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特開2023-80026鳥類の培養細胞株、バイオリアクターの評価用培養細胞株の製造方法及びバイオリアクター評価用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023080026
(43)【公開日】2023-06-08
(54)【発明の名称】鳥類の培養細胞株、バイオリアクターの評価用培養細胞株の製造方法及びバイオリアクター評価用キット
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230601BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230601BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230601BHJP
A01K 67/027 20060101ALN20230601BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230601BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12Q1/04
C12N15/12
A01K67/027
C12N15/09 100
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022180762
(22)【出願日】2022-11-11
(31)【優先権主張番号】P 2021192781
(32)【優先日】2021-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100168114
【弁理士】
【氏名又は名称】山中 生太
(74)【代理人】
【識別番号】100138955
【弁理士】
【氏名又は名称】末次 渉
(72)【発明者】
【氏名】堀内 浩幸
(72)【発明者】
【氏名】松崎 芽衣
(72)【発明者】
【氏名】江崎 僚
(72)【発明者】
【氏名】梶原 亮太
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 天海
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR48
4B063QS12
4B063QS25
4B063QS33
4B063QS34
4B063QS36
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】短期間でバイオリアクターを評価することができる鳥類の培養細胞株、バイオリアクターの評価用培養細胞株の製造方法及びバイオリアクター評価用キットを提供する。
【解決手段】鳥類の培養細胞株は、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をゲノムに有する。
【選択図】図１
【解決手段】鳥類の培養細胞株は、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をゲノムに有する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をゲノムに有する、
鳥類の培養細胞株。
鳥類の培養細胞株。
【請求項2】
前記卵内タンパク質遺伝子座は、
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座の少なくとも一方である、
請求項１に記載の鳥類の培養細胞株。
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座の少なくとも一方である、
請求項１に記載の鳥類の培養細胞株。
【請求項3】
前記卵内タンパク質遺伝子座は、
オボアルブミン遺伝子座であって、
前記遺伝子は、
オボアルブミン遺伝子及び前記オボアルブミン遺伝子座にノックインされた外来遺伝子である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
オボアルブミン遺伝子座であって、
前記遺伝子は、
オボアルブミン遺伝子及び前記オボアルブミン遺伝子座にノックインされた外来遺伝子である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
【請求項4】
前記外来プロモーター配列は、
前記オボアルブミン遺伝子のエクソン１の上流に位置する、
請求項３に記載の鳥類の培養細胞株。
前記オボアルブミン遺伝子のエクソン１の上流に位置する、
請求項３に記載の鳥類の培養細胞株。
【請求項5】
前記卵内タンパク質遺伝子座は、
オボムコイド遺伝子座であって、
前記遺伝子は、
オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた外来遺伝子である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
オボムコイド遺伝子座であって、
前記遺伝子は、
オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた外来遺伝子である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
【請求項6】
前記外来プロモーター配列は、
ＥＦ１αプロモーター配列である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
ＥＦ１αプロモーター配列である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
【請求項7】
前記卵内タンパク質遺伝子座は、
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座であって、
前記外来プロモーター配列は、
前記オボアルブミン遺伝子座に含まれる少なくとも１つの前記遺伝子を恒常発現させる第１の外来プロモーター配列及び前記オボムコイド遺伝子座に含まれる少なくとも１つの前記遺伝子を恒常発現させる第２の外来プロモーター配列であって、
前記第１の外来プロモーター配列によって恒常発現する前記遺伝子は、
オボアルブミン遺伝子及び前記オボアルブミン遺伝子座にノックインされた第１の外来遺伝子であって、
前記第２の外来プロモーター配列によって恒常発現する前記遺伝子は、
オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた第２の外来遺伝子である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座であって、
前記外来プロモーター配列は、
前記オボアルブミン遺伝子座に含まれる少なくとも１つの前記遺伝子を恒常発現させる第１の外来プロモーター配列及び前記オボムコイド遺伝子座に含まれる少なくとも１つの前記遺伝子を恒常発現させる第２の外来プロモーター配列であって、
前記第１の外来プロモーター配列によって恒常発現する前記遺伝子は、
オボアルブミン遺伝子及び前記オボアルブミン遺伝子座にノックインされた第１の外来遺伝子であって、
前記第２の外来プロモーター配列によって恒常発現する前記遺伝子は、
オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた第２の外来遺伝子である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
【請求項8】
遺伝子改変されたＤＦ－１細胞である、
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株。
【請求項9】
鳥類の培養細胞株のゲノムに、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をノックインするステップと、
前記卵内タンパク質遺伝子座に外来遺伝子をノックインするステップと、
を含む、バイオリアクターの評価用培養細胞株の製造方法。
前記卵内タンパク質遺伝子座に外来遺伝子をノックインするステップと、
を含む、バイオリアクターの評価用培養細胞株の製造方法。
【請求項10】
請求項１又は２に記載の鳥類の培養細胞株と、
前記卵内タンパク質遺伝子座に前記遺伝子として外来遺伝子をノックインするための試薬と、
を備える、バイオリアクター評価用キット。
前記卵内タンパク質遺伝子座に前記遺伝子として外来遺伝子をノックインするための試薬と、
を備える、バイオリアクター評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、鳥類の培養細胞株、バイオリアクターの評価用培養細胞株の製造方法及びバイオリアクター評価用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
鳥類の卵のタンパク質含有量は多いことが知られている。例えば産卵鶏の場合、１羽が年間に産む卵が約３００個と高い生産性を有している。このため、鳥類の卵は、卵白中に有用なタンパク質を大量に生産させるバイオリアクターとしての利用が望まれてきた。先天的なライソゾーム酸性リパーゼ欠損症の治療薬として、セベリパーゼアルファ（カヌマ（商標））が鶏卵で生産されている。セベリパーゼアルファの生産に使用される鶏卵は、ウイルスベクターを用いた遺伝子組み換えによって作製された。
【0003】
特許文献１及び特許文献２には、ゲノム編集技術を用いて、オボアルブミン遺伝子座にヒトインターフェロンβ遺伝子をノックインすることで、鶏卵中にヒトインターフェロンβが発現することが開示されている。
【0004】
上述のセベリパーゼアルファの生産、さらには特許文献１及び特許文献２に開示されたインターフェロンβの生産のように鳥類の卵をバイオリアクターとして利用するには、初期胚又は培養した始原生殖細胞に対して遺伝子組み換えを行うか、あるいはゲノム編集技術によって有用タンパク質の遺伝子を卵内タンパク質遺伝子座にノックインする必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１５／１９９２２５号
【特許文献2】国際公開第２０１７／１１１１４４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ノックインされた遺伝子の産物がどの程度、卵に含まれるのか、そして卵に蓄積された有用タンパク質が所望の活性を維持できるかは、実際にバイオリアクターを確立した後にしか確認できない。バイオリアクターの確立のために、始原生殖細胞の培養、遺伝子改変、移植実験、生殖細胞キメラの作出、生殖細胞キメラの性成熟、交配によるＧ１の作出、Ｇ１の性成熟、及びＧ１の交配によるＧ２の作出といった工程を経る必要がある。これらの工程にはニワトリで２～３年、ウズラでも１年以上の期間を要する。バイオリアクターを確立した後に有用タンパク質の量及び活性に問題があった場合は、バイオリアクターの構築を最初からやり直さなければならない。
【0007】
オボアルブミン及びオボムコイド等の卵内タンパク質は生体内の卵管内分泌細胞で産生される。卵内タンパク質の産生をｉｎ ｖｉｔｒｏで検討できれば、バイオリアクターの構築に着手する前に、バイオリアクターによって得られる有用タンパク質の量及び活性について見通しを立てることができる。しかし、卵内タンパク質が産生される卵管内分泌細胞の培養は極めて困難で、実用化されていない。
【0008】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、短期間でバイオリアクターを評価することができる鳥類の培養細胞株、バイオリアクターの評価用培養細胞株の製造方法及びバイオリアクター評価用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の第１の観点に係る鳥類の培養細胞株は、
卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をゲノムに有する。
卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をゲノムに有する。
【0010】
前記卵内タンパク質遺伝子座は、
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座の少なくとも一方である、
こととしてもよい。
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座の少なくとも一方である、
こととしてもよい。
【0011】
前記卵内タンパク質遺伝子座は、
オボアルブミン遺伝子座であって、
前記遺伝子は、
オボアルブミン遺伝子及び前記オボアルブミン遺伝子座にノックインされた外来遺伝子である、
こととしてもよい。
オボアルブミン遺伝子座であって、
前記遺伝子は、
オボアルブミン遺伝子及び前記オボアルブミン遺伝子座にノックインされた外来遺伝子である、
こととしてもよい。
【0012】
前記外来プロモーター配列は、
前記オボアルブミン遺伝子のエクソン１の上流に位置する、
こととしてもよい。
前記オボアルブミン遺伝子のエクソン１の上流に位置する、
こととしてもよい。
【0013】
前記卵内タンパク質遺伝子座は、
オボムコイド遺伝子座であって、
前記遺伝子は、
オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた外来遺伝子である、
こととしてもよい。
オボムコイド遺伝子座であって、
前記遺伝子は、
オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた外来遺伝子である、
こととしてもよい。
【0014】
前記外来プロモーター配列は、
ＥＦ１αプロモーター配列である、
こととしてもよい。
ＥＦ１αプロモーター配列である、
こととしてもよい。
【0015】
前記卵内タンパク質遺伝子座は、
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座であって、
前記外来プロモーター配列は、
前記オボアルブミン遺伝子座に含まれる少なくとも１つの前記遺伝子を恒常発現させる第１の外来プロモーター配列及び前記オボムコイド遺伝子座に含まれる少なくとも１つの前記遺伝子を恒常発現させる第２の外来プロモーター配列であって、
前記第１の外来プロモーター配列によって恒常発現する前記遺伝子は、
オボアルブミン遺伝子及び前記オボアルブミン遺伝子座にノックインされた第１の外来遺伝子であって、
前記第２の外来プロモーター配列によって恒常発現する前記遺伝子は、
オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた第２の外来遺伝子である、
こととしてもよい。
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座であって、
前記外来プロモーター配列は、
前記オボアルブミン遺伝子座に含まれる少なくとも１つの前記遺伝子を恒常発現させる第１の外来プロモーター配列及び前記オボムコイド遺伝子座に含まれる少なくとも１つの前記遺伝子を恒常発現させる第２の外来プロモーター配列であって、
前記第１の外来プロモーター配列によって恒常発現する前記遺伝子は、
オボアルブミン遺伝子及び前記オボアルブミン遺伝子座にノックインされた第１の外来遺伝子であって、
前記第２の外来プロモーター配列によって恒常発現する前記遺伝子は、
オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた第２の外来遺伝子である、
こととしてもよい。
【0016】
上記本発明の第１の観点に係る鳥類の培養細胞株は、
遺伝子改変されたＤＦ－１細胞である、
こととしてもよい。
遺伝子改変されたＤＦ－１細胞である、
こととしてもよい。
【0017】
本発明の第２の観点に係るバイオリアクターの評価用培養細胞株の製造方法は、
鳥類の培養細胞株のゲノムに、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をノックインするステップと、
前記卵内タンパク質遺伝子座に外来遺伝子をノックインするステップと、
を含む。
鳥類の培養細胞株のゲノムに、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をノックインするステップと、
前記卵内タンパク質遺伝子座に外来遺伝子をノックインするステップと、
を含む。
【0018】
本発明の第３の観点に係るバイオリアクター評価用キットは、
上記本発明の第１の観点に係る鳥類の培養細胞株と、
前記卵内タンパク質遺伝子座に前記遺伝子として外来遺伝子をノックインするための試薬と、
を備える。
上記本発明の第１の観点に係る鳥類の培養細胞株と、
前記卵内タンパク質遺伝子座に前記遺伝子として外来遺伝子をノックインするための試薬と、
を備える。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、短期間でバイオリアクターを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】Ａはニワトリの野生型の培養細胞株のゲノムにおけるオボアルブミン遺伝子座におけるエクソンの分布を示す図である。Ｂは本発明の実施の形態に係る培養細胞株のゲノムにおけるオボアルブミン遺伝子座の構成を例示する図である。Ｃはニワトリの野生型の培養細胞株のゲノムにおけるオボムコイド遺伝子座におけるエクソン１の分布を示す図である。Ｄは本発明の実施の形態に係る培養細胞株のゲノムにおけるオボムコイド遺伝子座の構成を例示する図である。
【図2】Ａは実施例１に係るオボアルブミン遺伝子座のエクソン１の上流にＥＦ１αプロモーターをノックインする場合におけるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的配列、及びＥＦ１αプロモーターをノックインするためのＰｒｅｃｉｓｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＰＩＴＣｈ）ベクターの構成を示す図である。大文字で表記された塩基配列はエクソンの塩基配列を示し、小文字で表記された塩基配列はイントロンの塩基配列を示す。Ｂはエクソン１の上流にＥＦ１αプロモーターをノックインしたオボアルブミン遺伝子座の構成を示す図である。Ｃは実施例１に係るオボアルブミン遺伝子座のエクソン１とエクソン２との間にＥＦ１αプロモーターをノックインする場合におけるｇＲＮＡの標的配列、及びＥＦ１αプロモーターをノックインするためのＰＩＴＣｈベクターの構成を示す図である。大文字で表記された塩基配列はエクソンの塩基配列を示し、小文字で表記された塩基配列はイントロンの塩基配列を示す。Ｄはエクソン１とエクソン２との間にＥＦ１αプロモーターをノックインしたオボアルブミン遺伝子座の構成を示す図である。
【図5】実施例１においてオボアルブミン遺伝子座の目的領域にＥＦ１αプロモーターがノックインされたことを確認するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の結果を示す図である。
【図6】実施例１においてオボアルブミン遺伝子座にＥＦ１αプロモーターがノックインされたことを確認するためのＰＣＲの結果を示す図である。
【図7】実施例１においてオボアルブミン遺伝子座にＥＦ１αプロモーターをノックインした細胞株についてオボアルブミン遺伝子が転写されたことを確認するためのｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）の結果を示す図である。
【図8】実施例１においてオボアルブミン遺伝子座にＥＦ１αプロモーターをノックインした細胞株についてオボアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で定量した結果を示す図である。
【図9】実施例１においてオボアルブミン遺伝子座にＥＦ１αプロモーターをノックインした細胞株についてオボアルブミンタンパク質の発現を確認するためのウエスタンブロット法の結果を示す図である。
【図10】実施例１においてオボアルブミン遺伝子座にＥＦ１αプロモーターをノックインした細胞株についてサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定したオボアルブミンタンパク質の濃度を示す図である。
【図11】Ａは実施例１に係るＥＦ１αプロモーターをノックインしたオボアルブミン遺伝子座にヒト線維芽細胞増殖因子（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２；ｈＦＧＦ２）遺伝子をノックインする位置を示す図である。ＢはｈＦＧＦ２遺伝子をノックインしたオボアルブミン遺伝子座の構成を示す図である。ＣはｈＦＧＦ２遺伝子をノックインしたオボアルブミン遺伝子座が転写された後に生じるｍＲＮＡの予想配列を示す図である。
【図12】実施例１に係るｈＦＧＦ２遺伝子を搭載するＰＩＴＣｈベクターの作製のために使用したベクターのマップを示す図である。
【図13】実施例１に係るｈＦＧＦ２遺伝子を搭載したＰＩＴＣｈベクターのマップを示す図である。
【図14】図１３に示すＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ ａｎｄ Ｃｒｉｓｐｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）ベクターを作製するために使用したベクターのマップを示す図である。
【図15】実施例１に係るｈＦＧＦ２がＥＦ１αプロモーターの下流にノックインされたことを確認するためのＰＣＲの結果を示す図である。
【図16】実施例１においてオボアルブミン遺伝子及びｈＦＧＦ２遺伝子が転写されたことを確認するためのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。
【図17】実施例１においてオボアルブミン遺伝子座にｈＦＧＦ２遺伝子をノックインした株を単一クローン化した後に測定したオボアルブミンタンパク質の濃度を示す図である。
【図18】実施例１においてオボアルブミン遺伝子座にｈＦＧＦ２遺伝子をノックインした株を単一クローン化した後に測定したｈＦＧＦ２タンパク質の濃度を示す図である。
【図19】Ａは実施例２に係るオボムコイド遺伝子の上流へのＥＦ１αプロモーターのノックインの概略、及びＥＦ１αプロモーターをノックインするためのＰＩＴＣｈベクターの構成を示す図である。ＢはＥＦ１αプロモーターをノックインした後のオボムコイド遺伝子座を示す図である。
【図20】Ａ及びＢは、それぞれ実施例２においてオボムコイド遺伝子座にノックインされたＥＦ１αプロモーターを含むカセットの５’側のつなぎ目及び３’側のつなぎ目を確認するためのＰＣＲの結果を示す図である。ＣはＥＦ１αプロモーターをノックインしたオボムコイド遺伝子座に係るジェノタイピングの結果を示す図である。
【図21】実施例２においてオボムコイド遺伝子座にＥＦ１αプロモーターをノックインした細胞株についてオボムコイド遺伝子が転写されたことを確認するためのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。
【図22】実施例２においてオボムコイド遺伝子座にＥＦ１αプロモーターをノックインした細胞株についてオボムコイドタンパク質の発現を確認するためのウエスタンブロット法の結果を示す図である。
【図23】実施例２においてオボムコイド遺伝子座にＥＦ１αプロモーターをノックインした細胞株についてサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定したオボムコイドタンパク質の濃度を示す図である。
【図24】実施例２に係るＥＦ１αプロモーターがノックインされたオボムコイド遺伝子座へのｈＦＧＦ２遺伝子を含むカセットのノックインの概略、ｇＲＮＡの標的配列、及びｈＦＧＦ２遺伝子をノックインするためのＰＩＴＣｈベクターの構成を示す図である。
【図25】実施例２に係るｈＦＧＦ２遺伝子をノックインしたオボムコイド遺伝子座を示す図である。
【図26】Ａ及びＢは、それぞれ実施例２においてオボムコイド遺伝子座にノックインされたｈＦＧＦ２遺伝子を含むカセットの５’側のつなぎ目及び３’側のつなぎ目を確認するためのＰＣＲの結果を示す図である。ＣはｈＦＧＦ２遺伝子をノックインしたオボムコイド遺伝子座に係るジェノタイピングの結果を示す図である。
【図27】実施例２に係るオボアルブミン遺伝子座にＥＦ１αプロモーターとｈＦＧＦ２遺伝子とをノックインした細胞株についてオボアルブミンタンパク質が発現しないことを確認するためのウエスタンブロット法の結果を示す図である。
【図28】実施例２に係るオボアルブミン遺伝子座にＥＦ１αプロモーターとｈＦＧＦ２遺伝子とをノックインした細胞株についてサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定したオボアルブミンタンパク質の濃度を示す図である。
【図29】実施例３に係るオボアルブミン遺伝子座のエクソン８の下流にｈＦＧＦ２遺伝子をノックインする場合のゲノム編集ツールの標的配列を示す図である。
【図30】実施例３に係るドナーベクターの作製に利用したベクターのマップを示す図である。
【図31】実施例３に係るドナーベクターのマップを示す図である。
【図32】Ａは実施例３に係るゲノム編集によってオボアルブミン遺伝子座にｈＦＧＦ２遺伝子をノックインする位置を示す図である。ＢはｈＦＧＦ２遺伝子をノックインしたオボアルブミン遺伝子座の構成を示す図である。ＣはｈＦＧＦ２遺伝子をノックインしたオボアルブミン遺伝子座が転写された後に生じるｍＲＮＡの予想配列を示す図である。
【図33】実施例３においてオボアルブミン遺伝子座にノックインされたｈＦＧＦ２遺伝子を確認するためのＰＣＲの結果を示す図である。
【図34】実施例３においてＥＦ１αプロモーター下流にｈＦＧＦ２遺伝子がノックインされたことを確認するためのＰＣＲの結果を示す図である。
【図35】実施例３においてオボアルブミン遺伝子及びｈＦＧＦ２遺伝子が転写されたことを確認するためのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。
【図36】実施例３においてオボアルブミン遺伝子座にｈＦＧＦ２遺伝子をノックインした株を単一クローン化した後に測定したオボアルブミンタンパク質の濃度を示す図である。
【図37】実施例３においてオボアルブミン遺伝子座にｈＦＧＦ２遺伝子をノックインした株を単一クローン化した後に測定したｈＦＧＦ２タンパク質の濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。
【0022】
本実施の形態に係る鳥類の培養細胞株は、タンパク質又はペプチド等の生産のために、鳥類の卵をバイオリアクターとして利用する際に使用する評価系に好適である。当該培養細胞株を用いて、卵におけるノックインされた外来遺伝子から生成するタンパク質又はペプチドの量及び生成したタンパク質又はペプチドが所望の活性を有するか否か等を確認できる。
【0023】
本実施の形態に係る鳥類の培養細胞株は、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をゲノムに有する。鳥類は、特に限定されず、例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、ダチョウ、エミュー及びヒクイドリ等である。好適には、鳥類は、ニワトリである。ニワトリの品種は特に限定されず、例えば、Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂｒｏｗｎ Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂａｒｒｅｄ Ｒｏｃｋ、Ｓｕｓｓｅｘ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ、Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ、Ｍｉｎｏｒｃａ、Ａｍｒｏｘ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｇｒａｙ、Ｉｔａｌｉａｎ Ｐａｒｔｉｄｇｅ ｃｏｌｏｒｅｄ及びＫｏｒｅａｎ Ｏｇｅ等が挙げられる。
【0024】
鳥類の培養細胞株は、鳥類由来の培養細胞株であれば任意であるが、バイオリアクターとして使用する鳥類由来の培養細胞株が好ましい。培養細胞株としては、例えば、ニワトリの胚線維芽細胞株及び胚腎臓細胞株等の公知の細胞株が使用できる。好適には、鳥類の培養細胞株は、遺伝子改変されたニワトリの胚線維芽細胞株（ＤＦ－１細胞）である。
【0025】
卵内タンパク質遺伝子は、鳥類の卵の中に発現するタンパク質をコードする遺伝子であれば任意であって、例えば、オボアルブミン、オボムコイド、オボインヒビター、オボグロブリン、リゾチーム、オボムチン及びオボトランスフェリン等をコードする遺伝子である。好ましくは、卵内タンパク質遺伝子座は、オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座の少なくとも一方である。
【0026】
卵内タンパク質遺伝子座は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）よりも上流の、卵内タンパク質遺伝子の発現に関与するプロモーター及びエンハンサー等の転写調節領域を含む領域、５’ＵＴＲ、開始コドンから終止コドンまでのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む領域のゲノム上の位置である。卵内タンパク質遺伝子座は、例えば、卵内タンパク質遺伝子の発現制御に関するエンハンサーからターミネーターまでの領域である。なお、ゲノムにおける上流とは、ゲノムの非鋳型鎖（センス鎖）の５’末端の方向のことであって、上流から下流への方向は、ゲノムの非鋳型鎖の５’から３’への方向をいう。
【0027】
外来プロモーター配列は、培養細胞株を由来としないプロモーター配列である。上記卵内タンパク質遺伝子の発現はプロモーターによって制御されており、卵内タンパク質は卵管特異的に発現する。これに対し、外来プロモーター配列は、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる遺伝子を恒常発現（又は強制発現）させる。恒常発現とは、例えば組織特異的等のように限定的な発現ではなく、常に発現することをいう。遺伝子を恒常発現させる（ユビキタス）プロモーター配列は、好ましくは哺乳類細胞で機能する公知のプロモーターであって、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＥＦＳ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＳＦＦＶ、ＭＳＣＶ、ＳＶ４０、ｍＰＧＫ、ｈＰＧＫ及びＵＢＣ等である。好ましくは、外来プロモーター配列はＥＦ１αプロモーター配列である。
【0028】
外来プロモーター配列は、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる遺伝子を恒常発現させる限り、当該遺伝子の任意の位置にノックインされる。例えば、卵内タンパク質遺伝子座がオボアルブミン遺伝子座である場合、外来プロモーター配列はオボアルブミン遺伝子のエクソン１の上流に位置するのが好ましい。図１Ａは、鳥類の野生型の培養細胞株のゲノムにおけるオボアルブミン遺伝子座を示す。これに対し、本実施の形態に係る培養細胞株は、図１Ｂに示すように、ゲノムにおけるオボアルブミン遺伝子座のエクソン１の上流に外来プロモーター配列を有する。なお、オボアルブミン遺伝子の開始コドンはエクソン２にあるため、卵内タンパク質遺伝子座がオボアルブミン遺伝子座である場合、外来遺伝子はオボアルブミン遺伝子のエクソン２の上流、すなわちエクソン１とエクソン２との間で、オボアルブミン遺伝子の開始コドンの上流に位置してもよい。
【0029】
本実施の形態に係る鳥類の培養細胞株は、卵内タンパク質遺伝子座にマーカー遺伝子を有してもよい。ゲノム編集等で外来プロモーター配列をノックインする場合、図１Ｂに示すように、マーカー遺伝子１を外来プロモーター配列とともにゲノムに安定的に組み込むことで、ノックインされた細胞株を選別できる点で好ましい。マーカー遺伝子１は、蛍光タンパク質の遺伝子、呈色反応を触媒する酵素の遺伝子及び薬剤耐性遺伝子等である。蛍光タンパク質及び呈色反応を触媒する酵素としては、例えば、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β－グルクロニダーゼ及びβ－ガラクトシダーゼ等が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨｙｇＲ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒｏＲ）、ブラストサイジン耐性遺伝子（ＢｌａｓｔＲ）及びゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）等が挙げられる。
【0030】
卵内タンパク質遺伝子座がオボアルブミン遺伝子座である場合、外来プロモーター配列によって恒常発現する、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる遺伝子は、好ましくは、オボアルブミン遺伝子及びノックインされた外来遺伝子である。外来遺伝子は、鳥類の卵を介したバイオリアクターで生産する任意の有用タンパク質又は有用ペプチド（以下、“有用タンパク質等”とも総称する）をコードする遺伝子である。外来遺伝子によってコードされる有用タンパク質等は、好ましくは、分泌性のタンパク質又はペプチドである。有用タンパク質等として、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ及びｄｓＦｖ等の抗体の断片、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、コラーゲン、細胞外マトリクス分子、ワクチン用抗原、アゴニスト性タンパク質及びアンタゴニスト性タンパク質等が挙げられる。例えば、有用タンパク質は、ｈＦＧＦ２である。外来遺伝子がコードするタンパク質がヒトに投与する医薬として使用される生理活性タンパク質の場合、外来遺伝子は、哺乳動物由来、好ましくはヒト由来である。また、プロテインＡ及び蜘蛛の糸を構成するタンパク質等の工業的に使用可能なタンパク質の場合、外来遺伝子は、細菌及び酵母等の微生物、植物並びに動物を含む任意の生物由来のタンパク質、あるいは人工的なタンパク質をコードしてもよい。
【0031】
外来遺伝子は、外来プロモーター配列によって恒常発現させる限り、卵内タンパク質遺伝子座の任意の位置にノックインされる。例えば、外来遺伝子は、卵内タンパク質遺伝子のＯＲＦの上流又は下流にノックインされる。好ましくは、図１Ｂに示すように、外来遺伝子はオボアルブミン遺伝子の上流にノックインされる。オボアルブミンは卵管内で必須のタンパク質であるため、卵内タンパク質遺伝子座がオボアルブミン遺伝子座である場合、外来遺伝子に加え、オボアルブミン遺伝子が発現するのが好ましい。外来遺伝子がノックインされた細胞株を選別するために、外来遺伝子とともにマーカー遺伝子２が組み込まれてもよい。
【0032】
卵内タンパク質遺伝子座に本来ある卵内タンパク質遺伝子の上流に外来遺伝子をノックインする場合、外来遺伝子と卵内タンパク質遺伝子との間に、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を１つのプロモーターで制御するために使用されるリンカーが挿入されてもよい。リンカーは、例えば、キャップ非依存的な翻訳の開始を可能にするＲＮＡエレメントに対応するｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）、及び細胞内のタンパク質の翻訳中にリボソームスキッピングを誘発する２Ａペプチドに対応する塩基配列である。図１Ｂに示すように、ＩＲＥＳを挿入することで、外来プロモーター配列の制御下で、外来遺伝子とオボアルブミン遺伝子がそれぞれ発現する。２Ａペプチドを使用した場合、外来遺伝子と卵内タンパク質遺伝子とが融合したタンパク質が発現し、２Ａペプチドの部分で切断されて、外来遺伝子がコードするタンパク質と卵内タンパク質が生成される。２Ａペプチドとしては、例えばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａ等が挙げられる。
【0033】
卵内タンパク質遺伝子座はオボムコイド遺伝子座であってもよい。図１Ｃは、鳥類の野生型の培養細胞株のゲノムにおけるオボムコイド遺伝子座の一部を示す。卵内タンパク質遺伝子座がオボムコイド遺伝子座である場合、図１Ｃに示すように、本実施の形態に係る培養細胞株において、外来プロモーター配列によって恒常発現する、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる遺伝子は、オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた外来遺伝子である。この場合、上記のリンカーを外来遺伝子とオボムコイド遺伝子との間に挿入しなければ、外来遺伝子のみが転写され、オボムコイド遺伝子は転写されず、オボムコイド遺伝子をノックオフすることができる。オボムコイドは卵管内で必須ではないうえ、アレルゲンともなるため、オボムコイドが生成しなくてもよい。なお、外来遺伝子は、オボムコイド遺伝子のエクソン１にある開始コドンの位置にノックインされてもよい。
【0034】
本実施の形態に係る卵内タンパク質遺伝子座は、１つに限らず、卵内タンパク質遺伝子座３及び卵内タンパク質遺伝子座３とは異なる卵内タンパク質遺伝子座４それぞれに、有用タンパク質等をコードする遺伝子をノックインしてもよい。例えば、卵内タンパク質遺伝子座３がオボアルブミン遺伝子座であって、卵内タンパク質遺伝子座４がオボムコイド遺伝子座である。以下では、卵内タンパク質遺伝子座３及び卵内タンパク質遺伝子座４がそれぞれオボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座である場合を例として説明する。
【0035】
オボアルブミン遺伝子座及びオボムコイド遺伝子座を利用する場合、外来プロモーター配列は、オボアルブミン遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列５（第１の外来プロモーター配列）及びオボムコイド遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列６（第２の外来プロモーター配列）である。外来プロモーター配列５と外来プロモーター配列６とは、同じ種類のプロモーター配列であってもよいし、異なる種類のプロモーター配列であってもよい。例えば、外来プロモーター配列５及び外来プロモーター配列６は、いずれもＥＦ１αプロモーター配列である。
【0036】
外来プロモーター配列５によって恒常発現する遺伝子は、オボアルブミン遺伝子及びオボアルブミン遺伝子座にノックインされた外来遺伝子７（第１の外来遺伝子）である。外来プロモーター配列６によって恒常発現する遺伝子は、オボムコイド遺伝子の上流にノックインされた外来遺伝子８（第２の外来遺伝子）である。
【0037】
外来遺伝子７と外来遺伝子８とを同じ有用タンパク質等をコードする外来遺伝子とすることで、１つの卵内タンパク質遺伝子座を利用した場合よりも有用タンパク質等の発現量を増大させることができる。また、外来遺伝子７と外来遺伝子８とを異なる有用タンパク質等をコードする外来遺伝子とすることで、複数種の有用タンパク質等を発現させることができる。
【0038】
続いて、本実施の形態に係る鳥類の培養細胞株の製造方法について説明する。当該培養細胞株の製造方法は、鳥類の培養細胞株のゲノムに、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をノックインする第１のステップと、卵内タンパク質遺伝子座に外来遺伝子をノックインする第２のステップとを含む。
【0039】
ノックインの対象となる鳥類の培養細胞株は、好ましくは人為的な遺伝子改変がなされていない野生型の培養細胞株である。好適には、ノックインの対象となる鳥類の培養細胞株はＤＦ－１細胞である。本実施の形態に係る鳥類の培養細胞株の製造方法にＤＦ－１細胞を使用することで、遺伝子改変されたＤＦ－１細胞が得られる。
【0040】
ゲノムへの外来プロモーター配列及び外来遺伝子のノックインは、公知のゲノム編集技術によって行うことができる。ゲノム編集は、２本鎖ＤＮＡの切断とその修復を利用して遺伝子改変を行う技術である。ゲノム編集には、例えば、ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが使用できる。
【0041】
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインからなるポリペプチドである。ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインの結合部位において一対のＤＮＡ切断ドメインが近接して二量体を形成することによって、二本鎖ＤＮＡを切断する。ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールを繰り返して含み、それぞれのＤＮＡ結合モジュールが、ＤＮＡの特定の塩基対を認識するため、ＤＮＡ結合モジュールを適切に設計することによって、ゲノム上の標的とする塩基配列を特異的に切断できる。ＺＦＮにおけるＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインは、それぞれジンクフィンガーモチーフ及びＦｏｋＩである。ＴＡＬＥＮにおけるＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインは、それぞれジＦｏｋＩとＴＡＬエフェクターである。
【0042】
ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質としてＣａｓ９を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノム上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ配列）と５’末端側に隣接する塩基との間で二本鎖ＤＮＡを特異的に切断してゲノムの任意の部位を改変することができる遺伝子改変ツールである。
【0043】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、Ｃａｓ９タンパク質と、ｇＲＮＡとを使用する。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に相当する、標的配列の相補鎖と塩基対を形成する塩基配列と、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の機能を担いＣａｓ９タンパク質の結合の足場となる塩基配列とを含む。ｇＲＮＡが標的配列の相補鎖に塩基対合することでＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体が形成される。そして、Ｃａｓ９タンパク質が二本鎖ＤＮＡを切断する。
【0044】
二本鎖ＤＮＡの切断は、多くの遺伝情報の損失又はガン化の原因になるため、細胞内で極めて迅速に修復される。好ましくは、本実施の形態に係る培養細胞株の製造方法において、外来プロモーター配列及び外来遺伝子のノックインはＰＩＴＣｈシステムを介して行われる。ＰＩＴＣｈシステムは、切断された二本鎖ＤＮＡの修復機構の１つであるマイクロホモロジー媒介末端結合（ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ；ＭＭＥＪ）を利用して外来プロモーター配列及び外来遺伝子を挿入する。ＭＭＥＪは二本鎖切断の際に生じた切断両末端間で、相補的な配列（５～２５塩基対）同士で結合し、修復される機構である。
【0045】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及びＰＩＴＣｈシステムを用いて外来プロモーター配列をゲノムにノックインする場合、卵内タンパク質遺伝子座において二本鎖ＤＮＡを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を発現するベクターと、外来プロモーター配列を含むドナーベクターと、ドナーベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を発現するベクターとを、培養細胞株に導入すればよい。これらベクターは、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等の公知の方法で培養細胞株に導入すればよい。外来遺伝子をゲノムにノックインする場合も同様に、第１のステップにおいて外来プロモーター配列がゲノムに導入された細胞株に、卵内タンパク質遺伝子座において二本鎖ＤＮＡを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を発現するベクターと、外来遺伝子を含むドナーベクターと、ドナーベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を発現するベクターとを導入すればよい。
【0046】
第１のステップ及び第２のステップでは、それぞれ外来プロモーター配列及び外来遺伝子とともにマーカー遺伝子１及びマーカー遺伝子２がノックインされてもよい。これにより、外来プロモーター配列及び外来遺伝子がゲノムにノックインされた培養細胞株（クローン）を、外来プロモーター配列及び外来遺伝子とともにゲノムに導入されたマーカー遺伝子を介して選別できる。外来遺伝子とともにノックインされたマーカー遺伝子２は、外来プロモーター配列とともにノックインされたマーカー遺伝子１と異なるのが好ましい。
【0047】
なお、第１のステップと、第２のステップとは同時に行ってもよい。すなわち、外来プロモーター配列のノックインに使用する上記ベクターと、外来遺伝子のノックインに使用する上記ベクターとを、培養細胞株に導入してもよい。
【0048】
ノックインした外来プロモーター配列が卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させることを確認するには、第１のステップで得られた培養細胞株について、卵内タンパク質遺伝子が転写されたｍＲＮＡ又は卵内タンパク質の発現を公知の方法で評価すればよい。ｍＲＮＡの発現は、培養した培養細胞株からＲＮＡを抽出しＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ及び転写産物の配列解析等の公知の方法で確認できる。卵内タンパク質の発現は、培養した培養細胞株の培養上清又はライセートから調製した試料についてウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡ法等の公知の方法で確認できる。ノックインした外来遺伝子の発現は、上述の卵内タンパク質遺伝子の発現と同様に第２のステップで得られた培養細胞株について確認すればよい。
【0049】
複数の卵内タンパク質遺伝子座に外来遺伝子をノックインする場合は、上記第１のステップにおいて、鳥類の培養細胞株のゲノムに、卵内タンパク質遺伝子座３に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列５をノックインする。そして、上記第２のステップにおいて、卵内タンパク質遺伝子座３に外来遺伝子７をノックインする。さらに、卵内タンパク質遺伝子座４について、第１のステップと第２のステップとを行えばよい。具体的には、第３のステップとして、外来遺伝子７をノックインした培養細胞株のゲノムに、卵内タンパク質遺伝子座４に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列６をノックインする。続いて、第４のステップとして、卵内タンパク質遺伝子座４に外来遺伝子８をノックインすればよい。
【0050】
本実施の形態に係る培養細胞株によれば、実用化されていない卵管内分泌細胞で発現するオボアルブミン及びオボムコイド等の卵内タンパク質を卵管内分泌細胞ではない細胞株で発現させることができる。このため、卵内タンパク質遺伝子座にノックインされた外来遺伝子にコードされる有用タンパク質の発現量、及び有用タンパク質が所望の活性を維持しているか否かを検討することができる。遺伝子改変された培養細胞株において有用タンパク質の所望の発現と活性が確認された場合、卵内タンパク質遺伝子座の同じ位置にノックインされた外来遺伝子は、卵管内分泌細胞でも同様に発現すると考えられる。したがって、バイオリアクターによる有用タンパク質の産生量及び活性をバイオリアクターの構築に着手する前に、短期間で評価することができる。
【0051】
本実施の形態に係る培養細胞株を用いて評価に基づいてバイオリアクターを構築する場合、鳥類の胚性幹細胞、特には胚盤葉上層由来多能性幹細胞又は始原生殖細胞等を対象として、培養細胞株での検討で決定した卵内タンパク質遺伝子座の位置に上記のように外来遺伝子をノックインすればよい。続いて、外来遺伝子をノックインした始原生殖細胞を、鳥類の胚に移植する。移植操作は、特に限定されないが、細管を用いて、鳥類の胚に始原生殖細胞を注入すればよい。始原生殖細胞を移植した後、移植された胚を含む卵を、孵化させることでキメラ個体を作出することができる。得られたキメラ個体を交配することで、卵内タンパク質遺伝子座にノックインされた外来遺伝子をホモ接合で有するゲノムを受け継いだ遺伝子改変鳥類が高い確率で作出される。
【0052】
上記のように本実施の形態に係る培養細胞株の製造方法はバイオリアクターの構築方法に組み入れることができる。よって、別の実施の形態では、上記第１のステップと、第２のステップとを含む、バイオリアクターの構築方法が提供される。
【0053】
また、別の実施の形態では、バイオリアクター評価用キットが提供される。当該キットは、卵内タンパク質遺伝子座に含まれる少なくとも１つの遺伝子を恒常発現させる外来プロモーター配列をゲノムに有する鳥類の培養細胞株と、卵内タンパク質遺伝子座に前記遺伝子として外来遺伝子をノックインするための試薬と、を備える。キットに含まれる培養細胞株のゲノムには、外来遺伝子はノックインされておらず、外来プロモーター配列のみがノックインされている。外来遺伝子をノックインするための試薬は、例えば、上記の第２のステップで用いた外来遺伝子のゲノム編集技術によるノックインの試薬である。より具体的には、試薬として、卵内タンパク質遺伝子座において二本鎖ＤＮＡを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を発現するベクターと、外来遺伝子を組み込み可能なドナーベクター（ＰＩＴＣｈベクター）と、ドナーベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を発現するベクター等が挙げられる。
【0054】
バイオリアクター評価用キットは、緩衝液、マーカー遺伝子による選別のための薬剤、及びノックインを確認するための各種プライマー等をさらに含んでもよい。
【実施例0055】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【0056】
［実施例１：オボアルブミン（ＯＶＡ）遺伝子座のゲノム編集］
１．ゲノム編集ツールの構築
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して、ＯＶＡ遺伝子座に強制発現プロモーター（外来プロモーター配列）をノックインするために、ゲノム編集ツールを作製した。ノックインの手法として高効率なノックイン技術であるＰＩＴＣｈシステムを利用した（Ｎａｋａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１４）。ＰＩＴＣｈシステムで使用するゲノム編集ツールは、ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター、外来プロモーター配列としてのＥＦ１αプロモーターを含むドナーベクター（ＰＩＴＣｈベクター）及びＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの３種類である。
１．ゲノム編集ツールの構築
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して、ＯＶＡ遺伝子座に強制発現プロモーター（外来プロモーター配列）をノックインするために、ゲノム編集ツールを作製した。ノックインの手法として高効率なノックイン技術であるＰＩＴＣｈシステムを利用した（Ｎａｋａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１４）。ＰＩＴＣｈシステムで使用するゲノム編集ツールは、ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター、外来プロモーター配列としてのＥＦ１αプロモーターを含むドナーベクター（ＰＩＴＣｈベクター）及びＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの３種類である。
【0057】
（ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製）
図２Ａには、ＯＶＡ遺伝子のエクソン１の上流を標的とする場合（以下、“エクソン１編集”ともいう）のＰＡＭ配列とｇＲＮＡの標的配列（下線）とが示されている。一方、エクソン１とエクソン２との間を標的とする場合（以下、“エクソン２編集”ともいう）のＰＡＭ配列とｇＲＮＡの標的配列（下線）とが図２Ｃに示されている。ｇＲＮＡの鋳型となる、アニーリングした合成オリゴを合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。エクソン１編集について合成オリゴの塩基配列を配列番号３及び４に示す。エクソン２編集について合成オリゴの塩基配列を配列番号５及び６に示す。
図２Ａには、ＯＶＡ遺伝子のエクソン１の上流を標的とする場合（以下、“エクソン１編集”ともいう）のＰＡＭ配列とｇＲＮＡの標的配列（下線）とが示されている。一方、エクソン１とエクソン２との間を標的とする場合（以下、“エクソン２編集”ともいう）のＰＡＭ配列とｇＲＮＡの標的配列（下線）とが図２Ｃに示されている。ｇＲＮＡの鋳型となる、アニーリングした合成オリゴを合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。エクソン１編集について合成オリゴの塩基配列を配列番号３及び４に示す。エクソン２編集について合成オリゴの塩基配列を配列番号５及び６に示す。
【0058】
アニーリング済み合成オリゴを、ＢｐｉＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用したＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、ｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃４２２３０、以下“ｐＸ３３０ベクター”ともいう）に挿入した。反応液をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換し、スモールカルチャー後、プラスミドを抽出した（ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉＫｉｔ、日本ジェネティクス社製）。その後、抽出したプラスミドをシークエンス解析（ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のテンプレートとして使用した。シークエンス解析の結果、合成オリゴがｐＸ３３０ベクターに挿入されていることが確認された。
【0059】
（ＥＦ１αプロモーターを搭載したＰＩＴＣｈベクターの作製）
ＰＩＴＣｈベクターの構築に利用したｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α Ｐｕｒベクター（タカラバイオ社製）のベクターのマップを図３に示す。本実施例に係るＰＩＴＣｈベクターは、ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α Ｐｕｒベクターのクローニングサイト内のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間にＯＶＡ遺伝子と相同な約２０ｂｐの塩基配列（マイクロホモロジー配列）を挿入することにより作製した。挿入する塩基配列を合成オリゴとして合成し、合成オリゴをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製時と同様にアニールした。エクソン１編集における合成オリゴの塩基配列を配列番号７及び８に示す。エクソン２編集における合成オリゴの塩基配列を配列番号９及び１０に示す。エクソン１編集に使用する合成オリゴの塩基配列には、制限酵素サイト（ＢａｍＨＩサイト及びＨｉｎｄＩＩＩサイト）及びマイクロホモロジー配列が含まれる。なお、エクソン２には開始コドンが存在するため、エクソン２編集における合成オリゴの塩基配列には、制限酵素サイト及びマイクロホモロジー配列の他にコザック配列が含まれる。
ＰＩＴＣｈベクターの構築に利用したｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α Ｐｕｒベクター（タカラバイオ社製）のベクターのマップを図３に示す。本実施例に係るＰＩＴＣｈベクターは、ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α Ｐｕｒベクターのクローニングサイト内のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間にＯＶＡ遺伝子と相同な約２０ｂｐの塩基配列（マイクロホモロジー配列）を挿入することにより作製した。挿入する塩基配列を合成オリゴとして合成し、合成オリゴをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製時と同様にアニールした。エクソン１編集における合成オリゴの塩基配列を配列番号７及び８に示す。エクソン２編集における合成オリゴの塩基配列を配列番号９及び１０に示す。エクソン１編集に使用する合成オリゴの塩基配列には、制限酵素サイト（ＢａｍＨＩサイト及びＨｉｎｄＩＩＩサイト）及びマイクロホモロジー配列が含まれる。なお、エクソン２には開始コドンが存在するため、エクソン２編集における合成オリゴの塩基配列には、制限酵素サイト及びマイクロホモロジー配列の他にコザック配列が含まれる。
【0060】
ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α ＰｕｒベクターをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し、１％アガロースゲルで電気泳動した。その後、目的のベクターを切り出し、精製した（ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、日本ジェネティクス社製）。精製したベクターとインサートとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２により連結した。それらを上述のようにコンピテントセルへ形質転換し、シークエンス解析に供試した。シークエンス解析の結果、ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α Ｐｕｒベクターのクローニングサイトに合成オリゴが挿入されていることが確認された。
【0061】
（ＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製）
エクソン１編集及びエクソン２編集について作製したＰＩＴＣｈベクター中の標的配列をそれぞれ図４Ａ及び図４Ｂに示す。上述のＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製と同様に、ｇＲＮＡの鋳型となるアニーリングした合成オリゴを合成した。エクソン１編集における合成オリゴの塩基配列を配列番号１１及び１２に示す。エクソン２編集における合成オリゴの塩基配列を配列番号１３及び１４に示す。合成オリゴをアニール後、ｐＸ３３０ベクターへ挿入し、シークエンス解析により合成オリゴの挿入を確認した。
エクソン１編集及びエクソン２編集について作製したＰＩＴＣｈベクター中の標的配列をそれぞれ図４Ａ及び図４Ｂに示す。上述のＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製と同様に、ｇＲＮＡの鋳型となるアニーリングした合成オリゴを合成した。エクソン１編集における合成オリゴの塩基配列を配列番号１１及び１２に示す。エクソン２編集における合成オリゴの塩基配列を配列番号１３及び１４に示す。合成オリゴをアニール後、ｐＸ３３０ベクターへ挿入し、シークエンス解析により合成オリゴの挿入を確認した。
【0062】
２．ゲノム編集技術を利用したＯＶＡ発現細胞株の作製
上述のように作製したＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター、ＥＦ１αプロモーターを搭載したＰＩＴＣｈベクター及びＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを混合したＤＮＡ溶液をＤＦ－１細胞（ＡＴＣＣ（商標） ＣＲＬ－１２２０３（商標））に遺伝子導入した。ＤＦ－１細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）－ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して維持した。遺伝子導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をプロトコルに従って使用した。遺伝子導入２４時間後、１．０μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを添加し、２週間培養した。
上述のように作製したＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター、ＥＦ１αプロモーターを搭載したＰＩＴＣｈベクター及びＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを混合したＤＮＡ溶液をＤＦ－１細胞（ＡＴＣＣ（商標） ＣＲＬ－１２２０３（商標））に遺伝子導入した。ＤＦ－１細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）－ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して維持した。遺伝子導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をプロトコルに従って使用した。遺伝子導入２４時間後、１．０μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを添加し、２週間培養した。
【0063】
ＥＦ１αプロモーターのノックインを確認するために、ポリクローナルな細胞からゲノムＤＮＡを抽出し（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）、ゲノミックＰＣＲ（ＫＯＤ Ｏｎｅ（商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＴＯＹＯＢＯ社製）に供試した。図２Ｂに示す、エクソン１編集に係るフォワードプライマーＰ１及びリバースプライマーＰ２の塩基配列をそれぞれ配列番号１５及び１６に示す。図２Ｄに示す、エクソン２編集に係るフォワードプライマーＰ３及びリバースプライマーＰ４の塩基配列をそれぞれ配列番号１７及び１８に示す。図５に示すように、エクソン１編集及びエクソン２編集についてそれぞれ目的とするバンドが検出された。その後、限界希釈法により細胞をモノクローン化し、さらなる解析に供試した。
【0064】
ノックインが片アレルに生じているか、両アレルに生じているかを判断するために、ノックイン領域を挟み込むようにＯＶＡ遺伝子座上にプライマーを設計した。図２Ｂに示すように、エクソン１編集に係るプライマーには、フォワードプライマーＰ１及び塩基配列を配列番号１９に示すリバースプライマーＰ５を用いた。図２Ｄに示す、エクソン２編集に係るフォワードプライマーＰ６及びリバースプライマーＰ７の塩基配列をそれぞれ配列番号２０及び２１に示す。このプライマーを使用してゲノミックＰＣＲを行った結果、図６に示すように、エクソン１編集及びエクソン２編集において高分子量及び低分子量にバンドが検出された。このことから、ゲノム編集ツールの導入の結果、ＥＦ１αプロモーターが片アレルに挿入されていることが明らかとなった。
【0065】
３．オフターゲット作用の有無の確認
上記で樹立したＥＦ１αプロモーターがＯＶＡ遺伝子のエクソン１の上流にノックインされている株（以下、“ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株”とする）及びＥＦ１αプロモーターがエクソン１とエクソン２との間にノックインされている株（以下、“ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株”とする）に目的外の変異が生じていないか（オフターゲット作用）を確認した。まずＣＲＩＳＰＲ ｄｉｒｅｃｔにより、ＰＡＭとｇＲＮＡの標的配列とを合わせた１２塩基が一致しているニワトリのゲノム領域の情報を取得した。それらのゲノム領域に関して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ（ＵＣＳＣ） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒを使用し、アノテーションを行った。ＣＲＩＳＰＲ ｄｉｒｅｃｔにより取得したゲノム領域のうち、遺伝子がコードされている領域を候補領域とし、候補領域におけるオフターゲット作用の有無を確認した。候補領域を表１に示す。
上記で樹立したＥＦ１αプロモーターがＯＶＡ遺伝子のエクソン１の上流にノックインされている株（以下、“ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株”とする）及びＥＦ１αプロモーターがエクソン１とエクソン２との間にノックインされている株（以下、“ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株”とする）に目的外の変異が生じていないか（オフターゲット作用）を確認した。まずＣＲＩＳＰＲ ｄｉｒｅｃｔにより、ＰＡＭとｇＲＮＡの標的配列とを合わせた１２塩基が一致しているニワトリのゲノム領域の情報を取得した。それらのゲノム領域に関して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ（ＵＣＳＣ） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒを使用し、アノテーションを行った。ＣＲＩＳＰＲ ｄｉｒｅｃｔにより取得したゲノム領域のうち、遺伝子がコードされている領域を候補領域とし、候補領域におけるオフターゲット作用の有無を確認した。候補領域を表１に示す。
【0066】
【表1】
【0067】
候補領域について、それぞれを増幅するプライマーを設計した。ＤＡＣＨ１に係るフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３２及び３３に示す。ＩＦＴ１４０に係るフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３４及び３５に示す。ＴＲＡＩＰに係るフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３６及び３７に示す。ＳＮＸ２に係るフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３８及び３９に示す。ＡＴＰ２Ａ２に係るフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号４０及び４１に示す。ＫＩＦ４Ｂに係るフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号４２及び４３に示す。
【0068】
ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株の単一クローン細胞及びコントロールとしての野生型ＤＦ－１細胞から抽出したゲノムＤＮＡについて、候補領域を増幅した。それらをテンプレートとしてダイレクトシークエンス法を実施し、シークエンス解析を行った。その結果、計６箇所のオフターゲット候補領域に変異は確認されなかった。
【0069】
４．ＯＶＡの発現解析
樹立したＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株及びＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株におけるＯＶＡ遺伝子の発現を検討した。まず、ＯＶＡ遺伝子の転写が行われているか否かを確認するため、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びＯＶＡ遺伝子の転写産物のシークエンス解析を実施した。
樹立したＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株及びＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株におけるＯＶＡ遺伝子の発現を検討した。まず、ＯＶＡ遺伝子の転写が行われているか否かを確認するため、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びＯＶＡ遺伝子の転写産物のシークエンス解析を実施した。
【0070】
培養したＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株及びＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株からＲＮＡを抽出し（ＦａｓｔＧｅｎｅＴＭ ＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｋｉｔ、日本ジェネティクス社製）、ｃＤＮＡを合成した（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）。合成したｃＤＮＡを使用して、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号４４及び４５に示す。ＲＴ－ＰＣＲの結果、図７に示すように、各株についてＯＶＡ遺伝子が転写されていることが確認できた。
【0071】
続いてｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株及びＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株におけるＯＶＡ遺伝子の発現強度を評価した。ｑＲＴ－ＰＣＲにはＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用した。コントロールとしてβ－アクチンの発現量を定量した。ＯＶＡに対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号４６及び４７に示す。β－アクチンに対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号４８及び４９に示す。ｑＲＴ－ＰＣＲの結果、図８に示すように、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株において、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株の約３倍の発現強度を示した。
【0072】
ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株及びＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株においてＯＶＡ遺伝子の正常な転写が行われているか否かを調べるため、ＯＶＡ遺伝子の転写産物のシークエンス解析を実施した。まず各細胞株から合成したｃＤＮＡをテンプレートに、ＯＶＡ遺伝子の予測される転写産物の全長をＰＣＲにより増幅した。続いてＰＣＲ産物を使用してダイレクトシークエンス法を実施し、ＯＶＡ遺伝子の転写産物のシークエンス解析を行った。使用したプライマーの塩基配列を配列番号５０～５５に示す。シークエンス解析の結果、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１及びＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株において正常なＯＶＡ遺伝子の転写が確認された。
【0073】
ＯＶＡタンパク質がＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株及びＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株において発現しているか否かを調べるため、ウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡ法を行った。ウエスタンブロット法では、サンプルとして、各株の培養上清及び細胞のライセートを供試した。２週間培養した培養上清をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ社製）により約２倍濃縮し、培養上清サンプルとして使用した。
【0074】
Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｋｉｔ（ＡＣＴＩＶＥ ＭＯＴＩＦ社製）をプロトコルに従い使用することでライセートサンプルを調製した。それぞれのサンプルを１５％ポリアクリルアミドゲルにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写後、一晩、４℃でブロッキングした（ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（商標）、ＴＯＹＯＢＯ社製）。メンブレン上のＯＶＡタンパク質は、抗ＯＶＡウサギ抗体（Ｅｇｇ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｋｉｔ（卵白アルブミン、森永生科学研究所製）で検出した。これらは一次抗体用Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（商標） Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＴＯＹＯＢＯ社製）で１：１０００に希釈した。二次抗体にはＨＲＰ標識抗ウサギヤギ抗体を使用し、二次抗体用Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（商標） Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＴＯＹＯＢＯ社製）で１：５０００に希釈した。化学発光はＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で検出した。その結果、図９に示すように、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株の培養上清サンプルからＯＶＡタンパク質が検出された。
【0075】
ＥＬＩＳＡ法にはＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株及びＥＦ１α－Ｅｘｏｎ２株を４日間培養した培養上清及びライセートサンプルを供試した。ライセートサンプルはＮｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｋｉｔを用いて調製した。ＥＬＩＳＡ法には、捕捉抗体と検出抗体の２種類の抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用した。捕捉抗体として、Ａｎｔｉ－ＯＶＡＬＢＵＭＩＮ（Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ）（ＲＡＢＢＩＴ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を用いた。捕捉抗体をＰＢＳで１：２０００に希釈し、４℃で一晩、固相化した。ＯＶＡ標準試料は、ＩＴＥＡ Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ） ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＩＴＥＡ社製）のＯＶＡ標準試料を５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６及び０．７８ｎｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈して調製した。
【0076】
検出抗体は、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で標識した抗ＯＶＡウサギ抗体（Ｅｇｇ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｋｉｔ（卵白アルブミン、森永生科学研究所製）を一次抗体用Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１で１：１０００希釈して使用した。基質にはＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ（商標） ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｋｙ Ｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で発色を検出した。ＯＶＡ標準試料から作成した検量線に基づいてＯＶＡ濃度を求めたところ、図１０に示すように、ウエスタンブロット法の結果と一貫して、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株の培養上清サンプルに多くのＯＶＡタンパク質が含まれていることが分かった。
【0077】
５．有用タンパク質遺伝子の導入及び発現解析
ＯＶＡ遺伝子の発現解析により、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株でＯＶＡ遺伝子が高発現していることが明らかになったため、有用タンパク質遺伝子の導入にはＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株を使用した。図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、有用タンパク質として再生医療等で用いられるｈＦＧＦ２をコードするｈＦＧＦ２遺伝子をＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株のＯＶＡ遺伝子座のエクソン１とエクソン２との間にノックインした。ｈＦＧＦ２遺伝子のＯＶＡ遺伝子座へのノックインにもＰＩＴＣｈシステムを使用した。ＰＩＴＣｈシステムで使用するゲノム編集ツールは、ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター、ｈＦＧＦ２遺伝子を含むドナーベクター（ＰＩＴＣｈベクター）及びＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの３種類である。ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターとして、上記のエクソン２編集におけるＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを用いた。
ＯＶＡ遺伝子の発現解析により、ＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株でＯＶＡ遺伝子が高発現していることが明らかになったため、有用タンパク質遺伝子の導入にはＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株を使用した。図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、有用タンパク質として再生医療等で用いられるｈＦＧＦ２をコードするｈＦＧＦ２遺伝子をＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株のＯＶＡ遺伝子座のエクソン１とエクソン２との間にノックインした。ｈＦＧＦ２遺伝子のＯＶＡ遺伝子座へのノックインにもＰＩＴＣｈシステムを使用した。ＰＩＴＣｈシステムで使用するゲノム編集ツールは、ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター、ｈＦＧＦ２遺伝子を含むドナーベクター（ＰＩＴＣｈベクター）及びＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの３種類である。ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターとして、上記のエクソン２編集におけるＯＶＡ遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを用いた。
【0078】
（ｈＦＧＦ２遺伝子を搭載したＰＩＴＣｈベクターの作製）
ＰＩＴＣｈベクターの作製には、図１２に示す、ｐＣＲＩＳ－ＰＩＴＣｈｖ２－ＦＢＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃６３６７２）（Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１６）を使用した。ＰＩＴＣｈベクターはｐＣＲＩＳ－ＰＩＴＣｈｖ２－ＦＢＬのＰＩＴＣｈ ｇＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ内を、図１３に示すようにｈＦＧＦ２－ＮｅｏＲ－ＩＲＥＳに組み換えることで構築した。必要な遺伝子を所定のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ反応後（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、タカラバイオ社製）、コンピテントセルに形質転換した。スモールカルチャー後、プラスミドを抽出し、シークエンス解析を行いｈＦＧＦ２－ＮｅｏＲ－ＩＲＥＳカセットの組込みを確認した。ＰＩＴＣｈベクターの作製のためのプライマーの塩基配列を表２に示す。
ＰＩＴＣｈベクターの作製には、図１２に示す、ｐＣＲＩＳ－ＰＩＴＣｈｖ２－ＦＢＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃６３６７２）（Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１６）を使用した。ＰＩＴＣｈベクターはｐＣＲＩＳ－ＰＩＴＣｈｖ２－ＦＢＬのＰＩＴＣｈ ｇＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ内を、図１３に示すようにｈＦＧＦ２－ＮｅｏＲ－ＩＲＥＳに組み換えることで構築した。必要な遺伝子を所定のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ反応後（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、タカラバイオ社製）、コンピテントセルに形質転換した。スモールカルチャー後、プラスミドを抽出し、シークエンス解析を行いｈＦＧＦ２－ＮｅｏＲ－ＩＲＥＳカセットの組込みを確認した。ＰＩＴＣｈベクターの作製のためのプライマーの塩基配列を表２に示す。
【0079】
【表2】
【0080】
（ＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製）
ＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターには、図１４に示すｐＸ３３０Ｓ－２－ＰＩＴＣｈ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃６３６７０）（Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１６）を使用した。
ＰＩＴＣｈベクターを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターには、図１４に示すｐＸ３３０Ｓ－２－ＰＩＴＣｈ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃６３６７０）（Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１６）を使用した。
【0081】
構築したゲノム編集ツールをＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株に遺伝子導入し、２週間の期間、１００μｇ／ｍＬのネオマイシンによる薬剤選抜を行った。ポリクローナルな細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックＰＣＲに供試した。ｈＦＧＦ２遺伝子のノックイン検出のためのフォワードプライマーＰ８及びリバースプライマーＰ９の塩基配列をそれぞれ配列番号６４及び６５に示す。
【0082】
図１５に示すように、ＥＦ１αプロモーターの下流に、ｈＦＧＦ２がノックインされていることを確認した。その後、限界希釈法により、細胞をモノクローン化し、シークエンス解析を行い、ＯＶＡ遺伝子座の目的位置にｈＦＧＦ２遺伝子がノックインされていることを確認した。
【0083】
モノクローン化により、ＯＶＡ遺伝子座の目的位置にｈＦＧＦ２遺伝子がノックインされている３つの株（クローン番号＃３０、＃４６及び＃５２）を取得した。クローン番号＃３０、＃４６及び＃５２を培養し、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを使用して、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。３つの株におけるスプライシング後の予想配列を図１１Ｃに示す。塩基配列を配列番号６６及び６７にそれぞれ示すフォワードプライマー（Ｆｗｄ１）及びリバースプライマー（Ｒｅｖ１）を使用したＲＴ－ＰＣＲによる増副産物のサイズは２４７２ｂｐである。ＲＴ－ＰＣＲの結果、図１６に示すように、クローン番号＃３０、＃４６及び＃５２においてＯＶＡ遺伝子及びｈＦＧＦ２遺伝子が転写されていることが確認できた。
【0084】
ＯＶＡタンパク質及びｈＦＧＦ２タンパク質がクローン番号＃３０、＃４６及び＃５２において発現しているか否かを調べるため、ＥＬＩＳＡ法を実施した。ＯＶＡタンパク質の検出には、クローン番号＃３０、＃４６及び＃５２を７日間培養した培養上清を供試した。ＦＧＦ２タンパク質の検出には、クローン番号＃３０、＃４６及び＃５２のライセートサンプルを供試した。ライセートサンプルは、Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ２ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ （Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）のプロトコルに従い作製した。図１７及び図１８はそれぞれＯＶＡタンパク質及びｈＦＧＦ２タンパク質の濃度を示す。ＯＶＡタンパク質は培養上清中に３０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれていた。ｈＦＧＦ２タンパク質はライセート中に１２００ｐｇ／ｍｌ～１９００ｐｇ／ｍｌの濃度で含まれていた。
【0085】
［実施例２：オボムコイド（ＯＶＭ）遺伝子座のゲノム編集］
１．ＯＶＭ発現細胞作製のためのベクター構築
ＤＦ－１細胞にゲノム編集を施し、ＯＶＭ発現細胞株を樹立した。具体的には、ＯＶＭ遺伝子上流を標的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用したＰＩＴＣｈシステムによってＥＦ１αプロモーターを挿入することで、ＯＶＭ遺伝子の転写及び翻訳を促す。
１．ＯＶＭ発現細胞作製のためのベクター構築
ＤＦ－１細胞にゲノム編集を施し、ＯＶＭ発現細胞株を樹立した。具体的には、ＯＶＭ遺伝子上流を標的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用したＰＩＴＣｈシステムによってＥＦ１αプロモーターを挿入することで、ＯＶＭ遺伝子の転写及び翻訳を促す。
【0086】
ＯＶＭ発現細胞の樹立では、ＰＩＴＣｈベクターと２種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを作製した。図１９Ａに示すように、ＰＩＴＣｈベクターには、ＥＦ１αプロモーターとマーカー遺伝子及びＰＩＴＣｈシステムに必要なマイクロホモロジー配列を搭載させた。２種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、それぞれＯＶＭ遺伝子の上流とＰＩＴＣｈベクターのマイクロホモロジー配列を標的とする。図１９Ａにおいて下線を付した塩基配列はｇＲＮＡの標的配列を示し、矢印は切断箇所を示す。
【0087】
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築にはｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターを用いた。ＢｐｉＩで線状化したｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターにｇＲＮＡの鋳型となるアニーリングした合成オリゴを挿入することで作製した。合成オリゴのアニーリングの方法について以下で説明する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築にはｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターを用いた。ＢｐｉＩで線状化したｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターにｇＲＮＡの鋳型となるアニーリングした合成オリゴを挿入することで作製した。合成オリゴのアニーリングの方法について以下で説明する。
【0088】
１０×バッファー（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ） １μＬ、１００μＭ センスオリゴ １μＬ、１００μＭ アンチセンスオリゴ １μＬ及び滅菌蒸留水 ７μＬを含むアニーリング溶液を、９５℃で５分間反応させた後、９０分間かけて２５℃まで冷却することで、合成オリゴをアニールした。その後、アニールした合成オリゴを、以下に示す手順でｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターに挿入した。以下にアニーリングオリゴ挿入のための反応液の組成を示す。
ｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９（２５ｎｇ／μＬ） ０．３μＬ
アニーリング済み合成オリゴ ０．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ社製） １．０μＬ
ＢｐｉＩ ０．１μＬ
滅菌蒸留水 ０．１μＬ
ｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９（２５ｎｇ／μＬ） ０．３μＬ
アニーリング済み合成オリゴ ０．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ社製） １．０μＬ
ＢｐｉＩ ０．１μＬ
滅菌蒸留水 ０．１μＬ
【0089】
３７℃で５分、１６℃で１０分の反応を３サイクル行うことで、線状化ベクターにアニーリングオリゴを挿入した。ＯＶＭ遺伝子の上流を標的とする合成オリゴに含まれるセンスオリゴ及びアンチセンスオリゴの塩基配列を、それぞれ配列番号７２及び７３に示す。ＰＩＴＣｈベクターのマイクロホモロジー配列を標的とする合成オリゴに含まれるセンスオリゴ及びアンチセンスオリゴの塩基配列を、それぞれ配列番号７４及び７５に示す。以降ＯＶＭ遺伝子上流を標的としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを、ｐＸ３３０－ＯＶＭ ５’－ＵＴＲ、ＰＩＴＣｈベクターを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをｐＸ３３０－ＥＦ１α ｄｏｎｏｒと表記する。
【0090】
（ＰＩＴＣｈベクターの構築）
ＰＩＴＣｈベクターには強制発現プロモーターであるＥＦ１αプロモーターとピューロマイシン耐性遺伝子が含まれるｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α－ｐｕｒベクターを使用した。ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α－ｐｕｒベクターに、アニーリングした合成オリゴを挿入することによってＰＩＴＣｈベクターを作製した。ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α－ｐｕｒベクターをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、電気泳動した後、切り出し精製を行った。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、アニールさせた合成オリゴとＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α－ｐｕｒベクターをアセンブルした。合成オリゴのアニーリング方法は上記で示した方法と同様の手順で行なった。挿入した合成オリゴに含まれるセンスオリゴ及びアンチセンスオリゴの塩基配列を、それぞれ配列番号７６及び７７に示す。
ＰＩＴＣｈベクターには強制発現プロモーターであるＥＦ１αプロモーターとピューロマイシン耐性遺伝子が含まれるｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α－ｐｕｒベクターを使用した。ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α－ｐｕｒベクターに、アニーリングした合成オリゴを挿入することによってＰＩＴＣｈベクターを作製した。ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α－ｐｕｒベクターをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、電気泳動した後、切り出し精製を行った。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、アニールさせた合成オリゴとＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＢＡｐｏ－ＥＦ１α－ｐｕｒベクターをアセンブルした。合成オリゴのアニーリング方法は上記で示した方法と同様の手順で行なった。挿入した合成オリゴに含まれるセンスオリゴ及びアンチセンスオリゴの塩基配列を、それぞれ配列番号７６及び７７に示す。
【0091】
２．ゲノム編集技術を利用したＯＶＭ発現細胞株の作製
ＤＦ－１細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＫＯ－ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。
ＤＦ－１細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＫＯ－ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。
【0092】
ＤＦ－１細胞を、遺伝子導入直前に６ウェルの培養プレートに１×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入を行った。導入したプラスミドは、上記３種のプラスミド（ＰＩＴＣｈベクター、ｐＸ３３０－ＯＶＭ ５’－ＵＴＲ及びｐＸ３３０－ＥＦ１α ｄｏｎｏｒ）であり、各０．８μｇずつ用いて共導入した。遺伝子導入の２日後からピューロマイシン １．０μｇ／ｍＬによる薬剤選択を１週間行った。薬剤選択後、生存していた細胞からＰｕｒｅｇｅｎｅ ｃｏｒｅ ｋｉｔ Ａ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムを抽出し、生存している細胞集団に目的の変異を有する細胞集団が存在するか否かを判定するためにＰＣＲを行った。フォワードプライマーＦ２をＰＩＴＣｈベクター由来のＥＦ１αプロモーター内に、リバースプライマーＲ２をＤＦ－１細胞ゲノムのＯＶＭ遺伝子本体にそれぞれ設計した（図１９ＢにおけるＦ２及びＲ２）。フォワードプライマーＦ２及びリバースプライマーＲ２の塩基配列をそれぞれ配列番号７８及び７９に示す。フォワードプライマーＦ２及びリバースプライマーＲ２によって、挿入したＰＩＴＣｈベクターの３’側がＯＶＭ遺伝子上流に挿入されているか否かを判定することができる。
【0093】
得られた細胞を、限界希釈によるクローニングによってモノクローナルな状態の細胞集団とした。細胞は、９６ウェルプレート１枚につき５０細胞となるように調製し、播種した。細胞が十分に増殖した後に、細胞を回収しＰｕｒｅｇｅｎｅ ｃｏｒｅ ｋｉｔ Ａ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムを抽出し、フォワードプライマーＦ２及びリバースプライマーＲ２を用いてゲノミックＰＣＲを行った。加えて、挿入したＰＩＴＣｈベクターの外側にフォワードプライマーＦ１を、ＰＩＴＣｈベクター内の配列にリバースプライマーＲ１をそれぞれ設計してゲノミックＰＣＲを行うことでＰＩＴＣｈベクターの５’側も挿入されているか否かを判定した（図１９ＢにおけるＦ１及びＲ１）。フォワードプライマーＦ１及びリバースプライマーＲ１の塩基配列をそれぞれ配列番号８０及び８１に示す。さらに、ＥＦ１αプロモーターが両アレルに挿入されたホモ接合型か片アレルにしか挿入されていないヘテロ接合型かを判定するために、挿入したＰＩＴＣｈベクターの外側にフォワードプライマーＦ３を設計した（図１９ＢにおけるＦ３）。フォワードプライマーＦ３の塩基配列を配列番号８２に示す。
【0094】
図２０Ａ及び図２０Ｂに示すように、クローニングにより得られた細胞株＃２及び細胞株＃３において、５’側及び３’側のつなぎ目を含む領域に設計したプライマーによって目的のＰＣＲ産物の増幅が確認された。図２０Ｃに示されたジェノタイピングの結果、細胞株＃２がＥＦ１αプロモーターヘテロ接合型で、細胞株＃３がＥＦ１αプロモーターホモ接合型であることが判明した。
【0095】
３．ＯＶＭの発現解析
細胞株＃２（ＥＦ１α－ＯＶＭヘテロＤＦ－１細胞株）及び細胞株＃３（ＥＦ１α－ＯＶＭホモＤＦ－１細胞株）を用いて挿入したＥＦ１αプロモーターによるＯＶＭ遺伝子の発現解析を以下のように行った。
細胞株＃２（ＥＦ１α－ＯＶＭヘテロＤＦ－１細胞株）及び細胞株＃３（ＥＦ１α－ＯＶＭホモＤＦ－１細胞株）を用いて挿入したＥＦ１αプロモーターによるＯＶＭ遺伝子の発現解析を以下のように行った。
【0096】
（ｍＲＮＡの検出）
ＥＦ１αプロモーターの導入によりＯＶＭ遺伝子が転写されていることを確認するためにＲＴ－ＰＣＲを行った。野生型ＤＦ－１細胞、細胞株＃２及び細胞株＃３からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成は、それぞれＦａｓｔＧｅｎｅ（商標） ＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をプロトコルにしたがって使用して行った。得られたｃＤＮＡを鋳型としたＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲに使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれＯＶＭ ｍＲＮＡの５’と３’の非翻訳領域に設計した。フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を配列番号８３及び８４に示す。
ＥＦ１αプロモーターの導入によりＯＶＭ遺伝子が転写されていることを確認するためにＲＴ－ＰＣＲを行った。野生型ＤＦ－１細胞、細胞株＃２及び細胞株＃３からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成は、それぞれＦａｓｔＧｅｎｅ（商標） ＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をプロトコルにしたがって使用して行った。得られたｃＤＮＡを鋳型としたＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲに使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれＯＶＭ ｍＲＮＡの５’と３’の非翻訳領域に設計した。フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を配列番号８３及び８４に示す。
【0097】
増幅されたＰＣＲ産物が既知の塩基配列と一致しているか否かを明らかにするためにＰＣＲ産物を鋳型としたダイレクトシークエンスを行った。サイクルシークエンスにはＳｕｐｅｒＤｙｅ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＡｄｖａｎｃｅｄＳｅｑ社製）を使用し、ＳｅｑＳｔｕｄｉｏ（商標） ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて解析した。プライマーには上記のＲＴ－ＰＣＲと同様に、塩基配列が配列番号８３に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号８４に示されるリバースプライマーを使用した。
【0098】
図２１に示すように、ＲＴ－ＰＣＲによって、ＥＦ１αプロモーターがＤＦ－１細胞内在のＯＶＭ遺伝子の転写を促し、ＯＶＭ遺伝子を発現させることがｍＲＮＡレベルで確認された。ダイレクトシークエンスの結果、細胞株＃２及び細胞株＃３におけるＯＶＭ ｍＲＮＡの塩基配列は、ＮＣＢＩに登録されているＯＶＭ ｔｒａｎｓｃｒｐｔ ｖｒｉａｎｔ １（ＮＭ＿０１３０８４９４．２）とほとんど一致しており、アミノ酸配列に影響を及ぼすものではなかった。
【0099】
（ＯＶＭタンパク質の検出及び定量）
ＯＶＭタンパク質は分泌タンパク質であるため、細胞の培養上清に分泌される。培養上清から調製した試料に含まれるＯＶＭタンパク質を検出及び定量することでＯＶＭ遺伝子が翻訳されているか否かを確認することができる。ＯＶＭタンパク質の検出及び定量には、ＯＶＭタンパク質に特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用することができる。
ＯＶＭタンパク質は分泌タンパク質であるため、細胞の培養上清に分泌される。培養上清から調製した試料に含まれるＯＶＭタンパク質を検出及び定量することでＯＶＭ遺伝子が翻訳されているか否かを確認することができる。ＯＶＭタンパク質の検出及び定量には、ＯＶＭタンパク質に特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用することができる。
【0100】
ＯＶＭタンパク質検出のための試料には、野生型ＤＦ－１細胞、細胞株＃２及び細胞株＃３それぞれの培養上清を用いた。各ＤＦ－１細胞株を６ウェルプレートに１×１０６細胞／ウェルで播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で培養した。１週間後の培養上清を回収し、ウエスタンブロット法では、この培養上清を濃縮して試料とした。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、培養上清をＰＢＳで５０倍に希釈して試料とした。培養上清の濃縮にはＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（商標）－ＭＣ ５，０００ ＮＭＷＬ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を使用した。
【0101】
ウエスタンブロット法の陽性対照には１レーンあたり１０ｎｇの精製ＯＶＭを使用した。調製した培養上清試料にＮｕＰＡＧＥ（商標） ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（４×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え、９０℃で１０分間の熱処理を行なった。このサンプルを用いて１５％ポリアクリルアミドゲルによりＳＤＳ－ＰＡＧＥを行なった。泳動にはＣｏｍｐａｃｔ ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社製）のＴｒｉｓ－ｇｌｙ／ＰＡＧＥＬ、Ｈｉｇｈモードを使用し、泳動時間は３０分間とした。ウエスタンブロット法のメンブレンにはメタノールで１０分間の親水性処理したＩｍｍｕｎｏ－Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯＲＡＤ社製）を使用した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行なったゲルとメタノール処理したＩｍｍｕｎｏ－Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅをｂｌｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、５％（ｖ／ｖ）メタノール、０．０１％ＳＤＳ）を用いて１００Ｖ、０．２５Ａ、１時間のブロッティングを行なった。ブロッティングにはＰｏｗｅｒＰａｃ（ＢＩＯＲＡＤ社製）を使用した。
【0102】
ブロッティング後、Ｉｍｍｕｎｏ－Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで洗浄し、ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて４℃で終夜静置し、ブロッキングした。ブロッキングしたＩｍｍｕｎｏ－Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで洗浄した後、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で３０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ＯＶＭマウスモノクローナル抗体（当研究室で作製）を用いて抗体反応を行なった。反応後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ（商標） ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて反応させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ６８０を用いて検出した。
【0103】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、抗原エピトープの異なる２種類の抗体を用いることで定量性を担保した検出が可能となる。上記の方法で調製した各培養上清試料に含まれるＯＶＭタンパク質濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡプレートに固相化抗体として０．５μｇ／ｍＬの抗ＯＶＭウサギポリクローナル抗体（当研究室で作製）を１００μＬ／ウェル加え、４℃で終夜静置した。ブロッキングには２５％Ｂｌｏｃｋ－Ａｃｅ ｉｎ ＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を２００μＬ／ウェル加え、３７℃で２時間インキュベーションした。検量線を作成するための陽性対照として精製ＯＶＭを１００ｎｇ／ｍＬから２倍段階希釈したものを用いた。希釈には１０％Ｂｌｏｃｋ－Ａｃｅ ｉｎ ＰＢＳを使用し、それぞれ１００μＬ／ウェル加えて３７℃で１時間インキュベートした。検出抗体にはＨＲＰ標識された０．５μｇ／ｍＬ抗ＯＶＭマウスモノクローナル抗体（当研究室で作成）を１００μＬ／ウェル加え、３７℃で１時間インキュベートした。ｏ－フェニレンジアミン（ナカライテスク社製）を含む以下の組成の溶液により発色させた。
クエン酸―リン酸バッファー ５ｍＬ
ｏ－フェニレンジアミン ０．００２ｇ
過酸化水素 １μＬ
クエン酸―リン酸バッファー ５ｍＬ
ｏ－フェニレンジアミン ０．００２ｇ
過酸化水素 １μＬ
【0104】
溶液を５０μＬ／ウェルで加え暗所で反応させ、２Ｍ硫酸を５０μＬ／ウェルで加えて反応を止め、ＭＵＬＴＩＳＣＡＮ Ｓｋｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で吸光度４９０ｎｍを測定した。
【0105】
図２２にウエスタンブロット法の結果を示す。ＥＦ１αプロモーターのノックインにより、ＤＦ－１細胞内在のＯＶＭ遺伝子がタンパク質レベルで発現することが確認された。図２３にサンドイッチＥＬＩＳＡ法で定量したＯＶＭ濃度を示す。ＥＦ１αプロモーターホモ接合型である細胞株＃３の培養上清に含まれるＯＶＭ濃度は、ＥＦ１αプロモーターヘテロ接合型である細胞株＃２と比較して２倍以上高く、ＯＶＭタンパク質の発現がＥＦ１αプロモーターに依存的であることが示された。
【0106】
３．有用タンパク質遺伝子の導入及び発現解析
ＯＶＭ発現ＤＦ－１細胞のＯＶＭ開始コドン以降に、発現させたい遺伝子カセットを挿入することで、ＯＶＭ遺伝子の機能的なノックアウトが可能であるかを検討した。置き換える遺伝子カセットには、図２４に示すように、ｈＦＧＦ２遺伝子とマーカー遺伝子（ＺｅｏＲ及び緑色蛍光タンパク質であるＥＧＦＰ）が含まれる。標的とするＯＶＭ遺伝子への遺伝子カセットの挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用したＰＩＴＣｈシステムにより行なった。作製したＰＩＴＣｈベクター及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをそれぞれＰＩＴＣｈ－ＯＶＭ及びｐＸ３３０－ＯＶＭと以下では表記する。
ＯＶＭ発現ＤＦ－１細胞のＯＶＭ開始コドン以降に、発現させたい遺伝子カセットを挿入することで、ＯＶＭ遺伝子の機能的なノックアウトが可能であるかを検討した。置き換える遺伝子カセットには、図２４に示すように、ｈＦＧＦ２遺伝子とマーカー遺伝子（ＺｅｏＲ及び緑色蛍光タンパク質であるＥＧＦＰ）が含まれる。標的とするＯＶＭ遺伝子への遺伝子カセットの挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用したＰＩＴＣｈシステムにより行なった。作製したＰＩＴＣｈベクター及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをそれぞれＰＩＴＣｈ－ＯＶＭ及びｐＸ３３０－ＯＶＭと以下では表記する。
【0107】
（ｐＸ３３０－ＯＶＭの構築）
ｐＸ３３０－ＯＶＭの構築にはｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターを用いた。上記の方法と同様にしてＢｐｉＩで線状化したｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターにｇＲＮＡの鋳型となるアニーリングした合成オリゴを挿入することで作製した。ここで使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＯＶＭ遺伝子の開始コドン下流の、図２４において下線で示された塩基配列を標的とした。挿入した合成オリゴに含まれるセンスオリゴ及びアンチセンスオリゴの塩基配列を、それぞれ配列番号９０及び９１に示す。
ｐＸ３３０－ＯＶＭの構築にはｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターを用いた。上記の方法と同様にしてＢｐｉＩで線状化したｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＢＢ－ＣＢｈ－ＳｐＣａｓ９ベクターにｇＲＮＡの鋳型となるアニーリングした合成オリゴを挿入することで作製した。ここで使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＯＶＭ遺伝子の開始コドン下流の、図２４において下線で示された塩基配列を標的とした。挿入した合成オリゴに含まれるセンスオリゴ及びアンチセンスオリゴの塩基配列を、それぞれ配列番号９０及び９１に示す。
【0108】
（ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭの構築）
ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭでは、ｈＦＧＦ２遺伝子及びマーカー遺伝子がマイクロホモロジー配列に挟まれて搭載されている。図２４に示すように、マイクロホモロジー配列には、ＯＶＭ遺伝子の開始コドン直前の１６ｂｐとエクソン１の終わりからイントロンを含む２１ｂｐとを用いた。また、マイクロホモロジー配列の外側に上記で作製したｐＸ３３０－ＯＶＭの標的配列及びＰＡＭ配列を付加しており、１種類のＣＲＩＳＰＰＲ／Ｃａｓ９ベクターにより、ゲノムとＰＩＴＣｈ－ＯＶＭとを切断することができる。ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭの作製にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を使用した。
ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭでは、ｈＦＧＦ２遺伝子及びマーカー遺伝子がマイクロホモロジー配列に挟まれて搭載されている。図２４に示すように、マイクロホモロジー配列には、ＯＶＭ遺伝子の開始コドン直前の１６ｂｐとエクソン１の終わりからイントロンを含む２１ｂｐとを用いた。また、マイクロホモロジー配列の外側に上記で作製したｐＸ３３０－ＯＶＭの標的配列及びＰＡＭ配列を付加しており、１種類のＣＲＩＳＰＰＲ／Ｃａｓ９ベクターにより、ゲノムとＰＩＴＣｈ－ＯＶＭとを切断することができる。ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭの作製にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を使用した。
【0109】
（ＯＶＭ発現細胞へのゲノム編集）
作製した上記のベクター２種（ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭ及びｐＸ３３０－ＯＶＭ）を用いて細胞株＃２及び細胞株＃３のゲノム編集を行った。細胞株＃２及び細胞株＃３を、遺伝子導入直前に６ウェルの培養プレートに１×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて遺伝子導入を行った。遺伝子導入２日後からゼオシン ２００μｇ／ｍＬによる薬剤選択を１週間行った。薬剤選択後、生存していた細胞からＰｕｒｅｇｅｎｅ ｃｏｒｅ ｋｉｔ Ａ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムを抽出し、生存している細胞集団に目的の変異を有する細胞集団が存在するか否かを判定するためのＰＣＲを行った。図２５に示すように、ＯＶＭ発現細胞のゲノムに由来するＥＦ１αプロモーター内に対して設計したフォワードプライマーＦ４及びＰＩＴＣｈ－ＯＶＭベクター内に対して設計したリバースプライマーＲ３を用いてＰＣＲを行うことで、ＥＦ１αプロモーターが挿入されたアレルにＰＩＴＣｈ－ＯＶＭが挿入されているかを判定することができる。フォワードプライマーＦ４及びリバースプライマーＲ３の塩基配列をそれぞれ配列番号９２及び９３に示す。
作製した上記のベクター２種（ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭ及びｐＸ３３０－ＯＶＭ）を用いて細胞株＃２及び細胞株＃３のゲノム編集を行った。細胞株＃２及び細胞株＃３を、遺伝子導入直前に６ウェルの培養プレートに１×１０６細胞／ウェルとなるように播種し、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて遺伝子導入を行った。遺伝子導入２日後からゼオシン ２００μｇ／ｍＬによる薬剤選択を１週間行った。薬剤選択後、生存していた細胞からＰｕｒｅｇｅｎｅ ｃｏｒｅ ｋｉｔ Ａ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムを抽出し、生存している細胞集団に目的の変異を有する細胞集団が存在するか否かを判定するためのＰＣＲを行った。図２５に示すように、ＯＶＭ発現細胞のゲノムに由来するＥＦ１αプロモーター内に対して設計したフォワードプライマーＦ４及びＰＩＴＣｈ－ＯＶＭベクター内に対して設計したリバースプライマーＲ３を用いてＰＣＲを行うことで、ＥＦ１αプロモーターが挿入されたアレルにＰＩＴＣｈ－ＯＶＭが挿入されているかを判定することができる。フォワードプライマーＦ４及びリバースプライマーＲ３の塩基配列をそれぞれ配列番号９２及び９３に示す。
【0110】
得られた細胞を、限界希釈によるクローニングによって、モノクローナルな状態の細胞集団とした。細胞を９６ウェルプレート１枚につき５０細胞となるように調製し、播種した。細胞が十分に増殖した後に、細胞を回収しＰｕｒｅｇｅｎｅ ｃｏｒｅ ｋｉｔ Ａ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムを抽出し、フォワードプライマーＦ４及びリバースプライマーＲ３を用いてゲノミックＰＣＲを行った。さらに、図２５に示したように、挿入したＰＩＴＣ－ＯＶＭ内に対して設計したフォワードプライマーＦ５、及びＰＩＴＣｈ－ＯＶＭの３’側のＯＶＭ遺伝子内に対して設計されたリバースプライマーＲ４を用いてゲノミックＰＣＲを行うことでＰＩＴＣｈ－ＯＶＭの３’側に正確に挿入されているか否かを判定した。フォワードプライマーＦ５及びリバースプライマーＲ４の塩基配列をそれぞれ配列番号９４及び９５に示す。さらに、ＥＦ１αプロモーターが挿入されたアレルにＰＩＴＣｈ－ＯＶＭの全長が挿入されていることを確認するために、フォワードプライマーＦ２と、図２５に示すようにＰＩＴＣ－ＯＶＭの３’側のＯＶＭ遺伝子に対して設計されたリバースプライマーＲ５を用いてＰＣＲを行うことで、ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭがＥＦ１αプロモーターホモ接合型である細胞株＃３の両アレルに挿入されたホモ接合型か片アレルにしか挿入されていないヘテロ接合型かを判定することができる。リバースプライマーＲ５の塩基配列を配列番号９６に示す。
【0111】
図２６Ａ及び図２６Ｂに示すように、クローニングにより得られた細胞株＃２－３及び細胞株＃３－４において、５’側及び３’側のつなぎ目を含む領域に設計したプライマーによって目的のＰＣＲ産物の増幅が確認された。図２６Ｃに示されたジェノタイピングの結果、細胞株＃２－３及び細胞株＃３－４において、ｈＦＧＦ２カセットが挿入されていることを確認した。
【0112】
（タンパク質の検出及び定量）
細胞株＃２－３及び細胞株＃３－４はそれぞれ、ＥＦ１αプロモーターが挿入されたアレルのＯＶＭ遺伝子にＰＩＴＣｈ－ＯＶＭが挿入されている。これらの細胞株においてＯＶＭ遺伝子が機能的にノックアウトされ、ＯＶＭタンパク質の分泌能が欠損しているか、各細胞株の培養上清を用いて調べた。ＯＶＭタンパク質は分泌タンパク質であるため、ＯＶＭ発現細胞株である細胞株＃２及び細胞株＃３ではＯＶＭタンパク質が細胞培養上清に分泌される。したがって、ＯＶＭ遺伝子に加えた改変が機能的なノックアウトに寄与しているかは、細胞培養上清を用いてウエスタンブロット法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行うことで確認することができる。
細胞株＃２－３及び細胞株＃３－４はそれぞれ、ＥＦ１αプロモーターが挿入されたアレルのＯＶＭ遺伝子にＰＩＴＣｈ－ＯＶＭが挿入されている。これらの細胞株においてＯＶＭ遺伝子が機能的にノックアウトされ、ＯＶＭタンパク質の分泌能が欠損しているか、各細胞株の培養上清を用いて調べた。ＯＶＭタンパク質は分泌タンパク質であるため、ＯＶＭ発現細胞株である細胞株＃２及び細胞株＃３ではＯＶＭタンパク質が細胞培養上清に分泌される。したがって、ＯＶＭ遺伝子に加えた改変が機能的なノックアウトに寄与しているかは、細胞培養上清を用いてウエスタンブロット法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行うことで確認することができる。
【0113】
上記と同様に、ヘテロ接合型の細胞株＃２－３及びホモ接合型の細胞株＃３－４の培養上清に含まれるＯＶＭタンパク質をウエスタンブロット法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法で検出及び定量した。図２７に示すように、ウエスタンブロット法において、細胞株＃２－３及び細胞株＃３－４の培養上清にＯＶＭタンパク質が分泌されないことを確認した。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、図２８に示すように、細胞株＃２－３及び細胞株＃３－４において培養上清中に含まれるＯＶＭタンパク質の濃度が野生型ＤＦ－１と同様に検出限界以下であった。よって、ＰＩＴＣｈ－ＯＶＭをノックインすることで細胞株＃２－３及び細胞株＃３－４ではＯＶＭ遺伝子がノックアウトされたことが示された。
【0114】
［実施例３：ＯＶＡ遺伝子座のゲノム編集］
１．ゲノム編集ツールの構築
本実施例では、実施例１に示したＯＶＡ遺伝子座のエクソン１とエクソン２との間へのｈＦＧＦ２遺伝子のノックインと同様に、エクソン８の下流にｈＦＧＦ２遺伝子をノックインした。本実施例では、ＯＶＡ遺伝子とｈＦＧＦ２遺伝子との間に２ＡペプチドとしてＴ２Ａをコードする領域を挿入した。ＯＶＡ遺伝子座のエクソン８の下流へのノックインには相同組み換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＨＲ）を利用した。ＨＲによるノックインで使用したゲノム編集ツールは、ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＴＡＬＥＮ発現ベクター２種類（Ｌｅｆｔ及びＲｉｇｈｔ）とｈＦＧＦ２遺伝子を含むドナーベクターとである。
１．ゲノム編集ツールの構築
本実施例では、実施例１に示したＯＶＡ遺伝子座のエクソン１とエクソン２との間へのｈＦＧＦ２遺伝子のノックインと同様に、エクソン８の下流にｈＦＧＦ２遺伝子をノックインした。本実施例では、ＯＶＡ遺伝子とｈＦＧＦ２遺伝子との間に２ＡペプチドとしてＴ２Ａをコードする領域を挿入した。ＯＶＡ遺伝子座のエクソン８の下流へのノックインには相同組み換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＨＲ）を利用した。ＨＲによるノックインで使用したゲノム編集ツールは、ＯＶＡ遺伝子座を標的とするＴＡＬＥＮ発現ベクター２種類（Ｌｅｆｔ及びＲｉｇｈｔ）とｈＦＧＦ２遺伝子を含むドナーベクターとである。
【0115】
（ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製）
図２９に示すＯＶＡ遺伝子座のエクソン８の標的配列に基づいて、２種類のＴＡＬＥＮ発現ベクターを構築した。
図２９に示すＯＶＡ遺伝子座のエクソン８の標的配列に基づいて、２種類のＴＡＬＥＮ発現ベクターを構築した。
【0116】
（ｈＦＧＦ２遺伝子を搭載したドナーベクターの作製）
ドナーベクターの作製に利用したｐＣＲ２．１（商標）－ＴＯＰＯ（商標）ＴＡベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のベクターのマップを図３０に示す。まず、所定のプライマーを使用して、ＯＶＡ遺伝子座の標的配列付近約１０００ｂｐを相同配列としてｐＣＲ２．１（商標）－ＴＯＰＯ（商標）ＴＡベクターにクローニングした。その後、Ｔ２Ａ－ｈＦＧＦ２－ＰｕｒｏＲを所定のプライマーにより増幅し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ反応後、コンピテントセルに形質転換した。さらに、ＰｕｒｏＲをＮｅｏＲに変更するため、再度Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ反応を行い、コンピテントセルに形質転換した。スモールカルチャー後、プラスミドを抽出し、ＢｇｌＩＩで処理し、鎖状化した。ＢｇｌＩＩで処理する前のドナーベクターのマップを図３１に示す。ドナーベクターの作製に使用したプライマーの塩基配列を表３に示す。
ドナーベクターの作製に利用したｐＣＲ２．１（商標）－ＴＯＰＯ（商標）ＴＡベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のベクターのマップを図３０に示す。まず、所定のプライマーを使用して、ＯＶＡ遺伝子座の標的配列付近約１０００ｂｐを相同配列としてｐＣＲ２．１（商標）－ＴＯＰＯ（商標）ＴＡベクターにクローニングした。その後、Ｔ２Ａ－ｈＦＧＦ２－ＰｕｒｏＲを所定のプライマーにより増幅し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ反応後、コンピテントセルに形質転換した。さらに、ＰｕｒｏＲをＮｅｏＲに変更するため、再度Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ反応を行い、コンピテントセルに形質転換した。スモールカルチャー後、プラスミドを抽出し、ＢｇｌＩＩで処理し、鎖状化した。ＢｇｌＩＩで処理する前のドナーベクターのマップを図３１に示す。ドナーベクターの作製に使用したプライマーの塩基配列を表３に示す。
【0117】
【表3】
【0118】
２．有用タンパク質遺伝子の導入
構築したゲノム編集ツールを実施例１で得たＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株に遺伝子導入し、２週間の期間、１００μｇ／ｍＬのネオマイシンによる薬剤選抜を行った。ポリクローナルな細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックＰＣＲに供試した。ｈＦＧＦ２遺伝子のノックイン検出のためのフォワードプライマーＰ１０及びリバースプライマーＰ１１の位置を図３２Ｂに示す。フォワードプライマーＰ１０及びリバースプライマーＰ１１の塩基配列をそれぞれ配列番号１１３及び１１４に示す。その後、限界希釈法により、細胞をモノクローン化し、ゲノミックＰＣＲに供試した。
構築したゲノム編集ツールを実施例１で得たＥＦ１α－Ｅｘｏｎ１株に遺伝子導入し、２週間の期間、１００μｇ／ｍＬのネオマイシンによる薬剤選抜を行った。ポリクローナルな細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックＰＣＲに供試した。ｈＦＧＦ２遺伝子のノックイン検出のためのフォワードプライマーＰ１０及びリバースプライマーＰ１１の位置を図３２Ｂに示す。フォワードプライマーＰ１０及びリバースプライマーＰ１１の塩基配列をそれぞれ配列番号１１３及び１１４に示す。その後、限界希釈法により、細胞をモノクローン化し、ゲノミックＰＣＲに供試した。
【0119】
図３３に示すように、クローン番号＃１及び＃８においてＯＶＡ遺伝子座のエクソン８にｈＦＧＦ２遺伝子がノックインされていることを確認した。さらに、片アレルに存在するＥＦ１αプロモーターの下流にｈＦＧＦ２遺伝子がノックインされていることを調べるために、図３２Ｂに位置を示すフォワードプライマーＰ１２及びリバースプライマーＰ１３を使用したゲノミックＰＣＲを行った。Ｐ１２及びＰ１３の塩基配列を配列番号１１５及び１１６に示す。図３４に示すように、ｈＦＧＦ２遺伝子のノックインが確認されたクローン番号＃１及び＃８の内、クローン番号＃８においてＥＦ１αプロモーター下流へのノックインが確認された。クローン番号＃８をシークエンス解析に供試したところ、ＯＶＡ遺伝子座の目的位置にｈＦＧＦ２遺伝子がノックインされていることが確認された。
【0120】
クローン番号＃８と同様に、クローン番号＃２３及び＃２６においても、ＯＶＡ遺伝子座の目的位置にｈＦＧＦ２遺伝子がノックインされていることが確認された。３つの株（クローン番号＃８、＃２３及び＃２６）を培養し、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを使用して、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。３つの株におけるスプライシング後の予想配列を図３２Ｃに示す。塩基配列を配列番号１１７及び１１８にそれぞれ示すフォワードプライマー（Ｆｗｄ２）及びリバースプライマー（Ｒｅｖ２）を使用したＲＴ－ＰＣＲによる増副産物のサイズは６１３ｂｐである。ＲＴ－ＰＣＲの結果、図３５に示すように、クローン番号＃８、＃２３及び＃２６においてＯＶＡ遺伝子及びｈＦＧＦ２遺伝子が転写されていることが確認できた。
【0121】
ＯＶＡタンパク質及びｈＦＧＦ２タンパク質がクローン番号＃８、＃２３及び＃２６において発現しているか否かを調べるため、ＥＬＩＳＡ法を実施した。ＯＶＡタンパク質の検出には、クローン番号＃８、＃２３及び＃２６を７日間培養した培養上清を供試した。ＦＧＦ２タンパク質にはクローン番号＃８、＃２３及び＃２６のライセートサンプルを供試した。ライセートサンプルは、Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ２ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）のプロトコルに従い作製した。図３６及び図３７はそれぞれＯＶＡタンパク質及びｈＦＧＦ２タンパク質の濃度を示す。ＯＶＡタンパク質は培養上清中に８０ｎｇ／ｍｌ～３９０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれていた。ｈＦＧＦ２タンパク質はライセート中に５２０ｐｇ／ｍｌ～１５００ｐｇ／ｍｌの濃度で含まれていた。
【0122】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【0123】
本発明は、バイオリアクターの評価系及びバイオリアクターの構築に好適である。
【符号の説明】
【0124】
１，２ マーカー遺伝子
３，４ 卵内タンパク質遺伝子座
５，６ 外来プロモーター配列
７，８ 外来遺伝子
３，４ 卵内タンパク質遺伝子座
５，６ 外来プロモーター配列
７，８ 外来遺伝子
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【配列表】