特開2023-166500組織からの目的の領域の隔離および発現分析のための方法、組成物、およびデバイス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023166500
(43)【公開日】2023-11-21
(54)【発明の名称】組織からの目的の領域の隔離および発現分析のための方法、組成物、およびデバイス
(51)【国際特許分類】
G01N 1/28 20060101AFI20231114BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20231114BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20231114BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20231114BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20231114BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALN20231114BHJP
【ＦＩ】
G01N1/28 X ZNA
G01N1/28 J
G01N33/48 M
C12M1/00 A
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6844 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023142905
(22)【出願日】2023-09-04
(62)【分割の表示】P 2020568954の分割
【原出願日】2019-03-04
(31)【優先権主張番号】62/637,998
(32)【優先日】2018-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/691,559
(32)【優先日】2018-06-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520335369
【氏名又は名称】クァンタムサイト， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジョン バトラー
(72)【発明者】
【氏名】ビダン チョウドリー
(57)【要約】
【課題】平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離する方法が、本明細書で提供される。
【解決手段】上記方法は、インサイチュであり、組織から領域を規定するために固定化したヌクレオチドアレイの下準備を要しない。上記方法は、組織切片上に疎水性マスクをインサイチュで準備して、目的の領域を隔離し、続いて、表面張力アレイを必要に応じて使用して、上記疎水性マスクによって境界線を描いた特定の目的の領域に、抽出および／または分析試薬を添加および／または除去することを包含し得る。
【選択図】なし
【解決手段】上記方法は、インサイチュであり、組織から領域を規定するために固定化したヌクレオチドアレイの下準備を要しない。上記方法は、組織切片上に疎水性マスクをインサイチュで準備して、目的の領域を隔離し、続いて、表面張力アレイを必要に応じて使用して、上記疎水性マスクによって境界線を描いた特定の目的の領域に、抽出および／または分析試薬を添加および／または除去することを包含し得る。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年３月２日出願の米国仮出願第６２／６３７，９９８号、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ， ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ， ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＦＯＲ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＲＥＧＩＯＮＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＥＳＴ ＦＲＯＭ Ａ ＴＩＳＳＵＥ ＳＥＣＴＩＯＮ」および２０１８年６月２８日出願の米国仮出願第６２／６９１，５５９号、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ， ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ， ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＦＯＲ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＲＥＧＩＯＮＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＥＳＴ ＦＲＯＭ Ａ ＴＩＳＳＵＥ ＳＥＣＴＩＯＮ」（これらの全体は、本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
本出願は、２０１８年３月２日出願の米国仮出願第６２／６３７，９９８号、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ， ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ， ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＦＯＲ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＲＥＧＩＯＮＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＥＳＴ ＦＲＯＭ Ａ ＴＩＳＳＵＥ ＳＥＣＴＩＯＮ」および２０１８年６月２８日出願の米国仮出願第６２／６９１，５５９号、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ， ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ， ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＦＯＲ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＲＥＧＩＯＮＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＥＳＴ ＦＲＯＭ Ａ ＴＩＳＳＵＥ ＳＥＣＴＩＯＮ」（これらの全体は、本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
組織サンプルからの遺伝子およびタンパク質発現の従来の臨床分析は、核酸およびタンパク質を切片（例えば、組織の生検物）から抽出することを要する。選択機構が存在しないので、これらの切片に基づく分析は、組織内の種々の細胞タイプ（例えば、上皮、結合組織、および免疫）の発現プロフィールおよびＤＮＡ／ＲＮＡ配列データの複合を表す。
組織サンプルからの遺伝子およびタンパク質発現の従来の臨床分析は、核酸およびタンパク質を切片（例えば、組織の生検物）から抽出することを要する。選択機構が存在しないので、これらの切片に基づく分析は、組織内の種々の細胞タイプ（例えば、上皮、結合組織、および免疫）の発現プロフィールおよびＤＮＡ／ＲＮＡ配列データの複合を表す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
発明の要旨
いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、（ａ）固体基材上の前記平らな組織切片に、規定された目的の領域からポリマーで境界線を描いて、非物理的流体バリアを形成する工程であって、ここで前記目的の領域は、直径１ｍｍより小さい工程；および（ｂ）前記少なくとも１つの規定された目的の領域内の細胞をインサイチュで選択的に破壊する工程、を包含する方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程、を包含し、ここで前記化学的マスクは、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞の選択的破壊に適したバリアを形成し、前記化学的マスクは、物理的流体境界ではない、方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記目的の領域内の細胞の破壊に適した溶媒を分与して、遊離した細胞構成要素を含む液滴を形成する工程、を包含し、ここで前記液滴は、前記目的の領域の外側の組織から、物理的バリアなしに流体連通から隔離される、方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、組織切片中の複数の目的の領域から生体分子を単離および検出する方法であって、前記方法は、疎水性マスクを組織切片に付与し、前記平らな組織切片中の少なくとも１０００個の目的の領域が、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される工程、および前記少なくとも１０００個の目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出し、前記タンパク質または核酸の空間位置情報が保持される工程、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、直径約１００ミクロンより小さいかまたは直径約１００ミクロンに等しい目的の領域を隔離し得る。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、ＦＦＰＥ組織切片である。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出する工程を包含し、前記検出する工程は、前記細胞からインサイチュで遊離した前記核酸を配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記配列決定することは、前記インサイチュで遊離した核酸を、前記目的の領域の位置を識別するバーコードでタグ化することを包含する。いくつかの実施形態では、前記バーコードは、表面に連結されない。いくつかの実施形態では、前記タグ化することは、インサイチュで遊離したＲＮＡをタグ化することを包含し、（ａ）特有の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記少なくとも１０００個の目的の領域に付与すること；および（ｂ）第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、前記少なくとも１０００個の目的の領域に対して行い、前記目的の領域は、互いから隔離されること、を包含する。本方法のいくつかの実施形態では、前記目的の領域から合成したｃＤＮＡ分子間で前記特有の核酸配列の相互汚染が低減される。いくつかの実施形態では、前記第１鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる。いくつかの実施形態では、前記第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡを配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記ｍＲＮＡを配列決定することは、前記ｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡに対して行われる前増幅ステップを包含する。いくつかの実施形態では、前記前増幅ステップは、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムヘキサマープライマーでのＰＣＲ、ポリＡ特異的プライマーでのＰＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ゲノムＤＮＡを配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡを配列決定することは、前記ゲノムＤＮＡに対して行われる全ゲノム増幅（ＷＧＡ）ステップを包含する。いくつかの実施形態では、前記ＷＧＡ工程は、変性オリゴヌクレオチドプライム（ＤＯＰ）ＰＣＲ、マルチ置換増幅（ＭＤＡ）、マルチアニーリングおよびループ形成ベースの増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）、ＰｉｃｏＰｌｅｘ、自己縮重プライマーでの等温増幅、またはこれらの組み合わせである。
いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、（ａ）固体基材上の前記平らな組織切片に、規定された目的の領域からポリマーで境界線を描いて、非物理的流体バリアを形成する工程であって、ここで前記目的の領域は、直径１ｍｍより小さい工程；および（ｂ）前記少なくとも１つの規定された目的の領域内の細胞をインサイチュで選択的に破壊する工程、を包含する方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程、を包含し、ここで前記化学的マスクは、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞の選択的破壊に適したバリアを形成し、前記化学的マスクは、物理的流体境界ではない、方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記目的の領域内の細胞の破壊に適した溶媒を分与して、遊離した細胞構成要素を含む液滴を形成する工程、を包含し、ここで前記液滴は、前記目的の領域の外側の組織から、物理的バリアなしに流体連通から隔離される、方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、組織切片中の複数の目的の領域から生体分子を単離および検出する方法であって、前記方法は、疎水性マスクを組織切片に付与し、前記平らな組織切片中の少なくとも１０００個の目的の領域が、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される工程、および前記少なくとも１０００個の目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出し、前記タンパク質または核酸の空間位置情報が保持される工程、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、直径約１００ミクロンより小さいかまたは直径約１００ミクロンに等しい目的の領域を隔離し得る。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、ＦＦＰＥ組織切片である。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出する工程を包含し、前記検出する工程は、前記細胞からインサイチュで遊離した前記核酸を配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記配列決定することは、前記インサイチュで遊離した核酸を、前記目的の領域の位置を識別するバーコードでタグ化することを包含する。いくつかの実施形態では、前記バーコードは、表面に連結されない。いくつかの実施形態では、前記タグ化することは、インサイチュで遊離したＲＮＡをタグ化することを包含し、（ａ）特有の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記少なくとも１０００個の目的の領域に付与すること；および（ｂ）第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、前記少なくとも１０００個の目的の領域に対して行い、前記目的の領域は、互いから隔離されること、を包含する。本方法のいくつかの実施形態では、前記目的の領域から合成したｃＤＮＡ分子間で前記特有の核酸配列の相互汚染が低減される。いくつかの実施形態では、前記第１鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる。いくつかの実施形態では、前記第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡを配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記ｍＲＮＡを配列決定することは、前記ｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡに対して行われる前増幅ステップを包含する。いくつかの実施形態では、前記前増幅ステップは、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムヘキサマープライマーでのＰＣＲ、ポリＡ特異的プライマーでのＰＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ゲノムＤＮＡを配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡを配列決定することは、前記ゲノムＤＮＡに対して行われる全ゲノム増幅（ＷＧＡ）ステップを包含する。いくつかの実施形態では、前記ＷＧＡ工程は、変性オリゴヌクレオチドプライム（ＤＯＰ）ＰＣＲ、マルチ置換増幅（ＭＤＡ）、マルチアニーリングおよびループ形成ベースの増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）、ＰｉｃｏＰｌｅｘ、自己縮重プライマーでの等温増幅、またはこれらの組み合わせである。
【0004】
いくつかの局面では、本開示は、組織切片であって、前記切片に、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される、少なくとも１０００個の水性液滴を含む、組織切片を提供する。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、前記１０００個の水性液滴を、互いとの流体連通から隔離する疎水性マスクを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１０００個の水性液滴は、少なくとも１０００個の特有のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスクは、少なくともシアノアクリレートポリマーの層を含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスクは、少なくとも非シリル化フルオロアルキル層を含む。いくつかの実施形態では、前記非シリル化フルオロアルキル層は、フルオロアクリレートまたは非シリル化ペルフルオロアルカン化合物を含む。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、少なくともペルフルオロアルキルシラン層を含む。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルシラン層は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルトリクロロシランは、ＦＯＴＳ（トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン）である。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランは、PF10TAS(ペルフルオロデシルトリス(ジメチルアミノ)シラン)である。いくつかの実施
形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表面に連結されない。
形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表面に連結されない。
【0005】
いくつかの局面では、本開示は、固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離する方法であって、前記方法は、（ａ）前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程；および（ｂ）１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、前記目的の領域上に分与し、それによって、前記少なくとも１つの目的の領域内で境界線を描かれた細胞を選択的に溶解することによって、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞構成要素を溶解する工程、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記溶液を前記目的の領域上に分与する工程は、（ａ）前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、第２の固体基材の表面上に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む薬剤移動デバイスに分与すること；（ｂ）前記第２の固体基材の表面上に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を、前記平らな組織切片に接触させ、前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、前記平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域に空間的に対応することであって、ここで前記接触させることは、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、前記平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域に移動させることを可能にし、それによって、前記少なくとも１つの目的の領域中の細胞構成要素を、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液中で溶解させること、を包含する。いくつかの実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの溶解させた細胞構成要素を、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域から単離する工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記少なくとも１つの目的の領域から溶解させた前記細胞構成要素の中で核酸を配列決定する工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記少なくとも１つの目的の領域から溶解させた前記細胞構成要素の中でタンパク質に対してタンデム質量分析を行う工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態では、前記（ｂ）における溶液は、可溶性タグをさらに含み、ここで前記可溶性タグは、前記少なくとも１つの目的の領域に対応する。いくつかの実施形態では、前記可溶性タグは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、前記目的の領域に対応するサンプルインデックス配列、および必要に応じて、特有の分子識別子配列を含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、前記目的の領域に対応する電荷タグを含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは２本鎖である。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ビーズに結合体化される。いくつかの実施形態では、前記可溶性タグは、タンデム質量タグである。いくつかの実施形態では、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤は、１種またはこれより多くの界面活性剤、プロテアーゼ、張度調節剤、カオトロープ、ヌクレアーゼ、緩衝液、プロテアーゼインヒビター、ホスファターゼインヒビター、またはヌクレアーゼインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、前記化学的マスクは、接触角６０～１５５度を有する。いくつかの実施形態では、前記化学的マスクは、フルオロアルカンまたはフルオロアクリルポリマーを含む疎水性マスク溶液を介して付与される。いくつかの実施形態では、前記化学的マスク溶液は、アクリレートまたはシアノアクリレートを含む溶液を介して付与される。いくつかの実施形態では、前記化学的マスク溶液は、溶媒をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記溶媒は、ピロピレングリコール誘導体、フルオロカーボン、またはアルコールである。いくつかの実施形態では、前記溶媒は、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロ－２－メチルペンタン、ペルフルオロ－１，３－ジメチルシクロヘキサン、ペルフルオロデカリン、または１，３－ジフルオロプロパンである。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの目的の領域は、円形であり、前記目的の領域の直径は、１ｍｍもしくはこれ未満、５００ミクロンもしくはこれ未満、２５０ミクロンもしくはこれ未満、１２５ミクロンもしくはこれ未満、１００ミクロンもしくはこれ未満、８０ミクロンもしくはこれ未満、５０ミクロンもしくはこれ未満、２５ミクロンもしくはこれ未満、または１５ミクロンもしくはこれ未満である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの目的の領域は、面積約７．８×１０５平方ミクロン未満である。いくつかの実施形態では、前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、疎水性領域によって境界線が描かれた少なくとも１つの親水性領域を含む。いくつかの実施形態では、前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１０，０００ピコリットルもしくはこれ未満、１，０００ピコリットルもしくはこれ未満、５００ピコリットルもしくはこれ未満、２５０ピコリットルもしくはこれ未満、１００ピコリットルもしくはこれ未満、５０ピコリットルもしくはこれ未満、１０ピコリットルもしくはこれ未満、または２ピコリットルもしくはこれ未満の溶液体積を送達し得る。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性領域の境界線を描く前記疎水性領域は、接触角６０～１５５度を有する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記平らな組織切片中の１個より多くの目的の領域から細胞構成要素を溶解させることを包含する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記平らな組織切片中の少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１０００個、または少なくとも１０，０００個の目的の領域からの細胞構成要素を溶解させることを包含する。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、グリッドパターンを含む。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、楕円を含む。いくつかの実施形態では、前記固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、圧電式インクジェット送達デバイスを使用して前記平らな組織切片に付与される。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片は、約２～約５０μｍ厚である。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片は、約１～約１５μｍ厚である。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片である。前記平らな組織切片は、固定されていない組織切片である。
【0006】
いくつかの局面では、本開示は、第１の固体支持体上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離するためのシステムであって、前記システムは、（ａ）前記疎水性マスクで境界線が描かれる少なくとも１つの目的の領域を含む第１の固体支持体上の平らな組織切片；（ｂ）前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域と整列させるために、前記固体基材の表面に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む第２の固体支持体であって、前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を含む、第２の固体支持体；ならびに（ｃ）前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む前記固体支持体に連結され、前記固体支持体を移し得、前記固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素が、疎水性マスクで境界線を描かれた平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域と接触し得る電動式ステージ、を含むシステムを提供する。いくつかの局面では、前記システムは、（ｉ）前記電動式ステージの位置を制御するように構成され、前記第２の固体基材上の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、前記組織切片中の少なくとも１つの目的の領域と接触するコンピューターシステム、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスク溶液は、（ｉ）疎水性マスク溶液を前記固体支持体上の組織切片に送達し得る圧電式インクジェット送達デバイス、および（ｉｉ）前記圧電式インクジェット送達デバイスを制御して、前記疎水性マスク溶液で前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描いて、疎水性マスクを生成するように構成されたコンピューターシステムによって付与される。いくつかの実施形態では、前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、疎水性領域によって境界線が描かれる少なくとも１つの親水性領域を含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスク溶液は、Ｃ７Ｆ１５ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、ＦＣ－７２２、ＰｅｒＦｌｕｏｒｏＣｏａｔ、またはＦｌｕｏｒｏＰｅｌのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスク溶液は、アクリレートまたはシアノアクリレートのうちの少なくとも一方を含む。いくつかの実施形態では、前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１０，０００ピコリットルもしくはこれ未満、１，０００ピコリットルもしくはこれ未満、５００ピコリットルもしくはこれ未満、２５０ピコリットルもしくはこれ未満、１００ピコリットルもしくはこれ未満、５０ピコリットルもしくはこれ未満、１０ピコリットルもしくはこれ未満、または２ピコリットルもしくはこれ未満の溶液体積を送達し得る。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性領域の境界線を描く疎水性領域の接触角は、６０～１５５度である。いくつかの実施形態では、疎水性マスク溶液付与のための前記システムは、前記平らな組織切片への付与後に前記疎水性マスク溶液を重合し得るＵＶ光源を含む。いくつかの実施形態では、疎水性マスク溶液付与のための前記システムは、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルシランの化学蒸着のための装置を含む。
【0007】
いくつかの局面では、本開示は、平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離するためのキットであって、前記キットは、本明細書に記載される方法、システムまたは組織切片のいずれかの実施形態の局面のいずれか１つに記載の要素のうちのいずれかを含む、キットを提供する。
【0008】
いくつかの局面では、本開示は、組織切片であって、最も下から最も上へと、前記組織切片に接して少なくとも１つのシアノアクリレート層、続いて、少なくとも１つのペルフルオロアルキルシラン層を含む、組織切片を提供する。いくつかの局面では、前記ペルフルオロアルキルシラン層は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルトリクロロシランは、ＦＯＴＳである。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、前記少なくとも１つのシアノアクリレート層の下に少なくとも１つの非シリル化フルオロアルキル層を含む。いくつかの実施形態では、前記非シリル化フルオロアルキル層は、フルオロアクリレートまたは非シリル化ペルフルオロアルカン化合物を含む。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルトリクロロシランは、ＦＯＴＳ（（トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン）である。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、前記シアノアクリレート層を有する領域によって境界線が描かれる前記シアノアクリレート層を欠く少なくとも１つの領域を含む。いくつかの実施形態では、前記領域は、実質的に楕円形、多角形、または自由形態である。いくつかの実施形態では、前記組織切片への界面活性剤の水性溶液の付与は、前記領域内の細胞を溶解させ得る。いくつかの実施形態では、前記領域は、約１ｍｍ未満のサイズである。いくつかの実施形態では、前記領域は、約１００ミクロン未満のサイズである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
（ａ）固体基材上の前記平らな組織切片に、規定された目的の領域からポリマーで境界線を描いて、非物理的流体バリアを形成する工程であって、ここで前記目的の領域は、直径１ｍｍより小さい工程；および
（ｂ）前記少なくとも１つの規定された目的の領域内の細胞をインサイチュで選択的に破壊する工程、
を包含する方法。
（項目２）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程、
を包含し、ここで前記化学的マスクは、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞の選択的破壊に適したバリアを形成し、前記化学的マスクは、物理的流体境界ではない、方法。
（項目３）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
前記固体基材上の平らな組織切片中の前記目的の領域内の細胞の破壊に適した溶媒を分与して、遊離した細胞構成要素を含む液滴を形成する工程、
を包含し、ここで前記液滴は、前記目的の領域の外側の組織から、物理的バリアなしに流体連通から隔離される、方法。
（項目４）
組織切片中の複数の目的の領域から生体分子を単離および検出する方法であって、前記方法は、
疎水性マスクを組織切片に付与し、前記平らな組織切片中の少なくとも１０００個の目的の領域が、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される工程、および
前記少なくとも１０００個の目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出し、前記タンパク質または核酸の空間位置情報が保持される工程、
を包含する方法。
（項目５）
前記方法は、直径約１００ミクロンより小さいかまたは直径約１００ミクロンに等しい目的の領域を隔離し得る、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記組織切片は、ＦＦＰＥ組織切片である、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出する工程を包含し、ここで前記検出する工程は、前記細胞からインサイチュで遊離した前記核酸を配列決定することを包含する、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記配列決定することは、前記インサイチュで遊離した核酸を、前記目的の領域の位置を識別するバーコードでタグ化することを包含する、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記バーコードは、表面に連結されない、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記タグ化することは、インサイチュで遊離したＲＮＡをタグ化することを包含し、
（ａ）特有の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記少なくとも１０００個の目的の領域に付与すること；および
（ｂ）第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、前記少なくとも１０００個の目的の領域に対して行い、前記目的の領域は、互いから隔離されること、
を包含する、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記目的の領域から合成したｃＤＮＡ分子間で前記特有の核酸配列の相互汚染が低減される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第１鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を配列決定することを包含する、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡを配列決定することを包含する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ｍＲＮＡを配列決定することは、前記ｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡに対して行われる前増幅ステップを包含する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記前増幅ステップは、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムヘキサマープライマーでのＰＣＲ、ポリＡ特異的プライマーでのＰＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ゲノムＤＮＡを配列決定することを包含する、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記ゲノムＤＮＡを配列決定することは、前記ゲノムＤＮＡに対して行われる全ゲノム増幅（ＷＧＡ）ステップを包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ＷＧＡ工程は、変性オリゴヌクレオチドプライム（ＤＯＰ）ＰＣＲ、マルチ置換増幅（ＭＤＡ）、マルチアニーリングおよびループ形成ベースの増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）、ＰｉｃｏＰｌｅｘ、自己縮重プライマーでの等温増幅、またはこれらの組み合わせである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
組織切片であって、前記切片に、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される、少なくとも１０００個の水性液滴を含む、組織切片。
（項目２２）
前記１０００個の水性液滴を、互いとの流体連通から隔離する疎水性マスクを含む、項目２１に記載の組織切片。
（項目２３）
前記少なくとも１０００個の水性液滴は、少なくとも１０００個の特有のオリゴヌクレオチドを含む、項目２１または２２に記載の組織切片。
（項目２４）
前記疎水性マスクは、少なくともシアノアクリレートポリマーの層を含む、項目２１～２３のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目２５）
前記疎水性マスクは、少なくとも非シリル化フルオロアルキル層を含む、項目２１～２４のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目２６）
前記非シリル化フルオロアルキル層は、フルオロアクリレートまたは非シリル化ペルフルオロアルカン化合物を含む、項目２4に記載の組織切片。
（項目２７）
少なくともペルフルオロアルキルシラン層を含む、項目２１～２６のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目２８）
前記ペルフルオロアルキルシラン層は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む、項目２７に記載の組織切片。
（項目２９）
前記オリゴヌクレオチドは、表面に連結されない、項目２３～２８のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目３０）
固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程；
（ｂ）１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、前記目的の領域上に分与し、それによって、前記少なくとも１つの目的の領域内で境界線を描かれた細胞を選択的に溶解することによって、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞構成要素を溶解する工程、
を包含する方法。
（項目３１）
前記溶液を前記目的の領域上に分与する工程は、
（ａ）前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、第２の固体基材の表面上に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む薬剤移動デバイスに分与すること；
（ｂ）前記第２の固体基材の表面上に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を、前記平らな組織切片に接触させ、前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、前記平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域に空間的に対応することであって、ここで前記接触させることは、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、前記平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域に移動させることを可能にし、それによって、前記少なくとも１つの目的の領域中の細胞構成要素を、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液中で溶解させること、
を包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
少なくとも１つの溶解させた細胞構成要素を、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域から単離する工程、
をさらに包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記少なくとも１つの目的の領域から溶解させた前記細胞構成要素の中で核酸を配列決定する工程、
をさらに包含する、項目３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記少なくとも１つの目的の領域から溶解させた前記細胞構成要素の中でタンパク質に対してタンデム質量分析を行う工程、
をさらに包含する、項目３０～３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記（ｂ）における溶液は、可溶性タグをさらに含み、ここで前記可溶性タグは、前記少なくとも１つの目的の領域に対応する、項目３０～３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記可溶性タグは、オリゴヌクレオチドである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記オリゴヌクレオチドは、前記目的の領域に対応するサンプルインデックス配列、および必要に応じて、特有の分子識別子配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記オリゴヌクレオチドは、前記目的の領域に対応する電荷タグを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記オリゴヌクレオチドは２本鎖である、項目３６または３７に記載の方法。
（項目４０）
前記オリゴヌクレオチドは、ビーズに結合体化される、項目３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記可溶性タグは、タンデム質量タグである、項目３５に記載の方法。
（項目４２）
前記１種またはこれより多くの抽出薬剤は、１種またはこれより多くの界面活性剤、プロテアーゼ、張度調節剤、カオトロープ、ヌクレアーゼ、緩衝液、プロテアーゼインヒビター、ホスファターゼインヒビター、またはヌクレアーゼインヒビターを含む、項目３０～４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記化学的マスクは、接触角６０～１５５度を有する、項目３０～４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記化学的マスクは、フルオロポリマーまたはフルオロアクリルポリマーを含む疎水性マスク溶液を介して付与される、項目３０～４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記化学的マスク溶液は、アクリレートまたはシアノアクリレートを含む溶液を介して付与される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記化学的マスク溶液は、溶媒をさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記溶媒は、ピロピレングリコール誘導体、フルオロカーボン、またはアルコールである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記溶媒は、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロ－２－メチルペンタン、ペルフルオロ－１，３－ジメチルシクロヘキサン、ペルフルオロデカリン、または１，３－ジフルオロプロパンである、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記少なくとも１つの目的の領域は、円形であり、前記目的の領域の直径は、１ｍｍもしくはこれ未満、５００ミクロンもしくはこれ未満、２５０ミクロンもしくはこれ未満、１２５ミクロンもしくはこれ未満、１００ミクロンもしくはこれ未満、８０ミクロンもしくはこれ未満、５０ミクロンもしくはこれ未満、２５ミクロンもしくはこれ未満、または１５ミクロンもしくはこれ未満である、項目３０～４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記少なくとも１つの目的の領域は、面積約７．８×１０５平方ミクロン未満である、項目３０～４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、疎水性領域によって境界線が描かれた少なくとも１つの親水性領域を含む、項目３１～５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１０，０００ピコリットルもしくはこれ未満、１，０００ピコリットルもしくはこれ未満、５００ピコリットルもしくはこれ未満、２５０ピコリットルもしくはこれ未満、１００ピコリットルもしくはこれ未満、５０ピコリットルもしくはこれ未満、１０ピコリットルもしくはこれ未満、または２ピコリットルもしくはこれ未満の溶液体積を送達し得る、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記少なくとも１つの親水性領域の境界線を描く前記疎水性領域は、接触角６０～１５５度を有する、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記平らな組織切片中の１個より多くの目的の領域から細胞構成要素を溶解させることを包含する、項目３０～５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記平らな組織切片中の少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１０００個、または少なくとも１０，０００個の目的の領域からの細胞構成要素を溶解させることを包含する、項目３０～５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、グリッドパターンを含む、項目３０～５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、円形を含む、項目３０～５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
前記固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、圧電式インクジェット送達デバイスを使用して前記平らな組織切片に付与される、項目３０～５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記平らな組織切片は、約２～約５０μｍ厚である、項目３０～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記平らな組織切片は、約１～約１５μｍ厚である、項目３０～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記平らな組織切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片である、項目３０～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記平らな組織切片は、固定されていない組織切片である、項目３０～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
第１の固体支持体上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離するためのシステムであって、前記システムは、
（ａ）前記疎水性マスクで境界線が描かれる少なくとも１つの目的の領域を含む第１の固体支持体上の平らな組織切片；
（ｂ）前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域と整列させるために、前記固体基材の表面に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む第２の固体支持体であって、前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を含む、第２の固体支持体；ならびに
（ｃ）前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む前記固体支持体に連結され、前記固体支持体を移し得、前記固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素が、疎水性マスクで境界線を描かれた平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域と接触し得る電動式ステージ、
を含むシステム。
（項目６４）
（ｉ）前記電動式ステージの位置を制御するように構成され、前記第２の固体基材上の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、前記組織切片中の少なくとも１つの目的の領域と接触するコンピューターシステム、
をさらに含む、項目６３に記載のシステム。
（項目６５）
前記疎水性マスク溶液は、
（ｉ）疎水性マスク溶液を前記固体支持体上の組織切片に送達し得る圧電式インクジェット送達デバイス、および
（ｉｉ）前記圧電式インクジェット送達デバイスを制御して、前記疎水性マスク溶液で前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描いて、疎水性マスクを生成するように構成されたコンピューターシステムによって付与される、項目６３または６４に記載のシステム。
（項目６６）
前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、疎水性領域によって境界線が描かれる少なくとも１つの親水性領域を含む、項目６３～６５に記載のシステム。
（項目６７）
前記疎水性マスク溶液は、Ｃ７Ｆ１５ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、ＦＣ－７２２、ＰｅｒＦｌｕｏｒｏＣｏａｔ、またはＦｌｕｏｒｏＰｅｌのうちの少なくとも１つを含む、項目５８～６６のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６８）
前記疎水性マスク溶液は、アクリレートまたはシアノアクリレートのうちの少なくとも一方を含む、項目５８～６７のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６９）
前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１０，０００ピコリットルもしくはこれ未満、１，０００ピコリットルもしくはこれ未満、５００ピコリットルもしくはこれ未満、２５０ピコリットルもしくはこれ未満、１００ピコリットルもしくはこれ未満、５０ピコリットルもしくはこれ未満、１０ピコリットルもしくはこれ未満、または２ピコリットルもしくはこれ未満の溶液体積を送達し得る、項目５８～６８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７０）
前記少なくとも１つの親水性領域の境界線を描く疎水性領域の接触角は、６０～１５５度である、項目５８～６８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７１）
疎水性マスク溶液付与のための前記システムは、前記平らな組織切片への付与後に前記疎水性マスク溶液を重合し得るＵＶ光源を含む、項目６５～７０のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７２）
疎水性マスク溶液付与のための前記システムは、ペルフルオロアルキルシランの化学蒸着のための装置を含む、項目６５～７１のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７３）
平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離するためのキットであって、前記キットは、項目６３～７２のいずれか１項に記載の要素のうちのいずれかを含む、キット。
（項目７４）
組織切片であって、最も下から最も上へと、前記組織切片に接して少なくとも１つのシアノアクリレート層、続いて、少なくとも１つのペルフルオロアルキルシラン層を含む、組織切片。
（項目７５）
前記少なくとも１つのシアノアクリレート層の下に少なくとも１つの非シリル化フルオロアルキル層を含む、項目７４に記載の組織切片。
（項目７６）
前記非シリル化フルオロアルキル層は、フルオロアクリレートまたは非シリル化ペルフルオロアルカン化合物を含む、項目７５に記載の組織切片。
（項目７７）
前記ペルフルオロアルキルシラン層は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む、項目７４～７６のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目７８）
前記シアノアクリレート層を有する領域によって境界線が描かれる前記シアノアクリレート層を欠く少なくとも１つの領域を含む、項目７４～７７のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目７９）
前記領域は、実質的に楕円形、多角形、または自由形態である、項目７８に記載の組織切片。
（項目８０）
前記組織切片への界面活性剤の水性溶液の付与は、前記領域内の細胞を溶解させ得る、項目７８～７９のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目８１）
前記領域は、約１ｍｍ未満のサイズである、項目７８～８０のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目８２）
前記領域は、約１００ミクロン未満のサイズである、項目８１に記載の組織切片。
（項目８３）
前記組織切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片である、項目７４～８２のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目８４）
前記組織切片は、脱パラフィン化ＦＦＰＥ組織切片である、項目８３に記載の組織切片。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
（ａ）固体基材上の前記平らな組織切片に、規定された目的の領域からポリマーで境界線を描いて、非物理的流体バリアを形成する工程であって、ここで前記目的の領域は、直径１ｍｍより小さい工程；および
（ｂ）前記少なくとも１つの規定された目的の領域内の細胞をインサイチュで選択的に破壊する工程、
を包含する方法。
（項目２）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程、
を包含し、ここで前記化学的マスクは、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞の選択的破壊に適したバリアを形成し、前記化学的マスクは、物理的流体境界ではない、方法。
（項目３）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
前記固体基材上の平らな組織切片中の前記目的の領域内の細胞の破壊に適した溶媒を分与して、遊離した細胞構成要素を含む液滴を形成する工程、
を包含し、ここで前記液滴は、前記目的の領域の外側の組織から、物理的バリアなしに流体連通から隔離される、方法。
（項目４）
組織切片中の複数の目的の領域から生体分子を単離および検出する方法であって、前記方法は、
疎水性マスクを組織切片に付与し、前記平らな組織切片中の少なくとも１０００個の目的の領域が、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される工程、および
前記少なくとも１０００個の目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出し、前記タンパク質または核酸の空間位置情報が保持される工程、
を包含する方法。
（項目５）
前記方法は、直径約１００ミクロンより小さいかまたは直径約１００ミクロンに等しい目的の領域を隔離し得る、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記組織切片は、ＦＦＰＥ組織切片である、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出する工程を包含し、ここで前記検出する工程は、前記細胞からインサイチュで遊離した前記核酸を配列決定することを包含する、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記配列決定することは、前記インサイチュで遊離した核酸を、前記目的の領域の位置を識別するバーコードでタグ化することを包含する、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記バーコードは、表面に連結されない、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記タグ化することは、インサイチュで遊離したＲＮＡをタグ化することを包含し、
（ａ）特有の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記少なくとも１０００個の目的の領域に付与すること；および
（ｂ）第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、前記少なくとも１０００個の目的の領域に対して行い、前記目的の領域は、互いから隔離されること、
を包含する、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記目的の領域から合成したｃＤＮＡ分子間で前記特有の核酸配列の相互汚染が低減される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第１鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を配列決定することを包含する、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡを配列決定することを包含する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ｍＲＮＡを配列決定することは、前記ｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡに対して行われる前増幅ステップを包含する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記前増幅ステップは、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムヘキサマープライマーでのＰＣＲ、ポリＡ特異的プライマーでのＰＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ゲノムＤＮＡを配列決定することを包含する、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記ゲノムＤＮＡを配列決定することは、前記ゲノムＤＮＡに対して行われる全ゲノム増幅（ＷＧＡ）ステップを包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ＷＧＡ工程は、変性オリゴヌクレオチドプライム（ＤＯＰ）ＰＣＲ、マルチ置換増幅（ＭＤＡ）、マルチアニーリングおよびループ形成ベースの増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）、ＰｉｃｏＰｌｅｘ、自己縮重プライマーでの等温増幅、またはこれらの組み合わせである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
組織切片であって、前記切片に、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される、少なくとも１０００個の水性液滴を含む、組織切片。
（項目２２）
前記１０００個の水性液滴を、互いとの流体連通から隔離する疎水性マスクを含む、項目２１に記載の組織切片。
（項目２３）
前記少なくとも１０００個の水性液滴は、少なくとも１０００個の特有のオリゴヌクレオチドを含む、項目２１または２２に記載の組織切片。
（項目２４）
前記疎水性マスクは、少なくともシアノアクリレートポリマーの層を含む、項目２１～２３のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目２５）
前記疎水性マスクは、少なくとも非シリル化フルオロアルキル層を含む、項目２１～２４のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目２６）
前記非シリル化フルオロアルキル層は、フルオロアクリレートまたは非シリル化ペルフルオロアルカン化合物を含む、項目２4に記載の組織切片。
（項目２７）
少なくともペルフルオロアルキルシラン層を含む、項目２１～２６のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目２８）
前記ペルフルオロアルキルシラン層は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む、項目２７に記載の組織切片。
（項目２９）
前記オリゴヌクレオチドは、表面に連結されない、項目２３～２８のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目３０）
固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程；
（ｂ）１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、前記目的の領域上に分与し、それによって、前記少なくとも１つの目的の領域内で境界線を描かれた細胞を選択的に溶解することによって、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞構成要素を溶解する工程、
を包含する方法。
（項目３１）
前記溶液を前記目的の領域上に分与する工程は、
（ａ）前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、第２の固体基材の表面上に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む薬剤移動デバイスに分与すること；
（ｂ）前記第２の固体基材の表面上に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を、前記平らな組織切片に接触させ、前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、前記平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域に空間的に対応することであって、ここで前記接触させることは、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、前記平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域に移動させることを可能にし、それによって、前記少なくとも１つの目的の領域中の細胞構成要素を、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液中で溶解させること、
を包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
少なくとも１つの溶解させた細胞構成要素を、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域から単離する工程、
をさらに包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記少なくとも１つの目的の領域から溶解させた前記細胞構成要素の中で核酸を配列決定する工程、
をさらに包含する、項目３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記少なくとも１つの目的の領域から溶解させた前記細胞構成要素の中でタンパク質に対してタンデム質量分析を行う工程、
をさらに包含する、項目３０～３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記（ｂ）における溶液は、可溶性タグをさらに含み、ここで前記可溶性タグは、前記少なくとも１つの目的の領域に対応する、項目３０～３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記可溶性タグは、オリゴヌクレオチドである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記オリゴヌクレオチドは、前記目的の領域に対応するサンプルインデックス配列、および必要に応じて、特有の分子識別子配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記オリゴヌクレオチドは、前記目的の領域に対応する電荷タグを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記オリゴヌクレオチドは２本鎖である、項目３６または３７に記載の方法。
（項目４０）
前記オリゴヌクレオチドは、ビーズに結合体化される、項目３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記可溶性タグは、タンデム質量タグである、項目３５に記載の方法。
（項目４２）
前記１種またはこれより多くの抽出薬剤は、１種またはこれより多くの界面活性剤、プロテアーゼ、張度調節剤、カオトロープ、ヌクレアーゼ、緩衝液、プロテアーゼインヒビター、ホスファターゼインヒビター、またはヌクレアーゼインヒビターを含む、項目３０～４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記化学的マスクは、接触角６０～１５５度を有する、項目３０～４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記化学的マスクは、フルオロポリマーまたはフルオロアクリルポリマーを含む疎水性マスク溶液を介して付与される、項目３０～４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記化学的マスク溶液は、アクリレートまたはシアノアクリレートを含む溶液を介して付与される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記化学的マスク溶液は、溶媒をさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記溶媒は、ピロピレングリコール誘導体、フルオロカーボン、またはアルコールである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記溶媒は、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロ－２－メチルペンタン、ペルフルオロ－１，３－ジメチルシクロヘキサン、ペルフルオロデカリン、または１，３－ジフルオロプロパンである、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記少なくとも１つの目的の領域は、円形であり、前記目的の領域の直径は、１ｍｍもしくはこれ未満、５００ミクロンもしくはこれ未満、２５０ミクロンもしくはこれ未満、１２５ミクロンもしくはこれ未満、１００ミクロンもしくはこれ未満、８０ミクロンもしくはこれ未満、５０ミクロンもしくはこれ未満、２５ミクロンもしくはこれ未満、または１５ミクロンもしくはこれ未満である、項目３０～４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記少なくとも１つの目的の領域は、面積約７．８×１０５平方ミクロン未満である、項目３０～４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、疎水性領域によって境界線が描かれた少なくとも１つの親水性領域を含む、項目３１～５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１０，０００ピコリットルもしくはこれ未満、１，０００ピコリットルもしくはこれ未満、５００ピコリットルもしくはこれ未満、２５０ピコリットルもしくはこれ未満、１００ピコリットルもしくはこれ未満、５０ピコリットルもしくはこれ未満、１０ピコリットルもしくはこれ未満、または２ピコリットルもしくはこれ未満の溶液体積を送達し得る、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記少なくとも１つの親水性領域の境界線を描く前記疎水性領域は、接触角６０～１５５度を有する、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記平らな組織切片中の１個より多くの目的の領域から細胞構成要素を溶解させることを包含する、項目３０～５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記平らな組織切片中の少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１０００個、または少なくとも１０，０００個の目的の領域からの細胞構成要素を溶解させることを包含する、項目３０～５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、グリッドパターンを含む、項目３０～５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、円形を含む、項目３０～５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
前記固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、圧電式インクジェット送達デバイスを使用して前記平らな組織切片に付与される、項目３０～５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記平らな組織切片は、約２～約５０μｍ厚である、項目３０～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記平らな組織切片は、約１～約１５μｍ厚である、項目３０～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記平らな組織切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片である、項目３０～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記平らな組織切片は、固定されていない組織切片である、項目３０～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
第１の固体支持体上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離するためのシステムであって、前記システムは、
（ａ）前記疎水性マスクで境界線が描かれる少なくとも１つの目的の領域を含む第１の固体支持体上の平らな組織切片；
（ｂ）前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域と整列させるために、前記固体基材の表面に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む第２の固体支持体であって、前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を含む、第２の固体支持体；ならびに
（ｃ）前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む前記固体支持体に連結され、前記固体支持体を移し得、前記固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素が、疎水性マスクで境界線を描かれた平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域と接触し得る電動式ステージ、
を含むシステム。
（項目６４）
（ｉ）前記電動式ステージの位置を制御するように構成され、前記第２の固体基材上の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、前記組織切片中の少なくとも１つの目的の領域と接触するコンピューターシステム、
をさらに含む、項目６３に記載のシステム。
（項目６５）
前記疎水性マスク溶液は、
（ｉ）疎水性マスク溶液を前記固体支持体上の組織切片に送達し得る圧電式インクジェット送達デバイス、および
（ｉｉ）前記圧電式インクジェット送達デバイスを制御して、前記疎水性マスク溶液で前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描いて、疎水性マスクを生成するように構成されたコンピューターシステムによって付与される、項目６３または６４に記載のシステム。
（項目６６）
前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、疎水性領域によって境界線が描かれる少なくとも１つの親水性領域を含む、項目６３～６５に記載のシステム。
（項目６７）
前記疎水性マスク溶液は、Ｃ７Ｆ１５ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、ＦＣ－７２２、ＰｅｒＦｌｕｏｒｏＣｏａｔ、またはＦｌｕｏｒｏＰｅｌのうちの少なくとも１つを含む、項目５８～６６のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６８）
前記疎水性マスク溶液は、アクリレートまたはシアノアクリレートのうちの少なくとも一方を含む、項目５８～６７のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６９）
前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１０，０００ピコリットルもしくはこれ未満、１，０００ピコリットルもしくはこれ未満、５００ピコリットルもしくはこれ未満、２５０ピコリットルもしくはこれ未満、１００ピコリットルもしくはこれ未満、５０ピコリットルもしくはこれ未満、１０ピコリットルもしくはこれ未満、または２ピコリットルもしくはこれ未満の溶液体積を送達し得る、項目５８～６８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７０）
前記少なくとも１つの親水性領域の境界線を描く疎水性領域の接触角は、６０～１５５度である、項目５８～６８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７１）
疎水性マスク溶液付与のための前記システムは、前記平らな組織切片への付与後に前記疎水性マスク溶液を重合し得るＵＶ光源を含む、項目６５～７０のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７２）
疎水性マスク溶液付与のための前記システムは、ペルフルオロアルキルシランの化学蒸着のための装置を含む、項目６５～７１のいずれか１項に記載のシステム。
（項目７３）
平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離するためのキットであって、前記キットは、項目６３～７２のいずれか１項に記載の要素のうちのいずれかを含む、キット。
（項目７４）
組織切片であって、最も下から最も上へと、前記組織切片に接して少なくとも１つのシアノアクリレート層、続いて、少なくとも１つのペルフルオロアルキルシラン層を含む、組織切片。
（項目７５）
前記少なくとも１つのシアノアクリレート層の下に少なくとも１つの非シリル化フルオロアルキル層を含む、項目７４に記載の組織切片。
（項目７６）
前記非シリル化フルオロアルキル層は、フルオロアクリレートまたは非シリル化ペルフルオロアルカン化合物を含む、項目７５に記載の組織切片。
（項目７７）
前記ペルフルオロアルキルシラン層は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む、項目７４～７６のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目７８）
前記シアノアクリレート層を有する領域によって境界線が描かれる前記シアノアクリレート層を欠く少なくとも１つの領域を含む、項目７４～７７のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目７９）
前記領域は、実質的に楕円形、多角形、または自由形態である、項目７８に記載の組織切片。
（項目８０）
前記組織切片への界面活性剤の水性溶液の付与は、前記領域内の細胞を溶解させ得る、項目７８～７９のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目８１）
前記領域は、約１ｍｍ未満のサイズである、項目７８～８０のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目８２）
前記領域は、約１００ミクロン未満のサイズである、項目８１に記載の組織切片。
（項目８３）
前記組織切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片である、項目７４～８２のいずれか１項に記載の組織切片。
（項目８４）
前記組織切片は、脱パラフィン化ＦＦＰＥ組織切片である、項目８３に記載の組織切片。
【0009】
援用の表示
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されていることが示されるものと同程度まで、参考として援用される。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されていることが示されるものと同程度まで、参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
本発明の新規な特徴は、添付の請求項において詳細に記載される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面への言及によって得られる。
【0011】
【0012】
【図2A】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆは、本明細書で記載される疎水性マスク形成技術の適用によって、ＦＦＰＥヒト肝臓ミクロトーム切片から単離された種々のサイズ（約２５ミクロン、約１００ミクロン、約２５０ミクロン、約５００ミクロン、および１ｍｍ直径）および形状（矩形または円形）の目的の領域を示す明視野顕微鏡画像（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、１０×倍率、２Ｅは、４×倍率である）を示す。
【図2B】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆは、本明細書で記載される疎水性マスク形成技術の適用によって、ＦＦＰＥヒト肝臓ミクロトーム切片から単離された種々のサイズ（約２５ミクロン、約１００ミクロン、約２５０ミクロン、約５００ミクロン、および１ｍｍ直径）および形状（矩形または円形）の目的の領域を示す明視野顕微鏡画像（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、１０×倍率、２Ｅは、４×倍率である）を示す。
【図2C】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆは、本明細書で記載される疎水性マスク形成技術の適用によって、ＦＦＰＥヒト肝臓ミクロトーム切片から単離された種々のサイズ（約２５ミクロン、約１００ミクロン、約２５０ミクロン、約５００ミクロン、および１ｍｍ直径）および形状（矩形または円形）の目的の領域を示す明視野顕微鏡画像（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、１０×倍率、２Ｅは、４×倍率である）を示す。
【図2D】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆは、本明細書で記載される疎水性マスク形成技術の適用によって、ＦＦＰＥヒト肝臓ミクロトーム切片から単離された種々のサイズ（約２５ミクロン、約１００ミクロン、約２５０ミクロン、約５００ミクロン、および１ｍｍ直径）および形状（矩形または円形）の目的の領域を示す明視野顕微鏡画像（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、１０×倍率、２Ｅは、４×倍率である）を示す。
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
発明の詳細な説明
組織内の希なおよび／または多様な細胞タイプの検出に基づく臨床分析は、困難である。例えば、前がん組織は、小さな割合の異常細胞のみを含み得、その周りの正常細胞がシグナルの希釈を引き起こし、がんの早期ステージ検出を妨害していることもある。後期ステージ腫瘍は、対照的に、異常細胞の高い集団を有し得るが、化学療法ストラテジーに異なって応答する異なる遺伝子型を有する多様性の大きな細胞を含み得る。これらの場合に、形態的に異常な細胞を選択的に単離し、分析する能力は、改善された診断および疾患病態生理の理解の恩恵である。
組織内の希なおよび／または多様な細胞タイプの検出に基づく臨床分析は、困難である。例えば、前がん組織は、小さな割合の異常細胞のみを含み得、その周りの正常細胞がシグナルの希釈を引き起こし、がんの早期ステージ検出を妨害していることもある。後期ステージ腫瘍は、対照的に、異常細胞の高い集団を有し得るが、化学療法ストラテジーに異なって応答する異なる遺伝子型を有する多様性の大きな細胞を含み得る。これらの場合に、形態的に異常な細胞を選択的に単離し、分析する能力は、改善された診断および疾患病態生理の理解の恩恵である。
【0022】
しかし、組織サンプル内の選択された細胞の小さな集団の単離および分析の既存の方法は、面倒で、高価であり、かつ組織の真にハイスループットの多重分析（例えば、多量の手動操作および高価な機器類を要するレーザーキャプチャーマイクロダイセクション）に適していない。
【0023】
よって、組織サンプル内の領域の多重単離および分析のための簡単で、安価なハイスループット方法の必要性がある。
【0024】
定義
【0025】
用語「組織（ｔｉｓｓｕｅ）」とは、細胞の集合体、および必要に応じて、細胞内物質（例えば、ＥＣＭ）に言及する。代表的には、組織中の細胞は、自由に浮遊しているのではなく、多細胞構造を形成するために互いに付着している。組織タイプとしては、筋、神経、表皮および結合組織が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で記載されるとおりの組織は、種々の生物に由来し得、それら生物としては、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄類、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類（すなわち、ヒトまたは非ヒト霊長類）のような哺乳動物；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、トウモロコシ、ソルガム、オーツ麦、コムギ、イネ、キャノーラ、またはダイズのような植物；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのような藻類；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのような線形動物；Drosophila melanogaster、蚊、ミバエ、ミツバチまたはクモのような昆虫；ゼブラフィッシュのような魚類；爬虫類；またはカエルもしくはＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓのような両生類が挙げられるが、これらに限定されない。
【0026】
用語「接触角（ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｇｌｅ）」とは、固体表面に載っている液滴の形状に言及する。空気中の固体平面に液体が存在すると仮定すると、用語「接触角」は、その液体の接線とその液体、固体平面および空気の接触点でのその固体平面の接線との間の角度を示す。
【0027】
用語「疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）」とは、水に濡れにくい表面またはコーティングに言及する。表面は、少なくとも６０°の後退水接触角を示す場合に疎水性、少なくとも１１０°の接触角を示す場合に非常に疎水性、そして少なくとも１２０°の後退水接触角を示す場合に極めて疎水性と考えられる。
【0028】
用語「超疎水性（ｓｕｐｅｒｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）」とは、水に極めて濡れにくい表面またはコーティングに言及する。超疎水性表面またはコーティングは、通常は１４０°を超える、およびしばしば１５０°を超える接触角を有する。
【0029】
用語「親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）」とは、水性流体によって濡れ得る表面に言及するために使用される。表面は、流体が、不連続の液滴を形成することとは対照的に、上記表面にわたって自発的に拡がる傾向がある場合に、流体によって濡らされることをいう（親水性）。表面は、約５０度未満の接触角を示す場合に、親水性と考えられる。
【0030】
「インクジェット送達（ｉｎｋｊｅｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」とは、二次元および三次元構造への液体の１～１００ピコリットル（ｐｌ）の液滴の処理を可能にする非接触アプローチである。このアプローチは、インクを形成するために、液体に目的の物質を溶解または分散させることを要する。インクジェット送達のために使用される最も普及した方法は、ドロップオンデマンド（ＤＯＤ）型の方法であり、ここでドロップは、マイクロメートルスケールのノズルから射出され、（ａ）沸点より高い温度へと液体を加熱して（サーマルＤＯＤ）、上記ノズルからの液滴の放出を刺激する蒸気泡を生成すること、または（ｂ）材料の振動および上記ノズルからの液滴の放出をもたらす、圧電変換器への電圧の印加（圧電式ＤＯＤ）のいずれかによって作られる。
【0031】
概観
【0032】
固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離する方法が、本明細書で提供される。上記方法は、インサイチュであり、組織から領域を規定するために固定化したヌクレオチドアレイの下準備（ｐｒｅ－ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を要しない。むしろ、上記方法は、組織切片上に疎水性マスクをインサイチュで準備して、目的の領域を隔離し、続いて、表面張力アレイを必要に応じて使用して、上記疎水性マスクによって境界線を描いた特定の目的の領域に、抽出および／または分析試薬を添加および／または除去することを包含する。表面張力アレイの使用は、例えば、上記疎水性マスクによって隔離された多数の領域が存在する（例えば、１０を超える、１００を超える、１０００を超える）場合に、特に有用である。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ａ）平らな組織切片に疎水性マスクを付与して、固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く工程；（ｂ）１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、第２の固体基材の表面上に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む薬剤移動デバイスに分与する工程；および（ｃ）上記第２の固体基材の表面に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を上記平らな組織切片に接触させ、その結果、上記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、上記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域に空間的に対応する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液が、上記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域に移され、それによって、上記少なくとも１つの目的の領域中の細胞構成要素を、上記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液中に溶解させることを可能にする。
【0033】
上記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液は、核酸またはタンパク質を標識するために適した1種またはこれより多くのタグまたは標識を含み得る。このようなタグま
たは標識は、バーコードまたは空間的にアドレス指定可能な他のものを含み得、その結果、抽出される核酸またはタンパク質から得られる核酸配列決定データまたは質量分析データは、その後、上記核酸またはタンパク質が単離され得る目的の領域と関連付けられ得る。よって、本明細書中の方法はまた、組織切片から核酸またはタンパク質を空間的にタグ化するためのスキームを提供する。
たは標識は、バーコードまたは空間的にアドレス指定可能な他のものを含み得、その結果、抽出される核酸またはタンパク質から得られる核酸配列決定データまたは質量分析データは、その後、上記核酸またはタンパク質が単離され得る目的の領域と関連付けられ得る。よって、本明細書中の方法はまた、組織切片から核酸またはタンパク質を空間的にタグ化するためのスキームを提供する。
【0034】
組織切片
【0035】
上記方法において利用される組織切片は、免疫組織化学の準備のために一般に使用される任意の標準的方法によって調製され得、固定されていても、固定されていなくても、いずれでもよい（例えば、新鮮に切除されたてもよいし、凍結のような非固定組織調製法によって調製されてもよい）。細胞または組織の固定は、架橋剤（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）の使用を要し得る。
【0036】
固定した組織はさらに、パラフィン・ワックス中またはヒドロゲル（例えば、ポリアクリルアミド支持マトリクス）に包埋され得る。組織調製の普及している方法は、ＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）であり、これは、組織片をホルマリン溶液中で固定し、上記組織を徐々に高くなる濃度のアルコール中で脱水し、上記組織をキシレンできれいにし、組織にワックスを浸潤させ（代表的には、パラフィン、種々の異なる融解点を伴って得られ得る２０～４０の間の炭素鎖長を有する直鎖またはｎ－アルカンの混合物）、次いで、上記組織をワックスブロックの中に包埋することを要する。次いで、ＦＦＰＥ組織は、ミクロトームを使用して、組織切片へと調製され得る。
【0037】
いくつかの実施形態において、ＦＦＰＥによって調製される組織切片の厚みは、約１ミクロン～約５０ミクロンである。いくつかの実施形態において、ＦＦＰＥによって調製される組織切片の厚みは、少なくとも約１ミクロンである。いくつかの実施形態において、ＦＦＰＥによって調製される組織切片の厚みは、最大で約５０ミクロンである。いくつかの実施形態において、ＦＦＰＥによって調製される組織切片の厚みは、約１ミクロン～約３ミクロン、約１ミクロン～約５ミクロン、約１ミクロン～約１０ミクロン、約１ミクロン～約１５ミクロン、約１ミクロン～約２０ミクロン、約１ミクロン～約３０ミクロン、約１ミクロン～約４０ミクロン、約１ミクロン～約５０ミクロン、約３ミクロン～約５ミクロン、約３ミクロン～約１０ミクロン、約３ミクロン～約１５ミクロン、約３ミクロン～約２０ミクロン、約３ミクロン～約３０ミクロン、約３ミクロン～約４０ミクロン、約３ミクロン～約５０ミクロン、約５ミクロン～約１０ミクロン、約５ミクロン～約１５ミクロン、約５ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約３０ミクロン、約５ミクロン～約４０ミクロン、約５ミクロン～約５０ミクロン、約１０ミクロン～約１５ミクロン、約１０ミクロン～約２０ミクロン、約１０ミクロン～約３０ミクロン、約１０ミクロン～約４０ミクロン、約１０ミクロン～約５０ミクロン、約１５ミクロン～約２０ミクロン、約１５ミクロン～約３０ミクロン、約１５ミクロン～約４０ミクロン、約１５ミクロン～約５０ミクロン、約２０ミクロン～約３０ミクロン、約２０ミクロン～約４０ミクロン、約２０ミクロン～約５０ミクロン、約３０ミクロン～約４０ミクロン、約３０ミクロン～約５０ミクロン、または約４０ミクロン～約５０ミクロンである。いくつかの実施形態において、ＦＦＰＥによって調製される組織切片の厚みは、約１ミクロン、約３ミクロン、約５ミクロン、約１０ミクロン、約１５ミクロン、約２０ミクロン、約３０ミクロン、約４０ミクロン、または約５０ミクロンである。
【0038】
包埋した組織切片は、さらなる処理（例えば、疎水性化学物質での処理および本明細書でさらに記載されるサンプル抽出技術）の前に脱パラフィン化され得る。脱パラフィン化は、例えば、キシレンバス中での上記切片のインキュベーション、続いて、キシレン／エタノールバス中でのインキュベーション、続いて、徐々に低くなるエタノール濃度（１００％から５０％へ）のバス中でのインキュベーション、続いて、乾燥もしくは水中でのすすぎによって行われ得る。
【0039】
いくつかの実施形態において、固定されていないまたは固定した組織は、凍結切片化によって切片へと調製され得る。固定されていない組織に関しては、組織は、先ず凍結組織マトリクス（例えば、ＯＣＴまたはＣｒｙｏｍａｔｒｉｘ）の中に浸漬され、液体窒素と接触した状態にあるイソペンタンおよび／または２－メチルブタンバスの中で凍結され。クライオスタットで切片化される。固定した組織に関しては、組織は、組織マトリクス中で包埋／凍結する前に、スクロース中で低温保護され得、これは、徐々に高くなる濃度のスクロースバス（３０％まで）の中でのインキュベーションを含む。次いで、上記低温保護され、固定した組織は、凍結組織マトリクス（例えば、ＯＣＴまたはＣｒｙｏｍａｔｒｉｘ）中に浸漬され得、ａ）液体窒素と接触した状態にあるイソペンタンバス、またはｂ）代替のよりゆっくりとした凍結法（例えば、粉末化ドライアイスまたはドライアイス・メタノール／エタノールスラリー）において凍結され得る。次いで、低温保護され、凍結され、固定した組織は、クライオスタットで切片化され得る。
【0040】
いくつかの実施形態において、凍結切片化によって調製される組織切片の厚みは、約５ミクロン～約５０ミクロンであり得る。いくつかの実施形態において、凍結切片化によって調製される組織切片の厚みは、少なくとも約５ミクロンであり得る。いくつかの実施形態において、凍結切片化によって調製される組織切片の厚みは、最大で約５０ミクロンであり得る。いくつかの実施形態において、凍結切片化によって調製される組織切片の厚みは、約５ミクロン～約７ミクロン、約５ミクロン～約９ミクロン、約５ミクロン～約１１ミクロン、約５ミクロン～約１３ミクロン、約５ミクロン～約１５ミクロン、約５ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約３０ミクロン、約５ミクロン～約４０ミクロン、約５ミクロン～約５０ミクロン、約７ミクロン～約９ミクロン、約７ミクロン～約１１ミクロン、約７ミクロン～約１３ミクロン、約７ミクロン～約１５ミクロン、約７ミクロン～約２０ミクロン、約７ミクロン～約３０ミクロン、約７ミクロン～約４０ミクロン、約７ミクロン～約５０ミクロン、約９ミクロン～約１１ミクロン、約９ミクロン～約１３ミクロン、約９ミクロン～約１５ミクロン、約９ミクロン～約２０ミクロン、約９ミクロン～約３０ミクロン、約９ミクロン～約４０ミクロン、約９ミクロン～約５０ミクロン、約１１ミクロン～約１３ミクロン、約１１ミクロン～約１５ミクロン、約１１ミクロン～約２０ミクロン、約１１ミクロン～約３０ミクロン、約１１ミクロン～約４０ミクロン、約１１ミクロン～約５０ミクロン、約１３ミクロン～約１５ミクロン、約１３ミクロン～約２０ミクロン、約１３ミクロン～約３０ミクロン、約１３ミクロン～約４０ミクロン、約１３ミクロン～約５０ミクロン、約１５ミクロン～約２０ミクロン、約１５ミクロン～約３０ミクロン、約１５ミクロン～約４０ミクロン、約１５ミクロン～約５０ミクロン、約２０ミクロン～約３０ミクロン、約２０ミクロン～約４０ミクロン、約２０ミクロン～約５０ミクロン、約３０ミクロン～約４０ミクロン、約３０ミクロン～約５０ミクロン、または約４０ミクロン～約５０ミクロンであり得る。いくつかの実施形態において、凍結切片化によって調製される組織切片の厚みは、約５ミクロン、約７ミクロン、約９ミクロン、約１１ミクロン、約１３ミクロン、約１５ミクロン、約２０ミクロン、約３０ミクロン、約４０ミクロン、または約５０ミクロンであり得る。
【0041】
化学的マスク
【0042】
Ａ． 組成／付与
【0043】
いくつかの実施形態において、本明細書に関する方法は、組織切片（例えば、新鮮な凍結された、固定され凍結された、および／または脱パラフィン化されたＦＦＰＥ組織切片）中の目的の領域の周りを囲いかつ隔離するために、化学的マスクの堆積を含む。上記化学的マスクは、周りの領域の構成要素による汚染なしに、目的の領域から細胞構成要素の選択的水性抽出／再水和を可能にする（なぜならば、上記目的の領域以外のサンプルの領域は、細胞を破壊／抽出／再水和するために必要な溶液をはじくからである）。よって、上記化学的マスク溶液は、疎水性である（例えば、少なくとも６０度の後退水接触角を有する）。
【0044】
いくつかの実施形態において、上記化学的マスクの接触角は、約６０度～約１５０度であり得る。いくつかの実施形態において、上記化学的マスクの接触角は、少なくとも約６０度であり得る。いくつかの実施形態において、上記化学的マスクの接触角は、最大で約１５０度であり得る。いくつかの実施形態において、上記化学的マスクの接触角は、約６０度～約１００度、約６０度～約１１０度、約６０度～約１４０度、約６０度～約１５０度、約１００度～約１１０度、約１００度～約１４０度、約１００度～約１５０度、約１１０度～約１４０度、約１１０度～約１５０度、または約１４０度～約１５０度であり得る。いくつかの実施形態において、上記化学的マスクの接触角は、約６０度、約１００度、約１１０度、約１４０度、または約１５０度であり得る。
【0045】
少なくとも６０度の表面後退水接触角を生成するために使用され得、従って、本明細書で記載されるように化学的マスクを生成することにおける使用に適切であり得る広く種々の表面コーティングポリマーおよびコポリマーが記載されている。
【0046】
このような薬剤の重要なクラスは、フルオロカーボン、特に、少なくとも１つの末端トリフルオロメチル基を含むフッ化カーボンモノマーである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの末端トリフルオロメチル基を含む上記フッ化カーボンモノマーは、約３～約２０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、このようなフルオロカーボンは、実質的に非分枝状のフルオロアルキルまたはペルフルオロアルキルのエチレン不飽和モノマーである。いくつかの実施形態において、上記エチレン不飽和モノマーは、アクリレート（例えば、メタクリレート）である。いくつかの実施形態において、上記エチレン不飽和モノマーは、シアノアクリレートである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの末端トリフルオロメチル基を含むフッ化カーボンモノマーは、フッ化もしくは過フッ化されたアクリレート、シリコーン、エポキシ、ウレタン、またはオキシム、またはこれらの任意の組み合わせである。このような薬剤としては、フルオロアクリレート（またはその溶液）またはペルフルオロアルキルシランが挙げられる。フルオロアクリレートまたはその溶液としては、上記フルオロアルキルメタクリレートモノマーＣ７Ｆ１５ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、ＦＣ－７２２（３Ｍから入手可能）、ＰｅｒＦｌｕｏｒｏＣｏａｔ（Ｃｙｔｏｎｉｘ）、およびＦｌｕｏｒｏＰｅｌ（Ｃｙｔｏｎｉｘ， ＦｌｕｏｒｏＰｅｌ ８００および８００Ｍ製品が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。上記溶液は、希釈なしで（ｆｕｌｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）で使用され得るが、低濃度のコーティングポリマーまたはフルオロアルカンを形成するために、溶媒（例えば、フルオロ溶媒（ｆｌｕｏｒｏｓｏｌｖｅｎｔ）、アルコール、エタノール）で希釈されてもよい。本発明のコーティングを作製するために使用されるポリマー溶液は、好ましくは、約０．０１重量％～約５０重量％のコーティングポリマー含有量を有する。ペルフルオロアルキルシランは、ペルフルオロアルキルトリクロロシランおよびペルフルオロトリス（ジメチルアミノ）シラン（例えば、ＰＦ１０ＴＡＳ）を含む。ペルフルオロアルキルトリクロロシランは、種々の長さおよび異性体のペルフルオロ化アルキル基（例えば、ペルフルオロメチル、ペルフルオロエチル、ペルフルオロプロピル、ペルフルオロブチル、ペルフルオロ－ｔｅｒｔブチル、ペルフルオロペンチル、ペルフルオロヘキシル、ペルフルオロオクチル、ペルフルオロノニル、ペルフルオロデシルのようなＣ１－Ｃ２０ペルフルオロアルキル基）に結合されたトリクロロシリル基を含む有機分子である。ペルフルオロアルキルトリクロロシランの例としては、ＦＯＴＳ（トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シラン）、
が挙げられるが、これらに限定されない。ペルフルオロトリス（ジメチルアミノ）シランは、種々の長さおよび異性体の過フッ化アルキル基（例えば、ペルフルオロメチル、ペルフルオロエチル、ペルフルオロプロピル、ペルフルオロブチル、ペルフルオロ－ｔｅｒｔブチル、ペルフルオロペンチル、ペルフルオロヘキシル、ペルフルオロオクチル、ペルフルオロノニル、ペルフルオロデシルのようなＣ１－Ｃ２０ペルフルオロアルキル）に結合されたトリス（ジメチルアミノ）シリル基を含む有機分子である。ペルフルオロアルキルシラン、ペルフルオロトリス（ジメチルアミノ）シランまたはペルフルオロアルキルトリクロロシランは、直接的に（例えば、浸漬、スプレー）または間接的に（例えば、化学蒸着、ＣＶＤ）付与され得る。
【化1】
が挙げられるが、これらに限定されない。ペルフルオロトリス（ジメチルアミノ）シランは、種々の長さおよび異性体の過フッ化アルキル基（例えば、ペルフルオロメチル、ペルフルオロエチル、ペルフルオロプロピル、ペルフルオロブチル、ペルフルオロ－ｔｅｒｔブチル、ペルフルオロペンチル、ペルフルオロヘキシル、ペルフルオロオクチル、ペルフルオロノニル、ペルフルオロデシルのようなＣ１－Ｃ２０ペルフルオロアルキル）に結合されたトリス（ジメチルアミノ）シリル基を含む有機分子である。ペルフルオロアルキルシラン、ペルフルオロトリス（ジメチルアミノ）シランまたはペルフルオロアルキルトリクロロシランは、直接的に（例えば、浸漬、スプレー）または間接的に（例えば、化学蒸着、ＣＶＤ）付与され得る。
【0047】
いくつかの実施形態において、上記フルオロカーボンは、上記マスクを生成するために、ポリマーとして直接的に（排除されることが望まれる領域に選択的に、または組織領域全体に非特異的に、のいずれかで）、組織切片に付与される（例えば、フルオロアクリレートのようなフッ化カーボンモノマーは、光開始剤とともに組織切片に付加される）。いくつかの実施形態において、上記フルオロカーボンは、上記組織切片に、非フッ化アクリレートまたはシアノアクリレートを上記光開始剤とともに、上記組織切片に例えば、インクジェット印刷によって最初に付与した後に、付与される。いくつかの実施形態において、１種より多くのフルオロカーボンは、コポリマーとして上記組織切片に付与される（例えば、フルオロアクリレート（ｆｌｕｏｒｏａｃｒｙａｔｅ）のようなフルオロカーボンを上記組織切片に最初に付与し、続いて、非フッ化アクリレートまたはシアノアクリレートを、それに対して光開始剤とともに付与し、続いて、それに対してその同じフルオロカーボンまたはペルフルオロアルキルシランのような異なるフルオロカーボンを付与する）。
【0048】
いくつかの実施形態において、上記フルオロカーボンは、ポリマーとして、上記マスクを生成するために、上記組織切片の頂上に疎水性物質の層に付与される（シアノアクリレートのような疎水性ポリマーを上記組織切片に、例えば、スプレーまたは浸漬によって、例えば、最初の付与後に）。いくつかの実施形態において、上記フルオロカーボンは、疎水性物質の層に、上記疎水性物質の層と同じまたは異なるパターンで付与され、その結果、上記フルオロカーボンおよび疎水性物質は、それらが満たすコポリマーマスクを形成する。
【0049】
いくつかの実施形態において、疎水性物質の層は、ポリマーとして、上記化学的マスクに（例えば、ポリマーまたはコポリマーとしの上記マスク物質を、上記組織切片に最初に付与した後に）付与される。いくつかの実施形態において、上記疎水性物質は、フルオロカーボンである。いくつかの実施形態において、上記疎水性物質は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シラン（トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシランのようなペルフルオロアルキルシランを含む。いくつかの実施形態において、上記疎水性物質は、フルオロカーボンを含む。いくつかの実施形態において、上記疎水性物質は、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シランのようなペルフルオロアルキルトリクロロシランを含む。いくつかの実施形態において、上記疎水性物質は、ＰＦ１０ＴＡＳのようなペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む。
【0050】
化学的マスクを生成するために付与され得る薬剤の他のクラスとしては、光触媒ありまたはなしで光硬化性である（ＵＶで硬化し得る）、アクリレートおよびシアノアクリレートが挙げられる。
【0051】
上記化学的マスクを含むモノマーは、種々のアプローチ（標準的な溶媒（例えば、エタノールのようなアルコール、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、メチルエチルケトン、またはペルフルオロオクタン、ペルフルオロ－２－メチルペンタン、ペルフルオロ－１，３－ジメチルシクロヘキサン、ペルフルオロデカリン、１，３－ジフルオロプロパンなどのような室温より高い沸点を有する適切なフルオロカーボン）中で懸濁したモノマーを使用するインクジェット印刷（例えば、ＤＯＤまたは圧電式インクジェット印刷法）が挙げられるが、これらに限定されない）によって、上記組織切片に付与され得る。
【0052】
上記化学的マスクは、１またはこれより多くのモノマーまたはポリマー層を含み得る。上記１またはこれより多くのモノマーまたはポリマー層は、その同じまたは異なるモノマーまたはポリマーを含み得る。上記１またはこれより多くのモノマーまたはポリマー層は、コポリマーを形成し得る。上記１またはこれより多くのモノマーまたはポリマー層は、１層、２層、３層、４層、５層、６層、７層、８層、９層、もしくは１０層のポリマー層であり得るか、またはこれより多い。いくつかの実施形態において、上記化学的マスクは、シアノアクリレートの層、続いて、ペルフルオロアルキルシラン（例えば、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シラン）の層を含む。いくつかの実施形態において、上記化学的マスクは、シアノアクリレート、続いて、ペルフルオロアルキルシラン（例えば、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シラン）の多数の層を含む。いくつかの実施形態において、上記化学的マスクは、フルオロアクリレートまたは非シリル化フルオロアルカンの層、続いて、シアノアクリレートの層、続いて、ペルフルオロアルキルシラン（例えば、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シラン）の層を含む。いくつかの実施形態において、上記化学的マスクは、フルオロアクリレートまたは非シリル化フルオロアルカン、続いて、シアノアクリレート、続いて、ペルフルオロアルキルシラン（例えば、ペルフルオロアルキルトリクロロシラまたはｏｒ ペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シラン）の多数の層を含む。
【0053】
Ｂ．境界線を描いた目的の領域のフォーマット（形状、サイズ、数、分離、アレイ、予め選択されたＲＯＩ、以前の画像との関連付け）
【0054】
上記化学的マスクは、その後の単離のために、組織切片上に、ある範囲の形状およびサイズであり得る、少なくとも１つの目的の領域の境界線を描くために使用され得る。上記目的の領域は、種々の形状、例えば、矩形、円形、卵形、三角形、台形、五角形、六角形、またはｎ角形であり得る。上記目的の領域は、約１７６平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、少なくとも約１７６平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、最大で約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、約１７６平方ミクロン～約１２，０００平方ミクロン、約１７６平方ミクロン～約４９，０００平方ミクロン、約１７６平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約１７６平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約４９，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、または約１９０，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、約１７６平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン、約１９０，０００平方ミクロン、または約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、約４９０平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、少なくとも約４９０平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、最大で約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、約４９０平方ミクロン～約１２，０００平方ミクロン、約４９０平方ミクロン～約４９，０００平方ミクロン、約４９０平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約４９０平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約４９，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、または約１９０，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記目的の領域は、約４９０平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン、約１９０，０００平方ミクロン、または約７８０，０００平方ミクロンであり得る。
【0055】
円形の目的の領域は、直径約１５ミクロン～直径約１０，０００平方ミクロンであり得る。円形の目的の領域は、直径少なくとも約１５ミクロンであり得る。円形の目的の領域は、直径少なくとも約２５ミクロンであり得る。円形の目的の領域は、最大で直径約１，０００ミクロンであり得る。円形の目的の領域は、直径約１５ミクロン～直径約５０ミクロン、直径約１５ミクロン～直径約１２５ミクロン、直径約１５ミクロン～直径約２５０ミクロン、直径約１５ミクロン～直径約５００ミクロン、直径約１５ミクロン～直径約７５０ミクロン、直径約１５平方ミクロン～直径約１，０００ミクロン、直径約１５ミクロン～直径約１２５ミクロン、直径約５０ミクロン～直径約２５０ミクロン、直径約５０ミクロン～直径約５００ミクロン、直径約５０ミクロン～直径約７５０ミクロン、直径約５０ミクロン～直径約１，０００ミクロン、直径約１２５ミクロン～直径約２５０ミクロン、直径約１２５ミクロン～直径約５００ミクロン、直径約１２５ミクロン～直径約７５０ミクロン、直径約１２５ミクロン～直径約１，０００ミクロン、直径約２５０ミクロン～直径約５００ミクロン、直径約２５０ミクロン～直径約７５０ミクロン、直径約２５０ミクロン～直径約１，０００ミクロン、直径約５００ミクロン～直径約７５０ミクロン、直径約５００ミクロン～直径約１０，０００ミクロン、または直径約７５０ミクロン～直径約１，０００ミクロンであり得る。円形の目的の領域は、直径約１５ミクロン、直径約２５ミクロン、直径約５０ミクロン、直径約１２５ミクロン、直径約２５０ミクロン、直径約５００ミクロン、直径約７５０ミクロン、直径約１，０００ミクロン、直径約２，０００ミクロン、直径約３，０００ミクロン、直径約４，０００ミクロン、直径約５，０００ミクロン、直径約６，０００ミクロン、直径約７，０００ミクロン、直径約８，０００ミクロン、直径約９，０００ミクロン、または直径約１０，０００ミクロンであり得る。円形の目的の領域は、直径約１５ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約２５ミクロン未満もしくはこれに等しい、約５０ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約１２５ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約２５０ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約５００ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約７５０ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約１，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約２，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約３，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約４，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約５，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約６，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約７，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、直径約８，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、または直径約９，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、または直径約１０，０００ミクロン未満もしくはこれに等しい、可能性がある。
【0056】
いくつかの実施形態において、１種より多くの目的の領域は、上記目的の領域がグリッドを形成するように、組織サンプルにおいて境界線が描かれる。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、約１０個の目的の領域～約１０，０００個の目的の領域を含む。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、少なくとも約１０個の目的の領域を含む。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、最大で約１０，０００個の目的の領域を含む。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、約１０個の目的の領域～約１００個の目的の領域、約１０個の目的の領域～約１，０００個の目的の領域、約１０個の目的の領域～約１０，０００個の目的の領域、約１００個の目的の領域～約１，０００個の目的の領域、約１００個の目的の領域～約１０，０００個の目的の領域、または約１，０００個の目的の領域～約１０，０００個の目的の領域を含む。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、約１０個の目的の領域、約１００個の目的の領域、約１，０００個の目的の領域、または約１０，０００個の目的の領域を含む。
【0057】
いくつかの実施形態において、上記目的の領域のサイズ、形状、および／またはパターンは、ユーザー定義され得る。このようなユーザー定義のパターンは、適切な可視化技術（例えば、ヘマトキシリン／エオシン染色、免疫蛍光、免疫組織化学）によって組織ブロックにおける高い方の垂直位置または低い方の垂直位置から対応する組織切片を最初に染色／画像化し、コンピューターシステムにおいて上記組織画像上に上記目的の領域を規定し、インクジェット印刷およびコンピューターシステムのガイダンスを使用して、所望のパターンを新鮮な処理されていない対応する組織切片に移すことによって達成され得る。
【0058】
抽出
【0059】
Ａ．溶液
【0060】
上記化学的マスクの付与を介して、組織切片上で１またはこれより多くの目的の領域を規定した後に、抽出溶液を、１またはこれより多くの目的の領域に移して、核酸および／またはタンパク質を上記目的の領域から単離し得る。抽出溶液は、１またはこれより多くのイオン性または非イオン性の界面活性剤（例えば、β－オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ－２０、ＣＨＡＰＳ）、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼ－Ｋ、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、コラゲナーゼ）、張度調節剤（例えば、デキストロース、グリセロール、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム）、カオトロープ（例えば、尿素、チオ尿素、グアニジウム塩酸塩）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ）、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｚｍａ、ＭＯＰＳ、リン酸ナトリウム、炭酸水素塩、ビシン、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ）、プロテアーゼインヒビター（例えば、ＡＥＢＳＦ・ＨＣｌ、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｅｎｉｎ）、ベスタチン、Ｅ－６４ｄ、ロイペプチン、ペプスタチン、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ）、ホスファターゼインヒビター（例えば、フッ化ナトリウム、オルトバナジン酸ナトリウム、β－グリセロホスフェート（ｂｅｔａ－Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｓｅ）、オルトリン酸ナトリウム）、またはヌクレアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＥＰＣ、ＲＮａｉｓｉｎ）を含み得る。凍結され、固定されていない組織切片の場合には、培養した哺乳動物細胞からの核酸またはタンパク質の単離のための標準的組成物が、使用され得る（例えば、緩衝液、塩、および界面活性剤を含む溶液）。ＦＦＰＥ組織切片からタンパク質またはＤＮＡを検索するために、例示的なプロトコールが、例えば、Ｐｉｋｏｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ． ２０１１； （４９）： ２７６３またはＰａｕｌｏ ｅｔ ａｌ． ＪＯＰ． ２０１３
Ｊｕｌ； １４（４）： ４０５－４１４において見出され得る。
Ｊｕｌ； １４（４）： ４０５－４１４において見出され得る。
【0061】
ｉ．可溶性タグ
いくつかの実施形態において、上記抽出溶液は、目的の領域に空間的に対応する可溶性タグをさらに含み得、その結果、下流の多重配列決定または質量分析データが、上記目的の領域に割り当てられ得る。
いくつかの実施形態において、上記抽出溶液は、目的の領域に空間的に対応する可溶性タグをさらに含み得、その結果、下流の多重配列決定または質量分析データが、上記目的の領域に割り当てられ得る。
【0062】
上記目的の領域に由来する核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）の多重配列決定（例えば、ＮＧＳシーケンシング）に関して、適切な可溶性タグは、合成オリゴヌクレオチドを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、位置配列（例えば、上記目的の領域に対応する非ランダム配列）および必要に応じて、下流の配列決定において各個々の逆転写されたｃＤＮＡ分子の計数を可能にする特有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む。上記ＵＭＩ配列は、ランダム配列生成を使用して生成され得る。上記ＵＭＩ配列は、バーコード配列が上記組織サンプルからの核酸、例えば、ＲＮＡの捕捉に干渉せず、困難なしに互いから識別可能であることを確実にするために、全ての共通する参照種のゲノムに、予め設定したＴｍ間隔、ＧＣ含有量および他のバーコード配列までの規定された距離差でマッピングすることによって、ストリンジェントなフィルタリングに続き得る。上記合成オリゴヌクレオチドは、単に５’末端もしくは３’末端標識、または逆転写されたｃＤＮＡの５’末端および３’末端標識の両方のタグ化のために、位置配列および／またはＵＭＩ配列を含み得る。
【0063】
このような合成オリゴヌクレオチドを使用して各目的の領域から単離された核酸（例えば、ＲＮＡ）のタグ化は、種々の方法によって達成され得る。いくつかの実施形態において、上記位置配列／ＵＭＩ配列を含む合成オリゴヌクレオチドは、２本鎖（必要に応じてヘアピンもしくはＹ字型、および／または必要に応じて、例えば、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ２０１６ Ｊａｎ； ２０２（１）： ３７－４４にあるように、３’末端Ｔオーバーハングを含む）であり、Ａテール形成、続いて、ライゲーションによってオリゴｄＴユニバーサルプライマーを使用して、第１回の逆転写酵素合成から生成されるｃＤＮＡのいずれかの末端に結合される。いくつかの実施形態において、上記合成オリゴヌクレオチドは、１本鎖であり、さらに、オリゴｄＴ配列を含み、その結果、上記位置配列／ＵＭＩ配列は、ｃＤＮＡへの第１回の逆転写の間に組み込まれる。他の例示的なプリンター設計およびｃＤＮＡライブラリータグ化のプロトコールは、例えば、Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１６） １７：７７， Ｈａｓｈｉｍｏｎｙ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２０１２ Ｓｅｐ ２７；２（３）：６６６－７３、およびＨｅａｄ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２０１４； ５６（２）： ６１－ｐａｓｓｉｍにおいて見出され得る。
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ２０１６ Ｊａｎ； ２０２（１）： ３７－４４にあるように、３’末端Ｔオーバーハングを含む）であり、Ａテール形成、続いて、ライゲーションによってオリゴｄＴユニバーサルプライマーを使用して、第１回の逆転写酵素合成から生成されるｃＤＮＡのいずれかの末端に結合される。いくつかの実施形態において、上記合成オリゴヌクレオチドは、１本鎖であり、さらに、オリゴｄＴ配列を含み、その結果、上記位置配列／ＵＭＩ配列は、ｃＤＮＡへの第１回の逆転写の間に組み込まれる。他の例示的なプリンター設計およびｃＤＮＡライブラリータグ化のプロトコールは、例えば、Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１６） １７：７７， Ｈａｓｈｉｍｏｎｙ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２０１２ Ｓｅｐ ２７；２（３）：６６６－７３、およびＨｅａｄ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２０１４； ５６（２）： ６１－ｐａｓｓｉｍにおいて見出され得る。
【0064】
上記１またはこれより多くの目的の領域に由来するタンパク質の多重質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）に関し、適切な可溶性タグ配列としては、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なタンデム質量タグ（例えば、Ｄｕｐｌｅｘ ＴＭＴ、Ｓｉｍｐｌｅｘ ＴＭＴ、１０ｐｌｅｘ ＴＭＴ、１１ｐｌｅｘ ＴＭＴ）およびＷＯ２０１６１９６９９４Ａ１に記載されるものが挙げられる。これらは、多数の別個のサンプルに端を発するトリプシンペプチドが、ＭＳ／ＭＳスペクトルで容易に識別されることを可能にする、分子量にわずかな差異がある上記目的の領域からのタンパク質から生成されるトリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）への結合体化に適したアミン反応性タグである（ＴＭＴ構築および検出のさらなる詳細については、ＷＯ２０１６１９６９９４Ａ１およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１７； １５５０：１８５－１９８を参照のこと）。
【0065】
Ｂ． 薬剤移動デバイス
【0066】
いくつかの実施形態において、抽出溶液または他の構成要素を、マスク形成した組織切片上の上記目的の領域へまたはその領域から移すことは、１またはこれより多くの薬剤移動デバイスの使用を要する。上記薬剤移動デバイスは、上記マスク形成した組織切片上の上記目的の領域に空間的に対応する複数の親水性領域を含むアレイ（薬剤移動アレイ要素）を含む。上記疎水性に面した親水性領域は、「表面張力アレイ（ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｎｓｉｏｎ ａｒｒａｙ）」を表し、ここで上記親水性領域に添加される水性溶液は、その面している疎水性領域によって含まれ、上記薬剤移動アレイ要素の最大の溶液容積が、上記親水性領域の面積／直径（上記特徴に添加され得る溶液の「幅（ｗｉｄｔｈ）」を制御する）ならびに上記親水性領域と上記疎水性領域との接触角の間の差異（上記特徴に添加され得る溶液の「高さ（ｈｅｉｇｈｔ）」を制御する）を改変することによって制御され得る。図３は、抽出溶液（黒色）を充填した薬剤移動アレイＢが、Ｂの液体ドームを上記組織切片上に接触させ、表面張力が組織切片上に液体メニスカスを描くことを可能にする（Ｃ）ことによって、スライドＡ上の目的の領域に溶液を移すために使用され得る方法を示す。
【0067】
このような薬剤移動デバイスは、種々の基剤上に種々の異なる疎水性／親水性化学物質を使用して生成され得る。１つの便利なプロセスは、親水性化合物でのガラスの誘導体化、続いて、フルオロカーボンを使用するコーティングとともにポジ型フォトレジストでの親水性特徴の保護を含む。一実施形態において、親水性薬剤移動アレイ特徴を含むアレイは、定量的に清浄なガラススライドを単官能性（シラン化のための１つの結合部位）有機シラン（例えば、３－アミノプロピルジメチルエトキシシラン（ＡＰＤＭＳ）を誘導体化し、続いて、薬剤移動アレイ要素／親水性領域をポジ型フォトレジストで保護し、ペルフルオロアルキルトリクロロシラン（例えば、（トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン）または別の適切な耐摩耗コーティング（例えば、ジメチルジクロロシランＤＤＭＳ、ペルフルオロデシルトリス（ジメチルアミノ）シランＰＦ１０ＴＡＳ、ペルフルオロデカン酸ＰＦＤＡ。または種々の長さおよび異性体のペルフルオロアルキル鎖での改変体）で処理することによって生成される；例えば、Ａｓｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ． ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｌａｔａｂｉｌｉｔｙ． ３（４）：１７３－１７８ （２００３））を参照のこと。親水性および疎水性領域を有するガラススライドの誘導体化のさらなる化学的詳細は、例えば、Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００１， １２３， ８８８７－８８９４およびＵＳ２０１５０２６８２３３ Ａ１に見出され得る。
【0068】
上記薬剤移動デバイス上の親水性領域／薬剤移動アレイ要素の寸法は、上記組織サンプル上でマスク形成された上記目的の領域の寸法に対応する。上記薬剤移動アレイ要素は、種々の形状、例えば、矩形、円形、卵形、三角形、台形、五角形、六角形、またはｎ角形であり得る。上記薬剤移動アレイ要素は、約４９０平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記薬剤移動アレイ要素は、少なくとも約４９０平方ミクロンであり得る。上記薬剤移動アレイ要素は、最大で約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記薬剤移動アレイ要素は、約４９０平方ミクロン～約１２，０００平方ミクロン、約４９０平方ミクロン～約４９，０００平方ミクロン、約４９０平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約４９０平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約４９，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン～約１９０，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロン、または約１９０，０００平方ミクロン～約７８０，０００平方ミクロンであり得る。上記薬剤移動アレイ要素は、約４９０平方ミクロン、約１２，０００平方ミクロン、約４９，０００平方ミクロン、約１９０，０００平方ミクロン、または約７８０，０００平方ミクロンであり得る。円形の薬剤移動アレイ要素は、直径約２５平方ミクロン～直径約１，０００平方ミクロンであり得る。円形の薬剤移動アレイ要素は、直径少なくとも約２５平方ミクロンであり得る。円形の薬剤移動アレイ要素は、最大で直径約１，０００平方ミクロンであり得る。円形の薬剤移動アレイ要素は、直径約２５平方ミクロン～直径約５０平方ミクロン、直径約２５平方ミクロン～直径約１２５平方ミクロン、直径約２５平方ミクロン～直径約２５０平方ミクロン、直径約２５平方ミクロン～直径約５００平方ミクロン、直径約２５平方ミクロン～直径約７５０平方ミクロン、直径約２５平方ミクロン～直径約１，０００平方ミクロン、直径約５０平方ミクロン～直径約１２５平方ミクロン、直径約５０平方ミクロン～直径約２５０平方ミクロン、直径約５０平方ミクロン～直径約５００平方ミクロン、直径約５０平方ミクロン～直径約７５０平方ミクロン、直径約５０平方ミクロン～直径約１，０００平方ミクロン、直径約１２５平方ミクロン～直径約２５０平方ミクロン、直径約１２５平方ミクロン～直径約５００平方ミクロン、直径約１２５平方ミクロン～直径約７５０平方ミクロン、直径約１２５平方ミクロン～直径約１，０００平方ミクロン、直径約２５０平方ミクロン～直径約５００平方ミクロン、直径約２５０平方ミクロン～直径約７５０平方ミクロン、直径約２５０平方ミクロン～直径約１，０００平方ミクロン、直径約５００平方ミクロン～直径約７５０平方ミクロン、直径約５００平方ミクロン～直径約１，０００平方ミクロン、または直径約７５０平方ミクロン～直径約１，０００平方ミクロンであり得る。円形の薬剤移動アレイ要素は、直径約２５平方ミクロン、直径約５０平方ミクロン、直径約１２５平方ミクロン、直径約２５０平方ミクロン、直径約５００平方ミクロン、直径約７５０平方ミクロン、または直径約１，０００平方ミクロンであり得る。
【0069】
いくつかの実施形態において、１種より多くの薬剤移動アレイ要素は、薬剤移動デバイス上に印刷され、その結果、上記薬剤移動アレイ要素はグリッドを形成する。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、約１０個の薬剤移動アレイ要素～約１０，０００個の薬剤移動アレイ要素を含む。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、少なくとも約１０個の薬剤移動アレイ要素を含む。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、最大で約１０，０００個の薬剤移動アレイ要素を含む。いくつかの実施形態において、上記グリッドは、約１０個の薬剤移動アレイ要素～約１００個の薬剤移動アレイ要素、約１０個の薬剤移動アレイ要素～約１，０００個の薬剤移動アレイ要素、約１０個の薬剤移動アレイ要素～約１０，０００個の薬剤移動アレイ要素、約１００個の薬剤移動アレイ要素～約１，０００個の薬剤移動アレイ要素、約１００個の薬剤移動アレイ要素～約１０，０００個の薬剤移動アレイ要素、または約１，０００個の薬剤移動アレイ要素～約１０，０００個の薬剤移動アレイ要素を含む／いくつかの実施形態において、上記グリッドは、約１０個の薬剤移動アレイ要素、約１００個の薬剤移動アレイ要素、約１，０００個の薬剤移動アレイ要素、または約１０，０００個の薬剤移動アレイ要素を含む。
【0070】
上記薬剤移動アレイ要素は、広い範囲の容積を収容するように設計され得る。いくつかの実施形態において、上記薬剤移動アレイ要素の最大容積は、約２ピコリットル～約１０，０００ピコリットルである。いくつかの実施形態において、上記薬剤移動アレイ要素の最大容積は、少なくとも約２ピコリットルである。いくつかの実施形態において、上記薬剤移動アレイ要素の最大容積は、最大で約１０，０００ピコリットルである。いくつかの実施形態において、上記薬剤移動アレイ要素の最大容積は、約２ピコリットル～約１０ピコリットル、約２ピコリットル～約５０ピコリットル、約２ピコリットル～約１００ピコリットル、約２ピコリットル～約２５０ピコリットル、約２ピコリットル～約５００ピコリットル、約２ピコリットル～約１，０００ピコリットル、約２ピコリットル～約１０，０００ピコリットル、約１０ピコリットル～約５０ピコリットル、約１０ピコリットル～約１００ピコリットル、約１０ピコリットル～約２５０ピコリットル、約１０ピコリットル～約５００ピコリットル、約１０ピコリットル～約１，０００ピコリットル、約１０ピコリットル～約１０，０００ピコリットル、約５０ピコリットル～約１００ピコリットル、約５０ピコリットル～約２５０ピコリットル、約５０ピコリットル～約５００ピコリットル、約５０ピコリットル～約１，０００ピコリットル、約５０ピコリットル～約１０，０００ピコリットル、約１００ピコリットル～約２５０ピコリットル、約１００ピコリットル～約５００ピコリットル、約１００ピコリットル～約１，０００ピコリットル、約１００ピコリットル～約１０，０００ピコリットル、約２５０ピコリットル～約５００ピコリットル、約２５０ピコリットル～約１，０００ピコリットル、約２５０ピコリットル～約１０，０００ピコリットル、約５００ピコリットル～約１，０００ピコリットル、約５００ピコリットル～約１０，０００ピコリットル、または約１，０００ピコリットル～約１０，０００ピコリットルである。いくつかの実施形態において、上記薬剤移動アレイ要素の最大容積は、約２ピコリットル、約１０ピコリットル、約５０ピコリットル、約１００ピコリットル、約２５０ピコリットル、約５００ピコリットル、約１，０００ピコリットル、または約１０，０００ピコリットルである。
【0071】
Ｃ．検出技術
【0072】
次いで、上記少なくとも１つの目的の領域から抽出された生体分子は、上記目的の領域内の細胞の生体分子発現プロフィール、または上記目的の領域内の細胞のゲノムＤＮＡ組成（例えば、がん性細胞を含む組織サンプルの場合、上記組織切片内の細胞のゲノムＤＮＡは、変異、欠失、および／または転座に起因して不均質であり得る）を分析するために検出され得る。従って、本明細書に含まれる方法、デバイス、および組成物は、上記目的の領域内の細胞の遺伝的特徴およびエピジェネティック特徴の両方を分析するために使用され得る。
【0073】
いくつかの方法では、上記少なくとも１つの目的の領域内の生体分子（例えば、ｍＲＮＡ、または逆転写によってｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡ）の発現レベルは、配列決定によって決定され得る。配列決定法としては、以下が挙げられ得る：次世代シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、ピロシーケンシング、古典的なサンガー配列決定法、ライゲーションごとのシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）、合成ごとのシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ハイブリダイゼーションごとのシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタルＰＣＲ、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代シーケンシング、合成ごとの単一分子シーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、大規模並列シーケンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ－ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、クローン性単一分子アレイ（ｃｌｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙ）（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシーケンシング、マキサム－ギルバートシーケンシング、およびプライマーウォーキング。
【0074】
いくつかの方法では、上記少なくとも１つの目的の領域内の生体分子（例えば、ｍＲＮＡ、または逆転写によってｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ）の発現レベルは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはＴａｑｍａｎとしても公知の、いわゆる「リアルタイム増幅（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」法によって決定される（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号（Ｇｅｌｆａｎｄ）、同第５，５３８，８４８号（Ｌｉｖａｋ， ｅｔ ａｌ．，）および同第５，８６３，７３６号（Ｈａａｌａｎｄ）、ならびにＨｅｉｄ， Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：９８６－９９４ （１９９６）； Ｇｉｂｓｏｎ， Ｕ．Ｅ．Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５－１００１ （１９９６）； Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６－７２８０， （１９９１）；およびＬｉｖａｋ， Ｋ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７－３６２ （１９９５）を参照のこと）。増幅生成物の形成をモニターするこの方法の基本は、二重標識蛍光性オリゴヌクレオチドプローブを使用してＰＣＲ生成物蓄積を連続的に測定することである。このようなアッセイにおいて使用されるプローブは、代表的には、２種の異なる蛍光色素で標識された短い（約２０～２５塩基）ポリヌクレオチドである。上記プローブの５’末端は、代表的には、レポーター色素に結合され、３’末端は、クエンチング色素に結合される。上記プローブは、標的ｍＲＮＡまたはこれに由来する核酸上の部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計される。その遺伝子座の隣接領域に結合する上流および下流のＰＣＲプライマーはまた、反応混合物に添加される。上記プローブが無傷である場合、その２種の発蛍光団の間のエネルギー転移が起こり、上記クエンチャーは、上記レポーターからの発光をクエンチする。ＰＣＲの伸長相の間に、上記プローブは、核酸ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによって、ポリヌクレオチド－クエンチャーからレポーターを放出し、適切な検出器によって測定され得るレポーター発光強度の増大を生じる。次いで、その記録された値は、連続ベースに対して正規化したレポーター発光強度における増大を計算するために使用され得、最終的に、増幅されているｍＲＮＡの量を定量し得る。
【0075】
いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲまたはＴａｑｍａｎ検出に関しては、ＲＴ－ＰＣＲステップは、細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを生成するために最初に行われる。ＲＴ－ＰＣＲによるこのような増幅は、包括的（例えば部分的に／完全に縮重のオリゴヌクレオチドプライマーでの増幅）または標的化（例えば、後のステップで分析されることになる特異的遺伝子に対して指向されるオリゴヌクレオチドプライマーでの増幅）のいずれかであり得る。
【0076】
いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲまたはＴａｑｍａｎは、単離された細胞ｍＲＮＡに対して行われる逆転写酵素反応の直後に使用される；この多様性は、ｑＰＣＲの間の個々のｍＲＮＡのレベルを定量するように働く。
【0077】
ｑＰＣＲまたはＴａｑｍａｎに関して、特定の遺伝子のレベルは、同じサンプルから同じ検出方法論を使用して測定される１またはこれより多くの内部コントロール遺伝子と比較して表され得る。内部コントロール遺伝子としては、いわゆる「ハウスキーピング（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）」遺伝子（例えば、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＵＢＣ、ＧＡＰＤおよびＨＰＲＴ１）が挙げられ得る。
【0078】
いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲもしくはＴａｑｍａｎ検出またはＲＮＡ配列決定に関して、「前増幅（ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」工程は、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡに対して最初に行われる。これは、検出されることになるＲＮＡ／ｃＤＮＡの天然のレベルが非常に低い条件においてシグナルを増大するように働く。前増幅に適切な方法としては、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーでのＰＣＲ（例えば、ランダムヘキサマーＰＣＲ）、ポリＡ特異的プライマーでのＰＣＲ、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。上記前増幅は、包括的であり得るかまたは上記の逆転写反応と同じ方法で標的化され得るかのいずれかである。
【0079】
ｍＲＮＡレベルはまた、プローブへのハイブリダイゼーションによる増幅なしで、例えば、分枝状核酸プローブ（例えば、ＰａｎｏｍｉｃｓのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定され得る。
【0080】
代わりにまたはさらに、上記少なくとも１つの目的の領域からの遺伝子の発現レベルは、タンパク質レベルで決定され得、これは、上記で考察される遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルが測定されることを意味する。いくつかの方法およびデバイスは、例えば、米国特許第６，１４３，５７６号；同第６，１１３，８５５号；同第６，０１９，９４４号；同第５，９８５，５７９号；同第５，９４７，１２４号；同第５，９３９，２７２号；同第５，９２２，６１５号；同第５，８８５，５２７号；同第５，８５１，７７６号；同第５，８２４，７９９号；同第５，６７９，５２６号；同第５，５２５，５２４号；および同第５，４８０，７９２号に記載されるイムノアッセイを含め、タンパク質のレベルを決定するために周知である。これらのアッセイとしては、目的のタンパク質分析物の存在または量に関するシグナルを生成するために、種々のサンドイッチ、競合、または非競合的アッセイフォーマットを含む。任意の適切なイムノアッセイが利用され得る（例えば、ラテラルフロー、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイなど）。抗体アレイに関する多くのフォーマットが記載され、抗体の使用を提唱されてきた。このようなアレイは、代表的には、検出されることが意図される異なるタンパク質に対して特異性を有する異なる抗体を含む。例えば、通常は、少なくとも１００種の異なる抗体は、１００種の異なるタンパク質標的を検出するために使用され、各抗体は、１つの標的に対して特異的である。特定のタンパク質標的に対して特異性を有する他のリガンドがまた、使用され得る（例えば、ＷＯ／２００８／０４８９７０で開示される合成抗体）。所望の結合特異性を有する他の化合物は、ペプチドまたは低分子のランダムライブラリーから選択され得る。米国特許第５，９２２，６１５号は、アレイにおいて多数の標的抗原を検出するために、膜上に固定化した抗体の多数の別個のゾーンを利用するデバイスを記載する。米国特許第５，４５８，８５２号、同第６，０１９，９４４号、同第６，１４３，５７６号。マイクロタイタープレートまたは自動化は、多数の異なるタンパク質の検出を容易にするために使用され得る。タンパク質レベルはまた、質量分析（例えば、タンデムＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって決定され得る。いくつかの実施形態において、目的の領域から単離されたゲノムＤＮＡが分析される（例えば、上述の配列決定技術のうちのいずれかによって、またはｑＰＣＲによって）。このような分析は、遺伝子中または遺伝子の周りのヌクレオチド配列におけるバリエーション、ＳＮＰｓ、挿入、欠失、および／またはコピー数バリエーションの存在が挙げられるが、これらに限定されないゲノムバリエーションを検出するように働き得る。この実施形態のいくつかのバリエーションにおいて、単離されたＤＮＡは、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）技術によって最初に増幅して、制限されたサンプルからＤＮＡ配列を決定する能力が改善される。
【0081】
いくつかの実施形態において、ＷＧＡ技術は、縮重オリゴヌクレオチドプライム（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｐｒｉｍｅｄ）（ＤＯＰ）ＰＣＲとして公知の２段階技術である。第１段階において、ＤＯＰ－ＰＣＲは、ａ）３’末端にランダムな６ヌクレオチド配列、およびｂ）ＰＣＲ増幅に最適なＴｍを有する固定したアダプター配列（必要に応じて、サンプルインデックスおよび／または特有の分子識別子を含むバーコードを含む）を含むプライマーを使用する；ランダムプライマーは、低いアニーリング温度でサンプルへとハイブリダイズし、続いて、高温でポリメラーゼを使用して鎖伸長される。第２の段階において、上記第１段階のプライマーの５’固定化アダプター配列（および必要に応じて、それらの５’末端にサンプルインデックスおよび／または特有の分子識別子を含むバーコードを含む）に相補的な３’末端を含むプライマーは、上記第１段階より高温でのＰＣＲアニーリングを使用して、上記第１段階からの生成物を増幅するために使用される。
【0082】
いくつかの実施形態において、上記ＷＧＡ技術は、マルチ置換増幅（ＭＤＡ）として公知の１段階の等温性の技法である。ＭＤＡは、ＤＯＰ－ＰＣＲの第１段階に類似のプライマー、例えば、ａ）それらの３’末端にランダムな６ヌクレオチド配列、およびｂ）固定されたアダプター配列（必要に応じて、サンプルインデックスおよび／または特有の分子識別子をふくむバーコードを含む）を含むプライマーを使用し得る。しかし、従来のＰＣＲ ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑの代わりに、ＭＤＡは、鎖置換ポリメラーゼ、例えば、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用する。上記単離されたＤＮＡは、上記プライマーおよびφ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、等温条件下でのサイクリングなしで増幅される。
【0083】
いくつかの実施形態において、上記ＷＧＡ技術は、マルチアニーリングおよびループ形成ベースの増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）として公知の準線形増幅技術である。第１段階において、ＭＡＬＢＡＣは、５’末端に共通する２７ヌクレオチド配列（例えば、ＧＴＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＴＧＡ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＴＧ ＧＡＧ）を、および３’末端に８ランダムヌクレオチドを有する特別に設計されたプライマーを使用する；セミアンプリコンは、低温（例えば、１５～２０℃）での第１のアニーリング、続いて、より高温（例えば、７０～７５℃）での鎖置換ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）を使用する伸長によってこれらのプライマーを使用して生成される。上記テンプレートからプライマーを融解した後（例えば、９５℃またはこれより高い）、低温（例えば、１５～２０℃）、高温（例えば、７０～７５℃）、変性温度（例えば、９５℃またはこれより高い）およびヘアピン形成（例えば、５８℃）の反復サイクル（例えば、１０＋サイクル）は、セミアンプリコンを全アンプリコンへとさらに増幅するために使用される。全アンプリコンは、同一の５’ ２７ヌクレオチド配列（例えば、ＧＴＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＴＧＡ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＴＧ ＧＡＧ）を含むことから、それらが一旦作成されれば、上記ヘアピン形成工程は、それらを増幅の後のサイクルにさらに関与させることから除去する。このことは、元のＤＮＡからのコピーのコピーのコピーが作製されないことから、より線形の増幅を確実にし得る。
【0084】
いくつかの実施形態において、ＷＧＡ技術は、Ｐｉｃｏ－ＰｌｅｘＴＭ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）の派生である、および／または米国特許第８，２０６，９１３号に記載される。これらの技術および派生は、全ゲノムの完全ランダムプライマー増幅と関連する問題のうちのいくつか（例えば、ある特定の領域の提示不足）を補正しようと試みる。いくつかの実施形態において、自己不活性（例えば、非自己プライミング）縮重プライマーは、等温増幅工程または約１５～２０℃での最初のアニーリング工程、続いて、約７５℃での伸長工程（例えば、中温性ＤＮＡポリメラーゼでの）であり得る、この方法の第１の工程において使用される。いくつかの実施形態において、これらのプライマーは、ａ）５’固定された領域、ｂ）３’可変領域を含み、プライマーが交差ハイブリダイズも自己ハイブリダイズもしないように設計される。いくつかの実施形態において、上記可変領域は、部分的に縮重した配列（例えば、全てＹ、Ｒ、Ｋ、またはＭであり得る１０ｎｔ長（ここでＹ＝ランダムＣまたはＴ；Ｒ＝ランダムＡまたはＧ；Ｍ＝ランダムＡまたはＣ；Ｋ＝ランダムＧまたはＴ））および完全に縮重した配列（例えば、２ｎｔ長、Ｎｓ、ランダムＡ／Ｃ／Ｔ／Ｇ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記自己不活性縮重プライマーの定常領域および可変領域は、アデニンおよびグアニン；アデニンおよびシトシン；グアニンおよびチミジンからなる群より選択される非相補的ヌクレオチドの２タイプのみから本質的になる。いくつかの実施形態において、等温増幅工程において使用される上記自己不活性縮重プライマーは、以下の表１中の配列番号１～８のうちのいずれかに従う。
いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼでのさらなる増幅ステップは、上記で増幅されたＤＮＡに対して行われる。上記さらなる増幅ステップは、等温増幅ステップにおいて使用されるプライマーに由来する直ぐ５’側の固定された領域からなるプライマーを使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、これらのプライマーは、表１中の配列番号８～１２のうちのいずれかである。上記さらなる増幅ステップは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する通常のＰＣＲサイクリングの＞１０サイクル（例えば、変性、アニーリング、伸長）を含み得る。いくつかの実施形態において、サイクリング条件は、上記のＭＡＬＢＡＣの方法に類似のヘアピンＤＮＡの形成を促進するために、上記伸長ステップの後にさらなる低温ステップを組み込む。
【表1】
いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼでのさらなる増幅ステップは、上記で増幅されたＤＮＡに対して行われる。上記さらなる増幅ステップは、等温増幅ステップにおいて使用されるプライマーに由来する直ぐ５’側の固定された領域からなるプライマーを使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、これらのプライマーは、表１中の配列番号８～１２のうちのいずれかである。上記さらなる増幅ステップは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する通常のＰＣＲサイクリングの＞１０サイクル（例えば、変性、アニーリング、伸長）を含み得る。いくつかの実施形態において、サイクリング条件は、上記のＭＡＬＢＡＣの方法に類似のヘアピンＤＮＡの形成を促進するために、上記伸長ステップの後にさらなる低温ステップを組み込む。
【実施例0085】
実施例１Ａ． － 組織切片に対する疎水性マスクの付与のためのプロトコール
コンピューター支援インクジェットシステムは、複数の規則的に間隔が空けられたコーティングされていない領域が作られるように、組織サンプルにコーティングのグリッドパターンを付与するために使用される。上記コーティングは、アルコールまたはケトン溶媒＋光開始剤中で、本明細書で記載されるように、フルオロアルキルアクリレートモノマーと混合された非フッ化アクリレートまたはシアノアクリレートを含む。次いで、上記切片をＵＶ光に短時間曝露して、上記コーティングを硬化させる。
コンピューター支援インクジェットシステムは、複数の規則的に間隔が空けられたコーティングされていない領域が作られるように、組織サンプルにコーティングのグリッドパターンを付与するために使用される。上記コーティングは、アルコールまたはケトン溶媒＋光開始剤中で、本明細書で記載されるように、フルオロアルキルアクリレートモノマーと混合された非フッ化アクリレートまたはシアノアクリレートを含む。次いで、上記切片をＵＶ光に短時間曝露して、上記コーティングを硬化させる。
【0086】
実施例１Ｂ． - 組織切片に対する疎水性マスクの付与のための代替のプロトコール
コンピューター支援インクジェットシステムは、複数の規則的に間隔が空けられたコーティングされていない領域が作られるように、組織サンプルに第１のコーティングのグリッドパターンを付与するために使用される。上記第１のコーティングは、非フッ化アクリレートまたはシアノアクリレート＋光開始剤を含む。上記第１のコーティングを、ＵＶ光に短時間曝露して、硬化させる。次に、同様にコンピューター支援インクジェットシステムを使用して、本明細書で記載されるとおりのフルオロアルキルアクリレートモノマー＋光開始剤を含む第２のコーティングを、上記第１のコーティングを覆って添加する。次いで、上記第２のコーティングを、ＵＶ光への短時間の曝露によって硬化させる。
コンピューター支援インクジェットシステムは、複数の規則的に間隔が空けられたコーティングされていない領域が作られるように、組織サンプルに第１のコーティングのグリッドパターンを付与するために使用される。上記第１のコーティングは、非フッ化アクリレートまたはシアノアクリレート＋光開始剤を含む。上記第１のコーティングを、ＵＶ光に短時間曝露して、硬化させる。次に、同様にコンピューター支援インクジェットシステムを使用して、本明細書で記載されるとおりのフルオロアルキルアクリレートモノマー＋光開始剤を含む第２のコーティングを、上記第１のコーティングを覆って添加する。次いで、上記第２のコーティングを、ＵＶ光への短時間の曝露によって硬化させる。
【0087】
実施例２． － 疎水性化学物質を使用する、組織サンプル中の目的の領域の隔離
ＦＦＰＥ肝細胞癌組織切片を、脱パラフィン化ありまたはなし、およびフルオロアルキルアクリレートモノマーを使用する目的の領域の疎水性マスク形成ありまたはなしのヘマトキシリン／エオシン染色に供した。得られたスライドの写真を、図１に示す。ＦＦＰＥ組織切片の脱パラフィン化、続いて、実施例１の疎水性化学物質での処理は、マスク形成した目的の領域の効果的な水性隔離を引き起こし、ヘマトキシリン／エオシンでの染色を防止した。
ＦＦＰＥ肝細胞癌組織切片を、脱パラフィン化ありまたはなし、およびフルオロアルキルアクリレートモノマーを使用する目的の領域の疎水性マスク形成ありまたはなしのヘマトキシリン／エオシン染色に供した。得られたスライドの写真を、図１に示す。ＦＦＰＥ組織切片の脱パラフィン化、続いて、実施例１の疎水性化学物質での処理は、マスク形成した目的の領域の効果的な水性隔離を引き起こし、ヘマトキシリン／エオシンでの染色を防止した。
【0088】
実施例３．－ ＦＦＰＥマウス肝臓切片中の種々のサイズの領域の隔離
【0089】
ＦＦＰＥマウス肝臓切片を脱パラフィン化し、マスク形成して、種々のサイズ（直径が１００ミクロン、２５０ミクロン、５００ミクロン、１０００ミクロン）および形状（矩形および円形）の領域を隔離し、ヘマトキシリン／エオシンで染色して、上記目的の領域の親水性の接近しやすさ（および周りの疎水性マスクの接近しにくさ）、ならびに上記マスクのインクジェット付与の精度／正確さを示した。図２Ａは、直径約１６０ミクロンまたは約５５０ミクロンの領域が、上記化学的マスクのインクジェット印刷を使用して明らかに規定され得ることを示す。図２Ｂは、直径約３００または約１０００ミクロンの領域が、上記化学的マスクのインクジェット印刷を使用して明らかに規定され得ることを示す。図２Ｃは、円形および多角形両方の形状が、切片から隔離され得ることを示す。図２Ｅは、直径２ｍｍの領域が、切片上で明らかに規定され得ることを示す。図２Ｄは、種々の直径（１００ｍｍ、２５０ｍｍ、５００ｍｍ、１ｍｍ）および形状（矩形および円形）の領域が、１個の組織切片上で明らかに規定されたグリッドで印刷され得ることを示す。
【0090】
実施例４． － 疎水性マスク形成は、マスク形成した領域からの核酸の抽出を遮断する
【0091】
ＦＦＰＥ組織切片を、実施例１Ａまたは実施例１Ｂの方法に従ってマスク形成して、種々のサイズを有する目的の領域を生成した。
【0092】
５５～６０℃のオーブン中で１時間焼成し、キシレン中に３分間、２回浸漬し、１００％ エタノール中に３分間、２回浸漬することによって、スライドを脱パラフィン化した。スライドを、必要に応じて、最大１ヶ月間、エタノール中で貯蔵した。
【0093】
さらなる分析のために、スライドを風乾して、エタノールを除去し、上記組織を溶解した。接着性チャンバーを、上記組織領域の境界線を描くスライドに付着させ、６００マイクロリットルのプロテイナーゼＫ含有Ｑｉａｇｅｎ組織溶解緩衝液ＡＴＬを添加し、上記チャンバーを接着フィルムでシールし、スライドを、５６℃のヒートブロック上で１時間インキュベートした。液体（約４５０マイクロリットル）を、微量遠心チューブ中のスライドチャンバーから集め、次いで、上記微量遠心チューブを、９０℃で１時間加熱した。次いで、上記微量遠心チューブを遠心分離して、不溶性物質をペレット化し、上清を新たなチューブへと取り出し、４５マイクロリットルのＲＮＡｓｅ Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）で処理し、続いて、室温で２分間インキュベートした。等容積のＱｉａｇｅｎ 緩衝液ＡＬ（約５００マイクロリットル）を上記上清に添加し、上記サンプルをボルテックスすることによって混合した。ボルテックス後、等量の１００％ エタノール（約５００マイクロリットル）を上記上清に添加し、溶液全体をＱｉａｇｅｎ ｍｉｎ－ｅｌｕｔｅカラムに移した。上記カラムを、製造業者の説明書に従って、緩衝液ＡＷ１およびＡＷ２を使用して洗浄し、核酸を、Ｑｉａｇｅｎ緩衝液ＡＴＥ中で溶離した。次いで、各サンプルに由来する核酸を、Ｑｕｂｉｔ分光光度計で定量した。目的の領域のサイズと抽出されたＤＮＡとの間の関係性を、表２に示す。ＤＮＡ収量 対 コーティングされていない表面積に関するデータは、ＤＮＡ収量が覆われている面積に比例することを示し、これは、ＤＮＡが、疎水性コーティングによって覆われている組織切片の領域から抽出されないことを示唆する。
【表2】
【0094】
実施例５． － 最適化された疎水性コーティング手順：
【0095】
Ａ）小さな特徴（＜１ｍｍ直径）のための手順
【0096】
組織サンプルがＦＦＰＥサンプルである場合、上記組織サンプルを最初に、標準的手順（例えば、およそ６０度のオーブン中で１時間焼成、続いて、キシレン中で３分間、キシレン中で３分間、１００％ ＥｔＯＨ中で３分間、１００％ ＥｔＯＨ中で３分間のインキュベーション、および５分間風乾）によって脱パラフィン化に供する。上記組織表面を、フルオロアクリレートを含むアルコール溶液中に、ミクロンサイズのフルオロ粒状物（ｆｌｕｏｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）とともにスプレーまたは浸漬することによって、最初の疎水性コーティングでコーティングする；例としては、Ｆｌｕｏｒｏ－ｐｅｌ ８００または８００Ｍが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、上記スライドを風乾する（この最初の処理は、以下のシアノアクリレート印刷工程によって小さな特徴の規定を改善する）。
【0097】
光開始剤を含むシアノアクリレートの溶液を、上記組織サンプルにインクジェット印刷して、排除することが望ましい領域または望ましい特徴を分離する領域を覆ってマスクを形成した。印刷の間に、上記シアノアクリレートを、堆積後に、最小限の秒数にわたるＵＶ光（例えば、３９５ｎｍ＠約４００ｍＪ／ｃｍ２）への曝露を介して、留め置く（ｐｉｎ）。次いで、上記スライドを印刷装置から取り出し、直ぐに、長時間のＵＶ硬化（例えば、約４００ｍＪ／ｃｍ２での３９５ｎｍ、約５分間）に供する。
【0098】
ＵＶ硬化の後、スライド全体を、ペルフルオロアルキルトリクロロシラン（例えば、ＦＯＴＳ、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シラン））の真空支援気相蒸着に供する。この技術の付与は、２５ミクロン程度の小さな直径で、ＦＦＰＥヒト肝臓組織切片上での円形の目的の領域の生成を可能にした。
【0099】
Ｂ）大きな特徴（およそ約１ｍｍまたはこれより大きい）のための手順
【0100】
組織サンプルがＦＦＰＥサンプルである場合、上記組織サンプルを最初に、標準的手順（例えば、およそ６０度のオーブン中で１時間焼成、続いて、キシレン中で３分間、キシレン中で３分間、１００％ ＥｔＯＨ中で３分間、１００％ ＥｔＯＨ中で３分間のインキュベーション、および５分間風乾）によって脱パラフィン化に供する。より大きな特徴は、最初のフルオロアルキルコーティングの先に進み得る。光開始剤を含むシアノアクリレートの溶液を、排除することが望ましい領域または望ましい特徴を分離する領域において、上記組織サンプルにインクジェット印刷する。印刷する間に、上記シアノアクリレートを、沈着後に、最小限の秒数にわたるＵＶ光（例えば、３９５ｎｍ＠約４００ｍＪ／ｃｍ２）への曝露を介して留め置く。次いで、上記スライドを印刷装置から取り出し、直ぐに、長時間のＵＶ硬化（例えば、約４００ｍＪ／ｃｍ２での３９５ｎｍ、約５分間）に供する。
【0101】
ＵＶ硬化の後、スライド全体を、ペルフルオロアルキルシラン（例えば、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シラン）の真空支援気相蒸着に供する。
【0102】
実施例６． － 疎水的に分離した領域の溶解および単離
【0103】
表面張力アレイを、ＵＳ２０１５０２６８２３３ Ａ１またはＢｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００１， １２３， ８８８７－８８９４にあるように、親水性特徴が上記組織サンプルに付与されたマスクの排除されない領域に対応する状態で調製する。この派生手順は、定量的に清浄なガラススライドを単官能性（シラン化のための１個の結合部位）有機シラン（例えば、３－アミノプロピルジメチルエトキシシラン（ＡＰＤＭＳ））でコーティングし、続いて、上記排除されない領域／親水性領域をポジ型フォトレジストで保護し、ペルフルオロアルキルシラン（例えば、トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシランのような耐摩耗コーティングで処理することを含む。
【0104】
界面活性剤を含む適切な溶解緩衝液を、表面張力アレイの親水性特徴に付与する。上記溶解緩衝液を有する親水性領域を含む表面張力アレイを、実施例１Ａ、１Ｂ、または５にあるように調製した組織サンプルと接触させる。その接触は、適切な期間にわたって、細胞溶解を可能にするために与えられる。上記表面張力アレイ（これは、ここで溶解した細胞構成要素を含む溶解緩衝液を含む）は、上記組織切片との接触から取り出され、上記表面張力アレイ上の個々のスポットは、所望の特性（例えば、タンパク質または核酸の存在量、配列、または両方）のために問い合わせされる。
【0105】
実施例７． － コーティングされた表面での接触角測定
【0106】
ＦＦＰＥ組織切片またはガラススライドを、実施例５Ｂに示されるコーティング手順の異なる段階に供し、ＦＯＴＳ（（トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン）での種々の長さの気相コーティングに供した。接触角測定を、Ｔｅｌｅｓｃｏｐｅ－Ｇｏｎｉｏｍｅｔｅｒ（例えば、Ｂｒａｃｃｏ ａｎｄ Ｈｏｌｓｔ． Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２０１３． ＩＳＢＮ ９７８－３－６４２－３４２４３－１． ｐｐ．３－３４を参照のこと）による直接測定を使用して行った。そのデータは、上記組織切片の一番上にシアノアクリレートを添加すると、ＦＯＴＳによるコーティングが増強され、その２つの組み合わせが、その合わせたＦＯＴＳ／シアノアクリレート組織表面の接触角を非常に疎水性（１１０より大きい接触角）範囲へと増大させることを示す。
【表3】
【0107】
実施例８． － 疎水性マスク形成したＦＦＰＥ組織切片から単離されたＲＮＡのｑＰＣＲ
【0108】
同じＦＦＰＥ乳がん組織サンプル（Ｂｉｏｍａｘ， ｈｕＣＡＴ２９９）からの種々の連続切片を、実施例５の最適化したコーティング手順に供して、非がん性組織、移行組織（例えば、ある程度非がん性かつある程度がん性の組織）、およびがん性の組織を含む種々の異なる目的の領域を選択した（図７および８を参照のこと。ここで図８の左側は、種々の組織層／切片に付与された異なるマスクパターンを示し、右側は、マスク形成後に隔離された種々の組織目的の領域を示す）。コーティング後に、上記目的の領域を、界面活性剤含有溶解緩衝液＋プロテイナーゼＫを上記スライドに付与することによって溶解した（溶解緩衝液は、コントロールとしてのコーティングされた領域にも付与した）。全ＲＮＡを、上記溶解緩衝液を、上記領域に直接配置し、５６℃において１時間インキュベートすることによって、図８に示されるサンプルから抽出した。全ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｔｏｔａｌＲＮＡ ＦＦＰＥ ＸＳキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用して製造業者のプロトコールに従って精製し、上記サンプルからのＲＮＡ量を、Ｑｕｂｉｔ蛍光アッセイによって定量した。ｑＰＣＲアッセイのパネルを、上記サンプルから抽出されたＲＮＡに対して行って、乳がんにおいて富化されていることが公知の遺伝子を検出した（上記組織から個々の公知の腫瘍で富化される遺伝子のｑＰＣＲ Ｃｔ値を示す図９を参照のこと）。その分析は、腫瘍サンプルにおいて、予測されるように、ｑＰＣＲによって検出される遺伝子のレベルが、健康な組織よりがん性の組織に特徴的であったことを示し、これは、上記マスクが、選択的溶解のための組織領域を隔離するために有効であること、および上記疎水性コーティング手順が、規定された目的の領域から遊離した核酸の下流の増幅に干渉しないことを示す。
【0109】
上記のマスク形成手順によって隔離されたＲＮＡサンプルを、同じサンプルに対して行った従来の手動の空間的隔離技術（図９パネルＢにおいて「チューブ」と表記）とも比較した。ｑＰＣＲ Ｃｔ計数を、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して計算し、そのデータをグラフ化した（図９）。両方の方法を介する遺伝子の発現レベルは、高度に相関することが見出され、これは、上記疎水性マスク形成手順が、上記手動の隔離ワークフローに等しいことを示す。
【0110】
さらに、例示的なマスク形成した組織領域に関して、マスク形成したまたはマスクされていない領域に付与される溶解緩衝液によって遊離した核酸の量を比較した（図９パネルＣ）。その分析は、劇的に少ない核酸が、覆われた領域から単離されたことを示す。これは、上記疎水性マスクが、上記手順において溶解から望ましくない組織を排除するために有効であることを示す。
【0111】
さらに、乳がんにおいて選択的に発現される遺伝子を検出するように設計された一連の１７７のｑＰＣＲアッセイを、上記マスク形成した腫瘍サンプルから単離したＲＮＡに対して行った。１７７の特有の発現されたｑＰＣＲ生成物を、上記マスク形成手順によってがん性サンプルから遊離したＲＮＡ内で検出した。これは、発現されたゲノムの広い部分が、上記マスク形成手順によって隔離したがん性細胞から単離されたことを示す。
【0112】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示されかつ記載されてきたが、このような実施形態が例示によって提供されるに過ぎないことは、当業者に明らかである。多くのバリエーション、変更、および置換は、いまや、本発明から逸脱することなく当業者に想起される。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する種々の選択肢が本発明を実施するにあたって使用され得ることは、理解されるべきである。以下の請求項は、本発明の範囲を規定し、これら請求項およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造は、それによって網羅されることが意図される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【配列表】
【外国語明細書】