(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024118072
(43)【公開日】2024-08-30
(54)【発明の名称】細胞培養方法および細胞培養装置
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20240823BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20240823BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20240823BHJP
C12N 5/0775 20100101ALN20240823BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 A
C12M3/00 A
C12N5/071
C12N5/0775
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023024255
(22)【出願日】2023-02-20
(71)【出願人】
【識別番号】000253019
【氏名又は名称】澁谷工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100156199
【弁理士】
【氏名又は名称】神崎 真
(74)【代理人】
【識別番号】100124497
【弁理士】
【氏名又は名称】小倉 洋樹
(72)【発明者】
【氏名】米田 健二
(72)【発明者】
【氏名】越田 一朗
(72)【発明者】
【氏名】永井 寛之
(72)【発明者】
【氏名】牧畠 亮太
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029AA21
4B029BB01
4B029BB11
4B029CC11
4B029DA01
4B029DF05
4B029DF09
4B029DG06
4B029GA01
4B065AA90X
4B065BC20
4B065BC41
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】 内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場を用いた細胞培養において、より効率的な培養を行う。
【解決手段】 内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場２に細胞を播種し、当該細胞の播種された培養用足場２を培養容器３に収容した培地Ｍに浸漬させて、上記細胞を培養する細胞培養方法および細胞培養装置１に関する。
上記培養用足場２は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成されている。
細胞を培養する際、上記細胞の播種された上記培養用足場２を厚さ方向に圧縮し、圧縮した状態で培養用足場２を培地Ｍに浸漬させて繊維に細胞を接着させて培養する。
その後、上記培養用足場２の圧縮量を低減させて、厚さ方向に復元した状態で培養用足場２を培地Ｍに浸漬させて培養を継続する。
【選択図】 図６
【解決手段】 内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場２に細胞を播種し、当該細胞の播種された培養用足場２を培養容器３に収容した培地Ｍに浸漬させて、上記細胞を培養する細胞培養方法および細胞培養装置１に関する。
上記培養用足場２は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成されている。
細胞を培養する際、上記細胞の播種された上記培養用足場２を厚さ方向に圧縮し、圧縮した状態で培養用足場２を培地Ｍに浸漬させて繊維に細胞を接着させて培養する。
その後、上記培養用足場２の圧縮量を低減させて、厚さ方向に復元した状態で培養用足場２を培地Ｍに浸漬させて培養を継続する。
【選択図】 図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場に細胞を播種し、当該細胞の播種された培養用足場を培養容器に収容した培地に浸漬させて細胞を培養する細胞培養方法において、
上記培養用足場は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成され、
細胞を培養する際、上記細胞の播種された培養用足場を厚さ方向に圧縮し、圧縮した状態で培養用足場を培地に浸漬させて繊維に細胞を接着させて培養し、
その後、上記培養用足場の圧縮量を低減させて、厚さ方向に復元した状態で培養用足場を培地に浸漬させて培養を継続することを特徴とする細胞培養方法。
上記培養用足場は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成され、
細胞を培養する際、上記細胞の播種された培養用足場を厚さ方向に圧縮し、圧縮した状態で培養用足場を培地に浸漬させて繊維に細胞を接着させて培養し、
その後、上記培養用足場の圧縮量を低減させて、厚さ方向に復元した状態で培養用足場を培地に浸漬させて培養を継続することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項2】
上記培養用足場に細胞を播種する際、
上記培養用足場に細胞懸濁液を浸透させ、
その後上記培養用足場を圧縮して、細胞懸濁液を培養用足場の細部に行き渡らせることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
上記培養用足場に細胞懸濁液を浸透させ、
その後上記培養用足場を圧縮して、細胞懸濁液を培養用足場の細部に行き渡らせることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項3】
上記培養用足場で細胞を培養する際、
上記培養用足場の圧縮量の低減に伴って、上記培養容器に収容する培地の量を増加することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞培養方法。
上記培養用足場の圧縮量の低減に伴って、上記培養容器に収容する培地の量を増加することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項4】
上記培養用足場で細胞を培養する際、
上記培養用足場を、圧縮した状態を維持したまま浸漬させた培地から取り出し、再び培地に浸漬させて培養を継続することを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の細胞培養方法。
上記培養用足場を、圧縮した状態を維持したまま浸漬させた培地から取り出し、再び培地に浸漬させて培養を継続することを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項5】
上記培養用足場の圧縮量を低減して、圧縮しない状態で培養を行った後に、上記培養容器に収容する培地の量を増加させて、再び圧縮しない状態で培養を行うことを特徴とする請求項３に記載の細胞培養方法。
【請求項6】
内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場に細胞を播種し、当該細胞の播種された培養用足場を培養容器に収容した培地に浸漬させて細胞を培養する細胞培養装置において、
上記培養用足場は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成され、
上記培養用足場を培養容器の内部で圧縮する圧縮手段を設け、
上記圧縮手段は、上記培養用足場に播種された細胞を培養する際、上記培養用足場を圧縮した状態を維持することを特徴とする細胞培養装置。
上記培養用足場は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成され、
上記培養用足場を培養容器の内部で圧縮する圧縮手段を設け、
上記圧縮手段は、上記培養用足場に播種された細胞を培養する際、上記培養用足場を圧縮した状態を維持することを特徴とする細胞培養装置。
【請求項7】
上記圧縮手段による上記培養用足場の圧縮量を変更可能としたことを特徴とする請求項６に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は細胞培養方法および細胞培養装置に関し、詳しくは内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場で細胞を培養する細胞培養方法および細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、細胞の培養方法には様々な方法が知られているが、たとえば内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場で細胞を培養するものが知られている（特許文献１）。
上記特許文献１では、上記培養用足場として不織布や多孔質膜などの内部に液体が浸透するシート状の培養用足場を用いており、これらのシート状の培養用足場を培養容器に収容された培地に浸漬させることで、培養用足場の内部に培地が浸透して内部で細胞が培養されるようになっている。
また上記特許文献１では、１枚のシート状の培養用足場においてある程度細胞が培養されると、細胞を培養している培養用足場に新たなシート状の培養用足場を密着させて、細胞を継代させることにより培養を継続するようになっている。
上記特許文献１では、上記培養用足場として不織布や多孔質膜などの内部に液体が浸透するシート状の培養用足場を用いており、これらのシート状の培養用足場を培養容器に収容された培地に浸漬させることで、培養用足場の内部に培地が浸透して内部で細胞が培養されるようになっている。
また上記特許文献１では、１枚のシート状の培養用足場においてある程度細胞が培養されると、細胞を培養している培養用足場に新たなシート状の培養用足場を密着させて、細胞を継代させることにより培養を継続するようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特許第６５０２３９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ここで、上記特許文献１で用いられるようなシート状の培養用足場を用いる場合、培養用足場の厚さを厚く設定すれば内部に多くの細胞を取り込むことができることから、より多くの細胞を培養することが期待できる。
しかしながら、細胞を培養するためには上記培養用足場を培地に浸漬させなければならないが、細胞を播種した直後は培養用足場における細胞密度が小さく、内部に保持している細胞の数に対して過剰な培地を使用することとなるため、培地のロスが大きいという問題が生じる。
また特許文献１では、細胞の培養された培養用足場に新たなシート状の培養用足場を密着させて継代を行っているが、その作業が煩雑であった。
このような問題に鑑み、本発明は内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場を用いて細胞を培養する場合において、培地の使用量を抑えるとともに継代操作を簡略化することが可能であり、より効率的に培養を行うことが可能な細胞培養方法および細胞培養装置を提供するものである。
しかしながら、細胞を培養するためには上記培養用足場を培地に浸漬させなければならないが、細胞を播種した直後は培養用足場における細胞密度が小さく、内部に保持している細胞の数に対して過剰な培地を使用することとなるため、培地のロスが大きいという問題が生じる。
また特許文献１では、細胞の培養された培養用足場に新たなシート状の培養用足場を密着させて継代を行っているが、その作業が煩雑であった。
このような問題に鑑み、本発明は内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場を用いて細胞を培養する場合において、培地の使用量を抑えるとともに継代操作を簡略化することが可能であり、より効率的に培養を行うことが可能な細胞培養方法および細胞培養装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
すなわち請求項１の発明にかかる細胞培養方法は、内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場に細胞を播種し、当該細胞の播種された培養用足場を培養容器に収容した培地に浸漬させて細胞を培養する細胞培養方法において、
上記培養用足場は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成され、
細胞を培養する際、上記細胞の播種された培養用足場を厚さ方向に圧縮し、圧縮した状態で培養用足場を培地に浸漬させて繊維に細胞を接着させて培養し、
その後、上記培養用足場の圧縮量を低減させて、厚さ方向に復元した状態で培養用足場を培地に浸漬させて培養を継続することを特徴としている。
また請求項６の発明にかかる細胞培養装置は、内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場に細胞を播種し、当該細胞の播種された培養用足場を培養容器に収容した培地に浸漬させて細胞を培養する細胞培養装置において、
上記培養用足場は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成され、
上記培養用足場を培養容器の内部で圧縮する圧縮手段を設け、
上記圧縮手段は、上記培養用足場に播種された細胞を培養する際、上記培養用足場を圧縮した状態を維持した状態を維持することを特徴としている。
上記培養用足場は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成され、
細胞を培養する際、上記細胞の播種された培養用足場を厚さ方向に圧縮し、圧縮した状態で培養用足場を培地に浸漬させて繊維に細胞を接着させて培養し、
その後、上記培養用足場の圧縮量を低減させて、厚さ方向に復元した状態で培養用足場を培地に浸漬させて培養を継続することを特徴としている。
また請求項６の発明にかかる細胞培養装置は、内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場に細胞を播種し、当該細胞の播種された培養用足場を培養容器に収容した培地に浸漬させて細胞を培養する細胞培養装置において、
上記培養用足場は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成され、
上記培養用足場を培養容器の内部で圧縮する圧縮手段を設け、
上記圧縮手段は、上記培養用足場に播種された細胞を培養する際、上記培養用足場を圧縮した状態を維持した状態を維持することを特徴としている。
【発明の効果】
【0006】
上記発明によれば、培養用足場を繊維によって構成するとともに、厚さ方向に弾性変形可能なものとしているため、細胞の播種された培養用足場を圧縮させることで、培養用足場の全体を浸漬させるために必要な培地の量を少なくすることができる。
また、培養が進行して細胞が増殖したら、培養用足場の圧縮量を低減させれば培養用足場が厚さ方向に復元して容積が拡大するため、特許文献１のように新たな培養用足場に細胞を継代させる必要がなく、継代操作を簡略化させることができる。
また、培養が進行して細胞が増殖したら、培養用足場の圧縮量を低減させれば培養用足場が厚さ方向に復元して容積が拡大するため、特許文献１のように新たな培養用足場に細胞を継代させる必要がなく、継代操作を簡略化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】第１実施形態にかかる細胞培養装置の構成図
【図2】細胞培養方法を説明するフロー図
【図3】懸濁液供給作業を説明する図
【図4】分散作業、接着作業を説明する図
【図5】培地供給作業を説明する図
【図6】圧縮培養を説明する図
【図7】圧縮しない状態での培養を説明する図
【図8】最終培養を説明する図
【図9】各回収工程を説明する図
【図10】第２実施形態にかかる細胞培養装置の構成図
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下、図示実施形態について説明すると、図１は細胞の培養を行う細胞培養装置１を示しており、当該細胞培養装置１は培養に適した環境に維持された図示しないインキュベータ内に設置されている。
上記細胞培養装置１は、内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場２を用いて細胞の培養を行うようになっており、当該培養用足場２は培養容器３に収容された培地Ｍに浸漬されるようになっている。
上記培養容器３は、培地Ｍを収容可能な外容器３Ａと、当該外容器３Ａの内部に収容されるとともに、上記培養用足場２を収容する内容器３Ｂとから構成されている。
そして上記細胞培養装置１は、上記培養容器３の外容器３Ａを昇降させる外容器昇降手段４と、上記内容器３Ｂを所定の高さに支持する内容器支持手段５と、上記培養容器３内の培養用足場２を圧縮する圧縮手段６とから構成され、これらはコンピュータなどからなる図示しない制御手段によって制御されるようになっている。
本実施形態において培養する細胞は、間葉系幹細胞であって足場依存性の接着細胞であり、上記培養用足場２を構成する繊維に接着した状態で増殖する性質を有している。
上記細胞培養装置１は、内部に液体が浸透するよう構成された培養用足場２を用いて細胞の培養を行うようになっており、当該培養用足場２は培養容器３に収容された培地Ｍに浸漬されるようになっている。
上記培養容器３は、培地Ｍを収容可能な外容器３Ａと、当該外容器３Ａの内部に収容されるとともに、上記培養用足場２を収容する内容器３Ｂとから構成されている。
そして上記細胞培養装置１は、上記培養容器３の外容器３Ａを昇降させる外容器昇降手段４と、上記内容器３Ｂを所定の高さに支持する内容器支持手段５と、上記培養容器３内の培養用足場２を圧縮する圧縮手段６とから構成され、これらはコンピュータなどからなる図示しない制御手段によって制御されるようになっている。
本実施形態において培養する細胞は、間葉系幹細胞であって足場依存性の接着細胞であり、上記培養用足場２を構成する繊維に接着した状態で増殖する性質を有している。
【0009】
上記培養用足場２は繊維によって構成されるとともに、厚さ方向に弾性変形可能に構成されたものとなっている。ここで厚さ方向に弾性変形可能とは、所定の厚さを有する培養用足場２を厚さ方向に圧縮した後、当該圧縮力を解放した際に厚さ方向に復元する性質を指している。
また本実施形態の培養用足場２は、厚さ１～３ｍｍで直径が１５ｃｍ程度の円盤状の足場シート２ａを１０～２０枚程度積層させたものとなっており、上記足場シート２ａとしては、伸縮性を有さない繊維を用いた一般的なダブルラッセル構造のシートを用いることができる。
上記ダブルラッセル構造の足場シート２ａは、２ｍｍ程度の開口が形成されたラッセル編みによる２枚の編物を作製し、これら２枚の編物を多数の縦糸で連結することにより得ることができる。これら編物や縦糸は、太さが１０～１００μｍのＰＥＴ等のポリエステル繊維からなる糸を使用している。
このようなダブルラッセル構造を有した足場シート２ａは、ラッセル編みにより形成された多数の開口や編目、２枚の編物と編物との間に設けられた多数の縦糸の間に形成される空間や間隙により、内部に液体が浸透するようになっており、また上記多数の縦糸によって厚さ方向に弾性変形する性質を有したものとなっている。そして、これらダブルラッセル構造からなる足場シート２ａの編物や縦糸の繊維に細胞を接着させるようにしている。
一方、上記足場シート２ａに伸縮性を有さない繊維を使用していることで、シート２ａが厚さ方向に弾性変形しても繊維自体は伸縮せず、当該繊維に接着した細胞が脱落しないようにすることができる。
なお、上記足場シート２ａの厚さや直径は本実施形態の寸法に限るものではなく、さらには上記培養用足場２としては、細胞培養に適した厚さや大きさを有し厚さ方向に弾性変形可能であれば、上記ダブルラッセル構造を有した足場シート２ａ以外を用いてもよく、また必ずしも複数枚の足場シート２ａを積層させる必要もない。
また本実施形態の培養用足場２は、厚さ１～３ｍｍで直径が１５ｃｍ程度の円盤状の足場シート２ａを１０～２０枚程度積層させたものとなっており、上記足場シート２ａとしては、伸縮性を有さない繊維を用いた一般的なダブルラッセル構造のシートを用いることができる。
上記ダブルラッセル構造の足場シート２ａは、２ｍｍ程度の開口が形成されたラッセル編みによる２枚の編物を作製し、これら２枚の編物を多数の縦糸で連結することにより得ることができる。これら編物や縦糸は、太さが１０～１００μｍのＰＥＴ等のポリエステル繊維からなる糸を使用している。
このようなダブルラッセル構造を有した足場シート２ａは、ラッセル編みにより形成された多数の開口や編目、２枚の編物と編物との間に設けられた多数の縦糸の間に形成される空間や間隙により、内部に液体が浸透するようになっており、また上記多数の縦糸によって厚さ方向に弾性変形する性質を有したものとなっている。そして、これらダブルラッセル構造からなる足場シート２ａの編物や縦糸の繊維に細胞を接着させるようにしている。
一方、上記足場シート２ａに伸縮性を有さない繊維を使用していることで、シート２ａが厚さ方向に弾性変形しても繊維自体は伸縮せず、当該繊維に接着した細胞が脱落しないようにすることができる。
なお、上記足場シート２ａの厚さや直径は本実施形態の寸法に限るものではなく、さらには上記培養用足場２としては、細胞培養に適した厚さや大きさを有し厚さ方向に弾性変形可能であれば、上記ダブルラッセル構造を有した足場シート２ａ以外を用いてもよく、また必ずしも複数枚の足場シート２ａを積層させる必要もない。
【0010】
上記培養容器３は、上述したように外容器３Ａと内容器３Ｂとから構成されており、このうち外容器３Ａは上部に開口部が形成された有底円筒状を有したものとなっている。
外容器３Ａの上端開口部には蓋部材３Ｃが装着されるようになっており、外容器３Ａの開口部外周縁に設けられたフランジに対し、複数本のボルトを用いて連結されることで密閉状態が維持されるようになっている。
また蓋部材３Ｃには、外容器３Ａの内部空間の環境を清浄に維持するためのエアフィルタを備えた通気菅７が設けられている。
外容器３Ａの上端開口部には蓋部材３Ｃが装着されるようになっており、外容器３Ａの開口部外周縁に設けられたフランジに対し、複数本のボルトを用いて連結されることで密閉状態が維持されるようになっている。
また蓋部材３Ｃには、外容器３Ａの内部空間の環境を清浄に維持するためのエアフィルタを備えた通気菅７が設けられている。
【0011】
上記内容器３Ｂは、内径が上記培養用足場２の直径よりも大きな筒状部材１１と、当該筒状部材１１の下端開口部に装着されて培地Ｍを流出入させるための複数の貫通穴を備えた底部材１２とから構成されている。
上記底部材１２は上記圧縮手段６による押圧に耐えうる構造を有し、例えば金属板に直径１０ｍｍ程度の穴が複数穿設されたパンチング板や金網を用いることが可能であり、上記培養用足場２を下方から支持可能であれば、上記貫通穴の直径や配置または金網の網目の大きさ等は任意である。
上記底部材１２は上記圧縮手段６による押圧に耐えうる構造を有し、例えば金属板に直径１０ｍｍ程度の穴が複数穿設されたパンチング板や金網を用いることが可能であり、上記培養用足場２を下方から支持可能であれば、上記貫通穴の直径や配置または金網の網目の大きさ等は任意である。
【0012】
上記外容器昇降手段４は、上記外容器３Ａを載置させて支持する板状の容器台４ａと、当該容器台４ａの下方に設けられた電動シリンダやエアシリンダ等の昇降用アクチュエーター４ｂとから構成されている。
上記容器台４ａには図示しないが位置決め部材が設けられており、上記容器台４ａに対して上記外容器３Ａが常に同じ位置に載置されるようになっている。
上記昇降用アクチュエーター４ｂは細胞培養装置１を構成する架台１３に固定されており、上記制御手段によって容器台４ａの高さを制御可能となっており、外容器３Ａは上記容器台４ａに載置されて上下に移動するようになっている。
上記容器台４ａには図示しないが位置決め部材が設けられており、上記容器台４ａに対して上記外容器３Ａが常に同じ位置に載置されるようになっている。
上記昇降用アクチュエーター４ｂは細胞培養装置１を構成する架台１３に固定されており、上記制御手段によって容器台４ａの高さを制御可能となっており、外容器３Ａは上記容器台４ａに載置されて上下に移動するようになっている。
【0013】
上記内容器支持手段５は内容器３Ｂを常時一定の高さに保持するようになっており、上記架台１３に立設された支柱１３ａの上端部に設けられたブラケット１３ｂに設けられた吊り下げロッド５ａと、当該吊り下げロッド５ａと連結される固定ロッド５ｂによって構成されている。
上記固定ロッド５ｂは上記外容器３Ａに装着される蓋部材３Ｃを貫通して、端部が上記内容器３Ｂの筒状部材１１の側面に固定されており、蓋部材３Ｃから上方に突出する固定ロッド５ｂの周囲を蛇腹で覆って、蓋部材３Ｃで密閉される外容器３Ａの内部に外気や塵埃が流入することを防止している。
上記吊り下げロッド５ａの下端にはフランジ５ａａが形成されるとともに、上記固定ロッド５ｂの上端にフランジ５ｂｂが形成されて連結部５ｃが構成されており、これらフランジ５ａａ、５ｂｂをボルトで固定することで、上記吊り下げロッド５ａと固定ロッド５ｂを連結できるようになっている。
このような構成により、内容器３Ｂは外容器３Ａに収容されるものの、外容器３Ａ内においても内容器支持手段５に支持されて高さ方向の位置が固定されるようになっており、また外容器３Ａが上昇しても、内容器３Ｂに当接することによって上昇が規制されるようになっている。
なお、外容器３Ａを内容器３Ｂに当接させた状態では、外容器３Ａの底面が内容器３Ｂの底部材１２を覆うため、内容器３Ｂに対する底部材１２を介した培地Ｍの流出入ができなくなる。
そこで、上記培養用足場２を内容器３Ｂに収容して細胞を培養する際には、上記制御手段によって上記昇降用アクチュエーター４ｂの作動により、外容器３Ａと内容器３Ｂとの間に所定の隙間を設けた、培養用の高さに外容器３Ａを位置させるようになっている。
上記固定ロッド５ｂは上記外容器３Ａに装着される蓋部材３Ｃを貫通して、端部が上記内容器３Ｂの筒状部材１１の側面に固定されており、蓋部材３Ｃから上方に突出する固定ロッド５ｂの周囲を蛇腹で覆って、蓋部材３Ｃで密閉される外容器３Ａの内部に外気や塵埃が流入することを防止している。
上記吊り下げロッド５ａの下端にはフランジ５ａａが形成されるとともに、上記固定ロッド５ｂの上端にフランジ５ｂｂが形成されて連結部５ｃが構成されており、これらフランジ５ａａ、５ｂｂをボルトで固定することで、上記吊り下げロッド５ａと固定ロッド５ｂを連結できるようになっている。
このような構成により、内容器３Ｂは外容器３Ａに収容されるものの、外容器３Ａ内においても内容器支持手段５に支持されて高さ方向の位置が固定されるようになっており、また外容器３Ａが上昇しても、内容器３Ｂに当接することによって上昇が規制されるようになっている。
なお、外容器３Ａを内容器３Ｂに当接させた状態では、外容器３Ａの底面が内容器３Ｂの底部材１２を覆うため、内容器３Ｂに対する底部材１２を介した培地Ｍの流出入ができなくなる。
そこで、上記培養用足場２を内容器３Ｂに収容して細胞を培養する際には、上記制御手段によって上記昇降用アクチュエーター４ｂの作動により、外容器３Ａと内容器３Ｂとの間に所定の隙間を設けた、培養用の高さに外容器３Ａを位置させるようになっている。
【0014】
上記圧縮手段６は、上記架台１３に立設された支柱１３ｃの上端部に設けられた保持部材１３ｄに設けられている。
圧縮手段６は、上記保持部材１３ｄの下面に設けられた電動シリンダやエアシリンダ等の圧縮用アクチュエーター６ａと、当該圧縮用アクチュエーター６ａにより進退動可能に設けられた円盤状の圧縮板６ｂとから構成されている。
上記圧縮用アクチュエーター６ａは進退動する進退ロッド６ｃを下方に向けて設けており、当該圧縮用アクチュエーター６ａの進退ロッド６ｃの先端には、上記圧縮板６ｂの中心に立設させた支持ロッド６ｄが連結されている。
上記支持ロッド６ｄは上記外容器３Ａに装着される蓋部材３Ｃを貫通しており、圧縮板６ｂは圧縮用アクチュエーター６ａにより蓋部材３Ｃや外容器３Ａに対して上下に移動可能に設けられている。
また蓋部材３Ｃから上方に突出する支持ロッド６ｄの周囲を蛇腹で覆って、蓋部材３Ｃで密閉される外容器３Ａの内部に外気や塵埃が流入することを防止している。
上記進退ロッド６ｃの先端にフランジ６ｃｃが形成されるとともに、上記支持ロッド６ｄの上端にフランジ６ｄｄが形成されて連結部６ｅが構成され、これらフランジ６ｃｃ、６ｄｄをボルトで固定することで、上記進退ロッド６ｃと支持ロッド６ｄを連結できるようになっている。
そして、上記圧縮板６ｂは円盤状を有するとともにその直径は上記内容器３Ｂの筒状部材１１の内径よりも小径で、培養用足場２よりも大径となるように設定されており、筒状部材１１の内側で内容器３Ｂに収容された培養用足場２を上方から覆うように配置されている。
上記圧縮用アクチュエーター６ａは、容器支持手段５に支持された内容器３Ｂに収容される培養用足場２に対して、圧縮板６ｂを内容器３Ｂの内部で下降させて、培養用足場２を厚さ方向に圧縮することが可能となっている。
ここで、上記圧縮手段６は上記制御手段によって圧縮板６ｂの高さを制御することが可能となっており、図１は上記圧縮板６ｂを培養用足場２を圧縮しない程度に当該培養用足場２の上面に接触させた状態を示している。
この状態から培養用足場２を圧縮する場合は、圧縮板６ｂをさらに下降させて培養用足場２を押し下げるようになっており、このため、上記内容器３、底部材１２および内容器支持手段５は、圧縮用アクチュエーター６ａの押圧力に耐え得るよう構成されている。
圧縮手段６は、上記保持部材１３ｄの下面に設けられた電動シリンダやエアシリンダ等の圧縮用アクチュエーター６ａと、当該圧縮用アクチュエーター６ａにより進退動可能に設けられた円盤状の圧縮板６ｂとから構成されている。
上記圧縮用アクチュエーター６ａは進退動する進退ロッド６ｃを下方に向けて設けており、当該圧縮用アクチュエーター６ａの進退ロッド６ｃの先端には、上記圧縮板６ｂの中心に立設させた支持ロッド６ｄが連結されている。
上記支持ロッド６ｄは上記外容器３Ａに装着される蓋部材３Ｃを貫通しており、圧縮板６ｂは圧縮用アクチュエーター６ａにより蓋部材３Ｃや外容器３Ａに対して上下に移動可能に設けられている。
また蓋部材３Ｃから上方に突出する支持ロッド６ｄの周囲を蛇腹で覆って、蓋部材３Ｃで密閉される外容器３Ａの内部に外気や塵埃が流入することを防止している。
上記進退ロッド６ｃの先端にフランジ６ｃｃが形成されるとともに、上記支持ロッド６ｄの上端にフランジ６ｄｄが形成されて連結部６ｅが構成され、これらフランジ６ｃｃ、６ｄｄをボルトで固定することで、上記進退ロッド６ｃと支持ロッド６ｄを連結できるようになっている。
そして、上記圧縮板６ｂは円盤状を有するとともにその直径は上記内容器３Ｂの筒状部材１１の内径よりも小径で、培養用足場２よりも大径となるように設定されており、筒状部材１１の内側で内容器３Ｂに収容された培養用足場２を上方から覆うように配置されている。
上記圧縮用アクチュエーター６ａは、容器支持手段５に支持された内容器３Ｂに収容される培養用足場２に対して、圧縮板６ｂを内容器３Ｂの内部で下降させて、培養用足場２を厚さ方向に圧縮することが可能となっている。
ここで、上記圧縮手段６は上記制御手段によって圧縮板６ｂの高さを制御することが可能となっており、図１は上記圧縮板６ｂを培養用足場２を圧縮しない程度に当該培養用足場２の上面に接触させた状態を示している。
この状態から培養用足場２を圧縮する場合は、圧縮板６ｂをさらに下降させて培養用足場２を押し下げるようになっており、このため、上記内容器３、底部材１２および内容器支持手段５は、圧縮用アクチュエーター６ａの押圧力に耐え得るよう構成されている。
【0015】
以下、上記構成を有する細胞培養装置１を用いた細胞培養方法を説明する。図２は本実施形態における細胞培養方法の手順を示すフロー図となっている。最初に、培養容器３に細胞の播種を行う播種工程Ａを行う。図３は上記播種工程Ａのうち、培養用足場２に細胞を含んだ細胞懸濁液を供給する懸濁液供給作業Ａ－１を示している。
この懸濁液供給作業Ａ－１は細胞培養装置１から培養容器３を取り外した状態で、アイソレータや安全キャビネット等の無菌環境の作業室で行う。
作業の開始に当たり、図１に示す上記吊り下げロッド５ａと固定ロッド５ｂの連結を解除するとともに、進退ロッド６ｃと支持ロッド６ｄの連結を解除することで、培養容器３を細胞培養装置１から取り外し、インキュベータから取り出して上記無菌環境の作業室に搬入する。
続いて図３（ａ）に示すように、取り外された培養容器３において、圧縮板６ｂを蓋部材３Ｃに当接するまで引き上げ、その状態で蓋部材３Ｃを固定ロッド５ｂを中心軸として旋回させて、外容器３Ａに収容した状態の内容器３Ｂの上方から退避させる。
これにより外容器３Ａの上部が開放されるため、内容器３Ｂの内部に未使用の培養用足場２を収容することが可能となり、本実施形態では、上記培養用足場２は複数枚のシート２ａによって構成されていることから、複数枚のシート２ａを積層させた状態で内容器３Ｂに収容する。
この懸濁液供給作業Ａ－１は細胞培養装置１から培養容器３を取り外した状態で、アイソレータや安全キャビネット等の無菌環境の作業室で行う。
作業の開始に当たり、図１に示す上記吊り下げロッド５ａと固定ロッド５ｂの連結を解除するとともに、進退ロッド６ｃと支持ロッド６ｄの連結を解除することで、培養容器３を細胞培養装置１から取り外し、インキュベータから取り出して上記無菌環境の作業室に搬入する。
続いて図３（ａ）に示すように、取り外された培養容器３において、圧縮板６ｂを蓋部材３Ｃに当接するまで引き上げ、その状態で蓋部材３Ｃを固定ロッド５ｂを中心軸として旋回させて、外容器３Ａに収容した状態の内容器３Ｂの上方から退避させる。
これにより外容器３Ａの上部が開放されるため、内容器３Ｂの内部に未使用の培養用足場２を収容することが可能となり、本実施形態では、上記培養用足場２は複数枚のシート２ａによって構成されていることから、複数枚のシート２ａを積層させた状態で内容器３Ｂに収容する。
【0016】
続いて、内容器３Ｂに収容された上記培養用足場２に対して、細胞を含んだ細胞懸濁液をピペットＰ等の分注手段を用いて所定量滴下することにより供給する。
このときの細胞懸濁液の液量は、以下に説明する圧縮培養工程Ｂで培養用足場２を圧縮した際に、細胞懸濁液が圧縮された培養用足場２の全体に浸透して均一に行き渡り、かつ培養用足場２の外部に漏れ出ない程度を目安とする。
このように設定することで、使用する細胞懸濁液のロスを抑えるとともに、培養用足場２に接着する細胞数を可及的に多くすることができる。
具体的には、半分の容積まで圧縮される培養用足場２に対しては、圧縮前の培養用足場２の容積の半分の量を目安に細胞懸濁液を供給するようにし、圧縮後の培養用足場２の内部が細胞懸濁液で満たされるようにする。
なお、培養用足場２に対する細胞懸濁液の供給は滴下に限らず、培養用足場２にピペットＰの先端を挿し入れて細胞懸濁液を内部に注入するようにしてもよい。
また、供給した細胞懸濁液が培養用足場２から流れ出ることがあっても、内容器３を外容器３Ａに載置させて底部材１２の貫通穴や金網の網目を塞いでいるため、内容器３Ｂの底部材１２から外容器３Ａに細胞懸濁液が流出することはない。
このように培養用足場２に所定量の細胞懸濁液を供給した後は、支持ロッド６ｄのフランジ６ｄｄを保持して圧縮板６ｂを引き上げながら、外容器３Ａの底面から内容器３Ｂが浮き上がらないようにしつつ、蓋部材３Ｃを固定ロッド５Ｂを中心に旋回させて外容器３Ａに被せる。これにより圧縮板６ｂが内容器３Ｂの上方に位置することとなり、圧縮板６ｂをゆっくりと下降させて内容器３Ｂに収容されている培養用足場２に載せる。
この状態で蓋部材３Ｃを外容器３Ａにボルト締めして密閉し、上記アイソレータや安全キャビネット等の作業室から搬出してインキュベータに搬入する。その後、上記固定ロッド５ｂを吊り下げロッド５ａに連結するとともに、支持ロッド６ｄを進退ロッド６ｃに連結して、培養容器３を細胞培養装置１に取り付ける。
このときの細胞懸濁液の液量は、以下に説明する圧縮培養工程Ｂで培養用足場２を圧縮した際に、細胞懸濁液が圧縮された培養用足場２の全体に浸透して均一に行き渡り、かつ培養用足場２の外部に漏れ出ない程度を目安とする。
このように設定することで、使用する細胞懸濁液のロスを抑えるとともに、培養用足場２に接着する細胞数を可及的に多くすることができる。
具体的には、半分の容積まで圧縮される培養用足場２に対しては、圧縮前の培養用足場２の容積の半分の量を目安に細胞懸濁液を供給するようにし、圧縮後の培養用足場２の内部が細胞懸濁液で満たされるようにする。
なお、培養用足場２に対する細胞懸濁液の供給は滴下に限らず、培養用足場２にピペットＰの先端を挿し入れて細胞懸濁液を内部に注入するようにしてもよい。
また、供給した細胞懸濁液が培養用足場２から流れ出ることがあっても、内容器３を外容器３Ａに載置させて底部材１２の貫通穴や金網の網目を塞いでいるため、内容器３Ｂの底部材１２から外容器３Ａに細胞懸濁液が流出することはない。
このように培養用足場２に所定量の細胞懸濁液を供給した後は、支持ロッド６ｄのフランジ６ｄｄを保持して圧縮板６ｂを引き上げながら、外容器３Ａの底面から内容器３Ｂが浮き上がらないようにしつつ、蓋部材３Ｃを固定ロッド５Ｂを中心に旋回させて外容器３Ａに被せる。これにより圧縮板６ｂが内容器３Ｂの上方に位置することとなり、圧縮板６ｂをゆっくりと下降させて内容器３Ｂに収容されている培養用足場２に載せる。
この状態で蓋部材３Ｃを外容器３Ａにボルト締めして密閉し、上記アイソレータや安全キャビネット等の作業室から搬出してインキュベータに搬入する。その後、上記固定ロッド５ｂを吊り下げロッド５ａに連結するとともに、支持ロッド６ｄを進退ロッド６ｃに連結して、培養容器３を細胞培養装置１に取り付ける。
【0017】
次に、図４は、上記播種工程Ａのうち、培養用足場２に供給した細胞を培養用足場２の全体に分散させる分散作業Ａ－２を示しており、この分散作業はインキュベータの内部で行う。
上記図３に係る懸濁液供給作業Ａ－１では、細胞が培養用足場２の全体に均一に分散していないことから、この分散作業Ａ－２を行うことで、細胞を培養用足場２の全体に行き渡らせるものとなっている。
図４（ａ）は、上記外容器昇降手段４が外容器３Ａを、底面が内容器３Ｂの筒状部材１１の下端や底部材１２と当接する上昇端まで移動させており、懸濁液供給作業Ａ－１を終えて培養容器３を細胞培養装置１に取り付けた後の状態を示している。
このとき、圧縮手段６は圧縮板６ｂを培養用足場２を圧縮しない高さに位置させており、外容器昇降手段４は内容器３Ｂの底部材１２に外容器３Ａの底面を当接させて隙間のない状態としている。これにより、その後の圧縮動作で培養用足場２が圧縮されて培養用足場２から細胞懸濁液が漏れ出ることがあっても、細胞懸濁液が底部材１２を介して外容器３Ａまで流出することを防止している。
その状態から、図４（ｂ）に示すように、圧縮手段６が圧縮板６ｂを所定量下降させて培養用足場２を圧縮する。このとき、圧縮手段６は培養用足場２を元の厚さに対して半分の厚さとなるまで圧縮し、この状態を所定時間維持する。これにより培養用足場２は半分の容積となり、培養用足場２に吸収された細胞懸濁液が培養用足場２を構成する繊維の細部にも行き渡るようになる。
続いて、図４（ｃ）に示すように、圧縮手段６は圧縮板６ｂを再び図４（ａ）と同じ高さに上昇させる。これにより培養用足場２は圧縮された状態から厚さ方向に復元するようになっている。
そして制御手段は圧縮手段６を制御して、上記図４（ａ）～（ｃ）の動作を複数回繰り返す。
上記動作を行うことにより、培養用足場２を構成する複数枚の足場シート２ａの圧縮と解放とが繰り返され、懸濁液供給作業Ａ－１において供給された細胞懸濁液は、各足場シート２ａに形成された開口や編目および空間や間隙を流通して上下左右に浸透し、圧縮された培養用足場２の全体に行き渡って均一に分散するようになっている。
ここで、上記懸濁液供給作業Ａ－１において、細胞懸濁液の供給量を圧縮していない状態の培養用足場２の容積の半分程度としているため、図４（ｂ）において培養用足場２を容積の半分まで圧縮した際に、細胞懸濁液が培養用足場２の全体に行き渡ることになり、細胞のロスを抑えることができる。
上記図３に係る懸濁液供給作業Ａ－１では、細胞が培養用足場２の全体に均一に分散していないことから、この分散作業Ａ－２を行うことで、細胞を培養用足場２の全体に行き渡らせるものとなっている。
図４（ａ）は、上記外容器昇降手段４が外容器３Ａを、底面が内容器３Ｂの筒状部材１１の下端や底部材１２と当接する上昇端まで移動させており、懸濁液供給作業Ａ－１を終えて培養容器３を細胞培養装置１に取り付けた後の状態を示している。
このとき、圧縮手段６は圧縮板６ｂを培養用足場２を圧縮しない高さに位置させており、外容器昇降手段４は内容器３Ｂの底部材１２に外容器３Ａの底面を当接させて隙間のない状態としている。これにより、その後の圧縮動作で培養用足場２が圧縮されて培養用足場２から細胞懸濁液が漏れ出ることがあっても、細胞懸濁液が底部材１２を介して外容器３Ａまで流出することを防止している。
その状態から、図４（ｂ）に示すように、圧縮手段６が圧縮板６ｂを所定量下降させて培養用足場２を圧縮する。このとき、圧縮手段６は培養用足場２を元の厚さに対して半分の厚さとなるまで圧縮し、この状態を所定時間維持する。これにより培養用足場２は半分の容積となり、培養用足場２に吸収された細胞懸濁液が培養用足場２を構成する繊維の細部にも行き渡るようになる。
続いて、図４（ｃ）に示すように、圧縮手段６は圧縮板６ｂを再び図４（ａ）と同じ高さに上昇させる。これにより培養用足場２は圧縮された状態から厚さ方向に復元するようになっている。
そして制御手段は圧縮手段６を制御して、上記図４（ａ）～（ｃ）の動作を複数回繰り返す。
上記動作を行うことにより、培養用足場２を構成する複数枚の足場シート２ａの圧縮と解放とが繰り返され、懸濁液供給作業Ａ－１において供給された細胞懸濁液は、各足場シート２ａに形成された開口や編目および空間や間隙を流通して上下左右に浸透し、圧縮された培養用足場２の全体に行き渡って均一に分散するようになっている。
ここで、上記懸濁液供給作業Ａ－１において、細胞懸濁液の供給量を圧縮していない状態の培養用足場２の容積の半分程度としているため、図４（ｂ）において培養用足場２を容積の半分まで圧縮した際に、細胞懸濁液が培養用足場２の全体に行き渡ることになり、細胞のロスを抑えることができる。
【0018】
上記分散作業Ａ－２において細胞を培養用足場２の全体に分散させたら、続いて上記細胞を培養用足場２に接着させる接着作業Ａ－３を行う。
接着作業Ａ－３では、図４（ｂ）に示すように圧縮手段６によって培養用足場２を所定量圧縮し、この状態のままインキュベータ内で数時間静置する。その時も本実施形態では、圧縮手段６は培養用足場２を元の厚さに対して半分の厚さに維持する。
培養用足場２を圧縮した状態で静置することにより、培養用足場２内に行き渡った細胞が培養され、細胞が培養用足場２を構成する繊維に接着するようになっている。
そして、本実施形態では上記分散作業Ａ－２と接着作業Ａ－３とを複数回繰り返すようになっている。すなわち、２回目の分散作業Ａ－２で培養用足場２を圧縮し解放をすることで、１回目の接着作業Ａ－３で繊維に接着できなかった細胞が培養用足場２の内部で移動され、当該細胞が培養用足場２の内部で接着することが期待される。
接着作業Ａ－３では、図４（ｂ）に示すように圧縮手段６によって培養用足場２を所定量圧縮し、この状態のままインキュベータ内で数時間静置する。その時も本実施形態では、圧縮手段６は培養用足場２を元の厚さに対して半分の厚さに維持する。
培養用足場２を圧縮した状態で静置することにより、培養用足場２内に行き渡った細胞が培養され、細胞が培養用足場２を構成する繊維に接着するようになっている。
そして、本実施形態では上記分散作業Ａ－２と接着作業Ａ－３とを複数回繰り返すようになっている。すなわち、２回目の分散作業Ａ－２で培養用足場２を圧縮し解放をすることで、１回目の接着作業Ａ－３で繊維に接着できなかった細胞が培養用足場２の内部で移動され、当該細胞が培養用足場２の内部で接着することが期待される。
【0019】
上記接着作業Ａ－３による培養期間が終了したら、続いて圧縮培養工程Ｂの培地供給作業Ｂ－１に移行して、培養容器３に所定量の培地Ｍを供給する。
この培地供給作業Ｂ－１においては、図４（ｂ）に示す圧縮板６ｂによって培養用足場２を圧縮した状態から、圧縮板６ｂを上昇させて蓋部材３Ｃの下面に当接させ、これにより蓋部材３Ｃが圧縮板６ｂによって下方から支持されるようにする。
次に、図５に示すように、外容器３Ａに蓋部材３Ｃを密閉しているボルトを外して、外容器昇降手段４を作動させて容器台４ａごと外容器３Ａを下降させる。これにより、圧縮板６ｂに支持された蓋部材３Ｃから外容器３Ａが離隔するとともに、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａの底面が離隔する。
これにより外容器３Ａの上部が開放された状態となり、この状態でピペットＰ等の分注手段を用いて、外容器３Ａに対して所定量の培地Ｍを供給する。
この培地供給作業Ｂ－１においては、図４（ｂ）に示す圧縮板６ｂによって培養用足場２を圧縮した状態から、圧縮板６ｂを上昇させて蓋部材３Ｃの下面に当接させ、これにより蓋部材３Ｃが圧縮板６ｂによって下方から支持されるようにする。
次に、図５に示すように、外容器３Ａに蓋部材３Ｃを密閉しているボルトを外して、外容器昇降手段４を作動させて容器台４ａごと外容器３Ａを下降させる。これにより、圧縮板６ｂに支持された蓋部材３Ｃから外容器３Ａが離隔するとともに、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａの底面が離隔する。
これにより外容器３Ａの上部が開放された状態となり、この状態でピペットＰ等の分注手段を用いて、外容器３Ａに対して所定量の培地Ｍを供給する。
【0020】
培地Ｍの供給が終わると、図６（ａ）に示すように、上記外容器昇降手段４を作動させて外容器３Ａを上昇させ、外容器３Ａに蓋部材３Ｃを装着させて密閉するとともに、上記圧縮手段６の圧縮板６ｂを下降させて、培養用足場２を再び圧縮した状態として、培養用足場２を培地Ｍに浸漬させて圧縮培養Ｂ－２を開始する。
なお、この際の外容器昇降手段４による外容器３Ａの上昇位置は、上昇端から若干下降した培養用の高さとなっており、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａの底面に形成される隙間により、底部材１２の貫通穴や網目を介して内容器３Ｂの内外を培地Ｍが流通できるようになっている。
培地供給作業Ｂ－１における外容器３Ａに供給する培地Ｍの供給量は、続く圧縮培養Ｂ－２では培養用足場２を半分の容積に圧縮した状態で行うことから、圧縮された培養用足場２の高さとほぼ等しい水位となる量の培地Ｍを投入すればよい。
これに対し、従来のように圧縮しない状態で培養する場合は、圧縮していない培養用足場２の全体が浸漬されるようにしなければならないため、それだけ多くの培地Ｍを必要とし、培養初期の細胞数の少ない状態に対して過剰な量の培地を準備することになる。これに対して本発明のように培養初期には、培養用足場２を圧縮することで培地Ｍの使用量を抑えることが可能となっている。
なお、インキュベータ内が清浄であれば、上述したように培地供給作業Ｂ－１をインキュベータ内で実施するが、インキュベータ内の清浄度が十分でない場合は、この培地供給作業Ｂ－１についても、懸濁液供給作業Ａ－１と同様に、蓋部材３Ｃで密閉した外容器３Ａを細胞培養装置１から取り外し、アイソレータや安全キャビネットなどの無菌環境下において作業を行うようにしてもよい。
なお、この際の外容器昇降手段４による外容器３Ａの上昇位置は、上昇端から若干下降した培養用の高さとなっており、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａの底面に形成される隙間により、底部材１２の貫通穴や網目を介して内容器３Ｂの内外を培地Ｍが流通できるようになっている。
培地供給作業Ｂ－１における外容器３Ａに供給する培地Ｍの供給量は、続く圧縮培養Ｂ－２では培養用足場２を半分の容積に圧縮した状態で行うことから、圧縮された培養用足場２の高さとほぼ等しい水位となる量の培地Ｍを投入すればよい。
これに対し、従来のように圧縮しない状態で培養する場合は、圧縮していない培養用足場２の全体が浸漬されるようにしなければならないため、それだけ多くの培地Ｍを必要とし、培養初期の細胞数の少ない状態に対して過剰な量の培地を準備することになる。これに対して本発明のように培養初期には、培養用足場２を圧縮することで培地Ｍの使用量を抑えることが可能となっている。
なお、インキュベータ内が清浄であれば、上述したように培地供給作業Ｂ－１をインキュベータ内で実施するが、インキュベータ内の清浄度が十分でない場合は、この培地供給作業Ｂ－１についても、懸濁液供給作業Ａ－１と同様に、蓋部材３Ｃで密閉した外容器３Ａを細胞培養装置１から取り外し、アイソレータや安全キャビネットなどの無菌環境下において作業を行うようにしてもよい。
【0021】
培養容器３に培地Ｍが供給されると、培養用足場２を圧縮した状態を維持したまま、培養用足場２の内部に接着した細胞を培養する圧縮培養Ｂ－２を所定期間に亘って行う。
この圧縮培養Ｂ－２では、一定期間毎に上記培養用足場２を一旦培地Ｍから取り出す培地攪拌作業を実行するようになっている。
これにより、培養用足場２の内部から培地Ｍが流出して、細胞が酸素に触れることで増殖を促進させるとともに、再び浸漬させた際には培養用足場２の内部に培地Ｍが流入することで、培養用足場２の内部で培地Ｍが攪拌され、培養用足場２の内部における局所的な栄養成分の枯渇と老廃物の蓄積を防ぐようになっている。
具体的には、図６（ｂ）に示すように、上記圧縮手段６によって培養用足場２を圧縮した状態のまま、上記外容器昇降手段４が外容器３Ａを下降させて、培地Ｍの液面を内容器３Ｂの底部材１２と等しいかそれよりも下方に位置させる。
これにより、培養用足場２の内部から培地Ｍを流出させて内容器３Ｂの底部材１２を介して外容器３Ａへと落下させることができる。
その後、図６（ｃ）に示すように、上記外容器昇降手段４が外容器３Ａを再び培養用の高さまで上昇させることにより、内容器３Ｂを再び外容器３Ａの底面に接近させ、底部材１２を介して内容器３Ｂに培地Ｍを流入させ、培養用足場２を再び培地Ｍに浸漬させる。
上記外容器３Ａの上下動は、上記圧縮培養Ｂ－２を実行している間の一定期間毎に、例えば３０分に１回程度行うようにする。
この圧縮培養Ｂ－２では、一定期間毎に上記培養用足場２を一旦培地Ｍから取り出す培地攪拌作業を実行するようになっている。
これにより、培養用足場２の内部から培地Ｍが流出して、細胞が酸素に触れることで増殖を促進させるとともに、再び浸漬させた際には培養用足場２の内部に培地Ｍが流入することで、培養用足場２の内部で培地Ｍが攪拌され、培養用足場２の内部における局所的な栄養成分の枯渇と老廃物の蓄積を防ぐようになっている。
具体的には、図６（ｂ）に示すように、上記圧縮手段６によって培養用足場２を圧縮した状態のまま、上記外容器昇降手段４が外容器３Ａを下降させて、培地Ｍの液面を内容器３Ｂの底部材１２と等しいかそれよりも下方に位置させる。
これにより、培養用足場２の内部から培地Ｍを流出させて内容器３Ｂの底部材１２を介して外容器３Ａへと落下させることができる。
その後、図６（ｃ）に示すように、上記外容器昇降手段４が外容器３Ａを再び培養用の高さまで上昇させることにより、内容器３Ｂを再び外容器３Ａの底面に接近させ、底部材１２を介して内容器３Ｂに培地Ｍを流入させ、培養用足場２を再び培地Ｍに浸漬させる。
上記外容器３Ａの上下動は、上記圧縮培養Ｂ－２を実行している間の一定期間毎に、例えば３０分に１回程度行うようにする。
【0022】
上記圧縮培養Ｂ－２ではさらに、培養中の毎日決まった時間に培地のサンプルを採取し成分を測定する培地成分測定作業を実行して、培養用足場２の内部における細胞密度を求めるようになっている。サンプルの採取については、図５に示す培地供給作業Ｂ－１と同様の動作で行うことができる。
すなわち、図６（ａ）に示す培養用足場２を圧縮して細胞を培養している状態から、上記圧縮手段６の作動により圧縮板６ｂを上昇させて蓋部材３Ｃを下方から支持するとともに、蓋部材３Ｃと外容器３Ａの連結を解除した後、上記外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを下降させて、図５に示すように外容器３Ａを開放状態とする。
この状態で、図示しないピペットＰ等の分注手段で、外容器３Ａから所定量の培地Ｍを吸引して採取用の容器に分注する。このように採取された培地Ｍについて成分測定を行う。
なお、この培地成分測定作業におけるサンプルの採取についても、図３に示す懸濁液供給作業Ａ－１と同様に、蓋部材３Ｃで密閉した外容器３Ａを細胞培養装置１から取り外し、細胞が播種された培養用足場２を収容したままアイソレータや安全キャビネット等の作業室に移動させて、無菌環境下において作業を行うようにしてもよい。
すなわち、図６（ａ）に示す培養用足場２を圧縮して細胞を培養している状態から、上記圧縮手段６の作動により圧縮板６ｂを上昇させて蓋部材３Ｃを下方から支持するとともに、蓋部材３Ｃと外容器３Ａの連結を解除した後、上記外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを下降させて、図５に示すように外容器３Ａを開放状態とする。
この状態で、図示しないピペットＰ等の分注手段で、外容器３Ａから所定量の培地Ｍを吸引して採取用の容器に分注する。このように採取された培地Ｍについて成分測定を行う。
なお、この培地成分測定作業におけるサンプルの採取についても、図３に示す懸濁液供給作業Ａ－１と同様に、蓋部材３Ｃで密閉した外容器３Ａを細胞培養装置１から取り外し、細胞が播種された培養用足場２を収容したままアイソレータや安全キャビネット等の作業室に移動させて、無菌環境下において作業を行うようにしてもよい。
【0023】
上記圧縮培養Ｂ－２によって細胞の培養を行うと、細胞が増殖して細胞密度が高まり最終的には増殖が限界に達する。そこで培養中の培地Ｍの成分の測定結果から細胞密度を推定し、圧縮量低減の要否判定を行うようにしている。
培地Ｍの成分としては、主要な栄養分としてグルコースが含まれており、細胞の増殖に伴って培地Ｍ中のグルコース濃度が低下する。また、細胞は増殖に伴って老廃物である乳酸を分泌するため、培地Ｍの成分として乳酸濃度が上昇する。
そこで、事前の検証により培地Ｍにおけるグルコース濃度および乳酸濃度と細胞密度との相関関係を求めておき、毎日の培地Ｍの成分の測定結果から１日あたりのグルコース消費量（濃度低下量）および乳酸蓄積量（濃度上昇量）を求めて、これらの値に基づいて培養用足場２の細胞密度を推定できるようにしている。
そして測定の結果、細胞密度が予め設定した規定値を下回るようであれば、引き続き同じ圧縮量で圧縮した培養用足場２で培養を継続するものとし、細胞密度が規定値以上となれば増殖が限界に達したものとして、予め設定した量だけ培養用足場２の圧縮量を低減させて、培養用足場２の容積を増大させるようにする。
増殖が限界に達しておらず、引き続き同じ圧縮量で圧縮した培養用足場２で培養を継続する場合には、定期的な培地Ｍの成分測定結果から、栄養分の枯渇または老廃物の蓄積が発生しているか否かにより培地成分の良否を判定し、これらの発生が認められなければそのまま圧縮培養Ｂ－２を続行し、発生が認められるようであれば培地成分が不良であるとして、培地交換作業Ｂ－３を実行してから圧縮培養Ｂ－２を再開するものとしている。
培地Ｍの成分としては、主要な栄養分としてグルコースが含まれており、細胞の増殖に伴って培地Ｍ中のグルコース濃度が低下する。また、細胞は増殖に伴って老廃物である乳酸を分泌するため、培地Ｍの成分として乳酸濃度が上昇する。
そこで、事前の検証により培地Ｍにおけるグルコース濃度および乳酸濃度と細胞密度との相関関係を求めておき、毎日の培地Ｍの成分の測定結果から１日あたりのグルコース消費量（濃度低下量）および乳酸蓄積量（濃度上昇量）を求めて、これらの値に基づいて培養用足場２の細胞密度を推定できるようにしている。
そして測定の結果、細胞密度が予め設定した規定値を下回るようであれば、引き続き同じ圧縮量で圧縮した培養用足場２で培養を継続するものとし、細胞密度が規定値以上となれば増殖が限界に達したものとして、予め設定した量だけ培養用足場２の圧縮量を低減させて、培養用足場２の容積を増大させるようにする。
増殖が限界に達しておらず、引き続き同じ圧縮量で圧縮した培養用足場２で培養を継続する場合には、定期的な培地Ｍの成分測定結果から、栄養分の枯渇または老廃物の蓄積が発生しているか否かにより培地成分の良否を判定し、これらの発生が認められなければそのまま圧縮培養Ｂ－２を続行し、発生が認められるようであれば培地成分が不良であるとして、培地交換作業Ｂ－３を実行してから圧縮培養Ｂ－２を再開するものとしている。
【0024】
培地交換作業Ｂ－３についても、図５に示す培地供給作業Ｂ－１と同様の動作で行うことができる。
すなわち、図６（ａ）に示す培養用足場２を圧縮して細胞を培養している状態から、上記圧縮手段６の作動により圧縮板６ｂを上昇させて蓋部材３Ｃを下方から支持するとともに、蓋部材３Ｃと外容器３Ａの連結を解除した後、上記外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを下降させて、図５に示すように外容器３Ａを開放状態とする。
この状態で、図示しないアスピレータ等の吸引手段により外容器３Ａから古い培地Ｍを吸引して排出したら、ピペットＰ等の分注手段により圧縮した培養用足場２を浸漬させることのできる所定量の新しい培地Ｍを外容器３Ａに供給する。
その後、外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを培養用の高さまで上昇させて、圧縮手段６の作動で圧縮板６ｂを下降させて再び培養用足場２を圧縮するとともに、蓋部材３Ｃと外容器３Ａを連結させて細胞の培養を再開する。
また、この培地交換作業Ｂ－３についても、図３に示す懸濁液供給作業Ａ－１と同様に、蓋部材３Ｃで密閉した外容器３Ａを細胞培養装置１から取り外し、培養中の培養用足場２を収容したままアイソレータや安全キャビネット等の作業室に移動させて、無菌環境下において作業を行うようにしてもよい。
すなわち、図６（ａ）に示す培養用足場２を圧縮して細胞を培養している状態から、上記圧縮手段６の作動により圧縮板６ｂを上昇させて蓋部材３Ｃを下方から支持するとともに、蓋部材３Ｃと外容器３Ａの連結を解除した後、上記外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを下降させて、図５に示すように外容器３Ａを開放状態とする。
この状態で、図示しないアスピレータ等の吸引手段により外容器３Ａから古い培地Ｍを吸引して排出したら、ピペットＰ等の分注手段により圧縮した培養用足場２を浸漬させることのできる所定量の新しい培地Ｍを外容器３Ａに供給する。
その後、外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを培養用の高さまで上昇させて、圧縮手段６の作動で圧縮板６ｂを下降させて再び培養用足場２を圧縮するとともに、蓋部材３Ｃと外容器３Ａを連結させて細胞の培養を再開する。
また、この培地交換作業Ｂ－３についても、図３に示す懸濁液供給作業Ａ－１と同様に、蓋部材３Ｃで密閉した外容器３Ａを細胞培養装置１から取り外し、培養中の培養用足場２を収容したままアイソレータや安全キャビネット等の作業室に移動させて、無菌環境下において作業を行うようにしてもよい。
【0025】
一方、細胞密度が規定値以上となって限界に達していて、培養用足場２が圧縮量を低減できる場合は、圧縮量低減作業Ｂ－４を実行する。
すなわち、圧縮培養Ｂ－２において圧縮された培養用足場２の内部で、細胞密度が上昇し限界まで細胞が培養されると、培養用足場２の内部で細胞の増殖する余地がなくなり、細胞の増殖速度が低下するとともに培地Ｍの交換頻度が高くなる。
そこで、細胞密度が限界に達しかつ培養用足場２が圧縮された状態であれば、図７に示すように、上記培養用足場２の圧縮量を低減させて培養用足場２の容積を増大させるとともに、外容器３Ａから培地Ｍを排出して新たな培地Ｍを増量して供給する圧縮量低減作業Ｂ－４を行う。
圧縮量低減作業Ｂ－４における培地Ｍの排出と供給は、上記培地交換作業Ｂ－３と同様の動作で行うことができる。
培地交換作業Ｂ－３との違いは、新たに外容器３Ａに供給する培地Ｍの量を外容器３Ａから排出した量よりも多くすることである。このとき増量する培地Ｍの量は、上記厚さが復元された培養用足場２の全体が、外容器３Ａおよび内容器３Ｂの内部で培地Ｍに浸漬されるような深さとなるように設定される。
すなわち、それまで圧縮されていた培養用足場２の厚さに対し、圧縮が解消されて培養用足場２の厚さが復元するため、復元により増加する厚さに対応して培養用足場２を浸漬させる液面高さとなる量の培地Ｍを供給する。
このように、培養用足場２の圧縮量を低減させ、培養用足場２を厚さ方向に復元させることにより、培養用足場２の容積が拡大し、圧縮されていた時に比べて細胞の増殖可能な領域が増大することとなる。
すなわち、圧縮培養Ｂ－２において圧縮された培養用足場２の内部で、細胞密度が上昇し限界まで細胞が培養されると、培養用足場２の内部で細胞の増殖する余地がなくなり、細胞の増殖速度が低下するとともに培地Ｍの交換頻度が高くなる。
そこで、細胞密度が限界に達しかつ培養用足場２が圧縮された状態であれば、図７に示すように、上記培養用足場２の圧縮量を低減させて培養用足場２の容積を増大させるとともに、外容器３Ａから培地Ｍを排出して新たな培地Ｍを増量して供給する圧縮量低減作業Ｂ－４を行う。
圧縮量低減作業Ｂ－４における培地Ｍの排出と供給は、上記培地交換作業Ｂ－３と同様の動作で行うことができる。
培地交換作業Ｂ－３との違いは、新たに外容器３Ａに供給する培地Ｍの量を外容器３Ａから排出した量よりも多くすることである。このとき増量する培地Ｍの量は、上記厚さが復元された培養用足場２の全体が、外容器３Ａおよび内容器３Ｂの内部で培地Ｍに浸漬されるような深さとなるように設定される。
すなわち、それまで圧縮されていた培養用足場２の厚さに対し、圧縮が解消されて培養用足場２の厚さが復元するため、復元により増加する厚さに対応して培養用足場２を浸漬させる液面高さとなる量の培地Ｍを供給する。
このように、培養用足場２の圧縮量を低減させ、培養用足場２を厚さ方向に復元させることにより、培養用足場２の容積が拡大し、圧縮されていた時に比べて細胞の増殖可能な領域が増大することとなる。
【0026】
圧縮量低減作業Ｂ－４が終了したら、圧縮されていない培養用足場２を用いて圧縮培養Ｂ－２を再開する。
図７は圧縮量低減作業Ｂ－４後の圧縮培養Ｂ-２の状態を示し、外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを培養用の高さまで上昇させた状態として、圧縮手段６の作動で圧縮板６ｂを培養用足場２に接触するが圧縮しない位置まで下降させて、培養用足場２の浮き上がりを防止しつつ細胞の培養を再開する。
圧縮されていない培養用足場２を用いた圧縮培養Ｂ－２においても、所定の周期で培地攪拌作業と培地成分測定作業を実施し、培地成分の測定結果から細胞密度が限界に達したか否かを判定する。
細胞密度が限界に達していないと判定した場合は、培地成分の良否を判定し、不良でなければ引き続き培養を継続し、不良であれば一旦培養を中断して、培地交換作業Ｂ－３を行ってから培養を再開する。
一方で、細胞密度が限界に達していた場合は、圧縮を解除した状態での培養であり、圧縮量を低減させて培養用足場２の容積を拡大することができないことから、最終培養工程Ｃへと移行する。
なお、上記実施形態では、培養用足場２を半分の容積まで圧縮して圧縮培養Ｂ－２を開始し、その後の圧縮量低減作業Ｂ－４で圧縮を解除して圧縮されていない培養用足場２を用いて培養を継続するものとしているが、当初の培養用足場２の圧縮を半分以上とするなど可変可能な圧縮手段６による圧縮量を調整して、圧縮量低減作業Ｂ－４における圧縮量の低減を、二段階以上に分けて実行するようにしてもよい。
図７は圧縮量低減作業Ｂ－４後の圧縮培養Ｂ-２の状態を示し、外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを培養用の高さまで上昇させた状態として、圧縮手段６の作動で圧縮板６ｂを培養用足場２に接触するが圧縮しない位置まで下降させて、培養用足場２の浮き上がりを防止しつつ細胞の培養を再開する。
圧縮されていない培養用足場２を用いた圧縮培養Ｂ－２においても、所定の周期で培地攪拌作業と培地成分測定作業を実施し、培地成分の測定結果から細胞密度が限界に達したか否かを判定する。
細胞密度が限界に達していないと判定した場合は、培地成分の良否を判定し、不良でなければ引き続き培養を継続し、不良であれば一旦培養を中断して、培地交換作業Ｂ－３を行ってから培養を再開する。
一方で、細胞密度が限界に達していた場合は、圧縮を解除した状態での培養であり、圧縮量を低減させて培養用足場２の容積を拡大することができないことから、最終培養工程Ｃへと移行する。
なお、上記実施形態では、培養用足場２を半分の容積まで圧縮して圧縮培養Ｂ－２を開始し、その後の圧縮量低減作業Ｂ－４で圧縮を解除して圧縮されていない培養用足場２を用いて培養を継続するものとしているが、当初の培養用足場２の圧縮を半分以上とするなど可変可能な圧縮手段６による圧縮量を調整して、圧縮量低減作業Ｂ－４における圧縮量の低減を、二段階以上に分けて実行するようにしてもよい。
【0027】
最終培養工程Ｃにおいては、圧縮しない培養用足場２に対して、圧縮培養Ｂ－２での培養よりも培地Ｍを増量して行うことで、細胞の増殖能の向上を図るものである。
はじめに、圧縮されていない培養用足場２を浸漬させるために、外容器３Ａの培地Ｍの収容量を増加させる培地増量作業Ｃ－１を実施する。
培地増量作業Ｃ－１は、圧縮培養工程Ｂの圧縮量低減作業Ｂ－４で行う培地Ｍの供給と同様に、外容器３Ａから培地Ｍを排出した後で、排出した量よりの多くの培地Ｍを外容器３Ａに供給するものである。
すなわち、最終培養Ｃ－２に移行するあたり、外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを培養用の高さまで上昇させる。ただし、図８（ａ）に示すように、この際の外容器３Ａを上昇させる高さを圧縮培養Ｂ－２の際の培養用の高さよりも低くして、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａ内の底面との間の隙間を大きくする。
そして培地増量作業Ｃ－１で外容器３Ａに培地Ｍを供給する際の供給量を、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａ内の底面との間隔に対応させて、圧縮されていない培養用足場２が浸漬されるように増量する。
はじめに、圧縮されていない培養用足場２を浸漬させるために、外容器３Ａの培地Ｍの収容量を増加させる培地増量作業Ｃ－１を実施する。
培地増量作業Ｃ－１は、圧縮培養工程Ｂの圧縮量低減作業Ｂ－４で行う培地Ｍの供給と同様に、外容器３Ａから培地Ｍを排出した後で、排出した量よりの多くの培地Ｍを外容器３Ａに供給するものである。
すなわち、最終培養Ｃ－２に移行するあたり、外容器昇降手段４の作動で外容器３Ａを培養用の高さまで上昇させる。ただし、図８（ａ）に示すように、この際の外容器３Ａを上昇させる高さを圧縮培養Ｂ－２の際の培養用の高さよりも低くして、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａ内の底面との間の隙間を大きくする。
そして培地増量作業Ｃ－１で外容器３Ａに培地Ｍを供給する際の供給量を、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａ内の底面との間隔に対応させて、圧縮されていない培養用足場２が浸漬されるように増量する。
【0028】
この培地Ｍを増量させて培養を行う最終培養Ｃ－２においても、圧縮培養Ｂ－２の場合と同様に、所定の周期で培地攪拌作業と培地成分測定作業を実施するとともに、定期的な培地成分の測定結果から細胞の増殖が完了したか否かを判定するようになっている。
細胞増殖の完了判定は、培地Ｍ中の栄養分としてのグルコース濃度もしくは老廃物としての乳酸濃度に基づいており、毎日の培地成分の測定によりグルコースの消費量の増加（グルコース濃度の低下）もしくは乳酸の蓄積量の増加（乳酸濃度の上昇）が確認される場合は、活発に増殖しているものと判断して改めて培地増量作業Ｃ－１を行う。
つまり図８（ｂ）に示すように、外容器昇降手段４により外容器３Ａを所定量下降させて、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａ内の底面との間隔をさらに大きくし、供給する培地Ｍを増量して最終培養Ｃ－２を継続する。
一方で、グルコースの消費量もしくは乳酸の蓄積量の所定量の増加が確認されなければ、細胞の増殖が鈍化したものとして増殖完了と判定し、次工程の回収工程Ｄに移行する。
細胞増殖の完了判定は、培地Ｍ中の栄養分としてのグルコース濃度もしくは老廃物としての乳酸濃度に基づいており、毎日の培地成分の測定によりグルコースの消費量の増加（グルコース濃度の低下）もしくは乳酸の蓄積量の増加（乳酸濃度の上昇）が確認される場合は、活発に増殖しているものと判断して改めて培地増量作業Ｃ－１を行う。
つまり図８（ｂ）に示すように、外容器昇降手段４により外容器３Ａを所定量下降させて、内容器３Ｂの底部材１２と外容器３Ａ内の底面との間隔をさらに大きくし、供給する培地Ｍを増量して最終培養Ｃ－２を継続する。
一方で、グルコースの消費量もしくは乳酸の蓄積量の所定量の増加が確認されなければ、細胞の増殖が鈍化したものとして増殖完了と判定し、次工程の回収工程Ｄに移行する。
【0029】
このように圧縮されていない培養用足場２を用いて、培地Ｍの成分測定の結果に応じて培地Ｍを交換しつつ、培養容器に収容する培地Ｍの量を増加させて、再び培養用足場２を圧縮しない状態で内部に接着している細胞を培養することにより、培養用足場２の内部における細胞の増殖を促進させるようにしており、培養用足場２の内部において細胞を十分に増殖させた上で、次工程の回収工程Ｄへ移行するようにしている。
【0030】
回収工程Ｄにおいては、培養した細胞が分泌したエクソソーム等の細胞外小胞を回収する上清回収作業と、上記培養用足場２から細胞を回収する細胞回収作業とを行う。なお、細胞回収作業は省略してもよい。
図９は上記上清回収作業を行う状態を示し、上記培養容器３の外容器３Ａの底部に設けた接続口３ａには、チューブ２１を介して回収バッグ２２が接続され、また上記チューブ２１はチューブポンプ２３に装着されている。
上記外容器昇降手段４は外容器３Ａを下降させて内容器３Ｂを培地Ｍの上方に位置させ、この状態で上記圧縮手段６が圧縮板６ｂを下降させて、上記内容器３Ｂ内の培養用足場２を圧縮する。
これにより、培養用足場２に含まれていた培地Ｍとともに、当該培地Ｍに含まれている細胞外小胞が押し出され、内容器３Ｂの底部材１２を通過して外容器３Ａ内に落下することとなる。
その後、上記チューブポンプ２３を作動させることにより、上記外容器３Ａに収容されている培地Ｍとともに上記細胞外小胞が回収バッグ２２に回収されるようになっている。
図９は上記上清回収作業を行う状態を示し、上記培養容器３の外容器３Ａの底部に設けた接続口３ａには、チューブ２１を介して回収バッグ２２が接続され、また上記チューブ２１はチューブポンプ２３に装着されている。
上記外容器昇降手段４は外容器３Ａを下降させて内容器３Ｂを培地Ｍの上方に位置させ、この状態で上記圧縮手段６が圧縮板６ｂを下降させて、上記内容器３Ｂ内の培養用足場２を圧縮する。
これにより、培養用足場２に含まれていた培地Ｍとともに、当該培地Ｍに含まれている細胞外小胞が押し出され、内容器３Ｂの底部材１２を通過して外容器３Ａ内に落下することとなる。
その後、上記チューブポンプ２３を作動させることにより、上記外容器３Ａに収容されている培地Ｍとともに上記細胞外小胞が回収バッグ２２に回収されるようになっている。
【0031】
次に、上記細胞回収作業について説明すると、最初に培地供給作業Ｂ－１と同様の動作で、培地Ｍが回収された外容器３Ａ内にＰＢＳ等の洗浄液Ｗを供給する。この時の液量は、例えば圧縮していない状態の培養用足場２が浸漬する程度の液量とする。
洗浄液Ｗを供給したら、図４に示した分散作業Ａ－２と同様に、上記圧縮手段６が圧縮板６ｂを複数回上下に移動させて、培養用足場２の圧縮と解放を繰り返し、これにより培養用足場２の内部に洗浄液を均一に浸透させる。
続いて、図９に示すように、外容器３Ａにチューブ２１を介して廃液バッグ２２Ａを接続するとともに、外容器３Ａを下降させた状態で上記圧縮手段６により培養用足場２を圧縮する。
すると、培養用足場２に含まれる洗浄液Ｗが内容器３Ｂの底部材１２を介して外容器３Ａに落下するが、このとき細胞は培養用足場２に接着した状態を維持するため、圧縮により洗浄液Ｗだけが押し出されて落下し、チューブポンプ２３の作動により廃液バッグ２２Ａに回収されるようになる。
洗浄液Ｗを供給したら、図４に示した分散作業Ａ－２と同様に、上記圧縮手段６が圧縮板６ｂを複数回上下に移動させて、培養用足場２の圧縮と解放を繰り返し、これにより培養用足場２の内部に洗浄液を均一に浸透させる。
続いて、図９に示すように、外容器３Ａにチューブ２１を介して廃液バッグ２２Ａを接続するとともに、外容器３Ａを下降させた状態で上記圧縮手段６により培養用足場２を圧縮する。
すると、培養用足場２に含まれる洗浄液Ｗが内容器３Ｂの底部材１２を介して外容器３Ａに落下するが、このとき細胞は培養用足場２に接着した状態を維持するため、圧縮により洗浄液Ｗだけが押し出されて落下し、チューブポンプ２３の作動により廃液バッグ２２Ａに回収されるようになる。
【0032】
このようにして培養用足場２を洗浄液Ｗによって洗浄したら、今度は培地供給作業Ｂ－１と同様の動作で外容器３Ａ内にトリプシン等の剥離剤Ｒを供給する。この時の液量は、圧縮した状態の培養用足場２が浸漬される程度の深さが得られればよい。
剥離剤Ｒを供給したら、図４に示した分散作業Ａ－２と同様に上記圧縮手段６が圧縮板６ｂを複数回上下に移動させて、培養用足場２の圧縮と解放を繰り返し、これにより培養用足場２の内部に剥離剤Ｒを均一に浸透させ、培養用足場２に接着していた細胞を剥離させる。
続いて、図９に示すように上記上清回収作業と同様に、外容器３Ａにチューブ２１を介して回収バッグ２２Ｂを接続し、外容器３Ａを下降させた状態で上記圧縮手段６により培養用足場２を圧縮する。
これにより、培養用足場２に含まれる剥離剤Ｒと共に、剥離された細胞が内容器３Ｂの底部材１２を介して外容器３Ａに落下するため、これをチューブポンプ２３の作動により上記回収バッグ２２Ｂへと回収することができる。
剥離剤Ｒを供給したら、図４に示した分散作業Ａ－２と同様に上記圧縮手段６が圧縮板６ｂを複数回上下に移動させて、培養用足場２の圧縮と解放を繰り返し、これにより培養用足場２の内部に剥離剤Ｒを均一に浸透させ、培養用足場２に接着していた細胞を剥離させる。
続いて、図９に示すように上記上清回収作業と同様に、外容器３Ａにチューブ２１を介して回収バッグ２２Ｂを接続し、外容器３Ａを下降させた状態で上記圧縮手段６により培養用足場２を圧縮する。
これにより、培養用足場２に含まれる剥離剤Ｒと共に、剥離された細胞が内容器３Ｂの底部材１２を介して外容器３Ａに落下するため、これをチューブポンプ２３の作動により上記回収バッグ２２Ｂへと回収することができる。
【0033】
以上のように、本実施形態の細胞培養方法によれば、播種直後の細胞密度が小さい時には、上記培養用足場２を厚さ方向に圧縮させた状態で培養を行うことで、細胞数に合わせた最小限の培地Ｍで細胞の培養をすることができる。
培養によって細胞が増殖し、細胞密度が大きくなると、培養用足場２の圧縮量を低減させて培養用足場２を厚さ方向に復元させて容積を増大させることから、細胞が増殖する余地を増大させることが可能となっている。
つまり、細胞数の増加に伴って培養用足場２の容積を増やすために、培養用足場２の圧縮量を減少させれば、新たな培養用足場を追加する必要はなく、細胞の継代としては作業を簡略化することが可能である。
培養によって細胞が増殖し、細胞密度が大きくなると、培養用足場２の圧縮量を低減させて培養用足場２を厚さ方向に復元させて容積を増大させることから、細胞が増殖する余地を増大させることが可能となっている。
つまり、細胞数の増加に伴って培養用足場２の容積を増やすために、培養用足場２の圧縮量を減少させれば、新たな培養用足場を追加する必要はなく、細胞の継代としては作業を簡略化することが可能である。
【0034】
図１０は、上記細胞培養方法をより自動化して実施することが可能な細胞培養装置１を示しており、上記第１実施形態で説明した細胞培養装置１に対し、培地Ｍの供給および排出を自動的に行うための構成を追加したものとなっている。
本実施形態の培養容器３には、上記外容器３Ａの底部に供給口３ｂおよび排出口３ｃが設けられ、上記供給口３ｂには培地Ｍを供給する培地供給手段３１が、上記排出口３ｃには培地Ｍを排出する培地排出手段３２が接続されている。
本実施形態の培養容器３には、上記外容器３Ａの底部に供給口３ｂおよび排出口３ｃが設けられ、上記供給口３ｂには培地Ｍを供給する培地供給手段３１が、上記排出口３ｃには培地Ｍを排出する培地排出手段３２が接続されている。
【0035】
上記培地供給手段３１は、培地Ｍを収容した供給タンク３１ａと、当該供給タンク３１ａと外容器３Ａとの間に設けられた供給チューブ３１ｂと、上記供給タンク３１ａから培地Ｍを送液する供給ポンプ３１ｃとによって構成されている。
上記供給タンク３１ａには新鮮な培地Ｍが収容されており、上記供給ポンプ３１ｃによって新鮮な培地Ｍを培養容器３に供給することが可能となっている。
上記供給タンク３１ａには新鮮な培地Ｍが収容されており、上記供給ポンプ３１ｃによって新鮮な培地Ｍを培養容器３に供給することが可能となっている。
【0036】
上記培地排出手段３２は、使用済みの培地Ｍを回収する排液タンク３２ａと、当該排液タンク３２ａと外容器３Ａとの間に設けられた排液チューブ３２ｂと、上記外容器３Ａから使用済みの培地Ｍを送液する排液ポンプ３２ｃとによって構成されている。
また、外容器３Ａ内には、蓋部材３Ｃに取り付けられて培地成分センサ３３が設けられており、外容器３Ａに収容されている培地Ｍに接触させて、圧縮培養工程Ｂの圧縮培養Ｂ－２や最終培養工程Ｃの最終培養Ｃ－２における、培養中に定期的に培地Ｍの成分を測定する培地成分測定作業を実行できるようになっている。
また、外容器３Ａ内には、蓋部材３Ｃに取り付けられて培地成分センサ３３が設けられており、外容器３Ａに収容されている培地Ｍに接触させて、圧縮培養工程Ｂの圧縮培養Ｂ－２や最終培養工程Ｃの最終培養Ｃ－２における、培養中に定期的に培地Ｍの成分を測定する培地成分測定作業を実行できるようになっている。
【0037】
上記構成を有する細胞培養装置１の使用方法について説明する。なお細胞を培養する工程自体は第１実施形態における細胞培養方法と同じであるため、上記培地供給手段３１および培地排出手段３２を使用する動作、ならびに培地成分センサ３３を使用する培地成分測定作業について説明する。
まず培地供給手段３１は、圧縮培養工程Ｂにおける培地供給作業Ｂ－１および培地交換作業Ｂ－３、圧縮量低減作業Ｂ－４、最終培養工程Ｃの培地増量作業Ｃ－１における培地Ｍの供給に使用することができ、また培地排出手段３２は、培地交換作業Ｂ－３、圧縮量低減作業Ｂ－４、最終培養工程Ｃの培地増量作業Ｃ－１における培地Ｍの排出に使用することができる。
本実施形態では、図５に示すような動作を必要とせず、外容器３Ａを蓋部材３Ｃによって密閉した状態を維持し、また内容器３Ｂと外容器３Ａの底面とを所定間隔に維持し、さらには、上記圧縮手段６が上記培養用足場２を圧縮した状態を維持したまま、上記供給ポンプ３１ｃを作動させることにより、供給タンク３１ａから上記各作業において必要な量の新鮮な培地Ｍを外容器３Ａに供給することができ、また排液ポンプ３２ｃを作動させることにより、外容器３Ａから排液タンク３２ａに使用済みの培地Ｍを排出することができる。
まず培地供給手段３１は、圧縮培養工程Ｂにおける培地供給作業Ｂ－１および培地交換作業Ｂ－３、圧縮量低減作業Ｂ－４、最終培養工程Ｃの培地増量作業Ｃ－１における培地Ｍの供給に使用することができ、また培地排出手段３２は、培地交換作業Ｂ－３、圧縮量低減作業Ｂ－４、最終培養工程Ｃの培地増量作業Ｃ－１における培地Ｍの排出に使用することができる。
本実施形態では、図５に示すような動作を必要とせず、外容器３Ａを蓋部材３Ｃによって密閉した状態を維持し、また内容器３Ｂと外容器３Ａの底面とを所定間隔に維持し、さらには、上記圧縮手段６が上記培養用足場２を圧縮した状態を維持したまま、上記供給ポンプ３１ｃを作動させることにより、供給タンク３１ａから上記各作業において必要な量の新鮮な培地Ｍを外容器３Ａに供給することができ、また排液ポンプ３２ｃを作動させることにより、外容器３Ａから排液タンク３２ａに使用済みの培地Ｍを排出することができる。
【0038】
さらに、上記のように培養容器３内に培地成分センサ３３を設けることにより、圧縮培養工程Ｂの圧縮培養Ｂ－２や最終培養工程Ｃの最終培養Ｃ－２における培地成分測定作業において、図５に示すような動作を伴うサンプルの採取を必要とせず、また常時継続的に外容器３Ａに収容されている培養中の培地Ｍの成分を測定して、図示しない制御手段でデータを収集することができる。
これにより、連続的な培地Ｍの成分測定が可能であり、制御手段は培地Ｍ中のグルコース濃度または乳酸濃度を随時把握して、速やかに細胞密度の推定、培地成分の良否判定および細胞増殖の完了判定を行うことができる。
このような第２実施形態の細胞培養装置１によっても、本発明の細胞培養方法を実施することが可能である。
これにより、連続的な培地Ｍの成分測定が可能であり、制御手段は培地Ｍ中のグルコース濃度または乳酸濃度を随時把握して、速やかに細胞密度の推定、培地成分の良否判定および細胞増殖の完了判定を行うことができる。
このような第２実施形態の細胞培養装置１によっても、本発明の細胞培養方法を実施することが可能である。
【符号の説明】
【0039】
１ 細胞培養装置 ２ 培養用足場
２ａ 足場シート ３ 培養容器
３Ａ 外容器 ３Ｂ 内容器
４ 外容器昇降手段 ５ 内容器支持手段
６ 圧縮手段 ６ｂ 圧縮板
２ａ 足場シート ３ 培養容器
３Ａ 外容器 ３Ｂ 内容器
４ 外容器昇降手段 ５ 内容器支持手段
６ 圧縮手段 ６ｂ 圧縮板
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】