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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025001351
(43)【公開日】2025-01-08
(54)【発明の名称】分析方法、キット及び検出用デバイス
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20241225BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALI20241225BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20241225BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241225BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20241225BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20241225BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
C12Q1/6837 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6886 Z
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】33
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023100877
(22)【出願日】2023-06-20
(71)【出願人】
【識別番号】000003078
【氏名又は名称】株式会社東芝
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】宮川 拓也
(72)【発明者】
【氏名】佐野 良威
(72)【発明者】
【氏名】高橋 友美
(72)【発明者】
【氏名】石原 美津子
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
(57)【要約】
【課題】
乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、分析対象における罹患の可能性を簡便に判定することができる分析方法及びキットを提供する。
【解決手段】
実施形態によれば、分析対象由来の試料中の、標的ｍｉＲＮＡ群から選択された標的ｍｉＲＮＡを定量することを含む、対象の乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性を判定する分析方法及びキットが提供される。
【選択図】 図１
乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、分析対象における罹患の可能性を簡便に判定することができる分析方法及びキットを提供する。
【解決手段】
実施形態によれば、分析対象由来の試料中の、標的ｍｉＲＮＡ群から選択された標的ｍｉＲＮＡを定量することを含む、対象の乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性を判定する分析方法及びキットが提供される。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象由来の試料中の、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐからなるｍｉＲＮＡ群から選択されるｍｉＲＮＡを定量することと、
前記対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することと
を含む、分析方法。
前記対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することと
を含む、分析方法。
【請求項2】
対照由来の試料中の前記ｍｉＲＮＡを定量することを更に含み、
前記判定は、前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する請求項１に記載の方法。
前記判定は、前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記対照は、健常体であるか、又は、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種であることが既知の検体である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記対照は、健常体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐからなるｍｉＲＮＡ群から選択される何れか１種のｍｉＲＮＡの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐからなるｍｉＲＮＡ群から選択される何れか１種のｍｉＲＮＡの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記対照は、健常体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は胃がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は胃がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記対照は、健常体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は大腸がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は大腸がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記対照は、大腸がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐのそれぞれの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は胃がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐのそれぞれの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は胃がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記対照は、大腸がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０の定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん又は胃がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０の定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん又は胃がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項9】
前記対照は、大腸がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん又は膵臓がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん又は膵臓がんに罹患していると判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項10】
対象由来の試料中の、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐからなるｍｉＲＮＡ群から選択されるｍｉＲＮＡを定量することと、
前記対象が乳がんに罹患している可能性があると判定することとを含む、分析方法。
前記対象が乳がんに罹患している可能性があると判定することとを含む、分析方法。
【請求項11】
対照由来の試料中の前記ｍｉＲＮＡを定量することを更に含み、
前記判定は、前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、前記対象が乳がんに罹患している可能性があると判定する、請求項１０に記載の方法。
前記判定は、前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、前記対象が乳がんに罹患している可能性があると判定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記対照は、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種であることが既知の検体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記対照は、肺がん又は胃がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がんに罹患していると判定する、請求項１１に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がんに罹患していると判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記対照は、肺がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０の定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がんに罹患していると判定する、請求項１１に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０の定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がんに罹患していると判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記対照は、大腸がん、肺がん又は胃がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がんに罹患していると判定する、請求項１１に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がんに罹患していると判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記対照は、胃がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がんに罹患していると判定する、請求項１１に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がんに罹患していると判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
対象由来の試料中の、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐからなるｍｉＲＮＡ群から選択されるｍｉＲＮＡを定量することと、前記対象における乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することとを含む、分析方法。
【請求項18】
対照由来の試料中の前記ｍｉＲＮＡを定量することを更に含み、
前記判定は、前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、前記対象が乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する請求項１７に記載の方法。
前記判定は、前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、前記対象が乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記対照は、健常体であるか、又は、乳がん、膵臓がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種であることが既知の検体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記対照は、健常体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん又は大腸がんに罹患していると判定する、請求項１９に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が乳がん、膵臓がん又は大腸がんに罹患していると判定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記対照は、健常体又は乳がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が膵臓がん又は大腸がんに罹患していると判定する、請求項１９に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が膵臓がん又は大腸がんに罹患していると判定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
対象由来の試料中の、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐからなるｍｉＲＮＡ群から選択されるｍｉＲＮＡを定量することと、
前記対象が大腸がんに罹患している可能性があると判定することとを含む、分析方法。
前記対象が大腸がんに罹患している可能性があると判定することとを含む、分析方法。
【請求項23】
対照由来の試料中の前記ｍｉＲＮＡを定量することを更に含み、
前記判定は、前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、前記対象が大腸がんに罹患している可能性があると判定する、請求項２２に記載の方法。
前記判定は、前記対象における前記ｍｉＲＮＡの定量値と、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、前記対象が大腸がんに罹患している可能性があると判定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記対照は、健常体、乳がん及び膵臓がんのうち少なくとも何れか１種であることが既知の検体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記対照は、乳がん又は膵臓がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐのそれぞれの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が大腸がんに罹患していると判定する、請求項２４に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐのそれぞれの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が大腸がんに罹患していると判定する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記対照は、膵臓がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が大腸がんに罹患していると判定する、請求項２４に記載の方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が大腸がんに罹患していると判定する、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記対照は、健常体、乳がん罹患体又は膵臓がん罹患体であり、
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が大腸がんに罹患していると判定することを含む、請求項２４に記載の分析方法。
前記判定は、前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐの定量値が、前記対照における前記ｍｉＲＮＡの定量値よりも小さい場合に、前記対象が大腸がんに罹患していると判定することを含む、請求項２４に記載の分析方法。
【請求項28】
前記定量は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、又はマイクロアレイ法を用いて行われる、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記試料は、血清又は血漿である請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記対象由来の試料の前記ｍｉＲＮＡの定量値、及び前記対照由来の試料の前記ｍｉＲＮＡの定量値は、前記対象由来の試料及び前記対照由来の試料に共通して含有される標準ｍｉＲＮＡによって補正される、請求項２～９、１１～１６、１８～２１及び２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記標準ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐである請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐからなるｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含む、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性を検出するためのキット。
【請求項33】
前記ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸は、前記ｍｉＲＮＡを逆転写するための逆転写用プライマー、前記ｍｉＲＮＡを伸長するための伸長用プライマー、前記ｍｉＲＮＡを増幅するための増幅用プライマーセット、又は前記ｍｉＲＮＡを検出するための核酸プローブである請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の実施形態は、分析方法、キット及び検出用デバイスに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と疾患との関係が注目されている。ｍｉＲＮＡは遺伝子発現を調節する機能を持ち、種々の疾患でその種類や発現量が初期の段階から変化していることが報告されている。即ち、ある疾患を持つ患者では、特定のｍｉＲＮＡ量が健常者と比較して増加又は減少している。そのため、被検者から採取された試料中の該ｍｉＲＮＡの量を調べることは、患者がその疾患に罹患しているか否かを知る手段となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明が解決しようとする課題は、分析対象について、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種の罹患の有無を簡便に判定することができる分析方法、キット及び検出用デバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
実施形態によれば、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐのうちの少なくとも１つを定量することと、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することとを含む、分析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】図１は、第１実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートであり、（ａ）は、第１の標的ｍｉＲＮＡのうちの何れか１種の定量工程を含む分析方法の一例であり、（ｂ）は乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する判定工程を含む分析方法の一例であり、（ｃ）は予後又は再発の有無を判定する判定工程を含む分析方法の一例であり、（ｄ）は対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程を含む分析方法の一例である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
以下に、図面を参照しながら実施形態の分析方法、キット及び検出用デバイスについて説明する。
・第１実施形態
（分析方法）
第１実施形態に従う分析方法は、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐのうちの少なくとも１つを定量することと、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することとを含む、分析方法である。
・第１実施形態
（分析方法）
第１実施形態に従う分析方法は、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐのうちの少なくとも１つを定量することと、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することとを含む、分析方法である。
【0007】
上述の計９種のｍｉＲＮＡは、以下の説明において「第１の標的ｍｉＲＮＡ群」とも称する（省略して、単に「標的ｍｉＲＮＡ群」と称する場合もある）。また、標的ｍｉＲＮＡ群を構成する個々のｍｉＲＮＡを「第１の標的ｍｉＲＮＡ」とも称する（省略して、単に「標的ｍｉＲＮＡ」と称する場合もある）。
【0008】
例えば、標的ｍｉＲＮＡはそれぞれ下記の表１に示される塩基配列で表される。なお、本明細書において、各配列番号に対応する配列表上の「Ｔ」の表記は、「Ｕ」を意味する。定量される標的ｍｉＲＮＡは、標的ｍｉＲＮＡ群のうちの１種類であればよい。
【0009】
【表1】
【0010】
対象は、本方法において分析に供される動物、即ち、試料を提供する動物である。対象は、何らかの疾患を有する動物であってもよいし、健常な動物であってもよい。例えば、対象は、がんに罹患している可能性がある動物、或いは過去にがんに罹患したことのある動物等であってもよく、特に、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種に罹患している可能性がある動物、或いは過去に乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種に罹患したことのある動物等であってもよい。対象はヒトであることが好ましい。
【0011】
或いは、対象は他の動物であってもよい。他の動物は、例えば哺乳動物であり、例えば、サル等の霊長類、マウス、ラット又はモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ又はウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ又はブタ等の家畜動物、或いは展示動物等に属する動物を含む。ヒト以外の動物である場合は、標的ｍｉＲＮＡは、その動物に存在する、上記ｍｉＲＮＡに対応したｍｉＲＮＡである。
【0012】
対象由来の試料とは、対象から採取された試料又はそれを適切に処理した試料等を含む。試料は、好ましくは、血清又は血漿である。試料は、その他の体液、例えば、血液、白血球間質液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、鼻腔内粘膜、鼻水、咽頭粘膜、喀痰、消化液、胃液、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液又は膣液等であってもよい。或いは、試料は、組織又は細胞等であってもよく、対象から採取され、培養された組織又は細胞、或いはその上清であってもよい。
【0013】
本明細書における、各種の「がん」は、何れの病期のものも含み、例えば、発生母地の臓器内に留まった状態、更に周辺の組織まで及んだ状態、更にリンパ節へ転移した状態、及び更に離れた臓器への転移がある状態等を含む。例えば、本明細書において乳がんは、乳腺組織に形成される悪性腫瘍（新生物）をいう。また、例えば乳がんは、一般に「乳癌」又は「乳がん」と称されるものも含む。本明細書における、各種のがんは、例えば上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、又は、上皮性と非上皮性の両方からなる腫瘍を含む。
【0014】
以下、第１実施形態の方法の手順の一例について、図１の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を参照して説明する。
【0015】
【0016】
まず、対象由来の試料を用意する（用意工程（Ｓ１１））。試料は、その種類に従う一般的な方法を用いて採取することができる。試料は、採取後そのまま使ってもよいし、核酸の定量のための反応を阻害しない状態又は反応により適した状態となるように処理してもよい。処理は、例えば、細切、ホモジナイズ、遠心、沈殿、抽出及び／又は分離等であり、公知の何れかの手段により行うことができる。
【0017】
例えば、抽出は、市販の核酸抽出キットを用いて行ってもよい。核酸抽出キットとして、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａ（タカラバイオ製）、Ｑｕｉｃｋ－ｃｆＲＮＡ Ｓｅｒｕｍ ＆ Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（ザイモリサーチ製）、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ キット（キアゲン製）、ｍｉＲＶａｎａ（登録商標）ＰＡＲＩＳ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標） Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ製） 、ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標） ＳＰ Ｋｉｔ（和光純薬製）、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ製）等を用いることができる。或いは、市販のキットを使用せずに、例えば、試料を緩衝液で希釈し、８０～１００℃の加熱処理を行い、遠心分離し、その上清を採取することによって抽出を行ってもよい。
【0018】
次に、対象由来の試料に含有される、第１の標的ｍｉＲＮＡ群のうちの１種を定量する（定量工程（Ｓ１２））。定量工程（Ｓ１２）は、ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡ等の短鎖のＲＮＡを定量するための一般的な方法を用いて行うことができる。一般的な方法として、例えば、標的ｍｉＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成し、得られたｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を検出及び定量する方法が挙げられる。ＲＮＡが短鎖である場合、増幅を容易にするため、短鎖ＲＮＡの末端に人工配列を付加するように伸長したのちに逆転写すること、または逆転写して得たｃＤＮＡの末端に人工配列を付加するように伸長することも一般的に実施されている。また、逆転写を経ず、試料中のＲＮＡを直接増幅し、増幅産物を検出及び定量する技術としてローリングサークル増幅法が知られている。さらに、試料中の標的ｍｉＲＮＡの濃度が比較的高い場合や高感度測定が可能な装置を使用できる場合は、標的ｍｉＲＮＡを増幅することを経ずに、標的ｍｉＲＮＡ（又は、そのｃＤＮＡ）を直接検出することも一般的な方法の一つである。直接検出が可能な装置として、例えば標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合する核酸プローブを備えたマイクロアレイ等が挙げられる。
【0019】
増幅には、例えば、ＰＣＲ法(ｑＰＣＲ法を含む)、又はＬＡＭＰ法を用いることができる。検出及び定量は、増幅の後に行われてもよいし、増幅中に経時的に行われてもよい。検出及び定量には、例えば、濁度若しくは吸光度に基づく信号を用いる測定法、光学的信号を用いる測定法又は電気化学的信号を用いる測定法、或いはこれらの組み合わせ等を用いることができる。例えば、増幅産物量に応じて得られる上記信号の強度又は変化量、或いは信号が閾値に達するまでの時間（立ち上がり時間）又はＰＣＲ法を用いる場合は立ち上がりサイクル数から標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことができる。また、検出及び定量には、例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法の結果を用いてもよい。その場合、標的ｍｉＲＮＡにアライメントされたリード数等の検出結果から標的ｍｉＲＮＡの相対的な定量を行うことができる。
【0020】
標的ｍｉＲＮＡの定量値は、上記信号の検出結果と標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて決定してもよい。検量線は、異なる既知の濃度で標的ｍｉＲＮＡを含む複数の標準試料について信号の検出を行うことにより作成することができる。この検量線と、対象由来の試料について得られた信号の検出結果とを比較することによって、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量が算出され得る。試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量は、例えば、試料の単位量当たりの標的ｍｉＲＮＡのコピー数として算出してもよい。
【0021】
定量工程（Ｓ１２）における定量は、例えば、市販のキットを用いて行ってもよい。市販のキットの例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（サーモフィッシャー製、カタログＮｏ．Ａ２５５７６）、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標）ＬＮＡ（登録商標） ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ Ａｓｓａｙｓ（キアゲン製、カタログＮｏ．３３９３０６、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｍｉｃｒｏＲＮＡ検出システム（オリジンテクノロジーズ製）等であり、標的ｍｉＲＮＡを特異的に増幅するプライマーやプローブとともに用いられ得る。
【0022】
定量工程（Ｓ１２）で得られた、第１の標的ｍｉＲＮＡの検出に係るデータは、対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があるとの判定のために用いることができる。例えば、第１実施形態の分析方法は、図１の（ｂ）に示す通り、定量工程（Ｓ１２）の後に行われる、対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する工程（Ｓ１３）を更に含み得る。
【0023】
なお、「乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する」とは、対象は５種のがんの全てについて罹患の可能性があるものの、対象が罹患しているがんの種類は５種のがんの中の何れか一つには特定されない、と判定されるか、又は、対象は５種の何れのがんにも罹患していない、と判定されることを意味している。
【0024】
「対象は５種のがんの全てについて罹患の可能性があるものの、対象が罹患しているがんの種類は５種のがんの中の何れか一つには特定されない」と同義の表現として、「対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種の罹患の有無を判定する」が挙げられる。
【0025】
さらに換言すれば、「乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する」ことによって、対象が乳がんに罹患している可能性、対象が膵臓がんに罹患している可能性、対象が肺がんに罹患している可能性、対象が胃がんに罹患している可能性、及び、対象が大腸がんに罹患している可能性が一度に提示されるか、又は、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの何れにも罹患していないという可能性が提示される。
【0026】
すなわち、本実施形態の方法は、がん健診における一次スクリーニングとして、がんの早期発見・早期治療の重要性に鑑みて、出来るだけ多くのがん種の罹患可能性を見逃さずに提示することを意図するものである。
【0027】
判定工程（Ｓ１３）では、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があるとの判定を補助する情報を提供し得る。
【0028】
例えば、判定工程（Ｓ１３）は、対象由来の試料に対する定量工程（Ｓ１２）と並列的に対照由来の試料に対して定量を行うことで得られる、対照由来の試料中の第１の標的ｍｉＲＮＡの定量値を基準として、実施される。すなわち、第１実施形態の方法は、対照由来の試料中の第１の標的ｍｉＲＮＡを定量すること；及び対象における第１の標的ｍｉＲＮＡの定量値と、対照における第１の標的ｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することを含む。
【0029】
対照における第１の標的ｍｉＲＮＡの定量値は、例えば対象由来の試料と同じ又は類似する試料（例えば対象由来の試料が血清である場合、対照由来の試料は血清又は血漿とする）に対して、定量工程（Ｓ１２）で用いられるのと同じ方法を用いて予め得られた、標的ｍｉＲＮＡの定量値である。なお、対照に該当する検体を複数用意し、複数検体ごとに定量して得られた値からなる数値範囲を基準として、判定してもよい。
【0030】
対照は、例えば健常体であってもよい。健常体とは、少なくともがんに罹患していない個体をいう。健常体は、疾患や異常を有さない健康な個体であることが好ましい。
【0031】
対照として選択される個体は、本方法で分析される対象とは別の個体であってもよいが、同じ種に属する個体、即ち対象がヒトであればヒトであることが好ましい。また、対照の年齢、性別及び身長体重等の身体的条件又は人数は特に限定されるものではないが、身体的条件は、本分析方法で検査を受ける対象のものと同じ又は類似であることが好ましい。
【0032】
或いは、判定工程（Ｓ１３）は、予め設定された閾値等を基準として実施してもよい。閾値は、例えば、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種に罹患していることが既知の試料（以下、「標準試料」と称する）における定量値と、健常体における定量値とを切り分けることができる、第１の標的ｍｉＲＮＡの存在度である。標準試料は、例えば対象由来の別部位の試料、対象と類似する（例えば同種の）個体由来の試料、又は乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種の株化細胞を含む試料等である。標準試料における定量値は、対象の定量工程（Ｓ１２）と同様の方法を適用して得ることが好ましい。標準試料における定量値と健常体における定量値とを切り分ける値は、統計的な基準をもって決定してもよいし、標準試料における定量値の最大値又は最小値を閾値としてもよいし、或いは、対照における定量値の最大値又は最小値を閾値としてもよい。さらに、閾値は、用いられる定量方法、試料の種類及び測定条件等に従って決定されてもよい。
【0033】
或いは、閾値は対象ごとに決定されてもよい。例えば、対象の健常な状態での第１の標的ｍｉＲＮＡ定量値をモニターしていれば（例えば定期的な健康診断等）、それを閾値として用いることにより、閾値よりも定量値が高い又は低いときに乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性ありとしてアラームを出すことができる。閾値は個人ごとに異なり得る。例えば、通常、ｍｉＲＮＡの定量値が約１０３コピーで推移していた対象Ａにおいて、ある時点で１０４コピーとなった場合に乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性ありと判定することができる。一方で、約１０２コピーで推移していた対象Ｂにおいては、ある時点で１０３コピーとなった場合に乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性ありと判定することができる。
【0034】
ここで、判定の基準となる、対照における定量値又は閾値は、文献等の過去の知見から決定してもよい。罹患しているとの判定は、罹患している可能性が高いことも含む。反対に、罹患していないとの判定は、罹患している可能性が低いことも含む。
【0035】
乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんに罹患した対象において、標的ｍｉＲＮＡ群の中には、対照と比較して発現量が多いもの（多発現標的ｍｉＲＮＡ）と少ないもの（少発現標的ｍｉＲＮＡ）とが含まれる。少発現標的ｍｉＲＮＡは、対照と比較して定量値が低い場合に乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定され得る。一方で、多発現標的ｍｉＲＮＡは、対照と比較して定量値が高い場合に乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定され得る。
【0036】
なお、本明細書において、「乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定」とは、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんに罹患していると判定されるか、乳がん、膵臓がん、肺がん又は胃がんに罹患していると判定されるか、乳がん、膵臓がん、肺がん又は大腸がんに罹患していると判定されるか、乳がん、膵臓がん又は胃がんに罹患していると判定されるか、乳がん又は膵臓がんに罹患していると判定されるか、を含む。
【0037】
詳述すると、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ（配列番号７）及びｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ（配列番号９）のそれぞれは、対照を健常体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ（配列番号３）又はｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐ（配列番号５）は、対照を健常体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は胃がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ（配列番号８）は、対照を健常体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は大腸がんに罹患していると判定することができる。
【0038】
なお、対照における各ｍｉＲＮＡの定量値と対象における各ｍｉＲＮＡの定量値との差異は、統計的に有意であることが好ましい。統計的に有意であるかどうかは、各種がんに罹患していることが既知である試料を複数用意し、同試料における各ｍｉＲＮＡの定量値がとりうる数値範囲を確認し、その確率分布を前もって算出しておくか、又は、既知の文献等の情報から算出しておくことで判定することができる。
【0039】
更なる実施形態によれば、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することは、対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんの予後又は再発を判定することも含む。例えば、分析方法は、図１の（ｃ）に示すように、定量工程（Ｓ１２）の後、定量の結果から対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんの予後又は再発の有無を判定する予後再発判定工程（Ｓ１４）を含む。予後再発判定工程（Ｓ１４）においては、例えば、定量値が高い又は低い場合には、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんの予後が不良である、或いは乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんが再発している、或いはその可能性が高いと判定することが可能である。予後、再発の判定にも上記対照における定量値、閾値を用いることができる。特に対象ごとに決定された閾値を用いることが好ましい場合もあり得る。
【0040】
また、判定工程（Ｓ１３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ１４）の後、判定結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択、及びその補助を行うことも可能である。例えば、分析方法は、図１の（ｄ）に示すように、判定工程（Ｓ１３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ１４）の後、判定結果から対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ１５）を含む。ここで治療法又は薬剤は、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんの治療のためのものである。治療法の種類又は薬剤の種類は、治療法又は薬剤の使用量、タイミング若しくは期間を含む。
【0041】
以上に説明した第１実施形態の分析方法によれば、対象由来の試料中の、第１の標的ｍｉＲＮＡ群のうち１種の標的ｍｉＲＮＡを定量し、対照由来の試料中の同ｍｉＲＮＡの定量値と比較することにより、簡便に対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することが可能である。
【0042】
本実施形態の方法は、健康診断等で容易に採取できる血清または血漿を用いることが可能であるため、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんを早期に発見することができる。血清または血漿等を用いることで、細胞診等と比較して対象の肉体的及び経済的負担を大きく軽減することができるとともに、手順が容易であるため検査者にとっても負担が少ない。また、血清又は血漿は、そこに含まれるｍｉＲＮＡ濃度が安定しているため、より正確な検査を行うことが可能である。
【0043】
更なる実施形態によれば、対象由来の試料中の第１の標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ１２））を含む、対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があるとの判定を補助するための分析方法も提供される。「判定を補助する」とは、例えば、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについての対象における罹患の可能性に関する情報を取得することを含む。「情報」とは、例えば、試料の分析結果に関する情報であり、例えば定量値であり得る。本方法によれば、対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があるとの判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うためのより精度の高い情報を取得することができる。
【0044】
更なる実施形態によれば、対照は、例えば乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんに罹患していることが検診等により確認された個体であってもよい。すなわち、対照は、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんに罹患しているか否かが既知の個体である。すなわち、対照は、そのような判定工程（Ｓ１３）においては、対照が罹患しているがん種を、対象が罹患しているか否かが判定される。具体的には、対照由来の試料中の特定のがんに罹患していることを示すバイオマーカーの定量値を基準として、対象由来の試料中の同バイオマーカーを定量し、基準と比較することによって判断する。
【0045】
詳述すると、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ（配列番号３）及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐ（配列番号５）のそれぞれのｍｉＲＮＡは、対照を大腸がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がん、膵臓がん、肺がん又は胃がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０（配列番号４）は、対照を大腸がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がん、膵臓がん又は胃がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ（配列番号７）は、対照を大腸がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がん又は膵臓がんに罹患していると判定することができる。
【0046】
また、第１の標的ｍｉＲＮＡ群のうちのいくつかのｍｉＲＮＡは、対照を特定のがん種に設定することで、１つのがん種に特定するマーカーとして使用することもできる。すなわち、第１のｍｉＲＮＡ群のうちのいくつかのｍｉＲＮＡは、「乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性がある」との判定以外にも使用されうる。例えば、対象が乳がんに罹患しているとの判定をすることができる。
【0047】
上述の第１の標的ｍｉＲＮＡ群のうちのいくつかのｍｉＲＮＡとは、具体的には、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ（配列番号８）である。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（配列番号１）は、対照を肺がん又は胃がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象は乳がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ（配列番号３）及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０（配列番号４）のそれぞれは、対照を肺がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ（配列番号６）は、対照を大腸がん、肺がん又は胃がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ（配列番号８）は、対照を胃がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がんに罹患していると判定することができる。
【0048】
更なる実施形態によれば、本分析方法は、対象由来でない試料中における乳がん細胞、膵臓がん細胞又は大腸がん細胞の検出等にも使用することができる。例えば、乳がん細胞、膵臓がん細胞又は大腸がん細胞を人工的に製造する場合に、製造された細胞含有溶液中に同細胞が存在するか否かを確かめる際等にも使用することができる。
【0049】
（マーカー）
第１実施形態によれば、１種の標的ｍｉＲＮＡを含む、対象の乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種を検出するためのマーカーが提供される。
第１実施形態によれば、１種の標的ｍｉＲＮＡを含む、対象の乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種を検出するためのマーカーが提供される。
【0050】
ここで、「マーカー」は、試料中のその有無又は濃度を検出することで、試料及び／又はその由来となる対象が特定の状態であるか否かを判定することのできる物質をいう。
【0051】
第１実施形態の乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性を検出するためのマーカーは、例えば、対象由来の試料中のその存在量（定量値）を測定することで、上記したように対象における乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性の判定、予後又は再発の有無の判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うことができる。
【0052】
（キット）
第１実施形態によれば、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性を検出するためのキットが提供される。
第１実施形態によれば、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性を検出するためのキットが提供される。
【0053】
キットは、ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡ等の短鎖のＲＮＡを定量するための一般的な方法に用いられ得る試薬類、及び、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な（すなわち、標的ｍｉＲＮＡとハイブリダイズする）核酸を含む。標的ｍｉＲＮＡの検出にｑＰＣＲ法を用いる場合、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸は、標的ｍｉＲＮＡを逆転写するための逆転写用（ＲＴ）プライマーであってもよいし、標的ｍｉＲＮＡを伸長するための伸長用（ＥＬ）プライマーであってもよいし、標的ｍｉＲＮＡを増幅するための増幅用プライマーセットであってもよい。
【0054】
ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを得るためのプライマーである。ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列を含む。ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするためにｃＤＮＡに付加する人工配列を更に含んでもよい。
【0055】
ＥＬプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするためにｃＤＮＡに人工配列を付加するためのプライマーである。ＥＬプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列と、各ｃＤＮＡの伸長用に付加する配列とを含み得る。
【0056】
増幅用プライマーセットは、例えばＰＣＲ法用であれば、少なくともフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む。または、増幅用プライマーセットはＬＡＭＰ法用であってもよく、一般的なＬＡＭＰ法で使用される、標的ｍｉＲＮＡの塩基配列に対応する配列のプライマー類を含んでもよい。または、増幅用プライマーセットは例えばＮＧＳ法用であってもよく、人工的なアダプター配列を含むフォワードプライマーとその相補的配列を含むリバースプライマーを含んでもよい。ＮＧＳ法用の増幅用プライマーセットは、複数の検体を同時に解析するために、異なるバーコード配列を含むフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを複数種類含んでもよい。増幅用プライマーセットがローリングサイクル増幅法に用いられる場合、キットは、増幅用プライマーがハイブリダイズして増幅の鋳型となる環状１本鎖ＤＮＡをさらに含む。
【0057】
増幅用プライマーセットに含まれる各プライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ又はその相補配列と結合するように設計されてもよいし、ＲＴプライマー及び／又はＥＬプライマーによって付加された人工配列と結合するように設計されてもよい。
【0058】
増幅するｃＤＮＡの検出には、標的ｃＤＮＡ又はその相補配列と結合するように設計された核酸プローブを用いてもよい。
【0059】
さらに、試料中の標的ｍｉＲＮＡがマイクロアレイによって直接検出される場合、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸は、マイクロアレイが備える核酸プローブである。核酸プローブは、標的ｍｉＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、或いはその増幅産物の少なくとも１部の配列又はその相補配列を有し得る。
【0060】
キットに含まれる上記核酸は、個別に又は何れかが組み合わされて適切な担体とともに容器に収容されて提供されてもよい。適切な担体は、例えば、水、生理的溶液又は緩衝液等である。容器は、例えば、チューブ又はマイクロタイタープレート等である。或いは、これら核酸はマイクロ流体チップ等の固相に固定されて提供されてもよい。
【0061】
キットは、上記核酸の他に、逆転写、伸長又は増幅に用いられる試薬、例えば酵素、基質及び／又は検出に用いられる光学的信号又は電気的化学信号を生じる標識物質等を含んでもよい。標識物質は、例えば、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎやＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ（登録商標） ８２などの蛍光色素、電流検出する場合はルテニウムヘキサアミンなどの金属錯体等の指示薬である。
【0062】
キットは、例えば、上記のように乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性の判定、予後判定、再発の有無判定、治療法の種類又は薬剤の種類の選択等に使用することができる。
【0063】
更なる実施形態によれば、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて対象における罹患の可能性を検出するためのキットは、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて対象における罹患の可能性を診断するための組成物又は診断薬として提供される。また、実施形態によれば、上記の診断用組成物又は診断薬の製造における、上記核酸の少なくとも１種の使用も提供される。
【0064】
・第２実施形態
（分析方法）
第２実施形態に従う分析方法は、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐのうちの少なくとも１つを定量することと、乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することとを含む、分析方法である。
（分析方法）
第２実施形態に従う分析方法は、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐのうちの少なくとも１つを定量することと、乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することとを含む、分析方法である。
【0065】
第２実施形態の標的ｍｉＲＮＡ（以下、「第２の標的ｍｉＲＮＡ」と称する）はそれぞれ下記の表２に示される塩基配列で表される。すなわち、第２実施形態で定量される標的ｍｉＲＮＡは、表２に示す、第２の標的ｍｉＲＮＡ群のうちの１種類であればよい。
【0066】
【表2】
【0067】
図２の（ａ）に示す通り、第２実施形態の方法は、
対象由来の試料を用意すること（用意工程（Ｓ２１））と、
対象由来の試料中の、第２の標的ｍｉＲＮＡ群のうちの１種を定量すること（定量工程（Ｓ２２））と
を含む。
対象由来の試料を用意すること（用意工程（Ｓ２１））と、
対象由来の試料中の、第２の標的ｍｉＲＮＡ群のうちの１種を定量すること（定量工程（Ｓ２２））と
を含む。
【0068】
定量工程（Ｓ２２）で得られた、第２の標的ｍｉＲＮＡの検出に係るデータは、対象における乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があるとの判定のために用いることができる。例えば、第２実施形態の分析方法は、定量工程（Ｓ２２）の後に行われる、対象における乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する工程（Ｓ２３）を更に含み得る。
【0069】
例えば、判定工程（Ｓ２３）は、対象由来の試料に対する定量工程（Ｓ２２）と並列的に対照由来の試料に対して定量を行うことで得られる、対照由来の試料中の第２の標的ｍｉＲＮＡの定量値を基準として、実施される。すなわち、第２実施形態の方法は、第１実施形態と同様に、対照由来の試料中のｍｉＲＮＡを定量すること；及び対象におけるｍｉＲＮＡの定量値と、対照におけるｍｉＲＮＡの定量値とを比較することで、対象が乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することを含む。
【0070】
対照は、例えば健常体であってもよいし、乳がん、膵臓がん又は大腸がんに罹患していることが検診等により確認された個体であってもよい。すなわち、対照は、健常体、乳がん、膵臓がん又は大腸がんに罹患しているか否かが既知の個体である。
【0071】
対照が乳がん、膵臓がん又は大腸がんである場合、判定工程（Ｓ２３）において、対照が罹患しているがん種を対象が罹患しているか否かが判定される。具体的には、対照由来の試料中の特定のがんに罹患していることを示すバイオマーカーの定量値を基準として、対象由来の試料中の同バイオマーカーを定量し、基準と比較することによって判断する。
【0072】
なお、「乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する」とは、対象は３種のがんの全てについて罹患の可能性があるものの、対象が罹患しているがんの種類は３種のがんの中の何れか一つには特定されない、と判定されるか、又は、対象は３種の何れのがんにも罹患していない、と判定されることを意味している。
【0073】
「対象は３種のがんの全てについて罹患の可能性があるものの、対象が罹患しているがんの種類は３種のがんの中の何れか一つには特定されない」と同義の表現として、「対象における乳がん、膵臓がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種の罹患の有無を判定する」が挙げられる。
【0074】
さらに換言すれば、「乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定する」ことによって、対象が乳がんに罹患している可能性、対象が膵臓がんに罹患している可能性、及び、対象が大腸がんに罹患している可能性が一度に提示されるか、又は、対象が乳がん、膵臓がん及び大腸がんの何れにも罹患していないという可能性が提示される。
【0075】
すなわち、本実施形態の方法は、がん健診における一次スクリーニングとして、がんの早期発見・早期治療の重要性に鑑みて、出来るだけ多くのがん種の罹患可能性を見逃さずに提示することを意図するものである。
【0076】
なお、本明細書において、「乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定」とは、対象が乳がん、膵臓がん又は大腸がんに罹患していると判定されるか、膵臓がん又は大腸がんに罹患していると判定されるか、を含む。
【0077】
具体的には、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ（配列番号１４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ（配列番号１６）及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ（配列番号１７）のそれぞれは、対照を健常体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が乳がん、膵臓がん又は大腸がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ（配列番号１８）は、対照を健常体又は乳がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が膵臓がん又は大腸がんに罹患していると判定することができる。
【0078】
さらに、第２の標的ｍｉＲＮＡ群のうちのいくつかのｍｉＲＮＡは、特定の検体群を対照とすることで、１つのがん種に特定するマーカーとして使用することもできる。すなわち、第２の標的ｍｉＲＮＡ群のうちのいくつかのｍｉＲＮＡは、「乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性がある」以外の判定に使用されうる。例えば、対象が大腸がんに罹患していると判定することができる。
【0079】
上述の第２の標的ｍｉＲＮＡ群のうちのいくつかのｍｉＲＮＡとは、具体的には、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ（配列番号１４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ（配列番号１７）及びｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ（配列番号１８）である。さらに、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ（配列番号１９：ＵＡＣＣＣＵＧＵＡＧＡＡＣＣＧＡＡＵＵＵＧＵＧ）も１つのがん種に特定するマーカーとして使用することができる。
【0080】
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ（配列番号１４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ（配列番号１７）のそれぞれのｍｉＲＮＡは、対照を乳がん又は膵臓がんとし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が大腸がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ（配列番号１８）は、対照を膵臓がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が大腸がんに罹患していると判定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ（配列番号１９）は、対照を健常体、乳がん罹患体又は膵臓がん罹患体とし、対象の定量値が対照の定量値よりも小さい場合に、対象が大腸がんに罹患していると判定することができる。
【0081】
更なる実施形態によれば、乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することは、対象における乳がん、膵臓がん又は大腸がんの予後又は再発を判定することも含む。例えば、分析方法は、図２の（ｃ）に示すように、定量工程（Ｓ２２）の後、定量の結果から対象における乳がん、膵臓がん又は大腸がんの予後又は再発の有無を判定する予後再発判定工程（Ｓ２４）を含む。予後再発判定工程（Ｓ２４）においては、例えば、定量値が高い又は低い場合には、乳がん、膵臓がん又は大腸がんの予後が不良である、或いは乳がん、膵臓がん又は大腸がんが再発している、或いはその可能性が高いと判定することが可能である。予後、再発の判定にも上記対照における定量値、閾値を用いることができる。特に対象ごとに決定された閾値を用いることが好ましい場合もあり得る。
【0082】
また、判定工程（Ｓ２３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ２４）の後、判定結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択、及びその補助を行うことも可能である。例えば、分析方法は、図２の（ｄ）に示すように、判定工程（Ｓ２３）及び／又は予後再発判定工程（Ｓ２４）の後、判定結果から対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ２５）を含む。ここで治療法又は薬剤は、乳がん、膵臓がん又は大腸がんの治療のためのものである。治療法の種類又は薬剤の種類は、治療法又は薬剤の使用量、タイミング若しくは期間を含む。
【0083】
以上に説明した第２実施形態の分析方法によれば、対象由来の試料中の、第２の標的ｍｉＲＮＡ群のうち１種の標的ｍｉＲＮＡを定量し、対照由来の試料中の同ｍｉＲＮＡの定量値と比較することにより、簡便に対象における乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することが可能である。
【0084】
更なる実施形態によれば、第２実施形態に係る分析方法は、対象由来でない試料中における乳がん細胞、膵臓がん細胞又は大腸がん細胞の検出等にも使用することができる。例えば、乳がん細胞、膵臓がん細胞又は大腸がん細胞を人工的に製造する場合に、製造された細胞含有溶液中に同細胞が存在するか否かを確かめる際等にも使用することができる。
【0085】
第２実施形態によれば、１種の第２の標的ｍｉＲＮＡを含む、対象の乳がん、膵臓がん及び大腸がんのうち少なくとも何れか１種を検出するためのマーカーが提供される。
【0086】
第２実施形態の乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性を検出するためのマーカーは、例えば、対象由来の試料中のその存在量（定量値）を測定することで、上記したように対象における乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性の判定、予後又は再発の有無の判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うことができる。
【0087】
第２実施形態によれば、乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性を検出するためのキットが提供される。
【0088】
第２実施形態に係るキットは、第１実施形態と同様に、ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡ等の短鎖のＲＮＡを定量するための一般的な方法に用いられ得る試薬類、及び、標的ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含む。
【0089】
第２実施形態に係るキットは、例えば、乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性の判定、予後判定、再発の有無判定、治療法の種類又は薬剤の種類の選択等に使用することもできる。
【0090】
更なる実施形態によれば、乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて対象における罹患の可能性を検出するためのキットは、乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて対象における罹患の可能性を診断するための組成物又は診断薬として提供される。また、実施形態によれば、上記の診断用組成物又は診断薬の製造における、上記核酸の少なくとも１種の使用も提供される。
【0091】
［例］
以下に、本実施形態のマーカーを得るために行った実験について記載する。
以下に、本実施形態のマーカーを得るために行った実験について記載する。
【0092】
例１．各種がんの罹患体と健常体とを識別するｍｉＲＮＡマーカーの探索と選定
乳がん罹患体、膵臓がん罹患体、及び大腸がん罹患体と、健常体とを識別することができるｍｉＲＮＡマーカーを、以下に示すように探索した。
乳がん罹患体、膵臓がん罹患体、及び大腸がん罹患体と、健常体とを識別することができるｍｉＲＮＡマーカーを、以下に示すように探索した。
【0093】
・検体の用意
検体として、乳がん患者血清を２４検体、膵臓がん患者血清を２４検体、大腸がん検体を２４検体及び健常者血清を２４検体、計９６検体分用意した。
検体として、乳がん患者血清を２４検体、膵臓がん患者血清を２４検体、大腸がん検体を２４検体及び健常者血清を２４検体、計９６検体分用意した。
【0094】
・検体の処理とｍｉＲＮＡの定量
すべての血清３００μLから、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標） ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａ（タカラバイオ株式会社製）を用いてｍｉＲＮＡを抽出した。
すべての血清３００μLから、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標） ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａ（タカラバイオ株式会社製）を用いてｍｉＲＮＡを抽出した。
【0095】
ｃＤＮＡの合成には、ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ａ２８００７)を用いた。ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔは、成熟ＲＮＡの３’末端へのポリ（Ａ）鎖の付加、及び５’末端へのアダプター配列のライゲーションを行うことで、ターゲット特異的ではなく、サンプル内に存在する全ての成熟ＲＮＡを全般的に逆転写させることを特徴とするキットである。従って、各検体中の、ｍｉＲＮＡ含む全成熟ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを得た。
【0096】
得られたｃＤＮＡのうちｍｉＲＮＡには、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）とＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いたＲＴ－ｑＰＣＲを、同梱のプロトコルの通りに実施することで定量した。５’ヌクレアーゼアッセイの１つであるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、ターゲットを増幅するためのプライマーと、その分子内で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じており、かつ、ターゲットに特異的に結合するＴａｑＭａｎプローブとを併用することにより、検出精度が優れていることを特徴とする増幅方法である。このＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を適用することで得られるｃＤＮＡの定量値は、例えば、各プローブ及びプライマーに対応するｃＤＮＡが検出基準に達するまでのサイクル数（Ｃｔ値）である。
【0097】
なお、定量値については、個体毎にｍｉＲＮＡ全体の活動レベルが異なる場合があること、及び、検体の処理において抽出や増幅反応の収率が細胞や検体の種類ごとに異なる場合があることを考慮し、健常者及び各種がん罹患体の血清試料に共通して存在するｍｉＲＮＡ（標準ｍｉＲＮＡ）の定量値をもって補正していた。具体的には、健常者及び各種がん罹患体のうちのいずれの検体においても発現量が多いことが知られているｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ（配列番号１３３）の定量値を用いた。各ｍｉＲＮＡのＣｔ値からｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐのＣｔ値を引算することで正規化し、差分（△Ｃｔ値）が発現量の指標となるように補正した。
【0098】
なお、上述のように補正した各ｍｉＲＮＡの定量値は、健常者、乳がん罹患体、膵臓がん罹患体又は大腸がん罹患体の個々の検体ごと（すなわち、個体ごと）に得られる値である。よって、同種の検体を複数集めてなる群（例えば健常者の検体群）ごとに、定量結果を取り扱う場合には、複数の定量値の集合が得られる。このような複数の定量値の集合は、同種の検体群であったとしても個体差があることから、ある程度の分散を有する数値分布である。
【0099】
本実施例では、同種の検体群において観察される各ｍｉＲＮＡの定量値の数値分布が正規分布に従うものと仮定した。同正規分布における外れ値となる定量値は分析対象から除くことが好ましいので、外れ値にあたる定量値を除いたうえ、各検体群における各ｍｉＲＮＡの定量値の平均値を算出した。同平均値は、各検体群を代表する定量値と解釈することもできる。
【0100】
・定量の結果
上述したように算出した、各がん種罹患体における各ｍｉＲＮＡの定量値の平均値は、健常者の各ｍｉＲＮＡの定量値の平均値で相対化し（すなわち、対健常者発現比に換算し）、表３－１～表３－７に示した。
上述したように算出した、各がん種罹患体における各ｍｉＲＮＡの定量値の平均値は、健常者の各ｍｉＲＮＡの定量値の平均値で相対化し（すなわち、対健常者発現比に換算し）、表３－１～表３－７に示した。
【0101】
表３－１～表３－７に示すように、計９４種類のｍｉＲＮＡが検出可能であった。表３－１～表３－７中における「－」は、健常者、乳がん罹患体、膵臓がん罹患体及び大腸がん罹患体において、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法による増幅が十分にみられず、検出の基準値に達しなかったデータを表している。
【0102】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【0103】
・マーカーの選定
以下、前述の９４種類のｍｉＲＮＡの中から、乳がん罹患体、膵臓がん罹患体又は大腸がんのそれぞれに特徴的なｍｉＲＮＡ、すなわち、各がん種のマーカーを選定した。
以下、前述の９４種類のｍｉＲＮＡの中から、乳がん罹患体、膵臓がん罹患体又は大腸がんのそれぞれに特徴的なｍｉＲＮＡ、すなわち、各がん種のマーカーを選定した。
【0104】
各ｍｉＲＮＡががん種にとって特徴的であるか否かは、あるがん種の検体群（以下、検体群Ａとする）を代表する定量値（例えば平均値）のｌｏｇ２ｆｏｌｄ値と、他のがん種又は健常者の検体群（以下、検体群Ｂとする）を代表する定量値（例えば平均値）のｌｏｇ２ｆｏｌｄ値との差が２以上かどうかを基準として決定することができる。換言すれば、あるｍｉＲＮＡについて、検体群Ａの定量値の平均が、検体群Ｂの定量値の平均の２倍以上であるか又は２分の１以下である場合に、同ｍｉＲＮＡは検体群Ａにとって特徴的であり、検体群Ａのがん種の罹患の有無を示すマーカーであると決定してもよい。
【0105】
ただし、前述したように、各検体群における各ｍｉＲＮＡの複数の定量値は、ある程度の分散を有する数値分布である。数値分布の重複度合いによっては、検体群Ａと検体群Ｂとを区別できない場合がある。従って、検体群Ａと検体群Ｂとを統計的に区別できるか否かを検証することで、より精度の高いマーカー候補の選定が可能である。
【0106】
本実施例においては、膵臓がん用のマーカーの候補として、少なくとも健常体、乳がん罹患体及び大腸がん罹患体のうちのいずれか１つの検体群の定量値の平均値の２倍以上又は１／２以下である、膵臓がん罹患体の検体群の定量値の平均値が測定されたｍｉＲＮＡを選定した。さらに、選定した膵臓がんマーカーが統計的に有意であるか否かを検証した。
【0107】
同様に、大腸がん用のマーカーの候補として、健常体、乳がん罹患体、又は膵臓がん罹患体の検体群の定量値の平均値の２倍以上又は１／２以下である大腸がん罹患体の検体群の定量値の平均値から測定されたｍｉＲＮＡを選定し、統計的に有意であるかを検証した。
【0108】
・マーカー選定の結果
マーカーとして選定されたｍｉＲＮＡを、表４に示す。
マーカーとして選定されたｍｉＲＮＡを、表４に示す。
【0109】
【表4】
【0110】
表４に示すように、各がん種のがんマーカーを計１９種類特定することができた。すなわち、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７０（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ（配列番号１４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ（配列番号１８）及びｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ（配列番号１９）は、対象中のその存在度が健常体における存在度よりも小さいので、対象が乳がん、膵臓がん、または大腸がんに罹患していることを示す少発現標的ｍｉＲＮＡのマーカーであることが分かった。
【0111】
上記のうち、配列番号１０～１９の各ｍｉＲＮＡの健常体に対する比率を、それぞれ図３Ａ～図３Ｊに示した（配列番号１～９の箱ひげ図については、後述の例２において同様の結果を示すので、その図示を省略する）。図３Ａ～図３Jは箱ひげ図であり、横軸は各検体が罹患している各がん種を示し、縦軸は各検体において測定された各ｍｉＲＮＡの対健常者発現比（ｌｏｇ２ｆｏｌｄ値）を示す。
【0112】
図３Ａ～図３Jに示す定量値の分布を示す各ｍｉＲＮＡマーカーが、健常体、又はその他がん種と識別可能かどうかを検証した。具体的には、例えば対照を健常体とし、対象を乳がん、膵臓がん又は大腸がんの罹患体として、両者の間で各ｍｉＲＮＡの定量値のとりうる数値範囲が有意に異なるかどうかを検証した。同様に、対照を大腸がん罹患体、対象を乳がん又は膵臓がんの罹患体とする場合や、対照を乳がん罹患体、対象を膵臓がん罹患体とする場合などについても、各マーカーが統計的に有意に識別できるかどうかを検証した。
【0113】
統計解析の結果を表５及び６に示す。表５において、「＊」は有意水準（ｐ値）を０．０５よりも小さい値に設定した場合に有意であることを示し、「＊＊」は有意水準（ｐ値）を０．０１よりも小さい値に設定した場合に有意であることを示し、「＊＊＊」は有意水準（ｐ値）を０．００１よりも小さい値に設定した場合に有意であることを示し、「ｎ.ｓ」は有意な差異ではないことを示している。表６において、「減少」とは対照よりも対象の定量値の方が小さいことを示し、「増加」とは対照よりも対象の定量値の方が大きいことを示し、「ｎ.ｓ」は有意な差異ではないことを示している。なお、各ｍｉＲＮＡは略称で示した（例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐは、「１２６－３ｐ」と記載した）。
【0114】
【表5】
【0115】
【表6】
【0116】
表５及び６に示すように、配列番号１０～１９の各ｍｉＲＮＡの存在度を測定、比較することによって、対照と対象とを統計的に有意に区別できることが分かる。従って、配列番号１０～１９の各ｍｉＲＮＡは、乳がん、膵臓がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することが可能なマーカーであることが示された。
【0117】
例２．より広範に亘るマーカー探索と選定
例１と同様の方法によるｍｉＲＮＡマーカーの探索を、検体数とその種類を増やして再度実行した。
例１と同様の方法によるｍｉＲＮＡマーカーの探索を、検体数とその種類を増やして再度実行した。
【0118】
・検体の用意
検体として、乳がん患者血清、膵臓がん患者血清、肺がん患者血清、胃がん患者血清、大腸がん患者血清及び健常者血清を計５７６検体分用意した。それぞれの検体数は、表４に示したように、乳がん患者血清が１００検体、膵臓がん患者血清が９９検体、肺がん患者血清が９９検体、胃がん患者検体が９９検体、大腸がん検体が９８検体及び健常者血清が８１検体であった。
検体として、乳がん患者血清、膵臓がん患者血清、肺がん患者血清、胃がん患者血清、大腸がん患者血清及び健常者血清を計５７６検体分用意した。それぞれの検体数は、表４に示したように、乳がん患者血清が１００検体、膵臓がん患者血清が９９検体、肺がん患者血清が９９検体、胃がん患者検体が９９検体、大腸がん検体が９８検体及び健常者血清が８１検体であった。
【0119】
・検体の処理とｍｉＲＮＡの定量
上記の検体は、例１と同様の方法でｍｉＲＮＡを抽出し、各種ｍｉＲＮＡを定量した。各定量値については、標準ｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐの定量値で補正し、健常者、乳がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、及び大腸がんの群間でその発現量比を求めた。
上記の検体は、例１と同様の方法でｍｉＲＮＡを抽出し、各種ｍｉＲＮＡを定量した。各定量値については、標準ｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐの定量値で補正し、健常者、乳がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、及び大腸がんの群間でその発現量比を求めた。
【0120】
・定量結果と統計的検証
例２で特定された、９種のｍｉＲＮＡマーカーの定量値を図４Ａ～図４Ｉに示した。図４Ａ～図４Ｉは箱ひげ図であり、横軸は各検体が罹患している各がん種を示し、縦軸は各検体において測定された定量値の相対比を示している。
例２で特定された、９種のｍｉＲＮＡマーカーの定量値を図４Ａ～図４Ｉに示した。図４Ａ～図４Ｉは箱ひげ図であり、横軸は各検体が罹患している各がん種を示し、縦軸は各検体において測定された定量値の相対比を示している。
【0121】
図４Ａ～図４Ｉに示す定量値の分布を示す各ｍｉＲＮＡマーカーが、健常体、又はその他がん種と識別可能かどうかを検証した。具体的には、例えば対照を健常体とし、対象を乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん又は大腸がんの罹患体として、両者の間で各ｍｉＲＮＡの定量値のとりうる数値範囲が有意に異なるかどうかを検証した。同様に、対照を大腸がん罹患体、対象を乳がん、膵臓がん、肺がん又は胃がんの罹患体とする場合、対照を乳がん罹患体、対象を膵臓がん、肺がん又は胃がんとする場合、並びに、対照を肺がん罹患体、対象を膵臓がん又は胃がんとする場合についても、各マーカーが統計的に有意に識別できるかどうかを検証した。
【0122】
統計解析の結果を表７及び表８に示す。表７において、「＊」は有意水準（ｐ値）を０．０５よりも小さい値に設定した場合に有意であることを示し、「＊＊」は有意水準（ｐ値）を０．０１よりも小さい値に設定した場合に有意であることを示し、「＊＊＊」は有意水準（ｐ値）を０．００１よりも小さい値に設定した場合に有意であることを示し、「ｎ.ｓ」は有意な差異ではないことを示している。表８において、「減少」とは対照よりも対象の定量値の方が小さいことを示し、「増加」とは対照よりも対象の定量値の方が大きいことを示し、「ｎ.ｓ」は有意な差異ではないことを示している。なお、各ｍｉＲＮＡは略称で示した（例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－５ｐは、「１９０ａ－５ｐ」と記載した）。
【0123】
【表7】
【0124】
【表8】
【0125】
以上の通り、配列番号１～９の各ｍｉＲＮＡの存在度を測定、比較することによって、対照と対象とを統計的に有意に区別できることが分かる。従って、配列番号１～９の各ｍｉＲＮＡは、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん及び大腸がんの全てについて、対象における罹患の可能性があると判定することが可能なマーカーであることが示された。
【0126】
本発明の幾つかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これらの実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【配列表】