特開 2023-37252 微生物の質量分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023037252

(43)【公開日】2023-03-15

(54)【発明の名称】微生物の質量分析方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20230308BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20230308BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/04

G01N27/62 V

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021143889

(22)【出願日】2021-09-03

(71)【出願人】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】110001069

【氏名又は名称】弁理士法人京都国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】児嶋 浩一

【テーマコード（参考）】

2G041

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA04

2G041DA05

2G041EA03

2G041FA10

2G041FA12

2G041JA20

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ05

4B063QR41

4B063QS39

4B063QX10

(57)【要約】

【課題】微生物の質量分析において、マススペクトル上に含まれるピークの中から、特定の分子に由来するピークを見つけやすくする。
【解決手段】被検微生物を、第１の液体に懸濁することによって第１懸濁液を調製し（１１）、前記第１懸濁液に対して第１の遠心分離処理を行うことによって、前記第１懸濁液を第１の沈殿物と第１の上清に分離し（１２）、前記第１の沈殿物を、前記第１の液体よりもｐＨの低い第２の液体に懸濁することによって第２懸濁液を調製し（１４）、前記第２懸濁液に対して第２の遠心分離処理を行うことによって、前記第２懸濁液を第２の沈殿物と第２の上清に分離し（１５）、前記第２の上清について質量分析を行う（１６、２０）。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検微生物を、第１の液体に懸濁することによって第１懸濁液を調製し、
前記第１懸濁液に対して第１の遠心分離処理を行うことによって、前記第１懸濁液を第１の沈殿物と第１の上清に分離し、
前記第１の沈殿物を、前記第１の液体よりもｐＨの低い第２の液体に懸濁することによって第２懸濁液を調製し、
前記第２懸濁液に対して第２の遠心分離処理を行うことによって、前記第２懸濁液を第２の沈殿物と第２の上清に分離し、
前記第２の上清について質量分析を行う、
微生物の質量分析方法。

【請求項2】

更に、前記第１の上清について質量分析を行う、
請求項１に記載の微生物の質量分析方法。

【請求項3】

更に、
前記第２の沈殿物を、前記第２の液体よりも脂溶性の高い第３の液体に懸濁することによって第３懸濁液を調製し、
前記第３懸濁液に対して第３の遠心分離処理を行うことによって、前記第３懸濁液を第３の沈殿物と第３の上清に分離し、
前記第３の上清について質量分析を行う、
請求項１又は２に記載の微生物の質量分析方法。

【請求項4】

前記第２の液体が、酸を含む液体である請求項１～３のいずれかに記載の微生物の質量分析方法。

【請求項5】

前記酸が、ギ酸、酢酸、又はトリフルオロ酢酸である請求項４に記載の微生物の質量分析方法。

【請求項6】

前記第３の液体が、有機溶媒を含む液体である請求項３～５のいずれかに記載の微生物の質量分析方法。

【請求項7】

前記第１の液体が、有機溶媒を含む液体である請求項１～６のいずれかに記載の微生物の質量分析方法。

【請求項8】

前記有機溶媒が、エタノール、メタノール、又はアセトニトリルである請求項６又は７に記載の微生物の質量分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物の質量分析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix-assisted laser desorption/ionization：ＭＡＬＤＩ）による試料のイオン化を行う質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）を用いた微生物同定技術（例えば、非特許文献１を参照）が、臨床医学及び品質管理等の分野で急速に広がっている。この方法は、微生物試料を用いて得られるマススペクトルに基づいて微生物の同定を行う手法であり、ごく微量の試料で分析が可能である、短時間で分析結果を得ることができる、多検体の連続分析が可能である、といった利点がある。

【0003】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳによる微生物同定の一手法として、バイオマーカーピークを用いる方法がある。この方法では、分類上異なるグループに属する微生物（例えば、同一の種であるが株が異なる微生物）の間で、マススペクトル上での位置や高さが異なるピークがバイオマーカーピークとされ、被検微生物のマススペクトルを既知微生物のマススペクトルにおけるバイオマーカーピークと照合することによって、被検微生物の同定を行う。このような手法では、バイオマーカーピークとしてタンパク質のピークが用いられることが多い。例えば、非特許文献２では、特定の７種類のタンパク質のピークをバイオーカーピークとし、大腸菌をＭＡＬＤＩ－ＭＳで分析して得られたマススペクトルに基づいて病原性の大腸菌と非病原性のものを区別する試みが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】株式会社島津製作所分析計測事業部，「ＡＸＩＭＡ 微生物同定システム 操作ガイド」，株式会社島津製作所，平成２３年１２月

【非特許文献2】"Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics.", Fagerquist CK, Garbus BR, Miller WG, Williams KE, Yee E, Bates AH, Boyle S, Harden LA, Cooley MB, Mandrell RE., Anal Chem. 2010 Apr 1;82(7):2717-25.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、一般的に、微生物をＭＡＬＤＩ－ＭＳ等で質量分析して得られるマススペクトルには、当該微生物に由来する多数のピークが含まれる。そのため、該マススペクトル上において、特定の分子（例えば、バイオマーカー分子）に由来するピークを見つけるのが難しいという問題があった。

【0006】

本発明は上記の点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、微生物の質量分析において、マススペクトル上に含まれるピークの中から、特定の分子に由来するピークを見つけやすくすることである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決するために成された本発明に係る微生物の質量分析方法は、
被検微生物を、第１の液体に懸濁することによって第１懸濁液を調製し、
前記第１懸濁液に対して第１の遠心分離処理を行うことによって、前記第１懸濁液を第１の沈殿物と第１の上清に分離し、
前記第１の沈殿物を、前記第１の液体よりもｐＨの低い第２の液体に懸濁することによって第２懸濁液を調製し、
前記第２懸濁液に対して第２の遠心分離処理を行うことによって、前記第２懸濁液を第２の沈殿物と第２の上清に分離し、
前記第２の上清について質量分析を行うものである。

【発明の効果】

【0008】

上記構成を有する本発明に係る微生物の質量分析方法によれば、マススペクトル上に含まれるピークの中から、特定の分子に由来するピークが見つけやすくなる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明の一実施形態に係る微生物の質量分析方法における試料の調製及び該試料に対する質量分析の実行手順を示すフローチャート。

【図2】従来法による微生物の質量分析結果を示すマススペクトル。

【図3】本発明に係る方法による微生物の質量分析結果を示すマススペクトル。

【発明を実施するための形態】

【0010】

まず、本実施形態に係る微生物の質量分析方法の特徴について説明する。

【0011】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物分析においては、まず、分析担当者によって微生物とマトリクス物質との混合結晶が調製され、その後、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ内で該混合結晶にレーザー光を照射することによって微生物由来の成分がイオン化される。一般的に、前記混合結晶の調製時には、被検微生物の集塊を、ギ酸等の有機酸と有機溶媒との混合液に懸濁することによって、該被検微生物から微生物の構成成分を抽出し、その抽出液をマトリックス物質の溶液と混合した後に乾燥させて結晶化していた。

【0012】

しかしながら、上記従来の一般的な方法で調製された混合結晶をＭＡＬＤＩ－ＭＳで分析した場合、その分析結果として得られるマススペクトルは、被検微生物の多種多様な構成成分に由来するピークを含んだ複雑なものとなるため、該マススペクトル中から目的のピークを見つけ出すのが難しいという問題があった。

【0013】

これに対し、本実施形態に係る方法では、複数の異なる液体を用いて被検微生物の構成成分を多段階に抽出し、各段階で得られた抽出液について、それぞれＭＡＬＤＩ－ＭＳによる分析を行う。これにより、被検微生物の多種多様な構成成分が、各段階の抽出液に分散して含まれることとなるため、質量分析によって得られるマススペクトルの複雑性が低減され、該マススペクトル中から目的とするピークが見つけやすくなる。

【0014】

以上の方法を用いることで、微生物に由来する多種多様な分子を複数の分画に分けて質量分析法で測定することが可能になる。その結果、従来よりも複雑性が低減されたマススペクトルを得ることができ、特定の分子に由来するピークが見つけやすくなる。

【0015】

以下、このような方法による微生物試料の調製及び該試料に対する質量分析の実行手順について、図１のフローチャートを参照しつつ説明する。

【0016】

まず、被検微生物の集塊を、酸を含まない液体である第１の液体に懸濁する（ステップ１１）。これにより得られた懸濁液を、以下「第１懸濁液」とよぶ。前記第１の液体としては、例えば、水、有機溶媒、又はそれらの混合液を使用することができるが、これに限定されるものではない。なお、前記有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、又はアセトニトリル等を好適に用いることができるが、これらに限らず、極性溶媒且つ水に溶けるものであればよく、例えばアセトンなどを用いることもできる。

【0017】

前記被検微生物は、典型的には細菌又は酵母であるが、これに限定されるものではなく、例えば、糸状菌又はウイルスなど、いかなる微生物であってもよい。前記被検微生物の集塊としては、例えば、固体培地の表面から被検微生物を掻き取ったもの、又は液体培地から遠心分離等によって被検微生物を分離・回収したものなどを使用することができる。

【0018】

続いて、前記第１懸濁液を遠心分離処理（以下これを「第１の遠心分離処理」とよぶ）することによって、上清と沈殿物に分離させる（ステップ１２）。そして、前記第１の遠心分離処理によって生じた上清（本発明における「第１の上清」に相当）を、第１試料として回収する（ステップ１３）。この第１試料には、主に、被検微生物の細胞外に分泌される分子（被検微生物がウイルスである場合はウイルス粒子（ビリオン）の外部に存在する分子）が含まれる。

【0019】

次に、前記第１の遠心分離処理によって生じた沈殿物（本発明における「第１の沈殿物」に相当）を、酸を含み且つ有機溶媒を含まない液体である第２の液体に懸濁する（ステップ１４）。これにより得られた懸濁液を、以下「第２懸濁液」とよぶ。前記第２の液体としては、例えば、ギ酸、トリフルオロ酢酸、又は酢酸等の有機酸の水溶液を好適に用いることができる。但し、前記第２の液体に含まれる酸の種類は、これに限定されるものではなく、例えば塩酸などを用いることもできる。また、第２の液体における酸の濃度は、例えば、トリフルオロ酢酸の場合は１体積％以上とすることができ、ギ酸又は酢酸の場合は７０体積％以上とすることができる。

【0020】

続いて、前記第２懸濁液を遠心分離処理（以下これを「第２の遠心分離処理」とよぶ）することによって、上清と沈殿物に分離させる（ステップ１５）。そして、前記第２の遠心分離処理によって生じた上清（本発明における「第２の上清」に相当）を、第２試料として回収する（ステップ１６）。この第２試料には、主に、被検微生物の細胞（又はウイルス粒子）の内部に存在していた分子が含まれる。これは、前記第２の液体に含まれる酸の作用によって被検微生物の細胞膜（又はカプシド若しくはエンベロープ）の透過性が増し、細胞（又はウイルス粒子）内の分子の抽出率が向上するためである。また、前記第２の液体は有機溶媒を含まないため、前記第２試料には、被検細胞の細胞内（又はウイルス粒子内）に存在する分子のうち、比較的親水性のもの（例えば、タンパク質）が主に含まれる。

【0021】

次に、前記第２の遠心分離処理によって生じた沈殿物（本発明における「第２の沈殿物」に相当）を、有機溶媒を含む液体である第３の液体に懸濁する（ステップ１７）。これにより得られた懸濁液を、以下「第３懸濁液」とよぶ。前記第３の液体に含まれる有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、又はアセトニトリル等を好適に用いることができるが、これらに限らず、極性溶媒且つ水に溶けるものであればよく、例えばアセトンなどを用いることもできる。前記第３の液体における有機溶媒の濃度は、例えば３５～８５体積％（望ましくは５０～７０体積％）とすることができるが、これに限定されるものではない。なお、前記第３の液体は、有機溶媒に加えて酸を含有するものであってもよい。その場合、前記第３の液体に含まれる酸の種類又は濃度は、例えば、前記第２の液体に含まれる酸の種類又は濃度と同様とすることができる。

【0022】

続いて、前記第３懸濁液を遠心分離処理（以下これを「第３の遠心分離処理」とよぶ）することによって、上清と沈殿物（本発明における「第３の沈殿物」に相当）に分離させる（ステップ１８）。そして、前記第３の遠心分離処理によって生じた上清（本発明における「第３の上清」に相当）を、第３試料として回収する（ステップ１９）。この第３試料には、被検微生物の細胞内（又はウイルス粒子内）に存在する分子のうち、前記第２の液体では抽出されなかった、比較的疎水性の分子（例えば、脂質）が主に含まれる。

【0023】

以上で回収された前記第１試料、前記第２試料、及び前記第３試料が、それぞれ本発明における「質量分析用試料」に相当する。

【0024】

その後は、前記第１試料、前記第２試料、及び前記第３試料について質量分析を行う（ステップ２０）。

【0025】

具体的には、まず、エッペンドルフチューブ等のマイクロチューブ内で、マトリックス物質の溶液（マトリックス溶液）と前記第１試料、前記第２試料、又は前記第３試料とを混合し、得られた混合物を、それぞれサンプルプレート上の互いに異なるウェルに滴下して乾燥させることによって、各試料とマトリックス物質との混合結晶を形成させる。あるいは、サンプルプレート上の互いに異なるウェルに、前記第１試料、前記第２試料、又は前記第３試料を滴下した後に、その上から、マトリックス溶液を滴下して、ウェル上で各試料とマトリックス溶液を混合して乾燥させることによって、各試料とマトリックス物質との混合結晶を形成させるようにしてもよい。ここで、マトリックス物質の種類は特に限定されず、ＣＨＣＡ（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）、ＳＡ（シナピン酸）、又はＤＨＢ（2,5-dihydroxybenzoic acid）等を適宜用いることができる。また、前記マトリックス溶液における溶媒は、アセトニトリル等の有機溶媒を数十体積％含む水溶液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が０～３体積％程度（望ましくは０．０５～０．２体積％）添加されたもの等を用いることができるが、これに限定されるものではない。

【0026】

その後、前記混合結晶が保持されたサンプルプレートをＭＡＬＤＩ－ＭＳにセットして質量分析を行う。ＭＡＬＤＩ－ＭＳにおいて、前記各混合結晶へのレーザー照射によって発生したイオンは、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ内に設けられた質量分離器によって、ｍ／ｚに従って分離され、質量分離器の後段に設けられたイオン検出器によって順次検出される。そして、そのときのイオン検出器からの検出信号に基づいて、各イオンの検出強度を縦軸に、各イオンのｍ／ｚを横軸にとったマススペクトルが生成される。

【0027】

なお、ここでは、ステップ２０において、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによる質量分析を行うものとしたが、他の種類の質量分析装置、例えば、エレクトロスプレーイオン化法による試料のイオン化を行う質量分析装置（ＥＳＩ－ＭＳ）によって、前記第１試料、第２試料、及び第３試料の質量分析を行うようにしてもよい。その場合には、上記のような試料とマトリックス溶液との混合及び結晶化を行うことなく、各試料をそのままイオン化室に導入し、エレクトロスプレーイオン化による試料成分のイオン化、発生したイオンのｍ／ｚに基づく分離、及びイオンの検出を行う。

【0028】

このように、本実施形態に係る微生物の質量分析方法では、組成の異なる複数の液体（すなわち、前記第１の液体、前記第２の液体、及び前記第３の液体）を用いて被検微生物の構成成分を多段階に抽出する。これにより、被検微生物に由来する多種多様な成分が、各段階の抽出液である前記第１試料、第２試料、及び第３試料に分散して含まれることとなる。そのため、各試料を質量分析して得られたマススペクトルは、その複雑さが比較的低減されたものとなり、特定の分子に由来するピーク（例えば、バイオマーカーピーク）が見つけやすくなる。

【0029】

以上、本発明を実施するための形態について具体例を挙げて説明を行ったが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が可能である。

【0030】

例えば、上記実施形態では、第１の液体として酸を含まない液体を用いるものとしたが、本発明における第１の液体はこれに限定されるものではなく、第２の液体よりも酸性度が低い（すなわちｐＨが高い）ものであればよい。第１の液体としては、例えば、ｐＨが５．５～８．５の液体を用いることができ、第２の液体としては、例えば、ｐＨが１．０以上５．５未満の液体を用いることができる。また、上記実施形態では、第２の液体として酸を含み有機溶媒を含まない液体を用いるものとしたが、本発明における第２の液体はこれに限定されるものではなく、第１の液体よりも酸性度が高く（すなわちｐＨが低く）、第３の液体よりも脂溶性が低いものであればよい。

【0031】

目的の分子が前記第１の液体又は前記第２の液体によって抽出されることが分かっている場合には、前記第３の液体による抽出（すなわちステップ１７～１９）は必ずしも行わなくてよい。その場合、ステップ２０では、ステップ１３で得られた第１試料と、ステップ１６で得られた第２試料について、それぞれ質量分析を行うものとする。また、目的の分子が前記第２の液体又は前記第３の液体によって抽出されることが分かっている場合には、前記第１の遠心分離処理（ステップ１２）で生じた上清は、前記第１試料として回収することなく廃棄してもよい。その場合、ステップ２０では、前記第２試料及び前記第３試料のいずれか一方又は両方についてのみ質量分析を行うものとする。

【実施例0032】

本発明による効果を確認するため、従来法による微生物の質量分析と、本発明に係る方法による微生物の質量分析を行い、その結果を比較した。なお、いずれにおいても分析対象の微生物（被検微生物）としては大腸菌Ｋ１２株を使用した。

【0033】

従来法による微生物試料の調製は、以下の手順で行った。まず、大腸菌Ｋ１２株を液体培地（ＩＦＯ－８０２）で一晩培養し、その後、前記液体培地を遠心して上清を捨て、沈殿物、すなわち菌体の沈渣を得た。その後、前記沈渣を５０体積％のアセトニトリル、１体積％トリフルオロ酢酸水溶液によって濁度が約２．５となるように再懸濁し、そのうち１５０μＬを遠心して、上清を回収した（以下、この上清を「比較例の試料」とよぶ）。

【0034】

一方、本発明に係る方法における微生物試料の調製は、以下の手順で行った。まず、大腸菌Ｋ１２株を液体培地（ＩＦＯ－８０２）で一晩培養し、その後、前記液体培地を遠心して上清を捨て、菌体の沈渣を得た。その後、前記沈渣を５０体積％のアセトニトリル水溶液によって濁度が約２．５となるように再懸濁し、そのうちの１５０μＬを遠心して上清を回収した（以下、この上清を「実施例の試料１」とよぶ）。更に、上記の遠心で得られた沈渣を、１５０μＬの１体積％トリフルオロ酢酸水溶液で再懸濁し、それを遠心して上清を回収した（以下、この上清を「実施例の試料２」とよぶ）。更に、上記の遠心で得られた沈渣を、１５０μＬの５０体積％のアセトニトリル、１体積％トリフルオロ酢酸水溶液で再懸濁し、それを遠心して上清を回収した（以下、この上清を「実施例の試料３」とよぶ）。

【0035】

以上で調製された比較例の試料及び実施例の試料１～３を、それぞれマトリックス溶液と混合し、得られた混合液をサンプルプレートに滴下して乾燥させることによって、各試料について、試料とマトリックス物質との混合結晶を得た。なお、前記マトリックス溶液としては、１０mg/mLのＣＨＣＡ溶液（溶媒は５０体積％アセトニトリル、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液）を使用した。そして、各試料について得られた前記混合結晶について、それぞれマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（島津製作所、ＭＡＬＤＩ－８０２０）による質量分析を行うことにより、各試料に関するマススペクトルを取得した。

【0036】

以上により得られた各試料に関するマススペクトルを図２及び図３に示す。図２は比較例の試料に関するマススペクトルであり、図３は実施例の試料１～３に関するマススペクトルである。なお、図３の下段が実施例の試料１に関するマススペクトルであり、同図の中段が実施例の試料２に関するマススペクトル、同図の上段が実施例の試料３に関するマススペクトルである。

【0037】

図２に示すように、比較例の試料に関するスペクトルでは、１つのマススペクトル上で多数のピークが確認された。これに対し、実施例の試料においては、前記比較例の試料で観測された多数のピークが、３つのマススペクトル（図３）に分散して現れており、特に試料３に関するマススペクトル（図３上段）と試料２に関するマススペクトル（図３下段）では、いずれも観測されたピーク数が比較例よりも少なかった。更に、実施例の試料１に関するマススペクトル（図３下段）では、非特許文献２にて病原性大腸菌を区別するのに有用なバイオマーカーとして示されているm/z 9065.7のピーク及びm/z 9742.2のピークが明瞭に観察された。このことから、本発明に係る微生物の質量分析方法によれば、従来法（比較例）に比べて、目的分子に由来するピークを明瞭に観測できるようになることが確認された。また、実施例の試料１～３に関する３つのマススペクトル（図３）上のピークを合計すると、比較例の試料に関するマススペクトル（図２）よりもピーク数が多くなっていた。このことから、本発明に係る微生物の質量分析方法によれば、従来法では検出できなかったピークが検出可能となり、マススペクトルに基づく微生物同定の精度が向上できると考えられる。

【0038】

[種々の態様]
上述した例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

【0039】

（第１項）本発明の一態様に係る微生物の質量分析方法は、
被検微生物を、第１の液体に懸濁することによって第１懸濁液を調製し、
前記第１懸濁液に対して第１の遠心分離処理を行うことによって、前記第１懸濁液を第１の沈殿物と第１の上清に分離し、
前記第１の沈殿物を、前記第１の液体よりもｐＨの低い第２の液体に懸濁することによって第２懸濁液を調製し、
前記第２懸濁液に対して第２の遠心分離処理を行うことによって、前記第２懸濁液を第２の沈殿物と第２の上清に分離し、
前記第２の上清について質量分析を行うものである。

【0040】

第１項に記載の微生物の質量分析方法では、被検微生物の構成成分が、互いに組成の異なる前記第１の液体と前記第２の液体とによって、段階的に抽出される。これにより、被検微生物に由来する多種多様な成分を、複数の分画に分散させて抽出することができる。そのため、得られた分画（前記第２の上清）を質量分析して得られたマススペクトルは、その複雑さが比較的低減されたものとなり、特定の分子に由来するピーク（例えば、バイオマーカーピーク）が見つけやすくなる。

【0041】

（第２項）第１項に記載の微生物の質量分析方法は、
更に、
前記第１の上清について質量分析を行うものであってもよい。

【0042】

第２項に記載の微生物の質量分析方法では、前記第１の上清と前記第２の上清のそれぞれについて質量分析を行う。これにより、目的とする分子がいずれの上清中に抽出されるかが事前に分かっていない場合においても、目的の分子に由来するピークをより確実に見つけられるようになる。

【0043】

（第３項）第１項又は第２項に記載の微生物の質量分析方法は、
更に、
前記第２の沈殿物を、前記第２の液体よりも脂溶性の高い第３の液体に懸濁することによって第３懸濁液を調製し、
前記第３懸濁液に対して第３の遠心分離処理を行うことによって、前記第３懸濁液を第３の沈殿物と第３の上清に分離し、
前記第３の上清について質量分析を行うものであってもよい。

【0044】

第３項に記載の微生物の質量分析方法では、前記第１の液体、前記第２の液体、及び前記第３の液体を用いた３段階の抽出を行うことにより、被検微生物に由来する成分を、より多くの分画に分散させて抽出することができる。そのため、各分画を質量分析して得られたマススペクトルを、その複雑さがより一層低減されたものとすることができる。

【0045】

（第４項）第１項～第３項のいずれかに記載の微生物の質量分析方法は、前記第２の液体が、酸を含む液体であってもよい。

【0046】

（第５項）第４項に記載の微生物の質量分析方法は、前記酸が、ギ酸、酢酸、又はトリフルオロ酢酸であってもよい。

【0047】

（第６項）第３項～第５項のいずれかに記載の微生物の質量分析方法は、前記第３の液体が、有機溶媒を含む液体であってもよい。

【0048】

（第７項）第１項～第６項のいずれかに記載の微生物の質量分析方法は、前記第１の液体が、有機溶媒を含む液体であってもよい。

【0049】

（第８項）第６項又は第７項に記載の微生物の質量分析方法は、前記有機溶媒が、エタノール、メタノール、又はアセトニトリルであってもよい。

【図1】

【図2】

【図3】