▶ フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023126888
(43)【公開日】2023-09-12
(54)【発明の名称】環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20230905BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230905BHJP
A61K 38/57 20060101ALI20230905BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/11 Z
A61K38/57
A61K48/00
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023109861
(22)【出願日】2023-07-04
(62)【分割の表示】P 2020552672の分割
【原出願日】2018-12-14
(31)【優先権主張番号】62/599,547
(32)【優先日】2017-12-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/676,688
(32)【優先日】2018-05-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520445473
【氏名又は名称】フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】モラグ・ヘレン スチュアート
(72)【発明者】
【氏名】キャサリン シフエンテス－ロハス
(72)【発明者】
【氏名】キ・ヨン ペク
(72)【発明者】
【氏名】アバク カーベジアン
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス・マッカートニー プルギス
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンドラ・ソフィー デ ブール
(72)【発明者】
【氏名】エリカ・ガブリエル ウェイステイン
(72)【発明者】
【氏名】セバスチャン トルーシル
(57)【要約】
【課題】環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用の提供。
【解決手段】本発明は、概して、環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び調製並びにその使用に関する。一態様において、本発明は、ａ）エンクリプトゲン（encryptogen）；ｂ）スタガー要素（stagger element）；ｃ）調節要素；ｄ）複製要素；ｆ）疑似二本鎖二次構造；及びｇ）発現配列から選択される少なくとも１つの構造要素と；ａ）線状同等物より高い翻訳効率；ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；ｄ）線状同等物より増加した半減期；及びｅ）細胞分裂中の持続性から選択される少なくとも１つの機能特性とを含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物を含む。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、概して、環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び調製並びにその使用に関する。一態様において、本発明は、ａ）エンクリプトゲン（encryptogen）；ｂ）スタガー要素（stagger element）；ｃ）調節要素；ｄ）複製要素；ｆ）疑似二本鎖二次構造；及びｇ）発現配列から選択される少なくとも１つの構造要素と；ａ）線状同等物より高い翻訳効率；ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；ｄ）線状同等物より増加した半減期；及びｅ）細胞分裂中の持続性から選択される少なくとも１つの機能特性とを含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物を含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
[0001] 本出願は、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９
９，５４７号明細書及び２０１８年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６７
６，６８８号明細書の利益を主張するものであり、これらのそれぞれは、全体が参照によ
り本明細書に援用される。
[0001] 本出願は、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９
９，５４７号明細書及び２０１８年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６７
６，６８８号明細書の利益を主張するものであり、これらのそれぞれは、全体が参照によ
り本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
[0002] 特定の環状ポリリボヌクレオチドは、健常人の組織及び細胞を含むヒト組織及
び細胞中に遍在的に存在する。
び細胞中に遍在的に存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
[0003] 一態様において、本発明は、ａ）エンクリプトゲン（encryptogen）；ｂ）ス
タガー要素（staggerelement）；ｃ）調節要素；ｄ）複製要素；ｆ）疑似二本鎖二次構
造；及びｇ）発現配列から選択される少なくとも１つの構造要素と；ａ）線状同等物より
高い翻訳効率；ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；ｃ）エンクリプトゲンを欠い
た同等物より低い免疫原性；ｄ）線状同等物より増加した半減期；及びｅ）細胞分裂中の
持続性から選択される少なくとも１つの機能特性とを含む環状ポリリボヌクレオチドを含
む医薬組成物を含む。
タガー要素（staggerelement）；ｃ）調節要素；ｄ）複製要素；ｆ）疑似二本鎖二次構
造；及びｇ）発現配列から選択される少なくとも１つの構造要素と；ａ）線状同等物より
高い翻訳効率；ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；ｃ）エンクリプトゲンを欠い
た同等物より低い免疫原性；ｄ）線状同等物より増加した半減期；及びｅ）細胞分裂中の
持続性から選択される少なくとも１つの機能特性とを含む環状ポリリボヌクレオチドを含
む医薬組成物を含む。
【0004】
[0004] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する。この
ような一実施形態において、疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと
共に少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む。別のこのような実施形態において
、疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第２の
配列を含む。
ような一実施形態において、疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと
共に少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む。別のこのような実施形態において
、疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第２の
配列を含む。
【0005】
[0005] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを含
む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチ
ド、例えばプソイドウリジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。ある実施形
態において、エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タ
ンパク質を含む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例え
ばＣＴＬ応答を回避するために免疫タンパク質結合部位を含む。
む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチ
ド、例えばプソイドウリジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。ある実施形
態において、エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タ
ンパク質を含む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例え
ばＣＴＬ応答を回避するために免疫タンパク質結合部位を含む。
【0006】
[0006] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾
リボヌクレオチドを含む。
[0007] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ－Ｉ、
ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、Ｐ
ＫＲ、ＩＦＮ－βの少なくとも１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価
される際、エンクリプトゲンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する。
リボヌクレオチドを含む。
[0007] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ－Ｉ、
ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、Ｐ
ＫＲ、ＩＦＮ－βの少なくとも１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価
される際、エンクリプトゲンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する。
【0007】
[0008] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに
含む。
[0009] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに
含む。
含む。
[0009] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに
含む。
【0008】
[0010] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳開始配列、例えば
ＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、例えばストレス条件下での発現を含む。
[0011] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ポリペプチド
をコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このような一実施形態において、発現配
列は、ペプチド又はポリヌクレオチドをコードする。ある実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む。
ＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、例えばストレス条件下での発現を含む。
[0011] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ポリペプチド
をコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このような一実施形態において、発現配
列は、ペプチド又はポリヌクレオチドをコードする。ある実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む。
【0009】
[0012] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素、例えば
２Ａを含む。
[0013] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノン
コーディングＲＮＡを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例え
ば、発現配列の発現を変化させる調節要素を含む。
２Ａを含む。
[0013] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノン
コーディングＲＮＡを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例え
ば、発現配列の発現を変化させる調節要素を含む。
【0010】
[0014] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基～約２０ｋ
ｂの範囲のサイズを有する。
[0015] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチド
の環状化によって合成される。
ｂの範囲のサイズを有する。
[0015] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチド
の環状化によって合成される。
【0011】
[0016] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌ
クレアーゼに対して実質的に抵抗性である。
[0017] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ａ）５’－ＵＴＲ；ｂ
）３’－ＵＴＲ；ｃ）ポリ－Ａ配列；ｄ）５’－キャップ；ｅ）終止要素；ｆ）内部リボ
ソーム進入部位；ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性、及びｈ）キャップ結合タン
パク質への結合の少なくとも１つを欠いている。
クレアーゼに対して実質的に抵抗性である。
[0017] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ａ）５’－ＵＴＲ；ｂ
）３’－ＵＴＲ；ｃ）ポリ－Ａ配列；ｄ）５’－キャップ；ｅ）終止要素；ｆ）内部リボ
ソーム進入部位；ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性、及びｈ）キャップ結合タン
パク質への結合の少なくとも１つを欠いている。
【0012】
[0018] 一態様において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド
を含む組成物を製造する方法を含む。
[0019] 一態様において、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上
の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある、医薬組成物を含む。
を含む組成物を製造する方法を含む。
[0019] 一態様において、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上
の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある、医薬組成物を含む。
【0013】
[0020] ある実施形態において、１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌク
レオチド中のスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列の
ローリングサークル型翻訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成し、例えば、ス
タガー要素は、伸長ポリペプチドがリボソームから落下するようにリボソームを停滞又は
停止させる。ある実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻
訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生
成を防止する。例えば、スタガー要素は、２つ以上の発現配列の２回以上の翻訳からの単
一のポリペプチドの生成を防止することができ、例えば、スタガー要素は、リボソームを
停止させ、且つ／又は伸長ポリペプチドが環状ポリリボヌクレオチドの周りを１周した後
にリボソームから落下することを可能にする。
レオチド中のスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列の
ローリングサークル型翻訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成し、例えば、ス
タガー要素は、伸長ポリペプチドがリボソームから落下するようにリボソームを停滞又は
停止させる。ある実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻
訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生
成を防止する。例えば、スタガー要素は、２つ以上の発現配列の２回以上の翻訳からの単
一のポリペプチドの生成を防止することができ、例えば、スタガー要素は、リボソームを
停止させ、且つ／又は伸長ポリペプチドが環状ポリリボヌクレオチドの周りを１周した後
にリボソームから落下することを可能にする。
【0014】
[0021] ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離され
た配列である。
[0022] ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一
部を含む。
た配列である。
[0022] ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一
部を含む。
【0015】
[0023] 一態様において、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上
の発現配列を含み、且つローリングサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチ
ドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチ
ドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくと
も１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少
なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも
９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドである
ように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現配列の１回の翻訳又
は１回未満の翻訳から生成される、医薬組成物を含む。
の発現配列を含み、且つローリングサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチ
ドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチ
ドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくと
も１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少
なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも
９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドである
ように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現配列の１回の翻訳又
は１回未満の翻訳から生成される、医薬組成物を含む。
【0016】
[0024] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオ
チドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なく
とも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、
少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくと
も９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであ
るように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系にお
いて試験される。
チドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なく
とも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、
少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくと
も９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであ
るように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系にお
いて試験される。
【0017】
[0025] ある実施形態において、インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む
。
[0026] ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１
つの下流又は３’末端側にあり、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリン
グサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される。
。
[0026] ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１
つの下流又は３’末端側にあり、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリン
グサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される。
【0018】
[00207] 一態様において、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以
上の発現配列及び１つ以上の発現配列の少なくとも１つの下流又は３’末端側にあるスタ
ガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態
において、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に
リボソームを停滞させるように構成される。
上の発現配列及び１つ以上の発現配列の少なくとも１つの下流又は３’末端側にあるスタ
ガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態
において、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に
リボソームを停滞させるように構成される。
【0019】
[0028] ある実施形態において、スタガー要素は、２Ａ配列及び２Ａ様配列からなる群
から選択されるペプチド配列をコードする。
[0029] ある実施形態において、スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列
をコードする。
から選択されるペプチド配列をコードする。
[0029] ある実施形態において、スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列
をコードする。
【0020】
[0030] ある実施形態において、スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここ
で、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードす
る。
で、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードす
る。
【0021】
[0031] ある実施形態において、スタガー要素は、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮ
ＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、
ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、Ｉ
ＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶ
ＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳ
ＥＦＮＰＧＰの少なくとも１つをコードする。
ＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、
ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、Ｉ
ＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶ
ＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳ
ＥＦＮＰＧＰの少なくとも１つをコードする。
【0022】
[0032] ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のそれぞれの下
流又は３’末端側にある。
[0033] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタ
ガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳
開始配列の下流（５’末端側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離
は、第１の発現配列及び後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態にお
いて、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配
列の翻訳開始配列から上流（５’末端側）の距離を有する環状ポリリボヌクレオチドにお
ける第１の発現配列の終止要素を含み、この距離は、第１の発現配列及びその後続の発現
配列の連続した翻訳を可能にする。
流又は３’末端側にある。
[0033] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタ
ガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳
開始配列の下流（５’末端側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離
は、第１の発現配列及び後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態にお
いて、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配
列の翻訳開始配列から上流（５’末端側）の距離を有する環状ポリリボヌクレオチドにお
ける第１の発現配列の終止要素を含み、この距離は、第１の発現配列及びその後続の発現
配列の連続した翻訳を可能にする。
【0023】
[0034] ある実施形態において、第１のスタガー要素は、連続して翻訳された環状ポリ
リボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり
、対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されていない対応する環状ポリリ
ボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要
素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガー要素は、第２の翻訳開
始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中の第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間
の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍
大きい距離にある。ある実施形態において、スタガー要素は、連続して翻訳された環状ポ
リリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあ
る第１の終止要素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されてい
ない対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列から上
流にある第２の終止要素を含むスタガー要素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチド
中の第２の終止要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の
終止要素と第１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、
６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍大きい距離にある。
リボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり
、対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されていない対応する環状ポリリ
ボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要
素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガー要素は、第２の翻訳開
始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中の第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間
の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍
大きい距離にある。ある実施形態において、スタガー要素は、連続して翻訳された環状ポ
リリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあ
る第１の終止要素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されてい
ない対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列から上
流にある第２の終止要素を含むスタガー要素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチド
中の第２の終止要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の
終止要素と第１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、
６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍大きい距離にある。
【0024】
[0035] ある実施形態において、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は
、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０
ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８
ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０
ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える。ある実施
形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、第１のスタガー要
素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎ
ｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１
５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３
５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７
５ｎｔ又はそれを超えて大きい。
、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０
ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８
ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０
ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える。ある実施
形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、第１のスタガー要
素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎ
ｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１
５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３
５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７
５ｎｔ又はそれを超えて大きい。
【0025】
[0036] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を
含む。
[0037] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なく
とも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％
、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なく
とも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも
２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも
７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なく
とも５０倍又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する。
含む。
[0037] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なく
とも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％
、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なく
とも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも
２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも
７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なく
とも５０倍又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する。
【0026】
[0038] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なく
とも５倍高い翻訳効率を有する。
[0039] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部
位を欠いている。
とも５倍高い翻訳効率を有する。
[0039] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部
位を欠いている。
【0027】
[0040] ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む。
[0041] ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、ペプチドをコードする。
[0042] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノン
コーディングＲＮＡを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例え
ば、発現配列の発現を変化させる調節要素を含む。
[0041] ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、ペプチドをコードする。
[0042] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノン
コーディングＲＮＡを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例え
ば、発現配列の発現を変化させる調節要素を含む。
【0028】
[0043] 一態様において、本発明は、本明細書において提供される医薬組成物のいずれ
かの環状ポリリボヌクレオチドを提供する。
[0044] 一態様において、本発明は、本明細書において提供される医薬組成物を製造す
る方法であって、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及び本明細書に記載さ
れる薬学的に許容される担体又は賦形剤を組み合わせることを含む方法を含む。
かの環状ポリリボヌクレオチドを提供する。
[0044] 一態様において、本発明は、本明細書において提供される医薬組成物を製造す
る方法であって、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及び本明細書に記載さ
れる薬学的に許容される担体又は賦形剤を組み合わせることを含む方法を含む。
【0029】
[0045] 一態様において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド
を含む組成物を投与する方法を含む。
[0046] 一態様において、本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書
において提供される環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳することを含む方
法を含む。
を含む組成物を投与する方法を含む。
[0046] 一態様において、本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書
において提供される環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳することを含む方
法を含む。
【0030】
[0047] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は
、インビトロで行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくと
も領域の翻訳は、インビボで行われる。
、インビトロで行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくと
も領域の翻訳は、インビボで行われる。
【0031】
[0048] 一態様において、本発明は、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレ
オチドをコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡベクターを含む。
[0049] 一態様において、本発明は、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレ
オチドを製造する方法を含む。
オチドをコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡベクターを含む。
[0049] 一態様において、本発明は、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレ
オチドを製造する方法を含む。
【0032】
[0050] ある実施形態において、本方法は、線状ポリリボヌクレオチドのスプリントラ
イゲーション媒介性環状化を含む。
[0051] ある実施形態において、環状化、例えばスプリントライゲーション媒介性環状
化は、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なく
とも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４
％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少な
くとも４４％、少なくとも４６％、少なくとも４８％又は少なくとも５０％の効率を有す
る。ある実施形態において、スプリントライゲーション媒介性環状化は、約４０％～約５
０％又は５０％超の効率を有する。
定義
[0052] 本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本
発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載
される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきで
ある。
イゲーション媒介性環状化を含む。
[0051] ある実施形態において、環状化、例えばスプリントライゲーション媒介性環状
化は、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なく
とも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４
％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少な
くとも４４％、少なくとも４６％、少なくとも４８％又は少なくとも５０％の効率を有す
る。ある実施形態において、スプリントライゲーション媒介性環状化は、約４０％～約５
０％又は５０％超の効率を有する。
定義
[0052] 本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本
発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載
される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきで
ある。
【0033】
[0053] 「によって得ることができる」、「によって生成可能である」などの用語は、
請求項又は実施形態が化合物、組成物、生成物など自体を指す、すなわち、化合物、組成
物、生成物などが、化合物、組成物、生成物などの製造について記載される方法によって
得ることができるか又は生成可能であるが、化合物、組成物、生成物などが、記載される
方法以外の方法によっても得られるか又は生成され得ることを示すのに使用される。「に
よって得られる」、「によって生成される」などの用語は、化合物、組成物、生成物が、
記載される特定の方法によって得られるか又は生成されることを示す。「によって得るこ
とができる」、「によって生成可能である」などの用語は、「によって得ることができる
」、「によって生成可能である」などの好ましい実施形態として、「によって得られる」
、「によって生成される」などの用語も開示することが理解されるべきである。
請求項又は実施形態が化合物、組成物、生成物など自体を指す、すなわち、化合物、組成
物、生成物などが、化合物、組成物、生成物などの製造について記載される方法によって
得ることができるか又は生成可能であるが、化合物、組成物、生成物などが、記載される
方法以外の方法によっても得られるか又は生成され得ることを示すのに使用される。「に
よって得られる」、「によって生成される」などの用語は、化合物、組成物、生成物が、
記載される特定の方法によって得られるか又は生成されることを示す。「によって得るこ
とができる」、「によって生成可能である」などの用語は、「によって得ることができる
」、「によって生成可能である」などの好ましい実施形態として、「によって得られる」
、「によって生成される」などの用語も開示することが理解されるべきである。
【0034】
[0054] 「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、処置
、調節などの示される目的に好適な化合物、組成物、生成物など自体を指すことが理解さ
れるべきである。「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は
、好ましい実施形態として、このような化合物、組成物、生成物などが処置、調節などに
使用するためのものであることをさらに開示する。
、調節などの示される目的に好適な化合物、組成物、生成物など自体を指すことが理解さ
れるべきである。「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は
、好ましい実施形態として、このような化合物、組成物、生成物などが処置、調節などに
使用するためのものであることをさらに開示する。
【0035】
[0055] 「に使用するための化合物、組成物、生成物など」又は「のための薬剤、医薬
組成物、獣医用組成物、診断用組成物などの製造における化合物、組成物、生成物などの
使用」という表現は、このような化合物、組成物、生成物などが、ヒト又は動物の身体に
おいて実施され得る治療方法に使用されるものであることを示す。それらは、処置などの
方法に関する実施形態及び請求項の均等な開示であると考えられる。実施形態又は請求項
が、このように、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処置するのに使用する
ための化合物」を指す場合、これは、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処
置するための薬剤の製造における化合物の使用」又は「疾患に罹患している疑いのあるヒ
ト又は動物に化合物を投与することによる処置の方法」の開示であるとも考えられる。「
処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、処置、調節などの
示される目的に好適な化合物、組成物、生成物など自体を指すことが理解されるべきであ
る。
組成物、獣医用組成物、診断用組成物などの製造における化合物、組成物、生成物などの
使用」という表現は、このような化合物、組成物、生成物などが、ヒト又は動物の身体に
おいて実施され得る治療方法に使用されるものであることを示す。それらは、処置などの
方法に関する実施形態及び請求項の均等な開示であると考えられる。実施形態又は請求項
が、このように、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処置するのに使用する
ための化合物」を指す場合、これは、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処
置するための薬剤の製造における化合物の使用」又は「疾患に罹患している疑いのあるヒ
ト又は動物に化合物を投与することによる処置の方法」の開示であるとも考えられる。「
処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、処置、調節などの
示される目的に好適な化合物、組成物、生成物など自体を指すことが理解されるべきであ
る。
【0036】
[0056] 「医薬組成物」という用語は、医薬組成物内に含まれる環状ポリリボヌクレオ
チドが治療によるヒト又は動物の身体の処置のために使用され得ることも開示することが
意図される。したがって、それは、「治療に使用するための環状ポリリボヌクレオチド」
と同等であることが意図される。
チドが治療によるヒト又は動物の身体の処置のために使用され得ることも開示することが
意図される。したがって、それは、「治療に使用するための環状ポリリボヌクレオチド」
と同等であることが意図される。
【0037】
[0057] 本明細書に記載される、環状ポリリボヌクレオチド、このような環状ポリリボ
ヌクレオチドを含む組成物、このような環状ポリリボヌクレオチドを使用する方法などは
、異なる要素、例えば複製要素、発現配列、スタガー要素及びエンクリプトゲン（例えば
、実施例１を参照されたい）又は例えば発現配列、スタガー要素及び調節要素（例えば、
実施例３０及び３８を参照されたい）を含む環状ポリリボヌクレオチドエフェクターが、
異なる技術効果（例えば、実施例１及び３８における線状同等物より増加した翻訳効率並
びに実施例３８における線状同等物より増加した半減期）を達成するのにどのように使用
され得るかを示す実施例に部分的に基づいている。これ以降の説明が、実施例において考
えられる特定の発見及び組合せの様々な変形を想定していることは、特にこれらの実施例
に基づいている。
ヌクレオチドを含む組成物、このような環状ポリリボヌクレオチドを使用する方法などは
、異なる要素、例えば複製要素、発現配列、スタガー要素及びエンクリプトゲン（例えば
、実施例１を参照されたい）又は例えば発現配列、スタガー要素及び調節要素（例えば、
実施例３０及び３８を参照されたい）を含む環状ポリリボヌクレオチドエフェクターが、
異なる技術効果（例えば、実施例１及び３８における線状同等物より増加した翻訳効率並
びに実施例３８における線状同等物より増加した半減期）を達成するのにどのように使用
され得るかを示す実施例に部分的に基づいている。これ以降の説明が、実施例において考
えられる特定の発見及び組合せの様々な変形を想定していることは、特にこれらの実施例
に基づいている。
【0038】
[0058] 本明細書において使用される際、「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）」、又は「
環状ポリリボヌクレオチド」、又は「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ）」という
用語は、同義的に使用され、共有結合又は非共有結合を介して環状構造を形成するポリリ
ボヌクレオチドを指し得る。
環状ポリリボヌクレオチド」、又は「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ）」という
用語は、同義的に使用され、共有結合又は非共有結合を介して環状構造を形成するポリリ
ボヌクレオチドを指し得る。
【0039】
[0059] 本明細書において使用される際、「エンクリプトゲン」という用語は、免疫細
胞による検出を低下させ、避け、且つ／若しくは回避し、及び／又は環状ポリリボヌクレ
オチドに対する免疫応答の誘導を低下させるのに役立つ環状ポリリボヌクレオチドの核酸
配列又は構造を指し得る。
胞による検出を低下させ、避け、且つ／若しくは回避し、及び／又は環状ポリリボヌクレ
オチドに対する免疫応答の誘導を低下させるのに役立つ環状ポリリボヌクレオチドの核酸
配列又は構造を指し得る。
【0040】
[0060] 本明細書において使用される際、「発現配列」という用語は、産物、例えばペ
プチド若しくはポリペプチド又は調節核酸をコードする核酸配列を指し得る。ペプチド又
はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチド三つ組を含むこと
ができ、これらは、それぞれアミノ酸をコードすることができ、「コドン」と呼ばれる。
プチド若しくはポリペプチド又は調節核酸をコードする核酸配列を指し得る。ペプチド又
はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチド三つ組を含むこと
ができ、これらは、それぞれアミノ酸をコードすることができ、「コドン」と呼ばれる。
【0041】
[0061] 本明細書において使用される際、「免疫タンパク質結合部位」という用語は、
免疫タンパク質に結合するヌクレオチド配列を指し得る。ある実施形態において、免疫タ
ンパク質結合部位は、外因性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドをマスクするの
に役立ち、例えば、免疫タンパク質結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドが免疫タンパ
ク質によって認識及び結合されることを防ぐタンパク質（例えば、競合阻害剤）によって
結合され得、それにより環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を低下させるか又は
回避する。本明細書において使用される際、「免疫タンパク質」という用語は、例えば、
免疫原、例えば環状ポリリボヌクレオチドなどに対する免疫応答に関連する任意のタンパ
ク質又はペプチドを指し得る。免疫タンパク質の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体（
ＴＣＲ）、抗体（免疫グロブリン）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、補体
タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。
免疫タンパク質に結合するヌクレオチド配列を指し得る。ある実施形態において、免疫タ
ンパク質結合部位は、外因性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドをマスクするの
に役立ち、例えば、免疫タンパク質結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドが免疫タンパ
ク質によって認識及び結合されることを防ぐタンパク質（例えば、競合阻害剤）によって
結合され得、それにより環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を低下させるか又は
回避する。本明細書において使用される際、「免疫タンパク質」という用語は、例えば、
免疫原、例えば環状ポリリボヌクレオチドなどに対する免疫応答に関連する任意のタンパ
ク質又はペプチドを指し得る。免疫タンパク質の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体（
ＴＣＲ）、抗体（免疫グロブリン）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、補体
タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。
【0042】
[0062] 本明細書において使用される際、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖
、核酸塩基又はヌクレオシド間結合に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチド
を指し得る。
、核酸塩基又はヌクレオシド間結合に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチド
を指し得る。
【0043】
[0063] 本明細書において使用される際、「疑似らせん構造」という語句は、環状ポリ
リボヌクレオチドの高次構造を指し得、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも
一部がらせん構造に折り畳まれる。
リボヌクレオチドの高次構造を指し得、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも
一部がらせん構造に折り畳まれる。
【0044】
[0064] 本明細書において使用される際、「疑似二本鎖二次構造」という語句は、環状
ポリリボヌクレオチドの高次構造を指し得、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なく
とも一部が内部二本鎖を形成する。
ポリリボヌクレオチドの高次構造を指し得、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なく
とも一部が内部二本鎖を形成する。
【0045】
[0065] 本明細書において使用される際、「調節要素」という用語は、環状ポリリボヌ
クレオチド内の発現配列の発現を調節する核酸配列などの部分を指し得る。
[0066] 本明細書において使用される際、「反復ヌクレオチド配列」という用語は、Ｄ
ＮＡ若しくはＲＮＡのストレッチ内又はゲノム全体にわたる反復核酸配列を指し得る。あ
る実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＴＧ（ＵＧ）配列を含
む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリー中
の反復される配列を含む。
クレオチド内の発現配列の発現を調節する核酸配列などの部分を指し得る。
[0066] 本明細書において使用される際、「反復ヌクレオチド配列」という用語は、Ｄ
ＮＡ若しくはＲＮＡのストレッチ内又はゲノム全体にわたる反復核酸配列を指し得る。あ
る実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＴＧ（ＵＧ）配列を含
む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリー中
の反復される配列を含む。
【0046】
[0067] 本明細書において使用される際、「複製要素」という用語は、複製に有用であ
るか、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を開始させる配列及び／又はモチーフを指し
得る。
るか、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を開始させる配列及び／又はモチーフを指し
得る。
【0047】
[0068] 本明細書において使用される際、「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリ
ボソームの休止を誘導するヌクレオチド配列などの部分を指し得る。ある実施形態におい
て、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセン
サス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。
ある実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修
飾核酸又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
ボソームの休止を誘導するヌクレオチド配列などの部分を指し得る。ある実施形態におい
て、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセン
サス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。
ある実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修
飾核酸又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
【0048】
[0069] 本明細書において使用される際、「実質的に抵抗性」という用語は、対照と比
較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の抵抗性を有するものを指し得る。
較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の抵抗性を有するものを指し得る。
【0049】
[0070] 本明細書において使用される際、「化学量論的翻訳」という用語は、環状ポリ
リボヌクレオチドから翻訳された発現産物の実質的に同等の生成を指し得る。例えば、２
つの発現配列を有する環状ポリリボヌクレオチドでは、環状ポリリボヌクレオチドの化学
量論的翻訳は、２つの発現配列の発現産物が実質的に等しい量を有し得ること、例えば２
つの発現配列間の量の差（例えば、モルの差）が約０又は１％、２％、３％、４％、５％
、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％若しくは２０％未満であり得ることを意味し
得る。
リボヌクレオチドから翻訳された発現産物の実質的に同等の生成を指し得る。例えば、２
つの発現配列を有する環状ポリリボヌクレオチドでは、環状ポリリボヌクレオチドの化学
量論的翻訳は、２つの発現配列の発現産物が実質的に等しい量を有し得ること、例えば２
つの発現配列間の量の差（例えば、モルの差）が約０又は１％、２％、３％、４％、５％
、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％若しくは２０％未満であり得ることを意味し
得る。
【0050】
[0071] 本明細書において使用される際、「翻訳開始配列」という用語は、環状ポリリ
ボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を開始させる核酸配列を指し得る。
[0072] 本明細書において使用される際、「終止要素」という用語は、環状ポリリボヌ
クレオチド中の発現配列の翻訳を停止させる核酸配列などの部分を指し得る。
ボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を開始させる核酸配列を指し得る。
[0072] 本明細書において使用される際、「終止要素」という用語は、環状ポリリボヌ
クレオチド中の発現配列の翻訳を停止させる核酸配列などの部分を指し得る。
【0051】
[0073] 本明細書において使用される際、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチ
ド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量を指し得る。ある実施形態に
おいて、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物のようなイ
ンビトロ翻訳系において又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において
、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当た
りで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。
ド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量を指し得る。ある実施形態に
おいて、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物のようなイ
ンビトロ翻訳系において又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において
、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当た
りで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。
【0052】
[0074] 本明細書において使用される際、「環状化効率」という用語は、得られる環状
ポリリボヌクレオチドの、その出発材料と比べた測定値を指し得る。
[0075] 本明細書において使用される際、「免疫原性」という用語は、物質に対する免
疫応答を誘導する可能性を指し得る。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞
の免疫系が免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が誘導され得る。「非免疫原性」とい
う用語は、物質に対する検出可能な閾値を超える免疫応答の欠如又は非存在を指し得る。
ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が非免疫原性物質に曝された
とき、免疫応答が検出されない。ある実施形態において、本明細書において提供される非
免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定される際に所定の
閾値を超える免疫応答を誘導しない。例えば、免疫原性アッセイを用いて、環状ポリリボ
ヌクレオチド又は炎症マーカーに対して誘起される抗体を測定する際、本明細書において
提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、所定の閾値より低いレベルで抗体又はマ
ーカーの産生をもたらし得る。所定の閾値は、例えば、対照参照によって誘起される抗体
又はマーカーのレベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以下であり得る。
ポリリボヌクレオチドの、その出発材料と比べた測定値を指し得る。
[0075] 本明細書において使用される際、「免疫原性」という用語は、物質に対する免
疫応答を誘導する可能性を指し得る。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞
の免疫系が免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が誘導され得る。「非免疫原性」とい
う用語は、物質に対する検出可能な閾値を超える免疫応答の欠如又は非存在を指し得る。
ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が非免疫原性物質に曝された
とき、免疫応答が検出されない。ある実施形態において、本明細書において提供される非
免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定される際に所定の
閾値を超える免疫応答を誘導しない。例えば、免疫原性アッセイを用いて、環状ポリリボ
ヌクレオチド又は炎症マーカーに対して誘起される抗体を測定する際、本明細書において
提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、所定の閾値より低いレベルで抗体又はマ
ーカーの産生をもたらし得る。所定の閾値は、例えば、対照参照によって誘起される抗体
又はマーカーのレベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以下であり得る。
【0053】
参照による援用
[0076] 本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の
刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されていることが示され
ているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
[0076] 本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の
刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されていることが示され
ているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【0054】
[0077] 本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだときにより
よく理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、本明細書で例示される実施形
態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成及
び手段に限定されないことが理解されるべきである。
よく理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、本明細書で例示される実施形
態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成及
び手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0055】
【図2】[0079] 図２は、開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、スタガー要素（２Ａ）、エンクリプトゲン及びＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含有する環状ＲＮＡの例示的なインビトロ生成プロセスの概略図を示す。
【図24】[0101] 図２４Ａは、例示的なスタガー要素又は終止要素（終止コドン）を用いた様々な例示的な環状ＲＮＡ間のタンパク質発現の比較を示すウエスタンブロット画像である。[0102] 図２４Ｂは、２つの例示的な環状ＲＮＡから翻訳されたタンパク質産物のウエスタンブロット分析からのシグナル強度をまとめたグラフである。
【図27】[0105] 図２７Ａは、線状及び環状ＲＮＡの両方を捕捉したプライマーを用いた細胞への送達の２４時間後の線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。[0106] 図２７Ｂは、環状ＲＮＡに対して特異的なプライマーを用いた線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。
【図52A】[0131] 図５２Ａは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。
【図52B】図５２Ｂは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。
【図52C】図５２Ｃは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。
【図54A】[0133] 図５４Ａは、マウスへのガウシアルシフェラーゼを発現する環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡの注入後、ガウシアルシフェラーゼ活性が環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された一方、その活性が修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0056】
[0136] 本発明は、概して、環状ポリリボヌクレオチド医薬組成物及び調製並びにその
使用に関する。
使用に関する。
【0057】
環状ポリリボヌクレオチド
[0137] ある態様において、本明細書に記載される本発明は、組成物並びに環状ポリリ
ボヌクレオチドの使用及び作製方法並びに環状ポリリボヌクレオチドの送達を含む。ある
実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒトにおいて非免疫
原性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、水産養殖動物（魚、
カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の
動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜
若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養
細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（
例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成
体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せにおいて複製すること
が可能であるか又は複製する。ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載される
環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含み、ここで、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ
、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物
（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若し
くは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞
、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例え
ば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細
胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態にお
いて、細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含むように改変される。
[0137] ある態様において、本明細書に記載される本発明は、組成物並びに環状ポリリ
ボヌクレオチドの使用及び作製方法並びに環状ポリリボヌクレオチドの送達を含む。ある
実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒトにおいて非免疫
原性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、水産養殖動物（魚、
カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の
動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜
若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養
細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（
例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成
体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せにおいて複製すること
が可能であるか又は複製する。ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載される
環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含み、ここで、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ
、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物
（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若し
くは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞
、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例え
ば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細
胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態にお
いて、細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含むように改変される。
【0058】
[0138] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、配列又は発現産物を含
む。
[0139] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも、線状同等
物、例えば線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオチドのものの半減期を有する。あ
る実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより増加した半減
期を有する。ある実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５
％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％又はそれを超えて増加される。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日間又は少なく
とも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日
間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４
日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２
日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０
日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内
で半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、
約１０分間以下～約７日間又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７
時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間
、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間
、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下又は
それらの間の任意の時間にわたって細胞内で半減期又は持続性を有する。ある実施形態に
おいて、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞が分割している間、細胞内で半減期又は持続
性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分割後の細胞内で半
減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１
０分間超～約３０日間又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時
間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１
５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、
６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間
、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間
、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間
、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたり、分割してい
る細胞内で半減期又は持続性を有する。
む。
[0139] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも、線状同等
物、例えば線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオチドのものの半減期を有する。あ
る実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより増加した半減
期を有する。ある実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５
％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％又はそれを超えて増加される。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日間又は少なく
とも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日
間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４
日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２
日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０
日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内
で半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、
約１０分間以下～約７日間又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７
時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間
、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間
、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下又は
それらの間の任意の時間にわたって細胞内で半減期又は持続性を有する。ある実施形態に
おいて、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞が分割している間、細胞内で半減期又は持続
性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分割後の細胞内で半
減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１
０分間超～約３０日間又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時
間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１
５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、
６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間
、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間
、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間
、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたり、分割してい
る細胞内で半減期又は持続性を有する。
【0059】
[0140] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞機能、例えば一時
的に又は長期間調節する。特定の実施形態において、少なくとも約１時間～約３０日間又
は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日
間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日
間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日
間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日
間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたっ
て持続する、調節などの細胞機能は、安定して変化される。特定の実施形態において、例
えば約３０分間以下～約７日間又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間
、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５
時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４
時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下
又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、一時的に変化
される。
的に又は長期間調節する。特定の実施形態において、少なくとも約１時間～約３０日間又
は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日
間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日
間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日
間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日
間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたっ
て持続する、調節などの細胞機能は、安定して変化される。特定の実施形態において、例
えば約３０分間以下～約７日間又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間
、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５
時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４
時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下
又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、一時的に変化
される。
【0060】
[0141] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌク
レオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも
約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド
、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４
００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオ
チド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少
なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも
約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，
０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，００
０ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌ
クレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレ
オチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオ
チドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための
結合部位に対応するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレ
オチドの最大サイズが、環状ポリリボヌクレオチドを生成し、且つ／又は環状ポリリボヌ
クレオチドを使用する技術的制約の範囲内である程度の大きさであり得ることを理解する
ことができる。理論によって制約されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントが、
ＤＮＡ並びにＲＮＡの「列」を生成するようにアニールされたそれらの５’及び３’遊離
末端（それらは、最終的に、１つの５’遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残るとき
に環状化され得る）から生成され得ることが可能である。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングと、標的に送達する能力に
よって制限され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有
用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって少なくとも２０，００
０ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレ
オチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少
なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，
０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチ
ド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００
ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
レオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも
約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド
、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４
００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオ
チド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少
なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも
約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，
０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，００
０ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌ
クレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレ
オチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオ
チドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための
結合部位に対応するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレ
オチドの最大サイズが、環状ポリリボヌクレオチドを生成し、且つ／又は環状ポリリボヌ
クレオチドを使用する技術的制約の範囲内である程度の大きさであり得ることを理解する
ことができる。理論によって制約されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントが、
ＤＮＡ並びにＲＮＡの「列」を生成するようにアニールされたそれらの５’及び３’遊離
末端（それらは、最終的に、１つの５’遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残るとき
に環状化され得る）から生成され得ることが可能である。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングと、標的に送達する能力に
よって制限され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有
用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって少なくとも２０，００
０ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレ
オチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少
なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，
０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチ
ド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００
ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
【0061】
[0142] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に
記載される１つ以上の要素を含む。ある実施形態において、要素は、スペーサー配列又は
リンカーによって互いに隔てられ得る。ある実施形態において、要素は、１リボヌクレオ
チド、２ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、
約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、
約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチ
ド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌ
クレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約
８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、最大で約１ｋｂ
、少なくとも約１０００ヌクレオチド、それらの間のヌクレオチドの任意の量だけ互いに
隔てられ得る。ある実施形態において、１つ以上の要素は、例えば、スペーサー要素を欠
いて、互いに連続している。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ
以上の要素は、立体配座柔軟性がある。ある実施形態において、立体配座柔軟性は、配列
が二次構造を実質的に含まないことによる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドは、本明細書に記載される１つ以上の所望の機能又は特性に対応する、例えばリボ
ソームのための結合部位、例えば翻訳、例えばローリングサークル型翻訳に対応する二次
又は三次構造を含む。
記載される１つ以上の要素を含む。ある実施形態において、要素は、スペーサー配列又は
リンカーによって互いに隔てられ得る。ある実施形態において、要素は、１リボヌクレオ
チド、２ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、
約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、
約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチ
ド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌ
クレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約
８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、最大で約１ｋｂ
、少なくとも約１０００ヌクレオチド、それらの間のヌクレオチドの任意の量だけ互いに
隔てられ得る。ある実施形態において、１つ以上の要素は、例えば、スペーサー要素を欠
いて、互いに連続している。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ
以上の要素は、立体配座柔軟性がある。ある実施形態において、立体配座柔軟性は、配列
が二次構造を実質的に含まないことによる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドは、本明細書に記載される１つ以上の所望の機能又は特性に対応する、例えばリボ
ソームのための結合部位、例えば翻訳、例えばローリングサークル型翻訳に対応する二次
又は三次構造を含む。
【0062】
[0143] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、特定の配列特性を含む
。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、特定のヌクレオチド組成物を含み得る。あるこ
のような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリンリッチ領域
（アデニン又はグアノシン）を含み得る。あるこのような実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、１つ以上のプリンリッチ領域（アデニン又はグアノシン）を含み得る
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＡＵリッチ領域又は
要素（ＡＲＥ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ
以上のアデニンリッチ領域を含み得る。
。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、特定のヌクレオチド組成物を含み得る。あるこ
のような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリンリッチ領域
（アデニン又はグアノシン）を含み得る。あるこのような実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、１つ以上のプリンリッチ領域（アデニン又はグアノシン）を含み得る
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＡＵリッチ領域又は
要素（ＡＲＥ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ
以上のアデニンリッチ領域を含み得る。
【0063】
[0144] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に
記載される１つ以上の反復要素を含み得る。
[0145] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に
記載される１つ以上の修飾を含む。
記載される１つ以上の反復要素を含み得る。
[0145] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に
記載される１つ以上の修飾を含む。
【0064】
[0146] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を
含み、インビボで対象の細胞内における持続的発現のために構成される。ある実施形態に
おいて、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列
の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。このような実施形態に
おいて、１つ以上の発現配列の発現は、比較的安定したレベルに維持され得るか、又は時
間と共に増加し得る。発現配列の発現は、長期間にわたって比較的に安定的であり得る。
例えば、ある場合において、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２
０、２２、２３日又はそれを超える期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発
現は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は
５％減少しない。ある場合において、細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、少な
くとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日又はそれを超え
て、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５
％を超えて変化しないレベルに維持される。
含み、インビボで対象の細胞内における持続的発現のために構成される。ある実施形態に
おいて、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列
の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。このような実施形態に
おいて、１つ以上の発現配列の発現は、比較的安定したレベルに維持され得るか、又は時
間と共に増加し得る。発現配列の発現は、長期間にわたって比較的に安定的であり得る。
例えば、ある場合において、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２
０、２２、２３日又はそれを超える期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発
現は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は
５％減少しない。ある場合において、細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、少な
くとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日又はそれを超え
て、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５
％を超えて変化しないレベルに維持される。
【0065】
発現配列
ペプチド又はポリペプチド
[0147] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプ
チドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このようなペプチドとしては、限定
はされないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸及び
アミノ酸類似体が挙げられる。ペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。このような
ペプチドは、１モル当たり約５，０００ｇ未満の分子量、１モル当たり約２，０００ｇ未
満の分子量、１モル当たり約１，０００ｇ未満の分子量、１モル当たり約５００ｇ未満の
分子量並びにこのような化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容される形態を有し得
る。このようなペプチドとしては、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬剤、
毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成分子及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニス
トが挙げられる。
ペプチド又はポリペプチド
[0147] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプ
チドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このようなペプチドとしては、限定
はされないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸及び
アミノ酸類似体が挙げられる。ペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。このような
ペプチドは、１モル当たり約５，０００ｇ未満の分子量、１モル当たり約２，０００ｇ未
満の分子量、１モル当たり約１，０００ｇ未満の分子量、１モル当たり約５００ｇ未満の
分子量並びにこのような化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容される形態を有し得
る。このようなペプチドとしては、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬剤、
毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成分子及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニス
トが挙げられる。
【0066】
[0148] ポリペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。ポリペプチドは、約５～約
４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミ
ノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～
約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００
アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸又はそれらの間の任意の範囲の長さを有
し得る。ある実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００未満のアミノ酸、約３
５，０００未満のアミノ酸、約３０，０００未満のアミノ酸、約２５，０００未満のアミ
ノ酸、約２０，０００未満のアミノ酸、約１５，０００未満のアミノ酸、約１０，０００
未満のアミノ酸、約９，０００未満のアミノ酸、約８，０００未満のアミノ酸、約７，０
００未満のアミノ酸、約６，０００未満のアミノ酸、約５，０００未満のアミノ酸、約４
，０００未満のアミノ酸、約３，０００未満のアミノ酸、約２，５００未満のアミノ酸、
約２，０００未満のアミノ酸、約１，５００未満のアミノ酸、約１，０００未満のアミノ
酸、約９００未満のアミノ酸、約８００未満のアミノ酸、約７００未満のアミノ酸、約６
００未満のアミノ酸、約５００未満のアミノ酸、約４００未満のアミノ酸、約３００未満
のアミノ酸又はそれを下回る長さを有し、有用であり得る。
４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミ
ノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～
約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００
アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸又はそれらの間の任意の範囲の長さを有
し得る。ある実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００未満のアミノ酸、約３
５，０００未満のアミノ酸、約３０，０００未満のアミノ酸、約２５，０００未満のアミ
ノ酸、約２０，０００未満のアミノ酸、約１５，０００未満のアミノ酸、約１０，０００
未満のアミノ酸、約９，０００未満のアミノ酸、約８，０００未満のアミノ酸、約７，０
００未満のアミノ酸、約６，０００未満のアミノ酸、約５，０００未満のアミノ酸、約４
，０００未満のアミノ酸、約３，０００未満のアミノ酸、約２，５００未満のアミノ酸、
約２，０００未満のアミノ酸、約１，５００未満のアミノ酸、約１，０００未満のアミノ
酸、約９００未満のアミノ酸、約８００未満のアミノ酸、約７００未満のアミノ酸、約６
００未満のアミノ酸、約５００未満のアミノ酸、約４００未満のアミノ酸、約３００未満
のアミノ酸又はそれを下回る長さを有し、有用であり得る。
【0067】
[0149] ペプチド又はポリペプチドのいくつかの例としては、限定はされないが、蛍光
タグ又はマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然生物活性ペプチドに由来する合成若しく
はアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗菌ペプチド、孔形
成ペプチド、二環式ペプチド、標的化若しくは細胞毒性ペプチド、分解若しくは自壊性ペ
プチド及び複数の分解若しくは自壊性ペプチドが挙げられる。本明細書に記載される本発
明において有用なペプチドとしては、抗原結合ペプチド、例えば抗原結合抗体又は抗体様
フラグメント、例えば一本鎖抗体、ナノボディも挙げられる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ
ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂ
ｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒ
ｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３を参照されたい）。こ
のような抗原結合ペプチドは、細胞質抗原、核抗原、小器官内抗原に結合し得る。
タグ又はマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然生物活性ペプチドに由来する合成若しく
はアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗菌ペプチド、孔形
成ペプチド、二環式ペプチド、標的化若しくは細胞毒性ペプチド、分解若しくは自壊性ペ
プチド及び複数の分解若しくは自壊性ペプチドが挙げられる。本明細書に記載される本発
明において有用なペプチドとしては、抗原結合ペプチド、例えば抗原結合抗体又は抗体様
フラグメント、例えば一本鎖抗体、ナノボディも挙げられる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ
ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂ
ｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒ
ｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３を参照されたい）。こ
のような抗原結合ペプチドは、細胞質抗原、核抗原、小器官内抗原に結合し得る。
【0068】
[0150] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ発現
配列を含み、これらは、それぞれポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドは、かなり
の量で生成され得る。したがって、ポリペプチドは、生成され得る任意のタンパク質分子
であり得る。ポリペプチドは、細胞から分泌されるか、又は細胞の細胞質、核若しくは膜
区画に限局され得るポリペプチドであり得る。いくつかのポリペプチドとしては、限定は
されないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部、代謝調節酵素（例えば
、脂質又はステロイド産生を調節する）、抗原、トレラゲン、サイトカイン、毒素、非存
在が疾患に関連する酵素、及び切断されるまで動物内（例えば、動物の腸内）で活性でな
いポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。
配列を含み、これらは、それぞれポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドは、かなり
の量で生成され得る。したがって、ポリペプチドは、生成され得る任意のタンパク質分子
であり得る。ポリペプチドは、細胞から分泌されるか、又は細胞の細胞質、核若しくは膜
区画に限局され得るポリペプチドであり得る。いくつかのポリペプチドとしては、限定は
されないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部、代謝調節酵素（例えば
、脂質又はステロイド産生を調節する）、抗原、トレラゲン、サイトカイン、毒素、非存
在が疾患に関連する酵素、及び切断されるまで動物内（例えば、動物の腸内）で活性でな
いポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。
【0069】
[0151] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば治
療用タンパク質をコードする発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書に開示さ
れる環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る治療用タンパク質は、酸化防止活性、結
合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデュー
サ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳
調節活性又は輸送活性を有する。治療用タンパク質のいくつかの例としては、限定はされ
ないが、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例
えば腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば、
癌）、リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザー
ゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に
影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死
の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネテ
ィック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、Ｄ
ＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻
害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ
、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体及びＣＲＩＳＰＲ
システム若しくはその構成要素が挙げられる。
療用タンパク質をコードする発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書に開示さ
れる環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る治療用タンパク質は、酸化防止活性、結
合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデュー
サ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳
調節活性又は輸送活性を有する。治療用タンパク質のいくつかの例としては、限定はされ
ないが、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例
えば腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば、
癌）、リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザー
ゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に
影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死
の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネテ
ィック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、Ｄ
ＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻
害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ
、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体及びＣＲＩＳＰＲ
システム若しくはその構成要素が挙げられる。
【0070】
[0152] ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから
発現され得る例示的なタンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば受容体結合タンパク
質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体モジュレータ及び再生タンパク質（例えば、増
殖及び分化に関与しているタンパク質、例えば創傷治癒のための治療用タンパク質）が挙
げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから
発現され得る例示的なタンパク質としては、ＥＧＦ（上皮成長因子）が挙げられる。ある
実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例
示的なタンパク質としては、酵素、例えばオキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコ
ンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素及びデサチュラ
ーゼが挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオ
チドから発現され得る例示的なタンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパ
ク質が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＮａｎｏＬｕ
ｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）を発現する。ある実施形態において、本明細
書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては
、分泌タンパク質、例えば分泌酵素が挙げられる。ある場合において、環状ポリリボヌク
レオチドは、血液中で治療効果のある短い半減期を有し得る分泌タンパク質を発現するか
、又は細胞内局在化シグナルを有するタンパク質若しくは分泌シグナルペプチドを有する
タンパク質であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガウシア
ルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド
は、非ヒトタンパク質、例えば蛍光タンパク質、エネルギー移動受容体又はＦｌａｇ、Ｍ
ｙｃ若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグを発現する。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ＧＦＰが挙げられる
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タグ化タンパク質、例えばタン
パク質タグを含有する融合タンパク質又は改変タンパク質、例えばキチン結合タンパク質
（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、カルモ
ジュリン－タグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；ポリグル
タメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；Ｅ－タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；ＦＬＡＧ－
タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ－タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；Ｈｉｓ－タグ（ＨＨＨ
ＨＨＨ）；Ｍｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ＮＥ－タグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥ
ＥＳＹＤＤＮＥＳ）；Ｓ－タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ＳＢＰ－タグ（Ｍ
ＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；Ｓ
ｏｆｔａｇ １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；Ｓｏｆｔａｇ ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ
）；Ｓｐｏｔ－タグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ）；Ｓｔｒｅｐ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－タ
グＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ）；Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰ
ＬＤ）；Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；ＶＳＶ－タグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲ
ＬＧＫ）；又はＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）を発現する。
発現され得る例示的なタンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば受容体結合タンパク
質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体モジュレータ及び再生タンパク質（例えば、増
殖及び分化に関与しているタンパク質、例えば創傷治癒のための治療用タンパク質）が挙
げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから
発現され得る例示的なタンパク質としては、ＥＧＦ（上皮成長因子）が挙げられる。ある
実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例
示的なタンパク質としては、酵素、例えばオキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコ
ンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素及びデサチュラ
ーゼが挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオ
チドから発現され得る例示的なタンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパ
ク質が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＮａｎｏＬｕ
ｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）を発現する。ある実施形態において、本明細
書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては
、分泌タンパク質、例えば分泌酵素が挙げられる。ある場合において、環状ポリリボヌク
レオチドは、血液中で治療効果のある短い半減期を有し得る分泌タンパク質を発現するか
、又は細胞内局在化シグナルを有するタンパク質若しくは分泌シグナルペプチドを有する
タンパク質であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガウシア
ルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド
は、非ヒトタンパク質、例えば蛍光タンパク質、エネルギー移動受容体又はＦｌａｇ、Ｍ
ｙｃ若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグを発現する。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ＧＦＰが挙げられる
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タグ化タンパク質、例えばタン
パク質タグを含有する融合タンパク質又は改変タンパク質、例えばキチン結合タンパク質
（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、カルモ
ジュリン－タグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；ポリグル
タメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；Ｅ－タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；ＦＬＡＧ－
タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ－タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；Ｈｉｓ－タグ（ＨＨＨ
ＨＨＨ）；Ｍｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ＮＥ－タグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥ
ＥＳＹＤＤＮＥＳ）；Ｓ－タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ＳＢＰ－タグ（Ｍ
ＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；Ｓ
ｏｆｔａｇ １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；Ｓｏｆｔａｇ ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ
）；Ｓｐｏｔ－タグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ）；Ｓｔｒｅｐ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－タ
グＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ）；Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰ
ＬＤ）；Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；ＶＳＶ－タグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲ
ＬＧＫ）；又はＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）を発現する。
【0071】
[0153] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体、例えば抗体フラ
グメント又はその部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドに
よって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソ
タイプのものであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の
一部、例えば軽鎖、重鎖、Ｆｃフラグメント、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖフラグメ
ント又はＦａｂフラグメント、そのさらなる部分を発現する。ある実施形態において、環
状ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、環状ポリリボヌ
クレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、これらは、それぞれ抗体の一部を
発現し、これらの集合が抗体を構成し得る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチ
ドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列
を含む。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドが細胞内又は無細胞環境で発現さ
れる場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、折り畳み又は機能的抗体を形成する他の翻訳後
修飾に供され得る。
グメント又はその部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドに
よって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソ
タイプのものであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の
一部、例えば軽鎖、重鎖、Ｆｃフラグメント、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖフラグメ
ント又はＦａｂフラグメント、そのさらなる部分を発現する。ある実施形態において、環
状ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、環状ポリリボヌ
クレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、これらは、それぞれ抗体の一部を
発現し、これらの集合が抗体を構成し得る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチ
ドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列
を含む。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドが細胞内又は無細胞環境で発現さ
れる場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、折り畳み又は機能的抗体を形成する他の翻訳後
修飾に供され得る。
【0072】
調節要素
[0154] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば環状
ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
[0154] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば環状
ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
【0073】
[0155] 調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得
る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在
しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。さら
に、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物の量を
増加させ得る。したがって、１つの調節要素が１つ以上の発現配列の発現を促進すること
ができる。複数の調節要素が当業者に周知である。
る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在
しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。さら
に、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物の量を
増加させ得る。したがって、１つの調節要素が１つ以上の発現配列の発現を促進すること
ができる。複数の調節要素が当業者に周知である。
【0074】
[0156] 本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細
書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド
、例えば特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又
は活性化する核酸配列を指し得る。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書に
おいて使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド又は
環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指し得る。例示的な
選択的分解配列は、リボスイッチアプタザイム及びｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド
、例えば特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又
は活性化する核酸配列を指し得る。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書に
おいて使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド又は
環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指し得る。例示的な
選択的分解配列は、リボスイッチアプタザイム及びｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
【0075】
[0157] ある実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレ
ータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータ
は、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。ある実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳モジュレ
ータを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接す
る翻訳モジュレータを含む。ある実施形態において、翻訳モジュレータは、各発現配列の
１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離を
もたらす。
ータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータ
は、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。ある実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳モジュレ
ータを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接す
る翻訳モジュレータを含む。ある実施形態において、翻訳モジュレータは、各発現配列の
１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離を
もたらす。
【0076】
[0158] ある実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。ある実
施形態において、翻訳開始配列は、ＡＵＧコドンを含む。ある実施形態において、翻訳開
始配列は、ＡＵＧ、ＣＵＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＡＣＧ、ＡＵＣ、ＡＵＵ、ＡＡＧ、ＡＵＡ
又はＡＧＧなどの任意の真核生物開始コドンを含む。ある実施形態において、翻訳開始配
列は、コザック配列を含む。ある実施形態において、翻訳は、選択的条件、例えばストレ
ス誘発性条件下で別の翻訳開始配列、例えばＡＵＧコドン以外の翻訳開始配列から開始す
る。非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧなどの別の翻訳開
始配列から開始する。別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、別の
翻訳開始配列、ＣＴＧ／ＣＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、環状ポ
リリボヌクレオチド翻訳は、別の翻訳開始配列、ＧＴＧ／ＧＵＧから開始し得る。さらに
別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、反復ＲＮＡ、例えばＣＧＧ、Ｇ
ＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧの短いストレッチを含む別の翻訳開始配列などのリピート関
連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列から翻訳を開始し得る。
施形態において、翻訳開始配列は、ＡＵＧコドンを含む。ある実施形態において、翻訳開
始配列は、ＡＵＧ、ＣＵＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＡＣＧ、ＡＵＣ、ＡＵＵ、ＡＡＧ、ＡＵＡ
又はＡＧＧなどの任意の真核生物開始コドンを含む。ある実施形態において、翻訳開始配
列は、コザック配列を含む。ある実施形態において、翻訳は、選択的条件、例えばストレ
ス誘発性条件下で別の翻訳開始配列、例えばＡＵＧコドン以外の翻訳開始配列から開始す
る。非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧなどの別の翻訳開
始配列から開始する。別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、別の
翻訳開始配列、ＣＴＧ／ＣＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、環状ポ
リリボヌクレオチド翻訳は、別の翻訳開始配列、ＧＴＧ／ＧＵＧから開始し得る。さらに
別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、反復ＲＮＡ、例えばＣＧＧ、Ｇ
ＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧの短いストレッチを含む別の翻訳開始配列などのリピート関
連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列から翻訳を開始し得る。
【0077】
[0159] 限定はされないが、開始コドン又は別の開始コドンなど、翻訳を開始させるコ
ドンに隣接するヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／又は
構造に影響を与えることが知られている。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援
用されるＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１
を参照されたい）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクす
ることを用いて、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ及び／又
は構造を変化させ得る。
ドンに隣接するヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／又は
構造に影響を与えることが知られている。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援
用されるＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１
を参照されたい）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクす
ることを用いて、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ及び／又
は構造を変化させ得る。
【0078】
[0160] 一実施形態において、マスキング剤は、マスクされた開始コドン又は別の開始
コドンにおける翻訳開始の可能性を低下させるために、コドンをマスクするか又は隠すた
めに、開始コドン又は別の開始コドンの近くで使用され得る。マスキング剤の非限定的な
例としては、アンチセンスロックト核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソン接合
部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用され
るＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｍａｓｋｉｎｇ ａｇ
ｅｎｔｓ ＬＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＥＪＣｓ（ＰＬｏＳ
ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）を参照されたい）。別の実施形態において、マスキング剤
は、翻訳が別の開始コドンから開始する可能性を増加させるために、環状ポリリボヌクレ
オチドの開始コドンをマスクするために使用され得る。
コドンにおける翻訳開始の可能性を低下させるために、コドンをマスクするか又は隠すた
めに、開始コドン又は別の開始コドンの近くで使用され得る。マスキング剤の非限定的な
例としては、アンチセンスロックト核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソン接合
部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用され
るＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｍａｓｋｉｎｇ ａｇ
ｅｎｔｓ ＬＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＥＪＣｓ（ＰＬｏＳ
ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）を参照されたい）。別の実施形態において、マスキング剤
は、翻訳が別の開始コドンから開始する可能性を増加させるために、環状ポリリボヌクレ
オチドの開始コドンをマスクするために使用され得る。
【0079】
[0161] ある実施形態において、翻訳は、限定はされないが、ＧＲＳＦ－１の存在下に
おけるウイルス誘発性選択などの選択的条件下で開始され、環状ポリリボヌクレオチドは
、ＧＲＳＦ－１結合部位を含み、例えばｈｔｔｐ：／／ｊｖｉ．ａｓｍ．ｏｒｇ／ｃｏｎ
ｔｅｎｔ／７６／２０／１０４１７．ｆｕｌｌを参照されたい。
おけるウイルス誘発性選択などの選択的条件下で開始され、環状ポリリボヌクレオチドは
、ＧＲＳＦ－１結合部位を含み、例えばｈｔｔｐ：／／ｊｖｉ．ａｓｍ．ｏｒｇ／ｃｏｎ
ｔｅｎｔ／７６／２０／１０４１７．ｆｕｌｌを参照されたい。
【0080】
翻訳開始配列
[0162] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコード
し、翻訳開始配列、例えば開始コドンを含み得る。ある実施形態において、翻訳開始配列
は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えばコザック配列を含む。ある実
施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態において、
翻訳開始配列、例えばコザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現
産物の分離をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列
に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列
は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態において、翻訳
開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。
[0162] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコード
し、翻訳開始配列、例えば開始コドンを含み得る。ある実施形態において、翻訳開始配列
は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えばコザック配列を含む。ある実
施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態において、
翻訳開始配列、例えばコザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現
産物の分離をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列
に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列
は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態において、翻訳
開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。
【0081】
[0163] 環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２つ、少なくと
も３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくと
も８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくと
も１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくと
も１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくと
も３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０超の開始コドンなど
の２つ以上の開始コドンを含み得る。翻訳は、第１の開始コドン上で開始し得るか、又は
第１の開始コドンの下流で開始し得る。
も３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくと
も８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくと
も１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくと
も１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくと
も３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０超の開始コドンなど
の２つ以上の開始コドンを含み得る。翻訳は、第１の開始コドン上で開始し得るか、又は
第１の開始コドンの下流で開始し得る。
【0082】
[0164] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドンでな
いコドン、例えばＡＵＧから開始し得る。環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、限定はさ
れないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ
、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどの別の翻訳開始配列から開始し得る（それぞれの
内容全体が参照により本明細書に援用されるＴｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａ
ｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい）。ある実施
形態において、翻訳は、選択的条件、例えばストレス誘発性条件下で別の翻訳開始配列か
ら開始する。非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧなどの別
の翻訳開始配列から開始し得る。別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻
訳は、別の翻訳開始配列、ＣＴＧ／ＣＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例とし
て、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、別の翻訳開始配列、ＧＴＧ／ＧＵＧから開始し得
る。さらに別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、反復ＲＮＡ、例えば
ＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧの短いストレッチを含む別の翻訳開始配列などの
リピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列から翻訳を開始し得る。
いコドン、例えばＡＵＧから開始し得る。環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、限定はさ
れないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ
、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどの別の翻訳開始配列から開始し得る（それぞれの
内容全体が参照により本明細書に援用されるＴｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａ
ｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい）。ある実施
形態において、翻訳は、選択的条件、例えばストレス誘発性条件下で別の翻訳開始配列か
ら開始する。非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧなどの別
の翻訳開始配列から開始し得る。別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻
訳は、別の翻訳開始配列、ＣＴＧ／ＣＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例とし
て、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、別の翻訳開始配列、ＧＴＧ／ＧＵＧから開始し得
る。さらに別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、反復ＲＮＡ、例えば
ＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧの短いストレッチを含む別の翻訳開始配列などの
リピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列から翻訳を開始し得る。
【0083】
[0165] ある実施形態において、翻訳は、Ｒｏｃａｇｌａｔｅｓによる真核生物開始因
子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングをブロック
することによって抑制されて、ＲｏｃＡ－ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写産物からの早
期の上流の翻訳開始及び減少したタンパク質発現につながり、例えばｗｗｗ．ｎａｔｕｒ
ｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照されたい）。
子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングをブロック
することによって抑制されて、ＲｏｃＡ－ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写産物からの早
期の上流の翻訳開始及び減少したタンパク質発現につながり、例えばｗｗｗ．ｎａｔｕｒ
ｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照されたい）。
【0084】
ＩＲＥＳ
[0166] ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド中に含むの
に好適なＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームにかみ合うことが可能なＲＮＡ配列を含む
。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、少なくとも約５ｎｔ、少なくとも約８ｎｔ、
少なくとも約９ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約２０
ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくと
も約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約２５０
ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ又は少なくとも約５００ｎｔである。一実施形態において
、ＩＲＥＳ要素は、限定はされないが、ウイルス、哺乳動物及びショウジョウバエ（Dros
ophila）を含む生物のＤＮＡに由来する。このようなウイルスＤＮＡは、限定はされない
が、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ及びポリオウイルスｃＤＮＡと共にピコルナ
ウイルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に由来し得る。一実施形態において、ＩＲＥＳ要素が
由来するショウジョウバエ（Drosophila）ＤＮＡとしては、限定はされないが、キイロシ
ョウジョウバエ（Drosophilamelanogaster）に由来するアンテナペディア遺伝子が挙げ
られる。
[0166] ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド中に含むの
に好適なＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームにかみ合うことが可能なＲＮＡ配列を含む
。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、少なくとも約５ｎｔ、少なくとも約８ｎｔ、
少なくとも約９ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約２０
ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくと
も約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約２５０
ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ又は少なくとも約５００ｎｔである。一実施形態において
、ＩＲＥＳ要素は、限定はされないが、ウイルス、哺乳動物及びショウジョウバエ（Dros
ophila）を含む生物のＤＮＡに由来する。このようなウイルスＤＮＡは、限定はされない
が、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ及びポリオウイルスｃＤＮＡと共にピコルナ
ウイルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に由来し得る。一実施形態において、ＩＲＥＳ要素が
由来するショウジョウバエ（Drosophila）ＤＮＡとしては、限定はされないが、キイロシ
ョウジョウバエ（Drosophilamelanogaster）に由来するアンテナペディア遺伝子が挙げ
られる。
【0085】
[0167] ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、ウイルスに少なくとも部分的に由来
し、例えば、それは、ＡＢＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＡＥＶ、ＡＬＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、
ＢＱＣＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＢＶＤＶ１＿１－３８５、ＢＶＤＶ１＿２９－３９１、Ｃｒ
ＰＶ＿５ＮＣＲ、ＣｒＰＶ＿ＩＧＲ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳ
ｍｐ７５、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｍｐ２２８、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ｃｒＴＭＶ＿
ＩＲＥＳｃｐ、ＣＳＦＶ、ＣＶＢ３、ＤＣＶ＿ＩＧＲ、ＥＭＣＶ－Ｒ、ＥｏＰＶ＿５ＮＴ
Ｒ、ＥＲＡＶ＿２４５－９６１、ＥＲＢＶ＿１６２－９２０、ＥＶ７１＿１－７４８、Ｆ
ｅＬＶ－Ｎｏｔｃｈ２、ＦＭＤＶ＿ｔｙｐｅ＿Ｃ、ＧＢＶ－Ａ、ＧＢＶ－Ｂ、ＧＢＶ－Ｃ
、ｇｙｐｓｙ＿ｅｎｖ、ｇｙｐｓｙＤ５、ｇｙｐｓｙＤ２、ＨＡＶ＿ＨＭ１７５、ＨＣＶ
＿ｔｙｐｅ＿１ａ、ＨｉＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＨＩＶ－１、ＨｏＣＶ１＿ＩＧＲｐｒｅ
ｄ、ＨＲＶ－２、ＩＡＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ｉｄｅｆｉｘ、ＫＢＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、
ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ１＿－１０１＿ｔｏ＿－１、ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ１＿－３０２＿
ｔｏ＿－２０２、ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ２＿－１３８＿ｔｏ＿－８６、ＬＩＮＥ－１＿Ｏ
ＲＦ１＿－４４＿ｔｏ＿－１、ＰＳＩＶ＿ＩＧＲ、ＰＶ＿ｔｙｐｅ１＿Ｍａｈｏｎｅｙ、
ＰＶ＿ｔｙｐｅ３＿Ｌｅｏｎ、ＲＥＶ－Ａ、ＲｈＰＶ＿５ＮＣＲ、ＲｈＰＶ＿ＩＧＲ、Ｓ
ＩＮＶ１＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＳＶ４０＿６６１－８３０、ＴＭＥＶ、ＴＭＶ＿ＵＩ＿ＩＲ
ＥＳｍｐ２２８、ＴＲＶ＿５ＮＴＲ、ＴｒＶ＿ＩＧＲ又はＴＳＶ＿ＩＧＲなどのウイルス
ＩＲＥＳ要素に由来し得る。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、ＡＭＬ１／ＲＵＮ
Ｘ１、Ａｎｔｐ－Ｄ、Ａｎｔｐ－ＤＥ、Ａｎｔｐ－ＣＤＥ、Ａｐａｆ－１、Ａｐａｆ－１
、ＡＱＰ４、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ１、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ２、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ３、ＡＴ１Ｒ
＿ｖａｒ４、ＢＡＧ１＿ｐ３６ｄｅｌｔａ２３６ｎｔ、ＢＡＧ１＿ｐ３６、ＢＣＬ２、Ｂ
ｉＰ＿－２２２＿－３、ｃ－ＩＡＰ１＿２８５－１３９９、ｃ－ＩＡＰ１＿１３１３－１
４６２、ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｍｙｃ、Ｃａｔ－１＿２２４、ＣＣＮＤ１、ＤＡＰ５、ｅＩＦ
４Ｇ、ｅＩＦ４ＧＩ－ｅｘｔ、ｅＩＦ４ＧＩＩ、ｅＩＦ４ＧＩＩ－ｌｏｎｇ、ＥＬＧ１、
ＥＬＨ、ＦＧＦ１Ａ、ＦＭＲ１、Ｇｔｘ－１３３－１４１、Ｇｔｘ－１－１６６、Ｇｔｘ
－１－１２０、Ｇｔｘ－１－１９６、ｈａｉｒｌｅｓｓ、ＨＡＰ４、ＨＩＦ１ａ、ｈＳＮ
Ｍ１、Ｈｓｐ１０１、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ２＿ｌｅａｄｅｒ２
、Ｋｖ１．４＿１．２、Ｌ－ｍｙｃ、ＬａｍＢ１＿－３３５＿－１、ＬＥＦ１、ＭＮＴ＿
７５－２６７、ＭＮＴ＿３６－１６０、ＭＴＧ８ａ、ＭＹＢ、ＭＹＴ２＿９９７－１１５
２、ｎ－ＭＹＣ、ＮＤＳＴ１、ＮＤＳＴ２、ＮＤＳＴ３、ＮＤＳＴ４Ｌ、ＮＤＳＴ４Ｓ、
ＮＲＦ＿－６５３＿－１７、ＮｔＨＳＦ１、ＯＤＣ１、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ５３＿１２８
－２６９、ＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、Ｐｉｍ－１、ＰＩＴＳＬＲＥ＿ｐ５８、Ｒｂｍ３、
ｒｅａｐｅｒ、Ｓｃａｍｐｅｒ、ＴＦＩＩＤ、ＴＩＦ４６３１、Ｕｂｘ＿１－９６６、Ｕ
ｂｘ＿３７３－９６１、ＵＮＲ、Ｕｒｅ２、ＵｔｒＡ、ＶＥＧＦ－Ａ＿－１３３＿－１、
ＸＩＡＰ＿５－４６４、ＸＩＡＰ＿３０５－４６６又はＹＡＰ１などの細胞ＩＲＥＳに少
なくとも部分的に由来する。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、合成ＩＲＥＳ、例
えば（ＧＡＡＡ）１６、（ＰＰＴ１９）４、ＫＭＩ１、ＫＭＩ１、ＫＭＩ２、ＫＭＩ２、
ＫＭＩＸ、Ｘ１又はＸ２を含む。
し、例えば、それは、ＡＢＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＡＥＶ、ＡＬＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、
ＢＱＣＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＢＶＤＶ１＿１－３８５、ＢＶＤＶ１＿２９－３９１、Ｃｒ
ＰＶ＿５ＮＣＲ、ＣｒＰＶ＿ＩＧＲ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳ
ｍｐ７５、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｍｐ２２８、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ｃｒＴＭＶ＿
ＩＲＥＳｃｐ、ＣＳＦＶ、ＣＶＢ３、ＤＣＶ＿ＩＧＲ、ＥＭＣＶ－Ｒ、ＥｏＰＶ＿５ＮＴ
Ｒ、ＥＲＡＶ＿２４５－９６１、ＥＲＢＶ＿１６２－９２０、ＥＶ７１＿１－７４８、Ｆ
ｅＬＶ－Ｎｏｔｃｈ２、ＦＭＤＶ＿ｔｙｐｅ＿Ｃ、ＧＢＶ－Ａ、ＧＢＶ－Ｂ、ＧＢＶ－Ｃ
、ｇｙｐｓｙ＿ｅｎｖ、ｇｙｐｓｙＤ５、ｇｙｐｓｙＤ２、ＨＡＶ＿ＨＭ１７５、ＨＣＶ
＿ｔｙｐｅ＿１ａ、ＨｉＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＨＩＶ－１、ＨｏＣＶ１＿ＩＧＲｐｒｅ
ｄ、ＨＲＶ－２、ＩＡＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ｉｄｅｆｉｘ、ＫＢＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、
ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ１＿－１０１＿ｔｏ＿－１、ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ１＿－３０２＿
ｔｏ＿－２０２、ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ２＿－１３８＿ｔｏ＿－８６、ＬＩＮＥ－１＿Ｏ
ＲＦ１＿－４４＿ｔｏ＿－１、ＰＳＩＶ＿ＩＧＲ、ＰＶ＿ｔｙｐｅ１＿Ｍａｈｏｎｅｙ、
ＰＶ＿ｔｙｐｅ３＿Ｌｅｏｎ、ＲＥＶ－Ａ、ＲｈＰＶ＿５ＮＣＲ、ＲｈＰＶ＿ＩＧＲ、Ｓ
ＩＮＶ１＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＳＶ４０＿６６１－８３０、ＴＭＥＶ、ＴＭＶ＿ＵＩ＿ＩＲ
ＥＳｍｐ２２８、ＴＲＶ＿５ＮＴＲ、ＴｒＶ＿ＩＧＲ又はＴＳＶ＿ＩＧＲなどのウイルス
ＩＲＥＳ要素に由来し得る。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、ＡＭＬ１／ＲＵＮ
Ｘ１、Ａｎｔｐ－Ｄ、Ａｎｔｐ－ＤＥ、Ａｎｔｐ－ＣＤＥ、Ａｐａｆ－１、Ａｐａｆ－１
、ＡＱＰ４、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ１、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ２、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ３、ＡＴ１Ｒ
＿ｖａｒ４、ＢＡＧ１＿ｐ３６ｄｅｌｔａ２３６ｎｔ、ＢＡＧ１＿ｐ３６、ＢＣＬ２、Ｂ
ｉＰ＿－２２２＿－３、ｃ－ＩＡＰ１＿２８５－１３９９、ｃ－ＩＡＰ１＿１３１３－１
４６２、ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｍｙｃ、Ｃａｔ－１＿２２４、ＣＣＮＤ１、ＤＡＰ５、ｅＩＦ
４Ｇ、ｅＩＦ４ＧＩ－ｅｘｔ、ｅＩＦ４ＧＩＩ、ｅＩＦ４ＧＩＩ－ｌｏｎｇ、ＥＬＧ１、
ＥＬＨ、ＦＧＦ１Ａ、ＦＭＲ１、Ｇｔｘ－１３３－１４１、Ｇｔｘ－１－１６６、Ｇｔｘ
－１－１２０、Ｇｔｘ－１－１９６、ｈａｉｒｌｅｓｓ、ＨＡＰ４、ＨＩＦ１ａ、ｈＳＮ
Ｍ１、Ｈｓｐ１０１、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ２＿ｌｅａｄｅｒ２
、Ｋｖ１．４＿１．２、Ｌ－ｍｙｃ、ＬａｍＢ１＿－３３５＿－１、ＬＥＦ１、ＭＮＴ＿
７５－２６７、ＭＮＴ＿３６－１６０、ＭＴＧ８ａ、ＭＹＢ、ＭＹＴ２＿９９７－１１５
２、ｎ－ＭＹＣ、ＮＤＳＴ１、ＮＤＳＴ２、ＮＤＳＴ３、ＮＤＳＴ４Ｌ、ＮＤＳＴ４Ｓ、
ＮＲＦ＿－６５３＿－１７、ＮｔＨＳＦ１、ＯＤＣ１、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ５３＿１２８
－２６９、ＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、Ｐｉｍ－１、ＰＩＴＳＬＲＥ＿ｐ５８、Ｒｂｍ３、
ｒｅａｐｅｒ、Ｓｃａｍｐｅｒ、ＴＦＩＩＤ、ＴＩＦ４６３１、Ｕｂｘ＿１－９６６、Ｕ
ｂｘ＿３７３－９６１、ＵＮＲ、Ｕｒｅ２、ＵｔｒＡ、ＶＥＧＦ－Ａ＿－１３３＿－１、
ＸＩＡＰ＿５－４６４、ＸＩＡＰ＿３０５－４６６又はＹＡＰ１などの細胞ＩＲＥＳに少
なくとも部分的に由来する。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、合成ＩＲＥＳ、例
えば（ＧＡＡＡ）１６、（ＰＰＴ１９）４、ＫＭＩ１、ＫＭＩ１、ＫＭＩ２、ＫＭＩ２、
ＫＭＩＸ、Ｘ１又はＸ２を含む。
【0086】
[0168] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つ（例え
ば、２、３、４、５つ又はそれを超える）の発現配列に隣接する少なくとも１つのＩＲＥ
Ｓを含む。ある実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、
５つ又はそれを超える）の発現配列の両側に隣接する。ある実施形態において、環状ポリ
リボヌクレオチドは、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、得られるペプチド及び
又はポリペプチドの分離をもたらす１つ以上のＩＲＥＳ配列を含む。
ば、２、３、４、５つ又はそれを超える）の発現配列に隣接する少なくとも１つのＩＲＥ
Ｓを含む。ある実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、
５つ又はそれを超える）の発現配列の両側に隣接する。ある実施形態において、環状ポリ
リボヌクレオチドは、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、得られるペプチド及び
又はポリペプチドの分離をもたらす１つ以上のＩＲＥＳ配列を含む。
【0087】
終止要素
[0169] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を
含み、各発現配列は、終止要素を有していても又は有していなくてもよい。ある実施形態
において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、環状
ポリリボヌクレオチドが連続して翻訳されるように終止要素を欠いている。終止要素の排
除は、リボソームの停滞又は落下がないために、発現産物、例えばペプチド又はポリペプ
チドのローリングサークル型翻訳又は連続した発現をもたらし得る。このような実施形態
において、ローリングサークル型翻訳は、各発現配列を介して連続した発現産物を発現す
る。ある他の実施形態において、発現配列の終止要素は、スタガー要素の一部であり得る
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列は、終止要
素を含む。しかしながら、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、
第４、第５などの）発現配列のローリングサークル型翻訳又は発現が行われる。このよう
な場合、リボソームが終止要素、例えば終止コドンに遭遇し、翻訳を終止するとき、発現
産物は、リボソームから落下し得る。ある実施形態において、翻訳は、リボソーム、例え
ばリボソームの少なくとも１つのサブユニットが環状ポリリボヌクレオチドと接触状態を
保ちながら終止される。
[0169] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を
含み、各発現配列は、終止要素を有していても又は有していなくてもよい。ある実施形態
において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、環状
ポリリボヌクレオチドが連続して翻訳されるように終止要素を欠いている。終止要素の排
除は、リボソームの停滞又は落下がないために、発現産物、例えばペプチド又はポリペプ
チドのローリングサークル型翻訳又は連続した発現をもたらし得る。このような実施形態
において、ローリングサークル型翻訳は、各発現配列を介して連続した発現産物を発現す
る。ある他の実施形態において、発現配列の終止要素は、スタガー要素の一部であり得る
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列は、終止要
素を含む。しかしながら、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、
第４、第５などの）発現配列のローリングサークル型翻訳又は発現が行われる。このよう
な場合、リボソームが終止要素、例えば終止コドンに遭遇し、翻訳を終止するとき、発現
産物は、リボソームから落下し得る。ある実施形態において、翻訳は、リボソーム、例え
ばリボソームの少なくとも１つのサブユニットが環状ポリリボヌクレオチドと接触状態を
保ちながら終止される。
【0088】
[0170] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の
末端に終止要素を含む。ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、連続して２つ以
上の終止要素を含む。このような実施形態において、翻訳が終止され、ローリングサーク
ル型翻訳が終止される。ある実施形態において、リボソームは、環状ポリリボヌクレオチ
ドと完全に離脱する。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の
後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列の生成は、リボソームが翻訳
の開始前に環状ポリリボヌクレオチドと再度かみ合うことを必要とし得る。一般に、終止
要素は、翻訳の終止を示すインフレームヌクレオチド三つ組、例えばＵＡＡ、ＵＧＡ、Ｕ
ＡＧを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終止要素
は、限定はされないが、翻訳を終止し得るオフフレーム又は－１及び＋１シフトされたリ
ーディングフレーム（例えば、隠れた停止）などのフレームシフト終止要素である。フレ
ームシフト終止要素は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレームに現れるヌクレ
オチド三つ組、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡを含む。フレームシフト終止要素は、細胞に有
害であることが多い、ｍＲＮＡの読み違いを防ぐ際に重要であり得る。
末端に終止要素を含む。ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、連続して２つ以
上の終止要素を含む。このような実施形態において、翻訳が終止され、ローリングサーク
ル型翻訳が終止される。ある実施形態において、リボソームは、環状ポリリボヌクレオチ
ドと完全に離脱する。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の
後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列の生成は、リボソームが翻訳
の開始前に環状ポリリボヌクレオチドと再度かみ合うことを必要とし得る。一般に、終止
要素は、翻訳の終止を示すインフレームヌクレオチド三つ組、例えばＵＡＡ、ＵＧＡ、Ｕ
ＡＧを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終止要素
は、限定はされないが、翻訳を終止し得るオフフレーム又は－１及び＋１シフトされたリ
ーディングフレーム（例えば、隠れた停止）などのフレームシフト終止要素である。フレ
ームシフト終止要素は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレームに現れるヌクレ
オチド三つ組、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡを含む。フレームシフト終止要素は、細胞に有
害であることが多い、ｍＲＮＡの読み違いを防ぐ際に重要であり得る。
【0089】
スタガー要素
[0171] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少
なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド
は、各発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、スタガー要素は
、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペ
プチドの分離をもたらす。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列
の一部である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配
列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガ
ー要素によって後続の発現配列から隔てられる。ある実施形態において、スタガー要素は
、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の
翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。ある実施形態において、スタガー要素
は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。ある実施形態において、スタガー
要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。
[0171] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少
なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド
は、各発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、スタガー要素は
、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペ
プチドの分離をもたらす。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列
の一部である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配
列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガ
ー要素によって後続の発現配列から隔てられる。ある実施形態において、スタガー要素は
、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の
翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。ある実施形態において、スタガー要素
は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。ある実施形態において、スタガー
要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。
【0090】
[0172] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含む。
ローリングサークル型翻訳を維持しながら、連続した発現産物、例えばペプチド又はポリ
ペプチドの生成を避けるために、スタガー要素は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する
ために含まれ得る。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少な
くとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリング
サークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成され得る。スタガー要素としては
、限定はされないが、２Ａ様又はＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼ要素）配列が挙
げられる。ある実施形態において、スタガー要素は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（ここ
で、Ｘ１は、存在しないか、又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、存在しないか、又はＤ若
しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ、又はＶ、又はＩ、又はＳ、又はＭであり、Ｘ５は、任意の
アミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。ある実施形
態において、この配列は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコン
センサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）を含
む。スタガー要素のいくつかの非限定的な例としては、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥ
ＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ
、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、
ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤ
ＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤ
ＳＥＦＮＰＧＰが挙げられる。
ローリングサークル型翻訳を維持しながら、連続した発現産物、例えばペプチド又はポリ
ペプチドの生成を避けるために、スタガー要素は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する
ために含まれ得る。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少な
くとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリング
サークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成され得る。スタガー要素としては
、限定はされないが、２Ａ様又はＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼ要素）配列が挙
げられる。ある実施形態において、スタガー要素は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（ここ
で、Ｘ１は、存在しないか、又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、存在しないか、又はＤ若
しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ、又はＶ、又はＩ、又はＳ、又はＭであり、Ｘ５は、任意の
アミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。ある実施形
態において、この配列は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコン
センサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）を含
む。スタガー要素のいくつかの非限定的な例としては、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥ
ＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ
、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、
ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤ
ＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤ
ＳＥＦＮＰＧＰが挙げられる。
【0091】
[0173] ある実施形態において、本明細書に記載されるスタガー要素は、本明細書に記
載されるコンセンサス配列のＧとＰとの間などで発現産物を切断する。１つの非限定的な
例として、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するために少なくとも１つのス
タガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１
つの発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌク
レオチドは、各発現配列の後にスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両
側に存在して、各発現配列からの個々のペプチド及び又はポリペプチドの翻訳をもたらす
。
載されるコンセンサス配列のＧとＰとの間などで発現産物を切断する。１つの非限定的な
例として、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するために少なくとも１つのス
タガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１
つの発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌク
レオチドは、各発現配列の後にスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両
側に存在して、各発現配列からの個々のペプチド及び又はポリペプチドの翻訳をもたらす
。
【0092】
[0174] ある実施形態において、スタガー要素は、翻訳中にリボソームの休止を誘導す
る１つ以上の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックト核酸（ＬＮＡ）並びにグリコール核酸
（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含み得る。これらなどの例は、分子の骨格に
対する変化により、天然ＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。例示的な修飾は、糖、核酸塩基
、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合
／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び翻訳中にリボソームの休止を誘導し得
るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつ
かが本明細書の他の箇所に記載される。
る１つ以上の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックト核酸（ＬＮＡ）並びにグリコール核酸
（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含み得る。これらなどの例は、分子の骨格に
対する変化により、天然ＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。例示的な修飾は、糖、核酸塩基
、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合
／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び翻訳中にリボソームの休止を誘導し得
るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつ
かが本明細書の他の箇所に記載される。
【0093】
[0175] ある実施形態において、スタガー要素は、他の形態で環状ポリリボヌクレオチ
ド中に存在する。例えば、ある例示的な環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタガー要
素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終止要素及び第１の発現配列に続
く発現の第１の翻訳開始配列から終止要素を隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含む。
いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオ
チド中の第１の発現配列に続く発現の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。
ある場合において、第１の発現配列及び第１の発現配列に続く発現配列は、環状ポリリボ
ヌクレオチド中の２つの別個の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配
列との間の距離は、第１の発現配列及びその後続の発現配列の連続した翻訳を可能にし得
る。ある実施形態において、第１のスタガー要素は、終止要素を含み、第１の発現配列の
発現産物をその後続の発現配列の発現産物から隔て、それにより別個の発現産物を形成す
る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の配列の第１の翻訳開始配列
の上流の第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳される一
方、第２の発現配列に続く発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２の発現配列の
スタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されない。ある
場合において、環状ポリリボヌクレオチド中に１つのみの発現配列があり、第１の発現配
列及びその後続の発現配列は、同じ発現配列である。ある例示的な環状ポリリボヌクレオ
チドにおいて、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の
終止要素及び終止要素を下流の翻訳開始配列から隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含
む。あるこのような例において、第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の
第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。ある場合において、
第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の後
続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態において、第１のスタガー要素
は、第１の発現配列のある回の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から隔て、そ
れにより別個の発現産物を形成する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中の
第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流の第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌ
クレオチドは、連続して翻訳される一方、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の
発現配列の第２の翻訳開始配列の上流のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレ
オチドは、連続して翻訳されない。ある場合において、第２のスタガー要素と第２の翻訳
開始配列との間の距離は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１のスタガー要素と第１の翻
訳開始との間の距離より、対応する環状ポリリボヌクレオチド中で少なくとも２倍、３倍
、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍大きい。ある場合において、第１のス
タガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎ
ｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４
ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０
ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０
ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える。ある実施形態において、第２のスタガー要素と第２の
翻訳開始との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なく
とも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１
１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１
９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５
５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超えて大きい。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。
ド中に存在する。例えば、ある例示的な環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタガー要
素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終止要素及び第１の発現配列に続
く発現の第１の翻訳開始配列から終止要素を隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含む。
いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオ
チド中の第１の発現配列に続く発現の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。
ある場合において、第１の発現配列及び第１の発現配列に続く発現配列は、環状ポリリボ
ヌクレオチド中の２つの別個の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配
列との間の距離は、第１の発現配列及びその後続の発現配列の連続した翻訳を可能にし得
る。ある実施形態において、第１のスタガー要素は、終止要素を含み、第１の発現配列の
発現産物をその後続の発現配列の発現産物から隔て、それにより別個の発現産物を形成す
る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の配列の第１の翻訳開始配列
の上流の第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳される一
方、第２の発現配列に続く発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２の発現配列の
スタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されない。ある
場合において、環状ポリリボヌクレオチド中に１つのみの発現配列があり、第１の発現配
列及びその後続の発現配列は、同じ発現配列である。ある例示的な環状ポリリボヌクレオ
チドにおいて、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の
終止要素及び終止要素を下流の翻訳開始配列から隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含
む。あるこのような例において、第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の
第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。ある場合において、
第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の後
続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態において、第１のスタガー要素
は、第１の発現配列のある回の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から隔て、そ
れにより別個の発現産物を形成する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中の
第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流の第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌ
クレオチドは、連続して翻訳される一方、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の
発現配列の第２の翻訳開始配列の上流のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレ
オチドは、連続して翻訳されない。ある場合において、第２のスタガー要素と第２の翻訳
開始配列との間の距離は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１のスタガー要素と第１の翻
訳開始との間の距離より、対応する環状ポリリボヌクレオチド中で少なくとも２倍、３倍
、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍大きい。ある場合において、第１のス
タガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎ
ｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４
ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０
ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０
ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える。ある実施形態において、第２のスタガー要素と第２の
翻訳開始との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なく
とも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１
１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１
９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５
５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超えて大きい。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。
【0094】
調節核酸
[0176] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸をコードし、
例えば内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節する１つ以上の発現配列を含む
。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの発現
配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮ
Ａ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ
、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ及びｈｎＲＮＡなど、ノンコーディングＲＮＡのような調節
核酸に対してアンチセンスである配列を含み得る。
[0176] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸をコードし、
例えば内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節する１つ以上の発現配列を含む
。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの発現
配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮ
Ａ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ
、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ及びｈｎＲＮＡなど、ノンコーディングＲＮＡのような調節
核酸に対してアンチセンスである配列を含み得る。
【0095】
[0177] 一実施形態において、調節核酸は、宿主遺伝子を標的にする。調節核酸として
は、限定はされないが、内在性遺伝子（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように
、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲ
ＮＡ、ｇＲＮＡ）にハイブリダイズする核酸、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外来性核
酸にハイブリダイズする核酸、ＲＮＡにハイブリダイズする核酸、遺伝子転写を妨げる核
酸、ＲＮＡ翻訳を妨げる核酸、分解を標的化することなどによってＲＮＡを安定させるか
又はＲＮＡを不安定化する核酸及びＤＮＡ又はＲＮＡ結合因子を調節する核酸が挙げられ
る。一実施形態において、配列は、ｍｉＲＮＡである。ある実施形態において、調節核酸
は、宿主遺伝子のセンス鎖を標的にする。ある実施形態において、調節核酸は、宿主遺伝
子のアンチセンス鎖を標的にする。
は、限定はされないが、内在性遺伝子（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように
、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲ
ＮＡ、ｇＲＮＡ）にハイブリダイズする核酸、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外来性核
酸にハイブリダイズする核酸、ＲＮＡにハイブリダイズする核酸、遺伝子転写を妨げる核
酸、ＲＮＡ翻訳を妨げる核酸、分解を標的化することなどによってＲＮＡを安定させるか
又はＲＮＡを不安定化する核酸及びＤＮＡ又はＲＮＡ結合因子を調節する核酸が挙げられ
る。一実施形態において、配列は、ｍｉＲＮＡである。ある実施形態において、調節核酸
は、宿主遺伝子のセンス鎖を標的にする。ある実施形態において、調節核酸は、宿主遺伝
子のアンチセンス鎖を標的にする。
【0096】
[0178] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮ
Ａ）などの調節核酸を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイ
ドＲＮＡを含むか、又はガイドＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全
なエフェクター部分に結合するのに必要な「足場」配列及びゲノム標的のためのユーザー
定義の約２０ヌクレオチド標的化配列から構成される。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、一
般に、１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さを有
し、標的化核酸配列に対して相補的であるように設計される。カスタムｇＲＮＡジェネレ
ータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用するために市販されている。
遺伝子編集は、天然ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（
ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化さ
れる配列にヌクレアーゼをガイドするため）の両方を含有する改変された（合成）単一Ｒ
ＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いても行われた
。化学修飾されたｓｇＲＮＡは、ゲノム編集に有効であることも実証され、例えばＨｅｎ
ｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９
９１を参照されたい。
Ａ）などの調節核酸を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイ
ドＲＮＡを含むか、又はガイドＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全
なエフェクター部分に結合するのに必要な「足場」配列及びゲノム標的のためのユーザー
定義の約２０ヌクレオチド標的化配列から構成される。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、一
般に、１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さを有
し、標的化核酸配列に対して相補的であるように設計される。カスタムｇＲＮＡジェネレ
ータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用するために市販されている。
遺伝子編集は、天然ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（
ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化さ
れる配列にヌクレアーゼをガイドするため）の両方を含有する改変された（合成）単一Ｒ
ＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いても行われた
。化学修飾されたｓｇＲＮＡは、ゲノム編集に有効であることも実証され、例えばＨｅｎ
ｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９
９１を参照されたい。
【0097】
[0179] ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモータ、エンハンサー
、サイレンサー若しくはリプレッサーに隣接するか又はそれらの中にある配列）を認識し
得る。
、サイレンサー若しくはリプレッサーに隣接するか又はそれらの中にある配列）を認識し
得る。
【0098】
[0180] 一実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステム
の一部として使用される。遺伝子編集のために、環状ポリリボヌクレオチドは、所望の標
的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得、例え
ばＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３；Ｒａ
ｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１－２３
０８を参照されたい。ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが、ＤＮＡ
切断が起こるためにＣａｓ９によって必要とされ；Ｃｐｆ１について、ｇＲＮＡ配列の少
なくとも約１６ヌクレオチドが、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために必要とされる。
の一部として使用される。遺伝子編集のために、環状ポリリボヌクレオチドは、所望の標
的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得、例え
ばＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３；Ｒａ
ｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１－２３
０８を参照されたい。ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが、ＤＮＡ
切断が起こるためにＣａｓ９によって必要とされ；Ｃｐｆ１について、ｇＲＮＡ配列の少
なくとも約１６ヌクレオチドが、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために必要とされる。
【0099】
[0181] 特定の調節核酸がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子
発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、１５～５０塩基対（約１８～
２５塩基対など）を含有し、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相
補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様
構造を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ
）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（
ｓｈＲＮＡ）、メロ二本鎖（meroduplex）及びダイサー基質（dicer substrate）が挙げ
られる（米国特許第８，０８４，５９９号明細書、同第８，３４９，８０９号明細書及び
同第８，５１３，２０７号明細書）。
発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、１５～５０塩基対（約１８～
２５塩基対など）を含有し、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相
補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様
構造を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ
）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（
ｓｈＲＮＡ）、メロ二本鎖（meroduplex）及びダイサー基質（dicer substrate）が挙げ
られる（米国特許第８，０８４，５９９号明細書、同第８，３４９，８０９号明細書及び
同第８，５１３，２０７号明細書）。
【0100】
[0182] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的に、約５～５０
０塩基対（特定のＲＮＡ構造に応じて、例えばｍｉＲＮＡ５～３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ２
００～５００ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造であり、細胞内で発現される標的遺伝子中
のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を
有し得る調節核酸を含む。
０塩基対（特定のＲＮＡ構造に応じて、例えばｍｉＲＮＡ５～３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ２
００～５００ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造であり、細胞内で発現される標的遺伝子中
のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を
有し得る調節核酸を含む。
【0101】
[0183] 長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチドより長
い非タンパク質コード転写産物として定義される。このいくらか任意的な制限は、マイク
ロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び他の短鎖ＲＮＡなどの小
分子調節ＲＮＡとｌｎｃＲＮＡを区別する。一般に、大部分（約７８％）のｌｎｃＲＮＡ
は、組織特異的であると特徴付けられる。近傍のタンパク質コード遺伝子（哺乳動物ゲノ
ム中の全ｌｎｃＲＮＡの約２０％というかなりの割合を占める）と反対方向に転写される
分岐ｌｎｃＲＮＡが近傍の遺伝子の転写を場合により調節し得る。一実施形態では、本明
細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡのセンス鎖を含む。
一実施形態では、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮ
Ａのアンチセンス鎖を含む。
い非タンパク質コード転写産物として定義される。このいくらか任意的な制限は、マイク
ロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び他の短鎖ＲＮＡなどの小
分子調節ＲＮＡとｌｎｃＲＮＡを区別する。一般に、大部分（約７８％）のｌｎｃＲＮＡ
は、組織特異的であると特徴付けられる。近傍のタンパク質コード遺伝子（哺乳動物ゲノ
ム中の全ｌｎｃＲＮＡの約２０％というかなりの割合を占める）と反対方向に転写される
分岐ｌｎｃＲＮＡが近傍の遺伝子の転写を場合により調節し得る。一実施形態では、本明
細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡのセンス鎖を含む。
一実施形態では、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮ
Ａのアンチセンス鎖を含む。
【0102】
[0184] 環状ポリリボヌクレオチドは、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮ
Ａ）の全て又はフラグメントに対して実質的に相補的な又は完全に相補的な調節核酸をコ
ードし得る。調節核酸は、イントロンとエクソンとの間、エクソン間又はエクソンに隣接
する境界にある配列を補完して、転写のためのｍＲＮＡへの、特定の遺伝子の新たに生成
された核ＲＮＡ転写産物の成熟を防止し得る。特定の遺伝子に対して相補的な調節核酸は
、その遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズし、その翻訳を防止し得る。アンチセン
ス調節核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドであり得る。あ
る実施形態において、調節核酸は、内在性遺伝子又は外来性遺伝子の発現の調節に関与す
るタンパク質に結合し得るタンパク質－結合部位を含む。
Ａ）の全て又はフラグメントに対して実質的に相補的な又は完全に相補的な調節核酸をコ
ードし得る。調節核酸は、イントロンとエクソンとの間、エクソン間又はエクソンに隣接
する境界にある配列を補完して、転写のためのｍＲＮＡへの、特定の遺伝子の新たに生成
された核ＲＮＡ転写産物の成熟を防止し得る。特定の遺伝子に対して相補的な調節核酸は
、その遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズし、その翻訳を防止し得る。アンチセン
ス調節核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドであり得る。あ
る実施形態において、調節核酸は、内在性遺伝子又は外来性遺伝子の発現の調節に関与す
るタンパク質に結合し得るタンパク質－結合部位を含む。
【0103】
[0185] 環状ポリリボヌクレオチドの長さは、約５～３０ヌクレオチド、約１０～３０
ヌクレオチド又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２
１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれを超えるヌクレオ
チドである、対象とする転写産物にハイブリダイズする調節核酸をコードし得る。標的化
転写産物に対する調節核酸の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であるべきである。
ヌクレオチド又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２
１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれを超えるヌクレオ
チドである、対象とする転写産物にハイブリダイズする調節核酸をコードし得る。標的化
転写産物に対する調節核酸の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であるべきである。
【0104】
[0186] 環状ポリリボヌクレオチドは、標的遺伝子の約５～約２５の連続ヌクレオチド
と同一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子をコードし得る。ある実施形態において、ｍ
ｉＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡを標的にし、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０～７０％（
約３０～６０％、約４０～６０％又は約４５％～５５％）のＧＣ－含量を含み、例えば標
準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定した際、それが導入されるべきである哺乳動物のゲノ
ム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列との高いパーセンテージの同一性を有さない。
と同一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子をコードし得る。ある実施形態において、ｍ
ｉＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡを標的にし、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０～７０％（
約３０～６０％、約４０～６０％又は約４５％～５５％）のＧＣ－含量を含み、例えば標
準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定した際、それが導入されるべきである哺乳動物のゲノ
ム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列との高いパーセンテージの同一性を有さない。
【0105】
[0187] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉ
ＲＮＡ、例えば２、３、４、５、６つ又はそれを超えるものを含む。ある実施形態におい
て、環状ポリリボヌクレオチドは、このヌクレオチド配列のいずれか１つ又は標的配列に
対して相補的な配列との少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するｍｉＲＮＡを
コードする配列を含む。
ＲＮＡ、例えば２、３、４、５、６つ又はそれを超えるものを含む。ある実施形態におい
て、環状ポリリボヌクレオチドは、このヌクレオチド配列のいずれか１つ又は標的配列に
対して相補的な配列との少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するｍｉＲＮＡを
コードする配列を含む。
【0106】
[0188] ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子の
プロセシング経路中の中間体に類似している（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ １１６：２８１
－２９７，２００４）。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能す
ることができ、逆も同様である（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ９：１３
２７－１３３３，２００２；Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７：
４３８－４４２，２００３）。ｓｉＲＮＡのようなマイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣを用いて
、標的遺伝子を下方制御するが、ｓｉＲＮＡと異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍ
ＲＮＡを切断しない。代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分
解によってタンパク質出力を減少させる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：４０３４－４０３９，２００６）。公知のｍｉＲＮＡ
結合部位は、ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ内にあり；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端から
のヌクレオチド２～８に対してほぼ完全な相補性を有する部位を標的にするようである（
Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８－１３，２００６；Ｌ
ｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３３：７６９－７７３，２００５）。この領域は
、シード領域として知られている。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、置き換え可能であるた
め、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとのシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御する
（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：１９９－２０４
，２００６．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ａ ３’
ＵＴＲ ｇｉｖｅ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（Ｄｏｅｎｃｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７：４３８－４４２，２００３）。
プロセシング経路中の中間体に類似している（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ １１６：２８１
－２９７，２００４）。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能す
ることができ、逆も同様である（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ９：１３
２７－１３３３，２００２；Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７：
４３８－４４２，２００３）。ｓｉＲＮＡのようなマイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣを用いて
、標的遺伝子を下方制御するが、ｓｉＲＮＡと異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍ
ＲＮＡを切断しない。代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分
解によってタンパク質出力を減少させる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：４０３４－４０３９，２００６）。公知のｍｉＲＮＡ
結合部位は、ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ内にあり；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端から
のヌクレオチド２～８に対してほぼ完全な相補性を有する部位を標的にするようである（
Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８－１３，２００６；Ｌ
ｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３３：７６９－７７３，２００５）。この領域は
、シード領域として知られている。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、置き換え可能であるた
め、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとのシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御する
（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：１９９－２０４
，２００６．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ａ ３’
ＵＴＲ ｇｉｖｅ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（Ｄｏｅｎｃｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７：４３８－４４２，２００３）。
【0107】
[0189] 公知のｍｉＲＮＡ配列の一覧は、中でも特に、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ
Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｎｔｅｒ及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙなどの調査機関によって維持されているデータベースにおいて見られる。公知
の有効なｓｉＲＮＡ配列及び同種結合部位は、関連文献でも十分に表されている。ＲＮＡ
ｉ分子は、当該技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成される。さらに
、有効及び特定の配列モチーフを発見する機会を増加させるコンピューターによる手段が
ある（Ｌａｇａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０１５，１
２６９：３９３－４１２）。
Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｎｔｅｒ及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙなどの調査機関によって維持されているデータベースにおいて見られる。公知
の有効なｓｉＲＮＡ配列及び同種結合部位は、関連文献でも十分に表されている。ＲＮＡ
ｉ分子は、当該技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成される。さらに
、有効及び特定の配列モチーフを発見する機会を増加させるコンピューターによる手段が
ある（Ｌａｇａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０１５，１
２６９：３９３－４１２）。
【0108】
[0190] 環状ポリリボヌクレオチドは、遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を調
節し得る。複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有し得るため、ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを
標的にするように設計され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、
異なる遺伝子標的間で共有されるか又は特定の遺伝子標的に固有の配列に対する相補性を
有する配列を含有し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、いくつ
かの遺伝子間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的にし、それにより遺伝子ファ
ミリー（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異、突然変異遺伝子など）
におけるいくつかの遺伝子を標的にするように設計され得る。ある実施形態において、環
状ポリリボヌクレオチドは、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に固有の配列を標的にする
ように設計され得る。
節し得る。複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有し得るため、ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを
標的にするように設計され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、
異なる遺伝子標的間で共有されるか又は特定の遺伝子標的に固有の配列に対する相補性を
有する配列を含有し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、いくつ
かの遺伝子間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的にし、それにより遺伝子ファ
ミリー（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異、突然変異遺伝子など）
におけるいくつかの遺伝子を標的にするように設計され得る。ある実施形態において、環
状ポリリボヌクレオチドは、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に固有の配列を標的にする
ように設計され得る。
【0109】
[0191] ある実施形態において、発現配列は、５０００ｂｐ未満（例えば、約５０００
ｂｐ、４０００ｂｐ、３０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００
ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１
００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ未満又はそれを下回る）
の長さを有する。ある実施形態において、発現配列は、独立して又はそれに加えて、１０
ｂｐ超（例えば、少なくとも約１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６
０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００
ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｋｂ、
１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋ
ｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋ
ｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋ
ｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．
８ｋｂ、３．９ｋｂ、４ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．
５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５ｋｂ又はそれを超える）
の長さを有する。
ｂｐ、４０００ｂｐ、３０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００
ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１
００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ未満又はそれを下回る）
の長さを有する。ある実施形態において、発現配列は、独立して又はそれに加えて、１０
ｂｐ超（例えば、少なくとも約１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６
０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００
ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｋｂ、
１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋ
ｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋ
ｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋ
ｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．
８ｋｂ、３．９ｋｂ、４ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．
５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５ｋｂ又はそれを超える）
の長さを有する。
【0110】
[0192] ある実施形態において、発現配列は、本明細書に記載される特徴の１つ以上、
例えば１つ以上のペプチド又はタンパク質をコードする配列、１つ以上の調節要素、１つ
以上の調節核酸、例えば１つ以上のノンコーディングＲＮＡ、他の発現配列及びそれらの
任意の組合せを含む。
例えば１つ以上のペプチド又はタンパク質をコードする配列、１つ以上の調節要素、１つ
以上の調節核酸、例えば１つ以上のノンコーディングＲＮＡ、他の発現配列及びそれらの
任意の組合せを含む。
【0111】
翻訳効率
[0193] ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチ
ドの翻訳効率は、参照、例えば線状同等物、線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオ
チドより高い。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレ
オチドは、参照の翻訳効率より少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３
０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、
２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８
００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００
％又はそれを超えて高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドは、線状同等物のものより１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、
環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより３００％高い翻訳効率を有する。
[0193] ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチ
ドの翻訳効率は、参照、例えば線状同等物、線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオ
チドより高い。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレ
オチドは、参照の翻訳効率より少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３
０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、
２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８
００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００
％又はそれを超えて高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドは、線状同等物のものより１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、
環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより３００％高い翻訳効率を有する。
【0112】
[0194] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、化学量論比の発現産物
を生成する。ローリングサークル型翻訳は、実質的に同等の比率で発現産物を連続して生
成する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物が実質的に同等
の比率で生成されるような化学量論的翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、複数の発現産物、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、
８つ、９つ、１０、１１、１２又はそれを超える発現配列からの産物の化学量論的翻訳効
率を有する。
を生成する。ローリングサークル型翻訳は、実質的に同等の比率で発現産物を連続して生
成する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物が実質的に同等
の比率で生成されるような化学量論的翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、複数の発現産物、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、
８つ、９つ、１０、１１、１２又はそれを超える発現配列からの産物の化学量論的翻訳効
率を有する。
【0113】
ローリングサークル型翻訳
[0195] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環
状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なく
とも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。ある実施形態
において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻
訳の能力がある。ある実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌ
クレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは
、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少な
くとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少な
くとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１
４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少
なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも
９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２
５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくと
も２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回又
は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
[0195] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環
状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なく
とも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。ある実施形態
において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻
訳の能力がある。ある実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌ
クレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは
、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少な
くとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少な
くとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１
４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少
なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも
９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２
５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくと
も２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回又
は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
【0114】
[0196] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻
訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「
連続した」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオ
チドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は
、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチ
ド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される
全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、
少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくと
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％
又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。ある実施形態において、全
ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。ある
実施形態において、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶
解物を含む。ある実施形態において、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又
は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「
連続した」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオ
チドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は
、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチ
ド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される
全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、
少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくと
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％
又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。ある実施形態において、全
ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。ある
実施形態において、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶
解物を含む。ある実施形態において、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又
は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
【0115】
非翻訳領域
[0197] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）
を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある
実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含
まれ得る。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含
まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列
のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。
ある実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。ある実施形態において、
イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えばＺＫＳＣＡＮ１である。
[0197] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）
を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある
実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含
まれ得る。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含
まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列
のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。
ある実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。ある実施形態において、
イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えばＺＫＳＣＡＮ１である。
【0116】
[0198] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、中に埋め込まれたアデ
ノシン及びウリジンの１つ以上のストレッチを有するＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチ
シグネチャーは、発現産物のターンオーバ速度を上昇させ得る。
ノシン及びウリジンの１つ以上のストレッチを有するＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチ
シグネチャーは、発現産物のターンオーバ速度を上昇させ得る。
【0117】
[0199] ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の導入、除去又は修飾は、環状ポリリボヌ
クレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌ
クレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーが環状ポリリボヌクレオチドに導
入され得、ＡＲＥのコピーが発現産物の翻訳及び／又は生成を調節し得る。同様に、ＡＲ
Ｅは、環状ポリリボヌクレオチド中で同定され、除去又は改変されて細胞内安定性を調節
し、したがって得られるタンパク質翻訳及び生成に影響を与え得る。
クレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌ
クレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーが環状ポリリボヌクレオチドに導
入され得、ＡＲＥのコピーが発現産物の翻訳及び／又は生成を調節し得る。同様に、ＡＲ
Ｅは、環状ポリリボヌクレオチド中で同定され、除去又は改変されて細胞内安定性を調節
し、したがって得られるタンパク質翻訳及び生成に影響を与え得る。
【0118】
[0200] 任意の遺伝子からの任意のＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチドのそれぞれの
隣接領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。非限定的な例として、組み込ま
れ得るＵＴＲ又はそのフラグメントは、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用
される米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号明細書及び米国仮特許出願第６１／８２
９，３７２号明細書又は国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２１５
２２号明細書に列挙されるＵＴＲである。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型Ｕ
ＴＲが用いられ得る。野生型遺伝子の変異型でない人工ＵＴＲを提供することも本発明の
範囲内である。これらのＵＴＲ又はその部分は、それらを選択した転写産物と同じ配向で
配置され得るか、又は配向若しくは位置が改変され得る。したがって、５’又は３’ＵＴ
Ｒは、反転され、短縮され、伸長され、１つ以上の他の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲと共に
キメラにされ得る。本明細書において使用される際、「改変」という用語は、それがＵＴ
Ｒ配列に関する際、ＵＴＲが参照配列に対して何らかの方法で変化されたことを意味する
。例えば、３’又は５’ＵＴＲは、上に教示されるように配向若しくは位置の変化によっ
て野生型若しくは天然ＵＴＲに対して改変され得るか、又はさらなるヌクレオチドの包含
、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換又は転位によって改変され得る。「改変」Ｕ
ＴＲ（３’又は５’のいずれにかかわらず）を生成するこれらの変化のいずれも変異型Ｕ
ＴＲを含む。
隣接領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。非限定的な例として、組み込ま
れ得るＵＴＲ又はそのフラグメントは、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用
される米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号明細書及び米国仮特許出願第６１／８２
９，３７２号明細書又は国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２１５
２２号明細書に列挙されるＵＴＲである。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型Ｕ
ＴＲが用いられ得る。野生型遺伝子の変異型でない人工ＵＴＲを提供することも本発明の
範囲内である。これらのＵＴＲ又はその部分は、それらを選択した転写産物と同じ配向で
配置され得るか、又は配向若しくは位置が改変され得る。したがって、５’又は３’ＵＴ
Ｒは、反転され、短縮され、伸長され、１つ以上の他の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲと共に
キメラにされ得る。本明細書において使用される際、「改変」という用語は、それがＵＴ
Ｒ配列に関する際、ＵＴＲが参照配列に対して何らかの方法で変化されたことを意味する
。例えば、３’又は５’ＵＴＲは、上に教示されるように配向若しくは位置の変化によっ
て野生型若しくは天然ＵＴＲに対して改変され得るか、又はさらなるヌクレオチドの包含
、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換又は転位によって改変され得る。「改変」Ｕ
ＴＲ（３’又は５’のいずれにかかわらず）を生成するこれらの変化のいずれも変異型Ｕ
ＴＲを含む。
【0119】
[0201] 一実施形態において、５’又は３’ＵＴＲなどの二重、三重又は四重ＵＴＲが
使用され得る。本明細書において使用される際、「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つの
コピーが連続して又は実質的に連続してコードされるものである。例えば、内容全体が参
照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書に記
載されるように、二重β－グロビン３’ＵＴＲが使用され得る。
使用され得る。本明細書において使用される際、「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つの
コピーが連続して又は実質的に連続してコードされるものである。例えば、内容全体が参
照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書に記
載されるように、二重β－グロビン３’ＵＴＲが使用され得る。
【0120】
ポリＡ配列
[0202] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を含み得
る。ある実施形態において、ポリ－Ａ配列の長さは、１０ヌクレオチド長を超える。一実
施形態において、ポリ－Ａ配列は、１５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約
１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９
０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４０
０、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，
２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、
１，９００、２，０００、２，５００及び３，０００ヌクレオチド又はこれらを超える）
。ある実施形態において、ポリ－Ａ配列は、約１０～約３，０００ヌクレオチド（例えば
、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，
０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０
～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～
２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、
１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、
１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５０
０～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、
１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５０
０～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，
０００、２，０００～２，５００及び２，５００～３，０００）である。
[0202] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を含み得
る。ある実施形態において、ポリ－Ａ配列の長さは、１０ヌクレオチド長を超える。一実
施形態において、ポリ－Ａ配列は、１５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約
１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９
０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４０
０、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，
２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、
１，９００、２，０００、２，５００及び３，０００ヌクレオチド又はこれらを超える）
。ある実施形態において、ポリ－Ａ配列は、約１０～約３，０００ヌクレオチド（例えば
、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，
０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０
～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～
２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、
１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、
１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５０
０～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、
１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５０
０～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，
０００、２，０００～２，５００及び２，５００～３，０００）である。
【0121】
[0203] 一実施形態において、ポリ－Ａ配列は、全環状ポリリボヌクレオチドの長さに
対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴若しくは領域の長さ（第
１若しくは隣接領域など）に基づくか、又は環状ポリリボヌクレオチドから発現される最
終産物に基づき得る。これに関して、ポリ－Ａ配列は、環状ポリリボヌクレオチド又はそ
の特徴より１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％大きい
長さであり得る。ポリ－Ａ配列は、それが属する環状ポリリボヌクレオチドの一部として
も設計され得る。これに関して、ポリ－Ａ配列は、構築物の全長又は構築物の全長マイナ
スポリ－Ａ配列の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％又は
それを超え得る。さらに、ポリ－Ａ結合タンパク質のための環状ポリリボヌクレオチドの
改変された結合部位及び共役は、発現を促進し得る。
対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴若しくは領域の長さ（第
１若しくは隣接領域など）に基づくか、又は環状ポリリボヌクレオチドから発現される最
終産物に基づき得る。これに関して、ポリ－Ａ配列は、環状ポリリボヌクレオチド又はそ
の特徴より１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％大きい
長さであり得る。ポリ－Ａ配列は、それが属する環状ポリリボヌクレオチドの一部として
も設計され得る。これに関して、ポリ－Ａ配列は、構築物の全長又は構築物の全長マイナ
スポリ－Ａ配列の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％又は
それを超え得る。さらに、ポリ－Ａ結合タンパク質のための環状ポリリボヌクレオチドの
改変された結合部位及び共役は、発現を促進し得る。
【0122】
[0204] 一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテットを
含むように設計される。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方におけるＧリッチ配
列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。一実
施形態において、Ｇ－カルテットは、ポリ－Ａ配列の末端に組み込まれる。得られる環状
ポリリボヌクレオチド構築物は、安定性、タンパク質産生及び／又は様々な時点における
半減期を含む他のパラメータについてアッセイされる。ある実施形態において、ポリＡ－
Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチド単独のポリ－Ａ配列を用いて見られるものの少なく
とも７５％に相当するタンパク質産生をもたらす。
含むように設計される。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方におけるＧリッチ配
列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。一実
施形態において、Ｇ－カルテットは、ポリ－Ａ配列の末端に組み込まれる。得られる環状
ポリリボヌクレオチド構築物は、安定性、タンパク質産生及び／又は様々な時点における
半減期を含む他のパラメータについてアッセイされる。ある実施形態において、ポリＡ－
Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチド単独のポリ－Ａ配列を用いて見られるものの少なく
とも７５％に相当するタンパク質産生をもたらす。
【0123】
[0205] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡを含むか、ポリ
Ａを欠いているか、又は環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の特性を調節するための修
飾ポリＡを有する。ある実施形態において、ポリＡを欠いた又は修飾ポリＡを有する環状
ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の機能特性、例えば免疫原性、半減期、発現効率など
を改善する。
Ａを欠いているか、又は環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の特性を調節するための修
飾ポリＡを有する。ある実施形態において、ポリＡを欠いた又は修飾ポリＡを有する環状
ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の機能特性、例えば免疫原性、半減期、発現効率など
を改善する。
【0124】
ＲＮＡ結合
[0206] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合
部位を含む。マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核
酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する
短鎖ノンコーディングＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のマイクロ
ＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列又はマイクロＲＮＡシードを含み得る。このような
配列は、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２
６１２１８号明細書及び米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書において
教示されるものなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
[0206] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合
部位を含む。マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核
酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する
短鎖ノンコーディングＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のマイクロ
ＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列又はマイクロＲＮＡシードを含み得る。このような
配列は、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２
６１２１８号明細書及び米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書において
教示されるものなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
【0125】
[0207] マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟マイクロＲＮＡの２～
８位の領域中の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対する完全なワトソン・
クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２～８又は２
～７位を含み得る。ある実施形態において、マイクロＲＮＡシードは、７個のヌクレオチ
ド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍ
ｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）
に隣接する。ある実施形態において、マイクロＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例
えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的に
おけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。例
えば、それぞれ全体が参照により本明細書に援用されるＧｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ
Ｋ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａ
ｒｒｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５
を参照されたい。
８位の領域中の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対する完全なワトソン・
クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２～８又は２
～７位を含み得る。ある実施形態において、マイクロＲＮＡシードは、７個のヌクレオチ
ド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍ
ｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）
に隣接する。ある実施形態において、マイクロＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例
えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的に
おけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。例
えば、それぞれ全体が参照により本明細書に援用されるＧｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ
Ｋ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａ
ｒｒｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５
を参照されたい。
【0126】
[0208] マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と実質的に相補性である。マイクロ
ＲＮＡ標的配列を環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌク
レオチドは、該当するマイクロＲＮＡが利用可能であることを条件として、宿主の免疫系
を回避するか若しくは宿主の免疫系によって検出され得、調節された分解又は調節された
翻訳を有し得る。このプロセスは、環状ポリリボヌクレオチド送達時のオフターゲット効
果の危険を低下させる。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域並びにそれらの発現パ
ターン及び生物学における役割の特定が報告されている（それぞれ全体が参照により本明
細書に援用されるＢｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ
２０１０ １１：９４３－９４９；Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ
Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａ
ｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ
２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｒｅｌ Ｃｅｌ
ｌ ２００９ １３６：２１５－２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２
００７ １２９：１４０１－１４１４）。
ＲＮＡ標的配列を環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌク
レオチドは、該当するマイクロＲＮＡが利用可能であることを条件として、宿主の免疫系
を回避するか若しくは宿主の免疫系によって検出され得、調節された分解又は調節された
翻訳を有し得る。このプロセスは、環状ポリリボヌクレオチド送達時のオフターゲット効
果の危険を低下させる。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域並びにそれらの発現パ
ターン及び生物学における役割の特定が報告されている（それぞれ全体が参照により本明
細書に援用されるＢｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ
２０１０ １１：９４３－９４９；Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ
Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａ
ｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ
２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｒｅｌ Ｃｅｌ
ｌ ２００９ １３６：２１５－２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２
００７ １２９：１４０１－１４１４）。
【0127】
[0209] 逆に、マイクロＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を調節
するために、環状ポリリボヌクレオチドから出るように操作され得る（すなわち環状ポリ
リボヌクレオチドから除去され得る）。複数の組織における発現の調節は、１つ若しくは
いくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入又は除去を通して行われ得る。
するために、環状ポリリボヌクレオチドから出るように操作され得る（すなわち環状ポリ
リボヌクレオチドから除去され得る）。複数の組織における発現の調節は、１つ若しくは
いくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入又は除去を通して行われ得る。
【0128】
[0210] マイクロＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節する
ことが知られている組織の例としては、限定はされないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋
肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９
２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉ
Ｒ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（
ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－ｌｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ
－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１
３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。マイクロＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ－１３２）
などの複雑な生物学的プロセスも調節し得る（全体が参照により本明細書に援用されるＡ
ｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１
１８：１７１－１７６）。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドにおいて、こ
のようなプロセスに関与するマイクロＲＮＡの結合部位は、生物学的に関連する細胞型に
対して又は関連する生物学的プロセスに関連して、環状ポリリボヌクレオチドからの発現
を調整するために除去又は導入され得る。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ配列及びｍｉＲ結合部
位の一覧は、２０１３年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７５３，６６１
号明細書の表９、２０１３年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５４，１
５９明細書の表９及び２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８
，９２１明細書の表７に列挙されており、これらは、それぞれ全体が参照により本明細書
に援用される。ある実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、例えば、ｍｉＲ－７
を含む。
ことが知られている組織の例としては、限定はされないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋
肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９
２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉ
Ｒ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（
ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－ｌｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ
－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１
３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。マイクロＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ－１３２）
などの複雑な生物学的プロセスも調節し得る（全体が参照により本明細書に援用されるＡ
ｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１
１８：１７１－１７６）。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドにおいて、こ
のようなプロセスに関与するマイクロＲＮＡの結合部位は、生物学的に関連する細胞型に
対して又は関連する生物学的プロセスに関連して、環状ポリリボヌクレオチドからの発現
を調整するために除去又は導入され得る。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ配列及びｍｉＲ結合部
位の一覧は、２０１３年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７５３，６６１
号明細書の表９、２０１３年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５４，１
５９明細書の表９及び２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８
，９２１明細書の表７に列挙されており、これらは、それぞれ全体が参照により本明細書
に援用される。ある実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、例えば、ｍｉＲ－７
を含む。
【0129】
[0211] 本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲＢａｓｅ、ｄｅｅ
ｐＢａｓｅ、ｍｉＲＢａｓｅ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ、ｍｉＲＧｅｎ ２．０；ｍｉ
ＲＮＡＭａｐ、ＰＭＲＤ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ又はＶＩＲｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡ
データベースに開示されているもののいずれかなどの任意のｍｉＲＮＡにハイブリダイズ
するｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ある場合において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、その標
的遺伝子が、ＳｔａｒＢａｓｅ、ＳｔａｒＳｃａｎ、Ｃｕｐｉｄ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ
、ＴａｒＢａｓｅ、Ｄｉａｎａ－ｍｉｃｒｏＴ、ｍｉＲｅｃｏｒｄｓ、ＰｉｃＴａｒ、Ｐ
ＩＴＡ、ＲｅｐＴａｒｍ ＲＮＡ２２、ｍｉＲＴａｒＢａｓｅ、ｍｉＲｗａｌｋ又はＭＢ
ＳＴＡＲなどのマイクロＲＮＡ標的遺伝子データベースに開示されているｍｉＲＮＡに対
して相補的な任意の部位であり得る。
ｐＢａｓｅ、ｍｉＲＢａｓｅ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ、ｍｉＲＧｅｎ ２．０；ｍｉ
ＲＮＡＭａｐ、ＰＭＲＤ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ又はＶＩＲｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡ
データベースに開示されているもののいずれかなどの任意のｍｉＲＮＡにハイブリダイズ
するｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ある場合において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、その標
的遺伝子が、ＳｔａｒＢａｓｅ、ＳｔａｒＳｃａｎ、Ｃｕｐｉｄ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ
、ＴａｒＢａｓｅ、Ｄｉａｎａ－ｍｉｃｒｏＴ、ｍｉＲｅｃｏｒｄｓ、ＰｉｃＴａｒ、Ｐ
ＩＴＡ、ＲｅｐＴａｒｍ ＲＮＡ２２、ｍｉＲＴａｒＢａｓｅ、ｍｉＲｗａｌｋ又はＭＢ
ＳＴＡＲなどのマイクロＲＮＡ標的遺伝子データベースに開示されているｍｉＲＮＡに対
して相補的な任意の部位であり得る。
【0130】
[0212] 様々な細胞型のマイクロＲＮＡの発現パターンの理解により、本明細書に記載
される環状ポリリボヌクレオチドは、特定の細胞型で又は特定の生物学的条件下のみでの
より標的化された発現のために操作され得る。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入
により、環状ポリリボヌクレオチドは、組織において又は生物学的条件に関連して最適な
タンパク質発現のために設計され得る。組織又は疾患特異的遺伝子発現を駆動するための
マイクロＲＮＡの使用の例が列挙されている（全体が参照により本明細書に援用されるＧ
ｅｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２，８
０：３９３－４０３）。
される環状ポリリボヌクレオチドは、特定の細胞型で又は特定の生物学的条件下のみでの
より標的化された発現のために操作され得る。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入
により、環状ポリリボヌクレオチドは、組織において又は生物学的条件に関連して最適な
タンパク質発現のために設計され得る。組織又は疾患特異的遺伝子発現を駆動するための
マイクロＲＮＡの使用の例が列挙されている（全体が参照により本明細書に援用されるＧ
ｅｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２，８
０：３９３－４０３）。
【0131】
[0213] さらに、マイクロＲＮＡシード部位は、環状ポリリボヌクレオチドに組み込ま
れて、生物学的改善をもたらす、特定の細胞における発現を調節することができる。この
例は、ｍｉＲ－１４２部位への組み込みである。本明細書に記載される環状ポリリボヌク
レオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節し得るだけ
ではく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を
低下させるか又はなくすことができる。
れて、生物学的改善をもたらす、特定の細胞における発現を調節することができる。この
例は、ｍｉＲ－１４２部位への組み込みである。本明細書に記載される環状ポリリボヌク
レオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節し得るだけ
ではく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を
低下させるか又はなくすことができる。
【0132】
[0214] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の大きい遺伝
子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）結合部位を含む。大きい遺伝子間ノンコ
ーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）は、長鎖ノンコーディングＲＮＡの大部分を構成す
る。ＬｉｎｃＲＮＡは、非コード転写産物であり、ある実施形態において、約２００ヌク
レオチドを超える長さである。ある実施形態において、それらは、タンパク質コード遺伝
子と類似のエクソン－イントロン－エクソン構造を有するが、オープンリーディングフレ
ームを包含せず、タンパク質をコードしない。８，０００超のｌｉｎｃＲＮＡが最近記載
されており、ヒトにおける非コードトランスクリプトームに由来するＲＮＡの最大のサブ
クラスであると考えられている。何千ものｌｉｎｃＲＮＡが知られており、いくつかが多
様な細胞過程の主な調節因子であるようである。個々のｌｉｎｃＲＮＡの機能を決定する
ことは、依然として課題である。ｌｉｎｃＲＮＡ発現は、コード遺伝子と比較して著しく
組織特異的であり、それらは、隣接するタンパク質コード遺伝子の対のものと同程度にで
はあるが、典型的にそれらの隣接する遺伝子と共発現される。
子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）結合部位を含む。大きい遺伝子間ノンコ
ーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）は、長鎖ノンコーディングＲＮＡの大部分を構成す
る。ＬｉｎｃＲＮＡは、非コード転写産物であり、ある実施形態において、約２００ヌク
レオチドを超える長さである。ある実施形態において、それらは、タンパク質コード遺伝
子と類似のエクソン－イントロン－エクソン構造を有するが、オープンリーディングフレ
ームを包含せず、タンパク質をコードしない。８，０００超のｌｉｎｃＲＮＡが最近記載
されており、ヒトにおける非コードトランスクリプトームに由来するＲＮＡの最大のサブ
クラスであると考えられている。何千ものｌｉｎｃＲＮＡが知られており、いくつかが多
様な細胞過程の主な調節因子であるようである。個々のｌｉｎｃＲＮＡの機能を決定する
ことは、依然として課題である。ｌｉｎｃＲＮＡ発現は、コード遺伝子と比較して著しく
組織特異的であり、それらは、隣接するタンパク質コード遺伝子の対のものと同程度にで
はあるが、典型的にそれらの隣接する遺伝子と共発現される。
【0133】
[0215] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＦＩＲＲＥ、ＬＩＮＣ
００９６９、ＰＶＴ１、ＬＩＮＣ０１６０８、ＪＰＸ、ＬＩＮＣ０１５７２、ＬＩＮＣ０
０３５５、Ｃ１ｏｒｆ１３２、Ｃ３ｏｒｆ３５、ＲＰ１１－７３４、ＬＩＮＣ０１６０８
、ＣＣ－４９９Ｂ１５．５、ＣＡＳＣ１５、ＬＩＮＣ００９３７、ＲＰ１１－１９１など
の１つ以上のｌｉｎｃＲＮＡ又は公知のｌｎｃＲＮＡデータベースからのものなどの他の
ｌｉｎｃＲＮＡ若しくはｌｎｃＲＮＡを含む。
００９６９、ＰＶＴ１、ＬＩＮＣ０１６０８、ＪＰＸ、ＬＩＮＣ０１５７２、ＬＩＮＣ０
０３５５、Ｃ１ｏｒｆ１３２、Ｃ３ｏｒｆ３５、ＲＰ１１－７３４、ＬＩＮＣ０１６０８
、ＣＣ－４９９Ｂ１５．５、ＣＡＳＣ１５、ＬＩＮＣ００９３７、ＲＰ１１－１９１など
の１つ以上のｌｉｎｃＲＮＡ又は公知のｌｎｃＲＮＡデータベースからのものなどの他の
ｌｉｎｃＲＮＡ若しくはｌｎｃＲＮＡを含む。
【0134】
タンパク質結合
[0216] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えばリ
ボソームが、ＲＮＡ配列における内部部位に結合することを可能にする１つ以上のタンパ
ク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えばリボソーム結合部位を環状ポリリボヌ
クレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成
要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか
若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解又は調節された
翻訳を有し得る。
[0216] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えばリ
ボソームが、ＲＮＡ配列における内部部位に結合することを可能にする１つ以上のタンパ
ク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えばリボソーム結合部位を環状ポリリボヌ
クレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成
要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか
若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解又は調節された
翻訳を有し得る。
【0135】
[0217] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例
えばＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパ
ク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク
質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマスクするのに役立つ
ヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タン
パク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性又は外来性であるものとして隠すの
に役立つヌクレオチド配列である。
えばＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパ
ク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク
質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマスクするのに役立つ
ヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タン
パク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性又は外来性であるものとして隠すの
に役立つヌクレオチド配列である。
【0136】
[0218] 線状ＲＮＡへのリボソームのかみ合いの従来の機構は、ＲＮＡのキャップされ
た５’末端に結合するリボソームを含む。５’末端から、リボソームが開始コドンに移動
すると直ちに第１のペプチド結合が形成される。本発明によれば、環状ポリリボヌクレオ
チドの翻訳の内部の開始（すなわちキャップ非依存的）は、遊離末端又はキャップされた
末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより
、リボソームは、開始コドンにおけるポリペプチド伸長を開始する。ある実施形態におい
て、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば開始コドンを含む１つ以
上のＲＮＡ配列を含む。
た５’末端に結合するリボソームを含む。５’末端から、リボソームが開始コドンに移動
すると直ちに第１のペプチド結合が形成される。本発明によれば、環状ポリリボヌクレオ
チドの翻訳の内部の開始（すなわちキャップ非依存的）は、遊離末端又はキャップされた
末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより
、リボソームは、開始コドンにおけるポリペプチド伸長を開始する。ある実施形態におい
て、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば開始コドンを含む１つ以
上のＲＮＡ配列を含む。
【0137】
[0219] 天然５’ＵＴＲは、翻訳開始のために役割を果たす特徴を有する。それらは、
リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般的に知られ
ているコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣ
Ｒ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流の
プリン（アデニン又はグアニン）であり、その後、別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸
長因子結合に関与する二次構造にも関与することが知られている。
リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般的に知られ
ているコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣ
Ｒ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流の
プリン（アデニン又はグアニン）であり、その後、別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸
長因子結合に関与する二次構造にも関与することが知られている。
【0138】
[0220] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合する
タンパク質結合配列をコードする。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、環状
ポリリボヌクレオチドを標的にするか又はそれを特定の標的に限局する。ある実施形態に
おいて、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する
。
タンパク質結合配列をコードする。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、環状
ポリリボヌクレオチドを標的にするか又はそれを特定の標的に限局する。ある実施形態に
おいて、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する
。
【0139】
[0221] ある実施形態において、タンパク質結合部位としては、限定はされないが、Ａ
ＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣ
ＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７
、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４
２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ
３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１
、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮ
ＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、
ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲ
Ｐ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、
ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、Ｐ
ＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ
２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ
３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲ
ＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、
ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ
、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤ
Ｆ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１及びＲＮＡに結合する任意の他の
タンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
ＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣ
ＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７
、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４
２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ
３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１
、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮ
ＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、
ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲ
Ｐ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、
ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、Ｐ
ＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ
２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ
３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲ
ＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、
ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ
、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤ
Ｆ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１及びＲＮＡに結合する任意の他の
タンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
【0140】
エンクリプトゲン
[0222] 本明細書に記載される際、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答
を低下させるか、避けるか又は回避するためにエンクリプトゲンを含む。一態様において
、細胞に送達されると、参照化合物、例えば記載される環状ポリリボヌクレオチド又はエ
ンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによ
って引き起こされる応答と比較して、宿主からの低下された免疫応答をもたらす環状ポリ
リボヌクレオチドが本明細書において提供される。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性を有する。
[0222] 本明細書に記載される際、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答
を低下させるか、避けるか又は回避するためにエンクリプトゲンを含む。一態様において
、細胞に送達されると、参照化合物、例えば記載される環状ポリリボヌクレオチド又はエ
ンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによ
って引き起こされる応答と比較して、宿主からの低下された免疫応答をもたらす環状ポリ
リボヌクレオチドが本明細書において提供される。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性を有する。
【0141】
[0223] ある実施形態において、エンクリプトゲンは、安定性を向上させる。核酸分子
及び翻訳の安定性に関してＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が増加している。Ｕ
ＴＲの調節的特徴は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性を向上させるために、エンクリ
プトゲンに含まれ得る。
及び翻訳の安定性に関してＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が増加している。Ｕ
ＴＲの調節的特徴は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性を向上させるために、エンクリ
プトゲンに含まれ得る。
【0142】
[0224] ある実施形態において、５’又は３’ＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチド中
のエンクリプトゲンを構成し得る。例えば、ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の除去又
は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得
る。
のエンクリプトゲンを構成し得る。例えば、ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の除去又
は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得
る。
【0143】
[0225] ある実施形態において、発現配列、例えば翻訳可能領域におけるＡＵリッチ要
素（ＡＲＥ）の修飾又は除去は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節
するのに有用であり得る。
素（ＡＲＥ）の修飾又は除去は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節
するのに有用であり得る。
【0144】
[0226] ある実施形態において、エンクリプトゲンは、ｍｉＲＮＡ結合部位又は任意の
他のノンコーディングＲＮＡへの結合部位を含む。例えば、本明細書に記載される環状ポ
リリボヌクレオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節
するだけではなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する
免疫応答を低下させるか又はなくすことができる。
他のノンコーディングＲＮＡへの結合部位を含む。例えば、本明細書に記載される環状ポ
リリボヌクレオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節
するだけではなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する
免疫応答を低下させるか又はなくすことができる。
【0145】
[0227] ある実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質、例えば免疫タンパ
ク質がＲＮＡ配列に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タ
ンパク質結合部位を、環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクするこ
とにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有
し得、調節された分解又は調節された翻訳を有し得る。ある実施形態において、環状ポリ
リボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために少なくとも
１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位
は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマス
クするのに役立つヌクレオチド配列である。
ク質がＲＮＡ配列に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タ
ンパク質結合部位を、環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクするこ
とにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有
し得、調節された分解又は調節された翻訳を有し得る。ある実施形態において、環状ポリ
リボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために少なくとも
１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位
は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマス
クするのに役立つヌクレオチド配列である。
【0146】
[0228] ある実施形態において、エンクリプトゲンは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを
含む。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、結合ホス
フェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び環状
ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を防ぐか又は低下させ得るそれらの任意の組合せ
を含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが以下に詳細に説明さ
れる。
含む。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、結合ホス
フェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び環状
ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を防ぐか又は低下させ得るそれらの任意の組合せ
を含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが以下に詳細に説明さ
れる。
【0147】
[0229] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば修
飾を欠いた環状ポリリボヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主から
の免疫応答を低下させるために、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む
。特に、１つ以上のイノシンの追加は、ウイルスに対して内在性であるものとしてＲＮＡ
を区別することが示されている。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ
ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮ
Ａ ａｓ “ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい
。
飾を欠いた環状ポリリボヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主から
の免疫応答を低下させるために、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む
。特に、１つ以上のイノシンの追加は、ウイルスに対して内在性であるものとしてＲＮＡ
を区別することが示されている。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ
ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮ
Ａ ａｓ “ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい
。
【0148】
[0230] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡのための１
つ以上の発現配列又はｓｉＲＮＡにプロセシングされ得るＲＮＡ配列を含み、ｓｈＲＮＡ
又はｓｉＲＮＡは、ＲＩＧ－１を標的にし、ＲＩＧ－１の発現を低下させる。ＲＩＧ－１
は、外来性環状ＲＮＡを感知することができ、外来性環状ＲＮＡの分解をもたらす。した
がって、ＲＩＧ－１標的化ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は任意の他の調節核酸のための配列
を有する環状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫、例えば宿主
細胞免疫を低下させ得る。
つ以上の発現配列又はｓｉＲＮＡにプロセシングされ得るＲＮＡ配列を含み、ｓｈＲＮＡ
又はｓｉＲＮＡは、ＲＩＧ－１を標的にし、ＲＩＧ－１の発現を低下させる。ＲＩＧ－１
は、外来性環状ＲＮＡを感知することができ、外来性環状ＲＮＡの分解をもたらす。した
がって、ＲＩＧ－１標的化ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は任意の他の調節核酸のための配列
を有する環状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫、例えば宿主
細胞免疫を低下させ得る。
【0149】
[0231] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を
低下させるか、避けるか又は回避する際に環状ポリリボヌクレオチドを補助する配列、要
素又は構造を欠いている。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド
は、ポリ配列、５’末端、３’末端、リン酸基、ヒドロキシル基又はそれらの任意の組合
せを欠き得る。
低下させるか、避けるか又は回避する際に環状ポリリボヌクレオチドを補助する配列、要
素又は構造を欠いている。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド
は、ポリ配列、５’末端、３’末端、リン酸基、ヒドロキシル基又はそれらの任意の組合
せを欠き得る。
【0150】
リボスイッチ
[0232] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のリボスイッ
チを含む。
[0232] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のリボスイッ
チを含む。
【0151】
[0233] リボスイッチは、典型的に、小さい標的分子に直接結合することができる環状
ポリリボヌクレオチドの一部であると考えられ、その標的の結合がＲＮＡ翻訳、発現産物
安定性及び活性に影響を与える（Ｔｕｃｋｅｒ Ｂ Ｊ，Ｂｒｅａｋｅｒ Ｒ Ｒ（２０
０５），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５（３）：３４２－８）。し
たがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドは、その標的分子の存在又は非
存在に応じて、自らの活性を調節するのに直接関与する。ある実施形態において、リボス
イッチは、別個の分子に対するアプタマーのような親和性の領域を有する。したがって、
本発明のより広い文脈において、非コード核酸内に含まれる任意のアプタマーは、かさ容
積からの分子の隔離のために使用され得る。「（リボ）スイッチ」活性による事象の下流
での報告が特に有利であり得る。
ポリリボヌクレオチドの一部であると考えられ、その標的の結合がＲＮＡ翻訳、発現産物
安定性及び活性に影響を与える（Ｔｕｃｋｅｒ Ｂ Ｊ，Ｂｒｅａｋｅｒ Ｒ Ｒ（２０
０５），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５（３）：３４２－８）。し
たがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドは、その標的分子の存在又は非
存在に応じて、自らの活性を調節するのに直接関与する。ある実施形態において、リボス
イッチは、別個の分子に対するアプタマーのような親和性の領域を有する。したがって、
本発明のより広い文脈において、非コード核酸内に含まれる任意のアプタマーは、かさ容
積からの分子の隔離のために使用され得る。「（リボ）スイッチ」活性による事象の下流
での報告が特に有利であり得る。
【0152】
[0234] ある実施形態において、リボスイッチは、限定はされないが、転写終結、翻訳
開始の阻害、ｍＲＮＡ自己切断及び真核生物におけるスプライシング経路の変更を含む遺
伝子発現に影響を与え得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合又は除去によって遺伝
子発現を制御するように機能し得る。したがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌク
レオチドを、リボスイッチを活性化、不活性化又はブロックする条件に供して、発現を変
化させる。発現は、例えば、ＲＮＡに結合するリボソームの転写の終止又はブロックの結
果として変化され得る。トリガー分子又はその類似体の結合は、リボスイッチの性質に応
じて、ＲＮＡ分子の発現を低下させるか若しくは防ぐか、又はＲＮＡ分子の発現を促進す
るか若しくは増加させ得る。リボスイッチのいくつかの例が本明細書に記載される。
開始の阻害、ｍＲＮＡ自己切断及び真核生物におけるスプライシング経路の変更を含む遺
伝子発現に影響を与え得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合又は除去によって遺伝
子発現を制御するように機能し得る。したがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌク
レオチドを、リボスイッチを活性化、不活性化又はブロックする条件に供して、発現を変
化させる。発現は、例えば、ＲＮＡに結合するリボソームの転写の終止又はブロックの結
果として変化され得る。トリガー分子又はその類似体の結合は、リボスイッチの性質に応
じて、ＲＮＡ分子の発現を低下させるか若しくは防ぐか、又はＲＮＡ分子の発現を促進す
るか若しくは増加させ得る。リボスイッチのいくつかの例が本明細書に記載される。
【0153】
[0235] ある実施形態において、リボスイッチは、コバラミンリボスイッチ（Ｂ１２要
素とも呼ばれる）であり、これは、アデノシルコバラミン（ビタミンＢ１２の補酵素形態
）に結合して、コバラミン及び同様の代謝産物の生合成及び輸送を調節する。
素とも呼ばれる）であり、これは、アデノシルコバラミン（ビタミンＢ１２の補酵素形態
）に結合して、コバラミン及び同様の代謝産物の生合成及び輸送を調節する。
【0154】
[0236] ある実施形態において、リボスイッチは、環状ジ－ＧＭＰリボスイッチであり
、これは、環状ジ－ＧＭＰに結合して様々な遺伝子を調節する。２つの非構造的に関連す
る種類が存在する － 環状ジ－ＧＭＰ－ｌ及び環状ジ－ＧＭＰ－ｌｌ。
、これは、環状ジ－ＧＭＰに結合して様々な遺伝子を調節する。２つの非構造的に関連す
る種類が存在する － 環状ジ－ＧＭＰ－ｌ及び環状ジ－ＧＭＰ－ｌｌ。
【0155】
[0237] ある実施形態において、リボスイッチは、ＦＭＮリボスイッチ（ＲＦＮ要素と
も呼ばれる）であり、これは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）に結合して、リボフ
ラビン生合成及び輸送を調節する。
も呼ばれる）であり、これは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）に結合して、リボフ
ラビン生合成及び輸送を調節する。
【0156】
[0238] ある実施形態において、リボスイッチは、ｇｌｍＳリボスイッチであり、これ
は、十分な濃度のグルコサミン－６－リン酸があるときにそれ自体で切断する。
[0239] ある実施形態において、リボスイッチは、グルタミンリボスイッチであり、こ
れは、グルタミンに結合して、グルタミン及び窒素代謝に関与する遺伝子を調節する。そ
れらは、不明な機能の短鎖ペプチドにも結合する。このようなリボスイッチは、構造的に
関連する２つの種類に分類される：ｇｌｎＡ ＲＮＡ、モチーフ及び下流－ペプチドモチ
ーフ。
は、十分な濃度のグルコサミン－６－リン酸があるときにそれ自体で切断する。
[0239] ある実施形態において、リボスイッチは、グルタミンリボスイッチであり、こ
れは、グルタミンに結合して、グルタミン及び窒素代謝に関与する遺伝子を調節する。そ
れらは、不明な機能の短鎖ペプチドにも結合する。このようなリボスイッチは、構造的に
関連する２つの種類に分類される：ｇｌｎＡ ＲＮＡ、モチーフ及び下流－ペプチドモチ
ーフ。
【0157】
[0240] ある実施形態において、リボスイッチは、グリシンリボスイッチであり、これ
は、グリシンに結合してグリシン代謝遺伝子を調節する。それは、同じｍＲＮＡ中に２つ
の隣接するアプタマードメインを含み、協同的結合を示す公知の天然ＲＮＡのみである。
は、グリシンに結合してグリシン代謝遺伝子を調節する。それは、同じｍＲＮＡ中に２つ
の隣接するアプタマードメインを含み、協同的結合を示す公知の天然ＲＮＡのみである。
【0158】
[0241] ある実施形態において、リボスイッチは、リジンリボスイッチ（Ｌ－ボックス
とも呼ばれる）であり、これは、リジンに結合して、リジン生合成、異化及び輸送を調節
する。
とも呼ばれる）であり、これは、リジンに結合して、リジン生合成、異化及び輸送を調節
する。
【0159】
[0242] ある実施形態において、リボスイッチは、ＰｒｅＱ１リボスイッチであり、こ
れは、ｐｒｅ－クエオシンに結合して、クエオシンのこの前駆体の合成又は輸送に関与す
る遺伝子を調節する。２つの全く異なる種類のＰｒｅＧＩリボスイッチが公知である：Ｐ
ｒｅＱ１－ｌリボスイッチ及びＰｒｅＱ１－ｌｌリボスイッチ。ＰｒｅＱ１－ｌリボスイ
ッチの結合ドメインは、天然のリボスイッチの中でも非常に小さい。ストレプトコッカス
属（Streptococcus）及びラクトコッカス属（Lactococcus）の特定の種のみに見られるＰ
ｒｅＧＩ－ＩＩリボスイッチは、完全に異なる構造を有し、より大きい。
れは、ｐｒｅ－クエオシンに結合して、クエオシンのこの前駆体の合成又は輸送に関与す
る遺伝子を調節する。２つの全く異なる種類のＰｒｅＧＩリボスイッチが公知である：Ｐ
ｒｅＱ１－ｌリボスイッチ及びＰｒｅＱ１－ｌｌリボスイッチ。ＰｒｅＱ１－ｌリボスイ
ッチの結合ドメインは、天然のリボスイッチの中でも非常に小さい。ストレプトコッカス
属（Streptococcus）及びラクトコッカス属（Lactococcus）の特定の種のみに見られるＰ
ｒｅＧＩ－ＩＩリボスイッチは、完全に異なる構造を有し、より大きい。
【0160】
[0243] ある実施形態において、リボスイッチは、プリンリボスイッチであり、これは
、プリンに結合して、プリン代謝及び輸送を調節する。異なる形態のプリンリボスイッチ
がグアニン（Ｇ－ボックスとして元々知られている形態）又はアデニンに結合する。グア
ニン又はアデニンのいずれかに対する特異性は、Ｙ７４位におけるリボスイッチ中の単一
のピリミジンによるワトソン・クリック相互作用に完全に依存する。グアニンリボスイッ
チにおいて、この残基は、シトシン（すなわちＣ７４）であり、アデニン残基において、
それは、常にウラシル（すなわちＵ７４）である。同種のタイプのプリンリボスイッチが
デオキシグアノシンに結合するが、単一のヌクレオチド突然変異より有意な差を有する。
、プリンに結合して、プリン代謝及び輸送を調節する。異なる形態のプリンリボスイッチ
がグアニン（Ｇ－ボックスとして元々知られている形態）又はアデニンに結合する。グア
ニン又はアデニンのいずれかに対する特異性は、Ｙ７４位におけるリボスイッチ中の単一
のピリミジンによるワトソン・クリック相互作用に完全に依存する。グアニンリボスイッ
チにおいて、この残基は、シトシン（すなわちＣ７４）であり、アデニン残基において、
それは、常にウラシル（すなわちＵ７４）である。同種のタイプのプリンリボスイッチが
デオキシグアノシンに結合するが、単一のヌクレオチド突然変異より有意な差を有する。
【0161】
[0244] ある実施形態において、リボスイッチは、ＳＡＨリボスイッチであり、これは
、Ｓ－アデノシルホモシステインに結合して、Ｓ－アデノシルメチオニンがメチル化反応
に使用されるときに生成されるこの代謝産物の再利用に関与する遺伝子を調節する。
、Ｓ－アデノシルホモシステインに結合して、Ｓ－アデノシルメチオニンがメチル化反応
に使用されるときに生成されるこの代謝産物の再利用に関与する遺伝子を調節する。
【0162】
[0245] ある実施形態において、リボスイッチは、ＳＡＭリボスイッチであり、これは
、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に結合して、メチオニン及びＳＡＭ生合成及び輸
送を調節する。３つの異なるＳＡＭリボスイッチが公知である：ＳＡＭ－Ｉ（元々Ｓ－ボ
ックスと呼ばれる）、ＳＡＭ－ＩＩ及びＳＭＫボックスリボスイッチ。ＳＡＭ－Ｉは、細
菌中に広く存在するが、ＳＡＭ－ＩＩは、α－、β－及び少しのγ－プロテオバクテリア
のみに見られる。ＳＭＫボックスリボスイッチは、ラクトバチルス目（Lactobacillales
）のみに見られる。これらの３つの種のリボスイッチは、配列又は構造に関して明らかな
類似点を有さない。第４の種、ＳＡＭ－ＩＶは、ＳＡＭ－Ｉのものと類似のリガンド結合
コアを有するようであるが、異なる足場にある。
、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に結合して、メチオニン及びＳＡＭ生合成及び輸
送を調節する。３つの異なるＳＡＭリボスイッチが公知である：ＳＡＭ－Ｉ（元々Ｓ－ボ
ックスと呼ばれる）、ＳＡＭ－ＩＩ及びＳＭＫボックスリボスイッチ。ＳＡＭ－Ｉは、細
菌中に広く存在するが、ＳＡＭ－ＩＩは、α－、β－及び少しのγ－プロテオバクテリア
のみに見られる。ＳＭＫボックスリボスイッチは、ラクトバチルス目（Lactobacillales
）のみに見られる。これらの３つの種のリボスイッチは、配列又は構造に関して明らかな
類似点を有さない。第４の種、ＳＡＭ－ＩＶは、ＳＡＭ－Ｉのものと類似のリガンド結合
コアを有するようであるが、異なる足場にある。
【0163】
[0246] ある実施形態において、リボスイッチは、ＳＡＭ－ＳＡＨリボスイッチであり
、これは、同様の親和性でＳＡＭ及びＳＡＨの両方に結合する。それらは、メチオニンア
デノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を調節する位置において常に見られるた
め、ＳＡＭへのそれらの結合のみが生理学的に関連することが提示された。
、これは、同様の親和性でＳＡＭ及びＳＡＨの両方に結合する。それらは、メチオニンア
デノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を調節する位置において常に見られるた
め、ＳＡＭへのそれらの結合のみが生理学的に関連することが提示された。
【0164】
[0247] ある実施形態において、リボスイッチは、テトラヒドロ葉酸リボスイッチであ
り、これは、テトラヒドロ葉酸に結合して、合成及び輸送遺伝子を調節する。
[0248] ある実施形態において、リボスイッチは、テオフィリン結合リボスイッチ又は
チミンピロリン酸結合リボスイッチである。
り、これは、テトラヒドロ葉酸に結合して、合成及び輸送遺伝子を調節する。
[0248] ある実施形態において、リボスイッチは、テオフィリン結合リボスイッチ又は
チミンピロリン酸結合リボスイッチである。
【0165】
[0249] ある実施形態において、リボスイッチは、Ｔ．テングコンジェンシス（T.ten
gcongensis）ｇｌｍＳ触媒リボスイッチであり、これは、グルコサミン－６リン酸（Ｋｌ
ｅｉｎ ａｎｄ Ｆｅｒｒｅ－Ｄ’Ａｍａｒｅ ２００６）を感知する。
gcongensis）ｇｌｍＳ触媒リボスイッチであり、これは、グルコサミン－６リン酸（Ｋｌ
ｅｉｎ ａｎｄ Ｆｅｒｒｅ－Ｄ’Ａｍａｒｅ ２００６）を感知する。
【0166】
[0250] ある実施形態において、リボスイッチは、ＴＰＰリボスイッチ（ＴＨＩ－ボッ
クスとも呼ばれる）であり、これは、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に結合して、チアミ
ン生合成及び輸送並びに同様の代謝産物の輸送を調節する。それは、これまで真核生物の
みに見られるリボスイッチである。
クスとも呼ばれる）であり、これは、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に結合して、チアミ
ン生合成及び輸送並びに同様の代謝産物の輸送を調節する。それは、これまで真核生物の
みに見られるリボスイッチである。
【0167】
[0251] ある実施形態において、リボスイッチは、Ｍｏｃｏリボスイッチであり、これ
は、モリブデン補因子に結合して、この補酵素並びにそれ又はその誘導体を補因子として
使用する酵素の生合成及び輸送に関与する遺伝子を調節する。
は、モリブデン補因子に結合して、この補酵素並びにそれ又はその誘導体を補因子として
使用する酵素の生合成及び輸送に関与する遺伝子を調節する。
【0168】
[0252] ある実施形態において、リボスイッチは、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio
vulnificus）のアデニンデアミナーゼコード遺伝子の５’ＵＴＲに見られるアデニン感
知ａｄｄ－Ａリボスイッチである。
vulnificus）のアデニンデアミナーゼコード遺伝子の５’ＵＴＲに見られるアデニン感
知ａｄｄ－Ａリボスイッチである。
【0169】
アプタザイム
[0253] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムを含む。
アプタザイムは、アプタマー領域がアロステリック制御要素として使用され、触媒ＲＮＡ
（後述される「リボザイム」）の領域に結合される条件的発現のためのスイッチである。
ある実施形態において、アプタザイムは、細胞型特異的翻訳において活性である。ある実
施形態において、アプタザイムは、細胞状態特異的翻訳、例えばウイルス感染細胞で又は
ウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質の存在下で活性である。
[0253] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムを含む。
アプタザイムは、アプタマー領域がアロステリック制御要素として使用され、触媒ＲＮＡ
（後述される「リボザイム」）の領域に結合される条件的発現のためのスイッチである。
ある実施形態において、アプタザイムは、細胞型特異的翻訳において活性である。ある実
施形態において、アプタザイムは、細胞状態特異的翻訳、例えばウイルス感染細胞で又は
ウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質の存在下で活性である。
【0170】
[0254] リボザイム（ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも呼ばれるリボ核酸酵素に由来する
）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、それら自体のホ
スホジエステル結合の１つの加水分解又は他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれか
を触媒するが、それらは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも
分かっている。より最近では、触媒ＲＮＡがインビトロ方法によって「発生」され得るこ
とが示されている［１．Ａｇｒｅｓｔｉ Ｊ Ｊ，Ｋｅｌｌｙ Ｂ Ｔ，Ｊａｓｃｈｋｅ
Ａ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ａ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ
ｔｈａｔ ｃａｔａｌｙｓｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｔｕｒｎｏｖｅｒ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌ
ｄｅｒ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍ
ｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
２００５，１０２：１６１７０－１６１７５；２．Ｓｏｏｔｅｒ Ｌ Ｊ，Ｒｉｅｄｅ
ｌ Ｔ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｌｅｖｙ Ｍ，Ｃｏｘ Ｊ Ｃ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏ
ｎ Ａ Ｄ：Ｔｏｗａｒｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｚｙ
ｍｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，３
８２（９）：１３２７－１３３４］。Ｗｉｎｋｌｅｒらは、上述されるリボスイッチ活性
と同様に、リボザイム及びそれらの反応生成物が遺伝子発現を調節し得ることを示した［
Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｗ Ｃ，Ｎａｈｖｉ Ａ，Ｒｏｔｈ Ａ，Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｊ Ａ，Ｂ
ｒｅａｋｅｒ Ｒ Ｒ：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ
ａ ｎａｔｕｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｉｂｏｚｙｍ
ｅ．Ｎａｔｕｒｅ ２００４，４２８：２８１－２８６］。本発明に関して、リボザイム
が、かさ容積からの分子の化学変換のために細胞内の多くのコピーに存在するように、触
媒ＲＮＡ又はリボザイムをより大きいノンコーディングＲＮＡ内に配置することが特に有
利であり得る。さらに、同じノンコーディングＲＮＡ中のアプタマー及びリボザイムの両
方をコードすることが特に有利であり得る。
）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、それら自体のホ
スホジエステル結合の１つの加水分解又は他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれか
を触媒するが、それらは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも
分かっている。より最近では、触媒ＲＮＡがインビトロ方法によって「発生」され得るこ
とが示されている［１．Ａｇｒｅｓｔｉ Ｊ Ｊ，Ｋｅｌｌｙ Ｂ Ｔ，Ｊａｓｃｈｋｅ
Ａ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ａ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ
ｔｈａｔ ｃａｔａｌｙｓｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｔｕｒｎｏｖｅｒ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌ
ｄｅｒ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍ
ｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
２００５，１０２：１６１７０－１６１７５；２．Ｓｏｏｔｅｒ Ｌ Ｊ，Ｒｉｅｄｅ
ｌ Ｔ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｌｅｖｙ Ｍ，Ｃｏｘ Ｊ Ｃ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏ
ｎ Ａ Ｄ：Ｔｏｗａｒｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｚｙ
ｍｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，３
８２（９）：１３２７－１３３４］。Ｗｉｎｋｌｅｒらは、上述されるリボスイッチ活性
と同様に、リボザイム及びそれらの反応生成物が遺伝子発現を調節し得ることを示した［
Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｗ Ｃ，Ｎａｈｖｉ Ａ，Ｒｏｔｈ Ａ，Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｊ Ａ，Ｂ
ｒｅａｋｅｒ Ｒ Ｒ：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ
ａ ｎａｔｕｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｉｂｏｚｙｍ
ｅ．Ｎａｔｕｒｅ ２００４，４２８：２８１－２８６］。本発明に関して、リボザイム
が、かさ容積からの分子の化学変換のために細胞内の多くのコピーに存在するように、触
媒ＲＮＡ又はリボザイムをより大きいノンコーディングＲＮＡ内に配置することが特に有
利であり得る。さらに、同じノンコーディングＲＮＡ中のアプタマー及びリボザイムの両
方をコードすることが特に有利であり得る。
【0171】
[0255] リボザイムのいくつかの非限定的な例としては、ハンマーヘッド型リボザイム
、ＶＬリボザイム、リードザイム、ヘアピン型リボザイムが挙げられる。
[0256] ある実施形態において、アプタザイムは、ＲＮＡ配列を切断することができ、
結合リガンド／モジュレータの結果として調節され得るリボザイムである。リボザイムは
、自己切断リボザイムでもあり得る。したがって、それらは、リボザイム及びアプタマー
の特性を兼ね備えている。アプタザイムは、トランスにおけるそれらの活性の可能性のた
めに従来のアプタマーを上回る利点を提供し、それらが発現を不活性化するように触媒的
に作用すること及びその不活性化は、それら自体の切断又は異種転写産物のために不可逆
的である。
、ＶＬリボザイム、リードザイム、ヘアピン型リボザイムが挙げられる。
[0256] ある実施形態において、アプタザイムは、ＲＮＡ配列を切断することができ、
結合リガンド／モジュレータの結果として調節され得るリボザイムである。リボザイムは
、自己切断リボザイムでもあり得る。したがって、それらは、リボザイム及びアプタマー
の特性を兼ね備えている。アプタザイムは、トランスにおけるそれらの活性の可能性のた
めに従来のアプタマーを上回る利点を提供し、それらが発現を不活性化するように触媒的
に作用すること及びその不活性化は、それら自体の切断又は異種転写産物のために不可逆
的である。
【0172】
[0257] ある実施形態において、アプタザイムは、環状ポリリボヌクレオチドの非翻訳
領域に含まれ、リガンド／モジュレータの非存在下で不活性であり、導入遺伝子の発現を
可能にする。発現は、リガンドの添加によって停止され得る（又は下方制御され得る）。
特定のモジュレータの存在に応答して下方制御されるアプタザイムは、モジュレータに応
答した遺伝子発現の上方制御が望ましい制御系において使用され得ることが留意されるべ
きである。
領域に含まれ、リガンド／モジュレータの非存在下で不活性であり、導入遺伝子の発現を
可能にする。発現は、リガンドの添加によって停止され得る（又は下方制御され得る）。
特定のモジュレータの存在に応答して下方制御されるアプタザイムは、モジュレータに応
答した遺伝子発現の上方制御が望ましい制御系において使用され得ることが留意されるべ
きである。
【0173】
[0258] アプタザイムは、環状ポリリボヌクレオチド発現の自動調節のためのシステム
の開発も可能にし得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドのタンパク質産物は、特定の
小分子の合成における律速酵素であり、その分子の存在下で増加した触媒活性を有するよ
うに選択されるアプタザイムを含むように修飾され得、それにより、その合成のための自
己調節フィードバックループを提供する。代わりに、アプタザイム活性は、環状ポリリボ
ヌクレオチドからのタンパク質産物又は任意の他の細胞高分子の蓄積に対して感受性であ
るように選択され得る。
の開発も可能にし得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドのタンパク質産物は、特定の
小分子の合成における律速酵素であり、その分子の存在下で増加した触媒活性を有するよ
うに選択されるアプタザイムを含むように修飾され得、それにより、その合成のための自
己調節フィードバックループを提供する。代わりに、アプタザイム活性は、環状ポリリボ
ヌクレオチドからのタンパク質産物又は任意の他の細胞高分子の蓄積に対して感受性であ
るように選択され得る。
【0174】
[0259] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を含み
得る。いくつかの非限定的な例としては、ＲＮＡアプタマー結合リゾチーム、高い特異性
及び親和性でトロンビンに結合する２’フルオロピリミジンヌクレオチドを含むＲＮＡア
プタマーであるＴｏｇｇｌｅ－２５ｔ、ヒト免疫不全ウイルストランス作用性応答要素（
ＨＩＶ ＴＡＲ）に結合するＲＮＡＴａｔ、ＲＮＡアプタマー結合ｈｅｍｉｎ、ＲＮＡア
プタマー結合インターフェロンγ、ＲＮＡアプタマー結合血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）
、ＲＮＡアプタマー結合前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＲＮＡアプタマー結合ドーパミン及
びＲＮＡアプタマー結合非古典的癌遺伝子、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）が挙げられる
。
得る。いくつかの非限定的な例としては、ＲＮＡアプタマー結合リゾチーム、高い特異性
及び親和性でトロンビンに結合する２’フルオロピリミジンヌクレオチドを含むＲＮＡア
プタマーであるＴｏｇｇｌｅ－２５ｔ、ヒト免疫不全ウイルストランス作用性応答要素（
ＨＩＶ ＴＡＲ）に結合するＲＮＡＴａｔ、ＲＮＡアプタマー結合ｈｅｍｉｎ、ＲＮＡア
プタマー結合インターフェロンγ、ＲＮＡアプタマー結合血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）
、ＲＮＡアプタマー結合前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＲＮＡアプタマー結合ドーパミン及
びＲＮＡアプタマー結合非古典的癌遺伝子、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）が挙げられる
。
【0175】
環状化
[0260] 一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、環状化又はコンカテ
マー化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び
／又は送達前にインビトロで環状化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボ
ヌクレオチドは、細胞内で環状化され得る。
[0260] 一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、環状化又はコンカテ
マー化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び
／又は送達前にインビトロで環状化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボ
ヌクレオチドは、細胞内で環状化され得る。
【0176】
細胞外環状化
[0261] ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を用い
て環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的
方法において、核酸（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端
は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る
化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端
は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の
３’末端における３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上で求
核攻撃を起こして、新たな５’－／３’－アミド結合を形成するようになっている。
[0261] ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を用い
て環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的
方法において、核酸（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端
は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る
化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端
は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の
３’末端における３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上で求
核攻撃を起こして、新たな５’－／３’－アミド結合を形成するようになっている。
【0177】
[0262] 一実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’－リン酸化核
酸分子（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－
ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホロジエステル結合を形成し得る。例の
反応において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って１～１
０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼと共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる（
ニュー・イングランド・バイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）。ライゲーシ
ョン反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’－及び３’－領域の
両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。一実施形態において、
ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商
標）リガーゼのようなスプリントリガーゼがスプリントライゲーションに使用され得る。
スプリントライゲーションでは、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリ
ント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハブリダイゼーション時に並置され得るよ
うに線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。
したがって、スプリントリガーゼは、線状ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端
のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。
酸分子（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－
ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホロジエステル結合を形成し得る。例の
反応において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って１～１
０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼと共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる（
ニュー・イングランド・バイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）。ライゲーシ
ョン反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’－及び３’－領域の
両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。一実施形態において、
ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商
標）リガーゼのようなスプリントリガーゼがスプリントライゲーションに使用され得る。
スプリントライゲーションでは、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリ
ント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハブリダイゼーション時に並置され得るよ
うに線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。
したがって、スプリントリガーゼは、線状ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端
のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。
【0178】
[0263] 一実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの
合成に使用され得る。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガ
ーゼである。
合成に使用され得る。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガ
ーゼである。
【0179】
[0264] 一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端
のいずれかは、インビトロ転写中、得られる線状環状ポリリボヌクレオチドが、線状環状
ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状環状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲー
トすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコード
し得る。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン
型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的
な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２
４時間行われ得る。
のいずれかは、インビトロ転写中、得られる線状環状ポリリボヌクレオチドが、線状環状
ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状環状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲー
トすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコード
し得る。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン
型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的
な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２
４時間行われ得る。
【0180】
[0265] 一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非
核酸部分を用いることによって環状化又はコンカテマー化され得る。一態様において、少
なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー
化するために、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近傍及び／又は３’末端の近
傍の領域又は特徴と反応し得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線
状環状ポリリボヌクレオチド５’末端及び／又は３’末端に位置するか又は連結されるか
又はその近傍にあり得る。考えられる非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的
な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能
な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション
部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプ
タマー又は非核酸リンカーなどのオリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。
核酸部分を用いることによって環状化又はコンカテマー化され得る。一態様において、少
なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー
化するために、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近傍及び／又は３’末端の近
傍の領域又は特徴と反応し得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線
状環状ポリリボヌクレオチド５’末端及び／又は３’末端に位置するか又は連結されるか
又はその近傍にあり得る。考えられる非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的
な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能
な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション
部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプ
タマー又は非核酸リンカーなどのオリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。
【0181】
[0266] 一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、線状環状ポリリボヌ
クレオチド５’及び３’末端における、その近傍における若しくはそのような５’及び３
’末端に連結された、原子間、分子表面間の吸引力を引き起こす非核酸部分により、環状
化又はコンカテマー化され得る。非限定的な例として、１つ以上の線状環状ポリリボヌク
レオチドは、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間
力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘
起双極子力、ファン・デル・ワールス力及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非
限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結
合（agnosticbond）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
クレオチド５’及び３’末端における、その近傍における若しくはそのような５’及び３
’末端に連結された、原子間、分子表面間の吸引力を引き起こす非核酸部分により、環状
化又はコンカテマー化され得る。非限定的な例として、１つ以上の線状環状ポリリボヌク
レオチドは、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間
力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘
起双極子力、ファン・デル・ワールス力及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非
限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結
合（agnosticbond）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
【0182】
[0267] 一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、５’末端の近傍及び
３’末端の近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリ
ボザイムの残りの部分に曝されるとき、ペプチドに共有結合し得る。一態様において、５
’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに
結合して、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態
様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチド
は、限定はされないが、タンパク質ライゲーションなどの当該技術分野において公知の様
々な方法を用いたライゲーションに線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを供した後、それら
を環状化又はコンカテマー化させ得る。本発明の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使
用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込み且つ／又は共有結合する
ための方法の非限定的な一覧が米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記
載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
３’末端の近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリ
ボザイムの残りの部分に曝されるとき、ペプチドに共有結合し得る。一態様において、５
’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに
結合して、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態
様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチド
は、限定はされないが、タンパク質ライゲーションなどの当該技術分野において公知の様
々な方法を用いたライゲーションに線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを供した後、それら
を環状化又はコンカテマー化させ得る。本発明の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使
用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込み且つ／又は共有結合する
ための方法の非限定的な一覧が米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記
載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【0183】
[0268] ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、５’トリ
ホスフェートをＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒ
ドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’モノホスフェートに転化される
核酸の５’トリホスフェートを含み得る。代わりに、線状環状ポリリボヌクレオチドの５
’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）線状環状ポリリボ
ヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎ
ｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ又は仔牛小腸由来ホ
スファターゼ）と接触させて、３つ全てのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程
（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリ
ヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。
ホスフェートをＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒ
ドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’モノホスフェートに転化される
核酸の５’トリホスフェートを含み得る。代わりに、線状環状ポリリボヌクレオチドの５
’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）線状環状ポリリボ
ヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎ
ｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ又は仔牛小腸由来ホ
スファターゼ）と接触させて、３つ全てのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程
（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリ
ヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。
【0184】
[0269] ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率
は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５
％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５
％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０
％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。ある実施形態におい
て、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である
。
は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５
％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５
％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０
％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。ある実施形態におい
て、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である
。
【0185】
スプライシング要素
[0270] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプ
ライシング要素を含む。本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドにおいて
、スプライシング要素は、環状ポリリボヌクレオチドのスプライシングを媒介し得る完全
なスプライシング要素であり得る。代わりに、スプライシング要素は、完了したスプライ
シング事象からの残留スプライシング要素でもあり得る。例えば、ある場合において、線
状ポリリボヌクレオチドのスプライシング要素は、線状ポリリボヌクレオチドの環状化を
もたらすスプライシング事象を媒介することができ、それにより、得られる環状ポリリボ
ヌクレオチドは、このようなスプライシングを介した環状化事象からの残留スプライシン
グ要素を含む。ある場合において、残留スプライシング要素は、スプライシングを媒介す
ることができない。他の場合、残留スプライシング要素は、特定の状況下でスプライシン
グを依然として媒介することができる。ある実施形態において、スプライシング要素は、
少なくとも１つの発現配列に隣接する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチ
ドは、各発現配列に隣接するスプライシング要素を含む。ある実施形態において、スプラ
イシング要素は、各発現配列の１つの側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び
又はポリペプチドの分離をもたらす。
[0270] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプ
ライシング要素を含む。本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドにおいて
、スプライシング要素は、環状ポリリボヌクレオチドのスプライシングを媒介し得る完全
なスプライシング要素であり得る。代わりに、スプライシング要素は、完了したスプライ
シング事象からの残留スプライシング要素でもあり得る。例えば、ある場合において、線
状ポリリボヌクレオチドのスプライシング要素は、線状ポリリボヌクレオチドの環状化を
もたらすスプライシング事象を媒介することができ、それにより、得られる環状ポリリボ
ヌクレオチドは、このようなスプライシングを介した環状化事象からの残留スプライシン
グ要素を含む。ある場合において、残留スプライシング要素は、スプライシングを媒介す
ることができない。他の場合、残留スプライシング要素は、特定の状況下でスプライシン
グを依然として媒介することができる。ある実施形態において、スプライシング要素は、
少なくとも１つの発現配列に隣接する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチ
ドは、各発現配列に隣接するスプライシング要素を含む。ある実施形態において、スプラ
イシング要素は、各発現配列の１つの側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び
又はポリペプチドの分離をもたらす。
【0186】
[0271] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製されると、スプラ
イスされた末端が互いに結合される内部のスプライシング要素を含む。いくつかの例は、
スプライス部位配列及びＡｌｕＳｑ２、ＡｌｕＪｒ及びＡｌｕＳｚなどの短い逆方向反復
（３０～４０ｎｔ）、隣接するイントロン中の逆方向配列、隣接するイントロン中のＡｌ
ｕ要素並びに隣接するエクソンを有するバックスプライス部位の２００ｂｐ前にある（上
流にある）又は後ろにある（下流にある）配列など、バックスプライス事象の近位にある
（ｓｕｐｔａｂｌｅ４富化モチーフ）シス－配列要素に見られるモチーフを有する小型の
イントロン（＜１００ｎｔ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオ
チドは、内部のスプライシング要素として本明細書の他の箇所に記載される少なくとも１
つの反復ヌクレオチド配列を含む。このような実施形態において、反復ヌクレオチド配列
は、イントロンのＡｌｕファミリーからの反復配列を含み得る。ある実施形態において、
スプライシングに関連するリボソーム結合タンパク質は、環状ポリリボヌクレオチド生合
成を調節し得る（例えば、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ及びＱｕａｋｉｎｇ（ＱＫＩ）スプラ
イシング因子）。
イスされた末端が互いに結合される内部のスプライシング要素を含む。いくつかの例は、
スプライス部位配列及びＡｌｕＳｑ２、ＡｌｕＪｒ及びＡｌｕＳｚなどの短い逆方向反復
（３０～４０ｎｔ）、隣接するイントロン中の逆方向配列、隣接するイントロン中のＡｌ
ｕ要素並びに隣接するエクソンを有するバックスプライス部位の２００ｂｐ前にある（上
流にある）又は後ろにある（下流にある）配列など、バックスプライス事象の近位にある
（ｓｕｐｔａｂｌｅ４富化モチーフ）シス－配列要素に見られるモチーフを有する小型の
イントロン（＜１００ｎｔ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオ
チドは、内部のスプライシング要素として本明細書の他の箇所に記載される少なくとも１
つの反復ヌクレオチド配列を含む。このような実施形態において、反復ヌクレオチド配列
は、イントロンのＡｌｕファミリーからの反復配列を含み得る。ある実施形態において、
スプライシングに関連するリボソーム結合タンパク質は、環状ポリリボヌクレオチド生合
成を調節し得る（例えば、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ及びＱｕａｋｉｎｇ（ＱＫＩ）スプラ
イシング因子）。
【0187】
[0272] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオ
チドの頭尾接合部（head-to-tailjunction）に隣接する標準スプライス部位を含み得る
。
チドの頭尾接合部（head-to-tailjunction）に隣接する標準スプライス部位を含み得る
。
【0188】
[0273] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの３－ヌクレオチ
ドバルジによって隣接される４－塩基対ステムを含むバルジ－ヘリックス－バルジモチー
フを含み得る。切断がバルジ領域において起こり、末端５’－ヒドロキシル基及び２’，
３’－環状ホスフェートを有する特徴的なフラグメントを生成する。環状化は、３’，５
’－ホスホジエステル架橋を形成する同じ分子の２’，３’－環状ホスフェートへの５’
－ＯＨ基の求核攻撃によって進行する。
ドバルジによって隣接される４－塩基対ステムを含むバルジ－ヘリックス－バルジモチー
フを含み得る。切断がバルジ領域において起こり、末端５’－ヒドロキシル基及び２’，
３’－環状ホスフェートを有する特徴的なフラグメントを生成する。環状化は、３’，５
’－ホスホジエステル架橋を形成する同じ分子の２’，３’－環状ホスフェートへの５’
－ＯＨ基の求核攻撃によって進行する。
【0189】
[0274] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＨＰＲ要素を有する多
量体反復ＲＮＡ配列を含み得る。ＨＰＲは、２’，３’－環状ホスフェート及び５’－Ｏ
Ｈ末端を含む。ＨＰＲ要素は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を
自己プロセシングし、それによって末端を互いにライゲートする。
量体反復ＲＮＡ配列を含み得る。ＨＰＲは、２’，３’－環状ホスフェート及び５’－Ｏ
Ｈ末端を含む。ＨＰＲ要素は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を
自己プロセシングし、それによって末端を互いにライゲートする。
【0190】
[0275] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲーションを
媒介する配列を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライ
ゲートするために、ＨＤＶ配列（例えば、ＨＤＶ複製ドメイン保存配列、
GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCA
AGUUCGAGCAUGAGCC 又は
GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC）を含
み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするために
、ループＥ配列（例えば、ＰＳＴＶｄ中に）を含み得る。別の実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、自己環状化イントロン、例えば５’及び３’スプライス接合部又
はグループＩ、グループＩＩ若しくはグループＩＩＩイントロンなどの自己環状化触媒イ
ントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例は、
Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング置換イントロン－エク
ソン配列及びテトラヒメナ属（Tetrahymena）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡを含み得る
。
媒介する配列を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライ
ゲートするために、ＨＤＶ配列（例えば、ＨＤＶ複製ドメイン保存配列、
GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCA
AGUUCGAGCAUGAGCC 又は
GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC）を含
み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするために
、ループＥ配列（例えば、ＰＳＴＶｄ中に）を含み得る。別の実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、自己環状化イントロン、例えば５’及び３’スプライス接合部又
はグループＩ、グループＩＩ若しくはグループＩＩＩイントロンなどの自己環状化触媒イ
ントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例は、
Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング置換イントロン－エク
ソン配列及びテトラヒメナ属（Tetrahymena）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡを含み得る
。
【0191】
他の環状化方法
[0276] ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン
内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み
得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。ある実施
形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント
中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、
ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、２つ
の別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイ
ブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセ
グメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、相補的配列は、線状環状ポリ
リボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。ある実施形態において、相補的
配列は、約３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、
２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８
５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを含む。
[0276] ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン
内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み
得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。ある実施
形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント
中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、
ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、２つ
の別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイ
ブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセ
グメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、相補的配列は、線状環状ポリ
リボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。ある実施形態において、相補的
配列は、約３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、
２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８
５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを含む。
【0192】
[0277] ある実施形態において、環状化の化学的方法が、環状ポリリボヌクレオチドを
生成するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、クリック化学
（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法又はクリック可能な塩基）、オレフィンメタ
セシス、ホスホロアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾及
びそれらの任意の組合せが挙げられる。
生成するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、クリック化学
（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法又はクリック可能な塩基）、オレフィンメタ
セシス、ホスホロアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾及
びそれらの任意の組合せが挙げられる。
【0193】
[0278] ある実施形態において、環状化の酵素的方法は、環状ポリリボヌクレオチドを
生成するのに使用され得る。ある実施形態において、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ
又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボ
ヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。
生成するのに使用され得る。ある実施形態において、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ
又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボ
ヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。
【0194】
[0279] 環状ポリリボヌクレオチドの環状化は、当該技術分野において公知の方法、例
えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４－２４６５
からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉ
ｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ
Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐ
ｅｌによる“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記
載されているものによって行われ得る。
えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４－２４６５
からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉ
ｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ
Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐ
ｅｌによる“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記
載されているものによって行われ得る。
【0195】
複製要素
[0280] 環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコード
し得る。環状ポリリボヌクレオチドの複製は、相補体環状ポリリボヌクレオチドを生成す
ることによって行われ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、転写
を開始させるためのモチーフを含み、ここで、転写は、環状ポリリボヌクレオチドによっ
てコードされる内在性細胞機構（ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ）又はＲＮＡ依存的Ｒ
ＮＡポリメラーゼのいずれかによって駆動される。ローリングサークル型転写事象の産物
は、単位長において相補的又は伝播される環状ポリリボヌクレオチドのいずれかを生成す
るためにリボザイムによって切断され得る。リボザイムは、環状ポリリボヌクレオチド、
その相補体又はトランスにおけるＲＮＡ配列によってコードされ得る。ある実施形態にお
いて、コードされたリボザイムは、環状ＲＮＡ伝播を制御するためにリボザイムの活性を
調節する（阻害又は促進する）配列又はモチーフを含み得る。ある実施形態において、単
位長配列は、細胞内ＲＮＡリガーゼによって環状形態にライゲートされ得る。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己増幅に役立つ複製要素を含む。このよう
な複製要素の例としては、限定はされないが、本明細書の他の箇所に記載されるＨＤＶ複
製ドメイン、ジャガイモやせいもウイロイド（Ｐｏｔａｔｏ Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｔｕｂｅ
ｒ Ｖｉｒｏｉｄ）のＲＮＡプロモータ（例えば、Ｋｏｌｏｎｋｏ ２００５ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙを参照されたい）並びにアンチゲノム 5’-CGGGUCGGCAUGGCAUCUCCACCUCCUCGCGGU
CCGACCUGGGCAUCCGAAGGAGGACGCACGUCCACUCGGAUGGCUAAGGGAGAGCCA-3’ 若しくはゲノム5
’-UGGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACAUUCCGAGGGGACCGUCCCCUCGGUAAUGGCG
AAUGGGACCCA-3’
などの複製コンピテント環状ＲＮＡセンス及び／又はアンチセンスリボザイムが挙げられ
る。
[0280] 環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコード
し得る。環状ポリリボヌクレオチドの複製は、相補体環状ポリリボヌクレオチドを生成す
ることによって行われ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、転写
を開始させるためのモチーフを含み、ここで、転写は、環状ポリリボヌクレオチドによっ
てコードされる内在性細胞機構（ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ）又はＲＮＡ依存的Ｒ
ＮＡポリメラーゼのいずれかによって駆動される。ローリングサークル型転写事象の産物
は、単位長において相補的又は伝播される環状ポリリボヌクレオチドのいずれかを生成す
るためにリボザイムによって切断され得る。リボザイムは、環状ポリリボヌクレオチド、
その相補体又はトランスにおけるＲＮＡ配列によってコードされ得る。ある実施形態にお
いて、コードされたリボザイムは、環状ＲＮＡ伝播を制御するためにリボザイムの活性を
調節する（阻害又は促進する）配列又はモチーフを含み得る。ある実施形態において、単
位長配列は、細胞内ＲＮＡリガーゼによって環状形態にライゲートされ得る。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己増幅に役立つ複製要素を含む。このよう
な複製要素の例としては、限定はされないが、本明細書の他の箇所に記載されるＨＤＶ複
製ドメイン、ジャガイモやせいもウイロイド（Ｐｏｔａｔｏ Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｔｕｂｅ
ｒ Ｖｉｒｏｉｄ）のＲＮＡプロモータ（例えば、Ｋｏｌｏｎｋｏ ２００５ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙを参照されたい）並びにアンチゲノム 5’-CGGGUCGGCAUGGCAUCUCCACCUCCUCGCGGU
CCGACCUGGGCAUCCGAAGGAGGACGCACGUCCACUCGGAUGGCUAAGGGAGAGCCA-3’ 若しくはゲノム5
’-UGGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACAUUCCGAGGGGACCGUCCCCUCGGUAAUGGCG
AAUGGGACCCA-3’
などの複製コンピテント環状ＲＮＡセンス及び／又はアンチセンスリボザイムが挙げられ
る。
【0196】
[0281] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製を促進することが
本明細書に記載される少なくとも１つのスタガー要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド
内のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドから複製された長い転写産物を、特定の
長さに切断することができ、これが後に環状化されて、環状ポリリボヌクレオチドに対す
る相補体を形成する。
本明細書に記載される少なくとも１つのスタガー要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド
内のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドから複製された長い転写産物を、特定の
長さに切断することができ、これが後に環状化されて、環状ポリリボヌクレオチドに対す
る相補体を形成する。
【0197】
[0282] 別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオ
チドから複製された長い転写産物を特定の長さに切断するために、少なくとも１つのリボ
ザイム配列を含み、ここで、別のコードされたリボザイムがリボザイム配列において転写
産物を切断する。環状化は、環状ポリリボヌクレオチドに対する相補体を形成する。
チドから複製された長い転写産物を特定の長さに切断するために、少なくとも１つのリボ
ザイム配列を含み、ここで、別のコードされたリボザイムがリボザイム配列において転写
産物を切断する。環状化は、環状ポリリボヌクレオチドに対する相補体を形成する。
【0198】
[0283] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、エキソヌクレ
アーゼによる分解に対して実質的に抵抗性である。
[0284] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製する。あ
る実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０％～２０％、２０％～３０％
、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～７５％
、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％
又はそれらの間の任意のパーセンテージの速度において細胞内で複製する。ある実施形態
において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、娘細胞に送られる。ある実
施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％
、９０％、９５％又は９９％の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細
胞に送る。ある実施形態において、減数分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５
０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリ
ボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、有糸分裂を行っている細胞は、
少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９
％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。
アーゼによる分解に対して実質的に抵抗性である。
[0284] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製する。あ
る実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０％～２０％、２０％～３０％
、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～７５％
、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％
又はそれらの間の任意のパーセンテージの速度において細胞内で複製する。ある実施形態
において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、娘細胞に送られる。ある実
施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％
、９０％、９５％又は９９％の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細
胞に送る。ある実施形態において、減数分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５
０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリ
ボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、有糸分裂を行っている細胞は、
少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９
％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。
【0199】
[0285] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主細胞内で複製する
。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞内
で複製することが可能である。
。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞内
で複製することが可能である。
【0200】
[0286] 実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主細胞内で複製するが、
環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体により、宿主のゲノムに組み込まれ
ない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体によ
り、ごくわずかな組み換え頻度を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオ
チドは、例えば、宿主の染色体により、例えば約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、
０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃ
Ｍ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍｂ未満又はそれを下回
る組み換え頻度を有する。
環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体により、宿主のゲノムに組み込まれ
ない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体によ
り、ごくわずかな組み換え頻度を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオ
チドは、例えば、宿主の染色体により、例えば約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、
０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃ
Ｍ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍｂ未満又はそれを下回
る組み換え頻度を有する。
【0201】
他の配列
[0287] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、別の核酸配列をさらに
含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は人工核
酸を含む他の配列を含み得る。他の配列としては、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ分子をコードするゲ
ノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は配列が挙げられる。一実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座を標的にす
るためにｓｉＲＮＡを含む。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポ
リリボヌクレオチドと異なる遺伝子発現産物を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。
[0287] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、別の核酸配列をさらに
含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は人工核
酸を含む他の配列を含み得る。他の配列としては、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ分子をコードするゲ
ノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は配列が挙げられる。一実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座を標的にす
るためにｓｉＲＮＡを含む。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポ
リリボヌクレオチドと異なる遺伝子発現産物を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。
【0202】
[0288] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いて
いる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いている
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を欠いている。あ
る実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いている。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。ある
実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性
を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いて
いることは、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されないか、
又はエキソヌクレアーゼの非存在下と同等又は同様の限られた程度にエキソヌクレアーゼ
の存在下でのみ分解されることを意味し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌク
レオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解を欠いている。ある実施形態において、環状
ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝されたときに減少した分解を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合
を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠
いている。
いる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いている
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を欠いている。あ
る実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いている。ある実施形
態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。ある
実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性
を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いて
いることは、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されないか、
又はエキソヌクレアーゼの非存在下と同等又は同様の限られた程度にエキソヌクレアーゼ
の存在下でのみ分解されることを意味し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌク
レオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解を欠いている。ある実施形態において、環状
ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝されたときに減少した分解を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合
を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠
いている。
【0203】
[0289] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いて
おり、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態にお
いて、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配
列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオ
チドは、ポリ－Ａ配列を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する
能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いてお
り、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態におい
て、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上
の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現
する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲ、
３’－ＵＴＲ及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現
する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列の１
つ以上を含む：１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ以上の複製タンパク質をコ
ードする配列、外来性遺伝子をコードする配列、治療薬をコードする配列、調節要素（例
えば、翻訳モジュレータ、例えば翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、
内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡ）を標的にする１つ以上の調節
核酸及び治療用ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列。
おり、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態にお
いて、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配
列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオ
チドは、ポリ－Ａ配列を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する
能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いてお
り、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態におい
て、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上
の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現
する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲ、
３’－ＵＴＲ及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現
する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列の１
つ以上を含む：１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ以上の複製タンパク質をコ
ードする配列、外来性遺伝子をコードする配列、治療薬をコードする配列、調節要素（例
えば、翻訳モジュレータ、例えば翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、
内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡ）を標的にする１つ以上の調節
核酸及び治療用ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列。
【0204】
[0290] 他の配列は、約２～約１００００ｎｔ、約２～約５０００ｎｔ、約１０～約１
００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～約２５０ｎｔ、
約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～
約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約
２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００
～約５０００ｎｔ又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～約２５０ｎｔ、
約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～
約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約
２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００
～約５０００ｎｔ又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
【0205】
[0291] その環状化の結果として、環状ポリリボヌクレオチドは、それを線状ＲＮＡと
区別するいくつかの特徴を含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡ
と比較して、エキソヌクレアーゼによる分解に対する感受性がより低い。したがって、環
状ポリリボヌクレオチドは、特に、エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされる
とき、線状ＲＮＡより安定している。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの
増加した安定性により、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチドを生成する細胞形質
転換試薬としてより有用になり、線状ＲＮＡより容易に及びより長く貯蔵可能になる。エ
キソヌクレアーゼで処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が起こ
ったかどうかを決定する、当該技術分野において標準的な方法を用いて（例えば、ゲル電
気泳動によって）試験され得る。
区別するいくつかの特徴を含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡ
と比較して、エキソヌクレアーゼによる分解に対する感受性がより低い。したがって、環
状ポリリボヌクレオチドは、特に、エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされる
とき、線状ＲＮＡより安定している。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの
増加した安定性により、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチドを生成する細胞形質
転換試薬としてより有用になり、線状ＲＮＡより容易に及びより長く貯蔵可能になる。エ
キソヌクレアーゼで処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が起こ
ったかどうかを決定する、当該技術分野において標準的な方法を用いて（例えば、ゲル電
気泳動によって）試験され得る。
【0206】
[0292] さらに、線状ＲＮＡと異なり、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌ
クレオチドが仔牛小腸由来ホスファターゼなどのホスファターゼと共にインキュベートさ
れるとき、脱リン酸化に対する感受性がより低い。
クレオチドが仔牛小腸由来ホスファターゼなどのホスファターゼと共にインキュベートさ
れるとき、脱リン酸化に対する感受性がより低い。
【0207】
ヌクレオチドスペーサー配列
[0293] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む
。
[0293] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む
。
【0208】
[0294] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスペ
ーサー配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、
４、５、６、７つ又はそれを超えるスペーサー配列を含む。
ーサー配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、
４、５、６、７つ又はそれを超えるスペーサー配列を含む。
【0209】
[0295] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約０．０５：１、約０
．０６：１、約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．
１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１、約０．２：１、約０
．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、約０．４：１、約０．
４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．６５：１、約０．７：
１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：１、約０．９５：１、
約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約１．１：１、約１．１
５：１、約１．２：１、約１．２５：１、約１．３：１、約１．３５：１、約１．４：１
、約１．４５：１、約１．５：１、約１．５５：１、約１．６：１、約１．６５：１、約
１．７：１、約１．７５：１、約１．８：１、約１．８５：１、約１．９：１、約１．９
５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１又は約２：１の、環状ポリリボヌクレオチド
、例えば発現配列のスペーサー配列対非スペーサー配列の比率を含む。
．０６：１、約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．
１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１、約０．２：１、約０
．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、約０．４：１、約０．
４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．６５：１、約０．７：
１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：１、約０．９５：１、
約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約１．１：１、約１．１
５：１、約１．２：１、約１．２５：１、約１．３：１、約１．３５：１、約１．４：１
、約１．４５：１、約１．５：１、約１．５５：１、約１．６：１、約１．６５：１、約
１．７：１、約１．７５：１、約１．８：１、約１．８５：１、約１．９：１、約１．９
５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１又は約２：１の、環状ポリリボヌクレオチド
、例えば発現配列のスペーサー配列対非スペーサー配列の比率を含む。
【0210】
[0296] ある実施形態において、スペーサー配列は、約０．５：１、約０．０６：１、
約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．１２：１、約
０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１、約０．２：１、約０．２２５：１
、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、約０．４：１、約０．４５：１、約
０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．６５：１、約０．７：１、約０．７
５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：１、約０．９５：１、約０．９８：
１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約１．１：１、約１．１５：１、約１
．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、
約１．８：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１、約
２．１：１、約２．２：１、約２．３：１、約２．４：１、約２．５：１、約２．６：１
、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、約３：１、約３．１：１、約３．２：１
、約３．３：１、約３．４：１、約３．５：１、約３．６：１、約３．７：１、約３．８
：１、約３．８５：１，約３．９：１、約３．９５：１、約３．９８：１又は約４：１の
、環状ポリリボヌクレオチドの下流（例えば、スペーサー配列３’末端側）の非スペーサ
ー要素に対するスペーサー配列の比率を含む。ある実施形態において、スペーサー配列は
、約０．５：１、約０．０６：１、約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、
約０．１：１、約０．１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１
、約０．２：１、約０．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、
約０．４：１、約０．４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．
６５：１、約０．７：１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：
１、約０．９５：１、約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約
１．１：１、約１．１５：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：
１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１
．９７５：１、約１．９８：１、約２．１：１、約２．２：１、約２．３：１、約２．４
：１、約２．５：１、約２．６：１、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、約３
：１、約３．１：１、約３．２：１、約３．３：１、約３．４：１、約３．５：１、約３
．６：１、約３．７：１、約３．８：１、約３．８５：１，約３．９：１、約３．９５：
１、約３．９８：１又は約４：１の、環状ポリリボヌクレオチドの上流（例えば、スペー
サー配列の５’末端側）の非スペーサー要素に対するスペーサー配列の比率を含む。
約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．１２：１、約
０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１、約０．２：１、約０．２２５：１
、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、約０．４：１、約０．４５：１、約
０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．６５：１、約０．７：１、約０．７
５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：１、約０．９５：１、約０．９８：
１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約１．１：１、約１．１５：１、約１
．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、
約１．８：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１、約
２．１：１、約２．２：１、約２．３：１、約２．４：１、約２．５：１、約２．６：１
、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、約３：１、約３．１：１、約３．２：１
、約３．３：１、約３．４：１、約３．５：１、約３．６：１、約３．７：１、約３．８
：１、約３．８５：１，約３．９：１、約３．９５：１、約３．９８：１又は約４：１の
、環状ポリリボヌクレオチドの下流（例えば、スペーサー配列３’末端側）の非スペーサ
ー要素に対するスペーサー配列の比率を含む。ある実施形態において、スペーサー配列は
、約０．５：１、約０．０６：１、約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、
約０．１：１、約０．１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１
、約０．２：１、約０．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、
約０．４：１、約０．４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．
６５：１、約０．７：１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：
１、約０．９５：１、約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約
１．１：１、約１．１５：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：
１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１
．９７５：１、約１．９８：１、約２．１：１、約２．２：１、約２．３：１、約２．４
：１、約２．５：１、約２．６：１、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、約３
：１、約３．１：１、約３．２：１、約３．３：１、約３．４：１、約３．５：１、約３
．６：１、約３．７：１、約３．８：１、約３．８５：１，約３．９：１、約３．９５：
１、約３．９８：１又は約４：１の、環状ポリリボヌクレオチドの上流（例えば、スペー
サー配列の５’末端側）の非スペーサー要素に対するスペーサー配列の比率を含む。
【0211】
[0297] ある実施形態において、スペーサー配列は、少なくとも３リボヌクレオチド、
少なくとも４リボヌクレオチド、少なくとも５リボヌクレオチド、少なくとも約８リボヌ
クレオチド、少なくとも約１０リボヌクレオチド、少なくとも約１２リボヌクレオチド、
少なくとも約１５リボヌクレオチド、少なくとも約２０リボヌクレオチド、少なくとも約
２５リボヌクレオチド、少なくとも約３０リボヌクレオチド、少なくとも約４０リボヌク
レオチド、少なくとも約５０リボヌクレオチド、少なくとも約６０リボヌクレオチド、少
なくとも約７０リボヌクレオチド、少なくとも約８０リボヌクレオチド、少なくとも約９
０リボヌクレオチド、少なくとも約１００リボヌクレオチド、少なくとも約１２０リボヌ
クレオチド、少なくとも約１５０リボヌクレオチド、少なくとも約２００リボヌクレオチ
ド、少なくとも約２５０リボヌクレオチド、少なくとも約３００リボヌクレオチド、少な
くとも約４００リボヌクレオチド、少なくとも約５００リボヌクレオチド、少なくとも約
６００リボヌクレオチド、少なくとも約７００リボヌクレオチド、少なくとも約８００リ
ボヌクレオチド、少なくとも約９００リボヌクレオチド又は少なくとも約１００リボヌク
レオチドの配列を含む。
少なくとも４リボヌクレオチド、少なくとも５リボヌクレオチド、少なくとも約８リボヌ
クレオチド、少なくとも約１０リボヌクレオチド、少なくとも約１２リボヌクレオチド、
少なくとも約１５リボヌクレオチド、少なくとも約２０リボヌクレオチド、少なくとも約
２５リボヌクレオチド、少なくとも約３０リボヌクレオチド、少なくとも約４０リボヌク
レオチド、少なくとも約５０リボヌクレオチド、少なくとも約６０リボヌクレオチド、少
なくとも約７０リボヌクレオチド、少なくとも約８０リボヌクレオチド、少なくとも約９
０リボヌクレオチド、少なくとも約１００リボヌクレオチド、少なくとも約１２０リボヌ
クレオチド、少なくとも約１５０リボヌクレオチド、少なくとも約２００リボヌクレオチ
ド、少なくとも約２５０リボヌクレオチド、少なくとも約３００リボヌクレオチド、少な
くとも約４００リボヌクレオチド、少なくとも約５００リボヌクレオチド、少なくとも約
６００リボヌクレオチド、少なくとも約７００リボヌクレオチド、少なくとも約８００リ
ボヌクレオチド、少なくとも約９００リボヌクレオチド又は少なくとも約１００リボヌク
レオチドの配列を含む。
【0212】
[0298] ある実施形態において、スペーサー配列は、スペーサーの完全長にわたり又は
スペーサーの連続した核酸残基の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％にわ
たり、例えば６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３９
％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９
％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２０％、１９％、１８
％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、
７％、６％、５％、４％、３％、２％若しくは１％未満の低いＧＣ含量を有する核酸配列
又は分子であり得る。ある実施形態において、スペーサー配列は、少なくとも９５％、９
０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５
０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２０％又はそれらの間の任意のパーセンテージ
のアデニンリボヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、スペーサー配列は、連
続して少なくとも５個以上のアデニンリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、
スペーサー配列は、連続して少なくとも６個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少な
くとも７個のアデニンリボヌクレオチド、少なくとも８個のリボヌクレオチド、連続して
少なくとも約１０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１２個のアデニ
ンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１５個のアデニンリボヌクレオチド、連続し
て少なくとも約２０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約２５個のアデ
ニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約３０個のアデニンリボヌクレオチド、連続
して少なくとも約４０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約５０個のア
デニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約６０個のアデニンリボヌクレオチド、連
続して少なくとも約７０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約８０個の
アデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約９０個のアデニンリボヌクレオチド、
連続して少なくとも約９５個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１００
個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１５０個のアデニンリボヌクレオ
チド、連続して少なくとも約２００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも
約２５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約３００個のアデニンリボ
ヌクレオチド、連続して少なくとも約３５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少
なくとも約４００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約４５０個のアデ
ニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約５００個のアデニンリボヌクレオチド、連
続して少なくとも約５５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約６００
個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約７００個のアデニンリボヌクレオ
チド、連続して少なくとも約８００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも
約９００個のアデニンリボヌクレオチド又は連続して少なくとも約１０００個のアデニン
リボヌクレオチドを含む。
スペーサーの連続した核酸残基の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％にわ
たり、例えば６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３９
％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９
％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２０％、１９％、１８
％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、
７％、６％、５％、４％、３％、２％若しくは１％未満の低いＧＣ含量を有する核酸配列
又は分子であり得る。ある実施形態において、スペーサー配列は、少なくとも９５％、９
０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５
０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２０％又はそれらの間の任意のパーセンテージ
のアデニンリボヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、スペーサー配列は、連
続して少なくとも５個以上のアデニンリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、
スペーサー配列は、連続して少なくとも６個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少な
くとも７個のアデニンリボヌクレオチド、少なくとも８個のリボヌクレオチド、連続して
少なくとも約１０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１２個のアデニ
ンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１５個のアデニンリボヌクレオチド、連続し
て少なくとも約２０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約２５個のアデ
ニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約３０個のアデニンリボヌクレオチド、連続
して少なくとも約４０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約５０個のア
デニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約６０個のアデニンリボヌクレオチド、連
続して少なくとも約７０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約８０個の
アデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約９０個のアデニンリボヌクレオチド、
連続して少なくとも約９５個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１００
個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１５０個のアデニンリボヌクレオ
チド、連続して少なくとも約２００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも
約２５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約３００個のアデニンリボ
ヌクレオチド、連続して少なくとも約３５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少
なくとも約４００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約４５０個のアデ
ニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約５００個のアデニンリボヌクレオチド、連
続して少なくとも約５５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約６００
個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約７００個のアデニンリボヌクレオ
チド、連続して少なくとも約８００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも
約９００個のアデニンリボヌクレオチド又は連続して少なくとも約１０００個のアデニン
リボヌクレオチドを含む。
【0213】
[0299] ある実施形態において、スペーサー配列は、１つ以上の要素間に位置する。あ
る実施形態において、スペーサー配列は、要素間の立体配座柔軟性を提供する。ある実施
形態において、立体配座柔軟性は、スペーサー配列が二次構造を実質的に含まないことに
よる。ある実施形態において、スペーサー配列は、４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、－３９、
－３８、－３７、－３６、－３５、－３４、－３３、－３２、－３１、－３０、－２９、
－２８、－２７、－２６、－２５、－２４、－２３、－２２、－２０、－１９、－１８、
－１７、－１６、－１５、－１４、－１３、－１２、－１１、－１０、－９、－８、－７
、－６、－５、－４、－３、－２又は－１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満など、二次構造を実質的
に含まない。スペーサーは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を含み得る。
る実施形態において、スペーサー配列は、要素間の立体配座柔軟性を提供する。ある実施
形態において、立体配座柔軟性は、スペーサー配列が二次構造を実質的に含まないことに
よる。ある実施形態において、スペーサー配列は、４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、－３９、
－３８、－３７、－３６、－３５、－３４、－３３、－３２、－３１、－３０、－２９、
－２８、－２７、－２６、－２５、－２４、－２３、－２２、－２０、－１９、－１８、
－１７、－１６、－１５、－１４、－１３、－１２、－１１、－１０、－９、－８、－７
、－６、－５、－４、－３、－２又は－１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満など、二次構造を実質的
に含まない。スペーサーは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を含み得る。
【0214】
[0300] ある実施形態において、スペーサー配列は、ＲＮＡ配列及び好ましくは分泌シ
グナルペプチドを含むタンパク質又はペプチド配列をコードし得る。
[0301] ある実施形態において、スペーサー配列は、非コード性であり得る。スペーサ
ーが非コード配列である場合、翻訳開始配列は、隣接する配列のコード配列において提供
され得る。ある実施形態において、コード配列の第１の核酸残基は、ＡＵＧなどの翻訳開
始配列のＡ残基であり得ることが想定される。スペーサーがＲＮＡ又はタンパク質又はペ
プチド配列をコードする場合、翻訳開始配列は、スペーサー配列において提供され得る。
グナルペプチドを含むタンパク質又はペプチド配列をコードし得る。
[0301] ある実施形態において、スペーサー配列は、非コード性であり得る。スペーサ
ーが非コード配列である場合、翻訳開始配列は、隣接する配列のコード配列において提供
され得る。ある実施形態において、コード配列の第１の核酸残基は、ＡＵＧなどの翻訳開
始配列のＡ残基であり得ることが想定される。スペーサーがＲＮＡ又はタンパク質又はペ
プチド配列をコードする場合、翻訳開始配列は、スペーサー配列において提供され得る。
【0215】
[0302] ある実施形態において、スペーサーは、本明細書に記載される別の配列に動作
可能に連結される。
可能に連結される。
【0216】
非核酸リンカー
[0303] 本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、非核酸リンカーも含み得
る。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、本明細
書に記載される配列又は要素の１つ以上の間に非核酸リンカーを有する。一実施形態にお
いて、本明細書に記載される１つ以上の配列又は要素は、リンカーを用いて連結される。
非核酸リンカーは、化学結合、例えば１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。あ
る実施形態において、非核酸リンカーは、ペプチド又はタンパク質リンカーである。この
ようなリンカーは、２～３０アミノ酸又はそれを超えるものであり得る。リンカーは、本
明細書に記載される可撓性、剛性又は切断可能なリンカーを含む。
[0303] 本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、非核酸リンカーも含み得
る。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、本明細
書に記載される配列又は要素の１つ以上の間に非核酸リンカーを有する。一実施形態にお
いて、本明細書に記載される１つ以上の配列又は要素は、リンカーを用いて連結される。
非核酸リンカーは、化学結合、例えば１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。あ
る実施形態において、非核酸リンカーは、ペプチド又はタンパク質リンカーである。この
ようなリンカーは、２～３０アミノ酸又はそれを超えるものであり得る。リンカーは、本
明細書に記載される可撓性、剛性又は切断可能なリンカーを含む。
【0217】
[0304] 最も一般的に使用される可撓性リンカーは、主に、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基（「
ＧＳ」リンカー）のストレッチからなる配列を有する。可撓性リンカーは、ある程度の移
動又は相互作用を必要とするドメインを結合するのに有用であり得、小さい非極性（例え
ば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴ
ｈｒの組み込みは、水分子により水素結合を形成することによって水溶液中のリンカーの
安定性も維持し、したがってリンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用を
減少させ得る。
ＧＳ」リンカー）のストレッチからなる配列を有する。可撓性リンカーは、ある程度の移
動又は相互作用を必要とするドメインを結合するのに有用であり得、小さい非極性（例え
ば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴ
ｈｒの組み込みは、水分子により水素結合を形成することによって水溶液中のリンカーの
安定性も維持し、したがってリンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用を
減少させ得る。
【0218】
[0305] 剛性リンカーは、ドメイン間の一定の距離を保持し、それらの独立した機能を
維持するのに有用である。剛性リンカーは、ドメインの空間的隔離が、融合中の１つ以上
の構成要素の安定性又は生物活性を保つのに重要である場合にも有用であり得る。剛性リ
ンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎを有し得、ここで、Ｘは
、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕを示す。
維持するのに有用である。剛性リンカーは、ドメインの空間的隔離が、融合中の１つ以上
の構成要素の安定性又は生物活性を保つのに重要である場合にも有用であり得る。剛性リ
ンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎを有し得、ここで、Ｘは
、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕを示す。
【0219】
[0306] 切断可能なリンカーは、インビボで遊離機能的ドメインを解放し得る。ある実
施形態において、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在下などの特定の条件下で
切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆性を用い得る
。一例としては、２つのＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）を含む
。ＣＰＲＳＣのインビトロトロンビン処理は、トロンビン感受性配列の切断をもたらす一
方、可逆的なジスルフィド結合は無傷のままである。このようなリンカーが公知であり、
例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒ
：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄ
ｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている。融
合中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞又は組織内で病的状態（例えば、癌又は炎
症）においてインビボで発現されるか、又は特定の細胞内区画内で制限されるプロテアー
ゼによっても行われ得る。多くのプロテアーゼの特異性は、制限された区画におけるリン
カーのよりゆっくりとした切断を提供する。
施形態において、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在下などの特定の条件下で
切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆性を用い得る
。一例としては、２つのＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）を含む
。ＣＰＲＳＣのインビトロトロンビン処理は、トロンビン感受性配列の切断をもたらす一
方、可逆的なジスルフィド結合は無傷のままである。このようなリンカーが公知であり、
例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒ
：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄ
ｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている。融
合中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞又は組織内で病的状態（例えば、癌又は炎
症）においてインビボで発現されるか、又は特定の細胞内区画内で制限されるプロテアー
ゼによっても行われ得る。多くのプロテアーゼの特異性は、制限された区画におけるリン
カーのよりゆっくりとした切断を提供する。
【0220】
[0307] 連結分子の例としては、疎水性リンカー、例えば負の電荷を帯びたスルホネー
ト基；脂質、例えばポリ（－ＣＨ２－）炭化水素鎖、例えばポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）基、その不飽和形態、その水酸化形態、そのアミド化若しくは他の形のＮ含有形態
、非炭素リンカー；炭水化物リンカー；ホスホジエステルリンカー又は２つ以上のポリペ
プチドを共有結合することが可能な他の分子が挙げられる。例えば、ポリペプチドの疎水
性領域若しくはポリペプチドの疎水性伸長を介して、ポリペプチドが連結された疎水性脂
質小球、例えばロイシン、イソロイシン、バリン又はさらにおそらくアラニン、フェニル
アラニン或いはチロシン、メチオニン、グリシン又は他の疎水性残基に富んだ一連の残基
などの非共有結合リンカーも含まれる。ポリペプチドの正の電荷を帯びた部分が別のポリ
ペプチド又は核酸の負電荷に連結されるように、ポリペプチドは、電荷に基づいた化学を
用いて連結され得る。
ト基；脂質、例えばポリ（－ＣＨ２－）炭化水素鎖、例えばポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）基、その不飽和形態、その水酸化形態、そのアミド化若しくは他の形のＮ含有形態
、非炭素リンカー；炭水化物リンカー；ホスホジエステルリンカー又は２つ以上のポリペ
プチドを共有結合することが可能な他の分子が挙げられる。例えば、ポリペプチドの疎水
性領域若しくはポリペプチドの疎水性伸長を介して、ポリペプチドが連結された疎水性脂
質小球、例えばロイシン、イソロイシン、バリン又はさらにおそらくアラニン、フェニル
アラニン或いはチロシン、メチオニン、グリシン又は他の疎水性残基に富んだ一連の残基
などの非共有結合リンカーも含まれる。ポリペプチドの正の電荷を帯びた部分が別のポリ
ペプチド又は核酸の負電荷に連結されるように、ポリペプチドは、電荷に基づいた化学を
用いて連結され得る。
【0221】
安定性／半減期
[0308] ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチ
ドは、対照、例えば同じヌクレオチド配列を有するが、環状されていない線状ポリリボヌ
クレオチド（線状同等物）より増加した半減期を有する。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己分解に対して抵抗性である
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、酵素切断部位、例えばダイサー
切断部位を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対照、例
えば線状同等物より、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少
なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少
なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、
少なくとも約１２０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１
６０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なく
とも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％
、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％又は少なくと
も約１００００％長い半減期を有する。
[0308] ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチ
ドは、対照、例えば同じヌクレオチド配列を有するが、環状されていない線状ポリリボヌ
クレオチド（線状同等物）より増加した半減期を有する。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己分解に対して抵抗性である
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、酵素切断部位、例えばダイサー
切断部位を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対照、例
えば線状同等物より、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少
なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少
なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、
少なくとも約１２０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１
６０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なく
とも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％
、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％又は少なくと
も約１００００％長い半減期を有する。
【0222】
[0309] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中に細胞内で
持続する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、有糸分裂後に娘細胞内
で持続する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、
娘細胞に送られる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボ
ヌクレオチドの自己複製を媒介する複製要素を含む。ある実施形態において、複製要素は
、環状ポリリボヌクレオチドに対して相補的な線状ポリリボヌクレオチド（線状相補性）
への環状ポリリボヌクレオチドの転写を媒介する。ある実施形態において、線状相補性ポ
リリボヌクレオチドは、相補的な環状ポリリボヌクレオチドに細胞内においてインビボで
環状化され得る。ある実施形態において、相補的ポリリボヌクレオチドは、出発環状ポリ
リボヌクレオチドと同じ又は類似したヌクレオチド配列を有する別の環状ポリリボヌクレ
オチドにさらに自己複製し得る。１つの例示的な自己複製要素としては、ＨＤＶ複製ドメ
インが挙げられる（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌ，２０１４，４５０－４
５１：１６５－１７３によって記載されるように）。ある実施形態において、細胞は、少
なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％
の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態にお
いて、減数分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０
％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送
る。ある実施形態において、有糸分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、
６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌク
レオチドを娘細胞に送る。
持続する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、有糸分裂後に娘細胞内
で持続する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、
娘細胞に送られる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボ
ヌクレオチドの自己複製を媒介する複製要素を含む。ある実施形態において、複製要素は
、環状ポリリボヌクレオチドに対して相補的な線状ポリリボヌクレオチド（線状相補性）
への環状ポリリボヌクレオチドの転写を媒介する。ある実施形態において、線状相補性ポ
リリボヌクレオチドは、相補的な環状ポリリボヌクレオチドに細胞内においてインビボで
環状化され得る。ある実施形態において、相補的ポリリボヌクレオチドは、出発環状ポリ
リボヌクレオチドと同じ又は類似したヌクレオチド配列を有する別の環状ポリリボヌクレ
オチドにさらに自己複製し得る。１つの例示的な自己複製要素としては、ＨＤＶ複製ドメ
インが挙げられる（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌ，２０１４，４５０－４
５１：１６５－１７３によって記載されるように）。ある実施形態において、細胞は、少
なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％
の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態にお
いて、減数分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０
％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送
る。ある実施形態において、有糸分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、
６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌク
レオチドを娘細胞に送る。
【0223】
修飾
[0310] 環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列に対して１つ以上の置換、挿入及び／
又は付加、欠失及び共有結合修飾を含み得、特に親ポリリボヌクレオチドが本発明の範囲
内に含まれる。
[0310] 環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列に対して１つ以上の置換、挿入及び／
又は付加、欠失及び共有結合修飾を含み得、特に親ポリリボヌクレオチドが本発明の範囲
内に含まれる。
【0224】
[0311] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の転写後修飾
（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリ－Ａ配列、メチ
ル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化並びにチ
オール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ以上の転写後修飾は、ＲＮ
Ａにおいて同定された１００を超える様々なヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転
写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋ
ｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓ
ｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）
。ある実施形態において、第１の単離核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む
。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ
－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウ
リジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、
５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロ
ピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、
１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１
－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイド
ウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイド
ウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デ
アザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジ
ヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メ
トキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン及び４－メトキシ－２－
チオ－プソイドウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む
。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、５－アザ－シチジン、プソイドシチジン、３－メ
チル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジ
ン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドシチジン、ピロロ－シチジン
、ピロロ－プソイドシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、
４－チオ－プソイドシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドシチジン、４－チオ－１
－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン
、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－
ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチ
ル－シチジン、４－メトキシ－プソイドシチジン及び４－メトキシ－１－メチル－プソイ
ドシチジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形
態において、ｍＲＮＡは、２－アミノプリン、２、６－ジアミノプリン、７－デアザ－ア
デニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ
－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８
－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ
６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン
、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリ
シニルカルバモイル（glycinylcarbamoyl）アデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイル
アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－
ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン及び２－メトキシ
－アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形
態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン
、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン
、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、
７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６
－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２
－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン
、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン及びＮ２，
Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌク
レオシドを含む。
（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリ－Ａ配列、メチ
ル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化並びにチ
オール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ以上の転写後修飾は、ＲＮ
Ａにおいて同定された１００を超える様々なヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転
写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋ
ｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓ
ｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）
。ある実施形態において、第１の単離核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む
。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ
－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウ
リジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、
５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロ
ピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、
１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１
－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイド
ウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイド
ウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デ
アザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジ
ヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メ
トキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン及び４－メトキシ－２－
チオ－プソイドウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む
。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、５－アザ－シチジン、プソイドシチジン、３－メ
チル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジ
ン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドシチジン、ピロロ－シチジン
、ピロロ－プソイドシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、
４－チオ－プソイドシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドシチジン、４－チオ－１
－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン
、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－
ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチ
ル－シチジン、４－メトキシ－プソイドシチジン及び４－メトキシ－１－メチル－プソイ
ドシチジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形
態において、ｍＲＮＡは、２－アミノプリン、２、６－ジアミノプリン、７－デアザ－ア
デニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ
－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８
－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ
６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン
、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリ
シニルカルバモイル（glycinylcarbamoyl）アデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイル
アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－
ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン及び２－メトキシ
－アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形
態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン
、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン
、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、
７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６
－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２
－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン
、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン及びＮ２，
Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌク
レオシドを含む。
【0225】
[0312] 環状ポリリボヌクレオチドは、糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合などに対
する（例えば、連結ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対す
る）任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択的
に置換されるアミノ、任意選択的に置換されるチオール、任意選択的に置換されるアルキ
ル（例えば、メチル若しくはエチル）又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置
き換えられ得るか又は置換され得る。特定の実施形態において、修飾（例えば、１つ以上
の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。修飾は、デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（
ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）又はそのハイブリッド）へのリボ核酸（ＲＮＡ）の修
飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
する（例えば、連結ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対す
る）任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択的
に置換されるアミノ、任意選択的に置換されるチオール、任意選択的に置換されるアルキ
ル（例えば、メチル若しくはエチル）又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置
き換えられ得るか又は置換され得る。特定の実施形態において、修飾（例えば、１つ以上
の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。修飾は、デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（
ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）又はそのハイブリッド）へのリボ核酸（ＲＮＡ）の修
飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
【0226】
[0313] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳効率を高めるため
に、少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。ある実施形態に
おいて、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの免疫
原性を低下させ得る。
に、少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。ある実施形態に
おいて、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの免疫
原性を低下させ得る。
【0227】
[0314] ある実施形態において、修飾は、化学修飾又は細胞誘導性修飾を含み得る。例
えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定的な例は、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０からの“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄ
ｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”においてＬｅｗｉｓ及びＰａ
ｎによって記載されている。
えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定的な例は、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０からの“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄ
ｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”においてＬｅｗｉｓ及びＰａ
ｎによって記載されている。
【0228】
[0315] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのリボヌクレオチドに対す
る化学修飾は、免疫回避を促進し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、参照により本明細
書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉ
ｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載され
ているものなど、当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修
飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば５’末端修飾（リン酸化（一－、
二－及び三－リン酸化）、共役、反転結合など）、３’末端修飾（共役、ＤＮＡヌクレオ
チド、反転結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基又は広いレパート
リーのパートナーと塩基対合する塩基による置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）
又は共役塩基が挙げられる。修飾リボヌクレオチド塩基は、５－メチルシチジン及びプソ
イドウリジンも含み得る。ある実施形態において、塩基修飾は、環状ポリリボヌクレオチ
ドのいくつかの機能的効果を挙げると、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し
得る。ある実施形態において、修飾としては、双直交（bi-orthogonal）ヌクレオチド、
例えば非天然塩基が挙げられる。例えば、参照により本明細書に援用されるＫｉｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，Ｄ
ＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａを参照されたい。
る化学修飾は、免疫回避を促進し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、参照により本明細
書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉ
ｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載され
ているものなど、当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修
飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば５’末端修飾（リン酸化（一－、
二－及び三－リン酸化）、共役、反転結合など）、３’末端修飾（共役、ＤＮＡヌクレオ
チド、反転結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基又は広いレパート
リーのパートナーと塩基対合する塩基による置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）
又は共役塩基が挙げられる。修飾リボヌクレオチド塩基は、５－メチルシチジン及びプソ
イドウリジンも含み得る。ある実施形態において、塩基修飾は、環状ポリリボヌクレオチ
ドのいくつかの機能的効果を挙げると、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し
得る。ある実施形態において、修飾としては、双直交（bi-orthogonal）ヌクレオチド、
例えば非天然塩基が挙げられる。例えば、参照により本明細書に援用されるＫｉｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，Ｄ
ＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａを参照されたい。
【0229】
[0316] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上のリボヌクレオ
チドの糖修飾（例えば、２’位若しくは４’位における）又は糖の置換には、骨格修飾だ
けでなく、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含み得る。環状ポリリボヌクレオチド
の具体例としては、限定はされないが、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、ヌ
クレオシド間修飾などの修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含む環状ポリリボヌク
レオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドとしては、中でも特
に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本出願の趣旨では、且つ当該技術分
野において時々参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない
修飾ＲＮＡもオリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施形態において、環状
ポリリボヌクレオチドは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有するリボヌクレオチ
ドを含む。
チドの糖修飾（例えば、２’位若しくは４’位における）又は糖の置換には、骨格修飾だ
けでなく、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含み得る。環状ポリリボヌクレオチド
の具体例としては、限定はされないが、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、ヌ
クレオシド間修飾などの修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含む環状ポリリボヌク
レオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドとしては、中でも特
に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本出願の趣旨では、且つ当該技術分
野において時々参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない
修飾ＲＮＡもオリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施形態において、環状
ポリリボヌクレオチドは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有するリボヌクレオチ
ドを含む。
【0230】
[0317] 修飾環状ポリリボヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、
キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキ
ルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメ
チル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート
及びアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、チオノホスホロアミ
デート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル及びこれらの
通常の３’－５’結合、２’－５’連結類似体を有するボラノホスフェート及び逆極性を
有するものが挙げられ、ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対が連結される（３’－５
’を５’－３’に又は２’－５’を５’－２’に）。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も
含まれる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、負の電荷又は正の電荷
を帯び得る。
キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキ
ルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメ
チル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート
及びアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、チオノホスホロアミ
デート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル及びこれらの
通常の３’－５’結合、２’－５’連結類似体を有するボラノホスフェート及び逆極性を
有するものが挙げられ、ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対が連結される（３’－５
’を５’－３’に又は２’－５’を５’－２’に）。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も
含まれる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、負の電荷又は正の電荷
を帯び得る。
【0231】
[0318] 環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシ
ド間結合（例えば、ホスフェート骨格）上で修飾され得る。本明細書において、ポリヌク
レオチド骨格に関して、「ホスフェート」及び「ホスホジエステル」という語句は、同義
的に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を様々な置換基で置換することに
よって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載さ
れる別のヌクレオシド間結合による非修飾ホスフェート部分の大規模な置換を含み得る。
修飾リン酸基の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネー
ト、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデー
ト、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステル
が挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非連結酸素が硫黄で置換されている。ホ
スフェートリンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエー
ト）及び炭素（架橋メチレン－ホスホネート）による連結酸素の置換によっても修飾され
得る。
ド間結合（例えば、ホスフェート骨格）上で修飾され得る。本明細書において、ポリヌク
レオチド骨格に関して、「ホスフェート」及び「ホスホジエステル」という語句は、同義
的に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を様々な置換基で置換することに
よって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載さ
れる別のヌクレオシド間結合による非修飾ホスフェート部分の大規模な置換を含み得る。
修飾リン酸基の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネー
ト、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデー
ト、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステル
が挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非連結酸素が硫黄で置換されている。ホ
スフェートリンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエー
ト）及び炭素（架橋メチレン－ホスホネート）による連結酸素の置換によっても修飾され
得る。
【0232】
[0319] 非天然ホスホロチオエート骨格結合によってＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定
性を与えるためにａ－チオ置換ホスフェート部分が提供される。ホスホロチオエートＤＮ
Ａ及びＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性、したがって細胞環境内でのより長い半減期
を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免
疫分子のより弱い結合／活性化によって自然免疫応答を低減すると予測される。
性を与えるためにａ－チオ置換ホスフェート部分が提供される。ホスホロチオエートＤＮ
Ａ及びＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性、したがって細胞環境内でのより長い半減期
を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免
疫分子のより弱い結合／活性化によって自然免疫応答を低減すると予測される。
【0233】
[0320] 特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドとしては、α－チオ－ヌクレオシ
ド（例えば、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオ
ホスフェート）－シチジン（α－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート
）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジン又は５’－Ｏ－（１－
チオホスフェート）－プソイドウリジン）が挙げられる。
ド（例えば、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオ
ホスフェート）－シチジン（α－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート
）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジン又は５’－Ｏ－（１－
チオホスフェート）－プソイドウリジン）が挙げられる。
【0234】
[0321] リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む、本発明に従って用いられ得
る他のヌクレオシド間結合が本明細書に記載される。
[0322] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の細胞毒性ヌ
クレオシドを含み得る。例えば、細胞毒性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリ
リボヌクレオチドに組み込まれ得る。細胞毒性ヌクレオシドとしては、限定はされないが
、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペン
テニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、
１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシ
ン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビ
ン、テガフール及びウラシルの組合せ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テ
トラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサ
シタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）及び
６－メルカプトプリンが挙げられる。さらなる例としては、フルダラビンホスフェート、
Ｎ４－ベヘノイル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１
－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－
２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン及びＰ－４０５５（シタ
ラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。
る他のヌクレオシド間結合が本明細書に記載される。
[0322] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の細胞毒性ヌ
クレオシドを含み得る。例えば、細胞毒性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリ
リボヌクレオチドに組み込まれ得る。細胞毒性ヌクレオシドとしては、限定はされないが
、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペン
テニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、
１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシ
ン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビ
ン、テガフール及びウラシルの組合せ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テ
トラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサ
シタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）及び
６－メルカプトプリンが挙げられる。さらなる例としては、フルダラビンホスフェート、
Ｎ４－ベヘノイル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１
－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－
２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン及びＰ－４０５５（シタ
ラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。
【0235】
[0323] 環状ポリリボヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に修飾されても又はさ
れなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上若しくは全てのタイプ（例えば、天然
ヌクレオチド、プリン又はピリミジン又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのいずれか１つ以上
若しくは全て）は、環状ポリリボヌクレオチドにおいて又はその所与の所定の配列領域に
おいて均一に修飾されても又はされなくてもよい。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、プソイドウリジンを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドは、イノシンを含み、これは、免疫系が、ウイルスＲＮＡに対して内在性であるも
のとして環状ポリリボヌクレオチドを特徴付けることを促進し得る。イノシンの組み込み
は、向上したＲＮＡ安定性／減少した分解も媒介し得る。例えば、全体が参照により援用
されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１
ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１
２８４を参照されたい。
れなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上若しくは全てのタイプ（例えば、天然
ヌクレオチド、プリン又はピリミジン又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのいずれか１つ以上
若しくは全て）は、環状ポリリボヌクレオチドにおいて又はその所与の所定の配列領域に
おいて均一に修飾されても又はされなくてもよい。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、プソイドウリジンを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドは、イノシンを含み、これは、免疫系が、ウイルスＲＮＡに対して内在性であるも
のとして環状ポリリボヌクレオチドを特徴付けることを促進し得る。イノシンの組み込み
は、向上したＲＮＡ安定性／減少した分解も媒介し得る。例えば、全体が参照により援用
されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１
ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１
２８４を参照されたい。
【0236】
[0324] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド（又はその所与の配列）中
の全てのヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、修飾としては、発現を増大
し得るｍ６Ａ；免疫応答を弱め得るイノシン；ＲＮＡ安定性又は翻訳の読み過ごしを増大
し得るプソイドウリジン（スタガー要素）、安定性を増大し得るｍ５Ｃ；及び細胞内転座
（例えば、核局在化）を促進する２，２，７－トリメチルグアノシンが挙げられる。
の全てのヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、修飾としては、発現を増大
し得るｍ６Ａ；免疫応答を弱め得るイノシン；ＲＮＡ安定性又は翻訳の読み過ごしを増大
し得るプソイドウリジン（スタガー要素）、安定性を増大し得るｍ５Ｃ；及び細胞内転座
（例えば、核局在化）を促進する２，２，７－トリメチルグアノシンが挙げられる。
【0237】
[0325] 様々な糖修飾、ヌクレオチド修飾及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨
格構造）が環状ポリリボヌクレオチド中の様々な位置に存在し得る。当業者は、環状ポリ
リボヌクレオチドの機能が実質的に低下されないように、ヌクレオチド類似体又は他の修
飾が環状ポリリボヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることを理解するであろう。修飾
は、非コード領域の修飾でもあり得る。環状ポリリボヌクレオチドは、約１％～約１００
％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に対して又はヌクレオチドの１つ以上のタイ
プ、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ若しくはＣのいずれか１つ以上に対して）又はその間の任意のパ
ーセンテージ（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、
１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～
２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～
９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％
～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％
～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０
％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７
０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％
、９０％～１００％及び９５％～１００％）を含み得る。
格構造）が環状ポリリボヌクレオチド中の様々な位置に存在し得る。当業者は、環状ポリ
リボヌクレオチドの機能が実質的に低下されないように、ヌクレオチド類似体又は他の修
飾が環状ポリリボヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることを理解するであろう。修飾
は、非コード領域の修飾でもあり得る。環状ポリリボヌクレオチドは、約１％～約１００
％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に対して又はヌクレオチドの１つ以上のタイ
プ、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ若しくはＣのいずれか１つ以上に対して）又はその間の任意のパ
ーセンテージ（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、
１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～
２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～
９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％
～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％
～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０
％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７
０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％
、９０％～１００％及び９５％～１００％）を含み得る。
【0238】
構造
[0326] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば二次
又は三次構造を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメ
ントが二本鎖セグメントに折り畳まれ、対間、例えばＡ－Ｕ及びＣ－Ｇの水素結合で結合
される。ある実施形態において、末端ループに連結された二本鎖セグメントを有する、ス
テムとしても知られているらせんが分子内に形成される。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有す
る。ある実施形態において、疑似二本鎖二次構造を有するセグメントは、少なくとも３つ
、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５
、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを有する。ある実施形態において、環状ポリ
リボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、
３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、セグメントは、
３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９
、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、
９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドによって隔てられる。
[0326] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば二次
又は三次構造を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメ
ントが二本鎖セグメントに折り畳まれ、対間、例えばＡ－Ｕ及びＣ－Ｇの水素結合で結合
される。ある実施形態において、末端ループに連結された二本鎖セグメントを有する、ス
テムとしても知られているらせんが分子内に形成される。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有す
る。ある実施形態において、疑似二本鎖二次構造を有するセグメントは、少なくとも３つ
、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５
、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを有する。ある実施形態において、環状ポリ
リボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、
３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、セグメントは、
３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９
、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、
９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドによって隔てられる。
【0239】
[0327] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、実質
的に一本鎖対二本鎖領域を含む。ある実施形態において、一本対二本鎖の比率は、環状ポ
リリボヌクレオチドの機能性に影響を与え得る。
的に一本鎖対二本鎖領域を含む。ある実施形態において、一本対二本鎖の比率は、環状ポ
リリボヌクレオチドの機能性に影響を与え得る。
【0240】
[0328] ある実施形態では、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以
上の配列である。ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチ
ドの１つ以上の配列は、タンパク質－又はＲＮＡ－結合部位を含み得る。ある実施形態に
おいて、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、増大した相互作用を可
能にするために立体配座柔軟性であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドの配列は、結合するか又はタンパク質若しくは核酸結合を増加させるために、この
ような二次構造を含むように意図的に操作される。
上の配列である。ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチ
ドの１つ以上の配列は、タンパク質－又はＲＮＡ－結合部位を含み得る。ある実施形態に
おいて、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、増大した相互作用を可
能にするために立体配座柔軟性であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレ
オチドの配列は、結合するか又はタンパク質若しくは核酸結合を増加させるために、この
ような二次構造を含むように意図的に操作される。
【0241】
[0329] ある実施形態では、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列であ
る。ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上
の配列は、立体配座認識部位、例えばリボスイッチ又はアプタザイムを含み得る。ある実
施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、立体配座的に
固定され得る。あるこのような場合において、立体配座的に固定された配列は、環状ポリ
リボヌクレオチドを、タンパク質又は核酸の結合から立体的に遮蔽し得る。ある実施形態
において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質又は核酸結合を回避又は低減
するために、このような二次構造を含むように意図的に操作される。
る。ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上
の配列は、立体配座認識部位、例えばリボスイッチ又はアプタザイムを含み得る。ある実
施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、立体配座的に
固定され得る。あるこのような場合において、立体配座的に固定された配列は、環状ポリ
リボヌクレオチドを、タンパク質又は核酸の結合から立体的に遮蔽し得る。ある実施形態
において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質又は核酸結合を回避又は低減
するために、このような二次構造を含むように意図的に操作される。
【0242】
[0330] １６の可能な塩基対合があるが、これらの６つ（ＡＵ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＡ、Ｕ
Ｇ、ＣＧ）が実際の塩基対を形成し得る。残りは、ミスマッチと呼ばれ、らせん中に非常
に低い頻度で存在する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの構造は、そ
の機能に対する影響及び致命的な結果なしに容易に破壊することができず、それにより二
次構造を維持する選択を与える。ある実施形態において、ステム（すなわちそれらのヌク
レオチド配列）の一次構造は、らせん領域を依然として維持しながら、依然として変化し
得る。塩基の性質は、より高次の構造に伴い、置換は、それらが二次構造を保つ限り可能
である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する少なく
とも１つのセグメントを有する。ある実施形態において、疑似らせん構造を有するセグメ
ントは、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、
８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドを有する。ある実施形態
において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント
（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、
セグメントは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２
７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０
、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドによって隔てられる。ある実
施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｕリッチ又はＡリッチ配列又はそれらの
組合せの少なくとも１つを含む。ある実施形態において、Ｕリッチ及び／又はＡリッチ配
列は、三重疑似らせん構造を生成し得るように配置される。ある実施形態において、環状
ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２
、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列の少なくとも１つを含む。ある実施形
態において、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列は、三重疑似らせん構造を生成し得るよう
に配置される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、安定化を促進する
分子内三重疑似らせん構造を有する。
Ｇ、ＣＧ）が実際の塩基対を形成し得る。残りは、ミスマッチと呼ばれ、らせん中に非常
に低い頻度で存在する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの構造は、そ
の機能に対する影響及び致命的な結果なしに容易に破壊することができず、それにより二
次構造を維持する選択を与える。ある実施形態において、ステム（すなわちそれらのヌク
レオチド配列）の一次構造は、らせん領域を依然として維持しながら、依然として変化し
得る。塩基の性質は、より高次の構造に伴い、置換は、それらが二次構造を保つ限り可能
である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する
。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する少なく
とも１つのセグメントを有する。ある実施形態において、疑似らせん構造を有するセグメ
ントは、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、
８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドを有する。ある実施形態
において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント
（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、
セグメントは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２
７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０
、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドによって隔てられる。ある実
施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｕリッチ又はＡリッチ配列又はそれらの
組合せの少なくとも１つを含む。ある実施形態において、Ｕリッチ及び／又はＡリッチ配
列は、三重疑似らせん構造を生成し得るように配置される。ある実施形態において、環状
ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２
、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、環状ポリリボ
ヌクレオチドは、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列の少なくとも１つを含む。ある実施形
態において、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列は、三重疑似らせん構造を生成し得るよう
に配置される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、安定化を促進する
分子内三重疑似らせん構造を有する。
【0243】
[0331] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの疑似らせん構造
（例えば、ホスホジエステル結合によって隔てられる）を有し、それらの末端塩基対がス
タックし、疑似らせん構造が同一直線上になり、「同軸上にスタックされた」部分構造を
もたらすようになっている。
（例えば、ホスホジエステル結合によって隔てられる）を有し、それらの末端塩基対がス
タックし、疑似らせん構造が同一直線上になり、「同軸上にスタックされた」部分構造を
もたらすようになっている。
【0244】
[0332] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のモチーフ、
例えばシュードノット、グアニン四重鎖、らせん及び同軸的スタッキングを有する三次構
造を含む。
例えばシュードノット、グアニン四重鎖、らせん及び同軸的スタッキングを有する三次構
造を含む。
【0245】
[0333] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合
部位、例えば少なくとも１つのタンパク質結合部位、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部
位、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｔＲＮＡ結合部位、少な
くとも１つのｒＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つ
のｓｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｐｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎｏ
ＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｅｘＲＮＡ結
合部位、少なくとも１つのｓｃａＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのＹ ＲＮＡ結合部位
、少なくとも１つのｈｎＲＮＡ結合部位及び／又は少なくとも１つのｔＲＮＡモチーフを
有する。
部位、例えば少なくとも１つのタンパク質結合部位、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部
位、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｔＲＮＡ結合部位、少な
くとも１つのｒＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つ
のｓｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｐｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎｏ
ＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｅｘＲＮＡ結
合部位、少なくとも１つのｓｃａＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのＹ ＲＮＡ結合部位
、少なくとも１つのｈｎＲＮＡ結合部位及び／又は少なくとも１つのｔＲＮＡモチーフを
有する。
【0246】
送達
[0334] 本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、送達担体と共に医薬組成
物にも含まれ得る。
[0334] 本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、送達担体と共に医薬組成
物にも含まれ得る。
【0247】
[0335] 本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、医薬担体及び／又はポリマー担
体、例えばリポソームなどの担体を含む製剤であり得、それを必要とする対象（例えば、
ヒト又は非ヒト農用動物又は家畜、例えばウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に公知の方法
によって送達され得る。このような方法としては、限定はされないが、トランスフェクシ
ョン（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；
エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイ
ルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、微量
注入、微粒子銃（「遺伝子銃」）、フゲン（fugene）、直接音波負荷、細胞スクイージン
グ、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグ
ネトフェクション、エクソソーム媒介性移動、脂質ナノ粒子媒介性移動及びそれらの任意
の組合せが挙げられる。送達の方法は、例えば、Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ
Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５、２６（７）：
４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ
ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａ
ｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０にも
記載されている。
体、例えばリポソームなどの担体を含む製剤であり得、それを必要とする対象（例えば、
ヒト又は非ヒト農用動物又は家畜、例えばウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に公知の方法
によって送達され得る。このような方法としては、限定はされないが、トランスフェクシ
ョン（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；
エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイ
ルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、微量
注入、微粒子銃（「遺伝子銃」）、フゲン（fugene）、直接音波負荷、細胞スクイージン
グ、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグ
ネトフェクション、エクソソーム媒介性移動、脂質ナノ粒子媒介性移動及びそれらの任意
の組合せが挙げられる。送達の方法は、例えば、Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ
Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５、２６（７）：
４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ
ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａ
ｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０にも
記載されている。
【0248】
[0336] 本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿
主細胞にさらに関する。ある実施形態において、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌
、真菌、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）又は他の生物若しくは細胞である。
主細胞にさらに関する。ある実施形態において、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌
、真菌、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）又は他の生物若しくは細胞である。
【0249】
[0337] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主において非免疫原
性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば記
載される環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオ
チドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主の免
疫系による応答が減少されるか、又は宿主の免疫系による応答を生成することができない
。いくつかの免疫応答としては、限定はされないが、液性免疫応答（例えば、抗原特異的
抗体の産生）及び細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば記
載される環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオ
チドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主の免
疫系による応答が減少されるか、又は宿主の免疫系による応答を生成することができない
。いくつかの免疫応答としては、限定はされないが、液性免疫応答（例えば、抗原特異的
抗体の産生）及び細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
【0250】
[0338] ある実施形態において、宿主又は宿主細胞が環状ポリリボヌクレオチドと接触
される（例えば、それに送達又は投与される）。ある実施形態において、宿主は、ヒトな
どの哺乳動物である。宿主中の環状ポリリボヌクレオチド、発現産物又はその両方の量は
、投与後の任意の時点で測定され得る。特定の実施形態において、培養物中の宿主成長の
時間経過が決定される。成長が環状ポリリボヌクレオチドの存在下で増加又は減少される
場合、環状ポリリボヌクレオチド若しくは発現産物又はその両方は、宿主の成長を増加又
は減少させるのに有効であると特定される。
される（例えば、それに送達又は投与される）。ある実施形態において、宿主は、ヒトな
どの哺乳動物である。宿主中の環状ポリリボヌクレオチド、発現産物又はその両方の量は
、投与後の任意の時点で測定され得る。特定の実施形態において、培養物中の宿主成長の
時間経過が決定される。成長が環状ポリリボヌクレオチドの存在下で増加又は減少される
場合、環状ポリリボヌクレオチド若しくは発現産物又はその両方は、宿主の成長を増加又
は減少させるのに有効であると特定される。
【0251】
生成の方法
[0339] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換
え技術（以下に詳細に記載される方法、例えばＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得
られる）又は化学合成を用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
[0339] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換
え技術（以下に詳細に記載される方法、例えばＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得
られる）又は化学合成を用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
【0252】
[0340] ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮ
Ａ配列、その修飾形態又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分
子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含む得ることは、本発明の範囲内であ
る。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を
誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメ
ントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択
された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「
構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変
異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
Ａ配列、その修飾形態又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分
子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含む得ることは、本発明の範囲内であ
る。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を
誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメ
ントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択
された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「
構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変
異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
【0253】
[0341] 環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、化学合成及び酵素的合成を
含む任意の利用可能な技術に従って調製され得る。ある実施形態において、線状一次構築
物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポ
リリボヌクレオチドを生成し得る。環状化又はコンカテマー化の機構は、限定はされない
が、化学的、酵素的、スプリントライゲーション）又はリボザイム触媒方法などの方法に
よって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合
であり得る。
含む任意の利用可能な技術に従って調製され得る。ある実施形態において、線状一次構築
物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポ
リリボヌクレオチドを生成し得る。環状化又はコンカテマー化の機構は、限定はされない
が、化学的、酵素的、スプリントライゲーション）又はリボザイム触媒方法などの方法に
よって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合
であり得る。
【0254】
[0342] 本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、
Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ＆Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；Ｚｈａｏ，Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（
Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇ
ｌｉ＆Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒ
ｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗ
ｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ＆Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；Ｚｈａｏ，Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（
Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇ
ｌｉ＆Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒ
ｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗ
ｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
【0255】
[0343] 環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法は、当該技術分野でも記載さ
れている（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６
２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３
号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米
国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号
パンフレット及び国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照されたい）。
れている（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６
２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３
号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米
国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号
パンフレット及び国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照されたい）。
【0256】
[0344] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、生成不純物、例えば遊
離リボ核酸、線状又はニックＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などを除去するために、生成後
にクリーンアップされ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、当該
技術分野において一般的に使用される任意の公知の方法によって精製され得る。非限定的
な精製方法の例としては、カラムクロマトグラフィー、ゲル排除、サイズ排除などが挙げ
られる。
離リボ核酸、線状又はニックＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などを除去するために、生成後
にクリーンアップされ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、当該
技術分野において一般的に使用される任意の公知の方法によって精製され得る。非限定的
な精製方法の例としては、カラムクロマトグラフィー、ゲル排除、サイズ排除などが挙げ
られる。
【0257】
医薬組成物
[0345] 本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物を含む
。医薬組成物１つ以上のさらなる活性物質、例えば治療的及び／又は予防的に活性な物質
を任意選択的に含み得る。本発明の医薬組成物は、滅菌されており且つ／又はパイロジェ
ンフリーであり得る。医薬品の製剤化及び／又は製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａ
ｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，
２００５（参照により本明細書に援用される）に見られる。
[0345] 本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物を含む
。医薬組成物１つ以上のさらなる活性物質、例えば治療的及び／又は予防的に活性な物質
を任意選択的に含み得る。本発明の医薬組成物は、滅菌されており且つ／又はパイロジェ
ンフリーであり得る。医薬品の製剤化及び／又は製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａ
ｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，
２００５（参照により本明細書に援用される）に見られる。
【0258】
[0346] 本明細書において提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に好適
な医薬組成物に関するが、このような組成物は、一般に、任意の他の動物、例えば非ヒト
動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであ
ろう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成
物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとして
も通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。医薬組成物の投
与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；家禽、ニ
ワトリ、カモ、ガチョウ及び／又はシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類を含むウ
シ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラット；及び／又は鳥類などの
商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられる。
な医薬組成物に関するが、このような組成物は、一般に、任意の他の動物、例えば非ヒト
動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであ
ろう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成
物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとして
も通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。医薬組成物の投
与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；家禽、ニ
ワトリ、カモ、ガチョウ及び／又はシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類を含むウ
シ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラット；及び／又は鳥類などの
商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられる。
【0259】
[0347] 本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知で
あるか又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方
法は、有効成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の補助成分と組み合わせて、次に必要に
応じて及び／又は望ましい場合、生成物を分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
あるか又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方
法は、有効成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の補助成分と組み合わせて、次に必要に
応じて及び／又は望ましい場合、生成物を分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
【0260】
発現の方法
[0348] 本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書において提供され
る環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳することを含む方法を含む。
[0348] 本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書において提供され
る環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳することを含む方法を含む。
【0261】
[0349] ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、ポリペプチドへの、
環状ポリリボヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３
０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少
なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の翻訳を含む。ある実施形態に
おいて、タンパク質発現のための方法は、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ
酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少な
くとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なく
とも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくと
も５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも
８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプ
チドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質
発現のための方法は、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸
、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０
アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸
、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸又は約１０００アミノ酸のポ
リペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、本方
法は、本明細書において提供される連続したポリペプチド、本明細書において提供される
別個のポリペプチド又はその両方への環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。
環状ポリリボヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３
０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少
なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の翻訳を含む。ある実施形態に
おいて、タンパク質発現のための方法は、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ
酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少な
くとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なく
とも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくと
も５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも
８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプ
チドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質
発現のための方法は、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸
、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０
アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸
、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸又は約１０００アミノ酸のポ
リペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、本方
法は、本明細書において提供される連続したポリペプチド、本明細書において提供される
別個のポリペプチド又はその両方への環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。
【0262】
[0350] ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は
、ウサギ網状赤血球溶解物など、インビトロで行われる。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、例えば、真核細胞のトランスフェクショ
ン又は細菌などの原核細胞の形質転換後、インビボで行われる。
、ウサギ網状赤血球溶解物など、インビトロで行われる。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、例えば、真核細胞のトランスフェクショ
ン又は細菌などの原核細胞の形質転換後、インビボで行われる。
【0263】
[0351] ある態様において、本開示は、対象における１つ以上の発現配列のインビボ発
現の方法であって、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に
投与する工程と；細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する
工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、後
の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより
多いように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくと
も７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれを超える
期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現が約４０％を超えて低下しないよ
うに構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内における
１つ以上の発現配列の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、
２０、２２、２３日間又はそれを超えて、約４０％を超えて変化しないレベルに維持され
るように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの投与は、本明
細書に記載される任意の送達方法を用いて行われる。ある実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、静脈注射によって対象に投与される。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドの投与としては、限定はされないが、出産前投与、新生児期投与、出
生後投与、経口、注入によるもの（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下及び筋
肉内）、眼内投与及び鼻腔内投与によるものが挙げられる。
現の方法であって、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に
投与する工程と；細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する
工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、後
の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより
多いように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくと
も７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれを超える
期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現が約４０％を超えて低下しないよ
うに構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内における
１つ以上の発現配列の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、
２０、２２、２３日間又はそれを超えて、約４０％を超えて変化しないレベルに維持され
るように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの投与は、本明
細書に記載される任意の送達方法を用いて行われる。ある実施形態において、環状ポリリ
ボヌクレオチドは、静脈注射によって対象に投与される。ある実施形態において、環状ポ
リリボヌクレオチドの投与としては、限定はされないが、出産前投与、新生児期投与、出
生後投与、経口、注入によるもの（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下及び筋
肉内）、眼内投与及び鼻腔内投与によるものが挙げられる。
【0264】
[0352] ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、翻訳産物の修飾、折
り畳み又は他の翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法
は、例えば、細胞機構を介したインビボでの翻訳後修飾を含む。
り畳み又は他の翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法
は、例えば、細胞機構を介したインビボでの翻訳後修飾を含む。
【0265】
[0353] 本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物は、参照により本明細書に援
用される。
[0354] 上述される実施形態は、上記の機能特性を得るために組み合わされ得る。これ
は、得られる例示的な組合せ及び機能特性を記載する以下の実施例によっても示される。
表１は、上述される様々な要素がどのように組み合わされ得るか、及び観察される機能特
性を示す例示的な概要を示す。
用される。
[0354] 上述される実施形態は、上記の機能特性を得るために組み合わされ得る。これ
は、得られる例示的な組合せ及び機能特性を記載する以下の実施例によっても示される。
表１は、上述される様々な要素がどのように組み合わされ得るか、及び観察される機能特
性を示す例示的な概要を示す。
【0266】
【表1-1】
【0267】
【表1-2】
【実施例0268】
[0355] 以下の実施例は、本発明のある実施形態をさらに例示するために提供されるが
、本発明の範囲を限定することを意図されておらず；それらの例示的な性質により、当業
者に公知の他の手順、方法又は技術が代わりに使用され得ることが理解されるであろう。
、本発明の範囲を限定することを意図されておらず；それらの例示的な性質により、当業
者に公知の他の手順、方法又は技術が代わりに使用され得ることが理解されるであろう。
【0269】
実施例１：インビトロ環状ＲＮＡ生成
[0356] この実施例は、環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
[0356] この実施例は、環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
【0270】
[0357] 図２に示されるように、環状ＲＮＡは、開始コドン（配列番号１）、ＯＲＦ（
配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＩＲ
ＥＳ（配列番号５）を用いて設計される。環状化は、ローリングサークル型翻訳、別個の
ＯＲＦ発現及び制御されたタンパク質化学量論のための交互のスタガー要素を有する複数
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＲＮＡ免疫原性を弱めるか又は軽減するた
めのエンクリプトゲン及びポリ－Ａ配列なしでリボソーム進入のためのＲＮＡを標的にす
る任意選択のＩＲＥＳを可能にする。
配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＩＲ
ＥＳ（配列番号５）を用いて設計される。環状化は、ローリングサークル型翻訳、別個の
ＯＲＦ発現及び制御されたタンパク質化学量論のための交互のスタガー要素を有する複数
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＲＮＡ免疫原性を弱めるか又は軽減するた
めのエンクリプトゲン及びポリ－Ａ配列なしでリボソーム進入のためのＲＮＡを標的にす
る任意選択のＩＲＥＳを可能にする。
【0271】
[0358] この実施例において、環状ＲＮＡは、以下のように生成される。非修飾線状Ｒ
ＮＡは、５’－及び３’－ＺＫＳＣＡＮ１イントロン及び２Ａ配列に連結されたＧＦＰを
コードするＯＲＦを有するＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてイ
ンビトロ転写によって合成される。転写されたＲＮＡがＲＮＡ精製システム（キアゲン）
を用いて精製され、製造業者の説明に従ってアルカリホスファターゼ（サーモフィッシャ
ーサイエンティフィック、ＥＦ０６５２）で処理され、ＲＮＡ精製システムを用いて再度
精製される。
ＮＡは、５’－及び３’－ＺＫＳＣＡＮ１イントロン及び２Ａ配列に連結されたＧＦＰを
コードするＯＲＦを有するＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてイ
ンビトロ転写によって合成される。転写されたＲＮＡがＲＮＡ精製システム（キアゲン）
を用いて精製され、製造業者の説明に従ってアルカリホスファターゼ（サーモフィッシャ
ーサイエンティフィック、ＥＦ０６５２）で処理され、ＲＮＡ精製システムを用いて再度
精製される。
【0272】
[0359] スプリントライゲーション環状ＲＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）を用いて転写された線状ＲＮＡ及びＤ
ＮＡスプリントの処理によって生成され、環状ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｒ処理による富化
後、単離される。ＲＮＡ品質がアガロースゲル又は自動化電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）に
よって評価される。
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）を用いて転写された線状ＲＮＡ及びＤ
ＮＡスプリントの処理によって生成され、環状ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｒ処理による富化
後、単離される。ＲＮＡ品質がアガロースゲル又は自動化電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）に
よって評価される。
【0273】
実施例２：インビボ環状ＲＮＡ生成、細胞培養
[0360] この実施例は、環状ＲＮＡのインビボ生成を実証する。
[0360] この実施例は、環状ＲＮＡのインビボ生成を実証する。
【0274】
[0361] ＧＦＰ（配列番号２）が発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ａｄ
ｄｇｅｎｅ）（配列番号６）にクローニングされる。図３に示されるように、このベクタ
ーは、細胞内での環状ＲＮＡ生成を誘発するように突然変異誘発される（配列番号６及び
Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５によって記載される）。
ｄｇｅｎｅ）（配列番号６）にクローニングされる。図３に示されるように、このベクタ
ーは、細胞内での環状ＲＮＡ生成を誘発するように突然変異誘発される（配列番号６及び
Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５によって記載される）。
【0275】
[0362] ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎仔血清
が補充された、高グルコース（ライフテクノロジーズ）を含むダルベッコ改変イーグル培
地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。１μｇの上記の発現
プラスミドを、脂質トランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズ）を用いてトラン
スフェクトし、トランスフェクト細胞からの全ＲＮＡを、トランスフェクションの１時間
～２０日後、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離試薬（ライフテクノロジー
ズ）を用いて単離する。
が補充された、高グルコース（ライフテクノロジーズ）を含むダルベッコ改変イーグル培
地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。１μｇの上記の発現
プラスミドを、脂質トランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズ）を用いてトラン
スフェクトし、トランスフェクト細胞からの全ＲＮＡを、トランスフェクションの１時間
～２０日後、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離試薬（ライフテクノロジー
ズ）を用いて単離する。
【0276】
[0363] ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、ランダムヘキサマー
を用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。要するに、ＲＴ－ｑＰＣＲのために、同じ供給源か
らのＨｅｌａ細胞の全ＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｒ－消化ＲＮＡがＲＴ－ＰＣＲのための鋳
型として使用される。ＧＦＰ ｍＲＮＡ及び環状ＧＦＰ ＲＮＡのｃＤＮＡを調製するた
めに、逆転写反応は、製造業者の説明に従って逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ－Ｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ：ＲＮａｓｅ Ｈ；インビトロジェン）及びランダムヘキサマーを用いて行われる。
増幅されたＰＣＲ産物が６％のＰＡＧＥを用いて分析され、臭化エチジウム染色によって
視覚化される。富化因子を推定するために、ＰＣＲ産物がデンシトメトリー（Ｉｍａｇｅ
Ｑｕａｎｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量化され、全ＲＮＡサ
ンプルの濃度がＵＶ吸光度によって測定される。
を用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。要するに、ＲＴ－ｑＰＣＲのために、同じ供給源か
らのＨｅｌａ細胞の全ＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｒ－消化ＲＮＡがＲＴ－ＰＣＲのための鋳
型として使用される。ＧＦＰ ｍＲＮＡ及び環状ＧＦＰ ＲＮＡのｃＤＮＡを調製するた
めに、逆転写反応は、製造業者の説明に従って逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ－Ｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ：ＲＮａｓｅ Ｈ；インビトロジェン）及びランダムヘキサマーを用いて行われる。
増幅されたＰＣＲ産物が６％のＰＡＧＥを用いて分析され、臭化エチジウム染色によって
視覚化される。富化因子を推定するために、ＰＣＲ産物がデンシトメトリー（Ｉｍａｇｅ
Ｑｕａｎｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量化され、全ＲＮＡサ
ンプルの濃度がＵＶ吸光度によって測定される。
【0277】
[0364] さらなるＲＮＡ測定がノーザンブロット分析を用いて行われる。簡潔には、全
細胞抽出物を、フェノール系試薬（ＴＲＩｚｏｌ）を用いて得るか、又は核及び細胞質タ
ンパク質抽出物を市販のキット（ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＮｕＣＬＥＡＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔ、シグマ）を用いて細胞の分画によって得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写
を阻害するために、細胞を３７℃で０～６時間にわたってフラボピリドール（１ｍＭの最
終濃度；シグマ）で処理する。ＲＮａｓｅ Ｒ処理のために、１０ｍｇの全ＲＮＡを３７
℃で１時間にわたって２０ＵのＲＮａｓｅ Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理する。
細胞抽出物を、フェノール系試薬（ＴＲＩｚｏｌ）を用いて得るか、又は核及び細胞質タ
ンパク質抽出物を市販のキット（ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＮｕＣＬＥＡＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔ、シグマ）を用いて細胞の分画によって得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写
を阻害するために、細胞を３７℃で０～６時間にわたってフラボピリドール（１ｍＭの最
終濃度；シグマ）で処理する。ＲＮａｓｅ Ｒ処理のために、１０ｍｇの全ＲＮＡを３７
℃で１時間にわたって２０ＵのＲＮａｓｅ Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理する。
【0278】
[0365] オリゴヌクレオチドプローブを用いたノーザンブロットが以下のように行われ
る。オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲプライマーが標準的なプライマー設計ツールを
用いて設計される。Ｔ７プロモータ配列がリバースプライマーに加えられて、インビトロ
転写反応におけるアンチセンスプローブが得られる。インビトロ転写は、製造業者の説明
に従ってＤＩＧ－ＲＮＡ標識用ミックスを用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて行
われる。ＤＮＡ鋳型がＤＮＡ Ｉ消化によって除去され、ＲＮＡプローブがフェノールク
ロロホルム抽出及びその後の沈殿によって精製される。プローブは、５０ｎｇ／ｍｌで使
用される。全ＲＮＡ（２μｇ～１０μｇ）を、グリオキサールローディングダイ（アンビ
オン）を用いて変性させ、ＭＯＰＳ緩衝液中１．２％のアガロースゲル上で分解させる。
ゲルを２０分間にわたって１×ＴＢＥに浸漬させ、セミドライブロッティングシステム（
バイオラッド）を用いて１時間（１５Ｖ）にわたってＨｙｂｏｎｄ－Ｎ＋膜（ＧＥヘルス
ケア）に移す。膜を乾燥させ、１２０，０００μＪ／ｃｍ２で１回、（２６５ｎｍで）Ｕ
Ｖ架橋させる。プレハイブリダイゼーションを１時間にわたって６８℃で行い、ＤＩＧで
標識したインビトロで転写されたＲＮＡプローブを一晩ハイブリダイズする。膜を３０分
間にわたって６８℃において２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３回洗浄した後、６８℃に
おいて０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３０分間３回洗浄する。免疫検出は、アルカ
リホスファターゼ抗体と直接共役された抗ＤＩＧを用いて行われる。免疫活性ビースは、
化学発光アルカリホスファターゼ基質（ＣＤＰ ｓｔａｒ試薬）並びに画像検出及び定量
化システムＬＡＳ－４０００検出システム）を用いて視覚化される。
る。オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲプライマーが標準的なプライマー設計ツールを
用いて設計される。Ｔ７プロモータ配列がリバースプライマーに加えられて、インビトロ
転写反応におけるアンチセンスプローブが得られる。インビトロ転写は、製造業者の説明
に従ってＤＩＧ－ＲＮＡ標識用ミックスを用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて行
われる。ＤＮＡ鋳型がＤＮＡ Ｉ消化によって除去され、ＲＮＡプローブがフェノールク
ロロホルム抽出及びその後の沈殿によって精製される。プローブは、５０ｎｇ／ｍｌで使
用される。全ＲＮＡ（２μｇ～１０μｇ）を、グリオキサールローディングダイ（アンビ
オン）を用いて変性させ、ＭＯＰＳ緩衝液中１．２％のアガロースゲル上で分解させる。
ゲルを２０分間にわたって１×ＴＢＥに浸漬させ、セミドライブロッティングシステム（
バイオラッド）を用いて１時間（１５Ｖ）にわたってＨｙｂｏｎｄ－Ｎ＋膜（ＧＥヘルス
ケア）に移す。膜を乾燥させ、１２０，０００μＪ／ｃｍ２で１回、（２６５ｎｍで）Ｕ
Ｖ架橋させる。プレハイブリダイゼーションを１時間にわたって６８℃で行い、ＤＩＧで
標識したインビトロで転写されたＲＮＡプローブを一晩ハイブリダイズする。膜を３０分
間にわたって６８℃において２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３回洗浄した後、６８℃に
おいて０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３０分間３回洗浄する。免疫検出は、アルカ
リホスファターゼ抗体と直接共役された抗ＤＩＧを用いて行われる。免疫活性ビースは、
化学発光アルカリホスファターゼ基質（ＣＤＰ ｓｔａｒ試薬）並びに画像検出及び定量
化システムＬＡＳ－４０００検出システム）を用いて視覚化される。
【0279】
実施例３：環状ＲＮＡの調製及びインビトロ翻訳
[0366] この実施例は、環状ＲＮＡからの遺伝子産物の遺伝子発現及び検出を実証する
。
[0366] この実施例は、環状ＲＮＡからの遺伝子産物の遺伝子発現及び検出を実証する
。
【0280】
[0367] この実施例において、環状ＲＮＡは、開始コドン（配列番号１）、ＧＦＰ Ｏ
ＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、ヒト由来エンクリプトゲン（配列番
号４）を用いて、且つＩＲＥＳ（配列番号５）を用いて若しくは用いずに設計される（図
４を参照されたい）。この実施例において、環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載される
ように、インビトロで又は細胞内で生成される。
ＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、ヒト由来エンクリプトゲン（配列番
号４）を用いて、且つＩＲＥＳ（配列番号５）を用いて若しくは用いずに設計される（図
４を参照されたい）。この実施例において、環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載される
ように、インビトロで又は細胞内で生成される。
【0281】
[0368] 環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ、米国ウイス
コンシン州フィッツバーグ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終
組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０
μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（
東洋紡、大阪）を含む。アリコートを混合物から取り、１０～２０％の勾配のポリアクリ
ルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（アトー、東京）上で分離させる。上
清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐ
Ｈ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２－メルカプトエタノール、０
．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタン
パク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される
。
コンシン州フィッツバーグ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終
組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０
μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（
東洋紡、大阪）を含む。アリコートを混合物から取り、１０～２０％の勾配のポリアクリ
ルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（アトー、東京）上で分離させる。上
清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐ
Ｈ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２－メルカプトエタノール、０
．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタン
パク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される
。
【0282】
[0369] ５分間にわたる１，４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配の
ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（バイオラッド）がサイズマ
ーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜
（ミリポア）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）
を用いて視覚化される。
ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（バイオラッド）がサイズマ
ーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜
（ミリポア）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）
を用いて視覚化される。
【0283】
[0370] ＧＦＰタンパク質が細胞溶解物中で視覚化され、ローリングサークル型翻訳の
結果として、線状ＲＮＡより環状ＲＮＡ中で多い量で検出されることが予測される。
結果として、線状ＲＮＡより環状ＲＮＡ中で多い量で検出されることが予測される。
【0284】
実施例４：環状ＲＮＡからの化学量論的タンパク質発現
[0371] この実施例は、タンパク質を化学量論的に発現する環状ＲＮＡの能力を実証す
る。
[0371] この実施例は、タンパク質を化学量論的に発現する環状ＲＮＡの能力を実証す
る。
【0285】
[0372] この実施例において、１つの環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）
及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）及びＲＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号
８）を、ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むよ
うに設計される（図５を参照されたい）。別の環状ＲＮＡが同様に設計されるが、隣接す
る２Ａ配列の代わりに、それは、ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦ間に終止及び開始コドンを有
する。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生
成される。
及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）及びＲＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号
８）を、ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むよ
うに設計される（図５を参照されたい）。別の環状ＲＮＡが同様に設計されるが、隣接す
る２Ａ配列の代わりに、それは、ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦ間に終止及び開始コドンを有
する。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生
成される。
【0286】
[0373] 環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ、米国ウイス
コンシン州フィッツバーグ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終
組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０
μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（
東洋紡、大阪）を含む。アリコートを混合物から取り、１０～２０％の勾配のポリアクリ
ルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（アトー、東京）上で分離させる。上
清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐ
Ｈ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２－メルカプトエタノール、０
．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタン
パク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される
。
コンシン州フィッツバーグ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終
組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０
μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（
東洋紡、大阪）を含む。アリコートを混合物から取り、１０～２０％の勾配のポリアクリ
ルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（アトー、東京）上で分離させる。上
清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐ
Ｈ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２－メルカプトエタノール、０
．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタン
パク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される
。
【0287】
[0374] ５分間にわたる１，４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配の
ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（バイオラッド）がサイズマ
ーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜
（ミリポア）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）
を用いて視覚化される。
ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（バイオラッド）がサイズマ
ーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜
（ミリポア）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）
を用いて視覚化される。
【0288】
[0375] ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦが終止及び開始コドンによって隔てられていない環
状ＲＮＡは、いずれのタンパク質も等量で有する一方、ＯＲＦ間に開始及び終止コドンを
含む環状ＲＮＡで処理された細胞は、いずれのタンパク質も異なる量で有することが予測
される。
状ＲＮＡは、いずれのタンパク質も等量で有する一方、ＯＲＦ間に開始及び終止コドンを
含む環状ＲＮＡで処理された細胞は、いずれのタンパク質も異なる量で有することが予測
される。
【0289】
実施例５：細胞培養物における非免疫原性
[0376] この実施例は、細胞感染後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を実証する
。
[0376] この実施例は、細胞感染後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を実証する
。
【0290】
[0377] この実施例において、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン、例えばＺＫＳＣＡＮ
１イントロン及びＧＦＰ ＯＲＦを含むように設計される。さらに、対照環状ＲＮＡは、
イントロンを含むか又は含まずに、ＧＦＰ ＯＲＦを含むように設計される（図６を参照
されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞
内で生成される。ＨｅＬａ細胞が５００ｎｇの環状ＲＮＡでトランスフェクトされる。
１イントロン及びＧＦＰ ＯＲＦを含むように設計される。さらに、対照環状ＲＮＡは、
イントロンを含むか又は含まずに、ＧＦＰ ＯＲＦを含むように設計される（図６を参照
されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞
内で生成される。ＨｅＬａ細胞が５００ｎｇの環状ＲＮＡでトランスフェクトされる。
【0291】
[0378] 環状ＲＮＡのトランスフェクションは、以下の条件を含む：（１）細胞培養培
地中の裸の環状ＲＮＡ（Ｌｉｎｇｏｒ ｅｔ ａｌ ２００４）；（２）エレクトロポレ
ーション（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５）；（３）カチオン性脂質（ＳＮＡＬＰ
、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）（Ｃｈｅｓｎｏｙ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，２０００）；（３）カ
チオン性ポリマー（ＰＥＩ、ポリブレン、ＤＥＡＥ－デキストラン）（Ｔｕｒｂｏｆｅｃ
ｔ）；（４）ウイルス様粒子（ＨＰＶからのＬ１、ポリオーマウイルスからのＶＰ１）（
Ｔｏｎｇｅｓ ｅｔ ａｌ ２００６）；（５）エクソソーム（ＳＢＩからのＥｘｏ－Ｆ
ｅｃｔ）；（６）ナノ構造リン酸カルシウム（ナノＣａＰ）（Ｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ
２００６）；（６）ペプチド形質導入ドメイン（ＴＡＴ、ポリＲ、ＳＰ、ｐＶＥＣ、Ｓｙ
ｎＢ１など）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００９）；（７）小胞（ＶＳＶ－Ｇ、ＴＡＭ
ＥＬ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ ２０１７）；（８）細胞スクイージング；（ＳＱＺ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（９）ナノ粒子（Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ ２０１６
）；及び／又は（１０）マグネトフェクション（Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ ２００９）。ト
ランスフェクション方法が細胞培養培地（ＤＭＥＭ １０％のＦＢＳ）中で行われ、細胞
が、その後、２４～４８時間にわたって培養される。
地中の裸の環状ＲＮＡ（Ｌｉｎｇｏｒ ｅｔ ａｌ ２００４）；（２）エレクトロポレ
ーション（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５）；（３）カチオン性脂質（ＳＮＡＬＰ
、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）（Ｃｈｅｓｎｏｙ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，２０００）；（３）カ
チオン性ポリマー（ＰＥＩ、ポリブレン、ＤＥＡＥ－デキストラン）（Ｔｕｒｂｏｆｅｃ
ｔ）；（４）ウイルス様粒子（ＨＰＶからのＬ１、ポリオーマウイルスからのＶＰ１）（
Ｔｏｎｇｅｓ ｅｔ ａｌ ２００６）；（５）エクソソーム（ＳＢＩからのＥｘｏ－Ｆ
ｅｃｔ）；（６）ナノ構造リン酸カルシウム（ナノＣａＰ）（Ｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ
２００６）；（６）ペプチド形質導入ドメイン（ＴＡＴ、ポリＲ、ＳＰ、ｐＶＥＣ、Ｓｙ
ｎＢ１など）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００９）；（７）小胞（ＶＳＶ－Ｇ、ＴＡＭ
ＥＬ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ ２０１７）；（８）細胞スクイージング；（ＳＱＺ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（９）ナノ粒子（Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ ２０１６
）；及び／又は（１０）マグネトフェクション（Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ ２００９）。ト
ランスフェクション方法が細胞培養培地（ＤＭＥＭ １０％のＦＢＳ）中で行われ、細胞
が、その後、２４～４８時間にわたって培養される。
【0292】
[0379] トランスフェクションの２～４８時間後、培地が除去され、示されるＲＮＡ及
びトランスフェクトされたＲＮＡの相対的発現がｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。
[0380] ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の場合、全ＲＮＡは、製造業者の説明に従ってフェノール
系ＲＮＡ単離溶液（ＴＲＩｚｏｌ）及びＲＮＡ（キアゲン）を用いて、細胞から単離され
る。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＰＣＲマスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹ
ＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（Ｌ
ｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて３連で行われる。ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡ
Ｓ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子のｍＲＮＡレベルが定量化され、
アクチン、ＧＡＰＤＨ又はＨＰＲＴ値に対して正規化される。環状ＲＮＡトランスフェク
ションについての示されるＲＮＡ遺伝子の相対的発現は、トランスフェクトされたＲＮＡ
のレベルによって正規化され、エンクリプトゲンを含有しない環状ＲＮＡトランスフェク
ションによる細胞の発現レベルと比較される。
びトランスフェクトされたＲＮＡの相対的発現がｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。
[0380] ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の場合、全ＲＮＡは、製造業者の説明に従ってフェノール
系ＲＮＡ単離溶液（ＴＲＩｚｏｌ）及びＲＮＡ（キアゲン）を用いて、細胞から単離され
る。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＰＣＲマスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹ
ＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（Ｌ
ｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて３連で行われる。ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡ
Ｓ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子のｍＲＮＡレベルが定量化され、
アクチン、ＧＡＰＤＨ又はＨＰＲＴ値に対して正規化される。環状ＲＮＡトランスフェク
ションについての示されるＲＮＡ遺伝子の相対的発現は、トランスフェクトされたＲＮＡ
のレベルによって正規化され、エンクリプトゲンを含有しない環状ＲＮＡトランスフェク
ションによる細胞の発現レベルと比較される。
【0293】
[0381] ｑＲＴ－ＰＣＲ分析に加えて、実施例４に上述されるように、ウエスタンブロ
ット分析及び免疫組織化学を用いて、ＧＦＰ発現効率を評価する。
[0382] エンクリプトゲンを含有するＧＦＰ陽性細胞は、弱められた免疫原性応答を示
すことが予測される。
ット分析及び免疫組織化学を用いて、ＧＦＰ発現効率を評価する。
[0382] エンクリプトゲンを含有するＧＦＰ陽性細胞は、弱められた免疫原性応答を示
すことが予測される。
【0294】
[0383] さらに、（１）初代マウス樹枝状細胞；（２）ＴＬＲ－７、８又は９を安定的
に発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）；（３）単球由来樹枝状細胞（
ＡｌｌＣｅｌｌｓ）、又は（４）Ｒａｗ ２６４．７細胞は、上述されるようにＧＦＰを
コードする環状ＲＮＡを生成するＺＫＳＣＡＮ１又はｔｄイントロンを含むＤＮＡプラス
ミドでトランスフェクトされる。トランスフェクションの６～４８時間後、細胞培養物上
清が収集され、サイトカイン発現がＥＬＩＳＡを用いて測定される。細胞培養物上清が収
集されるとき、細胞がノーザンブロット、遺伝子発現アレイ及びＦＡＣＳ分析のために収
集される。
に発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）；（３）単球由来樹枝状細胞（
ＡｌｌＣｅｌｌｓ）、又は（４）Ｒａｗ ２６４．７細胞は、上述されるようにＧＦＰを
コードする環状ＲＮＡを生成するＺＫＳＣＡＮ１又はｔｄイントロンを含むＤＮＡプラス
ミドでトランスフェクトされる。トランスフェクションの６～４８時間後、細胞培養物上
清が収集され、サイトカイン発現がＥＬＩＳＡを用いて測定される。細胞培養物上清が収
集されるとき、細胞がノーザンブロット、遺伝子発現アレイ及びＦＡＣＳ分析のために収
集される。
【0295】
[0384] ＥＬＩＳＡの場合、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、ケモカイン（Ｃ－
Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ＩＬ－１２（ＢＤバイオサイエンス）、ＩＦＮ－
α、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のた
めのＥＬＩＳＡキットが使用される。ＥＬＩＳＡが製造業者の推奨に従って行われる。環
状ＲＮＡトランスフェクト細胞についての示されるサイトカインの発現が対照ＲＮＡトラ
ンスフェクト細胞のレベルと比較される。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトラン
スフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン
発現を有することが予測される。
Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ＩＬ－１２（ＢＤバイオサイエンス）、ＩＦＮ－
α、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のた
めのＥＬＩＳＡキットが使用される。ＥＬＩＳＡが製造業者の推奨に従って行われる。環
状ＲＮＡトランスフェクト細胞についての示されるサイトカインの発現が対照ＲＮＡトラ
ンスフェクト細胞のレベルと比較される。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトラン
スフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン
発現を有することが予測される。
【0296】
[0385] ノーザンブロット分析の場合。サンプルを処理し、上述されるように分析する
。プローブは、プラスミドから得られ、ヒトＩＦＮ－α １３、ＩＦＮ－β（Ｏｐｅｎ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ－α又はＧＡＰＤＨ（ＡＴＣＣ）のコード領域に特異的
である。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照ト
ランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン発現を有することが予測される。
。プローブは、プラスミドから得られ、ヒトＩＦＮ－α １３、ＩＦＮ－β（Ｏｐｅｎ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ－α又はＧＡＰＤＨ（ＡＴＣＣ）のコード領域に特異的
である。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照ト
ランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン発現を有することが予測される。
【0297】
[0386] 遺伝子発現アレイの場合、ＲＮＡがフェノール系溶液（ＴＲＩｚｏｌ）及び／
又はＲＮＡ単離キット（ＲＮｅａｓｙ、キアゲン）を用いて単離される。ＲＮＡを増幅し
、分析する（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ ５００ＧＸ中のＩｌ
ｌｕｍｉｎａヒトＨＴ１２ｖ４チップ）。モック対照処理細胞におけるレベルが増加倍数
の計算のためのベースラインとして使用される。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡで
トランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイト
カイン発現を有することが予測される。
又はＲＮＡ単離キット（ＲＮｅａｓｙ、キアゲン）を用いて単離される。ＲＮＡを増幅し
、分析する（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ ５００ＧＸ中のＩｌ
ｌｕｍｉｎａヒトＨＴ１２ｖ４チップ）。モック対照処理細胞におけるレベルが増加倍数
の計算のためのベースラインとして使用される。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡで
トランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイト
カイン発現を有することが予測される。
【0298】
[0387] ＦＡＣＳ分析の場合、細胞をＣＤ８３（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６に対する直接共役抗体で染色し
、フローサイトメーターにおいて分析する。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトラ
ンスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して、これらのマーカーの
低下された発現を示すことが予測される。
ｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６に対する直接共役抗体で染色し
、フローサイトメーターにおいて分析する。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトラ
ンスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して、これらのマーカーの
低下された発現を示すことが予測される。
【0299】
実施例６：選択的発現のためのリボスイッチ
[0388] この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからのタンパク質発現を制御する能力を
実証する。
[0388] この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからのタンパク質発現を制御する能力を
実証する。
【0300】
[0389] この実施例では、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）、ＧＦＰを
コードするＯＲＦ（配列番号２）の発現を調節する合成リボスイッチ（配列番号９）を、
ＧＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（２Ａ配列）（配列番号３）と共に含むように設
計される（図７を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、
インビトロで又は細胞内で生成される。
コードするＯＲＦ（配列番号２）の発現を調節する合成リボスイッチ（配列番号９）を、
ＧＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（２Ａ配列）（配列番号３）と共に含むように設
計される（図７を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、
インビトロで又は細胞内で生成される。
【0301】
[0390] テオフィリンは、リボスイッチの活性化を誘導して、遺伝子発現のオフスイッ
チをもたらす（Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１０によって記載されるように）
。リボスイッチは、環状ＲＮＡからのＧＦＰ発現を制御することが予測される。テオフィ
リンの存在下でＧＦＰ発現が観察されることは予測されなかった。
チをもたらす（Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１０によって記載されるように）
。リボスイッチは、環状ＲＮＡからのＧＦＰ発現を制御することが予測される。テオフィ
リンの存在下でＧＦＰ発現が観察されることは予測されなかった。
【0302】
[0391] ＨｅＬａ細胞を、テオフィリン依存性合成リボスイッチ（配列番号９）の制御
下でＧＦＰをコードする５００ｎｇの記載される環状ＲＮＡでトランスフェクトして、選
択的発現を評価する。トランスフェクション方法は、実施例５に記載されるとおりである
。
下でＧＦＰをコードする５００ｎｇの記載される環状ＲＮＡでトランスフェクトして、選
択的発現を評価する。トランスフェクション方法は、実施例５に記載されるとおりである
。
【0303】
[0392] ３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間の培養後、細胞を、１ｎＭ～３ｍＭの範囲
の濃度のテオフィリンを用いて及び用いずに処理する。２４時間の連続した培養後、細胞
を室温で１５分間にわたって４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、ブロックし、０．
２％の洗浄剤を含むＰＢＳ中の１０％のＦＢＳを用いて４５分間にわたって透過処理する
。次に、サンプルを、ＧＦＰに対する一次抗体（インビトロジェン）及び１０％のＦＢＳ
及び０．１％の洗浄剤を含むＰＢＳ中のＡｌｅｘａ ４８８及びＤＡＰＩ（インビトロジ
ェン）と共役された二次抗体と共に室温で２時間又は４℃で一晩インキュベートする。次
に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現について分析する。
の濃度のテオフィリンを用いて及び用いずに処理する。２４時間の連続した培養後、細胞
を室温で１５分間にわたって４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、ブロックし、０．
２％の洗浄剤を含むＰＢＳ中の１０％のＦＢＳを用いて４５分間にわたって透過処理する
。次に、サンプルを、ＧＦＰに対する一次抗体（インビトロジェン）及び１０％のＦＢＳ
及び０．１％の洗浄剤を含むＰＢＳ中のＡｌｅｘａ ４８８及びＤＡＰＩ（インビトロジ
ェン）と共役された二次抗体と共に室温で２時間又は４℃で一晩インキュベートする。次
に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現について分析する。
【0304】
実施例７：インビボ発現
[0393] この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからタンパク質を発現する能力を実証す
る。
[0393] この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからタンパク質を発現する能力を実証す
る。
【0305】
[0394] この実施例では、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰ
をコードするＯＲＦ（配列番号２）又はＲＦＰ（配列番号８）又はルシフェラーゼ（配列
番号１０）を、ＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列
番号３）と共に含むように設計される（図８を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１
及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
をコードするＯＲＦ（配列番号２）又はＲＦＰ（配列番号８）又はルシフェラーゼ（配列
番号１０）を、ＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列
番号３）と共に含むように設計される（図８を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１
及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
【0306】
[0395] ６～８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに、３００ｍｇ／ｋｇ（６ｍｇ）の環状Ｒ
ＮＡ（５０μＬ容量）を、本明細書に記載されるＧＦＰ、ＲＦＰ若しくはルシフェラーゼ
ＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）、経口（ＰＯ）
、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）投与によって投与する。動物に単回投与又は３回の
注入（１日目、３日目、５日目）を与える。
ＮＡ（５０μＬ容量）を、本明細書に記載されるＧＦＰ、ＲＦＰ若しくはルシフェラーゼ
ＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）、経口（ＰＯ）
、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）投与によって投与する。動物に単回投与又は３回の
注入（１日目、３日目、５日目）を与える。
【0307】
[0396] 血液、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓及び皮膚注入部位を非投与対照マウスから
、且つ投与の２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８及び２６４時間後の
時点（ｎ＝４匹のマウス／時点）で採取する。血液サンプルを試験の終了時に頸静脈穿刺
から採取する。
、且つ投与の２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８及び２６４時間後の
時点（ｎ＝４匹のマウス／時点）で採取する。血液サンプルを試験の終了時に頸静脈穿刺
から採取する。
【0308】
[0397] 血清及び組織の両方についての環状ＲＮＡ定量化が分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）（
Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮ
Ａ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された
組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量
は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。タンパ
ク質発現（ＲＦＰ又はＧＦＰ）は、前の実施例に記載されるように、各組織におけるＦＡ
ＣＳ又はウエスタンブロットによって評価される。
Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮ
Ａ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された
組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量
は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。タンパ
ク質発現（ＲＦＰ又はＧＦＰ）は、前の実施例に記載されるように、各組織におけるＦＡ
ＣＳ又はウエスタンブロットによって評価される。
【0309】
[0398] ルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与されたマウスの別の群に３ｍｇのルシフェリ
ンを投与の６、２４、４８、７２及び９６時間後の時点で注入し、動物をインビボイメー
ジングシステム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージン
グする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域
リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
ンを投与の６、２４、４８、７２及び９６時間後の時点で注入し、動物をインビボイメー
ジングシステム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージン
グする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域
リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
【0310】
[0399] マウスは、処理された組織においてＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼを発現
することが予測される。
することが予測される。
【0311】
実施例８：インビボ生体内分布
[0400] この実施例は、インビボの環状ＲＮＡの生体内分布を制御及び測定する能力を
実証する。
[0400] この実施例は、インビボの環状ＲＮＡの生体内分布を制御及び測定する能力を
実証する。
【0312】
[0401] この実施例において、マウスを、実施例９に記載されるように、ルシフェラー
ゼをコードする環状ＲＮＡで処理する。要するに、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配
列番号４）及びルシフェラーゼをコードするＯＲＦ（配列番号１０）を、ルシフェラーゼ
ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図９を参照
されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞
内で生成される。
ゼをコードする環状ＲＮＡで処理する。要するに、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配
列番号４）及びルシフェラーゼをコードするＯＲＦ（配列番号１０）を、ルシフェラーゼ
ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図９を参照
されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞
内で生成される。
【0313】
[0402] マウスにルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与し、投与の６、２４、４８、７２及
び９６時間後の時点で３ｍｇのルシフェリンを注入し、動物をインビボイメージングシス
テム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージングする。投
与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、
肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
び９６時間後の時点で３ｍｇのルシフェリンを注入し、動物をインビボイメージングシス
テム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージングする。投
与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、
肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
【0314】
[0403] 血清及び組織の両方についての環状ＲＮＡ定量化が分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）（
Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮ
Ａ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された
組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量
は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。
Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮ
Ａ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された
組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量
は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。
【0315】
[0404] ６～８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの別の群に筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ
）投与によって４つの用量レベル：１０、２、０．４及び０．０８ｍｇでルシフェラーゼ
環状ＲＮＡを投与する（１群当たりｎ＝６）。投与の６、２４、４８、７２及び９６時間
後の時点で動物に３ｍｇのルシフェリンを注入し、インビボイメージングシステム（ＩＶ
ＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージングする。投与の６時間
後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾
臓をエクスビボでイメージングする。また、マウスからの組織を、実施例９に記載される
ように、ルシフェラーゼ発現について評価し、この発現の組織分布を分析する。
）投与によって４つの用量レベル：１０、２、０．４及び０．０８ｍｇでルシフェラーゼ
環状ＲＮＡを投与する（１群当たりｎ＝６）。投与の６、２４、４８、７２及び９６時間
後の時点で動物に３ｍｇのルシフェリンを注入し、インビボイメージングシステム（ＩＶ
ＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージングする。投与の６時間
後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾
臓をエクスビボでイメージングする。また、マウスからの組織を、実施例９に記載される
ように、ルシフェラーゼ発現について評価し、この発現の組織分布を分析する。
【0316】
[0405] マウスは、処理された組織においてルシフェラーゼの発現を示すことが予測さ
れる。
れる。
【0317】
実施例９：インビボでの非免疫原性
[0406] この実施例は、細胞感染後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を実証する
。
[0406] この実施例は、細胞感染後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を実証する
。
【0318】
[0407] この実施例は、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡの投与後の免疫応答の定
量化及び比較を記載している（図１０を参照されたい）。一実施形態において、エンクリ
プトゲンを有する環状ＲＮＡのいずれも、対照と比較して、環状ＲＮＡの１回以上の投与
後、免疫原性応答を低下させる（例えば、対照ＲＮＡの投与と比較して低下させる）。
量化及び比較を記載している（図１０を参照されたい）。一実施形態において、エンクリ
プトゲンを有する環状ＲＮＡのいずれも、対照と比較して、環状ＲＮＡの１回以上の投与
後、免疫原性応答を低下させる（例えば、対照ＲＮＡの投与と比較して低下させる）。
【0319】
[0408] 環状ＲＮＡについての免疫原性の指標は、血清中のサイトカインレベルである
。
[0409] この実施例において、サイトカイン血清濃度が環状ＲＮＡの１回以上の投与後
に調べられる。前の実施例のいずれか１つからの環状ＲＮＡが皮内（ＩＤ）、筋肉内（Ｉ
Ｍ）、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）を介して６～８週齢のＢＡＬＢ
／ｃマウスに投与される。血清が異なるコホートから抜き取られる：エンクリプトゲンを
有する環状ＲＮＡ及びエンクリプトゲンを有さない環状ＲＮＡの注射を全身及び／又は局
所的に注入されたマウス。
。
[0409] この実施例において、サイトカイン血清濃度が環状ＲＮＡの１回以上の投与後
に調べられる。前の実施例のいずれか１つからの環状ＲＮＡが皮内（ＩＤ）、筋肉内（Ｉ
Ｍ）、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）を介して６～８週齢のＢＡＬＢ
／ｃマウスに投与される。血清が異なるコホートから抜き取られる：エンクリプトゲンを
有する環状ＲＮＡ及びエンクリプトゲンを有さない環状ＲＮＡの注射を全身及び／又は局
所的に注入されたマウス。
【0320】
[0410] 採取された血清サンプルをＰＢＳ中で１～１０倍に希釈し、酵素結合免疫吸着
法（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）及
びＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ、ミネソタ州ミネアポリス）により、マウスＩＦＮ－αについて分
析する。
法（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）及
びＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ、ミネソタ州ミネアポリス）により、マウスＩＦＮ－αについて分
析する。
【0321】
[0411] 血清中のサイトカインレベルに加えて、炎症マーカーの発現は、免疫原性の別
の指標である。この実施例において、ビヒクル（環状ＲＮＡなし）、線状ＲＮＡ又は環状
ＲＮＡで処理されたマウスからの脾臓組織を投与の１、４及び２４時間後に採取する。サ
ンプルを、以下の技術、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析、ノーザンブロット又はＦＡＣＳ分析を用い
て分析する。
の指標である。この実施例において、ビヒクル（環状ＲＮＡなし）、線状ＲＮＡ又は環状
ＲＮＡで処理されたマウスからの脾臓組織を投与の１、４及び２４時間後に採取する。サ
ンプルを、以下の技術、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析、ノーザンブロット又はＦＡＣＳ分析を用い
て分析する。
【0322】
[0412] ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の場合、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＴＮ
Ｆ－α及びＰＫＲについてのｍＲＮＡレベルを上述されるように定量化する。
[0413] ノーザンブロット分析の場合。サンプルを処理し、上述されるようにＩＦＮ－
α １３、ＩＦＮ－β（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ－α又はＧＡＰＤＨ
（ＡＴＣＣ）について分析する。
Ｆ－α及びＰＫＲについてのｍＲＮＡレベルを上述されるように定量化する。
[0413] ノーザンブロット分析の場合。サンプルを処理し、上述されるようにＩＦＮ－
α １３、ＩＦＮ－β（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ－α又はＧＡＰＤＨ
（ＡＴＣＣ）について分析する。
【0323】
[0414] ＦＡＣＳ分析の場合、細胞をＣＤ８３に対する直接共役抗体（Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６で染色し
、フローサイトメーターにおいて分析する。
ｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６で染色し
、フローサイトメーターにおいて分析する。
【0324】
[0415] 一実施形態において、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡは、対照ＲＮＡと
比較して、１回又は複数回の投与後、サイトカインレベルを低下させるであろう（ＥＬＩ
ＳＡ、ノーザンブロット、ＦＡＣＳ及び／又はｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される際）。
比較して、１回又は複数回の投与後、サイトカインレベルを低下させるであろう（ＥＬＩ
ＳＡ、ノーザンブロット、ＦＡＣＳ及び／又はｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される際）。
【0325】
実施例１０：環状ＲＮＡは、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む
[0416] この実施例は、環状ＲＮＡが少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む
ことを実証する。
[0416] この実施例は、環状ＲＮＡが少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む
ことを実証する。
【0326】
[0417] この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つにより、ＧＦＰ
ＯＲＦ及びＩＲＥＳを含むように合成される（図１１を参照されたい）。Ｊ２及びＫ１モ
ノクローナル抗体によるドットブロットアッセイを用いて、少なくとも４０ｂｐの長さの
二本鎖ＲＮＡ構造を測定する。環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）をナイロン膜（スーパーチャー
ジ（supercharged）Ｎｙｔｒａｎ）上にブロッティングし、乾燥させ、ＴＢＳ－Ｔ緩衝
液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０
、ｐＨ７．４）中５％の脱脂粉乳でブロックし、６０分間にわたってｄｓＲＮＡ特異的ｍ
Ａｂ Ｊ２又はＫ１（Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）
と共にインキュベートする。膜をＴＢＳ－Ｔで６回洗浄し、次にＨＲＰ共役ロバ抗マウス
Ｉｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で処理し、次に６回洗浄し、ドットを、
増強化学発光ウエスタンブロット検出試薬（アマシャム）を用いて視覚化する。
ＯＲＦ及びＩＲＥＳを含むように合成される（図１１を参照されたい）。Ｊ２及びＫ１モ
ノクローナル抗体によるドットブロットアッセイを用いて、少なくとも４０ｂｐの長さの
二本鎖ＲＮＡ構造を測定する。環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）をナイロン膜（スーパーチャー
ジ（supercharged）Ｎｙｔｒａｎ）上にブロッティングし、乾燥させ、ＴＢＳ－Ｔ緩衝
液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０
、ｐＨ７．４）中５％の脱脂粉乳でブロックし、６０分間にわたってｄｓＲＮＡ特異的ｍ
Ａｂ Ｊ２又はＫ１（Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）
と共にインキュベートする。膜をＴＢＳ－Ｔで６回洗浄し、次にＨＲＰ共役ロバ抗マウス
Ｉｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で処理し、次に６回洗浄し、ドットを、
増強化学発光ウエスタンブロット検出試薬（アマシャム）を用いて視覚化する。
【0327】
[0418] 環状ＲＮＡは、内部の疑似二本鎖ＲＮＡセグメントを生成することが予測され
る。
る。
【0328】
[0419] 実施例１１：環状ＲＮＡは、疑似二本鎖構造を含む
[0420] この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖構造を含むことを実証する。
[0420] この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖構造を含むことを実証する。
【0329】
[0421] この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶｍｉｎの発現の追加を伴って及び
伴わずに、上述される方法の１つによって合成される（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２
０１４）。このＲＮＡ配列は、疑似らせん構造を形成し（図１２を参照されたい）、陽性
対照として使用される（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４によって示されるように
）。
伴わずに、上述される方法の１つによって合成される（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２
０１４）。このＲＮＡ配列は、疑似らせん構造を形成し（図１２を参照されたい）、陽性
対照として使用される（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４によって示されるように
）。
【0330】
[0422] 環状ＲＮＡ構造が機能的疑似二本鎖構造を含むかどうかを試験するために、本
発明者らは、プライマー伸長（ＳＨＡＰＥ）によって分析される選択的２’ＯＨアシル化
を用いて二次構造を決定する。ＳＨＡＰＥは、単一ヌクレオチド分解におけるＲＮＡの局
所的骨格柔軟性を評価する。ＳＨＡＰＥ求電子剤に対する塩基位置の反応性は、二次構造
に関連している：塩基対合された位置は、反応性が弱く、非対合位置は、より反応性が高
い。
発明者らは、プライマー伸長（ＳＨＡＰＥ）によって分析される選択的２’ＯＨアシル化
を用いて二次構造を決定する。ＳＨＡＰＥは、単一ヌクレオチド分解におけるＲＮＡの局
所的骨格柔軟性を評価する。ＳＨＡＰＥ求電子剤に対する塩基位置の反応性は、二次構造
に関連している：塩基対合された位置は、反応性が弱く、非対合位置は、より反応性が高
い。
【0331】
[0423] ＳＨＡＰＥが環状ＲＮＡ、ＨＤＶｍｉｎ及び線状ＲＮＡにおいて行われる。Ｓ
ＨＡＰＥは、それぞれＷｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００６及びＧｒｉｆｆｉｎ
２０１４ ｅｔ ａｌによって本質的に報告されるＮ－メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ
）又はシアン化ベンゾイル（ＢｚＣＮ）を用いて行われる。ＢｚＣＮを用いたＳＨＡＰＥ
について簡潔に述べると、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１μｌの８００ｍＭの
ＢｚＣＮを、１６０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１Ｕ／ｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、
ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ ＲＮａｓｅ阻害剤）中の３～６ｐｍｏｌのＲＮＡを含有する２０
μｌの反応混合物に加え、３７℃で１分間インキュベートする。対照反応混合物は、Ｂｚ
ＣＮなしで１μｌのＤＭＳＯを含む。ＢｚＣＮとのインキュベーション後、ＲＮＡをフェ
ノールクロロホルムで抽出し、製造業者によって指示されるように精製し（例えば、ＲＮ
Ａ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５キットを用いて）、６μｌの１０ｍＭの
トリス、ｐＨ８．０中で再懸濁させる。一染料系を用いて、ＢｚＣＮ付加物を検出する。
ＲＮＡを、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）で標識されたプライマーでアニ
ールする。プライマー伸長は、インキュベーション条件に対する以下の変更を伴い、製造
業者の推奨に従って逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、インビトロジェン）
を用いて行われる：４２℃で５分、５５℃で３０分、６５℃で２５分及び７５℃で１５分
。２つのシーケンシングラダーは、プライマー伸長反応において０．５ｍＭのｄｄＡＴＰ
又は０．５ｍＭのｄｄＣＴＰのいずれかを用いて生成される。プライマー伸長産物をエタ
ノールで沈殿させ、洗浄して、過剰な塩を除去し、市販のサイズ標準（例えば、Ｌｉｚサ
イズ標準Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）と共
にキャピラリー電気泳動によって分解する。
ＨＡＰＥは、それぞれＷｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００６及びＧｒｉｆｆｉｎ
２０１４ ｅｔ ａｌによって本質的に報告されるＮ－メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ
）又はシアン化ベンゾイル（ＢｚＣＮ）を用いて行われる。ＢｚＣＮを用いたＳＨＡＰＥ
について簡潔に述べると、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１μｌの８００ｍＭの
ＢｚＣＮを、１６０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１Ｕ／ｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、
ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ ＲＮａｓｅ阻害剤）中の３～６ｐｍｏｌのＲＮＡを含有する２０
μｌの反応混合物に加え、３７℃で１分間インキュベートする。対照反応混合物は、Ｂｚ
ＣＮなしで１μｌのＤＭＳＯを含む。ＢｚＣＮとのインキュベーション後、ＲＮＡをフェ
ノールクロロホルムで抽出し、製造業者によって指示されるように精製し（例えば、ＲＮ
Ａ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５キットを用いて）、６μｌの１０ｍＭの
トリス、ｐＨ８．０中で再懸濁させる。一染料系を用いて、ＢｚＣＮ付加物を検出する。
ＲＮＡを、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）で標識されたプライマーでアニ
ールする。プライマー伸長は、インキュベーション条件に対する以下の変更を伴い、製造
業者の推奨に従って逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、インビトロジェン）
を用いて行われる：４２℃で５分、５５℃で３０分、６５℃で２５分及び７５℃で１５分
。２つのシーケンシングラダーは、プライマー伸長反応において０．５ｍＭのｄｄＡＴＰ
又は０．５ｍＭのｄｄＣＴＰのいずれかを用いて生成される。プライマー伸長産物をエタ
ノールで沈殿させ、洗浄して、過剰な塩を除去し、市販のサイズ標準（例えば、Ｌｉｚサ
イズ標準Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）と共
にキャピラリー電気泳動によって分解する。
【0332】
[0424] そのままの電気泳動図を、一次フラグメント分析ツール（例えば、ＰｅａｋＳ
ｃａｎｎｅｒ、アプライドバイオシステムズ）を用いて分析する。次に、電気泳動図の各
位置におけるピークを積分する。分析される各ＲＮＡについて、各プライマー伸長反応の
ためのバックグラウンドが、ＢｚＣＮで処理されないＲＮＡにおいて行われる陰性対照反
応のバックグラウンドに対して正規化されるように、ローディングエラー（loading erro
r）を補正するためのｙ軸スケーリングが行われる。シグナル減衰補正が各反応について
データに適用される。ピークは、２つのシーケンシング反応から生成されるラダーに整列
される。各位置において、陰性対照のピーク面積が、ＢｚＣＮ処理されたサンプルにおけ
るピーク面積から差し引かれ；次に、これらの値が、差し引かれたピーク面積を、差し引
かれたピーク面積の上位２％～１０％の平均で除算することにより、正規化ＳＨＡＰＥ反
応性に換算される。
ｃａｎｎｅｒ、アプライドバイオシステムズ）を用いて分析する。次に、電気泳動図の各
位置におけるピークを積分する。分析される各ＲＮＡについて、各プライマー伸長反応の
ためのバックグラウンドが、ＢｚＣＮで処理されないＲＮＡにおいて行われる陰性対照反
応のバックグラウンドに対して正規化されるように、ローディングエラー（loading erro
r）を補正するためのｙ軸スケーリングが行われる。シグナル減衰補正が各反応について
データに適用される。ピークは、２つのシーケンシング反応から生成されるラダーに整列
される。各位置において、陰性対照のピーク面積が、ＢｚＣＮ処理されたサンプルにおけ
るピーク面積から差し引かれ；次に、これらの値が、差し引かれたピーク面積を、差し引
かれたピーク面積の上位２％～１０％の平均で除算することにより、正規化ＳＨＡＰＥ反
応性に換算される。
【0333】
[0425] ＳＨＡＰＥ分析に加えて、本発明者らは、ＮＭＲ（Ｍａｒｃｈａｎｋａ ｅｔ
ａｌ ２０１５）；ヒドロキシル基プロービング（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１２）
；又はＤＭＳ及びＣＭＴＣ及びケトキサールの組合せ（Ｔｉｊｅｒｉｎａ ｅｔ ａｌ
２００７及びＺｉｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２００１）を行う。
ａｌ ２０１５）；ヒドロキシル基プロービング（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１２）
；又はＤＭＳ及びＣＭＴＣ及びケトキサールの組合せ（Ｔｉｊｅｒｉｎａ ｅｔ ａｌ
２００７及びＺｉｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２００１）を行う。
【0334】
[0426] 環状ＲＮＡは、疑似二本鎖構造を有することが予測される。
【0335】
実施例１２：環状ＲＮＡは、機能的疑似らせん構造を含む
[0427] この実施例は、環状ＲＮＡが機能的疑似らせん構造を含むことを実証する。
[0427] この実施例は、環状ＲＮＡが機能的疑似らせん構造を含むことを実証する。
【0336】
[0428] この実施例において、環状ＲＮＡは、３９５Ｌの発現の追加を伴い、上述され
る方法の１つによって合成される（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９）。こ
のＲＮＡ配列は、疑似らせん構造（上に示されるように、ＲＮＡ二次構造折り畳みアルゴ
リズムｍｆｏｌｄ及びＤｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９によって）、図１３
。この構造は、Ｄ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）との複合体形成に必須である。
る方法の１つによって合成される（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９）。こ
のＲＮＡ配列は、疑似らせん構造（上に示されるように、ＲＮＡ二次構造折り畳みアルゴ
リズムｍｆｏｌｄ及びＤｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９によって）、図１３
。この構造は、Ｄ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）との複合体形成に必須である。
【0337】
[0429] したがって、環状ＲＮＡ構造が機能的疑似構造を含むかどうかを試験するため
に、本発明者らは、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、ＨＤＡｇ－１６０又はＨＤＡｇ－１９
５と共にインキュベートし、ＥＭＳＡアッセイを用いて結合を分析する。結合反応を、１
０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．
１ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（ニュー・イングランド・バイオラボ）、５％のグリセロ
ール、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．２Ｕ／ｌのＲＮａｓｅ阻害剤（アプライドバイオシステ
ムズ）及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル溶液を含む２５μｌ中で行う。環状
ＲＮＡを０～１１０ｎＭの範囲の濃度のＨＤＡｇタンパク質（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅ
ｔ ａｌ ２００９によって記載されるように得られた）と共にインキュベートする。反
応混合物を氷上で集めて、３７℃で１時間インキュベートし、２．５時間にわたって２４
０Ｖで０．５トリス－ボレート－ＥＤＴＡ中において６％の天然ポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動させる。遊離及び結合ＲＮＡのレベルを、核酸染色（例えば、ゲルレッド（
gelred））を用いて決定する。結合は、バックグラウンドを差し引いた全レーンの強度に
対する非結合ＲＮＡの強度として計算される。
に、本発明者らは、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、ＨＤＡｇ－１６０又はＨＤＡｇ－１９
５と共にインキュベートし、ＥＭＳＡアッセイを用いて結合を分析する。結合反応を、１
０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．
１ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（ニュー・イングランド・バイオラボ）、５％のグリセロ
ール、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．２Ｕ／ｌのＲＮａｓｅ阻害剤（アプライドバイオシステ
ムズ）及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル溶液を含む２５μｌ中で行う。環状
ＲＮＡを０～１１０ｎＭの範囲の濃度のＨＤＡｇタンパク質（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅ
ｔ ａｌ ２００９によって記載されるように得られた）と共にインキュベートする。反
応混合物を氷上で集めて、３７℃で１時間インキュベートし、２．５時間にわたって２４
０Ｖで０．５トリス－ボレート－ＥＤＴＡ中において６％の天然ポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動させる。遊離及び結合ＲＮＡのレベルを、核酸染色（例えば、ゲルレッド（
gelred））を用いて決定する。結合は、バックグラウンドを差し引いた全レーンの強度に
対する非結合ＲＮＡの強度として計算される。
【0338】
[0430] 環状ＲＮＡは、機能的疑似らせん構造を有することが予測される。
【0339】
実施例１３：自己転写／複製
[0431] この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶ複製ドメインの発現の追加（Ｂｅ
ｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ ２０１４によって記載されるように）、アンチゲノム複製コ
ンピテントリボザイム及び核局在化シグナルを伴い、上述される方法の１つによって合成
される。これらのＲＮＡ配列は、環状ＲＮＡが核に位置することを可能にし、ここで、宿
主ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡに結合し、ＲＮＡを転写する。次に、このＲＮＡは、リボ
ザイムを用いて自己切断される。次に、ＲＮＡは、ライゲートされ、再度自己複製される
（図１４を参照されたい）。
[0431] この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶ複製ドメインの発現の追加（Ｂｅ
ｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ ２０１４によって記載されるように）、アンチゲノム複製コ
ンピテントリボザイム及び核局在化シグナルを伴い、上述される方法の１つによって合成
される。これらのＲＮＡ配列は、環状ＲＮＡが核に位置することを可能にし、ここで、宿
主ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡに結合し、ＲＮＡを転写する。次に、このＲＮＡは、リボ
ザイムを用いて自己切断される。次に、ＲＮＡは、ライゲートされ、再度自己複製される
（図１４を参照されたい）。
【0340】
[0432] 環状ＲＮＡ（１～５μｇ）は、上述される技術を用いてＨｅＬａ細胞中にトラ
ンスフェクトされる。ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％のウ
シ胎仔血清が補充された、高グルコース（ライフテクノロジーズ）を含むダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。トランスフ
ェクション後、ＨｅＬａ細胞をさらに４～７２時間培養し、次にトランスフェクトされた
細胞からの全ＲＮＡをトランスフェクションの１時間～２０日後、製造業者の説明に従っ
てフェノール系ＲＮＡ単離試薬（ライフテクノロジーズ）を用いて単離し、ＨＤＶドメイ
ンをコードする環状ＲＮＡの総量を決定し、本明細書に記載されるようにｑＰＣＲを用い
て、対照環状ＲＮＡと比較する。
ンスフェクトされる。ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％のウ
シ胎仔血清が補充された、高グルコース（ライフテクノロジーズ）を含むダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。トランスフ
ェクション後、ＨｅＬａ細胞をさらに４～７２時間培養し、次にトランスフェクトされた
細胞からの全ＲＮＡをトランスフェクションの１時間～２０日後、製造業者の説明に従っ
てフェノール系ＲＮＡ単離試薬（ライフテクノロジーズ）を用いて単離し、ＨＤＶドメイ
ンをコードする環状ＲＮＡの総量を決定し、本明細書に記載されるようにｑＰＣＲを用い
て、対照環状ＲＮＡと比較する。
【0341】
実施例１４：環状ＲＮＡ安定性／半減期
[0433] この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つによって合成され
る。環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配
列番号２）を、ＧＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように
設計される（図１５を参照されたい）。
[0433] この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つによって合成され
る。環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配
列番号２）を、ＧＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように
設計される（図１５を参照されたい）。
【0342】
[0434] ヒト線維芽細胞（例えば、ＩＭＲ－９０）を、組織培養物で処理されたプレー
ト上で５％のＣＯ２下、３７℃において、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；インビトロジ
ェン）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン）中でコ
ンフルエンスになるまで成長させる。線維芽細胞がコンフルエンスに達したとき、それら
は、接触阻止により分裂を停止する（Ｌｅｏｎｔｉｅｖａ ｅｔ ａｌ ２０１４）。脂
質トランスフェクション試薬（２μＬ；インビトロジェン）を、１２ウェル組織培養物で
処理されたプレートの１つのウェル中において、１μｇの環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ（上
述される）及び１４５μＬの血清低減培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ溶液）の混合物に加え
る。１５分間にわたる室温でのインキュベーション後、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中
で懸濁された約１×１０５個の細胞を環状ＲＮＡ溶液（上述される）に加える。
ト上で５％のＣＯ２下、３７℃において、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；インビトロジ
ェン）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン）中でコ
ンフルエンスになるまで成長させる。線維芽細胞がコンフルエンスに達したとき、それら
は、接触阻止により分裂を停止する（Ｌｅｏｎｔｉｅｖａ ｅｔ ａｌ ２０１４）。脂
質トランスフェクション試薬（２μＬ；インビトロジェン）を、１２ウェル組織培養物で
処理されたプレートの１つのウェル中において、１μｇの環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ（上
述される）及び１４５μＬの血清低減培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ溶液）の混合物に加え
る。１５分間にわたる室温でのインキュベーション後、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中
で懸濁された約１×１０５個の細胞を環状ＲＮＡ溶液（上述される）に加える。
【0343】
[0435] 細胞を培養し、次に環状ＲＮＡトランスフェクションの１、２、３、４、５、
１０、２０及び３０日後の時点で収集する。細胞をｑ－ｒｔ－ＰＣＲのために及び別のサ
ブセットをＦＡＣＳ分析のために単離する。ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定
するために、実施例２に記載されるように、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写
が行われる。細胞を、本明細書に記載されるようにＧＦＰ抗体を用いて、ＦＡＣＳを用い
て分析する。
１０、２０及び３０日後の時点で収集する。細胞をｑ－ｒｔ－ＰＣＲのために及び別のサ
ブセットをＦＡＣＳ分析のために単離する。ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定
するために、実施例２に記載されるように、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写
が行われる。細胞を、本明細書に記載されるようにＧＦＰ抗体を用いて、ＦＡＣＳを用い
て分析する。
【0344】
[0436] 環状ＲＮＡは、少なくとも数日間にわたって細胞内で持続し、それらは、ＧＦ
Ｐタンパク質の機能的発現を保持することが予測される。
Ｐタンパク質の機能的発現を保持することが予測される。
【0345】
実施例１５：娘細胞における環状ＲＮＡ保存
[0437] この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つによって合成され
る。環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配
列番号２）を、ＧＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように
設計される（図１６を参照されたい）。
[0437] この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つによって合成され
る。環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配
列番号２）を、ＧＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように
設計される（図１６を参照されたい）。
【0346】
[0438] ヒト線維芽細胞（例えば、ＩＭＲ－９０）を、組織培養物で処理されたプレー
ト上で５％のＣＯ２下、３７℃において、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；インビトロジ
ェン）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン）中で成
長させる。細胞を、指数増殖を維持するために定期的に継代する。脂質トランスフェクシ
ョン試薬（２μＬ；インビトロジェン）を、１２ウェル組織培養物で処理されたプレート
の１つのウェル中において、１μｇの環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ（上述される）及び１４
５μＬの血清低減培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ溶液）の混合物に加える。１５分間にわた
る室温でのインキュベーション後、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で懸濁された１×１
０５個のＨｅＬａ細胞を環状ＲＮＡ溶液（上述される）に加える。３７℃及び５％のＣＯ
２で２４時間にわたるインキュベーション後、細胞は、ＢｒｄＵ（例えば、シグマ－アル
ドリッヒ）を用いてパルスをかけられる。ＢｒｄＵ、標識期間がそれらの特定の集団の倍
加時間に従って各細胞型について最適化され、例えば、ＩＭＲ－９０ヒト線維芽細胞は、
２７時間の倍加時間を有し、Ｅｌａｂｄ ｅｔ ａｌ ２０１３によって記載されるよう
に、８～９時間にわたってパルスをかけられる。
ト上で５％のＣＯ２下、３７℃において、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；インビトロジ
ェン）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン）中で成
長させる。細胞を、指数増殖を維持するために定期的に継代する。脂質トランスフェクシ
ョン試薬（２μＬ；インビトロジェン）を、１２ウェル組織培養物で処理されたプレート
の１つのウェル中において、１μｇの環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ（上述される）及び１４
５μＬの血清低減培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ溶液）の混合物に加える。１５分間にわた
る室温でのインキュベーション後、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で懸濁された１×１
０５個のＨｅＬａ細胞を環状ＲＮＡ溶液（上述される）に加える。３７℃及び５％のＣＯ
２で２４時間にわたるインキュベーション後、細胞は、ＢｒｄＵ（例えば、シグマ－アル
ドリッヒ）を用いてパルスをかけられる。ＢｒｄＵ、標識期間がそれらの特定の集団の倍
加時間に従って各細胞型について最適化され、例えば、ＩＭＲ－９０ヒト線維芽細胞は、
２７時間の倍加時間を有し、Ｅｌａｂｄ ｅｔ ａｌ ２０１３によって記載されるよう
に、８～９時間にわたってパルスをかけられる。
【0347】
[0439] 細胞をＢｒｄＵパルスの１、２、３、４、５及び１０日後の時点で収集する。
細胞のサブセットをｑ－ｒｔ－ＰＣＲのために単離し、別のサブセットをＦＡＣＳ分析の
ために単離する。ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、実施例２に記
載されるように、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。細胞を、本明
細書に記載されるようにＢｒｄＵ及びＧＦＰ抗体を用いて、ＦＡＣＳを用いて分析する。
細胞のサブセットをｑ－ｒｔ－ＰＣＲのために単離し、別のサブセットをＦＡＣＳ分析の
ために単離する。ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、実施例２に記
載されるように、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。細胞を、本明
細書に記載されるようにＢｒｄＵ及びＧＦＰ抗体を用いて、ＦＡＣＳを用いて分析する。
【0348】
[0440] 環状ＲＮＡは、娘細胞内で持続し、娘細胞は、ＧＦＰタンパク質を発現するこ
とが予測される。
とが予測される。
【0349】
実施例１６：環状ＲＮＡ環状化
[0441] この実施例は、スプリントライゲーションを用いた環状ＲＮＡのインビトロ生
成を実証する。
[0441] この実施例は、スプリントライゲーションを用いた環状ＲＮＡのインビトロ生
成を実証する。
【0350】
[0442] 非天然環状ＲＮＡは、１つ以上の望ましい特性を含むように操作され得、組み
換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライ
ゲーションが線状ＲＮＡを環状化した。
換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライ
ゲーションが線状ＲＮＡを環状化した。
【0351】
[0443] 環状ＲＮＡ１を、終止コドン（２６４ｎｔ）なしで三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ
をコードするように設計した。それは、翻訳開始のために開始コドンにおいてコザック配
列（配列番号１１）を有する。環状ＲＮＡ２は、それが終止要素（三重終止コドン）（２
７３ｎｔ、配列番号１２）を有することを除いて、環状ＲＮＡ１と同一の配列を有する。
環状ＲＮＡ３を、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ）なしで、スタガー要素（２Ａ配
列、配列番号１３）によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設
計した。環状ＲＮＡ４は、それが終止要素（三重終止コドン）（３３９ｎｔ）を有するこ
とを除いて、環状ＲＮＡ３と同一の配列を有する。
をコードするように設計した。それは、翻訳開始のために開始コドンにおいてコザック配
列（配列番号１１）を有する。環状ＲＮＡ２は、それが終止要素（三重終止コドン）（２
７３ｎｔ、配列番号１２）を有することを除いて、環状ＲＮＡ１と同一の配列を有する。
環状ＲＮＡ３を、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ）なしで、スタガー要素（２Ａ配
列、配列番号１３）によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設
計した。環状ＲＮＡ４は、それが終止要素（三重終止コドン）（３３９ｎｔ）を有するこ
とを除いて、環状ＲＮＡ３と同一の配列を有する。
【0352】
[0444] この実施例において、環状ＲＮＡを以下のように生成した。インビトロ転写の
ためのＤＮＡ鋳型を、Ｔ７プロモータを有するフォワードプライマー及び２－Ｏ－メチル
化ヌクレオチドをリバースプライマーと共に有する対応する配列（ＩＤＴ）を有するｇＢ
ｌｏｃｋｓ遺伝子フラグメントから増幅した。増幅されたＤＮＡ鋳型を、ＤＮＡゲル精製
キット（キアゲン）を用いてゲル精製した。２５０～５００ｎｇの精製されたＤＮＡ鋳型
をインビトロ転写に供した。線状、５’－一リン酸化インビトロ転写産物を７．５ｍＭの
ＧＭＰ、１．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ及び７．５ｍＭ
のＡＴＰの存在下において、対応する配列を有する各ＤＮＡ鋳型からＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いて生成した。約４０μｇの線状ＲＮＡを各反応において生成した。インキュ
ベーション後、各反応をＤＮａｓｅで処理して、ＤＮＡ鋳型を除去した。インビトロ転写
ＲＮＡを２．５Ｍの酢酸アンモニウムの存在下においてエタノールで沈殿させて、取り込
まれないモノマーを除去した。
ためのＤＮＡ鋳型を、Ｔ７プロモータを有するフォワードプライマー及び２－Ｏ－メチル
化ヌクレオチドをリバースプライマーと共に有する対応する配列（ＩＤＴ）を有するｇＢ
ｌｏｃｋｓ遺伝子フラグメントから増幅した。増幅されたＤＮＡ鋳型を、ＤＮＡゲル精製
キット（キアゲン）を用いてゲル精製した。２５０～５００ｎｇの精製されたＤＮＡ鋳型
をインビトロ転写に供した。線状、５’－一リン酸化インビトロ転写産物を７．５ｍＭの
ＧＭＰ、１．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ及び７．５ｍＭ
のＡＴＰの存在下において、対応する配列を有する各ＤＮＡ鋳型からＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いて生成した。約４０μｇの線状ＲＮＡを各反応において生成した。インキュ
ベーション後、各反応をＤＮａｓｅで処理して、ＤＮＡ鋳型を除去した。インビトロ転写
ＲＮＡを２．５Ｍの酢酸アンモニウムの存在下においてエタノールで沈殿させて、取り込
まれないモノマーを除去した。
【0353】
[0445] 転写された線状ＲＮＡを、鋳型としての２０ｎｔのスプリントＤＮＡオリゴマ
ー（配列番号１４）上でＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いて環状化した。スプリントＤＮＡ
を、線状ＲＮＡの１０ｎｔの各５’又は３’末端をアニールするように設計した。スプリ
ントＤＮＡ（３μＭ）でアニールした後、１μＭの線状ＲＮＡを３７℃又は４時間で０．
５Ｕ／μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２と共にインキュベートした。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ
２を含まない混合物を陰性対照として使用した。
ー（配列番号１４）上でＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いて環状化した。スプリントＤＮＡ
を、線状ＲＮＡの１０ｎｔの各５’又は３’末端をアニールするように設計した。スプリ
ントＤＮＡ（３μＭ）でアニールした後、１μＭの線状ＲＮＡを３７℃又は４時間で０．
５Ｕ／μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２と共にインキュベートした。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ
２を含まない混合物を陰性対照として使用した。
【0354】
[0446] 線状ＲＮＡの環状化を６％の変性ＰＡＧＥにおいてＲＮＡを分離することによ
って監視した。よりゆっくりと移動するＲＮＡバンドは、それらの環状構造のため、変性
ポリアクリルアミドゲルにおける線状ＲＮＡより環状ＲＮＡと一致する。図１７から分か
るように、ＲＮＡ混合物へのリガーゼの追加（＋レーン）は、リガーゼを欠いた混合物（
－レーン）中に存在する線状ＲＮＡバンドを超えるようである新たなバンドを生成した。
よりゆっくりと移動するバンドは、全てのＲＮＡ混合物において見られ、これは、陰性対
照と比較して、複数の構築物で行われる成功したスプリントライゲーション（例えば、環
状化）を示す。
って監視した。よりゆっくりと移動するＲＮＡバンドは、それらの環状構造のため、変性
ポリアクリルアミドゲルにおける線状ＲＮＡより環状ＲＮＡと一致する。図１７から分か
るように、ＲＮＡ混合物へのリガーゼの追加（＋レーン）は、リガーゼを欠いた混合物（
－レーン）中に存在する線状ＲＮＡバンドを超えるようである新たなバンドを生成した。
よりゆっくりと移動するバンドは、全てのＲＮＡ混合物において見られ、これは、陰性対
照と比較して、複数の構築物で行われる成功したスプリントライゲーション（例えば、環
状化）を示す。
【0355】
実施例１７：ＲＮＡ環状化効率
[0447] この実施例は、ＲＮＡスプリントライゲーションの環状化効率を実証する。
[0447] この実施例は、ＲＮＡスプリントライゲーションの環状化効率を実証する。
【0356】
[0448] １つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡがスプリン
ト媒介性環状化を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライ
ゲーションは、対照より高い効率で線状ＲＮＡを環状化した。
ト媒介性環状化を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライ
ゲーションは、対照より高い効率で線状ＲＮＡを環状化した。
【0357】
[0449] 実施例１に記載される環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３及び環状Ｒ
ＮＡ４をここでも使用した。環状ＲＮＡ５を、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ
化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコ
ードするように設計した。環状ＲＮＡ６は、ナノルシフェラーゼ配列（７６２ｎｔ、配列
番号１８）の末端において、ＥＧＦ及びナノルシフェラーゼ遺伝子及び終止要素（三重終
止コドン）間に終止要素（三重終止コドン）を含んでいたことを除いて、環状ＲＮＡ５と
同一の配列を有する。
ＮＡ４をここでも使用した。環状ＲＮＡ５を、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ
化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコ
ードするように設計した。環状ＲＮＡ６は、ナノルシフェラーゼ配列（７６２ｎｔ、配列
番号１８）の末端において、ＥＧＦ及びナノルシフェラーゼ遺伝子及び終止要素（三重終
止コドン）間に終止要素（三重終止コドン）を含んでいたことを除いて、環状ＲＮＡ５と
同一の配列を有する。
【0358】
[0450] この実施例において、ＲＮＡの環状化効率を測定するために、６つの異なるサ
イズの線状ＲＮＡ（２６４ｎｔ、２７３ｎｔ、３３０ｎｔ、３３９ｎｔ、８７３ｎｔ及び
７６２ｎｔ）を生成し、実施例１に記載されるように環状化した。環状ＲＮＡを６％の変
性ＰＡＧＥによって分解し、線状又は環状ＲＮＡについてのゲルにおける対応するＲＮＡ
バンドを精製のために切除した。切除されたＲＮＡゲルバンドを破砕し、ＲＮＡを、８０
０μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって
除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。
イズの線状ＲＮＡ（２６４ｎｔ、２７３ｎｔ、３３０ｎｔ、３３９ｎｔ、８７３ｎｔ及び
７６２ｎｔ）を生成し、実施例１に記載されるように環状化した。環状ＲＮＡを６％の変
性ＰＡＧＥによって分解し、線状又は環状ＲＮＡについてのゲルにおける対応するＲＮＡ
バンドを精製のために切除した。切除されたＲＮＡゲルバンドを破砕し、ＲＮＡを、８０
０μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって
除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。
【0359】
[0451] 環状化効率を以下のように計算した。溶離された環状ＲＮＡの量を、溶離され
た全ＲＮＡの量（環状＋線状ＲＮＡ）で除算し、結果を図１８中のグラフとして示した。
[0452] Ｔ４ ＲＮＡｓｅリガーゼ２を用いた線状ＲＮＡのライゲーションは、対照よ
り高い効率速度で環状ＲＮＡを生成した。傾向データは、より多い構築物がより高い速度
で環状化されたことを示した。
た全ＲＮＡの量（環状＋線状ＲＮＡ）で除算し、結果を図１８中のグラフとして示した。
[0452] Ｔ４ ＲＮＡｓｅリガーゼ２を用いた線状ＲＮＡのライゲーションは、対照よ
り高い効率速度で環状ＲＮＡを生成した。傾向データは、より多い構築物がより高い速度
で環状化されたことを示した。
【0360】
実施例１８：分解感受性を欠いた環状ＲＮＡ
[0453] この実施例は、線状ＲＮＡと比較した、ＲＮＡｓｅ Ｒによる分解に対する環
状ＲＮＡの感受性を実証する。
[0453] この実施例は、線状ＲＮＡと比較した、ＲＮＡｓｅ Ｒによる分解に対する環
状ＲＮＡの感受性を実証する。
【0361】
[0454] 環状ＲＮＡは、５’及び３’末端の欠如のために、線状ＲＮＡよりエキソヌク
レアーゼ分解に対して抵抗性である。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、そ
の線状ＲＮＡ同等物より分解に対する感受性が低い。
レアーゼ分解に対して抵抗性である。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、そ
の線状ＲＮＡ同等物より分解に対する感受性が低い。
【0362】
[0455] 環状ＲＮＡ５を生成し、本明細書に記載されるアッセイに使用するために実施
例２に記載されるように環状化した。
[0456] 環状ＲＮＡ５の環状化を試験するために、２０ｎｇ／μｌの線状又は環状ＲＮ
Ａ５を３０分間にわたって３７℃において、２Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｒ、線状ＲＮＡを
消化するが、ラリアット又は環状ＲＮＡ構造を消化しない３’－５’エキソリボヌクレア
ーゼと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧ
Ｅによって分析した。
例２に記載されるように環状化した。
[0456] 環状ＲＮＡ５の環状化を試験するために、２０ｎｇ／μｌの線状又は環状ＲＮ
Ａ５を３０分間にわたって３７℃において、２Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｒ、線状ＲＮＡを
消化するが、ラリアット又は環状ＲＮＡ構造を消化しない３’－５’エキソリボヌクレア
ーゼと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧ
Ｅによって分析した。
【0363】
[0457 エキソヌクレアーゼを欠いたレーンに存在する線状ＲＮＡバンドは、環状ＲＮ
Ａ５レーンに存在せず（図１９を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡ５が、線状ＲＮＡ
対照と比較して、エキソヌクレアーゼ処理に対するより高い抵抗性を示したことを示す。
Ａ５レーンに存在せず（図１９を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡ５が、線状ＲＮＡ
対照と比較して、エキソヌクレアーゼ処理に対するより高い抵抗性を示したことを示す。
【0364】
実施例１９：環状ＲＮＡの単離及び精製
[0458] この実施例は、環状ＲＮＡ精製を実証する。
[0458] この実施例は、環状ＲＮＡ精製を実証する。
【0365】
[0459] 特定の実施形態において、前の実施例に記載される環状ＲＮＡが単離され、コ
ードされるタンパク質産物の発現前に精製され得る。この実施例は、ＵＲＥＡゲル分離を
用いた単離を記載している。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡを単離し、精製
した。
ードされるタンパク質産物の発現前に精製され得る。この実施例は、ＵＲＥＡゲル分離を
用いた単離を記載している。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡを単離し、精製
した。
【0366】
[0460] 実施例２に記載される環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３、環状ＲＮ
Ａ４、環状ＲＮＡ５及び環状ＲＮＡ６を本明細書に記載されるように単離した。
[0461] この実施例において、線状及び環状ＲＮＡを記載されるように生成した。環状
ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を６％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、
環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグ
メントを破砕し、ＲＮＡを８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破
片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下にお
いてエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分析
した（図２０を参照されたい）。
Ａ４、環状ＲＮＡ５及び環状ＲＮＡ６を本明細書に記載されるように単離した。
[0461] この実施例において、線状及び環状ＲＮＡを記載されるように生成した。環状
ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を６％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、
環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグ
メントを破砕し、ＲＮＡを８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破
片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下にお
いてエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分析
した（図２０を参照されたい）。
【0367】
[0462] 単一のバンドを、可変サイズを有する環状ＲＮＡについてＰＡＧＥによって視
覚化した。
覚化した。
【0368】
実施例２０：タンパク質発現の検出
[0463] この実施例は、環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
[0463] この実施例は、環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
【0369】
[0464] タンパク質発現は、ｍＲＮＡから特定のタンパク質を生成するプロセスである
。このプロセスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのＤＮＡの転写、続いてポリペ
プチド鎖へのｍＲＮＡの翻訳を含み、このポリペプチド鎖が最終的に機能的タンパク質に
折り畳まれ、特定の細胞内又は細胞外の位置に標的化され得る。
。このプロセスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのＤＮＡの転写、続いてポリペ
プチド鎖へのｍＲＮＡの翻訳を含み、このポリペプチド鎖が最終的に機能的タンパク質に
折り畳まれ、特定の細胞内又は細胞外の位置に標的化され得る。
【0370】
[0465] 以下の実施例に示されるように、タンパク質を環状ＲＮＡ配列からインビトロ
で発現させた。
[0466] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
で発現させた。
[0466] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【0371】
[0467] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び
１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び
１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0372】
[0468] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0373】
[0469] 蛍光が検出され、発現産物が存在することが示された。したがって、環状ＲＮ
Ａがタンパク質の発現を駆動することが示された。
Ａがタンパク質の発現を駆動することが示された。
【0374】
実施例２１：ＩＲＥＳ非依存的発現
[0470] この実施例は、環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下で発現を駆動することを実証
する。
[0470] この実施例は、環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下で発現を駆動することを実証
する。
【0375】
[0471] ＩＲＥＳ又は内部リボソーム進入部位は、キャップ非依存的に翻訳開始を可能
にするＲＮＡ要素である。環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下でＦｌａｇタンパク質の発現
を駆動することが示された。
にするＲＮＡ要素である。環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下でＦｌａｇタンパク質の発現
を駆動することが示された。
【0376】
[0472] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
[0473] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
[0473] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0377】
[0474] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウ
エスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウ
エスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0378】
[0475] 発現産物は、ＩＲＥＳの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
【0379】
実施例２２：キャップ非依存的発現
[0476] この実施例は、環状ＲＮＡがキャップの非存在下で発現を駆動できることを実
証する。
[0476] この実施例は、環状ＲＮＡがキャップの非存在下で発現を駆動できることを実
証する。
【0380】
[0477] キャップは、ｍＲＮＡの５’末端において特異的に改変されたヌクレオチドで
ある。５’キャップは、線状ｍＲＮＡの安定性並びに翻訳開始のために有用である。環状
ＲＮＡは、キャップの非存在下で産物の発現を駆動した。
ある。５’キャップは、線状ｍＲＮＡの安定性並びに翻訳開始のために有用である。環状
ＲＮＡは、キャップの非存在下で産物の発現を駆動した。
【0381】
[0478] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
[0479] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを１５分間にわたって７０℃で３０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩
衝液に溶解させた。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の
勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
[0479] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを１５分間にわたって７０℃で３０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩
衝液に溶解させた。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の
勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0382】
[0480] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0383】
[0481] 発現産物は、キャップの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
【0384】
実施例２３：５’－ＵＴＲなしでの発現
[0482] この実施例は、５’非翻訳領域を欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク
質発現を実証する。
[0482] この実施例は、５’非翻訳領域を欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク
質発現を実証する。
【0385】
[0483] ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、ＲＮＡ転写産物の下流のタンパク質翻訳を
促進する開始コドンの直接上流にある領域である。
[0484] 以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の５’－非翻訳領域は、イ
ンビトロタンパク質発現に必要でなかった。
促進する開始コドンの直接上流にある領域である。
[0484] 以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の５’－非翻訳領域は、イ
ンビトロタンパク質発現に必要でなかった。
【0386】
[0485] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【0387】
[0486] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0388】
[0487] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0389】
[0488] 発現産物は、５’ＵＴＲの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された
。
。
【0390】
実施例２４：３’－ＵＴＲなしでの発現
[0489] この実施例は、３’－ＵＴＲを欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質
発現を実証する。
[0489] この実施例は、３’－ＵＴＲを欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質
発現を実証する。
【0391】
[0490] ３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、翻訳終止コドンの直接下流にある領域で
あり、遺伝子発現に転写後に影響を与え得る調節領域を含む。３’－非翻訳領域は、ｍＲ
ＮＡの局在化、安定性、輸送及び翻訳効率に影響を与えることにより、遺伝子発現におい
て役割も果たし得る。さらに、３’－ＵＴＲの構造特性及び別のポリアデニル化のその使
用が遺伝子発現において役割を果たし得る。
あり、遺伝子発現に転写後に影響を与え得る調節領域を含む。３’－非翻訳領域は、ｍＲ
ＮＡの局在化、安定性、輸送及び翻訳効率に影響を与えることにより、遺伝子発現におい
て役割も果たし得る。さらに、３’－ＵＴＲの構造特性及び別のポリアデニル化のその使
用が遺伝子発現において役割を果たし得る。
【0392】
[0491] 以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の３’－ＵＴＲは、インビ
トロタンパク質発現に必要でなかった。
[0492] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
トロタンパク質発現に必要でなかった。
[0492] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで
、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【0393】
[0493] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0394】
[0494] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0395】
[0495] 発現産物は、３’ＵＴＲの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された
。
。
【0396】
実施例２５：終止コドンを用いない発現
[0496] この実施例は、終止コドンを欠いた環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻
訳後のポリペプチド産物の生成を実証する。
[0496] この実施例は、終止コドンを欠いた環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻
訳後のポリペプチド産物の生成を実証する。
【0397】
[0497] タンパク質は、アミノ酸の固有の配列から構成されるポリペプチドに基づいて
いる。各アミノ酸は、コドンと呼ばれるヌクレオチド三つ組によってｍＲＮＡ中でコード
される。タンパク質翻訳中、ｍＲＮＡ中の各コドンは、成長しているポリペプチド鎖中の
アミノ酸の付加に対応する。終止要素又は終止コドンは、結合解放因子によってこのプロ
セスの終了を示し、それによりリボソームサブユニットを分離させて、アミノ酸鎖を解放
する。
いる。各アミノ酸は、コドンと呼ばれるヌクレオチド三つ組によってｍＲＮＡ中でコード
される。タンパク質翻訳中、ｍＲＮＡ中の各コドンは、成長しているポリペプチド鎖中の
アミノ酸の付加に対応する。終止要素又は終止コドンは、結合解放因子によってこのプロ
セスの終了を示し、それによりリボソームサブユニットを分離させて、アミノ酸鎖を解放
する。
【0398】
[0498] 以下の実施例に示されるように、終止コドンを欠いた環状ＲＮＡは、ローリン
グサークル型翻訳により、反復したポリペプチド配列から構成される大きいポリペプチド
産物を生成した。
グサークル型翻訳により、反復したポリペプチド配列から構成される大きいポリペプチド
産物を生成した。
【0399】
[0499] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（２６４ｎｔ、配列番号２０）なしで
、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計し、翻訳開始に有利に作用するよう
に開始コドンにおいてコザック配列を含んでいた。
、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計し、翻訳開始に有利に作用するよう
に開始コドンにおいてコザック配列を含んでいた。
【0400】
[0500] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0401】
[0501] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２２を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２２を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0402】
[0502] 発現産物は、終止コドンの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された
。
。
【0403】
実施例２６：終止要素（終止コドン）を用いない別個のタンパク質の発現
[0503] この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡから翻訳された別
個のタンパク質産物の生成を実証する。
[0503] この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡから翻訳された別
個のタンパク質産物の生成を実証する。
【0404】
[0504] ２Ａペプチドなどのスタガー要素は、約２０ａａの短いアミノ酸配列を含み得
、これは、単一のｍＲＮＡからの等モルレベルの複数の遺伝子の生成を可能にする。スタ
ガー要素は、リボソームに、２Ａ要素のＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップさ
せて、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらすことによって機能し
得る。分離は、Ｃ末端上に見られるグリシン及びプロリン残基間で起こり、上流のシスト
ロンは、末端に加えられたいくつかのさらなる残基を有する一方、下流のシストロンは、
プロリンから開始する。
、これは、単一のｍＲＮＡからの等モルレベルの複数の遺伝子の生成を可能にする。スタ
ガー要素は、リボソームに、２Ａ要素のＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップさ
せて、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらすことによって機能し
得る。分離は、Ｃ末端上に見られるグリシン及びプロリン残基間で起こり、上流のシスト
ロンは、末端に加えられたいくつかのさらなる残基を有する一方、下流のシストロンは、
プロリンから開始する。
【0405】
[0505] 以下の実施例に示されるように、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡ
は、大きいポリペプチドポリマーを生成し（図２３の左側のパネル：スタガーなし－環状
ＲＮＡレーン）、コード領域の３’末端における２Ａ配列の包含は、同等の線状ＲＮＡ構
築物によって生成されるものと同等のサイズで別個のタンパク質の生成をもたらした（図
２３の右側のパネル：スタガー－環状ＲＮＡレーン）。
は、大きいポリペプチドポリマーを生成し（図２３の左側のパネル：スタガーなし－環状
ＲＮＡレーン）、コード領域の３’末端における２Ａ配列の包含は、同等の線状ＲＮＡ構
築物によって生成されるものと同等のサイズで別個のタンパク質の生成をもたらした（図
２３の右側のパネル：スタガー－環状ＲＮＡレーン）。
【0406】
[0506] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（２６４ｎｔ、配列番号２０）なり及
びスタガー要素なしで、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２の
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列
によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
びスタガー要素なしで、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２の
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列
によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【0407】
[0507] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及
び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0408】
[0508] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２３を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２３を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0409】
[0509] 別個の発現産物が検出され、これは、スタガー要素を含む環状ＲＮＡが終止要
素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
【0410】
実施例２７：ローリングサークル型翻訳
[0510] この実施例は、スタガー要素を用いた、環状ＲＮＡからのタンパク質の増加し
たインビトロ生合成を実証する。
[0510] この実施例は、スタガー要素を用いた、環状ＲＮＡからのタンパク質の増加し
たインビトロ生合成を実証する。
【0411】
[0511] 非天然環状ＲＮＡを、スタガー要素を欠いた環状ＲＮＡを用いたタンパク質発
現と比較するために、スタガー要素を含むように操作した。以下の実施例に示されるよう
に、スタガー要素は、このような配列を欠いた以外は同一の環状ＲＮＡと比較して、タン
パク質を過剰発現した。
現と比較するために、スタガー要素を含むように操作した。以下の実施例に示されるよう
に、スタガー要素は、このような配列を欠いた以外は同一の環状ＲＮＡと比較して、タン
パク質を過剰発現した。
【0412】
[0512] 環状ＲＮＡを、終止要素（例えば、並んだ３つの終止コドン）（２７３ｎｔ、
配列番号２１）を用いて、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２
の環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配
列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
配列番号２１）を用いて、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２
の環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配
列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【0413】
[0513] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び
１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び
１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタン
パク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え
、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。
上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわ
たって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清
を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0414】
[0514] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２４を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２４を参照されたい）、ウエスタンブロット
バンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0415】
[0515] 別個の発現産物が検出され、これは、スタガー要素を含む環状ＲＮＡが終止要
素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
【0416】
実施例２８：インビトロでの生物活性タンパク質の発現
[0516] この実施例は、環状ＲＮＡからの生物活性タンパク質のインビトロ生合成を実
証する。
[0516] この実施例は、環状ＲＮＡからの生物活性タンパク質のインビトロ生合成を実
証する。
【0417】
[0517] 非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。
以下の実施例に示されるように、生物活性タンパク質が網状赤血球溶解物中で環状ＲＮＡ
から発現された。
以下の実施例に示されるように、生物活性タンパク質が網状赤血球溶解物中で環状ＲＮＡ
から発現された。
【0418】
[0518] 環状ＲＮＡを、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦ
ＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計
した。
ＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計
した。
【0419】
[0519] 線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含
有していた。翻訳混合物中のルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコル（プロメガ）
に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて監視した。
球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％
のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含
有していた。翻訳混合物中のルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコル（プロメガ）
に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて監視した。
【0420】
[0520] 図２５に示されるように、対照ビヒクルＲＮＡよりはるかに高い蛍光が環状Ｒ
ＮＡ及び線状ＲＮＡの両方で検出され、これは、発現産物が存在していたことを示す。し
たがって、環状ＲＮＡが生物活性タンパク質を発現することが示された。
ＮＡ及び線状ＲＮＡの両方で検出され、これは、発現産物が存在していたことを示す。し
たがって、環状ＲＮＡが生物活性タンパク質を発現することが示された。
【0421】
実施例２９：線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有する環状ＲＮＡ
[0521] この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡと比較して延長された半減期を有す
るように操作されることを実証する。
[0521] この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡと比較して延長された半減期を有す
るように操作されることを実証する。
【0422】
[0522] 治療用タンパク質をコードする環状ＲＮＡは、例えば、線状ＲＮＡと比較して
、延長された生物学的半減期に起因する、より高いレベルのコードされたタンパク質を生
成する能力をレシピエント細胞に与えた。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは
、網状赤血球溶解物中でその線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有していた。
、延長された生物学的半減期に起因する、より高いレベルのコードされたタンパク質を生
成する能力をレシピエント細胞に与えた。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは
、網状赤血球溶解物中でその線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有していた。
【0423】
[0523] 環状ＲＮＡを、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦ
ＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計
した。
ＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計
した。
【0424】
[0524] この実施例において、時間経過実験がＲＮＡ安定性を監視するために行われた
。１００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解物と共にインキュベートし、
サンプルを１時間、５時間、１８時間及び３０時間の時点で収集した。全ＲＮＡを、フェ
ノール系試薬（インビトロジェン）を用いて溶解物から単離し、ｃＤＮＡを逆転写によっ
て生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲ反応ミックス（バイオラ
ッド）を用いて行った。
。１００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解物と共にインキュベートし、
サンプルを１時間、５時間、１８時間及び３０時間の時点で収集した。全ＲＮＡを、フェ
ノール系試薬（インビトロジェン）を用いて溶解物から単離し、ｃＤＮＡを逆転写によっ
て生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲ反応ミックス（バイオラ
ッド）を用いて行った。
【0425】
[0525] 図２６に示されるように、より高い濃度の環状ＲＮＡが線状ＲＮＡより後の時
点で検出された。したがって、環状ＲＮＡは、より安定しているか、又はその線状同等物
と比較して増加した半減期を有していた。
点で検出された。したがって、環状ＲＮＡは、より安定しているか、又はその線状同等物
と比較して増加した半減期を有していた。
【0426】
実施例３０：環状ＲＮＡは、細胞内における線状ＲＮＡより長い半減期を実証した
[0526] この実施例は、環状ＲＮＡが細胞内に送達され、線状ＲＮＡと比較して細胞内
での増加した半減期を有することを実証する。
[0526] この実施例は、環状ＲＮＡが細胞内に送達され、線状ＲＮＡと比較して細胞内
での増加した半減期を有することを実証する。
【0427】
[0527] 非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。
以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較してより高
いレベルで存在し、これは、環状ＲＮＡのより長い半減期を実証している。
以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較してより高
いレベルで存在し、これは、環状ＲＮＡのより長い半減期を実証している。
【0428】
[0528] この実施例において、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、コザック、２Ａによって
隣接されるＥＧＦ、終止又は非終止配列（配列番号１１、１９、２０、２１）をコードす
るように設計した。細胞中のＲＮＡの半減期を監視するために、０．１×１０６個の細胞
を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮ
Ａを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中
でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール
系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を
逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣ
Ｒミックス（バイオラッド）を用いて行った。プライマー配列は、以下のとおりであった
：線状又は環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧ
ＴＡＴ、Ｒ：ＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣ；環状ＲＮＡについてのプライ
マー、Ｆ：ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴ、Ｒ：ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧ
ＴＣＧＴＣＧＴＣ。
隣接されるＥＧＦ、終止又は非終止配列（配列番号１１、１９、２０、２１）をコードす
るように設計した。細胞中のＲＮＡの半減期を監視するために、０．１×１０６個の細胞
を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮ
Ａを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中
でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール
系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を
逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣ
Ｒミックス（バイオラッド）を用いて行った。プライマー配列は、以下のとおりであった
：線状又は環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧ
ＴＡＴ、Ｒ：ＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣ；環状ＲＮＡについてのプライ
マー、Ｆ：ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴ、Ｒ：ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧ
ＴＣＧＴＣＧＴＣ。
【0429】
[0529] 環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランス
フェクトされた。２４時間後、保持された環状及び線状ＲＮＡを、ｑＰＣＲを用いて測定
した。図２７Ａ及びＢに示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して細胞内に
おけるより長い半減期を有することが示された。
フェクトされた。２４時間後、保持された環状及び線状ＲＮＡを、ｑＰＣＲを用いて測定
した。図２７Ａ及びＢに示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して細胞内に
おけるより長い半減期を有することが示された。
【0430】
実施例３１：合成環状ＲＮＡを細胞内で翻訳し、合成環状ＲＮＡをローリングサークル型
翻訳によって翻訳した
[0530] この実施例は、細胞内での合成環状ＲＮＡの翻訳を実証する。
翻訳によって翻訳した
[0530] この実施例は、細胞内での合成環状ＲＮＡの翻訳を実証する。
【0431】
[0531] 以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、終止要素（配
列番号１１）なしで、コザック、３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列をコードするように設計した
。環状ＲＮＡがポリマーＥＧＦに翻訳された一方、線状ＲＮＡが翻訳されず、これは、細
胞が合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を行ったことを実証している。
列番号１１）なしで、コザック、３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列をコードするように設計した
。環状ＲＮＡがポリマーＥＧＦに翻訳された一方、線状ＲＮＡが翻訳されず、これは、細
胞が合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を行ったことを実証している。
【0432】
[0532] この実施例において、細胞内での線状又は環状ＲＮＡの翻訳効率を監視するた
めに、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日
後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビト
ロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時
間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次
に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤ
Ｓゲル上で分析した。ドライ転写方法を用いて、ニトロセルロース膜に電気泳動転写した
後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベー
トした。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体を使用した。ブロット
を、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した。ウエスタンブロットバンド強度
をＩｍａｇｅＪによって測定した。
めに、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日
後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビト
ロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時
間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次
に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤ
Ｓゲル上で分析した。ドライ転写方法を用いて、ニトロセルロース膜に電気泳動転写した
後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベー
トした。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体を使用した。ブロット
を、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した。ウエスタンブロットバンド強度
をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0433】
[0533] 環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランス
フェクトされた。しかしながら、図２８は、トランスフェクションの２４時間後、ＥＧＦ
タンパク質が環状ＲＮＡトランスフェクト細胞中で検出された一方、線状ＲＮＡトランス
フェクト細胞中で検出されなかったことを示す。したがって、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡ
と比較して、ローリングサークル型翻訳によって細胞内で翻訳された。
フェクトされた。しかしながら、図２８は、トランスフェクションの２４時間後、ＥＧＦ
タンパク質が環状ＲＮＡトランスフェクト細胞中で検出された一方、線状ＲＮＡトランス
フェクト細胞中で検出されなかったことを示す。したがって、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡ
と比較して、ローリングサークル型翻訳によって細胞内で翻訳された。
【0434】
実施例３２：合成環状ＲＮＡは、細胞内における低下した免疫原性遺伝子発現を実証した
[0534] この実施例は、環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有する
ように操作されることを実証する。
[0534] この実施例は、環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有する
ように操作されることを実証する。
【0435】
[0535] 治療用タンパク質をコードした環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、レシピ
エント細胞内での免疫原性関連遺伝子（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＡ及びＩＦＮ－β）
の低下した誘導を示した。ＲＩＧ－Ｉは、短い５’トリホスフェート非キャップ二本鎖又
は一本鎖ＲＮＡを認識し得る一方、ＭＤＡ５は、より長いｄｓＲＮＡを認識し得る。ＲＩ
Ｇ－Ｉ及びＭＤＡ５の両方は、ＭＡＶＳを活性化し、抗ウイルス応答を引き起こすことに
関与し得る。ＰＫＲは、ｄｓＲＮＡによって活性化され、ＩＦＮ－βなどのインターフェ
ロンによって誘導され得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、ｑ－ＰＣＲ
によるＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの発現によって評価した際、類似し
た線状ＲＮＡより、２９３Ｔ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有するこ
とが示された。
エント細胞内での免疫原性関連遺伝子（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＡ及びＩＦＮ－β）
の低下した誘導を示した。ＲＩＧ－Ｉは、短い５’トリホスフェート非キャップ二本鎖又
は一本鎖ＲＮＡを認識し得る一方、ＭＤＡ５は、より長いｄｓＲＮＡを認識し得る。ＲＩ
Ｇ－Ｉ及びＭＤＡ５の両方は、ＭＡＶＳを活性化し、抗ウイルス応答を引き起こすことに
関与し得る。ＰＫＲは、ｄｓＲＮＡによって活性化され、ＩＦＮ－βなどのインターフェ
ロンによって誘導され得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、ｑ－ＰＣＲ
によるＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの発現によって評価した際、類似し
た線状ＲＮＡより、２９３Ｔ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有するこ
とが示された。
【0436】
[0536] 環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、（１）コザック、終止要素（配列番号１１）を
有さない３ｘ ＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列；（２）コザック、終止要素（終止コドン）（配列
番号２１）によって隣接された３ｘ ＦＬＡＧ－ＥＧＦ；（３）コザック、２Ａ配列（配
列番号１９）によって隣接された３ｘ ＦＬＡＧ－ＥＧＦ；又は（４）コザック、２Ａ配
列によって隣接された３ｘ ＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列、続いて終止要素（終止コドン）（配
列番号２０）のいずれかをコードするように設計した。
有さない３ｘ ＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列；（２）コザック、終止要素（終止コドン）（配列
番号２１）によって隣接された３ｘ ＦＬＡＧ－ＥＧＦ；（３）コザック、２Ａ配列（配
列番号１９）によって隣接された３ｘ ＦＬＡＧ－ＥＧＦ；又は（４）コザック、２Ａ配
列によって隣接された３ｘ ＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列、続いて終止要素（終止コドン）（配
列番号２０）のいずれかをコードするように設計した。
【0437】
[0537] この実施例において、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェ
ル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視した。１日
後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビト
ロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時
間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離し
た。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分
析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行った。
ル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視した。１日
後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビト
ロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時
間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離し
た。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分
析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行った。
【0438】
[0538] 使用されるプライマー配列：ＧＡＰＤＨについてのプライマー、Ｆ：ＡＧＧＧ
ＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴ、Ｒ：ＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧ
Ａ；ＲＩＧ－Ｉ、Ｆ：ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ、Ｒ：ＧＡＡＧＣＡＣ
ＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ；ＭＤＡ５、Ｆ：ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴ
Ｔ、Ｒ：ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ；ＰＫＲ、Ｆ：ＴＣＧＣＴＧＧＴＡ
ＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ、Ｒ：ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ；ＩＦＮ－β
、Ｆ：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ、Ｒ：ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＧＴＣＣＴＴＧ。
ＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴ、Ｒ：ＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧ
Ａ；ＲＩＧ－Ｉ、Ｆ：ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ、Ｒ：ＧＡＡＧＣＡＣ
ＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ；ＭＤＡ５、Ｆ：ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴ
Ｔ、Ｒ：ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ；ＰＫＲ、Ｆ：ＴＣＧＣＴＧＧＴＡ
ＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ、Ｒ：ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ；ＩＦＮ－β
、Ｆ：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ、Ｒ：ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＧＴＣＣＴＴＧ。
【0439】
[0539] 図２９に示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞
からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比
較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示した。したがって、レ
シピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細
胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少された。
からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比
較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示した。したがって、レ
シピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細
胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少された。
【0440】
実施例３３：細胞内におけるローリングサークル型翻訳による合成環状ＲＮＡからの増加
した発現
[0540] この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳か
らの増加した発現を実証する。
した発現
[0540] この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳か
らの増加した発現を実証する。
【0441】
[0541] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）なしで、ナノルシフェラーゼ遺伝子又
はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（
配列番号２２）；ｎＬＵＣ ｓｔｏｐ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー
配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び
終止コドン；又はｎＬＵＣスタガー（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配
列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でト
ランスフェクトした。図３０に示されるように、両方の環状ＲＮＡは、機能的ルシフェラ
ーゼ活性を有する翻訳産物を生成した。
はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（
配列番号２２）；ｎＬＵＣ ｓｔｏｐ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー
配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び
終止コドン；又はｎＬＵＣスタガー（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配
列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でト
ランスフェクトした。図３０に示されるように、両方の環状ＲＮＡは、機能的ルシフェラ
ーゼ活性を有する翻訳産物を生成した。
【0442】
[0542] この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０
．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３０
０ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を
用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を
加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業
者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した
。
．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３０
０ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を
用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を
加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業
者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した
。
【0443】
[0543] 図３０に示されるように、両方の環状ＲＮＡが細胞内でタンパク質を発現した
。しかしながら、スタガー要素、例えば２Ａ配列を含み、終止要素（終止コドン）を欠い
た環状ＲＮＡは、終止要素（終止コドン）を有する環状ＲＮＡより、機能的ルシフェラー
ゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
。しかしながら、スタガー要素、例えば２Ａ配列を含み、終止要素（終止コドン）を欠い
た環状ＲＮＡは、終止要素（終止コドン）を有する環状ＲＮＡより、機能的ルシフェラー
ゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
【0444】
実施例３４：細胞内で翻訳される合成環状ＲＮＡ
[0544] この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この
実施例は、環状ＲＮＡがその線状同等物より多くの発現産物を生成したことを示す。
[0544] この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この
実施例は、環状ＲＮＡがその線状同等物より多くの発現産物を生成したことを示す。
【0445】
[0545] 環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランス
フェクトされた。細胞を、陰性対照としてＥＧＦをコードする環状ＲＮＡ（配列番号２２
）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列
、スタガー配列（２Ａ配列）；線状又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲ
ＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（
２Ａ配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図３１に示されるように、環状ＲＮ
Ａは、細胞内でナノルシフェラーゼにおいて翻訳された。
フェクトされた。細胞を、陰性対照としてＥＧＦをコードする環状ＲＮＡ（配列番号２２
）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列
、スタガー配列（２Ａ配列）；線状又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲ
ＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（
２Ａ配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図３１に示されるように、環状ＲＮ
Ａは、細胞内でナノルシフェラーゼにおいて翻訳された。
【0446】
[0546] 線状又は環状ＲＮＡ翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個
の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又
は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて
各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加える
ことにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプ
ロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又
は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて
各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加える
ことにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプ
ロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
【0447】
[0547] 図３１に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、
環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、より高いレベルのルシフェラーゼ活性
又は生成された増加したタンパク質を有していた。
環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、より高いレベルのルシフェラーゼ活性
又は生成された増加したタンパク質を有していた。
【0448】
実施例３５：合成環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳が細胞内で機能的タンパク
質産物を生成した
[0548] この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた、例えば細胞内において、終
止要素（終止コドン）を欠き、スタガー要素を有する、合成環状ＲＮＡからの機能的タン
パク質産物のローリングサークル型翻訳を実証する。さらに、この実施例は、スタガー要
素を有する環状ＲＮＡがその線状同等物より多い機能的タンパク質産物を発現したことを
示す。
質産物を生成した
[0548] この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた、例えば細胞内において、終
止要素（終止コドン）を欠き、スタガー要素を有する、合成環状ＲＮＡからの機能的タン
パク質産物のローリングサークル型翻訳を実証する。さらに、この実施例は、スタガー要
素を有する環状ＲＮＡがその線状同等物より多い機能的タンパク質産物を発現したことを
示す。
【0449】
[0549] 環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランス
フェクトされた。細胞を環状ＲＮＡ ＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；線状及び環状ｎ
ＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬ
ＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３２に
示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でナノルシフェラーゼ中において翻訳された。
フェクトされた。細胞を環状ＲＮＡ ＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；線状及び環状ｎ
ＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬ
ＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３２に
示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でナノルシフェラーゼ中において翻訳された。
【0450】
[0550] 線状又は環状ＲＮＡ翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個
の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又
は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて
各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加える
ことにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプ
ロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又
は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて
各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加える
ことにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプ
ロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
【0451】
[0551] 図３２に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、
終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、機能的ル
シフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、機能的ル
シフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
【0452】
実施例３６：合成環状ＲＮＡが細胞内におけるＩＲＥＳ開始によって翻訳される
[0552] この実施例は、細胞内におけるＩＲＥＳによる合成環状ＲＮＡ翻訳開始を実証
する。
[0552] この実施例は、細胞内におけるＩＲＥＳによる合成環状ＲＮＡ翻訳開始を実証
する。
【0453】
[0553] 環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にコ
ザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）
、ｎＬＵＣコザック（配列番号２５）：コザック配列、１ｘ ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列
、スタガー配列（Ｔ２Ａ配列）、１ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ、スタガー配列（Ｐ２Ａ
配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ ＩＲＥＳ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ
配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図３３に示されるように、ＩＲＥＳを有
する環状ＲＮＡは、コザック配列を有する環状ＲＮＡと比較して、より高いタンパク質レ
ベルに対応する、より高いレベルのルシフェラーゼ活性を示した。
ザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）
、ｎＬＵＣコザック（配列番号２５）：コザック配列、１ｘ ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列
、スタガー配列（Ｔ２Ａ配列）、１ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ、スタガー配列（Ｐ２Ａ
配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ ＩＲＥＳ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ
配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図３３に示されるように、ＩＲＥＳを有
する環状ＲＮＡは、コザック配列を有する環状ＲＮＡと比較して、より高いタンパク質レ
ベルに対応する、より高いレベルのルシフェラーゼ活性を示した。
【0454】
[0554] この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０
．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３０
０ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を
用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を
加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業
者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した
。
．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３０
０ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を
用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を
加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業
者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した
。
【0455】
[0555] 図３３に示されるように、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳによりタンパク質発現を開
始させ、コザックを有する環状ＲＮＡがタンパク質発現を開始させるより、機能的ルシフ
ェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
始させ、コザックを有する環状ＲＮＡがタンパク質発現を開始させるより、機能的ルシフ
ェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
【0456】
実施例３７：細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳
[0556] この実施例は、ＩＲＥＳによりタンパク質産生を開始させる細胞内における合
成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳によるより多いタンパク質産生を実証する。
[0556] この実施例は、ＩＲＥＳによりタンパク質産生を開始させる細胞内における合
成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳によるより多いタンパク質産生を実証する。
【0457】
[0557] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）を用いるか又は用いずに、ナノルシフ
ェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照と共にコザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計し
た。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；ｎＬＵＣ ＩＲＥＳ ｓｔｏｐ（配列番号
２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵ
Ｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ ＩＲＥＳスタガー（
配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ
化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３４に示され
るように、両方の環状ＲＮＡが発現産物を生成し、ローリングサークル型翻訳を実証し、
ＩＲＥＳを有し終止要素を有さない（例えば、コザック配列を有さない）環状ＲＮＡは、
ＩＲＥＳを有さず終止要素を有する（例えば、コザック配列を有する）環状ＲＮＡより、
機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を開始及び生成し、
これは、ローリングサークル型翻訳を実証している。
ェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照と共にコザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計し
た。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；ｎＬＵＣ ＩＲＥＳ ｓｔｏｐ（配列番号
２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵ
Ｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ ＩＲＥＳスタガー（
配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ
化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３４に示され
るように、両方の環状ＲＮＡが発現産物を生成し、ローリングサークル型翻訳を実証し、
ＩＲＥＳを有し終止要素を有さない（例えば、コザック配列を有さない）環状ＲＮＡは、
ＩＲＥＳを有さず終止要素を有する（例えば、コザック配列を有する）環状ＲＮＡより、
機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を開始及び生成し、
これは、ローリングサークル型翻訳を実証している。
【0458】
[0558] この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０
．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３０
０ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を
用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を
加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業
者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した
。
．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３０
０ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を
用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を
加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業
者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した
。
【0459】
[0559] 図３４に示されるように、環状ＲＮＡを、両方の環状ＲＮＡから与えられるロ
ーリングサークル型方法により、細胞内でタンパク質に翻訳した。しかしながら、終止要
素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡである。しかしながら、環状ＲＮＡのローリングサ
ークル型翻訳は、ＩＲＥＳでより多いタンパク質産生を開始させ、終止要素コザック翻訳
開始を有する環状ＲＮＡと比較して、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより多くのタン
パク質産物を生成した。
ーリングサークル型方法により、細胞内でタンパク質に翻訳した。しかしながら、終止要
素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡである。しかしながら、環状ＲＮＡのローリングサ
ークル型翻訳は、ＩＲＥＳでより多いタンパク質産生を開始させ、終止要素コザック翻訳
開始を有する環状ＲＮＡと比較して、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより多くのタン
パク質産物を生成した。
【0460】
実施例３８：環状ＲＮＡから発現される増加したタンパク質
[0560] この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この
実施例は、環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量のより多い発現産物を生成
したことを示す。
[0560] この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この
実施例は、環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量のより多い発現産物を生成
したことを示す。
【0461】
[0561] 線状及び環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）と共にナノルシフェラーゼ遺
伝子を含むように設計した。細胞を、ビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎ
ＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬ
ＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）；又は
環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ
ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）
でトランスフェクトした。図３５に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較し
て、適切な分子量を有する、より多いレベルのタンパク質を生成した。
伝子を含むように設計した。細胞を、ビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎ
ＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬ
ＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）；又は
環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ
ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）
でトランスフェクトした。図３５に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較し
て、適切な分子量を有する、より多いレベルのタンパク質を生成した。
【0462】
[0562] ２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集し
た。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアク
リルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
た。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアク
リルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0463】
[0563] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪ
によって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪ
によって測定した。
【0464】
【0465】
実施例３９：合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳が細胞内で別個のタンパク質産
物を生成した
[0565] この実施例は、別個のタンパク質産物が、終止要素（終止コドン）を欠いた、
例えば細胞内において、終止要素（終止コドン）の代わりにスタガー要素を有する合成環
状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳によって翻訳されたことを実証する。さらに、
この実施例は、スタガー要素を有する環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量
を有するより多いタンパク質産物を発現したことを示す。
物を生成した
[0565] この実施例は、別個のタンパク質産物が、終止要素（終止コドン）を欠いた、
例えば細胞内において、終止要素（終止コドン）の代わりにスタガー要素を有する合成環
状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳によって翻訳されたことを実証する。さらに、
この実施例は、スタガー要素を有する環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量
を有するより多いタンパク質産物を発現したことを示す。
【0466】
[0566] 環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）の代わりに、スタガー要素と共にナノ
ルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞をビヒクル：トランスフェクション試
薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列
）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）；又は環状ｎＬＵ
Ｃ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧ
タグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３６に示
されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有するより高いレ
ベルのタンパク質を生成した。
ルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞をビヒクル：トランスフェクション試
薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列
）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）；又は環状ｎＬＵ
Ｃ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧ
タグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３６に示
されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有するより高いレ
ベルのタンパク質を生成した。
【0467】
[0567] ２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集し
た。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアク
リルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
た。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアク
リルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0468】
[0568] ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロット
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪ
によって測定した。
を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロ
ットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪ
によって測定した。
【0469】
[0569] 図３６に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、
終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、適切な分
子量を有するより高いレベルの別個のタンパク質産物を生成した。
終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、適切な分
子量を有するより高いレベルの別個のタンパク質産物を生成した。
【0470】
実施例４０：疑似二本鎖、らせん構造を有する環状ＲＮＡの調製
[0570] この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖及びらせん構造の両方を有していたこ
とを実証する。
[0570] この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖及びらせん構造の両方を有していたこ
とを実証する。
【0471】
[0571] 非天然環状ＲＮＡを、疑似二本鎖、らせん構造を採用するように操作した。同
様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与することが示
された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；
８８（１３）：７４０２－１１．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４４３－１４，
Ｇｕｅｄｊ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１４ Ｄｅｃ；６０（６）：１９
０２－１０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２７３５７）。
様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与することが示
された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；
８８（１３）：７４０２－１１．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４４３－１４，
Ｇｕｅｄｊ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１４ Ｄｅｃ；６０（６）：１９
０２－１０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２７３５７）。
【0472】
[0572] この実施例において、環状ＲＮＡを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＯＲＦとしての３
ＸＦＬＡＧでタグ化されたＮｌｕｃ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ
Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓｔｏｐ）をコードするように設計した、ＲＮＡ二次構造を評価
するために、熱力学的ＲＮＡ構造予測ツール（ＲＮＡｆｏｌｄ）を使用した（Ｖｉｅｎｎ
ａ ＲＮＡ）。さらに、ＲＮＡ三次構造を、ＲＮＡモデリングアルゴリズムを用いて分析
した。
ＸＦＬＡＧでタグ化されたＮｌｕｃ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ
Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓｔｏｐ）をコードするように設計した、ＲＮＡ二次構造を評価
するために、熱力学的ＲＮＡ構造予測ツール（ＲＮＡｆｏｌｄ）を使用した（Ｖｉｅｎｎ
ａ ＲＮＡ）。さらに、ＲＮＡ三次構造を、ＲＮＡモデリングアルゴリズムを用いて分析
した。
【0473】
[0573] 図３７及び３８に示されるように、環状ＲＮＡは、疑似二本鎖、らせん構造を
採用したようにモデル化される。
採用したようにモデル化される。
【0474】
実施例４１：反復配列と連結された疑似らせん構造を有する環状ＲＮＡの調製
[0574] この実施例は、環状ＲＮＡが、反復配列と連結された疑似らせん構造を有する
ように設計され得ることを実証する。
[0574] この実施例は、環状ＲＮＡが、反復配列と連結された疑似らせん構造を有する
ように設計され得ることを実証する。
【0475】
[0575] 非天然環状ＲＮＡを、反復配列と連結された疑似らせん構造を採用するように
操作した。同様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与
することが示された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４、Ｇｕｅｄｊ ｅｔ ａｌ
２０１４）。
操作した。同様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与
することが示された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４、Ｇｕｅｄｊ ｅｔ ａｌ
２０１４）。
【0476】
[0576] この実施例において、環状ＲＮＡを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、Ｎｌｕｃ及び反復
配列（配列番号２６）を含むスペーサーをコードするように設計した。ＲＮＡ三次構造を
評価するためにＲＮＡモデリングアルゴリズムを使用した。
配列（配列番号２６）を含むスペーサーをコードするように設計した。ＲＮＡ三次構造を
評価するためにＲＮＡモデリングアルゴリズムを使用した。
【0477】
[0577] 図３９に示されるように、環状ＲＮＡは、疑似らせん構造を採用したようにモ
デル化される。
デル化される。
【0478】
実施例４２：環状化ＲＮＡは、環状であり、コンカテマーでない
[0578] この実施例は、ＲＮＡｓｅ Ｈによる環状ＲＮＡ分解が、環状ＲＮＡと一致し
、コンカテマーＲＮＡと一致しない核酸分解産物を生成したことを実証する。
[0578] この実施例は、ＲＮＡｓｅ Ｈによる環状ＲＮＡ分解が、環状ＲＮＡと一致し
、コンカテマーＲＮＡと一致しない核酸分解産物を生成したことを実証する。
【0479】
[0579] ＲＮＡは、リガーゼと共にインキュベートされる場合、反応しないか又は分子
内若しくは分子間結合を形成することができないかのいずれかであり、これは、それぞれ
環状（遊離末端がない）又はコンカテマーＲＮＡを生成する。相補的ＤＮＡプライマー及
びＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を認識する非特異的エンドヌクレアーゼによる
各タイプのＲＮＡの処理は、出発ＲＮＡ材料に応じて、特定のサイズの固有の数の分解産
物を生成することが予測される。
内若しくは分子間結合を形成することができないかのいずれかであり、これは、それぞれ
環状（遊離末端がない）又はコンカテマーＲＮＡを生成する。相補的ＤＮＡプライマー及
びＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を認識する非特異的エンドヌクレアーゼによる
各タイプのＲＮＡの処理は、出発ＲＮＡ材料に応じて、特定のサイズの固有の数の分解産
物を生成することが予測される。
【0480】
[0580] 以下の実施例に示されるように、ライゲートされたＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ Ｈ
分解によって生成されるＲＮＡの数及びサイズに基づいて環状であり、コンカテマーでな
いことが示された。
分解によって生成されるＲＮＡの数及びサイズに基づいて環状であり、コンカテマーでな
いことが示された。
【0481】
[0581] ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａを含有する環状ＲＮＡ及
び線状ＲＮＡを生成した。
[0582] ＲＮＡ（１２９９ｎｔ）の環状化状態を試験するために、０．０５ｐｍｏｌｅ
／μｌの線状又は環状ＲＮＡを２０分間にわたって３７℃において、１０３７－１０４６
ｎｔのＲＮＡ（ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ、配列番号５５）に対して、
０．２５Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を消化するエンドリボヌクレ
アーゼ及び０．３ｐｍｏｌｅ／μｌのオリゴマーと共にインキュベートした。インキュベ
ーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。
び線状ＲＮＡを生成した。
[0582] ＲＮＡ（１２９９ｎｔ）の環状化状態を試験するために、０．０５ｐｍｏｌｅ
／μｌの線状又は環状ＲＮＡを２０分間にわたって３７℃において、１０３７－１０４６
ｎｔのＲＮＡ（ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ、配列番号５５）に対して、
０．２５Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を消化するエンドリボヌクレ
アーゼ及び０．３ｐｍｏｌｅ／μｌのオリゴマーと共にインキュベートした。インキュベ
ーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。
【0482】
[0583] 上述される使用される線状ＲＮＡについて、ＤＮＡプライマーの結合及びＲＮ
Ａｓｅ Ｈによるその後の切断後、２つの切断産物が１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔで得ら
れることが予測される。コンカテマーが２５８、１０４１及び１２９９ｎｔの３つの切断
産物を生成することが予測される。環状が単一の１２９９ｎｔ切断産物を生成することが
予測される。
Ａｓｅ Ｈによるその後の切断後、２つの切断産物が１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔで得ら
れることが予測される。コンカテマーが２５８、１０４１及び１２９９ｎｔの３つの切断
産物を生成することが予測される。環状が単一の１２９９ｎｔ切断産物を生成することが
予測される。
【0483】
[0584] ＲＮＡｓｅエンドヌクレアーゼと共にインキュベートされた線状ＲＮＡレーン
中のバンドの数は、予測されるように１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔの２つのバンドを生成
した一方、１２９９ｎｔの単一のバンドは、環状ＲＮＡレーンにおいて生成され（図４０
を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡが実際に環状であり、コンカテマーでなかったこ
とを示す。
中のバンドの数は、予測されるように１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔの２つのバンドを生成
した一方、１２９９ｎｔの単一のバンドは、環状ＲＮＡレーンにおいて生成され（図４０
を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡが実際に環状であり、コンカテマーでなかったこ
とを示す。
【0484】
実施例４３：大きい環状ＲＮＡの調製
[0585] この実施例は、約２０塩基～約６．２Ｋｂの範囲の環状ポリリボヌクレオチド
の生成を実証する。
[0585] この実施例は、約２０塩基～約６．２Ｋｂの範囲の環状ポリリボヌクレオチド
の生成を実証する。
【0485】
[0586] １つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、所望の
機能に応じたサイズの範囲で生成された。以下の実施例に示されるように、最大で６２０
０ｎｔの線状ＲＮＡが環状化された。
機能に応じたサイズの範囲で生成された。以下の実施例に示されるように、最大で６２０
０ｎｔの線状ＲＮＡが環状化された。
【0486】
[0587] プラスミドｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴ（６．２ｋｂ）をここで使用した。プラ
イマーを、規則的な間隔でｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴにアニールして、５００ｎｔ、１０
００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔに対応するＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドを生成するように設計した。示されるＤＮＡオリゴヌクレオチドの
インビトロ転写を行って、対応するサイズの線状ＲＮＡを生成した。環状ＲＮＡを、スプ
リントＤＮＡを用いて、これらのＲＮＡオリゴヌクレオチドから生成した。
イマーを、規則的な間隔でｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴにアニールして、５００ｎｔ、１０
００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔに対応するＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドを生成するように設計した。示されるＤＮＡオリゴヌクレオチドの
インビトロ転写を行って、対応するサイズの線状ＲＮＡを生成した。環状ＲＮＡを、スプ
リントＤＮＡを用いて、これらのＲＮＡオリゴヌクレオチドから生成した。
【0487】
[0588] ＲＮＡの環状化効率を測定するために、６つの異なるサイズの線状ＲＮＡ（５
００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔ
）を生成した。それらを、ＤＮＡスプリント及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ２を用いて環状化
した。対照として、１つの反応をＴ４ ＲＮＡリガーゼなしで行った。環状化サンプルの
半分をＲＮＡｓｅ Ｒで処理して、線状ＲＮＡを除去した。
００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔ
）を生成した。それらを、ＤＮＡスプリント及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ２を用いて環状化
した。対照として、１つの反応をＴ４ ＲＮＡリガーゼなしで行った。環状化サンプルの
半分をＲＮＡｓｅ Ｒで処理して、線状ＲＮＡを除去した。
【0488】
[0589] 環状化効率を監視するために、各サンプルを、ｑＰＣＲを用いて分析した。図
４１に示されるように、環状ＲＮＡを異なる長さの様々なＤＮＡから生成した。図４２に
示されるように、ＲＮＡの環状化を、環状接合部に対して、ＲＮＡｓｅ Ｒ処理及びｑＰ
ＣＲ分析を用いて確認した。この実施例は、様々な長さの環状ＲＮＡ生成を実証する。
４１に示されるように、環状ＲＮＡを異なる長さの様々なＤＮＡから生成した。図４２に
示されるように、ＲＮＡの環状化を、環状接合部に対して、ＲＮＡｓｅ Ｒ処理及びｑＰ
ＣＲ分析を用いて確認した。この実施例は、様々な長さの環状ＲＮＡ生成を実証する。
【0489】
実施例４４：タンパク質結合部位を用いて操作される環状ＲＮＡ
[0590] この実施例は、タンパク質結合部位を有する環状ＲＮＡの生成を実証する。
[0590] この実施例は、タンパク質結合部位を有する環状ＲＮＡの生成を実証する。
【0490】
[0591] この実施例において、１つの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号５
６）及びガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードするＯＲＦ（配列番号５７）、続
いて少なくとも１つのタンパク質結合部位を含むように設計される。特定の例では、シン
ドビスウイルス３’ＵＴＲからのＨｕＲ結合配列（配列番号５２）を用いて、環状ＲＮＡ
免疫原性に対するタンパク質結合の影響を試験する。ＨｕＲ結合配列は、２つの要素、Ｕ
ＲＥ（Ｕリッチ要素；配列番号５０）及びＣＳＥ（保存配列要素；配列番号５１）を含む
。ＨｕＲ結合配列を有さない又はＵＲＥを有する環状ＲＮＡが対照として使用される。ア
ナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列の一部をＣＶＢ３
ＩＲＥＳ（配列番号５６）の前に配置する。環状ＲＮＡは、記載されるようにインビトロ
で生成される。図４５に示されるように、環状ＲＮＡは、ＨｕＲ結合部位を含有するよう
に生成された。
６）及びガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードするＯＲＦ（配列番号５７）、続
いて少なくとも１つのタンパク質結合部位を含むように設計される。特定の例では、シン
ドビスウイルス３’ＵＴＲからのＨｕＲ結合配列（配列番号５２）を用いて、環状ＲＮＡ
免疫原性に対するタンパク質結合の影響を試験する。ＨｕＲ結合配列は、２つの要素、Ｕ
ＲＥ（Ｕリッチ要素；配列番号５０）及びＣＳＥ（保存配列要素；配列番号５１）を含む
。ＨｕＲ結合配列を有さない又はＵＲＥを有する環状ＲＮＡが対照として使用される。ア
ナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列の一部をＣＶＢ３
ＩＲＥＳ（配列番号５６）の前に配置する。環状ＲＮＡは、記載されるようにインビトロ
で生成される。図４５に示されるように、環状ＲＮＡは、ＨｕＲ結合部位を含有するよう
に生成された。
【0491】
[0592] 環状ＲＮＡ免疫原性に対するＲＮＡ結合タンパク質の影響を監視するために、
細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養する。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮ
Ａを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中
にトランスフェクトする。翻訳効率／ＲＮＡ安定性／免疫原性を毎日最大で７２時間監視
する。Ｇｌｕｃ活性を監視するために培地を収集する。ＲＮＡレベルを測定するための細
胞溶解物を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（インビトロジェン）によって相対的遺伝子発現
の測定を可能にするキットを用いて調製する。
細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養する。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮ
Ａを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中
にトランスフェクトする。翻訳効率／ＲＮＡ安定性／免疫原性を毎日最大で７２時間監視
する。Ｇｌｕｃ活性を監視するために培地を収集する。ＲＮＡレベルを測定するための細
胞溶解物を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（インビトロジェン）によって相対的遺伝子発現
の測定を可能にするキットを用いて調製する。
【0492】
[0593] 製造業者の説明（ピアース）に従ってガウシアルシフェラーゼフラッシュアッ
セイキットを用いて、Ｇｌｕｃ活性を測定することにより、翻訳効率を監視する。
[0594] ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために、ｃＤＮＡは、製造業者の説明（インビトロジェ
ン）に従って細胞溶解物調製キットを用いて生成される。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＰＣＲ
マスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０）を
用いて３連で行われる。環状ＲＮＡ安定性をＮｌｕｃに対するプライマーによって測定す
る。ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子
のｍＲＮＡレベルを定量化し、アクチン値に対して正規化する。
セイキットを用いて、Ｇｌｕｃ活性を測定することにより、翻訳効率を監視する。
[0594] ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために、ｃＤＮＡは、製造業者の説明（インビトロジェ
ン）に従って細胞溶解物調製キットを用いて生成される。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＰＣＲ
マスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０）を
用いて３連で行われる。環状ＲＮＡ安定性をＮｌｕｃに対するプライマーによって測定す
る。ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子
のｍＲＮＡレベルを定量化し、アクチン値に対して正規化する。
【0493】
実施例４５：調節核酸部位を有する環状ＲＮＡの調製
[0595] この実施例は、調節ＲＮＡ結合部位を有する環状ＲＮＡのインビトロ生成を実
証する。
[0595] この実施例は、調節ＲＮＡ結合部位を有する環状ＲＮＡのインビトロ生成を実
証する。
【0494】
[0596] 異なる細胞型は、特定のＲＮＡ配列を標的にする独自の核酸調節機構を有する
。環状ＲＮＡ中のこれらの特定の配列をコードすることは、異なる細胞型における独自の
特性を与え得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ結合部
位をコードするように操作された。
。環状ＲＮＡ中のこれらの特定の配列をコードすることは、異なる細胞型における独自の
特性を与え得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ結合部
位をコードするように操作された。
【0495】
[0597] この実施例において、環状ＲＮＡは、ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをコードする
配列、ｍｉｒ６９２マイクロＲＮＡ結合部位（ＧＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＧＡＧＡＵ）及
びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
配列、ｍｉｒ６９２マイクロＲＮＡ結合部位（ＧＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＧＡＧＡＵ）及
びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
【0496】
[0598] 環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状
ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニ
ュー・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従っ
てＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、
Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された
ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴ）及びＴ４
ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０２３９）を用いて環状化し
た。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し（図４３）、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウ
ム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａ
ｓｅフリー水中で再懸濁させた。
ゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状
ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニ
ュー・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従っ
てＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、
Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された
ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴ）及びＴ４
ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０２３９）を用いて環状化し
た。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し（図４３）、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウ
ム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａ
ｓｅフリー水中で再懸濁させた。
【0497】
[0599] 図４３に示されるように、環状ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ結合部位を用いて生成し
た。
た。
【0498】
実施例４６：環状ＲＮＡの自己スプライシング
[0600] この実施例は、自己スプライシングによって環状ＲＮＡを生成する能力を実証
する。
[0600] この実施例は、自己スプライシングによって環状ＲＮＡを生成する能力を実証
する。
【0499】
[0601] この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラー
ゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要
素を含んでいた。
ゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要
素を含んでいた。
【0500】
[0602] 環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフを含むＤ
ＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。インビトロ転写反応は、１μｇ
の鋳型ＤＮＡ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、１０×Ｔ７反応緩衝液、７．５ｍ
ＭのＡＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ、７．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ
のＤＴＴ、４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤及びＴ７酵素を含んでいた。転写を３７℃で４時間
行った。転写されたＲＮＡは、３７℃で１５分間１ＵのＤＮａｓｅ Ｉで処理されたＤＮ
ａｓｅであった。自己スプライシングによる環状化に有利に作用するように、さらなるＧ
ＴＰを２ｍＭの最終濃度に加え、５５℃で１５分間インキュベートした。次に、ＲＮＡを
カラム精製し、ＵＲＥＡ－ＰＡＧＥによって視覚化した。
ＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。インビトロ転写反応は、１μｇ
の鋳型ＤＮＡ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、１０×Ｔ７反応緩衝液、７．５ｍ
ＭのＡＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ、７．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ
のＤＴＴ、４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤及びＴ７酵素を含んでいた。転写を３７℃で４時間
行った。転写されたＲＮＡは、３７℃で１５分間１ＵのＤＮａｓｅ Ｉで処理されたＤＮ
ａｓｅであった。自己スプライシングによる環状化に有利に作用するように、さらなるＧ
ＴＰを２ｍＭの最終濃度に加え、５５℃で１５分間インキュベートした。次に、ＲＮＡを
カラム精製し、ＵＲＥＡ－ＰＡＧＥによって視覚化した。
【0501】
[0603] 図４４は、自己スプライシングによって生成された環状ＲＮＡを示す。
【0502】
実施例４７：エンクリプトゲンを含むスプライシング要素を有する環状ＲＮＡ
[0604] この実施例は、環状ＲＮＡが、低下した免疫原性を有するように操作されるこ
とを実証する。
[0604] この実施例は、環状ＲＮＡが、低下した免疫原性を有するように操作されるこ
とを実証する。
【0503】
[0605] この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラー
ゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要
素を含んでおり、これらの２つのスペーサー要素は、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自
己触媒イントロン及びエクソン配列（配列番号５９）の一部であるスプライシング要素を
含む。
ゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要
素を含んでおり、これらの２つのスペーサー要素は、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自
己触媒イントロン及びエクソン配列（配列番号５９）の一部であるスプライシング要素を
含む。
【0504】
[0606] 環状ＲＮＡは、インビトロで生成される。
[0607] この実施例において、細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養する
ことにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視する。１日後、１μｇの線状又
は環状ＲＮＡは、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて
各ウェル中にトランスフェクトされる。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡは
、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離される。全ＲＮＡ（
５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成する。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、色素ベー
スの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行われる。
[0607] この実施例において、細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養する
ことにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視する。１日後、１μｇの線状又
は環状ＲＮＡは、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて
各ウェル中にトランスフェクトされる。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡは
、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離される。全ＲＮＡ（
５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成する。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、色素ベー
スの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行われる。
【0505】
[0608] スプライシング要素を含む環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞から
の免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較し
て、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示すことが予測される。した
がって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランス
フェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少されることが予測さ
れる。
の免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較し
て、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示すことが予測される。した
がって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランス
フェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少されることが予測さ
れる。
【0506】
実施例４８：細胞分裂中の環状ＲＮＡの持続性
[0609] この実施例は、細胞分裂中の環状ポリリボヌクレオチドの持続性を実証する。
１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、分解されずに細胞
分裂を通して細胞内で持続し得る。以下の実施例に示されるように、ガウシアルシフェラ
ーゼ（ＧＬｕｃ）を発現する環状ＲＮＡをＨｅＬａ細胞内で７２時間にわたって監視した
。
[0609] この実施例は、細胞分裂中の環状ポリリボヌクレオチドの持続性を実証する。
１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、分解されずに細胞
分裂を通して細胞内で持続し得る。以下の実施例に示されるように、ガウシアルシフェラ
ーゼ（ＧＬｕｃ）を発現する環状ＲＮＡをＨｅＬａ細胞内で７２時間にわたって監視した
。
【0507】
[0610] この実施例において、１３０７ｎｔの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガ
ウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する
２つのスペーサー要素を含んでいた。
ウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する
２つのスペーサー要素を含んでいた。
【0508】
[0611] 細胞分裂にわたる環状ＲＮＡの持続性をＨｅＬａ細胞内で監視した。９６ウェ
ルプレート中の５０００個の細胞／ウェルは、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた懸濁
液であった。Ｂｒｉｇｈｔ細胞イメージングをＡｖｏｓ ｉｍａｇｅｒ（サーモフィッシ
ャー）において行い、細胞計数を、０時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間
の時点で発光細胞生存アッセイ（プロメガ）を用いて行った。ガウシアルシフェラーゼ酵
素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウシアルシフェラ
ーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック ピアース）を用いて、２４時間ごとに
ウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの
血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装
置（プロメガ）において混合した直後に読み取った。
ルプレート中の５０００個の細胞／ウェルは、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた懸濁
液であった。Ｂｒｉｇｈｔ細胞イメージングをＡｖｏｓ ｉｍａｇｅｒ（サーモフィッシ
ャー）において行い、細胞計数を、０時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間
の時点で発光細胞生存アッセイ（プロメガ）を用いて行った。ガウシアルシフェラーゼ酵
素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウシアルシフェラ
ーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック ピアース）を用いて、２４時間ごとに
ウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの
血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装
置（プロメガ）において混合した直後に読み取った。
【0509】
[0612] 環状ＲＮＡからのタンパク質の発現は、分裂細胞内で線状ＲＮＡより高いレベ
ルで検出された（図４６）。環状ＲＮＡを有する細胞は、測定される全ての時点において
、線状ＲＮＡと比較してより高い細胞分裂速度を有していた。この実施例は、その線状Ｒ
ＮＡ同等物より、細胞分裂中の環状ＲＮＡの増加した検出を実証する。
ルで検出された（図４６）。環状ＲＮＡを有する細胞は、測定される全ての時点において
、線状ＲＮＡと比較してより高い細胞分裂速度を有していた。この実施例は、その線状Ｒ
ＮＡ同等物より、細胞分裂中の環状ＲＮＡの増加した検出を実証する。
【0510】
実施例４９：ローリングサークル型翻訳は、複数の発現配列を生成した
[0613] この実施例は、単一の構築物から複数のタンパク質を発現する環状ＲＮＡの能
力を実証する。さらに、この実施例は、複数のＯＲＦをコードする環状ＲＮＡのローリン
グサークル型翻訳を実証する。この実施例は、単一の構築物からの２つのタンパク質の発
現をさらに実証する。
[0613] この実施例は、単一の構築物から複数のタンパク質を発現する環状ＲＮＡの能
力を実証する。さらに、この実施例は、複数のＯＲＦをコードする環状ＲＮＡのローリン
グサークル型翻訳を実証する。この実施例は、単一の構築物からの２つのタンパク質の発
現をさらに実証する。
【0511】
[0614] １つの環状ＲＮＡ（ｍｔＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ
３ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ＩＳスペーサー）を、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（配列番号
５８）及び３ＸＦＬＡＧタグを有するＧＦＰをコードするＯＲＦ及び３ＸＦＬＡＧタグを
有するナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦを含むようにローリングサー
クル型翻訳のために設計した。スタガー要素（２Ａ）は、ＧＦＰ及びＮｌｕｃ ＯＲＦに
隣接していた。別の環状ＲＮＡを同様に設計したが、Ｎｌｕｃ ＯＲＦとスペーサーとの
間に三重終止コドンを含んでいた。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン
及びエクソン配列の一部がＥＭＣＶ ＩＲＥＳの前に含まれていた。環状ＲＮＡを記載さ
れるようにインビトロで生成した。
３ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ＩＳスペーサー）を、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（配列番号
５８）及び３ＸＦＬＡＧタグを有するＧＦＰをコードするＯＲＦ及び３ＸＦＬＡＧタグを
有するナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦを含むようにローリングサー
クル型翻訳のために設計した。スタガー要素（２Ａ）は、ＧＦＰ及びＮｌｕｃ ＯＲＦに
隣接していた。別の環状ＲＮＡを同様に設計したが、Ｎｌｕｃ ＯＲＦとスペーサーとの
間に三重終止コドンを含んでいた。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン
及びエクソン配列の一部がＥＭＣＶ ＩＲＥＳの前に含まれていた。環状ＲＮＡを記載さ
れるようにインビトロで生成した。
【0512】
[0615] 環状ＲＮＡからのタンパク質の発現をインビトロ又は細胞内で監視した。イン
ビトロ分析の場合、環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ，Ｆ
ｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で３時間インキュベートした。反応混合物の最終組
成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭの完全アミノ酸及び０．８Ｕ／μＬ
のＲＮａｓｅ阻害剤（東洋紡、大阪）を含んでいた。
ビトロ分析の場合、環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ，Ｆ
ｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で３時間インキュベートした。反応混合物の最終組
成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭの完全アミノ酸及び０．８Ｕ／μＬ
のＲＮａｓｅ阻害剤（東洋紡、大阪）を含んでいた。
【0513】
[0616] インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及
び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０
，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤ
Ｓサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間
にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド
／ＳＤＳゲル上で分析した。
び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０
，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤ
Ｓサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間
にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド
／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0514】
[0617] 細胞内での分析のため、細胞内での環状ＲＮＡの翻訳効率を監視するために細
胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮＡ
を、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中で
トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝
液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパ
ク質を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮＡ
を、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中で
トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝
液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパ
ク質を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【0515】
[0618] ドライ転写方法を用いて、網状赤血球溶解物及び細胞からのサンプルをニトロ
セルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペル
オキシダーゼと共にインキュベートした。ローディングコントロールとして、抗βチュー
ブリン抗体を使用した。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した
。ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
セルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペル
オキシダーゼと共にインキュベートした。ローディングコントロールとして、抗βチュー
ブリン抗体を使用した。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した
。ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【0516】
[0619] 図４７に示されるように、ＧＦＰ及びｎＬｕｃをコードする環状ＲＮＡは、２
つのタンパク質産物を生成した。三重終止を有さない環状ＲＮＡからの翻訳は、三重終止
コドンを有する環状ＲＮＡより多い両方のタンパク質産物を生成した。最後に、三重終止
を有する及び有さない両方の環状ＲＮＡは、それぞれ１／３．２４及び１／３．３７の比
率でタンパク質を発現した。
つのタンパク質産物を生成した。三重終止を有さない環状ＲＮＡからの翻訳は、三重終止
コドンを有する環状ＲＮＡより多い両方のタンパク質産物を生成した。最後に、三重終止
を有する及び有さない両方の環状ＲＮＡは、それぞれ１／３．２４及び１／３．３７の比
率でタンパク質を発現した。
【0517】
実施例５０：環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して低下した毒性を示す
[0620] この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより毒性が低いことを実証する。
[0620] この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより毒性が低いことを実証する。
【0518】
[0621] この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、３ＸＦＬＡＧタグを有
し、且つスタガー要素（２Ａ）及び終止要素（終止コドン）によって両側が隣接されたＮ
ａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦを含む。環状ＲＮＡをインビトロで生成し、本明細書に
記載されるように精製した。この実施例に使用される線状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを有
するｎＬｕｃをコードするキャップ修飾ポリＡテイルＲＮＡ又はキャップ非修飾ポリＡテ
イルＲＮＡであった。
し、且つスタガー要素（２Ａ）及び終止要素（終止コドン）によって両側が隣接されたＮ
ａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦを含む。環状ＲＮＡをインビトロで生成し、本明細書に
記載されるように精製した。この実施例に使用される線状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを有
するｎＬｕｃをコードするキャップ修飾ポリＡテイルＲＮＡ又はキャップ非修飾ポリＡテ
イルＲＮＡであった。
【0519】
[0622] 細胞内のＲＮＡの毒性を監視するために、ＢＪヒト線維芽細胞を９６ウェルプ
レートの各ウェル上で平板培養した。５０ｎｇの環状又はキャップ修飾ポリＡテイル線状
ＲＮＡのいずれかを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフェクション試薬（
サーモフィッシャー）を用いて、０、４８及び７２時間後にトランスフェクトした。Ｂｒ
ｉｇｈｔ細胞イメージングを９６時間の時点でＡｖｏｓ ｉｍａｇｅｒ（サーモフィッシ
ャー）において行った。１条件当たりの全細胞を、ＩｍａｇｅＪを用いて分析した。
レートの各ウェル上で平板培養した。５０ｎｇの環状又はキャップ修飾ポリＡテイル線状
ＲＮＡのいずれかを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフェクション試薬（
サーモフィッシャー）を用いて、０、４８及び７２時間後にトランスフェクトした。Ｂｒ
ｉｇｈｔ細胞イメージングを９６時間の時点でＡｖｏｓ ｉｍａｇｅｒ（サーモフィッシ
ャー）において行った。１条件当たりの全細胞を、ＩｍａｇｅＪを用いて分析した。
【0520】
[0623] 図４８に示されるように、環状ＲＮＡのトランスフェクションは、線状ＲＮＡ
と比較して、低下した毒性を実証した。
と比較して、低下した毒性を実証した。
【0521】
実施例５１：ストレス条件下での発現
[0624] この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより、ストレス条件下でより良好に
発現されたことを実証する。
[0624] この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより、ストレス条件下でより良好に
発現されたことを実証する。
【0522】
[0625] この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、３ＸＦＬＡＧタグを有
し、且つスタガー要素によって隣接されたＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦを含む。環
状ＲＮＡをインビトロで生成し、記載されるように精製した。この実施例に使用される線
状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを有するｎＬｕｃをコードするキャップポリＡテイルＲＮＡ
であった。
し、且つスタガー要素によって隣接されたＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦを含む。環
状ＲＮＡをインビトロで生成し、記載されるように精製した。この実施例に使用される線
状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを有するｎＬｕｃをコードするキャップポリＡテイルＲＮＡ
であった。
【0523】
[0626] 細胞からのガウシアルシフェラーゼの発現を監視するために、ＢＪヒト線維芽
細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。５０ｎｇの環状又はキャップ－
ポリＡテイル線状ＲＮＡのいずれかを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフ
ェクション試薬を用いて、０、４８及び７２時間後にトランスフェクトした。ガウシアル
シフェラーゼ酵素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウ
シアルシフェラーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック ピアース）を用いて、
２４時間ごとにウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ
基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレート
を、発光測定装置（プロメガ）において混合した直後に読み取った。
細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。５０ｎｇの環状又はキャップ－
ポリＡテイル線状ＲＮＡのいずれかを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフ
ェクション試薬を用いて、０、４８及び７２時間後にトランスフェクトした。ガウシアル
シフェラーゼ酵素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウ
シアルシフェラーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック ピアース）を用いて、
２４時間ごとにウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ
基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレート
を、発光測定装置（プロメガ）において混合した直後に読み取った。
【0524】
[0627] 図４９に示されるように、環状ＲＮＡは、ストレス条件下において、線状ＲＮ
Ａと比較してより高いレベルで翻訳された。
Ａと比較してより高いレベルで翻訳された。
【0525】
実施例５２：選択的発現のためのリボスイッチ
[0628] この実施例は、環状ＲＮＡからのタンパク質発現を制御する能力を実証する。
[0628] この実施例は、環状ＲＮＡからのタンパク質発現を制御する能力を実証する。
【0526】
[0629] この実施例では、環状ＲＮＡを、ＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦの発現を
調節する合成リボスイッチ（配列番号６０）を含むように設計した（図５０を参照された
い）。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプ
ロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮ
Ａをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニュー
・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲ
ＮＡ ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ
０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲ
ＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＣＣＧＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＧＴＡ
ＴＴＴＴＧＴＣＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、
Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製した（図５０）。
調節する合成リボスイッチ（配列番号６０）を含むように設計した（図５０を参照された
い）。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプ
ロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮ
Ａをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニュー
・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲ
ＮＡ ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ
０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲ
ＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＣＣＧＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＧＴＡ
ＴＴＴＴＧＴＣＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、
Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製した（図５０）。
【0527】
[0630] テオフィリン又はテトラサイクリンは、その特定のリボスイッチの活性化を誘
導して、遺伝子発現のオフスイッチをもたらす（Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１０ Ｍａｙ；６（５）：８０７－１４及びＯｇａｗａ ｅｔ
ａｌ，ＲＮＡ．２０１１ Ｍａｒ；１７（３）：４７８－８８．ｄｏｉ：１０．１２６
１／ｒｎａ．２４３３１１１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊａｎ １１によって記載されるよ
うに）。リボスイッチは、環状ＲＮＡからのＧＦＰ又はＮＬｕｃ発現を制御することが予
測される。したがって、ＧＦＰ又はＮＬｕｃ発現は、テオフィリン又はテトラサイクリン
の追加後に予測されない。
導して、遺伝子発現のオフスイッチをもたらす（Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１０ Ｍａｙ；６（５）：８０７－１４及びＯｇａｗａ ｅｔ
ａｌ，ＲＮＡ．２０１１ Ｍａｒ；１７（３）：４７８－８８．ｄｏｉ：１０．１２６
１／ｒｎａ．２４３３１１１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊａｎ １１によって記載されるよ
うに）。リボスイッチは、環状ＲＮＡからのＧＦＰ又はＮＬｕｃ発現を制御することが予
測される。したがって、ＧＦＰ又はＮＬｕｃ発現は、テオフィリン又はテトラサイクリン
の追加後に予測されない。
【0528】
[0631] リボスイッチの効率が無細胞翻訳系及びＨｅＬａ細胞内で試験される。無細胞
翻訳は、製造業者の推奨に従って無細胞翻訳キット（プロメガ、Ｌ４１４０）を使用し、
ＮＬｕｃ ＯＲＦについて発光測定装置（プロメガ）及びＧＦＰ ＯＲＦについて細胞イ
メージングマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて発光を測定することによって
行われる。
翻訳は、製造業者の推奨に従って無細胞翻訳キット（プロメガ、Ｌ４１４０）を使用し、
ＮＬｕｃ ＯＲＦについて発光測定装置（プロメガ）及びＧＦＰ ＯＲＦについて細胞イ
メージングマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて発光を測定することによって
行われる。
【0529】
[0632] 細胞アッセイのために、ＨｅＬａ細胞／ウェルは、テオフィリン又はテトラサ
イクリン依存的合成リボスイッチ（ｔｈｅｏＮ５についての第１のＰＣＲフォワードプラ
イマー：ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTA
GG；ｔｈｅｏＮ５についての第２のＰＣＲフォワードプライマー：GAAATTAATACGACTCACTA
TAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAG；ｔｃ－Ｎ５についての第１
のＰＣＲフォワードプライマー：ACATACCAGATTTCGATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGAGGT
CTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATC；ｔｃ－Ｎ５についての第２のＰＣＲフォワードプライ
マー：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTAAAACATACCAGATTTCGATC）の
いずれかの制御下において、１ｎＭの、ＧＦＰ又はＮＬｕｃをコードする記載される環状
ＲＮＡでトランスフェクトされて、選択的発現を評価する。脂質ベースのトランスフェク
ション試薬が製造業者の推奨に従って使用される。
イクリン依存的合成リボスイッチ（ｔｈｅｏＮ５についての第１のＰＣＲフォワードプラ
イマー：ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTA
GG；ｔｈｅｏＮ５についての第２のＰＣＲフォワードプライマー：GAAATTAATACGACTCACTA
TAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAG；ｔｃ－Ｎ５についての第１
のＰＣＲフォワードプライマー：ACATACCAGATTTCGATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGAGGT
CTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATC；ｔｃ－Ｎ５についての第２のＰＣＲフォワードプライ
マー：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTAAAACATACCAGATTTCGATC）の
いずれかの制御下において、１ｎＭの、ＧＦＰ又はＮＬｕｃをコードする記載される環状
ＲＮＡでトランスフェクトされて、選択的発現を評価する。脂質ベースのトランスフェク
ション試薬が製造業者の推奨に従って使用される。
【0530】
[0633] ３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間の培養後、細胞は、１ｎＭ～３ｍＭの範囲
の濃度を有する、環状ＲＮＡ内でコードされるリボスイッチに応じて、テオフィリン又は
テトラサイクリンを用いて及び用いずに処理される。２４時間の連続した培養後、蛍光又
は発光が評価される。ＧＦＰについて、生細胞は、５％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレ
プトマイシン及び核の染色を含む蛍光ニュートラルＤＭＥＭ培地中でイメージングされる
。ＮＬｕｃについて、発光は、発光測定装置（プロメガ）を用いて、製造業者の説明に従
ってルシフェラーゼシステムを用いて評価される。
の濃度を有する、環状ＲＮＡ内でコードされるリボスイッチに応じて、テオフィリン又は
テトラサイクリンを用いて及び用いずに処理される。２４時間の連続した培養後、蛍光又
は発光が評価される。ＧＦＰについて、生細胞は、５％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレ
プトマイシン及び核の染色を含む蛍光ニュートラルＤＭＥＭ培地中でイメージングされる
。ＮＬｕｃについて、発光は、発光測定装置（プロメガ）を用いて、製造業者の説明に従
ってルシフェラーゼシステムを用いて評価される。
【0531】
ＮＬｕｃ（青色：チャバネアオカメムシ（Plautia stali）腸管ウイルスＩＲＥＳ、オ
レンジ色：ＮＬｕｃ ＯＲＦ）についてのＤＮＡ鋳型
GACACGCGGCCTTCCAAGCAGTTAGGGAAACCGACTTCTTTGAAGAAGAAAGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGG
TTAAATTTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATG
GACCGGAGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCAC
TTCAAGAAAAAGAAACTAGTATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTG
GACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGT
CCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCC
AGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTA
ATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGAT
CACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCC
GAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAACTCGAGCTCGGTACCTGTCCGCGG
TCGCGACGTACGCGGGCGGCCGCCATAAATTGGATCCATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCA
TGGTTTTGTATAGAATTTACGGCTAGCGCCGGATGCGACGCCGGTCGCGTCTTATCCGGCCTTCCTATATCAGGCGGTGT
TTAAGACGCCGCCGCTTCGCCCAAATCCTTATGCCGGTTCGACGACTGGACAAAATACTGTTTATCT
ｅＧＦＰ（青色：チャバネアオカメムシ（Plautia stali）腸管ウイルスＩＲＥＳ、オ
レンジ色：ｅＧＦＰ ＯＲＦ）についてのＤＮＡ鋳型
GACACGCGGCCTTCCAAGCAGTTAGGGAAACCGACTTCTTTGAAGAAGAAAGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGG
TTAAATTTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATG
GACCGGAGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCAC
TTCAAGAAAAAGAAACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGAC
GGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTT
CATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCC
GCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTC
TTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAA
GGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCA
TGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCC
GACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGC
CCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA
TGGACGAGCTGTACAAGTAACTCGAGCTCGGTACCTGTCCGCGGTCGCGACGTACGCGGGCGGCCGCCATAAATTGGATC
CATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAATTTACGGCTAGCGCCGGATGC
GACGCCGGTCGCGTCTTATCCGGCCTTCCTATATCAGGCGGTGTTTAAGACGCCGCCGCTTCGCCCAAATCCTTATGCCG
GTTCGACGACTGGACAAAATACTGTTTATCT
プライマー配列
２（下線：Ｔ７プロモータ）についてのフォワードプライマー：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTGACTATGTGATC
ｔｈｅｏＮ５（オレンジ色：アプタマー；赤色：ａＩＲＥＳ；紫色：ａａＩＲＥＳ）につ
いての第１のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGG
ＴｈｅｏＮ５ 第２のＰＣＲ：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAG
ｔｃ－Ｎ５についての第１のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
ACATACCAGATTTCGATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATC
ｔｃ－Ｎ５についての第２のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTAAAACATACCAGATTTCGATC
全てのＰＣＲにおけるリバースプライマー：
AGATAAACAGTATTTTGTCCAGTCGTCGAAC
接合部：
GGACAAAATACTGTTTATCTGGGAGACCACAACGG
スプリント：
5’-CCG TTG TGGTCT CCC AGA TAA ACA GTA TTT TGT CC -3’
レンジ色：ＮＬｕｃ ＯＲＦ）についてのＤＮＡ鋳型
GACACGCGGCCTTCCAAGCAGTTAGGGAAACCGACTTCTTTGAAGAAGAAAGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGG
TTAAATTTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATG
GACCGGAGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCAC
TTCAAGAAAAAGAAACTAGTATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTG
GACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGT
CCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCC
AGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTA
ATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGAT
CACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCC
GAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAACTCGAGCTCGGTACCTGTCCGCGG
TCGCGACGTACGCGGGCGGCCGCCATAAATTGGATCCATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCA
TGGTTTTGTATAGAATTTACGGCTAGCGCCGGATGCGACGCCGGTCGCGTCTTATCCGGCCTTCCTATATCAGGCGGTGT
TTAAGACGCCGCCGCTTCGCCCAAATCCTTATGCCGGTTCGACGACTGGACAAAATACTGTTTATCT
ｅＧＦＰ（青色：チャバネアオカメムシ（Plautia stali）腸管ウイルスＩＲＥＳ、オ
レンジ色：ｅＧＦＰ ＯＲＦ）についてのＤＮＡ鋳型
GACACGCGGCCTTCCAAGCAGTTAGGGAAACCGACTTCTTTGAAGAAGAAAGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGG
TTAAATTTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATG
GACCGGAGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCAC
TTCAAGAAAAAGAAACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGAC
GGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTT
CATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCC
GCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTC
TTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAA
GGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCA
TGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCC
GACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGC
CCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA
TGGACGAGCTGTACAAGTAACTCGAGCTCGGTACCTGTCCGCGGTCGCGACGTACGCGGGCGGCCGCCATAAATTGGATC
CATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAATTTACGGCTAGCGCCGGATGC
GACGCCGGTCGCGTCTTATCCGGCCTTCCTATATCAGGCGGTGTTTAAGACGCCGCCGCTTCGCCCAAATCCTTATGCCG
GTTCGACGACTGGACAAAATACTGTTTATCT
プライマー配列
２（下線：Ｔ７プロモータ）についてのフォワードプライマー：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTGACTATGTGATC
ｔｈｅｏＮ５（オレンジ色：アプタマー；赤色：ａＩＲＥＳ；紫色：ａａＩＲＥＳ）につ
いての第１のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGG
ＴｈｅｏＮ５ 第２のＰＣＲ：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAG
ｔｃ－Ｎ５についての第１のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
ACATACCAGATTTCGATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATC
ｔｃ－Ｎ５についての第２のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTAAAACATACCAGATTTCGATC
全てのＰＣＲにおけるリバースプライマー：
AGATAAACAGTATTTTGTCCAGTCGTCGAAC
接合部：
GGACAAAATACTGTTTATCTGGGAGACCACAACGG
スプリント：
5’-CCG TTG TGGTCT CCC AGA TAA ACA GTA TTT TGT CC -3’
【0532】
実施例５３：修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが生成され、翻訳され、環状ＲＮＡの
免疫原性を低下させた
[0634] この実施例は、タンパク質産物を生成した修飾環状ポリリボヌクレオチドの生
成を実証する。さらに、この実施例は、ヌクレオチド修飾を有するように操作された環状
ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有していたことを実証する。
免疫原性を低下させた
[0634] この実施例は、タンパク質産物を生成した修飾環状ポリリボヌクレオチドの生
成を実証する。さらに、この実施例は、ヌクレオチド修飾を有するように操作された環状
ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有していたことを実証する。
【0533】
[0635] １つ以上の望ましい特性を含み、且つ修飾ヌクレオチドの完全又は部分的な組
み込みを有するように操作された非天然環状ＲＮＡを生成した。以下の実施例に示される
ように、完全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化し
、ｎＬｕｃの発現を評価した。さらに、修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較して
、ＢＪ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された（ＭＤＡ
５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現のｑ－ＰＣＲ）。
み込みを有するように操作された非天然環状ＲＮＡを生成した。以下の実施例に示される
ように、完全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化し
、ｎＬｕｃの発現を評価した。さらに、修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較して
、ＢＪ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された（ＭＤＡ
５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現のｑ－ＰＣＲ）。
【0534】
[0636] ＷＴ ＥＭＣＶ Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐスペーサーを有する環状ＲＮＡを生成し
た。完全な修飾置換のために、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン
又はｍ６Ａを、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシト
シン又はアデノシンのそれぞれの代わりに加えた。ハイブリッド構築物について、ＷＴ
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをｎＬｕｃ ＯＲＦとは別々に合成した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
を、修飾又は非修飾ヌクレオチドのいずれかを用いて合成した。対照的に、ｎＬｕｃ Ｏ
ＲＦ配列を、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシ
ン又はアデノシンのそれぞれの代わりに、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチ
ルシトシン又はｍ６Ａを用いて合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成
後、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲ
ートした。図５１Ａに示されるように、修飾環状ＲＮＡを生成した。
た。完全な修飾置換のために、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン
又はｍ６Ａを、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシト
シン又はアデノシンのそれぞれの代わりに加えた。ハイブリッド構築物について、ＷＴ
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをｎＬｕｃ ＯＲＦとは別々に合成した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
を、修飾又は非修飾ヌクレオチドのいずれかを用いて合成した。対照的に、ｎＬｕｃ Ｏ
ＲＦ配列を、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシ
ン又はアデノシンのそれぞれの代わりに、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチ
ルシトシン又はｍ６Ａを用いて合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成
後、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲ
ートした。図５１Ａに示されるように、修飾環状ＲＮＡを生成した。
【0535】
[0637] 完全修飾又はハイブリッド修飾構築物からのｎＬｕｃの発現効率を測定するた
めに、０．１ｐｍｏｌの線状及び環状ＲＮＡを６時間にわたってＢＪ線維芽細胞中にトラ
ンスフェクトした。ｎＬｕｃ発現をトランスフェクションの６時間、２４時間、４８時間
及び７２時間後の時点で測定した。
めに、０．１ｐｍｏｌの線状及び環状ＲＮＡを６時間にわたってＢＪ線維芽細胞中にトラ
ンスフェクトした。ｎＬｕｃ発現をトランスフェクションの６時間、２４時間、４８時間
及び７２時間後の時点で測定した。
【0536】
[0638] 自然免疫応答遺伝子のレベルを、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）
を用いて、細胞から単離された全ＲＮＡから細胞中で監視した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）
を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的Ｐ
ＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行った。
を用いて、細胞から単離された全ＲＮＡから細胞中で監視した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）
を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的Ｐ
ＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行った。
【0537】
[0639] 図５１Ｂ及び５１Ｃに示されるように、修飾環状ＲＮＡが翻訳された。図５２
Ａ～Ｃに示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連
遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、
ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現の低下を示した。したがって、レシピエント細胞内
における免疫原性関連遺伝子の誘導は、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較し
て、修飾環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞内で減少された。
Ａ～Ｃに示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連
遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、
ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現の低下を示した。したがって、レシピエント細胞内
における免疫原性関連遺伝子の誘導は、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較し
て、修飾環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞内で減少された。
【0538】
実施例５４：環状ＲＮＡがインビボで投与され、より長い半減期／増加した安定性を示し
た
[0640] この実施例は、環状ＲＮＡを送達する能力及びインビボの線状ＲＮＡと比較し
て、環状ＲＮＡの増加した安定性を実証する。
た
[0640] この実施例は、環状ＲＮＡを送達する能力及びインビボの線状ＲＮＡと比較し
て、環状ＲＮＡの増加した安定性を実証する。
【0539】
[0641] この実施例では、環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードす
るＯＲＦ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓ
ｔｏｐ及びＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｓｔｏｐ）と共にＥＭＣＶ
ＩＲＥＳを含むように設計した。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。
るＯＲＦ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓ
ｔｏｐ及びＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｓｔｏｐ）と共にＥＭＣＶ
ＩＲＥＳを含むように設計した。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。
【0540】
[0642] Ｂａｌｂ／ｃマウスに環状ＲＮＡをＮｌｕｃ ＯＲＦ又は対照としての線状Ｒ
ＮＡと共に静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によって注入した。動物に、製造業者の説明に従い
、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された単回用量の５
μｇのＲＮＡを投与した。
ＮＡと共に静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によって注入した。動物に、製造業者の説明に従い
、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された単回用量の５
μｇのＲＮＡを投与した。
【0541】
[0643] マウスを殺処分し、肝臓を投与の３、４及び７日後の時点で採取した（ｎ＝２
匹のマウス／時点）。肝臓を採取し、ＲＮＡ安定化試薬（インビトロジェン）中で貯蔵し
た。組織を、マイクロチューブホモジナイザ（フィッシャーサイエンティフィック）を用
いてＲＩＰＡ緩衝液中で均質化し、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成のためにフェノール系ＲＮＡ
抽出試薬を用いて抽出した。ｑＰＣＲを用いて、肝臓中の線状及び環状ＲＮＡの両方の存
在を測定した。
匹のマウス／時点）。肝臓を採取し、ＲＮＡ安定化試薬（インビトロジェン）中で貯蔵し
た。組織を、マイクロチューブホモジナイザ（フィッシャーサイエンティフィック）を用
いてＲＩＰＡ緩衝液中で均質化し、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成のためにフェノール系ＲＮＡ
抽出試薬を用いて抽出した。ｑＰＣＲを用いて、肝臓中の線状及び環状ＲＮＡの両方の存
在を測定した。
【0542】
[0644] 組織におけるＲＮＡ検出をｑＰＣＲによって行った。線状及び環状ＲＮＡを検
出するために、Ｎｌｕｃ ＯＲＦを増幅するプライマーを使用した。（Ｆ：ＡＧＡＴＴＴ
ＣＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣ、Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ）。環
状ＲＮＡのみを検出するために、５’－３’接合物を増幅するプライマーは、線状ＲＮＡ
構築物ではなく環状ＲＮＡ構築物の検出を可能にした（Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡ
ＧＧＡＧＡＡＣ、Ｒ：ＣＣＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴ）。
出するために、Ｎｌｕｃ ＯＲＦを増幅するプライマーを使用した。（Ｆ：ＡＧＡＴＴＴ
ＣＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣ、Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ）。環
状ＲＮＡのみを検出するために、５’－３’接合物を増幅するプライマーは、線状ＲＮＡ
構築物ではなく環状ＲＮＡ構築物の検出を可能にした（Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡ
ＧＧＡＧＡＡＣ、Ｒ：ＣＣＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴ）。
【0543】
[0645] 環状ＲＮＡは、注入の３、４－及び７日後の時点でマウスの肝臓中において線
状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図５３）。したがって、環状ＲＮＡが投与され、
投与後少なくとも７日間においてインビボで検出可能であった。
状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図５３）。したがって、環状ＲＮＡが投与され、
投与後少なくとも７日間においてインビボで検出可能であった。
【0544】
実施例５５：環状ＲＮＡのインビボ発現、半減期及び非免疫原性
[0646] この実施例は、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。そ
れは、線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した半減期を実証する。最後に、それは
、環状ＲＮＡがインビボで非免疫原性であるように操作されたことを実証する。
[0646] この実施例は、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。そ
れは、線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した半減期を実証する。最後に、それは
、環状ＲＮＡがインビボで非免疫原性であるように操作されたことを実証する。
【0545】
[0647] この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラー
ゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要
素を含んでいた。
ゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要
素を含んでいた。
【0546】
[0648] 環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転
写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮ
Ａをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニュー
・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲ
ＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０
３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮ
Ａを、スプリントＤＮＡ（ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＧＣＧ
ＴＣＴＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０２３
９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢
酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿さ
せ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮ
Ａをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニュー
・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲ
ＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０
３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮ
Ａを、スプリントＤＮＡ（ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＧＣＧ
ＴＣＴＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０２３
９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢
酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿さ
せ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
【0547】
[0649] マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に
２．５μｇの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与え、これらの両方は、担体として脂
質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された。
２．５μｇの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与え、これらの両方は、担体として脂
質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された。
【0548】
[0650] 投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血液サンプル（５０μｌ
）を各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を４℃において１３００
ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の
活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック ピアース
）を用いて試験した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃ
ルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（プロメガ）において
混合した直後に読み取った。
）を各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を４℃において１３００
ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の
活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック ピアース
）を用いて試験した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃ
ルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（プロメガ）において
混合した直後に読み取った。
【0549】
[0651] ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６
及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図５４Ａ～Ｂ）。
[0652] 対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２
日後の時点でのみ血漿中で検出された。線状ＲＮＡ由来タンパク質からの酵素活性は、６
日又はそれを超える時点でバックグラウンドレベルを超えて検出されなかった（図５４Ａ
～Ｂ）。
及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図５４Ａ～Ｂ）。
[0652] 対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２
日後の時点でのみ血漿中で検出された。線状ＲＮＡ由来タンパク質からの酵素活性は、６
日又はそれを超える時点でバックグラウンドレベルを超えて検出されなかった（図５４Ａ
～Ｂ）。
【0550】
[0653] １６日目に肝臓を３匹の動物から切除し、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬
（インビトロジェン）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供
して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス
（バイオラッド）を用いて行った。
（インビトロジェン）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供
して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス
（バイオラッド）を用いて行った。
【0551】
[0654] 図５５に示されるように、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲレ
ベルは、１６日目に肝臓及び脾臓の両方において検出された。図５６に示されるように、
線状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓からの免疫関連遺伝子は、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ
５、ＩＦＮ－Ｂ及びＯＡＳの増加した発現を示した一方、環状ＲＮＡでトランスフェクト
された肝臓は、１６日目に、担体でトランスフェクトされた動物と比較して、これらのマ
ーカーＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの増加した発現を示さなかった。し
たがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、トランスフェクト
された肝臓からの環状ＲＮＡ中に存在しなかった。
ベルは、１６日目に肝臓及び脾臓の両方において検出された。図５６に示されるように、
線状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓からの免疫関連遺伝子は、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ
５、ＩＦＮ－Ｂ及びＯＡＳの増加した発現を示した一方、環状ＲＮＡでトランスフェクト
された肝臓は、１６日目に、担体でトランスフェクトされた動物と比較して、これらのマ
ーカーＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの増加した発現を示さなかった。し
たがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、トランスフェクト
された肝臓からの環状ＲＮＡ中に存在しなかった。
【0552】
[0655] この実施例は、環状ＲＮＡが注入の複数日数後に血漿中のタンパク質活性のレ
ベルを有して、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証する。マウ
ス血漿中のガウシアルシフェラーゼの半減期が約２０分間である場合（Ｔａｎｎｏｕｓ，
Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．，２００９，４（４）：５８２－５９１を参照されたい）、同様
の活性レベルは、環状ＲＮＡからの連続した発現を示す。さらに、環状ＲＮＡは、免疫関
連遺伝子を誘導せずに、その修飾線状ＲＮＡ同等物より長い発現プロファイルを示した。
ベルを有して、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証する。マウ
ス血漿中のガウシアルシフェラーゼの半減期が約２０分間である場合（Ｔａｎｎｏｕｓ，
Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．，２００９，４（４）：５８２－５９１を参照されたい）、同様
の活性レベルは、環状ＲＮＡからの連続した発現を示す。さらに、環状ＲＮＡは、免疫関
連遺伝子を誘導せずに、その修飾線状ＲＮＡ同等物より長い発現プロファイルを示した。
【0553】
配列表
配列番号１（開始コドン）
ＡＵＧ
配列番号２（ＧＦＰ）
ＥＧＦＰ：
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaa
gttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagc
tgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag
cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaacta
caagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggagg
acggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac
ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacac
ccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacg
agaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
配列番号３（スタガー要素）
Ｐ２Ａ：gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacct
Ｔ２Ａ：gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccca
Ｅ２Ａ：cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc
その他：Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ
配列番号４ ＺＫＳＣＡＮイントロン
GTAAAAAGAGGTGAAACCTATTATGTGTGAGCAGGGCACAGACGTTGAAACTGGAGCCAGGAGAAGTATTGGCAGGCTTT
AGGTTATTAGGTGGTTACTCTGTCTTAAAAATGTTCTGGCTTTCTTCCTGCATCCACTGGCATACTCATGGTCTGTTTTT
AAATATTTTAATTCCCATTTACAAAGTGATTTACCCACAAGCCCAACCTGTCTGTCTTCAG
又は
GTAAGAAGCAAGGTTTCATTTAGGGGAAGGGAAATGATTCAGGACGAGAGTCTTTGTGCTGCTGAGTGCCTGTGATGAAG
AAGCATGTTAGTcctgggcaacgtagcgagaccccatctctacaaaaaatagaaaaattagccaggtatagtggcgcaca
cctgtgattccagctacgcaggaggctgaggtgggaggattgcttgagcccaggaggttgaggctgcagtgagctgtaat
catgccactactccaacctgggcaacacagcaaggaccctgtctcaaaaGCTACTTACAGAAAAGAATTAggctcggcac
ggtagctcacacctgtaatcccagcactttgggaggctgaggcgggcagatcacttgaggtcaggagtttgagaccagcc
tggccaacatggtgaaaccttgtctctactaaaaatatgaaaattagccaggcatggtggcacattcctgtaatcccagc
tactcgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccaggaggtggaggttgcagtaagccgagatcgtaccactgtgct
ctagccttggtgacagagcgagactgtcttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaattaattaaaaatttaaaaaaaaatg
aaaaaaaGCTGCATGCTTGTTTTTTGTTTTTAGTTATTCTACATTGTTGTCATTATTACCAAATATTGGGGAAAATACAA
CTTACAGACCAATCTCAGGAGTTAAATGTTACTACGAAGGCAAATGAACTATGCGTAATGAACCTGGTAGGCATTA
配列番号５（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）：
Acgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtctttt
ggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaat
gcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgacccttt
gcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcg
gcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggg
gctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagt
cgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataata
配列番号６（ａｄｄｇｅｎｅ ｐ３．１ラッカーゼ）
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ラッカーゼ２ ＭＣＳエクソンベクター配列 ６９２６ｂｐ
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTAT
CTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGA
CAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATT
GATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAA
CTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGT
AACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGT
ATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA
TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAA
TGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC
AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAG
GTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAG
GGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCCAT
TGAGAAATGACTGAGTTCCGGTGCTCTCAAGTCATTGATCTTTGTCGACTTTTATTTGGTCTCTGTAATAACGACTTCAA
AAACATTAAATTCTGTTGCGAAGCCAGTAAGCTACAAAAAGAAAaaacaagagagaatgctatagtcgtatagtatagtt
tcccgactatctgatacccattacttatctagggggaatgcgaacccaaaattttatcagttttctcggatatcgataga
tattggggaataaatttaaataaataaattttgggcgggtttagggcgtggcaaaaagttttttggcaaatcgctagaaa
tttacaagacttataaaattatgaaaaaatacaacaaaattttaaacacgtgggcgtgacagttttggGcggttttaggg
cgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttcct
tctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataaTAATAAGCTAAATCG
AGACTAAGttttattgttatatatattttttttattttatGCAGAAATTAATTAAACCGGTCCTGCAGGTGATCAGGCGC
GCCGGTTACCGGCCGGCCCCGCGGAGCGTAAGTATTCAAAATTCCAAAATTTTTTACTAGAAATATTCGATTTTTTAATA
GGCAGTTTCTATACTATTGTATACTATTGtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatg
taaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattGttttattaccgc
cgagacatcaggaactataaaagctagaaggatgagttttagcatacagattctagagacaaggacgcagagcaagtttg
ttgatccatgctgccacgctttaactttctcaaattgcccaaaactgccatgcccacatttttgaactattttcgaaatt
ttttcataattgtattactcgtgtaaatttccatcaatttgccaaaaaactttttgtcacgcgttaacgccctaaagccg
ccaatttggtcacgcccacactattgaGcaattatcaaattttttctcattttattccccaatatctatcgatatccccg
attatgaaattattaaatttcgcgttcgcattcacactagctgagtaacgagtatctgatagttggggaaatcgactTAT
TTTTTATATACAATGAAAATGAATTTAATCATATGAATATCGATTATAGCTTTTTATTTAATATGAATATTTATTTGGGC
TTAAGGTGTAACCTcctcgacataagactcacatggcgcaggcacattgaagacaaaaatactcaTTGTCGGGTCTCGCA
CCCTCCAGCAGCACCTAAAATTATGTCTTCAATTATTGCCAACATTGGAGACACAATTAGTCTGTGGCACCTCAGGCGGC
CGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGC
CCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCA
TTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCA
GGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCG
CCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCC
CGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTT
TAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
CCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAAC
ACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGA
TTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAG
GCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGT
ATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAG
TTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTAT
TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGA
TCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGT
GGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGG
GGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGG
CTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGA
AGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGC
TGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAA
GCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGC
GCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCT
TTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCT
GAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTT
CTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATC
ACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCC
TCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGC
AATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATC
TTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTT
ATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTC
ACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACG
CGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGC
GGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGA
GCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGA
GCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAA
GCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCG
CTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCC
CGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG
CAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTAC
GGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG
ATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAG
AAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTA
TCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG
GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGAC
TCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGC
TCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGC
CTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCA
TTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTT
ACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGT
GTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTG
AGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACC
GCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCT
GTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGT
GAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTT
TTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACA
AATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
配列番号８（ＲＦＰ）
ｍＣｈｅｒｒｙ：
atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgt
gaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtga
ccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcac
cccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacgg
cggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaact
tcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggc
gccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaa
ggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactaca
ccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag
配列番号９（リボスイッチ）
アプタザイム（テオフィリン依存性、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ２０１０ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓ
ｙｓを参照されたい）：
cugagaugcagguacauccagcugaugagucccaaauaggacgaaagccauaccagccgaaaggcccuuggcaggguucc
uggauuccacugcuauccac
配列番号１０（ルシフェラーゼ）
ｎＬｕｃ：
ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGG
AGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGC
TGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAG
GTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAA
CATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGT
GGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTG
ACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAA
配列番号１１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号１２
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号１３
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACC
CTGGACCTCT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号１４
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）についてのスプリン
ト
GGTGGCTCCCAGGCGCAGTT
配列番号１５
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）についてのスプリント
GGTGGCTCCCAGTTACTATC
配列番号１６
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）についての
スプリント
GGTGGCTCCCAGAGGTCCAG
配列番号１７
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏ
ｐ（８７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGT
ACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGG
GAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGG
GGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTG
GGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTC
GGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCC
GTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACT
TTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTAT
GAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCG
CCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTC
TGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２６５：Ｔ２Ａ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
配列番号１８
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐ（７６２
ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGT
ACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGG
GAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCAT
CGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAG
GTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTG
AAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGT
GGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACA
TGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGG
AACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGAC
CGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTGATAGTAACT
５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２１１：三重終止コドン
２１２～７５１：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
７５２～７６０：三重終止コドン
配列番号１９
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACC
CTGGACCTCT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号２０
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号２１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号２２
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（９５４ｂ
ｐ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGC
CGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC
AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGC
GACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTG
CAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTC
AACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATG
TGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA
TGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGAC
TACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAA
AGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAG
CATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAA
CTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～８８６：３ＸＦＡＬＧ－ＥＧＦ
８８７～９５２：Ｐ２Ａ
配列番号２３
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（１３１４ｎｔ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGC
CGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC
AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGC
GACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTG
CAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTC
AACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATG
TGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA
TGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGAC
TACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAA
AGCCATTGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAAC
AGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAAT
GGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTT
TAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGC
CGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACC
CTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGG
AGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAG
ACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTGATAGTAACT
５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
１３０４～１３１２：三重終止コドン
配列番号２４
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（１３０５ｎｔ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGC
CGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC
AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGC
GACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTG
CAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTC
AACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATG
TGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA
TGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGAC
TACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAA
AGCCATTGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAAC
AGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAAT
GGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTT
TAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGC
CGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACC
CTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGG
AGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAG
ACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
配列番号２５
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－ＮＬｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（
８８２ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGT
ACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGG
GAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGG
GGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTG
GGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTC
GGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCC
GTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACT
TTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTAT
GAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCG
CCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTC
TGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTGATAGTAA
CT
５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－ＮＬｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
８７２～８８０：三重終止コドン
配列番号２６
例示的な反復スペーサー配列
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATTATGCGTTACCGGCGAGACGCTACGGACTTGGGAAAATCCGTTGACCTTAAACGG
TCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCACGCCGGAAACGCAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAA
ACCAAAAAAACAAAACACA
配列番号２７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるフォワード
プライマー
CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGC
配列番号２８
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから０．５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用される
リバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATG
配列番号２９
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから１ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバ
ースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGG
配列番号３０
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバ
ースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAA
AGCC
配列番号３１
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから４ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバ
ースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGC
配列番号３２
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバ
ースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGAC
配列番号３３
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから６．２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用される
リバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACATTTCGATAAGCCAGTAAGCAGTGGGTTCT
CTAG
配列番号３４
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるフ
ォワードｑＰＣＲプライマー
ATTCTTGCCCGCCTGATGAA
配列番号３５
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるリ
バースｑＰＣＲプライマー
TTGCTCATGGAAAACGGTGT
配列番号３６
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるフ
ォワードｑＰＣＲプライマー
TGATCCTGCACTATGGCACA
配列番号３７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるリ
バースｑＰＣＲプライマー
CTGGACTAGTGGATCCGAGC
配列番号３８
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
GACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGG
配列番号３９
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GGTGTTGAAGGTCTCAAACATG
配列番号４０
ＲＩＧ－Ｉを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
TGTGGGCAATGTCATCAAAA
配列番号４２
ＲＩＧ－Ｉを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GAAGCACTTGCTACCTCTTGC
配列番号４２
ＭＤＡ５を検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
GGCACCATGGGAAGTGATT
配列番号４３
ＭＤＡ５を検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG
配列番号４４
ＰＫＲを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
TCGCTGGTATCACTCGTCTG
配列番号４５
ＰＫＲを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GATTCTGAAGACCGCCAGAG
配列番号４６
ＩＦＮ－βを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC
配列番号４７
ＩＦＮ－βを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG
配列番号４８
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＡＬＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ
ＩＳ
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCG
CTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGA
AACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTC
GTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGTAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCC
ACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACG
TTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAG
GTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCA
GGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGG
GCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATC
GACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
GTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCG
AGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTC
GTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGC
CATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGT
TCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAG
CTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGAT
CCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGC
TGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTG
CTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAA
TTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCG
ACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTATCATCGTCTTCACACTCGAA
GATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTT
TCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATG
TCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGAT
GATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGG
ACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTA
TCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGC
GAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACC
TTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
配列番号４９
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＡＬＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ
ＩＳ
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCG
CTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGA
AACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTC
GTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGTAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCC
ACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACG
TTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAG
GTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCA
GGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGG
GCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATC
GACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
GTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCG
AGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTC
GTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGC
CATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGT
TCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAG
CTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGAT
CCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGC
TGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTG
CTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAA
TTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTTGATAGTAAGACTACAAGGACGACGACGACA
AGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTATCATCGTCTTC
ACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTC
CAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCG
ACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTAC
CCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGA
CTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCA
ACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGG
CGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAA
CCCTGGACCTTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
配列番号５０
ＵＲＥ
UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUU
配列番号５１
ＣＳＥ
AUUUUGUUUUUAACAUUUC
配列番号５２
ＵＲＥ／ＣＳＥ
UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUC
配列番号５３
ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ＳＴＯＰ－ＵＲＥ
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAA
AAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAUUAAAACAGCCUGUGGGUUGAUCCCACCCACAGGCCCAU
UGGGCGCUAGCACUCUGGUAUCACGGUACCUUUGUGCGCCUGUUUUAUACCCCCUCCCCCAACUGUAACUUAGAAGUAAC
ACACACCGAUCAACAGUCAGCGUGGCACACCAGCCACGUUUUGAUCAAGCACUUCUGUUACCCCGGACUGAGUAUCAAUA
GACUGCUCACGCGGUUGAAGGAGAAAGCGUUCGUUAUCCGGCCAACUACUUCGAAAAACCUAGUAACACCGUGGAAGUUG
CAGAGUGUUUCGCUCAGCACUACCCCAGUGUAGAUCAGGUCGAUGAGUCACCGCAUUCCCCACGGGCGACCGUGGCGGUG
GCUGCGUUGGCGGCCUGCCCAUGGGGAAACCCAUGGGACGCUCUAAUACAGACAUGGUGCGAAGAGUCUAUUGAGCUAGU
UGGUAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACUGCGGAGCACACACCCUCAAGCCAGAGGGCAGUGUGUCGUAA
CGGGCAACUCUGCAGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCAUUUUAUUCCUAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAA
UUGAGAGAUCGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGACUAAUAGAGCUAUUAUAUAUCCCUUUGUUGGGUUU
AUACCACUUAGCUUGAAAGAGGUUAAAACAUUACAAUUCAUUGUUAAGUUGAAUACAGCAAAAUGGGAGUCAAAGUUCUG
UUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUGUGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAG
CAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCUGCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGA
UGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAGGGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUG
AAGAAGUUCAUCCCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGCGAGGCGAUCGU
CGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCCAUGGAGCAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACU
GCACAACUGGCUGCCUCAAAGGGCUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCG
ACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGACUAAUCAUAAUCAAUUUAUUAUUU
UCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUCAAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGC
GUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号５４
ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ＳＴＯＰ－ＵＲＥ／ＣＳＥ
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAA
AAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAUUAAAACAGCCUGUGGGUUGAUCCCACCCACAGGCCCAU
UGGGCGCUAGCACUCUGGUAUCACGGUACCUUUGUGCGCCUGUUUUAUACCCCCUCCCCCAACUGUAACUUAGAAGUAAC
ACACACCGAUCAACAGUCAGCGUGGCACACCAGCCACGUUUUGAUCAAGCACUUCUGUUACCCCGGACUGAGUAUCAAUA
GACUGCUCACGCGGUUGAAGGAGAAAGCGUUCGUUAUCCGGCCAACUACUUCGAAAAACCUAGUAACACCGUGGAAGUUG
CAGAGUGUUUCGCUCAGCACUACCCCAGUGUAGAUCAGGUCGAUGAGUCACCGCAUUCCCCACGGGCGACCGUGGCGGUG
GCUGCGUUGGCGGCCUGCCCAUGGGGAAACCCAUGGGACGCUCUAAUACAGACAUGGUGCGAAGAGUCUAUUGAGCUAGU
UGGUAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACUGCGGAGCACACACCCUCAAGCCAGAGGGCAGUGUGUCGUAA
CGGGCAACUCUGCAGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCAUUUUAUUCCUAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAA
UUGAGAGAUCGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGACUAAUAGAGCUAUUAUAUAUCCCUUUGUUGGGUUU
AUACCACUUAGCUUGAAAGAGGUUAAAACAUUACAAUUCAUUGUUAAGUUGAAUACAGCAAAAUGGGAGUCAAAGUUCUG
UUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUGUGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAG
CAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCUGCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGA
UGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAGGGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUG
AAGAAGUUCAUCCCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGCGAGGCGAUCGU
CGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCCAUGGAGCAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACU
GCACAACUGGCUGCCUCAAAGGGCUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCG
ACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGACUAAUCAUAAUCAAUUUAUUAUUU
UCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUCAAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGC
GUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号５５
実施例４２に使用される相補的プライマー
CACCGCTCAGGACAATCCTT
配列番号５６
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ
TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCT
GTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTT
TGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGG
CCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTC
GATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGC
TCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGC
GGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGT
GTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCG
GTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCAT
TGTTAAGTTGAATACAGCAAA
配列番号５７
Ｇｌｕｃ
ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAA
CATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGC
TGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATC
AAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGG
CATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGG
TCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGG
CTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAA
配列番号５８
終止突然変異を有するＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTT
GGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAAT
GCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTT
GCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCG
GCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGG
GCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGT
CGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACA
ACCATG
配列番号５９
スペーサー１
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAA
AAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA
スペーサー２
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGCGUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号６０
ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGGTTAAAT
TTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATGGACCGG
AGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCACTTCAAG
AAAAAGAAACTAGT
配列番号１（開始コドン）
ＡＵＧ
配列番号２（ＧＦＰ）
ＥＧＦＰ：
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaa
gttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagc
tgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag
cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaacta
caagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggagg
acggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac
ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacac
ccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacg
agaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
配列番号３（スタガー要素）
Ｐ２Ａ：gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacct
Ｔ２Ａ：gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccca
Ｅ２Ａ：cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc
その他：Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ
配列番号４ ＺＫＳＣＡＮイントロン
GTAAAAAGAGGTGAAACCTATTATGTGTGAGCAGGGCACAGACGTTGAAACTGGAGCCAGGAGAAGTATTGGCAGGCTTT
AGGTTATTAGGTGGTTACTCTGTCTTAAAAATGTTCTGGCTTTCTTCCTGCATCCACTGGCATACTCATGGTCTGTTTTT
AAATATTTTAATTCCCATTTACAAAGTGATTTACCCACAAGCCCAACCTGTCTGTCTTCAG
又は
GTAAGAAGCAAGGTTTCATTTAGGGGAAGGGAAATGATTCAGGACGAGAGTCTTTGTGCTGCTGAGTGCCTGTGATGAAG
AAGCATGTTAGTcctgggcaacgtagcgagaccccatctctacaaaaaatagaaaaattagccaggtatagtggcgcaca
cctgtgattccagctacgcaggaggctgaggtgggaggattgcttgagcccaggaggttgaggctgcagtgagctgtaat
catgccactactccaacctgggcaacacagcaaggaccctgtctcaaaaGCTACTTACAGAAAAGAATTAggctcggcac
ggtagctcacacctgtaatcccagcactttgggaggctgaggcgggcagatcacttgaggtcaggagtttgagaccagcc
tggccaacatggtgaaaccttgtctctactaaaaatatgaaaattagccaggcatggtggcacattcctgtaatcccagc
tactcgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccaggaggtggaggttgcagtaagccgagatcgtaccactgtgct
ctagccttggtgacagagcgagactgtcttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaattaattaaaaatttaaaaaaaaatg
aaaaaaaGCTGCATGCTTGTTTTTTGTTTTTAGTTATTCTACATTGTTGTCATTATTACCAAATATTGGGGAAAATACAA
CTTACAGACCAATCTCAGGAGTTAAATGTTACTACGAAGGCAAATGAACTATGCGTAATGAACCTGGTAGGCATTA
配列番号５（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）：
Acgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtctttt
ggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaat
gcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgacccttt
gcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcg
gcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggg
gctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagt
cgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataata
配列番号６（ａｄｄｇｅｎｅ ｐ３．１ラッカーゼ）
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ラッカーゼ２ ＭＣＳエクソンベクター配列 ６９２６ｂｐ
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTAT
CTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGA
CAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATT
GATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAA
CTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGT
AACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGT
ATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA
TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAA
TGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC
AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAG
GTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAG
GGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCCAT
TGAGAAATGACTGAGTTCCGGTGCTCTCAAGTCATTGATCTTTGTCGACTTTTATTTGGTCTCTGTAATAACGACTTCAA
AAACATTAAATTCTGTTGCGAAGCCAGTAAGCTACAAAAAGAAAaaacaagagagaatgctatagtcgtatagtatagtt
tcccgactatctgatacccattacttatctagggggaatgcgaacccaaaattttatcagttttctcggatatcgataga
tattggggaataaatttaaataaataaattttgggcgggtttagggcgtggcaaaaagttttttggcaaatcgctagaaa
tttacaagacttataaaattatgaaaaaatacaacaaaattttaaacacgtgggcgtgacagttttggGcggttttaggg
cgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttcct
tctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataaTAATAAGCTAAATCG
AGACTAAGttttattgttatatatattttttttattttatGCAGAAATTAATTAAACCGGTCCTGCAGGTGATCAGGCGC
GCCGGTTACCGGCCGGCCCCGCGGAGCGTAAGTATTCAAAATTCCAAAATTTTTTACTAGAAATATTCGATTTTTTAATA
GGCAGTTTCTATACTATTGTATACTATTGtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatg
taaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattGttttattaccgc
cgagacatcaggaactataaaagctagaaggatgagttttagcatacagattctagagacaaggacgcagagcaagtttg
ttgatccatgctgccacgctttaactttctcaaattgcccaaaactgccatgcccacatttttgaactattttcgaaatt
ttttcataattgtattactcgtgtaaatttccatcaatttgccaaaaaactttttgtcacgcgttaacgccctaaagccg
ccaatttggtcacgcccacactattgaGcaattatcaaattttttctcattttattccccaatatctatcgatatccccg
attatgaaattattaaatttcgcgttcgcattcacactagctgagtaacgagtatctgatagttggggaaatcgactTAT
TTTTTATATACAATGAAAATGAATTTAATCATATGAATATCGATTATAGCTTTTTATTTAATATGAATATTTATTTGGGC
TTAAGGTGTAACCTcctcgacataagactcacatggcgcaggcacattgaagacaaaaatactcaTTGTCGGGTCTCGCA
CCCTCCAGCAGCACCTAAAATTATGTCTTCAATTATTGCCAACATTGGAGACACAATTAGTCTGTGGCACCTCAGGCGGC
CGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGC
CCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCA
TTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCA
GGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCG
CCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCC
CGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTT
TAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
CCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAAC
ACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGA
TTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAG
GCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGT
ATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAG
TTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTAT
TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGA
TCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGT
GGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGG
GGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGG
CTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGA
AGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGC
TGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAA
GCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGC
GCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCT
TTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCT
GAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTT
CTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATC
ACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCC
TCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGC
AATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATC
TTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTT
ATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTC
ACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACG
CGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGC
GGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGA
GCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGA
GCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAA
GCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCG
CTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCC
CGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG
CAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTAC
GGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG
ATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAG
AAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTA
TCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG
GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGAC
TCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGC
TCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGC
CTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCA
TTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTT
ACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGT
GTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTG
AGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACC
GCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCT
GTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGT
GAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTT
TTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACA
AATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
配列番号８（ＲＦＰ）
ｍＣｈｅｒｒｙ：
atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgt
gaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtga
ccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcac
cccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacgg
cggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaact
tcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggc
gccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaa
ggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactaca
ccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag
配列番号９（リボスイッチ）
アプタザイム（テオフィリン依存性、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ２０１０ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓ
ｙｓを参照されたい）：
cugagaugcagguacauccagcugaugagucccaaauaggacgaaagccauaccagccgaaaggcccuuggcaggguucc
uggauuccacugcuauccac
配列番号１０（ルシフェラーゼ）
ｎＬｕｃ：
ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGG
AGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGC
TGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAG
GTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAA
CATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGT
GGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTG
ACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAA
配列番号１１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号１２
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号１３
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACC
CTGGACCTCT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号１４
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）についてのスプリン
ト
GGTGGCTCCCAGGCGCAGTT
配列番号１５
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）についてのスプリント
GGTGGCTCCCAGTTACTATC
配列番号１６
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）についての
スプリント
GGTGGCTCCCAGAGGTCCAG
配列番号１７
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏ
ｐ（８７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGT
ACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGG
GAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGG
GGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTG
GGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTC
GGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCC
GTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACT
TTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTAT
GAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCG
CCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTC
TGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２６５：Ｔ２Ａ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
配列番号１８
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐ（７６２
ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGT
ACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGG
GAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCAT
CGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAG
GTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTG
AAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGT
GGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACA
TGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGG
AACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGAC
CGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTGATAGTAACT
５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２１１：三重終止コドン
２１２～７５１：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
７５２～７６０：三重終止コドン
配列番号１９
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACC
CTGGACCTCT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号２０
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号２１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATA
AGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTG
TGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGA
CCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号２２
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（９５４ｂ
ｐ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGC
CGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC
AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGC
GACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTG
CAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTC
AACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATG
TGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA
TGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGAC
TACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAA
AGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAG
CATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAA
CTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～８８６：３ＸＦＡＬＧ－ＥＧＦ
８８７～９５２：Ｐ２Ａ
配列番号２３
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（１３１４ｎｔ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGC
CGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC
AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGC
GACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTG
CAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTC
AACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATG
TGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA
TGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGAC
TACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAA
AGCCATTGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAAC
AGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAAT
GGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTT
TAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGC
CGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACC
CTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGG
AGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAG
ACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTGATAGTAACT
５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
１３０４～１３１２：三重終止コドン
配列番号２４
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（１３０５ｎｔ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGC
CGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC
AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGC
GACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTG
CAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTC
AACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATG
TGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA
TGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGAC
TACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAA
AGCCATTGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAAC
AGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAAT
GGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTT
TAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGC
CGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACC
CTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGG
AGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAG
ACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
配列番号２５
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－ＮＬｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（
８８２ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGT
ACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGG
GAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGG
GGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTG
GGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTC
GGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCC
GTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACT
TTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTAT
GAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCG
CCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTC
TGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTGATAGTAA
CT
５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－ＮＬｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
８７２～８８０：三重終止コドン
配列番号２６
例示的な反復スペーサー配列
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATTATGCGTTACCGGCGAGACGCTACGGACTTGGGAAAATCCGTTGACCTTAAACGG
TCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCACGCCGGAAACGCAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAA
ACCAAAAAAACAAAACACA
配列番号２７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるフォワード
プライマー
CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGC
配列番号２８
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから０．５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用される
リバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATG
配列番号２９
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから１ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバ
ースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGG
配列番号３０
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバ
ースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAA
AGCC
配列番号３１
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから４ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバ
ースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGC
配列番号３２
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバ
ースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGAC
配列番号３３
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから６．２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用される
リバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACATTTCGATAAGCCAGTAAGCAGTGGGTTCT
CTAG
配列番号３４
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるフ
ォワードｑＰＣＲプライマー
ATTCTTGCCCGCCTGATGAA
配列番号３５
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるリ
バースｑＰＣＲプライマー
TTGCTCATGGAAAACGGTGT
配列番号３６
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるフ
ォワードｑＰＣＲプライマー
TGATCCTGCACTATGGCACA
配列番号３７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるリ
バースｑＰＣＲプライマー
CTGGACTAGTGGATCCGAGC
配列番号３８
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
GACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGG
配列番号３９
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GGTGTTGAAGGTCTCAAACATG
配列番号４０
ＲＩＧ－Ｉを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
TGTGGGCAATGTCATCAAAA
配列番号４２
ＲＩＧ－Ｉを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GAAGCACTTGCTACCTCTTGC
配列番号４２
ＭＤＡ５を検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
GGCACCATGGGAAGTGATT
配列番号４３
ＭＤＡ５を検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG
配列番号４４
ＰＫＲを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
TCGCTGGTATCACTCGTCTG
配列番号４５
ＰＫＲを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GATTCTGAAGACCGCCAGAG
配列番号４６
ＩＦＮ－βを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC
配列番号４７
ＩＦＮ－βを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG
配列番号４８
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＡＬＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ
ＩＳ
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCG
CTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGA
AACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTC
GTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGTAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCC
ACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACG
TTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAG
GTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCA
GGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGG
GCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATC
GACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
GTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCG
AGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTC
GTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGC
CATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGT
TCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAG
CTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGAT
CCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGC
TGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTG
CTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAA
TTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCG
ACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTATCATCGTCTTCACACTCGAA
GATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTT
TCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATG
TCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGAT
GATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGG
ACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTA
TCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGC
GAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACC
TTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
配列番号４９
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＡＬＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ
ＩＳ
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCG
CTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGA
AACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTC
GTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGTAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCC
ACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACG
TTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAG
GTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCA
GGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGG
GCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATC
GACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
GTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCG
AGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTC
GTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGC
CATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGT
TCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAG
CTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGAT
CCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGC
TGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTG
CTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAA
TTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTTGATAGTAAGACTACAAGGACGACGACGACA
AGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTATCATCGTCTTC
ACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTC
CAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCG
ACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTAC
CCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGA
CTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCA
ACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGG
CGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAA
CCCTGGACCTTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
配列番号５０
ＵＲＥ
UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUU
配列番号５１
ＣＳＥ
AUUUUGUUUUUAACAUUUC
配列番号５２
ＵＲＥ／ＣＳＥ
UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUC
配列番号５３
ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ＳＴＯＰ－ＵＲＥ
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAA
AAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAUUAAAACAGCCUGUGGGUUGAUCCCACCCACAGGCCCAU
UGGGCGCUAGCACUCUGGUAUCACGGUACCUUUGUGCGCCUGUUUUAUACCCCCUCCCCCAACUGUAACUUAGAAGUAAC
ACACACCGAUCAACAGUCAGCGUGGCACACCAGCCACGUUUUGAUCAAGCACUUCUGUUACCCCGGACUGAGUAUCAAUA
GACUGCUCACGCGGUUGAAGGAGAAAGCGUUCGUUAUCCGGCCAACUACUUCGAAAAACCUAGUAACACCGUGGAAGUUG
CAGAGUGUUUCGCUCAGCACUACCCCAGUGUAGAUCAGGUCGAUGAGUCACCGCAUUCCCCACGGGCGACCGUGGCGGUG
GCUGCGUUGGCGGCCUGCCCAUGGGGAAACCCAUGGGACGCUCUAAUACAGACAUGGUGCGAAGAGUCUAUUGAGCUAGU
UGGUAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACUGCGGAGCACACACCCUCAAGCCAGAGGGCAGUGUGUCGUAA
CGGGCAACUCUGCAGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCAUUUUAUUCCUAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAA
UUGAGAGAUCGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGACUAAUAGAGCUAUUAUAUAUCCCUUUGUUGGGUUU
AUACCACUUAGCUUGAAAGAGGUUAAAACAUUACAAUUCAUUGUUAAGUUGAAUACAGCAAAAUGGGAGUCAAAGUUCUG
UUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUGUGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAG
CAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCUGCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGA
UGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAGGGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUG
AAGAAGUUCAUCCCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGCGAGGCGAUCGU
CGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCCAUGGAGCAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACU
GCACAACUGGCUGCCUCAAAGGGCUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCG
ACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGACUAAUCAUAAUCAAUUUAUUAUUU
UCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUCAAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGC
GUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号５４
ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ＳＴＯＰ－ＵＲＥ／ＣＳＥ
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAA
AAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAUUAAAACAGCCUGUGGGUUGAUCCCACCCACAGGCCCAU
UGGGCGCUAGCACUCUGGUAUCACGGUACCUUUGUGCGCCUGUUUUAUACCCCCUCCCCCAACUGUAACUUAGAAGUAAC
ACACACCGAUCAACAGUCAGCGUGGCACACCAGCCACGUUUUGAUCAAGCACUUCUGUUACCCCGGACUGAGUAUCAAUA
GACUGCUCACGCGGUUGAAGGAGAAAGCGUUCGUUAUCCGGCCAACUACUUCGAAAAACCUAGUAACACCGUGGAAGUUG
CAGAGUGUUUCGCUCAGCACUACCCCAGUGUAGAUCAGGUCGAUGAGUCACCGCAUUCCCCACGGGCGACCGUGGCGGUG
GCUGCGUUGGCGGCCUGCCCAUGGGGAAACCCAUGGGACGCUCUAAUACAGACAUGGUGCGAAGAGUCUAUUGAGCUAGU
UGGUAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACUGCGGAGCACACACCCUCAAGCCAGAGGGCAGUGUGUCGUAA
CGGGCAACUCUGCAGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCAUUUUAUUCCUAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAA
UUGAGAGAUCGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGACUAAUAGAGCUAUUAUAUAUCCCUUUGUUGGGUUU
AUACCACUUAGCUUGAAAGAGGUUAAAACAUUACAAUUCAUUGUUAAGUUGAAUACAGCAAAAUGGGAGUCAAAGUUCUG
UUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUGUGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAG
CAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCUGCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGA
UGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAGGGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUG
AAGAAGUUCAUCCCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGCGAGGCGAUCGU
CGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCCAUGGAGCAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACU
GCACAACUGGCUGCCUCAAAGGGCUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCG
ACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGACUAAUCAUAAUCAAUUUAUUAUUU
UCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUCAAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGC
GUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号５５
実施例４２に使用される相補的プライマー
CACCGCTCAGGACAATCCTT
配列番号５６
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ
TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCT
GTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTT
TGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGG
CCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTC
GATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGC
TCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGC
GGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGT
GTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCG
GTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCAT
TGTTAAGTTGAATACAGCAAA
配列番号５７
Ｇｌｕｃ
ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAA
CATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGC
TGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATC
AAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGG
CATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGG
TCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGG
CTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAA
配列番号５８
終止突然変異を有するＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTT
GGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAAT
GCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTT
GCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCG
GCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGG
GCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGT
CGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACA
ACCATG
配列番号５９
スペーサー１
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAA
AAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA
スペーサー２
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGCGUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号６０
ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGGTTAAAT
TTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATGGACCGG
AGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCACTTCAAG
AAAAAGAAACTAGT
【0554】
実施形態の段落
[1]対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列
の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される、方法。
[1]対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列
の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される、方法。
【0555】
[2]対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１
６日間の期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現が約４０％を超えて低下
しないように構成される、方法。
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１
６日間の期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現が約４０％を超えて低下
しないように構成される、方法。
【0556】
[3]対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内における１つ以上の発現配列の発現が、少
なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間にわたって約４０％を超えて変化し
ないレベルに維持されるように構成される、方法。
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内における１つ以上の発現配列の発現が、少
なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間にわたって約４０％を超えて変化し
ないレベルに維持されるように構成される、方法。
【0557】
[4]１つ以上の発現配列の発現産物は、治療用タンパク質を含む、段落[1]～[3]のいず
れか１つに記載の方法。
[5]治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担
体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、
構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性を有する、段落[4]
に記載の方法。
れか１つに記載の方法。
[5]治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担
体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、
構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性を有する、段落[4]
に記載の方法。
【0558】
[6]１つ以上の発現配列の発現産物は、分泌タンパク質を含む、段落[1]～[5]のいずれ
か１つに記載の方法。
[7]分泌タンパク質は、分泌酵素を含む、段落[6]に記載の方法。
か１つに記載の方法。
[7]分泌タンパク質は、分泌酵素を含む、段落[6]に記載の方法。
【0559】
[8]分泌タンパク質は、分泌抗体を含む、段落[6]に記載の方法。
[9]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０
ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なく
とも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレ
オチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくと
も約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，００
０ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレ
オチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、
少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なく
とも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも
約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１
７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，
０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである、段落[1]～[8]の
いずれか１つに記載の方法。
[9]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０
ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なく
とも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレ
オチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくと
も約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，００
０ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレ
オチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、
少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なく
とも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも
約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１
７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，
０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである、段落[1]～[8]の
いずれか１つに記載の方法。
【0560】
[10]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間、２時間、６時間、１２時間、
１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日
間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日
間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日
間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超え
る時間又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内で持続性を有する、段落[1]～[9]の
いずれか１つに記載の方法。
１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日
間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日
間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日
間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超え
る時間又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内で持続性を有する、段落[1]～[9]の
いずれか１つに記載の方法。
【0561】
[11]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間、２時間、６時間、１２時間、
１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日
間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日
間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日
間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超え
る時間又はそれらの間の任意の時間にわたり、細胞が分裂しているときに細胞内で持続性
を有する、段落[1]～[10]のいずれか１つに記載の方法。
１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日
間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日
間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日
間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超え
る時間又はそれらの間の任意の時間にわたり、細胞が分裂しているときに細胞内で持続性
を有する、段落[1]～[10]のいずれか１つに記載の方法。
【0562】
[12]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間、２時間、６時間、１２時間、
１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日
間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日
間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日
間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超え
る時間又はそれらの間の任意の時間にわたって分割後の細胞内で持続性を有する、段落[1
]～[11]のいずれか１つに記載の方法。
１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日
間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日
間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日
間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超え
る時間又はそれらの間の任意の時間にわたって分割後の細胞内で持続性を有する、段落[1
]～[11]のいずれか１つに記載の方法。
【0563】
[13]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスペーサー配列を含む、段落[1]
～[12]のいずれか１つに記載の方法。
[14]スペーサー配列は、スペーサー配列の両側の環状ポリリボヌクレオチドの要素間の
立体配座柔軟性を与えるように構成される、段落[13]に記載の方法。
～[12]のいずれか１つに記載の方法。
[14]スペーサー配列は、スペーサー配列の両側の環状ポリリボヌクレオチドの要素間の
立体配座柔軟性を与えるように構成される、段落[13]に記載の方法。
【0564】
[15]環状ポリリボヌクレオチド、例えば発現配列のスペーサー配列対非スペーサー配列
の比率は、約０．０５：１、約０．０６：１、約０．０７：１、約０．０８：１、約０．
０９：１、約０．１：１、約０．１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．
１７５：１、約０．２：１、約０．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．
３５：１、約０．４：１、約０．４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：
１、約０．６５：１、約０．７：１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、
約０．９：１、約０．９５：１、約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０
５：１、約１．１：１、約１．１５：１、約１．２：１、約１．２５：１、約１．３：１
、約１．３５：１、約１．４：１、約１．４５：１、約１．５：１、約１．５５：１、約
１．６：１、約１．６５：１、約１．７：１、約１．７５：１、約１．８：１、約１．８
５：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１又は約２：
１である、段落[13]又は[14]に記載の方法。
の比率は、約０．０５：１、約０．０６：１、約０．０７：１、約０．０８：１、約０．
０９：１、約０．１：１、約０．１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．
１７５：１、約０．２：１、約０．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．
３５：１、約０．４：１、約０．４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：
１、約０．６５：１、約０．７：１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、
約０．９：１、約０．９５：１、約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０
５：１、約１．１：１、約１．１５：１、約１．２：１、約１．２５：１、約１．３：１
、約１．３５：１、約１．４：１、約１．４５：１、約１．５：１、約１．５５：１、約
１．６：１、約１．６５：１、約１．７：１、約１．７５：１、約１．８：１、約１．８
５：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１又は約２：
１である、段落[13]又は[14]に記載の方法。
【0565】
[16]スペーサー配列は、少なくとも３リボヌクレオチド、少なくとも４リボヌクレオチ
ド、少なくとも５リボヌクレオチド、少なくとも約８リボヌクレオチド、少なくとも約１
０リボヌクレオチド、少なくとも約１２リボヌクレオチド、少なくとも約１５リボヌクレ
オチド、少なくとも約２０リボヌクレオチド、少なくとも約２５リボヌクレオチド、少な
くとも約３０リボヌクレオチド、少なくとも約４０リボヌクレオチド、少なくとも約５０
リボヌクレオチド、少なくとも約６０リボヌクレオチド、少なくとも約７０リボヌクレオ
チド、少なくとも約８０リボヌクレオチド、少なくとも約９０リボヌクレオチド、少なく
とも約１００リボヌクレオチド、少なくとも約１２０リボヌクレオチド、少なくとも約１
５０リボヌクレオチド、少なくとも約２００リボヌクレオチド、少なくとも約２５０リボ
ヌクレオチド、少なくとも約３００リボヌクレオチド、少なくとも約４００リボヌクレオ
チド、少なくとも約５００リボヌクレオチド、少なくとも約６００リボヌクレオチド、少
なくとも約７００リボヌクレオチド、少なくとも約８００リボヌクレオチド、少なくとも
約９００リボヌクレオチド又は少なくとも約１００リボヌクレオチドを含む、段落[13]～
[15]のいずれか１つに記載の方法。
ド、少なくとも５リボヌクレオチド、少なくとも約８リボヌクレオチド、少なくとも約１
０リボヌクレオチド、少なくとも約１２リボヌクレオチド、少なくとも約１５リボヌクレ
オチド、少なくとも約２０リボヌクレオチド、少なくとも約２５リボヌクレオチド、少な
くとも約３０リボヌクレオチド、少なくとも約４０リボヌクレオチド、少なくとも約５０
リボヌクレオチド、少なくとも約６０リボヌクレオチド、少なくとも約７０リボヌクレオ
チド、少なくとも約８０リボヌクレオチド、少なくとも約９０リボヌクレオチド、少なく
とも約１００リボヌクレオチド、少なくとも約１２０リボヌクレオチド、少なくとも約１
５０リボヌクレオチド、少なくとも約２００リボヌクレオチド、少なくとも約２５０リボ
ヌクレオチド、少なくとも約３００リボヌクレオチド、少なくとも約４００リボヌクレオ
チド、少なくとも約５００リボヌクレオチド、少なくとも約６００リボヌクレオチド、少
なくとも約７００リボヌクレオチド、少なくとも約８００リボヌクレオチド、少なくとも
約９００リボヌクレオチド又は少なくとも約１００リボヌクレオチドを含む、段落[13]～
[15]のいずれか１つに記載の方法。
【0566】
[17]スペーサー配列は、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％
、６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％
、２０％又はそれらの間の任意のパーセンテージのアデニンリボヌクレオチドを含む、段
落[13]～[16]のいずれか１つに記載の方法。
、６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％
、２０％又はそれらの間の任意のパーセンテージのアデニンリボヌクレオチドを含む、段
落[13]～[16]のいずれか１つに記載の方法。
【0567】
[18]環状ポリリボヌクレオチドは、ローリング翻訳の能力がある、段落[1]～[17]のい
ずれか１つに記載の方法。
[19]１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要
素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻
訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成する、段落[18]に記載の方法。
ずれか１つに記載の方法。
[19]１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要
素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻
訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成する、段落[18]に記載の方法。
【0568】
[20]スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の
発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する、段落[19]に記載
の方法。
発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する、段落[19]に記載
の方法。
【0569】
[21]スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である、段落[19]又は
[20]に記載の方法。
[22]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む、段落[19]又は[20]
に記載の方法。
[20]に記載の方法。
[22]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む、段落[19]又は[20]
に記載の方法。
【0570】
[23]環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型
翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０
％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が
別個のポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上
の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、段落[18]～[22]のいずれか
１つに記載の方法。
翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０
％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が
別個のポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上
の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、段落[18]～[22]のいずれか
１つに記載の方法。
【0571】
[24]環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型
翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０
％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が
別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率
は、インビトロ翻訳系において試験される、段落[23]に記載の方法。
翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０
％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が
別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率
は、インビトロ翻訳系において試験される、段落[23]に記載の方法。
【0572】
[25]インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む、段落[24]に記載の方法。
[26]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にあり、スタガ
ー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞
させるように構成される、段落[19]～[25]のいずれか１つに記載の方法。
[26]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にあり、スタガ
ー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞
させるように構成される、段落[19]～[25]のいずれか１つに記載の方法。
【0573】
[27]スタガー要素は、２Ａ配列及び２Ａ様配列からなる群から選択されるペプチド配列
をコードする、段落[19]～[26]のいずれか１つに記載の方法。
[28]スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする、段落[19]～[2
7]のいずれか１つに記載の方法。
をコードする、段落[19]～[26]のいずれか１つに記載の方法。
[28]スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする、段落[19]～[2
7]のいずれか１つに記載の方法。
【0574】
[29]スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である
）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、段落[19]～[28]のいずれか
１つに記載の方法。
）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、段落[19]～[28]のいずれか
１つに記載の方法。
【0575】
[30]スタガー要素は、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、Ｉ
ＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶ
ＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮ
ＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮ
ＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰからなる群から
選択される配列をコードする、段落[19]～[29]のいずれか１つに記載の方法。
ＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶ
ＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮ
ＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮ
ＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰからなる群から
選択される配列をコードする、段落[19]～[29]のいずれか１つに記載の方法。
【0576】
[31]スタガー要素は、１つ以上の発現配列のそれぞれの３’末端にある、段落[19]～[3
0]のいずれか１つに記載の方法。
[32]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、環状ポリリボヌ
クレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側
）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後続
の発現配列の連続した翻訳を可能にする、段落[19]～[31]のいずれか１つに記載の方法。
0]のいずれか１つに記載の方法。
[32]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、環状ポリリボヌ
クレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側
）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後続
の発現配列の連続した翻訳を可能にする、段落[19]～[31]のいずれか１つに記載の方法。
【0577】
[33]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、連続して翻訳さ
れた環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上
流（５’末端側）にあり、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２
の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチ
ドは、連続して翻訳されておらず、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガ
ー要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素と第１
の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８
倍、９倍、１０倍大きい距離にある、段落[19]～[32]のいずれか１つに記載の方法。
れた環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上
流（５’末端側）にあり、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２
の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチ
ドは、連続して翻訳されておらず、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガ
ー要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素と第１
の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８
倍、９倍、１０倍大きい距離にある、段落[19]～[32]のいずれか１つに記載の方法。
【0578】
[34]スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎ
ｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎ
ｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎ
ｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎ
ｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える、段落[19]～[33]のいずれか１つに記載の方法
。
ｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎ
ｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎ
ｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎ
ｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える、段落[19]～[33]のいずれか１つに記載の方法
。
【0579】
[35]第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、スタガー要素と第１の翻訳
開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８
ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎ
ｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎ
ｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれ
を超えて大きい、段落[19]～[34]のいずれか１つに記載の方法。
開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８
ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎ
ｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎ
ｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれ
を超えて大きい、段落[19]～[34]のいずれか１つに記載の方法。
【0580】
[36]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配列は、第１の発現
配列以外の発現配列である、段落[19]～[35]のいずれか１つに記載の方法。
[37]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の後続の発現配列は、第１の発
現配列である、段落[19]～[35]のいずれか１つに記載の方法。
配列以外の発現配列である、段落[19]～[35]のいずれか１つに記載の方法。
[37]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の後続の発現配列は、第１の発
現配列である、段落[19]～[35]のいずれか１つに記載の方法。
【0581】
[38]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；及び
ｆ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素を含む、段落[1]～[37]のいずれか１つに記載
の方法。
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；及び
ｆ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素を含む、段落[1]～[37]のいずれか１つに記載
の方法。
【0582】
[39]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、段落[1]～[38]のいずれか１つに記載
の方法。
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、段落[1]～[38]のいずれか１つに記載
の方法。
【0583】
[40]環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５％、少なくとも１０％
、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なく
とも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０
％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少な
くとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少な
くとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍又は少なくとも１
００倍高い翻訳効率を有する、段落[1]～[39]のいずれか１つに記載の方法。
、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なく
とも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０
％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少な
くとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少な
くとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍又は少なくとも１
００倍高い翻訳効率を有する、段落[1]～[39]のいずれか１つに記載の方法。
【0584】
[41]環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有す
る、段落[1]～[40]のいずれか１つに記載の方法。
[42]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[1]～[41]のいずれか１つに記載の方法。
る、段落[1]～[40]のいずれか１つに記載の方法。
[42]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[1]～[41]のいずれか１つに記載の方法。
【0585】
[43]環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を含む、[1]～[42]のいず
れか１つに記載の方法。
[44]環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、[1]～[42]
のいずれか１つに記載の方法。
れか１つに記載の方法。
[44]環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、[1]～[42]
のいずれか１つに記載の方法。
【0586】
[45]１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、[1]～[43]のいずれか１つに記
載の方法。
[46]疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つの
二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、[38]～[45]のいずれか１つに記載の方法。
載の方法。
[46]疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つの
二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、[38]～[45]のいずれか１つに記載の方法。
【0587】
[47]疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第
２の配列を含む、段落[38]又は[46]に記載の方法。
[48]エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、段落[38]～[47]のいずれか１つ
に記載の方法。
２の配列を含む、段落[38]又は[46]に記載の方法。
[48]エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、段落[38]～[47]のいずれか１つ
に記載の方法。
【0588】
[49]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む、段
落[38]～[48]のいずれか１つに記載の方法。
[50]環状ポリリボヌクレオチドは、その全長の一部に修飾リボヌクレオチドを含む、段
落[38]～[49]のいずれか１つに記載の方法。
落[38]～[48]のいずれか１つに記載の方法。
[50]環状ポリリボヌクレオチドは、その全長の一部に修飾リボヌクレオチドを含む、段
落[38]～[49]のいずれか１つに記載の方法。
【0589】
[51]エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチド、例えばプソイドウ
リジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[38]～[50]のいずれか１つに
記載の方法。
リジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[38]～[50]のいずれか１つに
記載の方法。
【0590】
[52]エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパク
質を含む、段落[38]～[51]のいずれか１つに記載の方法。
[53]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫
タンパク質結合部位を含む、段落[38]～[52]のいずれか１つに記載の方法。
質を含む、段落[38]～[51]のいずれか１つに記載の方法。
[53]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫
タンパク質結合部位を含む、段落[38]～[52]のいずれか１つに記載の方法。
【0591】
[54]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、Ｔ
ＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ－βの少なくと
も１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲン
を欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[38]～[53]のいずれか１
つに記載の方法。
ＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ－βの少なくと
も１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲン
を欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[38]～[53]のいずれか１
つに記載の方法。
【0592】
[55]環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む、段落[38]～[54]のいず
れか１つに記載の方法。
[56]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[38]～[55]のいず
れか１つに記載の方法。
れか１つに記載の方法。
[56]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[38]～[55]のいず
れか１つに記載の方法。
【0593】
[57]環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、
例えばストレス条件下での発現を含む、段落[38]～[56]のいずれか１つに記載の方法。
[58]環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素、例えば２Ａを含む、段落[38]～[57]
のいずれか１つに記載の方法。
例えばストレス条件下での発現を含む、段落[38]～[56]のいずれか１つに記載の方法。
[58]環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素、例えば２Ａを含む、段落[38]～[57]
のいずれか１つに記載の方法。
【0594】
[59]環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む、
段落[38]～[58]のいずれか１つに記載の方法。
[60]環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基～約２０ｋｂの範囲のサイズを有する、
段落[38]～[59]のいずれか１つに記載の方法。
段落[38]～[58]のいずれか１つに記載の方法。
[60]環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基～約２０ｋｂの範囲のサイズを有する、
段落[38]～[59]のいずれか１つに記載の方法。
【0595】
[61]環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチドの環状化によって合成される
、段落[38]～[60]のいずれか１つに記載の方法。
[62]環状ポリリボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む、段
落[38]～[61]のいずれか１つに記載の方法。
、段落[38]～[60]のいずれか１つに記載の方法。
[62]環状ポリリボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む、段
落[38]～[61]のいずれか１つに記載の方法。
【0596】
[63]環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に
抵抗性である、段落[38]～[62]のいずれか１つに記載の方法。
[64]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[38]～[63]のいずれか１つに記載の方法。
抵抗性である、段落[38]～[62]のいずれか１つに記載の方法。
[64]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[38]～[63]のいずれか１つに記載の方法。
【0597】
[65]
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；
ｆ）疑似二本鎖二次構造；及び
ｇ）発現配列；
から選択される少なくとも１つの構造要素と、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性と
を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；
ｆ）疑似二本鎖二次構造；及び
ｇ）発現配列；
から選択される少なくとも１つの構造要素と、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性と
を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。
【0598】
[66]環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する、段落[65]に記載の組成物。
[67]疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つの
二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、段落[65]又は[66]に記載の組成物。
[67]疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つの
二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、段落[65]又は[66]に記載の組成物。
【0599】
[68]疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第
２の配列を含む、段落[65]～[67]のいずれか１つに記載の組成物。
[69]エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、段落[65]～[68]のいずれか１つ
に記載の組成物。
２の配列を含む、段落[65]～[67]のいずれか１つに記載の組成物。
[69]エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、段落[65]～[68]のいずれか１つ
に記載の組成物。
【0600】
[70]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む、段
落[65]～[69]のいずれか１つに記載の組成物。
[71]エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチド、例えばプソイドウ
リジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[65]～[70]のいずれか１つに
記載の組成物。
落[65]～[69]のいずれか１つに記載の組成物。
[71]エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチド、例えばプソイドウ
リジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[65]～[70]のいずれか１つに
記載の組成物。
【0601】
[72]エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパク
質を含む、段落[65]～[71]のいずれか１つに記載の組成物。
[73]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫
タンパク質結合部位を含む、段落[65]～[72]のいずれか１つに記載の組成物。
質を含む、段落[65]～[71]のいずれか１つに記載の組成物。
[73]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫
タンパク質結合部位を含む、段落[65]～[72]のいずれか１つに記載の組成物。
【0602】
[74]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、Ｔ
ＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ－βの少なくと
も１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲン
を欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[65]～[73]のいずれか１
つに記載の組成物。
ＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ－βの少なくと
も１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲン
を欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[65]～[73]のいずれか１
つに記載の組成物。
【0603】
[75]環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む、段落[65]～[74]のいず
れか１つに記載の組成物。
[76]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[65]～[75]のいず
れか１つに記載の組成物。
れか１つに記載の組成物。
[76]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[65]～[75]のいず
れか１つに記載の組成物。
【0604】
[77]環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、
例えばストレス条件下での発現を含む、段落[65]～[76]のいずれか１つに記載の組成物。
[78]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ポリペプチドをコードする少なくとも１つ
の発現配列を含む、段落[65]～[77]のいずれか１つに記載の組成物。
例えばストレス条件下での発現を含む、段落[65]～[76]のいずれか１つに記載の組成物。
[78]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ポリペプチドをコードする少なくとも１つ
の発現配列を含む、段落[65]～[77]のいずれか１つに記載の組成物。
【0605】
[79]発現配列は、ペプチド又はポリヌクレオチドをコードする、段落[78]に記載の組成
物。
[80]環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素、例えば２Ａを含む、段落[65]～[79]
のいずれか１つに記載の組成物。
物。
[80]環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素、例えば２Ａを含む、段落[65]～[79]
のいずれか１つに記載の組成物。
【0606】
[81]環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む、
段落[65]～[80]のいずれか１つに記載の組成物。
[82]環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基～約２０ｋｂの範囲のサイズを有する、
段落[65]～[81]のいずれか１つに記載の組成物。
段落[65]～[80]のいずれか１つに記載の組成物。
[82]環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基～約２０ｋｂの範囲のサイズを有する、
段落[65]～[81]のいずれか１つに記載の組成物。
【0607】
[83]環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチドの環状化によって合成される
、段落[65]～[82]のいずれか１つに記載の組成物。
[84]環状ポリリボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む、段
落[65]～[83]のいずれか１つに記載の組成物。
、段落[65]～[82]のいずれか１つに記載の組成物。
[84]環状ポリリボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む、段
落[65]～[83]のいずれか１つに記載の組成物。
【0608】
[85]環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に
抵抗性である、段落[65]～[84]のいずれか１つに記載の組成物。
[86]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[65]～[85]のいずれか１つに記載の組成物。
抵抗性である、段落[65]～[84]のいずれか１つに記載の組成物。
[86]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[65]～[85]のいずれか１つに記載の組成物。
【0609】
[87]段落[65]～[86]のいずれか１つに記載の組成物を製造する方法であって、環状ポリ
リボヌクレオチドを薬学的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせる工程を含む方法。
[88]治療の方法であって、段落[65]～[86]のいずれか１つに記載の組成物を投与する工
程を含む方法。
リボヌクレオチドを薬学的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせる工程を含む方法。
[88]治療の方法であって、段落[65]～[86]のいずれか１つに記載の組成物を投与する工
程を含む方法。
【0610】
[89]タンパク質発現の方法であって、段落[65]～[86]のいずれか１つに記載の環状ポリ
リボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
[90]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビトロで行われる、段
落[89]に記載の方法。
リボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
[90]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビトロで行われる、段
落[89]に記載の方法。
【0611】
[91]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビボで行われる、段落
[89]に記載の方法。
[92]段落[65]～[86]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドをコードするポ
リヌクレオチド。
[89]に記載の方法。
[92]段落[65]～[86]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドをコードするポ
リヌクレオチド。
【0612】
[93]薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌ
クレオチドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサー
クル型翻訳の能力がある、医薬組成物。
クレオチドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサー
クル型翻訳の能力がある、医薬組成物。
【0613】
[94]１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要
素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻
訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成する、段落[93]に記載の組成物。
素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻
訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成する、段落[93]に記載の組成物。
【0614】
[95]スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の
発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する、段落[94]に記載
の組成物。
発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する、段落[94]に記載
の組成物。
【0615】
[96]スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である、段落[94]又は
[95]に記載の組成物。
[97]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む、段落[94]又は[95]
に記載の組成物。
[95]に記載の組成物。
[97]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む、段落[94]又は[95]
に記載の組成物。
【0616】
[98]薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含み、且つローリン
グサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、
環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中
に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少
なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも
９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個の
ポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現
配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、医薬組成物。
グサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、
環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中
に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少
なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも
９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個の
ポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現
配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、医薬組成物。
【0617】
[99]環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型
翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０
％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が
別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率
は、インビトロ翻訳系において試験される、段落[98]に記載の組成物。
翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０
％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が
別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率
は、インビトロ翻訳系において試験される、段落[98]に記載の組成物。
【0618】
[100]インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む、段落[99]に記載の組成物
。
[101]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にあり、スタ
ガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停
滞させるように構成される、段落[93]～[100]のいずれか１つに記載の組成物。
。
[101]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にあり、スタ
ガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停
滞させるように構成される、段落[93]～[100]のいずれか１つに記載の組成物。
【0619】
[102]薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列及び１つ以上の発現
配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチド
とを含む医薬組成物であって、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリング
サークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、医薬組成物。
配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチド
とを含む医薬組成物であって、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリング
サークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、医薬組成物。
【0620】
[103]スタガー要素は、２Ａ配列及び２Ａ様配列からなる群から選択されるペプチド配
列をコードする、段落[101]又は[102]に記載の組成物。
[104]スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする、段落[101]～
[103]のいずれか１つに記載の組成物。
列をコードする、段落[101]又は[102]に記載の組成物。
[104]スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする、段落[101]～
[103]のいずれか１つに記載の組成物。
【0621】
[105]スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸であ
る）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、段落[101]～[104]のいず
れか１つに記載の組成物。
る）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、段落[101]～[104]のいず
れか１つに記載の組成物。
【0622】
[106]スタガー要素は、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、
ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤ
ＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬ
ＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳ
ＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰからなる群か
ら選択される配列をコードする、段落[101]～[105]のいずれか１つに記載の組成物。
ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤ
ＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬ
ＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳ
ＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰからなる群か
ら選択される配列をコードする、段落[101]～[105]のいずれか１つに記載の組成物。
【0623】
[107]スタガー要素は、１つ以上の発現配列のそれぞれの３’末端にある、段落[101]～
[106]のいずれか１つに記載の組成物。
[108]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、環状ポリリボ
ヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端
側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後
続の発現配列の連続した翻訳を可能にする、段落[93]～[107]のいずれか１つに記載の組
成物。
[106]のいずれか１つに記載の組成物。
[108]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、環状ポリリボ
ヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端
側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後
続の発現配列の連続した翻訳を可能にする、段落[93]～[107]のいずれか１つに記載の組
成物。
【0624】
[109]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、連続して翻訳
された環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の
上流（５’末端側）にあり、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第
２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオ
チドは、連続して翻訳されておらず、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタ
ガー要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素と第
１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、
８倍、９倍、１０倍大きい距離にある、段落[93]～[107]のいずれか１つに記載の組成物
。
された環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の
上流（５’末端側）にあり、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第
２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオ
チドは、連続して翻訳されておらず、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタ
ガー要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素と第
１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、
８倍、９倍、１０倍大きい距離にある、段落[93]～[107]のいずれか１つに記載の組成物
。
【0625】
[110]スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４
ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３
ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５
ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５
ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える、段落[108]又は[109]に記載の組成物。
ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３
ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５
ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５
ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える、段落[108]又は[109]に記載の組成物。
【0626】
[111]第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、スタガー要素と第１の翻
訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、
８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６
ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０
ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそ
れを超えて大きい、段落[108]又は[109]に記載の組成物。
訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、
８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６
ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０
ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそ
れを超えて大きい、段落[108]又は[109]に記載の組成物。
【0627】
[112]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配列は、第１の発
現配列以外の発現配列である、段落[108]～[110]のいずれか１つに記載の組成物。
[113]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の後続の発現配列は、第１の
発現配列である、段落[108]～[110]のいずれか１つに記載の組成物。
現配列以外の発現配列である、段落[108]～[110]のいずれか１つに記載の組成物。
[113]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の後続の発現配列は、第１の
発現配列である、段落[108]～[110]のいずれか１つに記載の組成物。
【0628】
[114]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；及び
ｆ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素を含む、段落[93]～[113]のいずれか１つに記
載の組成物。
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；及び
ｆ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素を含む、段落[93]～[113]のいずれか１つに記
載の組成物。
【0629】
[115]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、段落[93]～[114]のいずれか１つに記
載の組成物。
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、段落[93]～[114]のいずれか１つに記
載の組成物。
【0630】
[116]環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５％、少なくとも１０
％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少な
くとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９
０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少
なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少
なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍又は少なくとも
１００倍高い翻訳効率を有する、段落[93]～[115]のいずれか１つに記載の組成物。
％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少な
くとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９
０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少
なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少
なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍又は少なくとも
１００倍高い翻訳効率を有する、段落[93]～[115]のいずれか１つに記載の組成物。
【0631】
[117]環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有
する、段落[93]～[115]のいずれか１つに記載の組成物。
[118]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[93]～[117]のいずれか１つに記載の組成物。
する、段落[93]～[115]のいずれか１つに記載の組成物。
[118]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[93]～[117]のいずれか１つに記載の組成物。
【0632】
[119]環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、段落[93]
～[118]のいずれか１つに記載の組成物。
[120]１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、段落[93]～[119]のいずれか１
つに記載の組成物。
～[118]のいずれか１つに記載の組成物。
[120]１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、段落[93]～[119]のいずれか１
つに記載の組成物。
【0633】
[121]疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つ
の二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、段落[114]～[120]のいずれか１つに記載の組成物。
[122]疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び
第２の配列を含む、段落[121]に記載の組成物。
の二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、段落[114]～[120]のいずれか１つに記載の組成物。
[122]疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び
第２の配列を含む、段落[121]に記載の組成物。
【0634】
[123]エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、段落[114]～[122]のいずれか
１つに記載の組成物。
[124]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む、
段落[93]～[123]のいずれか１つに記載の組成物。
１つに記載の組成物。
[124]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む、
段落[93]～[123]のいずれか１つに記載の組成物。
【0635】
[125]エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチド、例えばプソイド
ウリジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[93]～[124]のいずれか１
つに記載の組成物。
ウリジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[93]～[124]のいずれか１
つに記載の組成物。
【0636】
[126]エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパ
ク質を含む、段落[93]～[125]のいずれか１つに記載の組成物。
[127]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免
疫タンパク質結合部位を含む、段落[93]～[126]のいずれか１つに記載の組成物。
ク質を含む、段落[93]～[125]のいずれか１つに記載の組成物。
[127]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免
疫タンパク質結合部位を含む、段落[93]～[126]のいずれか１つに記載の組成物。
【0637】
[128]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、
ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ－βの少なく
とも１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲ
ンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[93]～[127]のいずれ
か１つに記載の組成物。
ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ－βの少なく
とも１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲ
ンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[93]～[127]のいずれ
か１つに記載の組成物。
【0638】
[129]環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む、段落[93]～[128]のい
ずれか１つに記載の組成物。
[130]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[93]～[129]のい
ずれか１つに記載の組成物。
ずれか１つに記載の組成物。
[130]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[93]～[129]のい
ずれか１つに記載の組成物。
【0639】
[131]環状ポリリボヌクレオチドは、非標準的翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開
始コドン、例えばストレス条件下での発現を開始させる翻訳開始配列を含む、段落[93]～
[130]のいずれか１つに記載の組成物。
始コドン、例えばストレス条件下での発現を開始させる翻訳開始配列を含む、段落[93]～
[130]のいずれか１つに記載の組成物。
【0640】
[132]１つ以上の発現配列は、ペプチドをコードする、段落[93]～[131]のいずれか１つ
に記載の組成物。
[133]環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む
、段落[93]～[132]のいずれか１つに記載の組成物。
に記載の組成物。
[133]環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む
、段落[93]～[132]のいずれか１つに記載の組成物。
【0641】
[134]環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基～約２０ｋｂの範囲のサイズを有する
、段落[93]～[133]のいずれか１つに記載の組成物。
[135]環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドの環状化によって合成
される、段落[93]～[134]のいずれか１つに記載の組成物。
、段落[93]～[133]のいずれか１つに記載の組成物。
[135]環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドの環状化によって合成
される、段落[93]～[134]のいずれか１つに記載の組成物。
【0642】
[136]環状ポリリボヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列又は異なるヌクレオチド配
列のいずれかを有する複数の発現配列を含む、段落[93]～[135]のいずれか１つに記載の
組成物。
列のいずれかを有する複数の発現配列を含む、段落[93]～[135]のいずれか１つに記載の
組成物。
【0643】
[137]環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的
に抵抗性である、段落[93]～[136]のいずれか１つに記載の組成物。
[138]段落[94]～[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチド。
に抵抗性である、段落[93]～[136]のいずれか１つに記載の組成物。
[138]段落[94]～[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチド。
【0644】
[139]段落[93]～[137]のいずれか１つに記載の組成物を製造する方法であって、段落[9
3]～[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチド及び段落[93]～[137]のいず
れか１つに記載の薬学的に許容される担体又は賦形剤を組み合わせる工程を含む方法。
3]～[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチド及び段落[93]～[137]のいず
れか１つに記載の薬学的に許容される担体又は賦形剤を組み合わせる工程を含む方法。
【0645】
[140]治療の方法であって、段落[93]～[137]のいずれか１つに記載の組成物を投与する
工程を含む方法。
[141]タンパク質発現のための方法であって、段落[93]～[137]のいずれか１つに記載の
環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
工程を含む方法。
[141]タンパク質発現のための方法であって、段落[93]～[137]のいずれか１つに記載の
環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
【0646】
[142]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビトロで行われる、
段落[141]に記載の方法。
[143]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビボで行われる、段
落[141]に記載の方法。
段落[141]に記載の方法。
[143]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビボで行われる、段
落[141]に記載の方法。
【0647】
[144]段落[65]～[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドをコードする
ポリヌクレオチド。
[145]段落[65]～[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドを製造する方
法。
ポリヌクレオチド。
[145]段落[65]～[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドを製造する方
法。
【0648】
[146]線状ポリリボヌクレオチドのスプリントライゲーション媒介性環状化を含む、段
落[145]に記載の方法。
[147]スプリントライゲーション媒介性環状化は、少なくとも２％、少なくとも５％、
少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくと
も３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％
、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４４％、少なくとも４６％、少なく
とも４８％又は少なくとも５０％の効率を有する、段落[146]に記載の方法。
落[145]に記載の方法。
[147]スプリントライゲーション媒介性環状化は、少なくとも２％、少なくとも５％、
少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくと
も３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％
、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４４％、少なくとも４６％、少なく
とも４８％又は少なくとも５０％の効率を有する、段落[146]に記載の方法。
【0649】
[148]スプリントライゲーション媒介性環状化は、約４０％～約５０％又は５０％超の
効率を有する、段落[146]に記載の方法。
本願は以下の発明を包含する。
［項目１］ １つ以上の発現配列のローリングサークル型翻訳の方法であって、ローリン
グサークル型翻訳を介して、環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発
現する工程を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記１つ以上の発現配列、前記発
現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含み、且つ終止要素を欠いて
いる、方法。
［項目２］ 前記スタガー要素は、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記ローリングサー
クル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、項目１に記載の方法。
［項目３］ 前記スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミ
ノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、項目１に記載の
方法。
［項目４］ 前記１つ以上の発現配列を発現する工程は、前記環状ポリリボヌクレオチド
の前記ローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なく
とも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９
５％の別個のポリペプチドを生成し、前記別個のポリペプチドのそれぞれは、単一の発現
配列から生成される、項目１に記載の方法。
［項目５］ 前記発現配列の少なくとも１つは、分泌タンパク質をコードする、項目１に
記載の方法。
［項目６］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、
項目１に記載の方法。
［項目７］ 前記１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、項目１に記載の方法
。
［項目８］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、
（ａ）エンクリプトゲン；
（ｂ）調節要素；
（ｃ）複製要素；及び
（ｄ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素をさらに含む、項目１に記載の方法。
［項目９］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、
（ｉ）線状同等物より高い翻訳効率；
（ｉｉ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
（ｉｉｉ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
（ｉｖ）線状同等物より増加した半減期；及び
（ｖ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、項目１に記載の方法。
［項目１０］ 前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、線状同等物より少なくと
も５倍多い発現産物を生成する、項目１に記載の方法。
［項目１１］ 前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、前記環状ポリリボヌクレ
オチドを含む細胞内で前記１つ以上の発現配列を発現することを含む、項目１に記載の方
法。
［項目１２］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中に持続する、項目１１に記
載の方法。
［項目１３］ 前記環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約６０％は、前記細胞内
で少なくとも約７日間にわたって持続する、項目１１に記載の方法。
［項目１４］ （ａ）後の時点での前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現は
、前の時点と等しいか又はそれより多いか；又は
（ｂ）少なくとも約７日間の期間にわたる前記細胞内における前記１つ以上の発現配列
の発現は、４０％だけ低下しないか；又は
（ｃ）前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも約７日間にわ
たって４０％を超えて変化しないレベルに維持される、項目１１に記載の方法。
［項目１５］ 前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、哺乳動物対象において前
記発現配列を発現することを含む、項目１に記載の方法。
［項目１６］ 前記終止要素は、終止コドンを含む、項目１に記載の方法。
［項目１７］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記環状ポリリボヌクレオチドの自己
複製を媒介するように構成される複製ドメインをさらに含む、項目１１に記載の方法。
［項目１８］ 環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、
（ａ）１つ以上の発現配列と、前記１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端に
おけるスタガー要素とを含む環状ポリリボヌクレオチドであって、ローリングサークル型
翻訳の能力があり、且つ終止要素を欠いている、環状ポリリボヌクレオチドと；
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む医薬組成物。
［項目１９］ １つ以上の発現配列と、前記１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’
末端におけるスタガー要素とを含む環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞であって、前記
環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力があり、且つ終止要素を
欠いている、細胞。
［項目２０］ 対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する
工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工
程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での前記細胞内における前記１つ以
上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される、方法。
［項目２１］ 対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する
工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工
程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又
は１６日間の期間にわたる前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現が約４０％
を超えて低下しないように構成される、方法。
［項目２２］ 対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する
工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工
程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記細胞内における前記１つ以上の発現配列
の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間にわたって約４０％を
超えて変化しないレベルに維持されるように構成される、方法。
［項目２３］ ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；
ｆ）疑似二本鎖二次構造；及び
ｇ）発現配列
から選択される少なくとも１つの構造要素と、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性と
を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。
［項目２４］ 薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含む環状ポ
リリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、ロ
ーリングサークル型翻訳の能力がある、医薬組成物。
［項目２５］ 薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含み、且つ
ローリングサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物で
あって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記ローリ
ングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、
少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくと
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％
又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、前記別個のポリペプチドのそ
れぞれは、前記１つ以上の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、医
薬組成物。
［項目２６］ 薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列及び前記１つ
以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含む環状ポリリボヌ
クレオチドとを含む医薬組成物であって、前記スタガー要素は、前記環状ポリリボヌクレ
オチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、医薬
組成物。
［項目２７］ 項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法で
あって、項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド及び
項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の薬学的に許容される担体又は賦形剤を組
み合わせる工程を含む方法。
［項目２８］ 治療の方法であって、項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の組
成物を投与する工程を含む方法。
［項目２９］ タンパク質発現のための方法であって、項目１８又は２３～２６のいずれ
か一項に記載の環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
［項目３０］ 前記環状ポリリボヌクレオチドの前記少なくとも領域の前記翻訳は、イン
ビトロで行われる、項目２９に記載の方法。
［項目３１］ 前記環状ポリリボヌクレオチドの前記少なくとも領域の前記翻訳は、イン
ビボで行われる、項目２９に記載の方法。
［項目３２］ 項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチ
ドをコードするポリヌクレオチド。
［項目３３］ 項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチ
ドを製造する方法。
効率を有する、段落[146]に記載の方法。
本願は以下の発明を包含する。
［項目１］ １つ以上の発現配列のローリングサークル型翻訳の方法であって、ローリン
グサークル型翻訳を介して、環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発
現する工程を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記１つ以上の発現配列、前記発
現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含み、且つ終止要素を欠いて
いる、方法。
［項目２］ 前記スタガー要素は、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記ローリングサー
クル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、項目１に記載の方法。
［項目３］ 前記スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミ
ノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、項目１に記載の
方法。
［項目４］ 前記１つ以上の発現配列を発現する工程は、前記環状ポリリボヌクレオチド
の前記ローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なく
とも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９
５％の別個のポリペプチドを生成し、前記別個のポリペプチドのそれぞれは、単一の発現
配列から生成される、項目１に記載の方法。
［項目５］ 前記発現配列の少なくとも１つは、分泌タンパク質をコードする、項目１に
記載の方法。
［項目６］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、
項目１に記載の方法。
［項目７］ 前記１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、項目１に記載の方法
。
［項目８］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、
（ａ）エンクリプトゲン；
（ｂ）調節要素；
（ｃ）複製要素；及び
（ｄ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素をさらに含む、項目１に記載の方法。
［項目９］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、
（ｉ）線状同等物より高い翻訳効率；
（ｉｉ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
（ｉｉｉ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
（ｉｖ）線状同等物より増加した半減期；及び
（ｖ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、項目１に記載の方法。
［項目１０］ 前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、線状同等物より少なくと
も５倍多い発現産物を生成する、項目１に記載の方法。
［項目１１］ 前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、前記環状ポリリボヌクレ
オチドを含む細胞内で前記１つ以上の発現配列を発現することを含む、項目１に記載の方
法。
［項目１２］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中に持続する、項目１１に記
載の方法。
［項目１３］ 前記環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約６０％は、前記細胞内
で少なくとも約７日間にわたって持続する、項目１１に記載の方法。
［項目１４］ （ａ）後の時点での前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現は
、前の時点と等しいか又はそれより多いか；又は
（ｂ）少なくとも約７日間の期間にわたる前記細胞内における前記１つ以上の発現配列
の発現は、４０％だけ低下しないか；又は
（ｃ）前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも約７日間にわ
たって４０％を超えて変化しないレベルに維持される、項目１１に記載の方法。
［項目１５］ 前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、哺乳動物対象において前
記発現配列を発現することを含む、項目１に記載の方法。
［項目１６］ 前記終止要素は、終止コドンを含む、項目１に記載の方法。
［項目１７］ 前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記環状ポリリボヌクレオチドの自己
複製を媒介するように構成される複製ドメインをさらに含む、項目１１に記載の方法。
［項目１８］ 環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、
（ａ）１つ以上の発現配列と、前記１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端に
おけるスタガー要素とを含む環状ポリリボヌクレオチドであって、ローリングサークル型
翻訳の能力があり、且つ終止要素を欠いている、環状ポリリボヌクレオチドと；
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む医薬組成物。
［項目１９］ １つ以上の発現配列と、前記１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’
末端におけるスタガー要素とを含む環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞であって、前記
環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力があり、且つ終止要素を
欠いている、細胞。
［項目２０］ 対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する
工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工
程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での前記細胞内における前記１つ以
上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される、方法。
［項目２１］ 対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する
工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工
程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又
は１６日間の期間にわたる前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現が約４０％
を超えて低下しないように構成される、方法。
［項目２２］ 対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する
工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工
程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記細胞内における前記１つ以上の発現配列
の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間にわたって約４０％を
超えて変化しないレベルに維持されるように構成される、方法。
［項目２３］ ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；
ｆ）疑似二本鎖二次構造；及び
ｇ）発現配列
から選択される少なくとも１つの構造要素と、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性と
を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。
［項目２４］ 薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含む環状ポ
リリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、ロ
ーリングサークル型翻訳の能力がある、医薬組成物。
［項目２５］ 薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含み、且つ
ローリングサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物で
あって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記ローリ
ングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、
少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくと
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％
又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、前記別個のポリペプチドのそ
れぞれは、前記１つ以上の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、医
薬組成物。
［項目２６］ 薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列及び前記１つ
以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含む環状ポリリボヌ
クレオチドとを含む医薬組成物であって、前記スタガー要素は、前記環状ポリリボヌクレ
オチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、医薬
組成物。
［項目２７］ 項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法で
あって、項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド及び
項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の薬学的に許容される担体又は賦形剤を組
み合わせる工程を含む方法。
［項目２８］ 治療の方法であって、項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の組
成物を投与する工程を含む方法。
［項目２９］ タンパク質発現のための方法であって、項目１８又は２３～２６のいずれ
か一項に記載の環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
［項目３０］ 前記環状ポリリボヌクレオチドの前記少なくとも領域の前記翻訳は、イン
ビトロで行われる、項目２９に記載の方法。
［項目３１］ 前記環状ポリリボヌクレオチドの前記少なくとも領域の前記翻訳は、イン
ビボで行われる、項目２９に記載の方法。
［項目３２］ 項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチ
ドをコードするポリヌクレオチド。
［項目３３］ 項目１８又は２３～２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチ
ドを製造する方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51A】
【図51B】
【図51C】
【図52A】
【図52B】
【図52C】
【図53】
【図54A】
【図54B】
【図55】
【図56】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬組成物を製造する方法であって、
（ａ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素と、（ｂ）５’キャップおよびポリＡ配列の一方または両方を欠く治療用ポリペプチドをコードする、発現配列と、（ｃ）終止要素と、を含む線状ポリリボヌクレオチドを提供すること；
前記線状ポリリボヌクレオチドを環状化して、環状ポリリボヌクレオチドを含む環状ポリリボヌクレオチド調製物を生成すること；
前記環状ポリリボヌクレオチド調製物から前記環状ポリリボヌクレオチドを濃縮して、濃縮された調製物を形成すること；および
前記濃縮された調製物を、薬学的に許容される担体または賦形剤とともに製剤化し、それによって、前記医薬組成物を生成すること
を含む、方法。
（ａ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素と、（ｂ）５’キャップおよびポリＡ配列の一方または両方を欠く治療用ポリペプチドをコードする、発現配列と、（ｃ）終止要素と、を含む線状ポリリボヌクレオチドを提供すること；
前記線状ポリリボヌクレオチドを環状化して、環状ポリリボヌクレオチドを含む環状ポリリボヌクレオチド調製物を生成すること；
前記環状ポリリボヌクレオチド調製物から前記環状ポリリボヌクレオチドを濃縮して、濃縮された調製物を形成すること；および
前記濃縮された調製物を、薬学的に許容される担体または賦形剤とともに製剤化し、それによって、前記医薬組成物を生成すること
を含む、方法。
【請求項2】
前記内部リボソーム進入部位要素が、ピコルナウイルス相補的ＤＮＡ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）相補的ＤＮＡ、ポリオウイルス相補的ＤＮＡ、またはキイロショウジョウバエに由来するアンテナペディア遺伝子、に由来する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｉ）前記環状ポリリボヌクレオチド調製物中の１または複数の不純物の量を測定すること、および、（ｉｉ）前記医薬組成物中の１または複数の不純物の量を測定すること、の一方または両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記線状ポリリボヌクレオチドが、前記線状ポリリボヌクレオチドの５’末端および３’末端においてそれぞれ互いに対して相補的な配列の対を欠く、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記濃縮が、カラムクロマトグラフィー、ゲル排除、サイズ排除、またはこれらの任意の組み合わせを介して前記環状ポリリボヌクレオチドを精製することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記濃縮が、前記環状ポリリボヌクレオチド調製物から遊離リボ核酸、線状ＲＮＡ、ニックＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質のうちの１つまたは複数を除去することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記濃縮された調製物の製剤化が、脂質担体を用いて前記環状ポリリボヌクレオチドを製剤化することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】