載の測定キット。
（４） 前記検体希釈液は、競合試薬に対する抗体および／または高親和物質を結合した標識体を含むことを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の測定キット。
（５） 前記競合試薬に対する抗体は、抗ビオチン抗体であることを特徴とする（４）に記載の測定キット。
（６） 前記競合試薬に対する高親和物質は、アビジンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする（４）または（５）に記載の測定キット。
（７） 前記膜担体は、抗βカロテン抗体が固定されたテストラインを備えることを特徴とする（１）～（６）のいずれかに記載の測定キット。
（８） 前記生体試料は、全血、血漿または血清であることを特徴とする（１）～（７）のいずれかに記載の測定キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、肉牛の生産現場において生体試料（血液）中のβカロテン濃度を迅速、簡便、安価に測定することが可能なβカロテン測定用イムノクロマトキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明の測定キットに含まれるイムノクロマトストリップの一例を示す模式図である。
【図2】本発明の測定キットに含まれるイムノクロマトストリップをハウジングケースに収容した一例を示す模式図である。
【図3】本発明のイムノクロマト測定キットを用いて得られたβカロテンの測定結果の一例を示す図である。
【図4】本発明のイムノクロマト測定キットおよびＨＰＬＣ法による測定値の関係の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0013】
本発明は、生体試料中のβカロテンを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびβカロテンを定量するためのイムノクロマトストリップを含み、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなることを特徴とする測定キットである。
【0014】
（生体試料）
本発明において、生体試料は、特に限定されるものではないが、血液（全血でも血清でも血漿でもよい）等が適している。動物種も、ウシの他、ヒト、ウマ、イヌ、ネコなどの血液を測定対象とすることが出来る。
本発明において、生体試料は、特に限定されるものではないが、血液（全血でも血清でも血漿でもよい）等が適している。動物種も、ウシの他、ヒト、ウマ、イヌ、ネコなどの血液を測定対象とすることが出来る。
【0015】
（βカロテン）
βカロテンはカロテノイドと呼ばれる色素の1つで、ビタミンＡの前駆物質である。酵素の働きによって分解・還元され、ビタミンＡを生成する。ビタミンＡへの変換は、体内のビタミンＡの状況に依存しており、ビタミンＡが多く存在する場合には変換が抑制される。ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レチニルエステルなどのレチノイド類を指す。
βカロテンはカロテノイドと呼ばれる色素の1つで、ビタミンＡの前駆物質である。酵素の働きによって分解・還元され、ビタミンＡを生成する。ビタミンＡへの変換は、体内のビタミンＡの状況に依存しており、ビタミンＡが多く存在する場合には変換が抑制される。ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レチニルエステルなどのレチノイド類を指す。
【0016】
（検体希釈液）
本発明において、検体希釈液は、所定のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
本発明において、検体希釈液は、所定のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
【0017】
（検体希釈液）
本発明において、検体希釈液は、イムノクロマトストリップ上での生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しない非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、検体希釈液中の界面活性剤の濃度は、生体試料の希釈倍率にもよるが０．０１質量％～０．２質量％が好ましく、０．０５質量％～０．２質量％がより好ましく、０．０５質量％～０．１５質量％がさらに好ましい。濃度が低すぎると、生体試料希釈液が展開しにくくなることがあり、濃度が高すぎると、テストラインのシグナルが低くなることがある。
本発明において、検体希釈液は、イムノクロマトストリップ上での生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しない非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、検体希釈液中の界面活性剤の濃度は、生体試料の希釈倍率にもよるが０．０１質量％～０．２質量％が好ましく、０．０５質量％～０．２質量％がより好ましく、０．０５質量％～０．１５質量％がさらに好ましい。濃度が低すぎると、生体試料希釈液が展開しにくくなることがあり、濃度が高すぎると、テストラインのシグナルが低くなることがある。
【0018】
また、検体希釈液は、競合反応の効率化、促進、特異性向上のために、ポリエチレングリコールおよび／または塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。検体希釈液へのポリエチレングリコールおよび塩化ナトリウムの添加濃度は、それぞれ１質量％～４質量％、１質量％～３質量％とするのが好ましい。なお、使用するポリエチレングリコールの数平均分子量は、好ましくは２０００～１６０００であり、より好ましくは５０００～１００００である。数平均分子量が小さい場合、本発明に適した充分な抗原抗体反応の促進作用が得られないことがある。また、数平均分子量が大きい場合、同様に、抗原抗体反応の促進作用が得られないとか、検体希釈液の粘性が高くなり、イムノクロマトストリップ上の展開性が低下することがある。
【0019】
（競合試薬）
本発明において、競合試薬は、生体試料中の遊離またはタンパク質に結合した状態のβカロテンと競合することが出来、かつ標識体（物質）により検出が可能であれば特に制限はない。競合試薬としては、βカロテンと化合物との複合体を用いるのが好ましい。複合体とすることによりβカロテンが安定し、また性能の良い抗体が入手し易いことから好ましい。化合物としては、牛血清アルブミン、卵白アルブミンやビオチンなどが挙げられ、これらの中でもビオチンが好適に用いられる。詳細な理由は不明だが、βカロテンと低分子量であるビオチンとの複合体は、βカロテンとアルブミン等の高分子量物質との複合体よりも、生体試料中のβカロテンに対して競合原理が働きやすいと推測している。また、βカロテンと低分子量物質との複合体は、βカロテンと牛血清アルブミンなどのタンパク質（高分子量物質）との複合体よりも製造コストを低く抑えられるメリットもある。
本発明において、競合試薬は、生体試料中の遊離またはタンパク質に結合した状態のβカロテンと競合することが出来、かつ標識体（物質）により検出が可能であれば特に制限はない。競合試薬としては、βカロテンと化合物との複合体を用いるのが好ましい。複合体とすることによりβカロテンが安定し、また性能の良い抗体が入手し易いことから好ましい。化合物としては、牛血清アルブミン、卵白アルブミンやビオチンなどが挙げられ、これらの中でもビオチンが好適に用いられる。詳細な理由は不明だが、βカロテンと低分子量であるビオチンとの複合体は、βカロテンとアルブミン等の高分子量物質との複合体よりも、生体試料中のβカロテンに対して競合原理が働きやすいと推測している。また、βカロテンと低分子量物質との複合体は、βカロテンと牛血清アルブミンなどのタンパク質（高分子量物質）との複合体よりも製造コストを低く抑えられるメリットもある。
【0020】
なお、βカロテンは、不安定な化合物であり、光や熱によって二重結合の異性化が起こりやすく、また酸や空気、金属イオンとも反応しやすいため、容易に分解してしまう畏れがある。そのため、競合試薬は低温、暗所にて使用時まで保存するのが好ましい。保存温度としては４℃以下が好ましく、－２０℃以下がより好ましく、－８０℃以下がさらに好ましい。
【0021】
本発明において、生体試料１ｍｌに対して競合試薬を１０ｎｇ～１０μｇ添加するのが好ましい。生体試料中のβカロテン濃度と競合試薬の添加量の差が大きすぎると競合が上手くいかず定量性が低下することがある。なお、競合試薬は凍結乾燥等されたものを用いてもよいし、溶液の状態であってもよい。
【0022】
本発明において、検体希釈液は、競合試薬に対する抗体または高親和物質に標識物質を結合した標識体を含む。
【0023】
（希釈倍率）
本発明において、生体試料の希釈倍率は、３０倍～３００倍とするのが適当である。希釈倍率が低すぎると、生体試料中の夾雑物質が定量値に影響を与えることがある。また、希釈倍率が高すぎると、生体試料中のビタミンＡ量が少なくなるため、測定の精度が低くなることがある。
本発明において、生体試料の希釈倍率は、３０倍～３００倍とするのが適当である。希釈倍率が低すぎると、生体試料中の夾雑物質が定量値に影響を与えることがある。また、希釈倍率が高すぎると、生体試料中のビタミンＡ量が少なくなるため、測定の精度が低くなることがある。
【0024】
（イムノクロマトストリップ）
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１に示すようなイムノクロマトストリップ７が挙げられる。図１において、１は粘着シート、２は膜担体、３はテストライン、４はコントロールライン、５は試料添加部材、６は吸収部材を示している。膜担体２は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体２には、クロマト展開の始点側、すなわち図１の左側（上流側）の末端から右側（下流側）に向かって３～１５ｍｍの位置に、競合試薬（βカロテンと化合物との複合体）と生体試料中のβカロテンを競合的に捕捉するためのテストライン３（抗βカロテン抗体が線状に固定）が形成されている。さらに、膜担体２の上流側の末端から下流側に向かって８～２５ｍｍの位置にコントロールライン４（標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が線状に固定）が設けられている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に位置し、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン４は、分析対象物質であるβカロテンの存否に係わらずイムノクロマト反応が行われたことを確認するためのものである。
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１に示すようなイムノクロマトストリップ７が挙げられる。図１において、１は粘着シート、２は膜担体、３はテストライン、４はコントロールライン、５は試料添加部材、６は吸収部材を示している。膜担体２は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体２には、クロマト展開の始点側、すなわち図１の左側（上流側）の末端から右側（下流側）に向かって３～１５ｍｍの位置に、競合試薬（βカロテンと化合物との複合体）と生体試料中のβカロテンを競合的に捕捉するためのテストライン３（抗βカロテン抗体が線状に固定）が形成されている。さらに、膜担体２の上流側の末端から下流側に向かって８～２５ｍｍの位置にコントロールライン４（標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が線状に固定）が設けられている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に位置し、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン４は、分析対象物質であるβカロテンの存否に係わらずイムノクロマト反応が行われたことを確認するためのものである。
【0025】
（膜担体）
本発明において、膜担体２は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いるが、生体試料に含まれるβカロテンをクロマト展開可能で、かつ、テストライン３を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
本発明において、膜担体２は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いるが、生体試料に含まれるβカロテンをクロマト展開可能で、かつ、テストライン３を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
【0026】
（標識体）
本発明において、標識体は、競合試薬中の化合物に対する抗体、または、高親和性物質に標識物質を結合させて得ることが出来る。抗体は、競合試薬中の化合物に対する抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。高親和性物質としては、例えば化合物がビオチンの場合、アビジンやストレプトアビジンが好適に用いられる。
本発明において、標識体は、競合試薬中の化合物に対する抗体、または、高親和性物質に標識物質を結合させて得ることが出来る。抗体は、競合試薬中の化合物に対する抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。高親和性物質としては、例えば化合物がビオチンの場合、アビジンやストレプトアビジンが好適に用いられる。
【0027】
（標識物質）
標識物質は特に制限はなく、例えば、呈色（蛍光を含む）標識物質、酵素標識物質などが挙げられるが、迅速に検査結果が得られることから呈色標識物質であることが好ましい。呈色標識物質としては、コロイド金属および着色ラテックス粒子、着色セルロース粒子などが挙げられる。コロイド金属の代表例としては、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどが挙げられる。コロイド金属の粒子の大きさは通常、直径３～１００ｎｍ程度とされる。着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックス、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などが挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては特に制限されないが、粒径２５～５００ｎｍのものが好ましい。この他に、市販されている着色セルロース粒子なども使用出来る。着色セルロース粒子の粒径としては特に制限されないが、粒径１００～５００ｎｍのものが好ましい。蛍光標識物質としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができ、蛍光色素としてはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体などを例示することができる。
標識物質は特に制限はなく、例えば、呈色（蛍光を含む）標識物質、酵素標識物質などが挙げられるが、迅速に検査結果が得られることから呈色標識物質であることが好ましい。呈色標識物質としては、コロイド金属および着色ラテックス粒子、着色セルロース粒子などが挙げられる。コロイド金属の代表例としては、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどが挙げられる。コロイド金属の粒子の大きさは通常、直径３～１００ｎｍ程度とされる。着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックス、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などが挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては特に制限されないが、粒径２５～５００ｎｍのものが好ましい。この他に、市販されている着色セルロース粒子なども使用出来る。着色セルロース粒子の粒径としては特に制限されないが、粒径１００～５００ｎｍのものが好ましい。蛍光標識物質としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができ、蛍光色素としてはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体などを例示することができる。
【0028】
前記着色セルロース粒子の色は、特に限定されないが、例えば赤色、青色、黄色、緑色、黒色、白色、蛍光色が挙げられる。これらの中でも、バックグラウンドにヘモグロビン由来の赤色がある場合、その影響を受けにくい青色、黒色が好ましく、青色がより好ましい。このような着色セルロース粒子としては、旭化成社製の着色セルロースナノビーズ（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標））が挙げられるが、この中でもＮａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ（ＢＬ２）、Ｂｌａｃｋ（ＫＲ１）が好ましく、Ｎａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ（ＢＬ２）がより好ましい。
【0029】
本発明において、標識物質表面への非特異結合を抑えるために予めブロッキング剤を用いて処理しておいてもよい。ブロッキング剤は、ポリエチレングリコールやタンパク質を用いるのが好ましい。タンパク質としてはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどが好ましい。これらのブロッキング剤は市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にブロッキング剤の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するタンパク質の結合量が増加し感度などの性能が高くなる。
【0030】
（テストライン）
本発明において、テストラインに固定化する抗体は、βカロテンに特異的に結合することが出来る抗βカロテン抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明において、テストラインに固定化する抗体は、βカロテンに特異的に結合することが出来る抗βカロテン抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【0031】
（抗βカロテン抗体）
βカロテンは低分子化合物であり十分な複雑性を備えていないため、通常では免疫応答を誘発できない。このため、免疫した動物に抗体を産出させるには、卵白アルブミンなどのキャリアタンパク質にβカロテンを化学結合したものを免疫原として用いる必要がある。また、アジュバントを混合して免疫原を注入すると、免疫応答強度が上がり、よい抗体を得る可能性が高まる。ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清から精製して得ることが出来る。モノクローナル抗体の産生細胞は、例えば、βカロテンと卵白アルブミンの結合物を適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記βカロテンとの結合物などを使用して、たとえば酵素標識免疫法などにより選別することにより取得することができる。
βカロテンは低分子化合物であり十分な複雑性を備えていないため、通常では免疫応答を誘発できない。このため、免疫した動物に抗体を産出させるには、卵白アルブミンなどのキャリアタンパク質にβカロテンを化学結合したものを免疫原として用いる必要がある。また、アジュバントを混合して免疫原を注入すると、免疫応答強度が上がり、よい抗体を得る可能性が高まる。ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清から精製して得ることが出来る。モノクローナル抗体の産生細胞は、例えば、βカロテンと卵白アルブミンの結合物を適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記βカロテンとの結合物などを使用して、たとえば酵素標識免疫法などにより選別することにより取得することができる。
【0032】
（コントロールライン）
本発明において、コントロールラインには、標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が固定化されているのが好ましい。例えば、抗ウサギＩｇＧ抗体や抗マウスＩｇＧ抗体などを膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、標識体が膜担体の最下流部まで移動したこと、即ち、イムノクロマト反応が（正常に）行われたことを確認することができる。
本発明において、コントロールラインには、標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が固定化されているのが好ましい。例えば、抗ウサギＩｇＧ抗体や抗マウスＩｇＧ抗体などを膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、標識体が膜担体の最下流部まで移動したこと、即ち、イムノクロマト反応が（正常に）行われたことを確認することができる。
【0033】
（試料添加部材）
本発明において、試料添加部材５は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。
本発明において、試料添加部材５は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。
【0034】
（吸収部材）
本発明において、吸収部材６は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
本発明において、吸収部材６は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【0035】
イムノクロマトストリップは、これを保護するため、また、取り扱いがし易いように、プラスチック製のハウジングケース８などに収容されるのが好ましい（図２）。このケースは、例えば、イムノクロマトストリップの試料添加部材５およびテストライン３およびコントロールライン４の上部に試料滴下部９と判定部（判定窓）１０が開口されていることが好ましい。
【0036】
（イムノクロマト展開）
本発明のβカロテンの定量方法について説明する。まず、生体試料、競合試薬、および検体希釈液を混合して生体試料希釈液を調製する。得られた生体試料希釈液をイムノクロマトストリップの試料添加部材（試料滴下部位）に滴下して毛細管現象を利用してイムノクロマトストリップ上を展開させる。展開中の生体試料希釈液中のβカロテンは、競合試薬（βカロテンと化合物との複合体）と競合的にテストラインを成す抗βカロテン抗体に捕捉される。さらに、検体希釈液中の標識体は抗βカロテン抗体に捕捉された競合試薬（βカロテンと化合物との複合体）に結合する。テストラインのシグナル（呈色）を測定することにより生体試料中のβカロテンを定量することができる。なお、展開開始後、５～１２分の間にテストラインの呈色を測定することが望ましい。この間に測定を行えば、βカロテンと、競合試薬（βカロテンと化合物の複合体）との競合反応が最も効果的に起き、βカロテンの濃度変化に応じた測定値の変化がテストラインにおいて得られ、βカロテン濃度の違いが測定値に的確に反映されるため好ましい。
本発明のβカロテンの定量方法について説明する。まず、生体試料、競合試薬、および検体希釈液を混合して生体試料希釈液を調製する。得られた生体試料希釈液をイムノクロマトストリップの試料添加部材（試料滴下部位）に滴下して毛細管現象を利用してイムノクロマトストリップ上を展開させる。展開中の生体試料希釈液中のβカロテンは、競合試薬（βカロテンと化合物との複合体）と競合的にテストラインを成す抗βカロテン抗体に捕捉される。さらに、検体希釈液中の標識体は抗βカロテン抗体に捕捉された競合試薬（βカロテンと化合物との複合体）に結合する。テストラインのシグナル（呈色）を測定することにより生体試料中のβカロテンを定量することができる。なお、展開開始後、５～１２分の間にテストラインの呈色を測定することが望ましい。この間に測定を行えば、βカロテンと、競合試薬（βカロテンと化合物の複合体）との競合反応が最も効果的に起き、βカロテンの濃度変化に応じた測定値の変化がテストラインにおいて得られ、βカロテン濃度の違いが測定値に的確に反映されるため好ましい。
【0037】
（競合法）
本発明において、生体試料中のβカロテンは競合法により定量するのが好ましい。βカロテンのような低分子化合物は、２種類の抗体でサンドイッチすることが難しいため、競合法をとることが好ましい。即ち、生体試料、および競合試薬（βカロテンと化合物との複合体）を含む検体希釈液を混合して得られた生体試料希釈液をイムノクロマトストリップ上に滴下、展開することにより、試料中のβカロテン及び競合試薬は、テストラインに固定された抗βカロテン抗体に競合的に捕捉される。捕捉された競合試薬を、標識体（物質）により呈色させ、テストライン上のシグナルを測定することにより定量することができる。
本発明において、生体試料中のβカロテンは競合法により定量するのが好ましい。βカロテンのような低分子化合物は、２種類の抗体でサンドイッチすることが難しいため、競合法をとることが好ましい。即ち、生体試料、および競合試薬（βカロテンと化合物との複合体）を含む検体希釈液を混合して得られた生体試料希釈液をイムノクロマトストリップ上に滴下、展開することにより、試料中のβカロテン及び競合試薬は、テストラインに固定された抗βカロテン抗体に競合的に捕捉される。捕捉された競合試薬を、標識体（物質）により呈色させ、テストライン上のシグナルを測定することにより定量することができる。
【0038】
（イムノクロマトキット）
本発明のイムノクロマトキットは、上記のイムノクロマトストリップに加えて、検体を希釈するための検体希釈液、競合試薬、を少なくとも含み、更に必要に応じて、検量線を作成するためのβカロテン標準液や、生体試料希釈液を調製するための容器などを含む。また、イムノクロマト結果を測定するための測定装置（クロマトリーダー等）も含む場合がある。
本発明のイムノクロマトキットは、上記のイムノクロマトストリップに加えて、検体を希釈するための検体希釈液、競合試薬、を少なくとも含み、更に必要に応じて、検量線を作成するためのβカロテン標準液や、生体試料希釈液を調製するための容器などを含む。また、イムノクロマト結果を測定するための測定装置（クロマトリーダー等）も含む場合がある。
【実施例0039】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で測定された特性値の測定は、以下の方法に従った。
【0040】
（競合試薬の調製）
βカロテン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４２８４９４）を、Ｂｉｏｔｉｎ－ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（同仁化学、Ｂ３０３）を用いて、ビオチン化することにより、競合試薬（βカロテン－ビオチン複合体）を調製した。調製後、使用時まで－３０℃にて保存した。
βカロテン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４２８４９４）を、Ｂｉｏｔｉｎ－ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（同仁化学、Ｂ３０３）を用いて、ビオチン化することにより、競合試薬（βカロテン－ビオチン複合体）を調製した。調製後、使用時まで－３０℃にて保存した。
【0041】
（標識体溶液の調製）
標識物質としてセルロース粒子液（旭化成、ＢＬ１、１質量％）をｐＨ７．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）に懸濁させ、これに抗ビオチン抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ５３４９４）を加えて混合し、３７℃で１２０分間静置して、抗体をセルロース粒子表面に結合させた。更に、セルロース粒子表面への非特異結合を抑えるために、１質量％カゼインを添加し、３７℃で６０分間静置してブロッキング処理を行った。この後、洗浄操作を行った後、１質量％スクロース含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁して、標識体溶液（抗ビオチン抗体結合セルロース粒子液）を調製した。
標識物質としてセルロース粒子液（旭化成、ＢＬ１、１質量％）をｐＨ７．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）に懸濁させ、これに抗ビオチン抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ５３４９４）を加えて混合し、３７℃で１２０分間静置して、抗体をセルロース粒子表面に結合させた。更に、セルロース粒子表面への非特異結合を抑えるために、１質量％カゼインを添加し、３７℃で６０分間静置してブロッキング処理を行った。この後、洗浄操作を行った後、１質量％スクロース含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁して、標識体溶液（抗ビオチン抗体結合セルロース粒子液）を調製した。
【0042】
（検体希釈液の調製）
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、ナカライテスク社、２７５７６－２１）に、標識体、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社、１０７８９７０４００１）、ポリエチレングリコール、およびＮａＣｌの終濃度がそれぞれ、０．００３質量％、０．１５質量％、２質量％、１．５質量％になるように加えて溶解させ、検体希釈液を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、ナカライテスク社、２７５７６－２１）に、標識体、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社、１０７８９７０４００１）、ポリエチレングリコール、およびＮａＣｌの終濃度がそれぞれ、０．００３質量％、０．１５質量％、２質量％、１．５質量％になるように加えて溶解させ、検体希釈液を調製した。
【0043】
（１）抗βカロテン抗体の作製
βカロテンとＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の結合物をウサギに免疫して得られた血清から、アフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製して得られたものを、抗βカロテン抗体とした。
βカロテンとＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の結合物をウサギに免疫して得られた血清から、アフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製して得られたものを、抗βカロテン抗体とした。
【0044】
（２）膜担体の作製
前記（１）で調製した抗βカロテン抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μｌ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを作製した（図１、２）。
次に、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ５３９７８０）を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μｌ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを作製した（図１、２）。
テストラインおよびコントロールラインを作製後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、膜担体とした。
前記（１）で調製した抗βカロテン抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μｌ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを作製した（図１、２）。
次に、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ５３９７８０）を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μｌ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを作製した（図１、２）。
テストラインおよびコントロールラインを作製後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、膜担体とした。
【0045】
（３）イムノクロマトストリップの作製
上記得られた膜担体と、試料添加部材、吸収部材を用いてイムノクロマトストリップを作製した。
上記得られた膜担体と、試料添加部材、吸収部材を用いてイムノクロマトストリップを作製した。
【0046】
（４）βカロテン標準液の調製
２０か月齢の牛から採血して得られた血清中のβカロテン濃度をＨＰＬＣ法にて測定し、値付けしたものをβカロテン標準液とした。ＨＰＬＣによる測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）にて測定した。
２０か月齢の牛から採血して得られた血清中のβカロテン濃度をＨＰＬＣ法にて測定し、値付けしたものをβカロテン標準液とした。ＨＰＬＣによる測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）にて測定した。
【0047】
（５）測定キットを用いた定量
上記標準液に競合試薬および検体希釈液を加えて表１に示す各濃度のβカロテン希釈液を調製した。得られたβカロテン希釈液をイムノクロマトストリップの試料滴下部に１００μｌ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製Ｃ１００６０－１０、測定モード：青色系ライン測定モード）を用いてテストラインの発色（吸光度）を測定した。結果を表１および図３に示す。
上記標準液に競合試薬および検体希釈液を加えて表１に示す各濃度のβカロテン希釈液を調製した。得られたβカロテン希釈液をイムノクロマトストリップの試料滴下部に１００μｌ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製Ｃ１００６０－１０、測定モード：青色系ライン測定モード）を用いてテストラインの発色（吸光度）を測定した。結果を表１および図３に示す。
【0048】
【表1】
【0049】
（６）ＨＰＬＣ測定との対比実験
２０頭の牛から採血して得られた血清中のβカロテン濃度を、それぞれＨＰＬＣ法および本発明のイムノクロマト測定キットを用いて測定した。ＨＰＬＣによる測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）にて測定した。イムノクロマト法では、標準液を同時に測定して得られた標準曲線を用いて、各血清のβカロテン濃度を算出し測定結果を表２および図４に示した。イムノクロマト法の測定値とＨＰＬＣ法による測定値の相関係数は０．９７であり、良好な相関関係を示した。
本発明の測定キットを用いることにより、精度よくβカロテンを定量できることがわかった。
２０頭の牛から採血して得られた血清中のβカロテン濃度を、それぞれＨＰＬＣ法および本発明のイムノクロマト測定キットを用いて測定した。ＨＰＬＣによる測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）にて測定した。イムノクロマト法では、標準液を同時に測定して得られた標準曲線を用いて、各血清のβカロテン濃度を算出し測定結果を表２および図４に示した。イムノクロマト法の測定値とＨＰＬＣ法による測定値の相関係数は０．９７であり、良好な相関関係を示した。
本発明の測定キットを用いることにより、精度よくβカロテンを定量できることがわかった。
【0050】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0051】
本発明により、肉牛の生産現場において牛血液中のβカロテン濃度を迅速、簡便、安価に測定することができるので、血液中のβカロテン濃度をより正確にコントロールすることが出来、脂肪交雑を容易に調整することが可能となる。
【符号の説明】
【0052】
１ 粘着シート
２ 膜担体
３ テストライン
４ コントロールライン
５ 試料添加部材
６ 吸収部材
７ イムノクロマトストリップ
８ ハウジングケース
９ 試料滴下部
１０ 判定部（窓）
２ 膜担体
３ テストライン
４ コントロールライン
５ 試料添加部材
６ 吸収部材
７ イムノクロマトストリップ
８ ハウジングケース
９ 試料滴下部
１０ 判定部（窓）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
