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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025025916
(43)【公開日】2025-02-21
(54)【発明の名称】食物アレルギーを予防するための栄養組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/125 20160101AFI20250214BHJP
A61P 3/02 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/702 20060101ALI20250214BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/715 20060101ALI20250214BHJP
A23C 9/152 20060101ALI20250214BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20250214BHJP
【ＦＩ】
A23L33/125
A61P3/02
A61K31/702
A61P37/08
A61K31/715
A23C9/152
A23L2/00 F
A23L2/52 101
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023131157
(22)【出願日】2023-08-10
(71)【出願人】
【識別番号】711002926
【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】502392559
【氏名又は名称】雪印ビーンスターク株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山口 敏幸
(72)【発明者】
【氏名】河野 通生
(72)【発明者】
【氏名】樋口 淳一
(72)【発明者】
【氏名】福留 博文
(72)【発明者】
【氏名】酒井 史彦
(72)【発明者】
【氏名】辻森 祐太
【テーマコード（参考）】
4B001
4B018
4B117
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B001AC01
4B001AC05
4B001AC06
4B001AC15
4B001BC03
4B001BC08
4B001EC05
4B001EC06
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD09
4B018MD25
4B018MD27
4B018MD29
4B018MD34
4B018MD52
4B018ME07
4B117LC04
4B117LE10
4B117LG03
4B117LK08
4B117LK11
4B117LK12
4B117LP14
4B117LP17
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA01
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZB13
4C086ZC21
4C086ZC51
(57)【要約】
【課題】本発明は、母乳の成分から食物アレルギーの発症を予防するための成分を見出し、新たな栄養組成物を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ルイスＸ構造を有する糖鎖を有効成分として含むことを特徴とする、食物アレルギーの発症を予防するための栄養組成物に関する。本栄養組成物は、乳児だけでなく食物アレルギーのリスクが高い成人にも有効な成分となることから、成人向けの食品、栄養組成物に配合して、食物アレルギーの発症を予防する栄養組成物としても有効である。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ルイスＸ構造を有する糖鎖を有効成分として含むことを特徴とする、食物アレルギーの発症を予防するための栄養組成物に関する。本栄養組成物は、乳児だけでなく食物アレルギーのリスクが高い成人にも有効な成分となることから、成人向けの食品、栄養組成物に配合して、食物アレルギーの発症を予防する栄養組成物としても有効である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
糖鎖を有効成分とする食物アレルギーを予防するための栄養組成物であって、３－フコシルラクトース、ルイスＸ構造を有する糖鎖及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩからなる群のいずれか1以上を有効成分として含む前記栄養組成物。
【請求項2】
前記ルイスＸ構造を有する糖鎖が以下の（１）または（２）に示す構造のＯ結合型糖鎖である、請求項１に記載の栄養組成物。
（１）Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃ
（２）Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃ
（１）Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃ
（２）Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃ
【請求項3】
乳幼児用である、請求項１又は請求項２に記載の栄養組成物。
【請求項4】
請求項１又は２に記載の食物アレルギーを予防するための栄養組成物を含む、食物アレルギー予防用飲食品。
【請求項5】
請求項１又は２に記載の食物アレルギーを予防するための栄養組成物を含む、食物アレルギー予防用医薬品。
【請求項6】
Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃを３．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物。
【請求項7】
Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃを０．１４ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、食物アレルギーを予防するための栄養組成物に関する。特に詳しくは、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ及びルイスＸ構造を有する糖鎖からなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む食物アレルギーを予防するための栄養組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
食物アレルギーとは、食物によって引き起こされる抗原特異的な免疫学的機序を介して生体にとって不利益な症状が惹起される現象と定義される。特定の食物を摂取したり、触れたりすることで、アレルギー反応が現れる疾患であり、食品によってはアナフィラキシーショックを発症して命に係わることもある。一部の集団では、後にアトピー性皮膚炎や喘息へと進展する。
【0003】
食物アレルギーは、多くは乳幼児期に発症し、鶏卵と牛乳が主要な原因である。成人期以降では、甲殻類、小麦、果物、魚介類などが主要な食物アレルギーの原因食品である。食物アレルギーは０歳時を頂点にして年齢と共に有病率は減っていくものの、成人になっても管理が必要な場合も多い。また、成人してから突発的に発症することもある。
【0004】
したがって、全ての人にとって食物アレルギーを予防することは、健康な社会生活を営む上で重要であり、その予防法については、様々な検討がなされてきた。例えば、妊娠中や授乳中の母親の食事制限や、離乳食の開始時期などにより、食物アレルギーが予防される可能性が示されている。しかし、未だに十分なエビデンスはなく、効果的な食物アレルギーの予防法はない。
【0005】
ところで、母乳には、乳児にとって有用な様々な成分が含まれていることが知られている。本発明者らは、食物アレルギーの発症を予防する有効成分を探索するにあたり、母乳に含まれる成分に注目した。母乳には、様々な有用な成分が含まれており、特に、母乳に含まれるオリゴ糖を中心とした糖質によって、アレルギー反応が緩和されたり、低減されたりする可能性が報告されている（特許文献１、特許文献２）。しかし、母乳成分が具体的に食物アレルギーの発症自体を予防せしめることが可能か否かは不明であり、母乳中のどのような成分が食物アレルギーの発症を予防することが可能かを類推することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特表２０００―５０４０１９号公報
【特許文献2】特開２０２１―１３０６６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、母乳の成分の中に食物アレルギーの発症を予防せしめる成分を見出すことができれば、その成分を乳児用栄養組成物に配合することで、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物を供給することができるのではないかと考えた。また、当該成分は、乳児だけでなく成人にも有効な成分となることから、成人や高齢者向けの食品、栄養組成物に配合して、食物アレルギーの発症を予防する栄養組成物として供給することも可能であると考えた。
本発明の課題は、母乳の成分から食物アレルギーの発症を予防するための成分を見出し、新たな栄養組成物を提供することを課題とする。
本発明の課題は、母乳の成分から食物アレルギーの発症を予防するための成分を見出し、新たな栄養組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、母乳中の食物アレルギーの発症を予防する成分を探索するため、母乳中の糖質成分の量と乳児の食物アレルギー発症歴との関係を統計的に解析し、食物アレルギーの発症を予防する新たな成分について鋭意検討した結果、母乳中の、３－フコシルラクトース（以下、単に３－ＦＬということがある）、ラクト－Ｎ－フコペンタオース－ＩＩ（以下、単にＬＮＦＰ－ＩＩということがある）、および２種類のＯ結合型糖鎖（Ｏ結合型糖鎖Ａ、Ｏ結合型糖鎖Ｂ）が食物アレルギーの予防に効果を有することを見出した。さらに、Ｏ結合型糖鎖Ａ、およびＯ結合型糖鎖Ｂの構造を解析した結果、両者は共通のルイスＸ構造を有するＯ結合型糖鎖であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、３－ＦＬ，ＬＮＦＰ－ＩＩ、またはルイスＸ構造を有する糖鎖を有効成分として含むことを特徴とする、食物アレルギーの発症を予防する、乳児用栄養組成物、および栄養組成物である。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。
すなわち、本発明は、３－ＦＬ，ＬＮＦＰ－ＩＩ、またはルイスＸ構造を有する糖鎖を有効成分として含むことを特徴とする、食物アレルギーの発症を予防する、乳児用栄養組成物、および栄養組成物である。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。
【0009】
＜１＞
糖鎖を有効成分とする食物アレルギーを予防するための栄養組成物であって、３－フコシルラクトース、ルイスＸ構造を有する糖鎖及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩからなる群のいずれか１以上を有効成分として含む前記栄養組成物。
＜２＞
前記ルイスＸ構造を有する糖鎖が以下の（１）または（２）に示す構造であるＯ結合型糖鎖である、＜１＞に記載の栄養組成物。
（１）Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃ
（２）Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃ
＜３＞
乳幼児用である、＜１＞又は＜２＞に記載の栄養組成物。
＜４＞
＜１＞又は＜２＞に記載の食物アレルギーを予防するための栄養組成物を含む、食物アレルギー予防用飲食品。
＜５＞
＜１＞又は＜２＞に記載の食物アレルギーを予防するための栄養組成物を含む、食物アレルギー予防用医薬品。
＜６＞
Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃを３．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物。
＜７＞
Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃを０．１４ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物。
糖鎖を有効成分とする食物アレルギーを予防するための栄養組成物であって、３－フコシルラクトース、ルイスＸ構造を有する糖鎖及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩからなる群のいずれか１以上を有効成分として含む前記栄養組成物。
＜２＞
前記ルイスＸ構造を有する糖鎖が以下の（１）または（２）に示す構造であるＯ結合型糖鎖である、＜１＞に記載の栄養組成物。
（１）Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃ
（２）Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃ
＜３＞
乳幼児用である、＜１＞又は＜２＞に記載の栄養組成物。
＜４＞
＜１＞又は＜２＞に記載の食物アレルギーを予防するための栄養組成物を含む、食物アレルギー予防用飲食品。
＜５＞
＜１＞又は＜２＞に記載の食物アレルギーを予防するための栄養組成物を含む、食物アレルギー予防用医薬品。
＜６＞
Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃを３．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物。
＜７＞
Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃを０．１４ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、食物アレルギーを予防する新規な栄養組成物が提供される。当該栄養組成物は、有効成分として、３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、およびルイスＸ構造を有する糖鎖からなる群から１以上を含むものであり、これを摂取することで、食物アレルギーの発症を予防することができる。また、当該成分は、乳児だけでなく、成人や高齢者の食物アレルギーの発症をも予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】母乳中の３－ＦＬの濃度が乳児の食物アレルギーの発症に与える影響を示す。
【図2】母乳中のＬＮＦＰ－ＩＩの濃度が乳児の食物アレルギーの発症に与える影響を示す。
【図3】母乳中のＯ結合型糖鎖Ａの濃度が乳児の食物アレルギーの発症に与える影響を示す。
【図4】母乳中のＯ結合型糖鎖Ｂの濃度が乳児の食物アレルギーの発症に与える影響を示す。
【図5】母乳中のルイスＸ糖鎖の濃度が乳児の食物アレルギーの発症に与える影響を示す。
【図6】ヒト大腸杯細胞モデルＬＳ１７４Ｔ細胞に１０ｍｇ／ｍｌのルイスＸ糖鎖を添加して４８時間後のＴＦＦ３遺伝子（腸管バリア関連遺伝子）の発現量を示す。図中、＊Ｐ＜０．０５を示す。
【図7】ヒト単球由来細胞株ＴＨＰ－１を樹状細胞様に分化させたＴＤＤＣにＬＰＳと各種糖鎖を添加して３日間後のＨＬＡ－ＤＲ（樹状細胞活性化マーカー）の発現量を示す。図中、小文字アルファベットは異なる文字間で有意差があることを示す。
【図8】ヒト単球由来細胞株ＴＨＰ－１を樹状細胞様に分化させたＴＤＤＣにＬＰＳと各種糖鎖を添加して３日間後のＣＤ８６（樹状細胞活性化マーカー）の発現量を示す。図中、小文字アルファベットは異なる文字間で有意差があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
（有効成分）
本発明の食物アレルギーを予防するための栄養組成物は、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ及びルイスＸ構造を有する糖鎖からなる群のいずれか１以上を有効成分として含むことを特徴としている。また、本発明の栄養組成物には、食物アレルギーを予防するための有効量の前記糖鎖が含まれる。以下に各有効成分及び栄養組成物の固形物１００ｇあたりの必要量の好ましい範囲について説明する。
本発明の食物アレルギーを予防するための栄養組成物は、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ及びルイスＸ構造を有する糖鎖からなる群のいずれか１以上を有効成分として含むことを特徴としている。また、本発明の栄養組成物には、食物アレルギーを予防するための有効量の前記糖鎖が含まれる。以下に各有効成分及び栄養組成物の固形物１００ｇあたりの必要量の好ましい範囲について説明する。
【0013】
（３－フコシルラクトース（３－ＦＬ））
本発明に用いられる３－フコシルラクト―スは、フコースとラクトースが結合したオリゴ糖（3-O-(α-L-Fucopyranosyl)-4-O-(β-D-galactopyranosyl)-D-glucopyranose）である。
本発明において、３－ＦＬは、乳由来、遺伝子組換え細菌の発酵法由来でもよく、合成品、半合成品、又は天然品のいずれであってもよい。また、天然品を含有する天然の材料をそのまま供給源として、本発明の栄養組成物に配合してもよい。ここで、天然品とは、３－ＦＬを含有する天然の材料から公知の方法によって抽出されたもの、粗精製されたもの、又はそれらを更に高度に精製したものを意味する。
本発明の３－ＦＬを有効成分とする栄養組成物は、３－ＦＬを７０．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含むことが好ましく、さらに好ましくは３４８ｍｇ／１００ｇ固形以上である。なお、栄養組成物が粉ミルクの場合、調乳後の乳には９１．１ｍｇ／Ｌ以上の３－ＦＬが含まれることが好ましく、さらに好ましくは４５２ｍｇ／Ｌ以上である。
本発明に用いられる３－フコシルラクト―スは、フコースとラクトースが結合したオリゴ糖（3-O-(α-L-Fucopyranosyl)-4-O-(β-D-galactopyranosyl)-D-glucopyranose）である。
本発明において、３－ＦＬは、乳由来、遺伝子組換え細菌の発酵法由来でもよく、合成品、半合成品、又は天然品のいずれであってもよい。また、天然品を含有する天然の材料をそのまま供給源として、本発明の栄養組成物に配合してもよい。ここで、天然品とは、３－ＦＬを含有する天然の材料から公知の方法によって抽出されたもの、粗精製されたもの、又はそれらを更に高度に精製したものを意味する。
本発明の３－ＦＬを有効成分とする栄養組成物は、３－ＦＬを７０．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含むことが好ましく、さらに好ましくは３４８ｍｇ／１００ｇ固形以上である。なお、栄養組成物が粉ミルクの場合、調乳後の乳には９１．１ｍｇ／Ｌ以上の３－ＦＬが含まれることが好ましく、さらに好ましくは４５２ｍｇ／Ｌ以上である。
【0014】
（ラクト－Ｎ－フコペンタオース－ＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ））
本発明において、ＬＮＦＰ－ＩＩは、乳由来、遺伝子組換え細菌の発酵法由来でもよく、合成品、半合成品、又は天然品のいずれであってもよい。また、天然品を含有する天然の材料をそのまま供給源として、本発明の栄養組成物に配合してもよい。ここで、天然品とは、ＬＮＦＰ－ＩＩを含有する天然の材料から公知の方法によって抽出されたもの、粗精製されたもの、又はそれらを更に高度に精製したものを意味する。
本発明のＬＮＦＰ－ＩＩを有効成分とする栄養組成物は、ＬＮＦＰ－ＩＩを０．６８ｍｇ／１００ｇ固形以上含むことが好ましく、さらに好ましくは２４３ｍｇ／１００ｇ固形以上である。なお、調乳後の乳に０．８８ｍｇ／Ｌ以上のＬＮＦＰ－ＩＩが含まれることが好ましく、さらに好ましくは３１５ｍｇ／Ｌ以上である。
本発明において、ＬＮＦＰ－ＩＩは、乳由来、遺伝子組換え細菌の発酵法由来でもよく、合成品、半合成品、又は天然品のいずれであってもよい。また、天然品を含有する天然の材料をそのまま供給源として、本発明の栄養組成物に配合してもよい。ここで、天然品とは、ＬＮＦＰ－ＩＩを含有する天然の材料から公知の方法によって抽出されたもの、粗精製されたもの、又はそれらを更に高度に精製したものを意味する。
本発明のＬＮＦＰ－ＩＩを有効成分とする栄養組成物は、ＬＮＦＰ－ＩＩを０．６８ｍｇ／１００ｇ固形以上含むことが好ましく、さらに好ましくは２４３ｍｇ／１００ｇ固形以上である。なお、調乳後の乳に０．８８ｍｇ／Ｌ以上のＬＮＦＰ－ＩＩが含まれることが好ましく、さらに好ましくは３１５ｍｇ／Ｌ以上である。
【0015】
（ルイスＸ構造を有する糖鎖）
本発明におけるルイスＸ構造を有する糖鎖とは、糖鎖構造中にGalβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc構造を有し、食物アレルギーの発症を低下させる糖鎖をいう。具体的には、Neu5Acα2-3Galβ1-3[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-6]GalNAc（以下、単にＯ結合型糖鎖Ａということがある）や、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3GalNAc（以下、単にＯ結合型糖鎖Ｂということがある）を指す。他にも、例えば、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Gal、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-2Manα1-3(Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAcなどが挙げられる。ルイスＸ構造を有する糖鎖を以下、単に「ルイスＸ糖鎖」ということがある。
本発明におけるルイスＸ構造を有する糖鎖とは、糖鎖構造中にGalβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc構造を有し、食物アレルギーの発症を低下させる糖鎖をいう。具体的には、Neu5Acα2-3Galβ1-3[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-6]GalNAc（以下、単にＯ結合型糖鎖Ａということがある）や、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3GalNAc（以下、単にＯ結合型糖鎖Ｂということがある）を指す。他にも、例えば、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Gal、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-2Manα1-3(Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAcなどが挙げられる。ルイスＸ構造を有する糖鎖を以下、単に「ルイスＸ糖鎖」ということがある。
【0016】
本発明のルイスＸ糖鎖は、遊離した状態であっても、ペプチド及び／又はタンパク質に結合した状態であってもよい。また、乳由来、卵由来、肉由来、微生物由来、遺伝子組換え細菌の発酵法由来でもよく、合成品、半合成品、又は天然品のいずれであってもよい。また、天然品を含有する天然の材料をそのまま供給源として、本発明の栄養組成物に配合してもよい。ここで、天然品とは、ルイスＸ糖鎖を含有する天然の材料から公知の方法によって抽出されたもの、粗精製されたもの、又はそれらを更に高度に精製したものを意味する。
【0017】
本発明のルイスＸ糖鎖を有効成分とする栄養組成物は、ルイスＸ糖鎖を３．３μｍｏｌ／１００ｇ固形以上であることが好ましく、さらに好ましくは７．８μｍｏｌ／１００ｇ固形以上である。なお、調乳後の乳に４．３μｍｏｌ／Ｌ以上のルイスＸ糖鎖が含まれることが好ましく、さらに好ましくは１０．１μｍｏｌ／Ｌ以上である。
【0018】
（Ｏ結合型糖鎖Ａ）
本発明において、Ｏ結合型糖鎖ＡであるNeu5Acα2-3Galβ1-3[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-6]GalNAcを有効成分とする栄養組成物は、Ｏ結合型糖鎖Ａを３．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含むことが好ましく、さらに好ましくは８．０ｍｇ／１００ｇ固形以上である。なお、調乳後の乳に４．０ｍｇ／Ｌ以上のＯ結合型糖鎖Ａが含まれることが好ましく、さらに好ましくは１０．４ｍｇ／Ｌ以上である。
本発明において、Ｏ結合型糖鎖ＡであるNeu5Acα2-3Galβ1-3[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-6]GalNAcを有効成分とする栄養組成物は、Ｏ結合型糖鎖Ａを３．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含むことが好ましく、さらに好ましくは８．０ｍｇ／１００ｇ固形以上である。なお、調乳後の乳に４．０ｍｇ／Ｌ以上のＯ結合型糖鎖Ａが含まれることが好ましく、さらに好ましくは１０．４ｍｇ／Ｌ以上である。
【0019】
（Ｏ結合型糖鎖Ｂ）
本発明において、Ｏ結合型糖鎖ＢであるGalβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3GalNAcを有効成分とする栄養組成物は、Ｏ結合型糖鎖Ｂを０．１４ｍｇ／１００ｇ固形以上含むことが好ましく、さらに好ましくは０．２５ｍｇ／１００ｇ固形以上である。なお、調乳後の乳に０．１８ｍｇ／Ｌ以上のＯ結合型糖鎖Ｂが含まれることが好ましく、さらに好ましくは０．３３ｍｇ／Ｌ以上である。
本発明において、Ｏ結合型糖鎖ＢであるGalβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3GalNAcを有効成分とする栄養組成物は、Ｏ結合型糖鎖Ｂを０．１４ｍｇ／１００ｇ固形以上含むことが好ましく、さらに好ましくは０．２５ｍｇ／１００ｇ固形以上である。なお、調乳後の乳に０．１８ｍｇ／Ｌ以上のＯ結合型糖鎖Ｂが含まれることが好ましく、さらに好ましくは０．３３ｍｇ／Ｌ以上である。
【0020】
（食物アレルギーの予防効果）
本発明の食物アレルギーを予防するための栄養組成物は、３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ルイスＸ糖鎖を有効量摂取することにより、食物アレルギーの発症を予防できるという効果を有するものであり、作用機序としては、後述する実施例に示すように腸管バリア機能の強化や樹状細胞の活性化抑制作用などが挙げられる。当該作用を有することで食物の種類を問わず食物アレルギーの予防効果を奏すると考えられる。
本発明の食物アレルギーを予防するための栄養組成物は、３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ルイスＸ糖鎖を有効量摂取することにより、食物アレルギーの発症を予防できるという効果を有するものであり、作用機序としては、後述する実施例に示すように腸管バリア機能の強化や樹状細胞の活性化抑制作用などが挙げられる。当該作用を有することで食物の種類を問わず食物アレルギーの予防効果を奏すると考えられる。
【0021】
（栄養組成物、飲食品、医薬品）
本発明の３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ルイスＸ糖鎖（以下、これらをまとめて単に３－ＦＬ等ということがある）を有効成分として含む食物アレルギーを予防するための栄養組成物は、３－ＦＬ等を有効量含む組成物であればよく、有効成分以外にタンパク質、脂肪、糖質、ビタミン類及びミネラル類などを含むことができ、乳幼児用の栄養組成物のほか、成人や高齢者用の栄養組成物として用いられる。
乳幼児用栄養組成物としては、乳児用調製粉乳および調製液状乳、幼児用調製粉乳（フォローアップミルクおよびグローイングアップミルク）、低出生体重児用調製粉乳、牛乳アレルギー疾患用アレルゲン除去食品および乳糖不耐症用乳糖除去食品などが挙げられる。
また、成人や高齢者用の栄養組成物としては、成人用調製粉乳および調製液状乳、牛乳アレルギー疾患用アレルゲン除去食品、乳糖不耐症用乳糖除去食品、サプリメントなどが挙げられる。
また、本発明の３－ＦＬ等を含む食物アレルギーを予防するための飲食品としては、３－ＦＬ等を有効量含む飲食品であればどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
本発明の食物アレルギーを予防するための栄養組成物は、そのまま医薬品の原材料として用いることができ、錠剤、カプセル、粉末、シロップ等の常法により製造すれば良い。
したがって、本発明の３－ＦＬ等を有効成分として含む食物アレルギー予防用の組成物を有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、３－ＦＬ等を含む組成物をそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、食物アレルギー予防効果を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
本発明の３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ルイスＸ糖鎖（以下、これらをまとめて単に３－ＦＬ等ということがある）を有効成分として含む食物アレルギーを予防するための栄養組成物は、３－ＦＬ等を有効量含む組成物であればよく、有効成分以外にタンパク質、脂肪、糖質、ビタミン類及びミネラル類などを含むことができ、乳幼児用の栄養組成物のほか、成人や高齢者用の栄養組成物として用いられる。
乳幼児用栄養組成物としては、乳児用調製粉乳および調製液状乳、幼児用調製粉乳（フォローアップミルクおよびグローイングアップミルク）、低出生体重児用調製粉乳、牛乳アレルギー疾患用アレルゲン除去食品および乳糖不耐症用乳糖除去食品などが挙げられる。
また、成人や高齢者用の栄養組成物としては、成人用調製粉乳および調製液状乳、牛乳アレルギー疾患用アレルゲン除去食品、乳糖不耐症用乳糖除去食品、サプリメントなどが挙げられる。
また、本発明の３－ＦＬ等を含む食物アレルギーを予防するための飲食品としては、３－ＦＬ等を有効量含む飲食品であればどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
本発明の食物アレルギーを予防するための栄養組成物は、そのまま医薬品の原材料として用いることができ、錠剤、カプセル、粉末、シロップ等の常法により製造すれば良い。
したがって、本発明の３－ＦＬ等を有効成分として含む食物アレルギー予防用の組成物を有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、３－ＦＬ等を含む組成物をそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、食物アレルギー予防効果を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
【0022】
（乳幼児用栄養組成物）
本発明のさらなる態様は、特定のルイスＸ糖鎖を一定以上含む乳幼児用栄養組成物に関する。すなわち、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃを３．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物、または、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃを０．１４ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物である。
本発明のさらなる態様は、特定のルイスＸ糖鎖を一定以上含む乳幼児用栄養組成物に関する。すなわち、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６］ＧａｌＮＡｃを３．１ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物、または、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３ＧａｌＮＡｃを０．１４ｍｇ／１００ｇ固形以上含む乳幼児用栄養組成物である。
【実施例0023】
[試験例１]
１５５検体の母乳試料について各種糖質成分を測定し、乳児の生後１年間の食物アレルギーの発症の有無との関係をロジスティック回帰で解析した。以下に、その方法と結果を示す。
１５５検体の母乳試料について各種糖質成分を測定し、乳児の生後１年間の食物アレルギーの発症の有無との関係をロジスティック回帰で解析した。以下に、その方法と結果を示す。
【0024】
１．方法
（１）母乳サンプルと乳児の感染履歴の調査
雪印ビーンスターク（株）が２０１４年から２０１９年の間に実施した日本人の母乳成分と母子の健康状態との関係を調査するための前向きコホート研究（UMIN ID 000015494）において、１２１０人の母親から集められた母乳サンプルと母子の健康状態を調査したアンケート結果を本調査に使用した。さらに、１２１０人の検体からランダムに２００検体を選抜した。分析に供する母乳サンプルとして、出産後１から２か月までの間に採取された母乳を使用した。乳児の健康状態を調査したアンケートは、出産後１年の間に２か月おきに計６回を親が記入し、その結果を収集した。そのアンケート結果の中から、乳児が出産後１年間に医師から食物アレルギーの発症と診断されたか否かの結果を集計した。診断の有無について記載が不明の場合は、調査から除外した。その結果、１年間計６回のアンケートにおいて、食物アレルギーの診断の有無を適正に回答されたものは１５５検体であり、それらを本調査の分析対象とした。１５５検体のうち、出産後１年間に乳児が食物アレルギーと診断されたものは、１８検体であった。
（１）母乳サンプルと乳児の感染履歴の調査
雪印ビーンスターク（株）が２０１４年から２０１９年の間に実施した日本人の母乳成分と母子の健康状態との関係を調査するための前向きコホート研究（UMIN ID 000015494）において、１２１０人の母親から集められた母乳サンプルと母子の健康状態を調査したアンケート結果を本調査に使用した。さらに、１２１０人の検体からランダムに２００検体を選抜した。分析に供する母乳サンプルとして、出産後１から２か月までの間に採取された母乳を使用した。乳児の健康状態を調査したアンケートは、出産後１年の間に２か月おきに計６回を親が記入し、その結果を収集した。そのアンケート結果の中から、乳児が出産後１年間に医師から食物アレルギーの発症と診断されたか否かの結果を集計した。診断の有無について記載が不明の場合は、調査から除外した。その結果、１年間計６回のアンケートにおいて、食物アレルギーの診断の有無を適正に回答されたものは１５５検体であり、それらを本調査の分析対象とした。１５５検体のうち、出産後１年間に乳児が食物アレルギーと診断されたものは、１８検体であった。
【0025】
（２）母乳の各種糖質成分の測定
（２－１）オリゴ糖の測定
分析対象とした１５５検体の母乳２０μＬに対して、５８０μＬの超純水を添加した後、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜処理を行い、透過液をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣは、電気化学検出器を接続したＤＩＯＮＥＸ ＩＣＳ－５０００ＤＰシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、カラムはＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用した。移動相には超純水（Ａ液）、２００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液（Ｂ液）、および６００ｍＭ 酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液（Ｃ液）の３液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液した。開始から１０分間Ｂ液５０％で通液し、その後１８分までにＢ液を４７．５％まで直線的に減少、Ｃ液を５％まで直線的に増加させた。１８分から２８分にかけてはＢ液４７．５％、Ｃ液５％で通液した。２８分から３２分にかけて、Ｂ液を４２％まで直線的に減少、Ｃ液を１６％まで直線的に増加させた。３２分から３９分にかけてはＢ液４２％、Ｃ液１６％で通液した後、３９分から４３分にかけてＢ液３０％、Ｃ液４０％で通液した。濃度既知の２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、３’－シアリルラクトース、６’－シアリルラクトース、ラクトジフコテトラオース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ、およびラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩの標準品を用いて作成した検量線から、各母乳検体中の各オリゴ糖含量を算出した。
（２－１）オリゴ糖の測定
分析対象とした１５５検体の母乳２０μＬに対して、５８０μＬの超純水を添加した後、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜処理を行い、透過液をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣは、電気化学検出器を接続したＤＩＯＮＥＸ ＩＣＳ－５０００ＤＰシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、カラムはＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用した。移動相には超純水（Ａ液）、２００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液（Ｂ液）、および６００ｍＭ 酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液（Ｃ液）の３液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液した。開始から１０分間Ｂ液５０％で通液し、その後１８分までにＢ液を４７．５％まで直線的に減少、Ｃ液を５％まで直線的に増加させた。１８分から２８分にかけてはＢ液４７．５％、Ｃ液５％で通液した。２８分から３２分にかけて、Ｂ液を４２％まで直線的に減少、Ｃ液を１６％まで直線的に増加させた。３２分から３９分にかけてはＢ液４２％、Ｃ液１６％で通液した後、３９分から４３分にかけてＢ液３０％、Ｃ液４０％で通液した。濃度既知の２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、３’－シアリルラクトース、６’－シアリルラクトース、ラクトジフコテトラオース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ、およびラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩの標準品を用いて作成した検量線から、各母乳検体中の各オリゴ糖含量を算出した。
【0026】
（２－２）Ｎ結合型糖鎖の測定
分析対象とした１５５検体の母乳２０μＬに対して、１０μＬの３Ｍ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を添加し、室温で３０分間静置した。続いて、７．５μＬの酢酸を添加し、室温で３０分間静置した。１５μＬの１Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液、および７．５μＬの超純水を添加した。続けて、５μＬの５％のラウリル硫酸ナトリウムを含む４００ｍＭジチオスレイトール水溶液を添加し、１００℃で１０分間加熱してタンパク質変性させた。室温まで放冷し、１０μＬの１２３ｍＭヨードアセトアミド水溶液を添加して、室温で１時間静置した。７μＬの５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ ６．０）、および９μＬの１０％ ＮＰ－４０溶液を添加後、１０μＬの５００ｕｎｉｔｓ／μＬ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｎ－ｇｌｙｃａｎａｓｅ Ｆ溶液を添加し、３７℃で２４時間静置して、Ｎ結合型糖鎖を遊離した。１０９μＬの超純水を加えた後、全量を分画分子量１０，０００のＶｉｖａｓｐｉｎ ５００（ザルトリウス株式会社）へ導入し、１５，０００×ｇ、２５℃で１０分間遠心分離処理し、透過液を回収した。５０μＬの透過液に５０μＬのアセトニトリルを加え、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。ＬＣ／ＭＳ分析は以下のように行った。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。ＭＳスペクトルは、ポジティブモードでｍ／ｚ ４００－２０００の範囲でフルスキャン測定により取得した。取得したＭＳスペクトルは、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ２．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて解析した。既報の乳タンパク質のＮ結合型糖鎖から構築した糖鎖データベースと照合することで、糖鎖を検出した。また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒにより各糖鎖の分子イオンピークに対応する抽出クロマトグラムを作成し、各母乳検体中の検出した各糖鎖のシグナル面積値を算出した。算出した糖鎖のシグナル面積値を各糖鎖の相対定量値とした。
分析対象とした１５５検体の母乳２０μＬに対して、１０μＬの３Ｍ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を添加し、室温で３０分間静置した。続いて、７．５μＬの酢酸を添加し、室温で３０分間静置した。１５μＬの１Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液、および７．５μＬの超純水を添加した。続けて、５μＬの５％のラウリル硫酸ナトリウムを含む４００ｍＭジチオスレイトール水溶液を添加し、１００℃で１０分間加熱してタンパク質変性させた。室温まで放冷し、１０μＬの１２３ｍＭヨードアセトアミド水溶液を添加して、室温で１時間静置した。７μＬの５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ ６．０）、および９μＬの１０％ ＮＰ－４０溶液を添加後、１０μＬの５００ｕｎｉｔｓ／μＬ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｎ－ｇｌｙｃａｎａｓｅ Ｆ溶液を添加し、３７℃で２４時間静置して、Ｎ結合型糖鎖を遊離した。１０９μＬの超純水を加えた後、全量を分画分子量１０，０００のＶｉｖａｓｐｉｎ ５００（ザルトリウス株式会社）へ導入し、１５，０００×ｇ、２５℃で１０分間遠心分離処理し、透過液を回収した。５０μＬの透過液に５０μＬのアセトニトリルを加え、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。ＬＣ／ＭＳ分析は以下のように行った。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。ＭＳスペクトルは、ポジティブモードでｍ／ｚ ４００－２０００の範囲でフルスキャン測定により取得した。取得したＭＳスペクトルは、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ２．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて解析した。既報の乳タンパク質のＮ結合型糖鎖から構築した糖鎖データベースと照合することで、糖鎖を検出した。また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒにより各糖鎖の分子イオンピークに対応する抽出クロマトグラムを作成し、各母乳検体中の検出した各糖鎖のシグナル面積値を算出した。算出した糖鎖のシグナル面積値を各糖鎖の相対定量値とした。
【0027】
（２－３）Ｏ結合型糖鎖の測定
分析対象とした１５５検体の母乳に対して、Ｏ結合型糖鎖解析キットＥＺＧｌｙｃｏ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（住友ベークライト株式会社）に付属の糖鎖遊離試薬を添加し、５０℃で２０分間加熱した。超純水で希釈した後、分画分子量１０，０００のＶｉｖａｓｐｉｎ ５００へ導入し、１５，０００×ｇ、２５℃で１５分間遠心分離処理し、透過液を回収した。５０μＬの透過液に５０μＬのアセトニトリルを加え、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅを用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。ＭＳスペクトルは、ポジティブモードでｍ／ｚ ３００－２０００の範囲でフルスキャン測定により取得した。取得したＭＳスペクトルは、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ２．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて解析した。Ｏ結合型糖鎖データベースと照合することで、糖鎖を検出した。また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒにより各糖鎖の分子イオンピークに対応する抽出クロマトグラムを作成し、各母乳検体中の検出した各糖鎖のシグナル面積値を算出した。算出した糖鎖のシグナル面積値を各糖鎖の相対定量値とした。
分析対象とした１５５検体の母乳に対して、Ｏ結合型糖鎖解析キットＥＺＧｌｙｃｏ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（住友ベークライト株式会社）に付属の糖鎖遊離試薬を添加し、５０℃で２０分間加熱した。超純水で希釈した後、分画分子量１０，０００のＶｉｖａｓｐｉｎ ５００へ導入し、１５，０００×ｇ、２５℃で１５分間遠心分離処理し、透過液を回収した。５０μＬの透過液に５０μＬのアセトニトリルを加え、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅを用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。ＭＳスペクトルは、ポジティブモードでｍ／ｚ ３００－２０００の範囲でフルスキャン測定により取得した。取得したＭＳスペクトルは、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ２．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて解析した。Ｏ結合型糖鎖データベースと照合することで、糖鎖を検出した。また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒにより各糖鎖の分子イオンピークに対応する抽出クロマトグラムを作成し、各母乳検体中の検出した各糖鎖のシグナル面積値を算出した。算出した糖鎖のシグナル面積値を各糖鎖の相対定量値とした。
【0028】
（３）Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの構造決定
（３－１）構造解析
上記「Ｏ結合型糖鎖の測定」において調製した１５５検体の試料のうちの１検体について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行い、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの構造解析を行った。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は以下のように行った。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅを用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ポジティブモードで、データ依存的にＴｏｐ１０モードで取得した。取得したＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＳｉｍＧｌｙｃａｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して解析し、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの構造を解析した。
（３－１）構造解析
上記「Ｏ結合型糖鎖の測定」において調製した１５５検体の試料のうちの１検体について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行い、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの構造解析を行った。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は以下のように行った。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅを用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ポジティブモードで、データ依存的にＴｏｐ１０モードで取得した。取得したＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＳｉｍＧｌｙｃａｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して解析し、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの構造を解析した。
【0029】
（３－２）結合様式の決定
Ｏ結合型糖鎖Ａに含まれるＮ－アセチルノイラミン酸の結合様式を決定するため、α２，３結合を特異的に分解するシアリダーゼ、またはα２，３とα２，６結合の両方を分解するシアリダーゼ、のいずれかで処理した後にＬＣ／ＭＳで解析した。また、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂに含まれるフコースの結合様式を決定するため、α１，２結合を特異的に分解するフコシダーゼ、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼ、またはα１，２、α１，４およびα１，６結合を特異的に分解するフコシダーゼ、のいずれかで処理した後にＬＣ／ＭＳで解析した。さらに、ガラクトースの結合様式を決定するため、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼと同時にβ１，３結合を特異的に分解するガラクトシダーゼ、またはα１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼと同時に、β１，４結合を特異的に分解するガラクトシダーゼ、のいずれかで処理した後にＬＣ／ＭＳで解析した。上記（３－１）と同一の１検体について、１０μＬのＯ結合型糖鎖溶液に、２７μＬの超純水と５μＬの酵素に付属の緩衝液、５μＬの酵素に付属のウシ血清アルブミン溶液を添加した後、３μＬの各酵素溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。沸騰水中で５分間加熱して酵素を失活させた後、上記（２－４）と同じ方法で処理してＬＣ／ＭＳ分析に供した。ＬＣ／ＭＳ分析は以下のように行った。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅを用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。取得したＭＳスペクトルは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して解析した。
Ｏ結合型糖鎖Ａに含まれるＮ－アセチルノイラミン酸の結合様式を決定するため、α２，３結合を特異的に分解するシアリダーゼ、またはα２，３とα２，６結合の両方を分解するシアリダーゼ、のいずれかで処理した後にＬＣ／ＭＳで解析した。また、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂに含まれるフコースの結合様式を決定するため、α１，２結合を特異的に分解するフコシダーゼ、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼ、またはα１，２、α１，４およびα１，６結合を特異的に分解するフコシダーゼ、のいずれかで処理した後にＬＣ／ＭＳで解析した。さらに、ガラクトースの結合様式を決定するため、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼと同時にβ１，３結合を特異的に分解するガラクトシダーゼ、またはα１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼと同時に、β１，４結合を特異的に分解するガラクトシダーゼ、のいずれかで処理した後にＬＣ／ＭＳで解析した。上記（３－１）と同一の１検体について、１０μＬのＯ結合型糖鎖溶液に、２７μＬの超純水と５μＬの酵素に付属の緩衝液、５μＬの酵素に付属のウシ血清アルブミン溶液を添加した後、３μＬの各酵素溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。沸騰水中で５分間加熱して酵素を失活させた後、上記（２－４）と同じ方法で処理してＬＣ／ＭＳ分析に供した。ＬＣ／ＭＳ分析は以下のように行った。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅを用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。取得したＭＳスペクトルは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して解析した。
【0030】
（４）Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの絶対定量
食物アレルギーの発症と関連性が認められたＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂについて、母乳中の絶対量を測定した。Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの含有量は、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂを蛍光標識した後に、質量分析計（ＭＳ）と蛍光検出器（ＦＬ）を接続したＨＰＬＣで測定した。別途算出したＯ結合型糖鎖解析キットの回収率で除することで、母乳中のＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの含有量を算出した。
食物アレルギーの発症と関連性が認められたＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂについて、母乳中の絶対量を測定した。Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの含有量は、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂを蛍光標識した後に、質量分析計（ＭＳ）と蛍光検出器（ＦＬ）を接続したＨＰＬＣで測定した。別途算出したＯ結合型糖鎖解析キットの回収率で除することで、母乳中のＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの含有量を算出した。
【0031】
Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの測定について、詳細を以下に記す。分析対象とした１５５検体の母乳から無作為に選択した１検体の母乳１０μLを、Ｏ結合型糖鎖解析キットＥｚＧｌｙｃｏ Ｏ－ｇｌｙｃａｎ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（住友ベークライト）を使用して、２－アミノベンズアミド（ＡＢ）標識および精製を行った後、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。ＨＰＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００、ＭＳはＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅを用いた。カラムはＧｌｙｃａｎＰａｃ ＡＸＨ－１を使用し、カラム温度は４０℃に設定した。移動相はアセトニトリル（Ａ液）、およびｐＨを４．４に調製した５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｂ液）を使用し、流速は０．４ｍＬ／分で通液した。試料導入後、５５分までにＢ液の割合を１０％から３５％まで直線的に増加させた後、５５分から６５分までＢ液３５％で通液した。ＥＳＩプローブのスプレー電圧は３．５ｋＶ、キャピラリー温度は２７５℃、Ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ、ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ、およびｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓには窒素ガスを用いた。Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌは９０に設定した。ＭＳ測定は、ポジティブモードでｍ／ｚ ８５３．３５６６、およびｍ／ｚ １３０６．５０４９の選択イオンモニタリング測定を行った。蛍光測定は、励起波長３３０ｎｍ、および蛍光波長４２０ｎｍで行った。取得したＭＳクロマトグラム、および蛍光クロマトグラムはＦｒｅｅＳｔｙｌｅソフトウェアを使用して解析し、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの蛍光面積値を得た。濃度既知の蛍光標識Ｏ結合型糖鎖標準品（Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ－ＡＢ）を使用して作成した検量線から、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂを定量した。さらに、別途算出した当該キットの回収率で除することで、母乳中のＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの含有量を算出した。上記「Ｏ結合型糖鎖の測定」により取得済みの１５５検体の母乳の相対定量値を使用して、１５５検体のそれぞれの母乳中のＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの絶対定量値を得た。
【0032】
（５）母乳中の各種糖質成分の含有量と食物アレルギーとの関連性の解析
１５５検体の母乳について、分泌型母乳（２’－ＦＬ＞１００ ｍｇ／Ｌ）と非分泌型母乳（２’－ＦＬ＜１００ ｍｇ／Ｌ）の２群に分け、食物アレルギーとの関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定により評価した。また、オリゴ糖、Ｎ結合型糖鎖、およびＯ結合型糖鎖の濃度と、乳児の食物アレルギーの発症との関係をロジスティック回帰で分析した。調整因子として、乳児の性別、兄姉の有無、出産方法（自然分娩、帝王切開）、出生体重を用いた。
１５５検体の母乳について、分泌型母乳（２’－ＦＬ＞１００ ｍｇ／Ｌ）と非分泌型母乳（２’－ＦＬ＜１００ ｍｇ／Ｌ）の２群に分け、食物アレルギーとの関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定により評価した。また、オリゴ糖、Ｎ結合型糖鎖、およびＯ結合型糖鎖の濃度と、乳児の食物アレルギーの発症との関係をロジスティック回帰で分析した。調整因子として、乳児の性別、兄姉の有無、出産方法（自然分娩、帝王切開）、出生体重を用いた。
【0033】
（６）ルイスＸ糖鎖と腸管バリア機能との関連性の評価
（６－１）細胞および試薬
ヒト大腸杯細胞モデルＬＳ１７４Ｔ細胞（ＥＣ８７０６０４０１－Ｆ０）は、株式会社ケー・エー・シーより購入した。培地は、アール塩、ＮＥＡＡ、Ｌ－グルタミン含有ＭＥＭ（２１４４３－１５, ｎａｃａｌａｉ）に１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％ Ｐ/Ｓ（１５１４０－１２２, Ｇｉｂｃｏ）を添加したものを使用した。培養は３７℃、５％ ＣＯ２条件下で行った。ルイスＸ（ＯＬ０６４９０）はＢｉｏｓｙｎｔｈより購入した。
（６－１）細胞および試薬
ヒト大腸杯細胞モデルＬＳ１７４Ｔ細胞（ＥＣ８７０６０４０１－Ｆ０）は、株式会社ケー・エー・シーより購入した。培地は、アール塩、ＮＥＡＡ、Ｌ－グルタミン含有ＭＥＭ（２１４４３－１５, ｎａｃａｌａｉ）に１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％ Ｐ/Ｓ（１５１４０－１２２, Ｇｉｂｃｏ）を添加したものを使用した。培養は３７℃、５％ ＣＯ２条件下で行った。ルイスＸ（ＯＬ０６４９０）はＢｉｏｓｙｎｔｈより購入した。
【0034】
（６－２）ＬＳ１７４Ｔ細胞へのサンプル添加試験
ＬＳ１７４Ｔ細胞を１×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように４８－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（３８３０－０４８, ＡＧＣテクノグラス株式会社）に播種した。一晩培養したのち、ＰＢＳで1回洗浄して、各種サンプルを５または１０ｍｇ／ｍｌ含む培地に培地交換し、４８時間培養した。
ＬＳ１７４Ｔ細胞を１×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように４８－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（３８３０－０４８, ＡＧＣテクノグラス株式会社）に播種した。一晩培養したのち、ＰＢＳで1回洗浄して、各種サンプルを５または１０ｍｇ／ｍｌ含む培地に培地交換し、４８時間培養した。
【0035】
（６－３）ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、遺伝子発現量測定
細胞をＰＢＳで1回洗浄し、核酸抽出試薬（Ｍａｘｗｅｌｌ(R) ＲＳＣ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ，ＡＳ１３４０，Ｐｒｏｍｅｇａ）および装置（Ｍａｘｗｅｌｌ(R) ＲＳＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＦＳＱ－２０１，Ｔｏｙｏｂｏ）を使用して逆転写し、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡについて、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ(R) ＮｅｘｔＳＹＢＲ(R) ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＱＰＸ－２０１，Ｔｏｙｏｂｏ）とＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｎｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴＦＦ３遺伝子（ＴＦＦ３）およびハウスキーピング遺伝子である１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１８Ｓ ｒＲＮＡ）の発現量を測定した。いずれの遺伝子についても検量線を作成して相対発現量を算出し、１８Ｓ ｒＲＮＡ発現量で補正した。使用したプライマーは下表に示した。
細胞をＰＢＳで1回洗浄し、核酸抽出試薬（Ｍａｘｗｅｌｌ(R) ＲＳＣ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ，ＡＳ１３４０，Ｐｒｏｍｅｇａ）および装置（Ｍａｘｗｅｌｌ(R) ＲＳＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＦＳＱ－２０１，Ｔｏｙｏｂｏ）を使用して逆転写し、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡについて、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ(R) ＮｅｘｔＳＹＢＲ(R) ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＱＰＸ－２０１，Ｔｏｙｏｂｏ）とＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｎｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴＦＦ３遺伝子（ＴＦＦ３）およびハウスキーピング遺伝子である１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１８Ｓ ｒＲＮＡ）の発現量を測定した。いずれの遺伝子についても検量線を作成して相対発現量を算出し、１８Ｓ ｒＲＮＡ発現量で補正した。使用したプライマーは下表に示した。
【0036】
【表1】
【0037】
（６－４）統計解析
データは相加平均＋標準偏差で示した。二群比較はSｔｕｄｅｎｔ’s ｔ－ｔｅｓｔにて実施した。コントロール群との多重比較はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔにて実施した。有意水準はＰ＝０．０５とした。
データは相加平均＋標準偏差で示した。二群比較はSｔｕｄｅｎｔ’s ｔ－ｔｅｓｔにて実施した。コントロール群との多重比較はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔにて実施した。有意水準はＰ＝０．０５とした。
【0038】
（７）３－ＦＬと樹状細胞との関連性の評価
（７－１）細胞および試薬
ヒト単球由来細胞株ＴＨＰ－１は、ＡＴＣＣより入手した。培地は、ＲＰＭＩ １６４０培地（３０２６４－８５，Ｎａｃａｌａｉ）に１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ Ｐ／Ｓ（１５１４０－１２２，Ｇｉｂｃｏ） および０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール（１３３－１４５７１, 富士フィルム和光純薬株式会社）を添加したものを使用した。培養は３７℃、５％ ＣＯ２条件下で行った。
Ｌａｃｔｏｓｅ Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（１２８－０００９５）は富士フィルム和光純薬株式会社より購入した。２’－ＦＬ（ＯＦ１３７５５３）及び３－ＦＬ（ＯＦ０５６７３）はＣａｒｂｏｓｙｎｔｈより購入した。Ｌｅｗｉｓ Ａ Ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ （ＯＬ０４５４１）及びＬｅｗｉｓ Ｘ Ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＯＬ０６４９０）はＢｉｏｓｙｎｔｈより購入した。Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＧＭ－ＣＳＦ（１７３６５－８８）およびＨｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＬ－４（１９２６８－０８）はＰｅｐｒｏＴｅｃｈより購入した。Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ （４２０２０１, Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８６ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（３７４２０３）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－ＤＲ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（３０７６０５）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（４００１０７）、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ，κ ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（４００２１１）、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（４２３１０１）およびＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸＴＭ （４２２３０２）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄより購入した。
（７－１）細胞および試薬
ヒト単球由来細胞株ＴＨＰ－１は、ＡＴＣＣより入手した。培地は、ＲＰＭＩ １６４０培地（３０２６４－８５，Ｎａｃａｌａｉ）に１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ Ｐ／Ｓ（１５１４０－１２２，Ｇｉｂｃｏ） および０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール（１３３－１４５７１, 富士フィルム和光純薬株式会社）を添加したものを使用した。培養は３７℃、５％ ＣＯ２条件下で行った。
Ｌａｃｔｏｓｅ Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（１２８－０００９５）は富士フィルム和光純薬株式会社より購入した。２’－ＦＬ（ＯＦ１３７５５３）及び３－ＦＬ（ＯＦ０５６７３）はＣａｒｂｏｓｙｎｔｈより購入した。Ｌｅｗｉｓ Ａ Ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ （ＯＬ０４５４１）及びＬｅｗｉｓ Ｘ Ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＯＬ０６４９０）はＢｉｏｓｙｎｔｈより購入した。Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＧＭ－ＣＳＦ（１７３６５－８８）およびＨｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＬ－４（１９２６８－０８）はＰｅｐｒｏＴｅｃｈより購入した。Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ （４２０２０１, Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８６ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（３７４２０３）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－ＤＲ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（３０７６０５）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（４００１０７）、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ，κ ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（４００２１１）、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（４２３１０１）およびＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸＴＭ （４２２３０２）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄより購入した。
【0039】
（７－２）ＴＨＰ－１由来樹状細胞（ＴＨＰ－１ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ, ＴＤＤＣ）へのサンプル添加試験
ＴＨＰ－１細胞を５×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｍｌとなるように６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （３８１０－００６, ＡＧＣテクノグラス株式会社）に播種し、１５００ Ｕ/ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ、１５００ Ｕ/ｍｌ ＩＬ－４を含む培地で６日間培養 （３日目に培地交換） してＴＤＤＣに分化させた。６日目にＴＤＤＣを回収し、２×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（３８６０－０９６, ＡＧＣテクノグラス株式会社） に播種し、１００ ｎｇ/ｍｌ ＬＰＳおよび１０ ｍｇ/ｍｌの各種糖鎖 （２’-ＦＬ, ３-ＦＬ、ルイスＡ糖鎖、ルイスＸ糖鎖） を含む培地で３日間培養した。
ＴＨＰ－１細胞を５×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｍｌとなるように６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （３８１０－００６, ＡＧＣテクノグラス株式会社）に播種し、１５００ Ｕ/ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ、１５００ Ｕ/ｍｌ ＩＬ－４を含む培地で６日間培養 （３日目に培地交換） してＴＤＤＣに分化させた。６日目にＴＤＤＣを回収し、２×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（３８６０－０９６, ＡＧＣテクノグラス株式会社） に播種し、１００ ｎｇ/ｍｌ ＬＰＳおよび１０ ｍｇ/ｍｌの各種糖鎖 （２’-ＦＬ, ３-ＦＬ、ルイスＡ糖鎖、ルイスＸ糖鎖） を含む培地で３日間培養した。
【0040】
（７－３）表面抗原染色およびＦＡＣＳ解析
回収したＴＤＤＣをＰＢＳで洗浄し、生細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ/ｔｕｂｅ以上になるようにＦＡＣＳ用チューブに入れた。遠心して上清を除き、Ｚｏｍｂｉｅ Ｄｙｅ／ＰＢＳを添加して室温、暗所で１５分間反応させた。１５分後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した。遠心して上清を除き、０．１％ＰＦＡ／ＰＢＳを添加して室温、暗所で２０分間反応させた。２０分後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した。遠心して上清を除き、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸＴＭ／Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加して４℃、暗所で１０分間反応させた。１０分後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した。遠心して上清を除き、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで希釈した各種細胞表面染色液を添加し、暗所で３０分間反応させた。３０分後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄し、ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ ＩＩ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。フローサイトメトリーの分析結果から、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８６のＭｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）を算出した。
回収したＴＤＤＣをＰＢＳで洗浄し、生細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ/ｔｕｂｅ以上になるようにＦＡＣＳ用チューブに入れた。遠心して上清を除き、Ｚｏｍｂｉｅ Ｄｙｅ／ＰＢＳを添加して室温、暗所で１５分間反応させた。１５分後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した。遠心して上清を除き、０．１％ＰＦＡ／ＰＢＳを添加して室温、暗所で２０分間反応させた。２０分後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した。遠心して上清を除き、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸＴＭ／Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加して４℃、暗所で１０分間反応させた。１０分後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した。遠心して上清を除き、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで希釈した各種細胞表面染色液を添加し、暗所で３０分間反応させた。３０分後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄し、ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ ＩＩ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。フローサイトメトリーの分析結果から、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８６のＭｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）を算出した。
【0041】
（７－４）統計解析
データは相加平均±標準偏差で示した。群間比較はＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔにて実施した。有意水準はＰ＝０．０５とした。
データは相加平均±標準偏差で示した。群間比較はＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔにて実施した。有意水準はＰ＝０．０５とした。
【0042】
２．結果
（１）分泌型母乳と非分泌型母乳における各種糖質成分の含有量と乳児の食物アレルギー発症との関係
１５５検体の母乳について、分泌型母乳（２’－ＦＬ＞１００ ｍｇ／Ｌ）と非分泌型母乳（２’－ＦＬ＜１００ ｍｇ／Ｌ）の２群に分けたところ、非分泌型母乳を摂取した乳児では食物アレルギーの発症は認められなかった（表２）。また、両者での乳児の食物アレルギーの発症との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定に供した結果、ｐ＜０．０５以下となり、非分泌型母乳を飲んだ乳児の方が、食物アレルギーの発症率が有意に低いことが示された。
（１）分泌型母乳と非分泌型母乳における各種糖質成分の含有量と乳児の食物アレルギー発症との関係
１５５検体の母乳について、分泌型母乳（２’－ＦＬ＞１００ ｍｇ／Ｌ）と非分泌型母乳（２’－ＦＬ＜１００ ｍｇ／Ｌ）の２群に分けたところ、非分泌型母乳を摂取した乳児では食物アレルギーの発症は認められなかった（表２）。また、両者での乳児の食物アレルギーの発症との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定に供した結果、ｐ＜０．０５以下となり、非分泌型母乳を飲んだ乳児の方が、食物アレルギーの発症率が有意に低いことが示された。
【0043】
【表2】
【0044】
上記の結果から、非分泌型母乳を飲んだ乳児では食物アレルギーの発症リスクが低下することが明らかとなった。そこで、非分泌型母乳中のどの成分が食物アレルギーの発症予防に関係するのかを探索した。
分泌型母乳と比較して非分泌型母乳で含量が高かったオリゴ糖（４種類）、Ｎ結合型糖鎖（２種類）、およびＯ結合型糖鎖（５種類）について、母乳中でのそれぞれの濃度と乳児の食物アレルギーの発症との関係をロジスティック回帰で解析した。解析結果の一部を表３に示した。
解析の結果、３－ＦＬ（ｐ＝０．０３４）、ＬＮＦＰ－ＩＩ（ｐ＝０．０３５）、Ｏ結合型糖鎖Ａ（ｐ＝０．０２２）と、食物アレルギーとの間に有意な関連性が認められ、Ｏ結合型糖鎖Ｂ（ｐ＝０．０８９）と食物アレルギーとの間に関連性がある傾向が認められた。これら糖質成分と食物アレルギーの発症との間では回帰係数が負であり、オッズ比は１未満であったことから、３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、Ｏ結合型糖鎖Ａ、またはＯ結合型糖鎖Ｂの含量が多い母乳を飲んだ乳児では食物アレルギーの発症リスクが低下することが示された。
分泌型母乳と比較して非分泌型母乳で含量が高かったオリゴ糖（４種類）、Ｎ結合型糖鎖（２種類）、およびＯ結合型糖鎖（５種類）について、母乳中でのそれぞれの濃度と乳児の食物アレルギーの発症との関係をロジスティック回帰で解析した。解析結果の一部を表３に示した。
解析の結果、３－ＦＬ（ｐ＝０．０３４）、ＬＮＦＰ－ＩＩ（ｐ＝０．０３５）、Ｏ結合型糖鎖Ａ（ｐ＝０．０２２）と、食物アレルギーとの間に有意な関連性が認められ、Ｏ結合型糖鎖Ｂ（ｐ＝０．０８９）と食物アレルギーとの間に関連性がある傾向が認められた。これら糖質成分と食物アレルギーの発症との間では回帰係数が負であり、オッズ比は１未満であったことから、３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、Ｏ結合型糖鎖Ａ、またはＯ結合型糖鎖Ｂの含量が多い母乳を飲んだ乳児では食物アレルギーの発症リスクが低下することが示された。
【0045】
【表3】
【0046】
（２）３－ＦＬについての乳児の食物アレルギー発症予防効果の確認
乳児の食物アレルギーの発症の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳の３－ＦＬの濃度を比較した結果、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりも３－ＦＬ濃度が高い傾向を示した（図１）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルの３－ＦＬを含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の３－ＦＬ濃度の分布範囲は３８～２３４１ｍｇ／Ｌであり、中央値は５５７ｍｇ／Ｌであった（表４）。３－ＦＬ濃度の分布は、正規分布とは異なり濃度の高い方に裾の広がりを示す分布であった。このような分布は、乳幼児の身長や体重の分布でも認められており、乳幼児の発育曲線を作成する際には、全体の分布の３から９７パーセンタイルの間を基準としている（平成１２年乳幼児身体発育調査報告書）。これを参考にして、母乳における３－ＦＬ濃度の範囲として、３から９７パーセンタイルを基準とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の３－ＦＬ濃度としては、分布で３パーセンタイルに相当する９１．１ｍｇ／Ｌが最低値であった。また、母乳中の３－ＦＬ濃度を４５２ｍｇ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの発症の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定に供した結果、ｐ＜０．０５以下となり、母乳中の３－ＦＬ濃度が４５２ｍｇ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に９１．１ｍｇ／Ｌ以上の３－ＦＬが含まれることが必要であり、好ましくは４５２ ｍｇ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で７０．１ｍｇ以上の３－ＦＬを配合することが必要であり、好ましくは３４８ｍｇ以上の３－ＦＬを配合することが望まれる。
また、食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーのリスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じ３－ＦＬ含量を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
乳児の食物アレルギーの発症の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳の３－ＦＬの濃度を比較した結果、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりも３－ＦＬ濃度が高い傾向を示した（図１）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルの３－ＦＬを含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の３－ＦＬ濃度の分布範囲は３８～２３４１ｍｇ／Ｌであり、中央値は５５７ｍｇ／Ｌであった（表４）。３－ＦＬ濃度の分布は、正規分布とは異なり濃度の高い方に裾の広がりを示す分布であった。このような分布は、乳幼児の身長や体重の分布でも認められており、乳幼児の発育曲線を作成する際には、全体の分布の３から９７パーセンタイルの間を基準としている（平成１２年乳幼児身体発育調査報告書）。これを参考にして、母乳における３－ＦＬ濃度の範囲として、３から９７パーセンタイルを基準とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の３－ＦＬ濃度としては、分布で３パーセンタイルに相当する９１．１ｍｇ／Ｌが最低値であった。また、母乳中の３－ＦＬ濃度を４５２ｍｇ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの発症の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定に供した結果、ｐ＜０．０５以下となり、母乳中の３－ＦＬ濃度が４５２ｍｇ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に９１．１ｍｇ／Ｌ以上の３－ＦＬが含まれることが必要であり、好ましくは４５２ ｍｇ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で７０．１ｍｇ以上の３－ＦＬを配合することが必要であり、好ましくは３４８ｍｇ以上の３－ＦＬを配合することが望まれる。
また、食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーのリスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じ３－ＦＬ含量を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
【0047】
【表4】
【0048】
（３）ＬＮＦＰ－ＩＩについての乳児の食物アレルギー発症予防効果の確認
乳児の食物アレルギーの発症の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度を比較した結果、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりもＬＮＦＰ－ＩＩ濃度が高い傾向を示した（図２）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルのＬＮＦＰ－ＩＩ濃度を含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳におけるＬＮＦＰ－ＩＩ濃度の分布の範囲は０～４１２３ｍｇ／Ｌであり、中央値は３８８ｍｇ／Ｌであった（表４）。３－ＦＬの分布と同様に、母乳のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度の分布も正規分布では無く、濃度の高い方に裾が広がる分布であったため、３～９７パーセンタイルを母乳のＬＮＦＰ－ＩＩの濃度範囲とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度は、３パーセンタイル以上に相当する０．８８ｍｇ／Ｌ以上と考えられる。また、母乳中のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度が３１５ｍｇ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの発症の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定で評価した結果、ｐ＜０．０５となり、母乳中のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度が３１５ｍｇ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に０．８８ｍｇ／Ｌ以上のＬＮＦＰ－ＩＩが含まれることが必要であり、好ましくは３１５ｍｇ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で０．６８ｍｇ以上のＬＮＦＰ－ＩＩを配合することが必要であり、好ましくは２４３ｍｇ以上のＬＮＦＰ－ＩＩを配合することが望まれる。食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーのリスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じＬＮＦＰ－ＩＩ含量を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
乳児の食物アレルギーの発症の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度を比較した結果、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりもＬＮＦＰ－ＩＩ濃度が高い傾向を示した（図２）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルのＬＮＦＰ－ＩＩ濃度を含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳におけるＬＮＦＰ－ＩＩ濃度の分布の範囲は０～４１２３ｍｇ／Ｌであり、中央値は３８８ｍｇ／Ｌであった（表４）。３－ＦＬの分布と同様に、母乳のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度の分布も正規分布では無く、濃度の高い方に裾が広がる分布であったため、３～９７パーセンタイルを母乳のＬＮＦＰ－ＩＩの濃度範囲とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度は、３パーセンタイル以上に相当する０．８８ｍｇ／Ｌ以上と考えられる。また、母乳中のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度が３１５ｍｇ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの発症の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定で評価した結果、ｐ＜０．０５となり、母乳中のＬＮＦＰ－ＩＩ濃度が３１５ｍｇ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に０．８８ｍｇ／Ｌ以上のＬＮＦＰ－ＩＩが含まれることが必要であり、好ましくは３１５ｍｇ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で０．６８ｍｇ以上のＬＮＦＰ－ＩＩを配合することが必要であり、好ましくは２４３ｍｇ以上のＬＮＦＰ－ＩＩを配合することが望まれる。食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーのリスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じＬＮＦＰ－ＩＩ含量を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
【0049】
（４）Ｏ結合型糖鎖Ａについての乳児の食物アレルギー発症予防効果の確認
乳児の食物アレルギーの発症の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳のＯ結合型糖鎖Ａの濃度を比較した結果、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりもＯ結合型糖鎖Ａ量が有意に高いレベルであった（図３）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルのＯ結合型糖鎖Ａの濃度を含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳におけるＯ結合型糖鎖Ａ濃度の分布の範囲は０．３３～３２１ｍｇ／Ｌであり、中央値は１５．２ｍｇ／Ｌであった（表４）。３－ＦＬの分布と同様に、母乳のＯ結合型糖鎖Ａの濃度分布も正規分布では無く、濃度の高い方に裾が広がる分布であったため、３～９７パーセンタイルを母乳のＯ結合型糖鎖Ａの濃度範囲とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳のＯ結合型糖鎖Ａ濃度は、３パーセンタイル以上に相当する４．０ｍｇ／Ｌ以上と考えられる。また、母乳中のＯ結合型糖鎖Ａ濃度が１０．４ｍｇ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの発症の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定で評価した結果、ｐ＜０．０５となり、母乳中のＯ結合型糖鎖Ａの濃度が１０．４ｍｇ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に４．０ｍｇ／Ｌ以上のＯ結合型糖鎖Ａが含まれることが必要であり、好ましくは１０．４ｍｇ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で３．１ｍｇ以上のＯ結合型糖鎖Ａを配合することが必要であり、好ましくは８．０ｍｇ以上のＯ結合型糖鎖Ａを配合することが望まれる。食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーのリスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じＯ結合型糖鎖Ａ含量を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
乳児の食物アレルギーの発症の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳のＯ結合型糖鎖Ａの濃度を比較した結果、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりもＯ結合型糖鎖Ａ量が有意に高いレベルであった（図３）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルのＯ結合型糖鎖Ａの濃度を含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳におけるＯ結合型糖鎖Ａ濃度の分布の範囲は０．３３～３２１ｍｇ／Ｌであり、中央値は１５．２ｍｇ／Ｌであった（表４）。３－ＦＬの分布と同様に、母乳のＯ結合型糖鎖Ａの濃度分布も正規分布では無く、濃度の高い方に裾が広がる分布であったため、３～９７パーセンタイルを母乳のＯ結合型糖鎖Ａの濃度範囲とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳のＯ結合型糖鎖Ａ濃度は、３パーセンタイル以上に相当する４．０ｍｇ／Ｌ以上と考えられる。また、母乳中のＯ結合型糖鎖Ａ濃度が１０．４ｍｇ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの発症の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定で評価した結果、ｐ＜０．０５となり、母乳中のＯ結合型糖鎖Ａの濃度が１０．４ｍｇ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に４．０ｍｇ／Ｌ以上のＯ結合型糖鎖Ａが含まれることが必要であり、好ましくは１０．４ｍｇ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で３．１ｍｇ以上のＯ結合型糖鎖Ａを配合することが必要であり、好ましくは８．０ｍｇ以上のＯ結合型糖鎖Ａを配合することが望まれる。食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーのリスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じＯ結合型糖鎖Ａ含量を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
【0050】
（５）Ｏ結合型糖鎖Ｂについての乳児の食物アレルギー発症予防効果の確認
乳児の食物アレルギーの発症の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳のＯ結合型糖鎖Ｂの濃度を比較した結果、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりもＯ結合型糖鎖Ｂ量が有意に高いレベルであった（図４）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルのＯ結合型糖鎖Ｂの濃度を含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳におけるＯ結合型糖鎖Ｂ濃度の分布の範囲は０．０７～２２．１ｍｇ／Ｌであり、中央値は１．２６ｍｇ／Ｌであった（表４）。３－ＦＬの分布と同様に、母乳のＯ結合型糖鎖Ｂ濃度の分布も正規分布では無く、濃度の高い方に裾が広がる分布であったため、３～９７パーセンタイルを母乳のＯ結合型糖鎖Ｂの濃度範囲とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳のＯ結合型糖鎖Ｂ濃度は、３パーセンタイル以上に相当する０．１８ｍｇ／Ｌ以上と考えられる。また、母乳中のジＯ結合型糖鎖Ｂの濃度が０．３３ｍｇ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの発症の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定で評価した結果、ｐ＜０．０５以下となり、母乳中のＯ結合型糖鎖Ｂの濃度が０．３３ｍｇ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に０．１８ｍｇ／Ｌ以上のＯ結合型糖鎖Ｂが含まれることが必要であり、好ましくは０．３３ｍｇ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で０．１４ｍｇ以上のＯ結合型糖鎖Ｂを配合することが必要であり、好ましくは０．２５ｍｇ以上のＯ結合型糖鎖Ｂを配合することが望まれる。食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーのリスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じＯ結合型糖鎖Ｂ含量を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
乳児の食物アレルギーの発症の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳のＯ結合型糖鎖Ｂの濃度を比較した結果、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりもＯ結合型糖鎖Ｂ量が有意に高いレベルであった（図４）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルのＯ結合型糖鎖Ｂの濃度を含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳におけるＯ結合型糖鎖Ｂ濃度の分布の範囲は０．０７～２２．１ｍｇ／Ｌであり、中央値は１．２６ｍｇ／Ｌであった（表４）。３－ＦＬの分布と同様に、母乳のＯ結合型糖鎖Ｂ濃度の分布も正規分布では無く、濃度の高い方に裾が広がる分布であったため、３～９７パーセンタイルを母乳のＯ結合型糖鎖Ｂの濃度範囲とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳のＯ結合型糖鎖Ｂ濃度は、３パーセンタイル以上に相当する０．１８ｍｇ／Ｌ以上と考えられる。また、母乳中のジＯ結合型糖鎖Ｂの濃度が０．３３ｍｇ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの発症の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定で評価した結果、ｐ＜０．０５以下となり、母乳中のＯ結合型糖鎖Ｂの濃度が０．３３ｍｇ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に０．１８ｍｇ／Ｌ以上のＯ結合型糖鎖Ｂが含まれることが必要であり、好ましくは０．３３ｍｇ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で０．１４ｍｇ以上のＯ結合型糖鎖Ｂを配合することが必要であり、好ましくは０．２５ｍｇ以上のＯ結合型糖鎖Ｂを配合することが望まれる。食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーのリスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じＯ結合型糖鎖Ｂ含量を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
【0051】
（６）Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの構造の決定
乳児の食物アレルギーの発症との関係性が認められた母乳中のＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの構造を調べるため、ＬＣ／ＭＳ測定、およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を実施した結果、Ｏ結合型糖鎖ＡはNeu5Ac-Galβ1-3[Gal-(Fuc-)GlcNAcβ1-6]GalNAc、Ｏ結合型糖鎖ＢはGal-(Fuc-)GlcNAcβ1-3GalNAcと推定された。Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂにおけるフコースの結合様式を決定するため、α１，２結合を特異的に分解するフコシダーゼ、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼ、またはα１，２、α１，４およびα１，６結合を特異的に分解するフコシダーゼ、のいずれかで処理した後にＬＣ／ＭＳ測定を行ったところ、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼを使用したときのみ、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの分解が認められたことから、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂのフコースはα１，３結合であることが明らかとなった。同様に、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼと同時に、β１，４結合を特異的に分解するガラクトシダーゼを作用させた場合に糖鎖の分解が認められたことから、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖ＢのＧｌｃＮＡｃに結合したガラクトースはβ１，４結合であることが明らかとなった。さらに、Ｏ結合型糖鎖Ａはα２，３結合を特異的に分解するシアリダーゼにより分解されたことから、Ｏ結合型糖鎖ＡのＮ－アセチルノイラミン酸はα２，３結合であることが明らかとなった。以上よりＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂは、下記の構造で表されるＯ結合型糖鎖であることが示された。
乳児の食物アレルギーの発症との関係性が認められた母乳中のＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの構造を調べるため、ＬＣ／ＭＳ測定、およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を実施した結果、Ｏ結合型糖鎖ＡはNeu5Ac-Galβ1-3[Gal-(Fuc-)GlcNAcβ1-6]GalNAc、Ｏ結合型糖鎖ＢはGal-(Fuc-)GlcNAcβ1-3GalNAcと推定された。Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂにおけるフコースの結合様式を決定するため、α１，２結合を特異的に分解するフコシダーゼ、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼ、またはα１，２、α１，４およびα１，６結合を特異的に分解するフコシダーゼ、のいずれかで処理した後にＬＣ／ＭＳ測定を行ったところ、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼを使用したときのみ、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂの分解が認められたことから、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂのフコースはα１，３結合であることが明らかとなった。同様に、α１，３およびα１，４結合を特異的に分解するフコシダーゼと同時に、β１，４結合を特異的に分解するガラクトシダーゼを作用させた場合に糖鎖の分解が認められたことから、Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖ＢのＧｌｃＮＡｃに結合したガラクトースはβ１，４結合であることが明らかとなった。さらに、Ｏ結合型糖鎖Ａはα２，３結合を特異的に分解するシアリダーゼにより分解されたことから、Ｏ結合型糖鎖ＡのＮ－アセチルノイラミン酸はα２，３結合であることが明らかとなった。以上よりＯ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂは、下記の構造で表されるＯ結合型糖鎖であることが示された。
【0052】
＜Ｏ結合型糖鎖Ａ＞
Neu5Acα2-3Galβ1-3[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-6]GalNAc
＜Ｏ結合型糖鎖Ｂ＞
Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3GalNAc
Neu5Acα2-3Galβ1-3[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-6]GalNAc
＜Ｏ結合型糖鎖Ｂ＞
Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3GalNAc
【0053】
Ｏ結合型糖鎖ＡおよびＯ結合型糖鎖Ｂは、共通してルイスＸ構造（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ）を有していたことから、ルイスＸ糖鎖が食物アレルギーの予防効果を示すと考えられる。
【0054】
（７）ルイスＸ糖鎖についての乳児の食物アレルギー予防効果の確認
Ｏ結合型糖鎖ＡとＯ結合型糖鎖Ｂは、両者ともに、非還元末端に、共通してルイスＸ構造を有する糖鎖であったことから、ルイスＸ糖鎖が食物アレルギーの予防効果を示すと考えられた。そこで、Ｏ結合型糖鎖ＡとＯ結合型糖鎖Ｂの母乳中の物質量（モル濃度）の合算値であるルイスＸ糖鎖の母乳中での物質量（モル濃度）と食物アレルギーの発症歴との関連性をロジスティック回帰で解析した。その結果、ｐ＝０．０１６であり、ルイスＸ糖鎖の母乳中での物質量（モル濃度）と食物アレルギーの発症歴との間には、統計的に有意な関連性があることが判明した（表５）。これらの関連性は、回帰係数がマイナス値であり、オッズ比が１未満であることから、母乳中のルイスＸ糖鎖の物質量（モル濃度）が高い母乳を飲んだ乳児では、食物アレルギーの発症リスクが低下することが示された。
Ｏ結合型糖鎖ＡとＯ結合型糖鎖Ｂは、両者ともに、非還元末端に、共通してルイスＸ構造を有する糖鎖であったことから、ルイスＸ糖鎖が食物アレルギーの予防効果を示すと考えられた。そこで、Ｏ結合型糖鎖ＡとＯ結合型糖鎖Ｂの母乳中の物質量（モル濃度）の合算値であるルイスＸ糖鎖の母乳中での物質量（モル濃度）と食物アレルギーの発症歴との関連性をロジスティック回帰で解析した。その結果、ｐ＝０．０１６であり、ルイスＸ糖鎖の母乳中での物質量（モル濃度）と食物アレルギーの発症歴との間には、統計的に有意な関連性があることが判明した（表５）。これらの関連性は、回帰係数がマイナス値であり、オッズ比が１未満であることから、母乳中のルイスＸ糖鎖の物質量（モル濃度）が高い母乳を飲んだ乳児では、食物アレルギーの発症リスクが低下することが示された。
【0055】
【表5】
【0056】
乳児の食物アレルギーの発症歴の有無で母乳サンプルを２群に分け、母乳のルイスＸ糖鎖の物質量（モル濃度）を比較した結果、食物アレルギーの発症歴の罹患が無かった乳児が飲んだ母乳の方が、発症した乳児が飲んだ母乳よりもルイスＸ糖鎖の物質量（モル濃度）が有意に高いレベルであった（図５）。このことは、乳児用栄養組成物において食物アレルギーの発症リスクを下げるには、食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳と同等レベルのルイスＸ糖鎖を含有する乳児用栄養組成物が有効であることを示している。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳におけるルイスＸ糖鎖の物質量の分布の範囲は０．６６～３０１．４μｍｏｌ／Ｌであり、中央値は１６．９μｍｏｌ／Ｌであった（表６）。３－ＦＬの分布と同様に、母乳のルイスＸ糖鎖の分布も正規分布では無く、濃度の高い方に裾が広がる分布であったため、３～９７パーセンタイルを母乳のルイスＸ糖鎖の濃度範囲とした。食物アレルギーの発症が無かった乳児が飲んだ母乳のルイスＸ糖鎖は、３パーセンタイル以上に相当する４．３μｍｏｌ／Ｌ以上と考えられる。また、母乳中のルイスＸ糖鎖が１０．１μｍｏｌ／Ｌ以上の検体と以下の検体の２群に分け、食物アレルギーの罹患の有無との関係をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定で評価した結果、ｐ＜０．０５となり、母乳中のルイスＸ糖鎖が１０．１μｍｏｌ／Ｌ以上では、食物アレルギーの発症リスクが低くなることが示された。
【0057】
【表6】
【0058】
したがって、食物アレルギーの発症を予防する乳児用栄養組成物としては、調乳後の乳に４．３μｍｏｌ／Ｌ以上のルイスＸ糖鎖が含まれることが必要であり、好ましくは１０．１μｍｏｌ／Ｌ以上が望まれる。調乳濃度を１３％とすると、乳児用栄養組成物の固形１００ｇあたり最低で３．３μｍｏｌ以上のルイスＸ糖鎖を配合することが必要であり、好ましくは７．８μｍｏｌ以上のルイスＸ糖鎖を配合することが望まれる。食物アレルギーの発症の機序は、乳児と成人で同じであることから、この乳児用栄養組成物の配合は、食物アレルギーの発症リスクが高い成人や高齢者にも有効であると考えられる。したがって、上記と同じルイスＸ糖鎖を配合した成人向けの栄養組成物としても有効である。
【0059】
（８）ルイスＸ構造を有する糖鎖が腸管バリア機能に及ぼす影響の評価
上記結果を踏まえ、ルイスＸ糖鎖が食物アレルギーに関連する機能に影響するか否かを検証した。食物アレルギーの発症・進展には、腸管バリアの破綻によるアレルゲンの流入が関与している。そこで、ルイスＸ糖鎖が、腸管バリア関連遺伝子の発現に及ぼす影響を評価した。
上記結果を踏まえ、ルイスＸ糖鎖が食物アレルギーに関連する機能に影響するか否かを検証した。食物アレルギーの発症・進展には、腸管バリアの破綻によるアレルゲンの流入が関与している。そこで、ルイスＸ糖鎖が、腸管バリア関連遺伝子の発現に及ぼす影響を評価した。
【0060】
ヒト大腸杯細胞のモデルであるＬＳ１７４Ｔ細胞に、１０ｍｇ／ｍｌのルイスＸ糖鎖（Ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅの形態で投与）を添加して４８時間培養し、ＴＦＦ３（バリア機能を強化するタンパク質）の発現量を評価した。その結果、ルイスＸ糖鎖の添加でＴＦＦ３発現の有意な増加が認められた（図６）。すなわち、ルイスＸ糖鎖はＴＦＦ３発現増強作用を持つことが示された。
【0061】
ＴＦＦ３は、ムチンの結合強化、粘膜修復、炎症抑制や抗菌ペプチド産生誘導等の様々な作用を介して総合的に腸管バリア機能強化に寄与することが知られている。したがって、ルイスＸ糖鎖は、ＴＦＦ３発現増強作用を介して腸管バリアを強化し、食物アレルギーに対して予防効果を持つことが示唆された。
【0062】
（９）３－ＦＬ、ルイスＡ糖鎖、ルイスＸ糖鎖が樹状細胞に及ぼす影響の評価
食物アレルギーの発症・進展には、腸管バリア機能だけでなく、免疫細胞の一つである樹状細胞の応答性が関わることが知られている。そこで、各種糖鎖が、樹状細胞の活性化に及ぼす影響を評価した。なお、ＬＮＦＰ－ＩＩはルイスＡ構造を持つ糖鎖(ルイスＡ糖鎖ともいう)であるため、ＬＮＦＰ－ＩＩの代替としてルイスＡ糖鎖を評価した。
食物アレルギーの発症・進展には、腸管バリア機能だけでなく、免疫細胞の一つである樹状細胞の応答性が関わることが知られている。そこで、各種糖鎖が、樹状細胞の活性化に及ぼす影響を評価した。なお、ＬＮＦＰ－ＩＩはルイスＡ構造を持つ糖鎖(ルイスＡ糖鎖ともいう)であるため、ＬＮＦＰ－ＩＩの代替としてルイスＡ糖鎖を評価した。
【0063】
ＴＨＰ－１由来樹状細胞（ＴＤＤＣ）をＬＰＳ含有培地にて３日間培養することで、樹状細胞を活性化させた。ＬＰＳの刺激によって、樹状細胞の活性化マーカーであるＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８６の発現が増加したことから、樹状細胞が活性化していることが示された（図７、８）。ＬＰＳに加えて、各種糖鎖（ラクトース、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ルイスＡ糖鎖（Ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅの形態で投与）、ルイスＸ糖鎖（Ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅの形態で投与））を添加して培養すると、ラクトースはＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８６のいずれの発現にも影響しなかった（図７、８）。２’－ＦＬとルイスＡ糖鎖は、ＨＬＡ－ＤＲの発現には影響しなかったが（図７）、ＬＰＳによるＣＤ８６の発現増加を有意に抑制した（図８）。３－ＦＬとルイスＸは、ＨＬＡ－ＤＲとＣＤ８６のいずれの発現も強く抑制することが示された（図７）。したがって、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ルイスＡ糖鎖及びルイスＸ糖鎖は、いずれも樹状細胞活性化抑制効果を持つことが示された。ＨＬＡ－ＤＲは、獲得免疫におけるＴ細胞への抗原提示を行うＭＨＣクラスII分子であり、ＨＬＡ－ＤＲ発現の低下は、樹状細胞の抗原提示能低下を意味し、自己免疫疾患やアレルギーに対して抑制的に作用する。またＣＤ８６は、抗原提示に必要な補助シグナルを伝える共刺激分子の一つであり、ＣＤ８６遺伝子をノックダウンしたマウスではアレルギー症状が緩和されることが報告されている。したがって、３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ等などのルイスＡ糖鎖及びルイスＸ糖鎖は、樹状細胞の活性化を抑制することで、食物アレルギーに対して予防効果を持つことが示唆された。
【0064】
〔実施例１〕３－ＦＬ配合調製粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、および３－ＦＬ ３４８ｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを粉混合し、最終的に粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳の３－ＦＬ量は、３４８ｍｇ／１００ｇ固形であった。
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、および３－ＦＬ ３４８ｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを粉混合し、最終的に粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳の３－ＦＬ量は、３４８ｍｇ／１００ｇ固形であった。
【0065】
〔実施例２〕ＬＮＦＰ－ＩＩ配合調製粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、およびＬＮＦＰ－ＩＩ ２４２ｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを粉混合し、最終的に粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のＬＮＦＰ－ＩＩ量は、２４２ｍｇ／１００ｇ固形であった。
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、およびＬＮＦＰ－ＩＩ ２４２ｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを粉混合し、最終的に粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のＬＮＦＰ－ＩＩ量は、２４２ｍｇ／１００ｇ固形であった。
【0066】
〔実施例６〕ムチン配合粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、およびＯ結合型糖鎖Ａ含有素材としてブタ胃由来ムチン素材３２ｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを混合し、最終的に調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のＯ結合型糖鎖Ａ量は８．０ｍｇ／１００ｇ固形であった。
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、およびＯ結合型糖鎖Ａ含有素材としてブタ胃由来ムチン素材３２ｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを混合し、最終的に調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のＯ結合型糖鎖Ａ量は８．０ｍｇ／１００ｇ固形であった。
【0067】
〔実施例４〕糖ペプチド配合粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、およびＯ結合型糖鎖Ｂ粉末２５０ｍｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを混合し、最終的に調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のＯ結合型糖鎖Ｂ量は０．２５ｍｇ／１００ｇ固形であった。
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、およびＯ結合型糖鎖Ｂ粉末２５０ｍｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを混合し、最終的に調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のＯ結合型糖鎖Ｂ量は０．２５ｍｇ／１００ｇ固形であった。
【0068】
〔実施例５〕サプリメントの製造
３－ＦＬ粉末１ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明の食物アレルギーの予防用サプリメントを製造した。
３－ＦＬ粉末１ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明の食物アレルギーの予防用サプリメントを製造した。
【0069】
〔実施例６〕飲料の製造
下表に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の食物アレルギーの予防用飲料を製造した。
下表に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の食物アレルギーの予防用飲料を製造した。
【0070】
【表7】
【0071】
〔実施例７〕飲料の製造
下表に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の食物アレルギーの予防用飲料を製造した。
下表に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の食物アレルギーの予防用飲料を製造した。
【0072】
【表8】
【産業上の利用可能性】
【0073】
本発明によれば、３－ＦＬ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、またはルイスＸ構造を有する糖鎖を有効成分とする栄養組成物により、食物アレルギーの発症を予防することができる。また、当該成分は、乳児だけでなく食物アレルギーのリスクが高い成人にも有効な成分となることから、成人の食物アレルギーの発症をも予防することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】