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特開2025-87942ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化、造血幹細胞増殖、ｉＰＳ細胞分化を制御する組成物およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025087942
(43)【公開日】2025-06-11
(54)【発明の名称】ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化、造血幹細胞増殖、ｉＰＳ細胞分化を制御する組成物およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20250604BHJP
C12N 15/19 20060101ALI20250604BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250604BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250604BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20250604BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20250604BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250604BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20250604BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20250604BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250604BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20250604BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20250604BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20250604BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250604BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20250604BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250604BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071 ZNA
C12N15/19
C12N15/12
C12N15/62 Z
C07K14/47
C07K14/52
C07K19/00
C07K14/705
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12N5/0735
C12N5/074
A61K35/12
A61P35/00
A61P7/06
A61P43/00 107
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【請求項の数】61
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022071611
(22)【出願日】2022-04-25
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「先端的バイオ創薬等基盤技術開発事業」「人工エクソソームを用いた革新的免疫制御法の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(71)【出願人】
【識別番号】000003986
【氏名又は名称】日産化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】華山 力成
(72)【発明者】
【氏名】山野 友義
(72)【発明者】
【氏名】的場 一隆
(72)【発明者】
【氏名】木田 克彦
(72)【発明者】
【氏名】阿武 志保
(72)【発明者】
【氏名】西野 泰斗
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB63
4C087CA04
4C087CA47
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA55
4C087ZB22
4C087ZB26
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045DA86
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】サイトカイン分子を共投与するよりも効率よく特定細胞を活性化（すなわち、増殖及び／又は分化）させる、新規な細胞活性化法、細胞活性化用組成物およびその用途を提供する。
【解決手段】［０］少なくとも１種のサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞；
［１］少なくとも１種のターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞；又は
［２］少なくとも１種のターゲット因子及び少なくとも１種のサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】［０］少なくとも１種のサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞；
［１］少なくとも１種のターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞；又は
［２］少なくとも１種のターゲット因子及び少なくとも１種のサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原を膜外に提示する細胞外小胞。
【請求項2】
Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に更に提示する、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項3】
請求項２に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｂ）前記抗原を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ａ）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
（Ｂ）前記抗原を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ａ）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
【請求項4】
請求項２に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｃ）前記抗原と、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、抗原及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
（Ｃ）前記抗原と、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、抗原及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
【請求項5】
タンパク質（Ｂ）が、抗原と、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、請求項３に記載の細胞外小胞。
【請求項6】
タンパク質（Ａ）が、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、請求項３に記載の細胞外小胞。
【請求項7】
タンパク質（Ｃ）が、
前記抗原と、
前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、請求項４に記載の細胞外小胞。
前記抗原と、
前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、請求項４に記載の細胞外小胞。
【請求項8】
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項9】
タンパク質（Ｃ）が、
Ｎ末端側から、
（Ｃ－１）抗原ペプチド、
（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドを、この順番でコードするアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の細胞外小胞。
Ｎ末端側から、
（Ｃ－１）抗原ペプチド、
（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドを、この順番でコードするアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の細胞外小胞。
【請求項10】
細胞外小胞が、エクソソームである、請求項１～９のいずれか一項記載の細胞外小胞。
【請求項11】
（ａ）請求項３で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）請求項３で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）請求項４で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）請求項３で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）請求項４で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項12】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項13】
（ａ）請求項３で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；及び／又は
（ｂ）請求項３で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
（ｂ）請求項３で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
【請求項14】
（ｃ）請求項４で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
【請求項15】
請求項１３又は１４に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
【請求項16】
請求項１５記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
【請求項17】
請求項１又は２に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）請求項１３又は１４に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
１）請求項１３又は１４に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
【請求項18】
請求項１又は２に記載の細胞外小胞、又は請求項１５に記載の培養上清を含む、医薬組成物。
【請求項19】
前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を増殖させるための医薬組成物であって、請求項１又は２に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
【請求項20】
前記抗原を発現するがん細胞を含むがんを治療するための医薬組成物であって、請求項１又は２に記載の細胞外小胞を含み、前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与された患者に投与される、医薬組成物。
【請求項21】
前記抗原がＨｅｒ２タンパク質又はその断片である、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項22】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）と幹細胞因子（ＳＣＦ）を膜外に提示する細胞外小胞。
【請求項23】
請求項２２に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）―１ 前記ＴＰＯを含む、該ＴＰＯを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ａ）―２ 前記ＳＣＦを含む、該ＳＣＦを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
（Ａ）―１ 前記ＴＰＯを含む、該ＴＰＯを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ａ）―２ 前記ＳＣＦを含む、該ＳＣＦを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
【請求項24】
請求項２２に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）―３ 前記ＴＰＯと、前記ＳＣＦを含む、ＴＰＯ及びＳＣＦを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
（Ａ）―３ 前記ＴＰＯと、前記ＳＣＦを含む、ＴＰＯ及びＳＣＦを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
【請求項25】
（Ｂ）Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ又はＣＸＣＬ１２を含み、Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ又はＣＸＣＬ１２を膜外に提示可能なタンパク質をさらに含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項26】
タンパク質（Ａ）―１が、ＴＰＯと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、請求項２３に記載の細胞外小胞。
【請求項27】
タンパク質（Ａ）―２が、ＳＣＦと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、請求項２３に記載の細胞外小胞。
【請求項28】
タンパク質（Ａ）―３が、
前記ＴＰＯと、
前記ＳＣＦと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、請求項２４に記載の細胞外小胞。
前記ＴＰＯと、
前記ＳＣＦと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、請求項２４に記載の細胞外小胞。
【請求項29】
タンパク質（Ｂ）が、
前記Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ又はＣＸＣＬ１２と、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、請求項２５に記載の細胞外小胞。
前記Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ又はＣＸＣＬ１２と、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、請求項２５に記載の細胞外小胞。
【請求項30】
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項31】
細胞外小胞が、エクソソームである、請求項２２～３０のいずれか一項記載の細胞外小胞。
【請求項32】
（ａ）―１ 請求項２３で定義されるタンパク質（Ａ）―１をコードするポリヌクレオチド；
（ａ）―２ 請求項２３で定義されるタンパク質（Ａ）―２をコードするポリヌクレオチド；
（ａ）―３ 請求項２４で定義されるタンパク質（Ａ）―３をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｂ） 請求項２５で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）―２ 請求項２３で定義されるタンパク質（Ａ）―２をコードするポリヌクレオチド；
（ａ）―３ 請求項２４で定義されるタンパク質（Ａ）―３をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｂ） 請求項２５で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項33】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項34】
（ａ）―１ 請求項２３で定義されるタンパク質（Ａ）―１をコードするポリヌクレオチド；及び
（ａ）―２ 請求項２３で定義されるタンパク質（Ａ）―２をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
（ａ）―２ 請求項２３で定義されるタンパク質（Ａ）―２をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
【請求項35】
（ａ）―３ 請求項２４で定義されるタンパク質（Ａ）―３をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
【請求項36】
（ｄ）請求項２５で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３４又は３５に記載の細胞。
【請求項37】
請求項３４～３６のいずれか一項に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
【請求項38】
請求項３７に記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
【請求項39】
請求項２２に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）請求項３４～３６のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
１）請求項３４～３６のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
【請求項40】
請求項２２に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
【請求項41】
造血幹細胞をin vivo又はin vitroで活性化及び／又は増殖させるため医薬組成物であって、請求項２２に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
【請求項42】
対象において再生不良性貧血を治療するための医薬組成物であって、請求項２２に記載の細胞外小胞を含み、造血幹細胞を投与された対象に投与される、医薬組成物。
【請求項43】
対象において血液がんや免疫不全症を治療するための医薬組成物であって、請求項２２に記載の細胞外小胞を含み、前記対象が、化学療法及び／又は放射線治療処置後、造血幹細胞を投与されている、医薬組成物。
【請求項44】
ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示する細胞外小胞。
【請求項45】
請求項４４に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、該ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
（Ａ）前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、該ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
【請求項46】
さらにＢｃ２Ｌｃを膜外に提示する、請求項４５に記載の細胞外小胞。
【請求項47】
請求項４６に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、該ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）前記Ｂｃ２Ｌｃを含む、該Ｂｃ２Ｌｃを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
（Ａ）前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、該ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）前記Ｂｃ２Ｌｃを含む、該Ｂｃ２Ｌｃを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
【請求項48】
請求項４６に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｃ）前記Ｂｃ２Ｌｃと、前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、Ｂｃ２Ｌｃ及びＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
（Ｃ）前記Ｂｃ２Ｌｃと、前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、Ｂｃ２Ｌｃ及びＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
【請求項49】
タンパク質（Ａ）が、ＡｃｔｉｖｉｎＡと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、 請求項４５又は４７に記載の細胞外小胞。
【請求項50】
タンパク質（Ｂ）が、Ｂｃ２Ｌｃと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、請求項４７に記載の細胞外小胞。
【請求項51】
タンパク質（Ｃ）が、
前記Ｂｃ２Ｌｃと、
前記ＡｃｔｉｖｉｎＡと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、請求項４８に記載の細胞外小胞。
前記Ｂｃ２Ｌｃと、
前記ＡｃｔｉｖｉｎＡと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、請求項４８に記載の細胞外小胞。
【請求項52】
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項53】
細胞外小胞が、エクソソームである、請求項４４～５２のいずれか一項記載の細胞外小胞。
【請求項54】
（ａ）請求項４７で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）請求項４７で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）請求項４８で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）請求項４７で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）請求項４８で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項55】
請求項５４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項56】
（ａ）請求項４７で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；及び/又は
（ｂ）請求項４７で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
（ｂ）請求項４７で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
【請求項57】
（ｃ）請求項４８で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
【請求項58】
請求項５６又は請求項５７のいずれか一項に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
【請求項59】
請求項５８に記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
【請求項60】
請求項４４又は４６に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）請求項５６又は５７に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
１）請求項５６又は５７に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
【請求項61】
請求項４４又は４６に記載の細胞外小胞を含む、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞の分化誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化、造血幹細胞増殖、ｉＰＳ細胞分化を制御する組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
生体によるがん細胞等の排除や、自己抗原、アレルギー性物質等に対する応答の調節等の免疫反応には、抗原特異的なＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞等）が中心的な働きをしていることが知られている。抗原特異的なＴ細胞は、樹状細胞やマクロファージ等の抗原提示細胞の細胞表面のＭＨＣ分子と、がん、アレルギー性物質等に由来する抗原との結合複合体をＴ細胞受容体で認識して活性化、増殖、分化等する。活性化等した抗原特異的なＴ細胞は、抗原を提示しているがん細胞等を特異的に傷害することや、自己抗原、アレルギー性物質等に対する応答を調節する。したがって、抗原特異的なＴ細胞を活性化、増殖、分化等させることが、免疫反応において特に重要であると考えられている。
【0003】
抗原特異的なＴ細胞を活性化等させる方法としては、既に実用化されているＴ細胞にキメラ抗原受容体を発現させる方法だけでなく、その他の方法も開発されている。例えば、特許文献１は、ＭＨＣ分子とＴ細胞共刺激分子とを表面上に含むナノ粒子が、抗原特異的なＴ細胞を増殖させることを開示している。また、非特許文献１は、ＰＴＧＦＲＮを介してＩＬ－１２を膜上に発現させたエクソソームが、モデル抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖させることを開示している。
【0004】
本願発明者らも、抗原を提示するＭＨＣ分子とＴ細胞共刺激分子とをその表面に含むエクソソームを用いて、各種Ｔ細胞を活性化させる方法を開示している（特許文献２及び３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特表２０１６－５２０５１８号公報
【特許文献2】国際公開２０２１／１７２５９５号公報
【特許文献3】国際公開２０２１／１７２５９６号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Katherine Kirwin, et al., “Exosome Surface Display of IL-12 Results in Tumor-Retained Pharmacology with Superior Potency and Limited Systemic Exposure Compared to Recombinant IL-12”, 令和１年１１月６日, 34th Annual Meeting of the Society for Immuno-therapy of Cancer
【非特許文献2】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ（２０１８）；７：１５３５７５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
サイトカイン分子を共投与するよりも効率よく特定細胞を活性化（すなわち、増殖及び／又は分化）させる、新規な細胞活性化法、細胞活性化用組成物およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＭＨＣ分子を用いなくても、サイトカイン又はターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞であれば、特定の細胞(たとえばＣＡＲ－Ｔ細胞、造血幹細胞、ｉＰＳ細胞)を活性化（すなわち、増殖及び／又は分化）できることを新たに見出し、本願発明を完成させた。
【0009】
したがって、本発明は、以下のものを含む：
[０] 少なくとも１種のサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞。
[１] 少なくとも１種のターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞。
[２] 少なくとも１種のターゲット因子及び少なくとも１種のサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞。
[０] 少なくとも１種のサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞。
[１] 少なくとも１種のターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞。
[２] 少なくとも１種のターゲット因子及び少なくとも１種のサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞。
【0010】
［０Ａ]
前記ターゲット因子が抗原である、[１]に記載の細胞外小胞。
［１Ａ］
前記ターゲット因子が抗原であり、前記サイトカインがＴ細胞刺激性サイトカインである、[２]に記載の細胞外小胞。
［２Ａ］
［０Ａ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｂ）前記抗原を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
［３Ａ］
［１Ａ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（１）（Ａ）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）前記抗原を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質；
又は
（２）（Ｃ）前記抗原と、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、抗原及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
［４Ａ］
タンパク質（Ｂ）が、
抗原と、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［２Ａ］又は［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［５Ａ］
タンパク質（Ａ）が、
前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［６Ａ］
タンパク質（Ｃ）が、
前記抗原と、
前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［７Ａ］
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、［４Ａ］～［６Ａ］のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
［８Ａ］
タンパク質（Ｃ）が、
Ｎ末端側から、
（Ｃ－１）抗原ペプチド、
（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドを、この順番でコードするアミノ酸配列を含む、［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［９Ａ］
タンパク質（Ｃ）が、
Ｎ末端側から、
（Ｃ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチド
（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－３）抗原ペプチドを、
この順にコードするアミノ酸配列を含む、［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［１０Ａ］ 前記融合ペプチドが、Ｎ末端側から、
（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
（２）存在していてもよいスペーサー配列、
（３）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、
（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含む、［８Ａ］又は［９Ａ］に記載の細胞外小胞。
［１１Ａ］ 前記融合ペプチドが、Ｎ末端側から、
（１）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、
（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（３）ＭＦＧ－Ｅ８
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含む、［８Ａ］又は［９Ａ］に記載の細胞外小胞。
［１２Ａ］ 細胞外小胞が、エクソソームである、［０Ａ］～［１１Ａ］のいずれか一項記載の細胞外小胞。
前記ターゲット因子が抗原である、[１]に記載の細胞外小胞。
［１Ａ］
前記ターゲット因子が抗原であり、前記サイトカインがＴ細胞刺激性サイトカインである、[２]に記載の細胞外小胞。
［２Ａ］
［０Ａ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｂ）前記抗原を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
［３Ａ］
［１Ａ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（１）（Ａ）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）前記抗原を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質；
又は
（２）（Ｃ）前記抗原と、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、抗原及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
［４Ａ］
タンパク質（Ｂ）が、
抗原と、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［２Ａ］又は［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［５Ａ］
タンパク質（Ａ）が、
前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［６Ａ］
タンパク質（Ｃ）が、
前記抗原と、
前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［７Ａ］
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、［４Ａ］～［６Ａ］のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
［８Ａ］
タンパク質（Ｃ）が、
Ｎ末端側から、
（Ｃ－１）抗原ペプチド、
（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドを、この順番でコードするアミノ酸配列を含む、［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［９Ａ］
タンパク質（Ｃ）が、
Ｎ末端側から、
（Ｃ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチド
（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－３）抗原ペプチドを、
この順にコードするアミノ酸配列を含む、［３Ａ］に記載の細胞外小胞。
［１０Ａ］ 前記融合ペプチドが、Ｎ末端側から、
（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
（２）存在していてもよいスペーサー配列、
（３）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、
（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含む、［８Ａ］又は［９Ａ］に記載の細胞外小胞。
［１１Ａ］ 前記融合ペプチドが、Ｎ末端側から、
（１）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、
（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（３）ＭＦＧ－Ｅ８
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含む、［８Ａ］又は［９Ａ］に記載の細胞外小胞。
［１２Ａ］ 細胞外小胞が、エクソソームである、［０Ａ］～［１１Ａ］のいずれか一項記載の細胞外小胞。
【0011】
［１３Ａ］
（ａ）［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）［２Ａ］又は［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチド。
［１４Ａ］
［１３Ａ］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１５Ａ］
（ａ）［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）［２Ａ］又は［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド
を含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
［１６Ａ］
（ｃ）［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
［１７Ａ］
［１５Ａ］又は［１６Ａ］に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
［１８Ａ］
［１７Ａ］に記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
［１９Ａ］
［１Ａ］に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）［１５Ａ］又は［１６Ａ］に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
（ａ）［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）［２Ａ］又は［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチド。
［１４Ａ］
［１３Ａ］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１５Ａ］
（ａ）［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）［２Ａ］又は［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド
を含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
［１６Ａ］
（ｃ）［３Ａ］で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
［１７Ａ］
［１５Ａ］又は［１６Ａ］に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
［１８Ａ］
［１７Ａ］に記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
［１９Ａ］
［１Ａ］に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）［１５Ａ］又は［１６Ａ］に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
【0012】
［２０Ａ］
［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
［２１Ａ］
前記抗原に特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）をin vivo又はin vitroで増殖させるため医薬組成物であって、［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
［２２Ａ］
前記抗原を発現するがん細胞を含むがんを治療するための医薬組成物であって、［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を含み、前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与された患者に投与される、医薬組成物。
［２３Ａ］
前記抗原がＨｅｒ２タンパク質又はその断片である、［２１Ａ］又は［２２Ａ］に記載の医薬組成物。
［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
［２１Ａ］
前記抗原に特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）をin vivo又はin vitroで増殖させるため医薬組成物であって、［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
［２２Ａ］
前記抗原を発現するがん細胞を含むがんを治療するための医薬組成物であって、［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を含み、前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与された患者に投与される、医薬組成物。
［２３Ａ］
前記抗原がＨｅｒ２タンパク質又はその断片である、［２１Ａ］又は［２２Ａ］に記載の医薬組成物。
【0013】
［２４Ａ］
前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与された対象において、該ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化及び／又は増殖させるための方法であって、対象に［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を投与することを含み、
ここで、ＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記抗原が反応し、好ましくは更にＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴ細胞刺激性サイトカイン受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記Ｔ細胞刺激性サイトカインが反応することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が対象内で活性化及び／又は増殖する、方法。
［２５Ａ］
対象において前記抗原を発現するがん細胞を含むがんを治療するための方法であって、
対象に、前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与し、その後、［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を投与することを含み、
ここで、ＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記抗原が反応し、好ましくは更にＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴ細胞刺激性サイトカイン受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記Ｔ細胞刺激性サイトカインが反応することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が対象内で活性化及び／又は増殖し、活性化及び／又は増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞が前記がん細胞を攻撃することにより、がん細胞の増殖を抑制してがんを治療する、方法。
［２６Ａ］
前記抗原がＨｅｒ２タンパク質又はその断片である、［２４Ａ］又は［２５Ａ］に記載の方法。
前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与された対象において、該ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化及び／又は増殖させるための方法であって、対象に［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を投与することを含み、
ここで、ＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記抗原が反応し、好ましくは更にＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴ細胞刺激性サイトカイン受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記Ｔ細胞刺激性サイトカインが反応することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が対象内で活性化及び／又は増殖する、方法。
［２５Ａ］
対象において前記抗原を発現するがん細胞を含むがんを治療するための方法であって、
対象に、前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与し、その後、［０Ａ］又は［１Ａ］に記載の細胞外小胞を投与することを含み、
ここで、ＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記抗原が反応し、好ましくは更にＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴ細胞刺激性サイトカイン受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記Ｔ細胞刺激性サイトカインが反応することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が対象内で活性化及び／又は増殖し、活性化及び／又は増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞が前記がん細胞を攻撃することにより、がん細胞の増殖を抑制してがんを治療する、方法。
［２６Ａ］
前記抗原がＨｅｒ２タンパク質又はその断片である、［２４Ａ］又は［２５Ａ］に記載の方法。
【0014】
［２７Ａ］
前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与された対象において、該ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化及び／又は増殖させるための医薬の製造における［１Ａ］に記載の細胞外小胞の使用。
［２８Ａ］
対象において前記抗原を発現するがん細胞を含むがんを治療するための医薬の製造における［１Ａ］に記載の細胞外小胞の使用であって、前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が対象に投与されている、使用。
［２９Ａ］
前記抗原がＨｅｒ２タンパク質又はその断片である、［２７Ａ］又は［２８Ａ］に記載の方法。
前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与された対象において、該ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化及び／又は増殖させるための医薬の製造における［１Ａ］に記載の細胞外小胞の使用。
［２８Ａ］
対象において前記抗原を発現するがん細胞を含むがんを治療するための医薬の製造における［１Ａ］に記載の細胞外小胞の使用であって、前記抗原特異的なキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が対象に投与されている、使用。
［２９Ａ］
前記抗原がＨｅｒ２タンパク質又はその断片である、［２７Ａ］又は［２８Ａ］に記載の方法。
【0015】
［１Ｂ］
前記サイトカインがトロンボポエチン（ＴＰＯ）及び／又は幹細胞因子（ＳＣＦ）である、［０］に記載の細胞外小胞。
［２Ｂ］
［１Ｂ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）－１ 前記ＴＰＯを含む、該ＴＰＯを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ａ）－２ 前記ＳＣＦを含む、該ＳＣＦを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
［３Ｂ］
［１Ｂ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）―３ 前記ＴＰＯと、前記ＳＣＦを含む、ＴＰＯ及びＳＣＦを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
［４Ｂ］
（Ｂ）Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ及び／又はＣＸＣＬ１２を含み、Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ及び／又はＣＸＣＬ１２を膜外に提示可能なタンパク質をさらに含む、［１Ｂ］～［３Ｂ］のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
［５Ｂ］
タンパク質（Ａ）―１が、ＴＰＯと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、［２Ｂ］に記載の細胞外小胞。
［６Ｂ］
タンパク質（Ａ）―２が、ＳＣＦと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、［２Ｂ］に記載の細胞外小胞。
［７Ｂ］
タンパク質（Ａ）―３が、
前記ＴＰＯと、
前記ＳＣＦと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［３Ｂ］に記載の細胞外小胞。
［８Ｂ］
タンパク質（Ｂ）が、
前記Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ又はＣＸＣＬ１２と、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［４Ｂ］に記載の細胞外小胞。
［９Ｂ］
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、［５Ｂ］～［８Ｂ］のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
［１０Ｂ］
細胞外小胞が、エクソソームである、［１Ｂ］～［８Ｂ］のいずれか一項記載の細胞外小胞。
［１１Ｂ］
（ａ）―１ ［２Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―１をコードするポリヌクレオチド；
（ａ）―２ ［２Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―２をコードするポリヌクレオチド；
（ａ）―３ ［３Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―３をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｂ） ［４Ｂ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド。
［１２Ｂ］
［１１Ｂ］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１３Ｂ］
（ａ）―１ ［２Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―１をコードするポリヌクレオチド；及び／又は
（ａ）―２ ［２Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―２をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
［１４Ｂ］
（ａ）―３ ［３Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―３をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
［１５Ｂ］
（ｄ）［４Ｂ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、［１３Ｂ］又は［１４Ｂ］に記載の細胞。
［１６Ｂ］
［１３Ｂ］～［１５Ｂ］のいずれか一項に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
［１７Ｂ］
［１６Ｂ］に記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
［１８Ｂ］
［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）［１３Ｂ］～［１５Ｂ］のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
［１９Ｂ］
［１Ｂ］に記載の細胞外小胞、又は［１６Ｂ］記載の培養上清を含む、医薬組成物。
前記サイトカインがトロンボポエチン（ＴＰＯ）及び／又は幹細胞因子（ＳＣＦ）である、［０］に記載の細胞外小胞。
［２Ｂ］
［１Ｂ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）－１ 前記ＴＰＯを含む、該ＴＰＯを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ａ）－２ 前記ＳＣＦを含む、該ＳＣＦを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
［３Ｂ］
［１Ｂ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）―３ 前記ＴＰＯと、前記ＳＣＦを含む、ＴＰＯ及びＳＣＦを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
［４Ｂ］
（Ｂ）Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ及び／又はＣＸＣＬ１２を含み、Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ及び／又はＣＸＣＬ１２を膜外に提示可能なタンパク質をさらに含む、［１Ｂ］～［３Ｂ］のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
［５Ｂ］
タンパク質（Ａ）―１が、ＴＰＯと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、［２Ｂ］に記載の細胞外小胞。
［６Ｂ］
タンパク質（Ａ）―２が、ＳＣＦと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、［２Ｂ］に記載の細胞外小胞。
［７Ｂ］
タンパク質（Ａ）―３が、
前記ＴＰＯと、
前記ＳＣＦと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［３Ｂ］に記載の細胞外小胞。
［８Ｂ］
タンパク質（Ｂ）が、
前記Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ又はＣＸＣＬ１２と、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［４Ｂ］に記載の細胞外小胞。
［９Ｂ］
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、［５Ｂ］～［８Ｂ］のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
［１０Ｂ］
細胞外小胞が、エクソソームである、［１Ｂ］～［８Ｂ］のいずれか一項記載の細胞外小胞。
［１１Ｂ］
（ａ）―１ ［２Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―１をコードするポリヌクレオチド；
（ａ）―２ ［２Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―２をコードするポリヌクレオチド；
（ａ）―３ ［３Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―３をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｂ） ［４Ｂ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド。
［１２Ｂ］
［１１Ｂ］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１３Ｂ］
（ａ）―１ ［２Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―１をコードするポリヌクレオチド；及び／又は
（ａ）―２ ［２Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―２をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
［１４Ｂ］
（ａ）―３ ［３Ｂ］で定義されるタンパク質（Ａ）―３をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
［１５Ｂ］
（ｄ）［４Ｂ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、［１３Ｂ］又は［１４Ｂ］に記載の細胞。
［１６Ｂ］
［１３Ｂ］～［１５Ｂ］のいずれか一項に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
［１７Ｂ］
［１６Ｂ］に記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
［１８Ｂ］
［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）［１３Ｂ］～［１５Ｂ］のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
［１９Ｂ］
［１Ｂ］に記載の細胞外小胞、又は［１６Ｂ］記載の培養上清を含む、医薬組成物。
【0016】
［２０Ｂ］
造血幹細胞をin vivo又はin vitroで活性化及び／又は増殖させるため医薬組成物であって、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
［２１Ｂ］
対象において再生不良性貧血を治療するための医薬組成物であって、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を含み、造血幹細胞を投与された対象に投与される、医薬組成物。
［２２Ｂ］
対象において血液がんや免疫不全症を治療するための医薬組成物であって、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を含み、前記対象が、化学療法及び／又は放射線治療処置後、造血幹細胞を投与されている、医薬組成物。
造血幹細胞をin vivo又はin vitroで活性化及び／又は増殖させるため医薬組成物であって、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を含む、医薬組成物。
［２１Ｂ］
対象において再生不良性貧血を治療するための医薬組成物であって、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を含み、造血幹細胞を投与された対象に投与される、医薬組成物。
［２２Ｂ］
対象において血液がんや免疫不全症を治療するための医薬組成物であって、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を含み、前記対象が、化学療法及び／又は放射線治療処置後、造血幹細胞を投与されている、医薬組成物。
【0017】
［２３Ｂ］
造血幹細胞を投与された対象において、該造血幹細胞を活性化及び／又は増殖させるための方法であって、対象に［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を投与することを含み、
ここで、造血幹細胞上のサイトカインレセプターと細胞外小胞の膜外に提示されたサイトカインが反応することにより、造血幹細胞が対象内で活性化及び／又は増殖する、方法。
［２３Ｂ］
前記対象が、再生不良性貧血を患っている、［２２Ｂ］に記載の方法。
［２４Ｂ］
対象において血液がんや免疫不全症を治療するための方法であって、
対象に、化学療法及び／又は放射線治療処置後、造血幹細胞を投与し、その後、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を投与することを含み、
ここで、投与された造血幹細胞上のサイトカインレセプターと細胞外小胞の膜外に提示されたサイトカインが反応することにより、造血幹細胞が対象内で活性化及び／又は増殖して、対象における造血機能が回復する、方法。
造血幹細胞を投与された対象において、該造血幹細胞を活性化及び／又は増殖させるための方法であって、対象に［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を投与することを含み、
ここで、造血幹細胞上のサイトカインレセプターと細胞外小胞の膜外に提示されたサイトカインが反応することにより、造血幹細胞が対象内で活性化及び／又は増殖する、方法。
［２３Ｂ］
前記対象が、再生不良性貧血を患っている、［２２Ｂ］に記載の方法。
［２４Ｂ］
対象において血液がんや免疫不全症を治療するための方法であって、
対象に、化学療法及び／又は放射線治療処置後、造血幹細胞を投与し、その後、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞を投与することを含み、
ここで、投与された造血幹細胞上のサイトカインレセプターと細胞外小胞の膜外に提示されたサイトカインが反応することにより、造血幹細胞が対象内で活性化及び／又は増殖して、対象における造血機能が回復する、方法。
【0018】
［２５Ｂ］
造血幹細胞を投与された対象において、該造血幹細胞を活性化及び／又は増殖させるための医薬の製造における、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞の使用。
［２６Ｂ］
前記対象が、再生不良性貧血を患っている、［２５Ｂ］に記載の使用。
［２７Ｂ］
対象において血液がんや免疫不全症を治療するための医薬の製造における、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞の使用であって、
ここで、前記対象が、化学療法及び／又は放射線治療処置後、造血幹細胞を投与されており、投与された造血幹細胞上のサイトカインレセプターと細胞外小胞の膜外に提示されたサイトカインが反応することにより、造血幹細胞が対象内で活性化及び／又は増殖して、対象における造血機能が回復する、使用。
造血幹細胞を投与された対象において、該造血幹細胞を活性化及び／又は増殖させるための医薬の製造における、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞の使用。
［２６Ｂ］
前記対象が、再生不良性貧血を患っている、［２５Ｂ］に記載の使用。
［２７Ｂ］
対象において血液がんや免疫不全症を治療するための医薬の製造における、［１Ｂ］に記載の細胞外小胞の使用であって、
ここで、前記対象が、化学療法及び／又は放射線治療処置後、造血幹細胞を投与されており、投与された造血幹細胞上のサイトカインレセプターと細胞外小胞の膜外に提示されたサイトカインが反応することにより、造血幹細胞が対象内で活性化及び／又は増殖して、対象における造血機能が回復する、使用。
【0019】
［１Ｃ］
前記サイトカインがＡｃｔｉｖｉｎＡである、［０］に記載の細胞外小胞。
［２Ｃ］
前記ターゲット因子がＢｃ２Ｌｃであり、前記サイトカインがＡｃｔｉｖｉｎＡである、［１］に記載の細胞外小胞。
［３Ｃ］
［１Ｃ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、該ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質を含む、細胞外小胞。
［４Ｃ］
［２Ｃ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、該ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）前記Ｂｃ２Ｌｃを含む、該Ｂｃ２Ｌｃを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
［５Ｃ］
［２Ｃ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｃ）前記Ｂｃ２Ｌｃと、前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、Ｂｃ２Ｌｃ及びＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
［６Ｃ］
タンパク質（Ｂ）が、Ｂｃ２Ｌｃと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、［４Ｃ］に記載の細胞外小胞。
［７Ｃ］
タンパク質（Ａ）が、ＡｃｔｉｖｉｎＡと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、 ［３Ｃ］又は［４Ｃ］に記載の細胞外小胞。
［８Ｃ］
タンパク質（Ｃ）が、
前記Ｂｃ２Ｌｃと、
前記ＡｃｔｉｖｉｎＡと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［５Ｃ］に記載の細胞外小胞。
［９Ｃ］
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、［６Ｃ］～［８Ｃ］のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
［１０Ｃ］
細胞外小胞が、エクソソームである、［１Ｃ］～［９Ｃ］のいずれか一項記載の細胞外小胞。
［１１Ｃ］
（ａ）［３Ｃ］又は［４Ｃ］で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）［４Ｃ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）［５Ｃ］で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチド。
［１２Ｃ］
［１１Ｃ］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１３Ｃ］
（ａ）［３Ｃ］又は［４Ｃ］で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；及び／又は
（ｂ）［４Ｃ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
［１４Ｃ］
（ｃ）［５Ｃ］で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
［１５Ｃ］
［１１Ｃ］又は［１２Ｃ］のいずれか一項に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
［１６Ｃ］
［１５Ｃ］に記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
［１７Ｃ］
［１Ｃ］に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）［１１Ｃ］又は［１２Ｃ］に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
［１８Ｃ］
［１Ｃ］に記載の細胞外小胞、又は［１３Ｃ］記載の培養上清を含む、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞の分化誘導剤。
前記サイトカインがＡｃｔｉｖｉｎＡである、［０］に記載の細胞外小胞。
［２Ｃ］
前記ターゲット因子がＢｃ２Ｌｃであり、前記サイトカインがＡｃｔｉｖｉｎＡである、［１］に記載の細胞外小胞。
［３Ｃ］
［１Ｃ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、該ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質を含む、細胞外小胞。
［４Ｃ］
［２Ｃ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、該ＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）前記Ｂｃ２Ｌｃを含む、該Ｂｃ２Ｌｃを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞。
［５Ｃ］
［２Ｃ］に記載の細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｃ）前記Ｂｃ２Ｌｃと、前記ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む、Ｂｃ２Ｌｃ及びＡｃｔｉｖｉｎＡを膜外に提示可能なタンパク質
を含む、細胞外小胞。
［６Ｃ］
タンパク質（Ｂ）が、Ｂｃ２Ｌｃと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、［４Ｃ］に記載の細胞外小胞。
［７Ｃ］
タンパク質（Ａ）が、ＡｃｔｉｖｉｎＡと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質との融合タンパク質である、 ［３Ｃ］又は［４Ｃ］に記載の細胞外小胞。
［８Ｃ］
タンパク質（Ｃ）が、
前記Ｂｃ２Ｌｃと、
前記ＡｃｔｉｖｉｎＡと、
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質
との融合タンパク質である、［５Ｃ］に記載の細胞外小胞。
［９Ｃ］
細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインを含む、［６Ｃ］～［８Ｃ］のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
［１０Ｃ］
細胞外小胞が、エクソソームである、［１Ｃ］～［９Ｃ］のいずれか一項記載の細胞外小胞。
［１１Ｃ］
（ａ）［３Ｃ］又は［４Ｃ］で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）［４Ｃ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）［５Ｃ］で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチド。
［１２Ｃ］
［１１Ｃ］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１３Ｃ］
（ａ）［３Ｃ］又は［４Ｃ］で定義されるタンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチド；及び／又は
（ｂ）［４Ｃ］で定義されるタンパク質（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞。
［１４Ｃ］
（ｃ）［５Ｃ］で定義されるタンパク質（Ｃ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された細胞。
［１５Ｃ］
［１１Ｃ］又は［１２Ｃ］のいずれか一項に記載の細胞を培養して得られる培養上清。
［１６Ｃ］
［１５Ｃ］に記載の培養上清に含まれる、細胞外小胞。
［１７Ｃ］
［１Ｃ］に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
１）［１１Ｃ］又は［１２Ｃ］に記載の細胞を培養する工程、
２）培養後の培養上清を回収する工程、及び
３）任意選択で回収された培養上清から細胞外小胞を精製する方法を含む、方法。
［１８Ｃ］
［１Ｃ］に記載の細胞外小胞、又は［１３Ｃ］記載の培養上清を含む、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞の分化誘導剤。
【発明の効果】
【0020】
本発明によれば、主要組織適合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex、以下、「ＭＨＣ」ともいう。）分子を用いなくても、サイトカインを膜外に提示する細胞外小胞であれば、特定の細胞を活性化（すなわち、増殖及び／又は分化）できる。さらに特定の細胞を認識するターゲット因子を共存させることにより、選択的に特定の細胞を活性化（すなわち、増殖及び／又は分化）できる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】実施例１．２．１．における細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析の結果。上段：サンプル３の細胞外小胞；下段：サンプル４の細胞外小胞。
【図2】実施例１．３．１．におけるヒト骨髄ＣＤ３４陽性前駆細胞を用いた細胞増殖評価の結果。
【図3】実施例２．２．１．における細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析の結果。
【図4】実施例２．３．２．におけるＡｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を用いたｉＰＳＣ分化誘導実験の結果。
【図5】実施例３．１．における、各遺伝子構成の模式図。
【図6】実施例３．２．３．における細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析の結果。
【図7】実施例３．３．におけるＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞外小胞の評価の結果。
【図8】実施例３．４．の実験スケジュールとその結果。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本明細書において「含む」（comprising）は、「実質的に含む」態様（substantially comprising）、「必須に含む」態様(essentially comprising)、「本質的に…からなる」態様（consiting essentially of）、及び「からなる」態様（consisting of）を包含する。
【0023】
本明細書中で用いられる「細胞外小胞」とは、細胞から分泌される小胞である限り特段限定されるものではないが、例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ（エクソソーム）、Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＶ；微小小胞体）、Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｂｏｄｉｅｓ（アポトーシス小体）等が挙げられる。
【0024】
本明細書中で用いられる「エクソソーム」とは、エンドサイト－シス・パスウエイに由来する、約２０～約５００ｎｍ（好ましくは約２０～約２００ｎｍ、より好ましくは約２５～約１５０ｎｍ、更に好ましくは約３０～約１００ｎｍ）の小胞を意味する。エクソソームの構成成分としては、例えば、タンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ）等が挙げられる。エクソソームは、細胞間コミュニケーションを司る機能を有しうる。エクソソームのマーカー分子としては、例えば、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、テトラスパニン、ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、フォスファチジルセリン等が挙げられる。
【0025】
本明細書中で用いられる「微小小胞体」とは、細胞質膜に由来する、約５０～約１０００ｎｍの小胞を意味する。微小小胞体の構成成分としては、例えば、タンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ等）等が挙げられる。微小小胞体は、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。微小小胞体のマーカー分子としては、例えば、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０、ＣＤ１５４等が挙げられる。
【0026】
本明細書中で用いられる「アポトーシス小体」とは、細胞質膜に由来する、約５００～約２０００ｎｍの小胞を意味する。アポトーシス小体の構成成分としては、例えば、断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）等が挙げられる。アポトーシス小体は、ファゴサイトーシスを誘導する機能等を有しうる。アポトーシス小体のマーカー分子としては、例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、フォスファチジルセリン等が挙げられる。
【0027】
「サイトカイン （ｃｙｔｏｋｉｎｅ）」 は、細胞から分泌されるタンパク質の生理活性物質をいう。特に限定しないが、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）、ケモカイン（ＣＣＬなど）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、造血因子（コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）など）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ－βなど）、アクチビン、インヒビンなどが挙げられる。
本明細書においては、未成熟（不活性型）又は成熟（活性型）なサイトカインだけでなく、その部分配列、活性型のサイトカインのサブユニットもサイトカインに含めてよい。
サイトカインは、任意の動物種由来のものであってもよい。例えば、マウス、ラット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等の哺乳動物等の動物に由来するものが挙げられる。本明細書中に記載のサイトカインは、好ましくは、げっ歯類又は哺乳類動物に由来するものであり、より好ましくは、マウス又はヒトに由来するものである。
本明細書中に記載のサイトカインは、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のサイトカインは、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
本明細書においては、未成熟（不活性型）又は成熟（活性型）なサイトカインだけでなく、その部分配列、活性型のサイトカインのサブユニットもサイトカインに含めてよい。
サイトカインは、任意の動物種由来のものであってもよい。例えば、マウス、ラット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等の哺乳動物等の動物に由来するものが挙げられる。本明細書中に記載のサイトカインは、好ましくは、げっ歯類又は哺乳類動物に由来するものであり、より好ましくは、マウス又はヒトに由来するものである。
本明細書中に記載のサイトカインは、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のサイトカインは、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
【0028】
「Ｔ細胞刺激性サイトカイン」とは、Ｔ細胞の膜上に発現する受容体等を介して、Ｔ細胞を刺激（例えば、活性化、抑制等）することが可能なサイトカインである。Ｔ細胞刺激性サイトカインとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＴＧＦ－β、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ等が挙げられる。これらのうち、ホモ若しくはヘテロのサブユニットの多量体を形成しうるもの（例えば、ＩＬ－１２、ＴＧＦ－β等）は、機能的である限り（即ち、所望の薬理活性を有しうる限り）、場合によりペプチドリンカー等を介して連結された、連続したアミノ酸配列のものであってもよい。
【0029】
本明細書中で用いられる「ターゲット因子」とは、本願発明に係る細胞外小胞が刺激する細胞の表面に存在する分子と結合できる分子を指す。細胞の表面に存在する分子としては、特に限定しないが、抗体、受容体、細胞接着分子、糖鎖（及び糖鎖タンパク質）などが挙げられる。細胞の表面に存在する分子が抗体の場合は、その抗体が認識する抗原；細胞の表面に存在する分子が受容体の場合はそのリガンド（たとえばＣＸＣＬ１２のようなケモカイン）；細胞接着因子の場合はその細胞接着分子と結合する分子；細胞の表面に存在する分子が糖鎖（及び糖鎖タンパク質）の場合はその糖鎖と結合する糖鎖結合タンパク質（たとえば、Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎのようなセレクチンやＢｃ２Ｌｃのようなレクチン）等がターゲット因子に相当する。
【0030】
本明細書中で用いられる「抗原」とは、抗原性を有しうるものである限り特段限定されるものではなく、ペプチド性の抗原（すなわち、抗原ペプチド）だけでなく、リン脂質、複合炭水化物等の非ペプチド性の抗原（例えば、ミコール酸、リポアラビノアンナン等の細菌性膜構成要素等）も包含される。
【0031】
本明細書中で用いられる「抗原ペプチド」は、抗原となりうる２以上のアミノ酸で構成されるペプチド（５０超のアミノ酸で構成されるものを含む）である限り特段限定されるものではなく、天然由来のものであっても、合成由来のものであっても、市販されているものであってもよい。抗原ペプチドは、遺伝子産物の全長アミノ配列又はその部分アミノ酸配列を含んでもよい。抗原ペプチドは、これらに限定されるものではないが、例えば、Ａｘｌ、ＢＡＦＦ－Ｒ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＣＬＤＮ６、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、Ｆｌｔ３、葉酸受容体－α、ＧＤ２、Ｇｌｙｐｉｃａｎ ３、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＧＲＰ７８、ＧＰＣ１、ＨＧＦＲ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎαｖβ６、ＩＬ３Ｒ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＴＡＧ７２、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、５Ｔ４、ＷＴ－１、α－胎児タンパク質、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、胎盤アルカリ性ホスファターゼシアリル－ルイスＸ、ＣＡ－１２５、ＣＡ－１９、ＴＡＧ－７２、上皮糖タンパク質２、α胎児タンパク質受容体、Ｍ２Ａ、チロシナーゼ、Ｒａｓ、ｐ５３、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＥＧＦ－Ｒ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ｍｙｃ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＨＰＶ型１６、メラノトランスフェリン、ＭＵＣ１、ＣＤ１０、ＣＤ３７、ＣＤ４５Ｒ、ＩＬ－２受容体α鎖、Ｔ細胞受容体、前立腺酸性ホスファターゼ、ＧＰ１００、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ－１、ｇｐ７５／ブラウン、ＢＡＧＥ、Ｓ－１００、イトケラチン、ＣＹＦＲＡ２１－１等の腫瘍関連抗原ペプチド(その全長配列及び部分配列を含む)；インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ＩＣＡ５１２／ＩＡ－２タンパク質チロシンホスファターゼ、ＩＣＡ１２、ＩＣＡ６９、プレプロインスリン、ＨＳＰ６０、カルボキシペプチダーゼＨ、ペリフェリン、ＧＭ１－２、ビトロネクチン、βクリスタリン、カルレティキュリン、セロトランスフェリン、ケラチン、ピルビン酸カルボキシラーゼ、Ｃ１、ビリン２、ヌクレオソーム、リボヌクレオタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン／オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドアポタンパク質等の自己抗原ペプチド(その全長配列及び部分配列を含む)；原生動物（例えば、マラリア原虫、リーシュマニア種、トリパノソーマ種）、細菌（例えば、グラム陽性球菌、グラム陽性桿菌、グラム陰性細菌、嫌気性菌）、真菌（例えば、アスペルギルス、ブラストミセス、カンジダ、コクシジオイデス、クリプトコッカス、ヒストプラスマ、パラコクシジオイデス、スポロスリックス）、ウイルス（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、呼吸シンシチアウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶやＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のようなコロナウイルス）、細胞内寄生体（例えば、クラミジア科、マイコプラズマ科、アコレプラスマ科、リケッチア科）、蠕虫（例えば、線虫、吸虫、条虫）等の感染病原体に由来する抗原ペプチド(その全長配列及び部分配列を含む)；プリオン等のその他の抗原ペプチド(その全長配列及び部分配列を含む)等が挙げられる。
抗原ペプチドは、アレルギー症状を引き起こすアレルゲンを含んでもよい。アレルゲンとしては、上記原生動物、細菌、真菌、細胞内寄生体及び蠕虫に由来するペプチド以外に、外来性のペプチド、たとえば、ハウスダスト、ダニ、動物（たとえばネコ、イヌなどのコンパニオンアニマル）、及び花粉（たとえば、スギやヒノキ）由来のペプチド等が例示される。より詳細には、 Ｃｒｙｊ１などのスギ花粉に含まれるタンパク質(その全長配列及び部分配列を含む)が例示される。あるいは、アレルギー症状を引き起こすアレルゲンは、食物由来のものであってよい。食物に対するアレルギー症状を引き超すアレルゲンとしては、鶏卵、牛乳、小麦、そば、かに、えび及び落花生由来のペプチド(その全長配列及び部分配列を含む)等が例示される。
抗原ペプチドは、任意のプロセシングや修飾（たとえば、リン酸化や糖鎖修飾）をされていてもよい。
抗原ペプチドは、アレルギー症状を引き起こすアレルゲンを含んでもよい。アレルゲンとしては、上記原生動物、細菌、真菌、細胞内寄生体及び蠕虫に由来するペプチド以外に、外来性のペプチド、たとえば、ハウスダスト、ダニ、動物（たとえばネコ、イヌなどのコンパニオンアニマル）、及び花粉（たとえば、スギやヒノキ）由来のペプチド等が例示される。より詳細には、 Ｃｒｙｊ１などのスギ花粉に含まれるタンパク質(その全長配列及び部分配列を含む)が例示される。あるいは、アレルギー症状を引き起こすアレルゲンは、食物由来のものであってよい。食物に対するアレルギー症状を引き超すアレルゲンとしては、鶏卵、牛乳、小麦、そば、かに、えび及び落花生由来のペプチド(その全長配列及び部分配列を含む)等が例示される。
抗原ペプチドは、任意のプロセシングや修飾（たとえば、リン酸化や糖鎖修飾）をされていてもよい。
【0032】
サイトカイン又はターゲット因子を「膜外に提示する細胞外小胞」とは以下に規定される（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に規定されるタンパク質を膜に含むことによって、サイトカイン又はターゲット因子を膜外に提示させてもよい。
あるいは、単離した細胞外小胞にあとから、その膜表面にサイトカイン又はターゲット因子を付着させてもよい。付着させる方法は特に限定しないが、サイトカイン又はターゲット因子に各々リン脂質を結合し、細胞外小胞の膜に新脂質部分を取り込ませることにより、膜表面にサイトカイン又はターゲット因子を付着させてもよい。細胞外小胞にはフォスファチジルセリンが表面に存在している。従って、フォスファチジルセリンと結合するＭＦＧ－Ｅ８に、提示させたいサイトカイン又はターゲット因子を融合させたタンパク質を各々合成精製して、その融合タンパク質と細胞外小胞を混合することにより、膜表面にサイトカイン又はターゲット因子を提示する細胞外小胞を作製することができる。また、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）ナノボディをあらかじめ発現させた細胞外小胞に、後からＰＮＥｔａｇを付けたサイトカイン又はターゲット因子を加えて細胞外小胞の膜表面に提示させてもよい。ストレプトアビジンを発現させた細胞外小胞にビオチン化したサイトカイン又はターゲット因子を加えて、細胞外小胞の膜表面に提示させてもよい。
あるいは、単離した細胞外小胞にあとから、その膜表面にサイトカイン又はターゲット因子を付着させてもよい。付着させる方法は特に限定しないが、サイトカイン又はターゲット因子に各々リン脂質を結合し、細胞外小胞の膜に新脂質部分を取り込ませることにより、膜表面にサイトカイン又はターゲット因子を付着させてもよい。細胞外小胞にはフォスファチジルセリンが表面に存在している。従って、フォスファチジルセリンと結合するＭＦＧ－Ｅ８に、提示させたいサイトカイン又はターゲット因子を融合させたタンパク質を各々合成精製して、その融合タンパク質と細胞外小胞を混合することにより、膜表面にサイトカイン又はターゲット因子を提示する細胞外小胞を作製することができる。また、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）ナノボディをあらかじめ発現させた細胞外小胞に、後からＰＮＥｔａｇを付けたサイトカイン又はターゲット因子を加えて細胞外小胞の膜表面に提示させてもよい。ストレプトアビジンを発現させた細胞外小胞にビオチン化したサイトカイン又はターゲット因子を加えて、細胞外小胞の膜表面に提示させてもよい。
【0033】
本明細書中で用いられる「ＸＸＸを含む、該ＸＸＸを膜外に提示可能なタンパク質」とは、ＸＸＸを少なくとも含み、細胞外小胞の膜外に該ＸＸＸを提示することが可能なタンパク質を意味する。「ＸＸＸを膜外に提示可能なタンパク質」は、ＸＸＸが細胞又は細胞外小胞の膜に発現するように、プラスミド等を用いて、ＸＸＸと膜タンパク質又はその膜貫通ドメインを含むフラグメント等とを含む融合タンパク質として発現させたものであってもよい。或いは、「ＸＸＸを含む、ＸＸＸを膜外に提示可能なタンパク質」は、可溶性のＸＸＸ（これらに限定されるものではないが、例えば、ＸＸＸそのもの；ＸＸＸと抗体のＦｃ部分との融合タンパク質；ＸＸＸと、ＸＸＸを認識する抗体、又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等と、の複合体等）を用いる場合、可溶性のＸＸＸと細胞外小胞とを、必要に応じて脂質リンカー、ペプチドリンカー等を介して、細胞外小胞の膜に結合させたものであってもよい（例えば、特開２０１８－１０４３４１号公報等に記載の方法を参考にしてもよい）。或いは、可溶性のＸＸＸのＮ末端側又はＣ末端側に所望のタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＰＮＥタグを付加したもの（該タグは、例えば、他の構成要素とともに融合タンパク質として発現させてもよいし、別途用意した可溶性のＸＸＸに、必要に応じてリンカー等を介して結合させてもよい）と、該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等を含むタンパク質（例えば、必要に応じてリンカー等を介して細胞外小胞の膜に結合した、該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等自体；細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質又はその膜貫通ドメインのＮ末端側又はＣ末端側に、該タグに対するナノボディが結合した、融合タンパク質等）を膜に含む細胞外小胞とを、所望の条件で混合したものであってもよい（例えば、Raj D, et al., Gut., 2019 Jun;68(6):1052-1064等に記載の、ＰＮＥタグと該タグに対する抗体等とを用いる方法を参考にしてもよい）。なお、サブユニットの多量体で形成されるＸＸＸの場合、そのサブユニットの１つが、細胞外小胞の膜外に提示することが可能なタンパク質であれば、残りのサブユニットは膜外に提示可能な態様である必要はない。そのサブユニットの１つが、細胞外小胞の膜外に提示することが可能なタンパク質であれば、他のサブユニットを添加又は共発現させることにより、機能的なＸＸＸが細胞外小胞の膜外に構築されうる。
【0034】
本明細書中で用いられる「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」としては、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものである限り、任意の膜タンパク質又はその膜貫通ドメインを選択することができる。「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質又はその膜貫通ドメイン」は、細胞外小胞（例えば、エクソソーム等）に発現しうることが知られている膜タンパク質（例えば、テトラスパニン、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ－１、ＰＴＧＦＲＮ（例えば、非特許文献１、国際公開第２０１９／１８３５７８号等を参照）等）、又はこれらの膜貫通ドメイン等が好ましい。
【0035】
本明細書中で用いられる「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」としては、細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、任意のタンパク質又はそのドメインを選択することができる。「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」は、細胞外小胞（例えば、エクソソーム等）の膜に結合しうることが知られているもの（例えば、ＭＦＧ－Ｅ８、又はそのドメイン（例えば、Alain Delcayre, et al., Blood Cells, Molecules, and Diseases 35 (2005) 158-168に記載のＭＦＧ－Ｅ８のＣ１、Ｃ２ドメイン））等が好ましい。
【0036】
本明細書中に記載の「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」は、任意の動物種由来のものであってもよい。例えば、マウス、ラット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等の哺乳動物等の動物に由来するものが挙げられる。本明細書中に記載の「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」は、好ましくは、げっ歯類又は哺乳類動物に由来するものであり、より好ましくは、マウス又はヒトに由来するものである。
【0037】
非特許文献２によると、哺乳動物の細胞外小胞のマーカーは以下のように分類される。
細胞外小胞のマーカータンパク質として用いることのできる膜タンパク質又はＧＰＩアンカータンパク質としては、
１）組織非特異的なもの
テトラスパニン（ＣＤ６３，ＣＤ９，ＣＤ８１，ＣＤ８２），他の複数膜貫通型の膜タンパク質（ＣＤ４７やヘテロ３量体Ｇタンパク質（ＧＮＡ：Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）など）
ＭＨＣ クラスＩ（ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ，Ｈ２－Ｋ／Ｄ／Ｑ），
インテグリン（ＩＴＧＡ／ＩＴＧＢ）、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）；
ＬＡＭＰ１／２；
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（シンデカン（ＳＤＣ）を含む）；
細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）（ＢＳＧ又はＣＤ１４７ともいう）；
ＡＤＡＭ１０；
ＧＰＩアンカー型の５’ヌクレオチダーゼであるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ），
ＧＰＩアンカー型の補体結合タンパク質であるＣＤ５５及びＣＤ５９；
ソニックヘッジホッグタンパク質（ＳＨＨ）
２）細胞／組織特異的なもの
いくつかのテトラスパニン：ＴＳＰＡＮ８（上皮細胞特異的）、ＣＤ３７及びＣＤ５３（白血球特異的）；
ＰＥＣＡＭ１（内皮細胞特異的）；
ＥＲＢＢ２（乳癌特異的）；
ＥＰＣＡＭ（上皮性特異的）；
ＣＤ９０（ＴＨＹ１）（間葉系幹細胞特異的）；
ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）（免疫細胞特異的）、ＣＤ４１（ＩＴＧＡ２Ｂ）又はＣＤ４２ａ（ＧＰ９）（血小板特異的）；
グリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）（赤血球特異的）；
ＣＤ１４（単球特異的），ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ，Ｈ２－Ａ）；
ＣＤ３（Ｔ細胞特異的）；
アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ（神経細胞特異的）、ＡＣｈＥ－Ｅ（赤血球特異的）；
アミロイドβＡ４／ＡＰＰ（神経細胞特異的）；
などが挙げられる。
従って、これらに限定しないが、細胞外小胞のマーカーであるタンパク質を本発明における「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質」として用いてもよい。
細胞外小胞のマーカータンパク質として用いることのできる膜タンパク質又はＧＰＩアンカータンパク質としては、
１）組織非特異的なもの
テトラスパニン（ＣＤ６３，ＣＤ９，ＣＤ８１，ＣＤ８２），他の複数膜貫通型の膜タンパク質（ＣＤ４７やヘテロ３量体Ｇタンパク質（ＧＮＡ：Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）など）
ＭＨＣ クラスＩ（ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ，Ｈ２－Ｋ／Ｄ／Ｑ），
インテグリン（ＩＴＧＡ／ＩＴＧＢ）、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）；
ＬＡＭＰ１／２；
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（シンデカン（ＳＤＣ）を含む）；
細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）（ＢＳＧ又はＣＤ１４７ともいう）；
ＡＤＡＭ１０；
ＧＰＩアンカー型の５’ヌクレオチダーゼであるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ），
ＧＰＩアンカー型の補体結合タンパク質であるＣＤ５５及びＣＤ５９；
ソニックヘッジホッグタンパク質（ＳＨＨ）
２）細胞／組織特異的なもの
いくつかのテトラスパニン：ＴＳＰＡＮ８（上皮細胞特異的）、ＣＤ３７及びＣＤ５３（白血球特異的）；
ＰＥＣＡＭ１（内皮細胞特異的）；
ＥＲＢＢ２（乳癌特異的）；
ＥＰＣＡＭ（上皮性特異的）；
ＣＤ９０（ＴＨＹ１）（間葉系幹細胞特異的）；
ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）（免疫細胞特異的）、ＣＤ４１（ＩＴＧＡ２Ｂ）又はＣＤ４２ａ（ＧＰ９）（血小板特異的）；
グリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）（赤血球特異的）；
ＣＤ１４（単球特異的），ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ，Ｈ２－Ａ）；
ＣＤ３（Ｔ細胞特異的）；
アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ（神経細胞特異的）、ＡＣｈＥ－Ｅ（赤血球特異的）；
アミロイドβＡ４／ＡＰＰ（神経細胞特異的）；
などが挙げられる。
従って、これらに限定しないが、細胞外小胞のマーカーであるタンパク質を本発明における「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質」として用いてもよい。
【0038】
本明細書中で用いられる「テトラスパニン」とは、テトラスパニンファミリーに属するタンパク質（これらに限定されるものではないが、例えば、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１５１等）を意味する。テトラスパニンは、通常、Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１（以下、「ＴＭ１」ともいう。）、小型細胞外ループ（以下、「ＳＥＬ」ともいう。）、膜貫通ドメイン２（以下、「ＴＭ２」ともいう。）、小型細胞内ループ（以下、「ＳＩＬ」ともいう。）、膜貫通ドメイン３（以下、「ＴＭ３」ともいう。）、大型細胞外ループ（以下、「ＬＥＬ」ともいう。）、及び膜貫通ドメイン４（以下、「ＴＭ４」ともいう。）を有することから、４回膜貫通型であり、かつ、Ｎ末端側及びＣ末端側の両方が細胞質側に存在する。例えば、テトラスパニンがマウスＣＤ６３の場合、通常、アミノ酸配列 約１～約１１０において、ＴＭ１、ＳＥＬ、ＴＭ２、ＳＩＬ及びＴＭ３を含み、アミノ酸配列 約１１１～約２００において、ＬＥＬを含み、アミノ酸配列 約２０１～約２３８において、ＴＭ４を含みうる。
【0039】
本明細書中に記載の「テトラスパニン」における各ドメイン（例えば、ＴＭ１、ＳＥＬ、ＳＩＬ、ＬＴＬ等）は、同一のテトラスパニン由来のものであってもよいし、全部又は一部が異なるテトラスパニン由来のものであってもよい。
【0040】
本明細書中に記載のテトラスパニンは、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のテトラスパニンは、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
【0041】
本明細書中に記載のテトラスパニンの部分配列（例えば、各ドメイン；ＴＭ１、ＳＥＬ、ＴＭ２、ＳＩＬ及びＴＭ３を含む部分配列；ＴＭ４を含む部分配列）は、その野生型のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のテトラスパニンの部分配列は、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
【0042】
本明細書中に記載のＭＦＧ－Ｅ８は、細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のＭＦＧ－Ｅ８は、細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
【0043】
本明細書中に記載のＣＤ５８、ＰＴＧＦＲＮ等は、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものであるか、又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のＣＤ５８、ＰＴＧＦＲＮ等は、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものであるか、又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
【0044】
本明細書中で用いられる「スペーサー配列（以下、「ペプチドリンカー配列」又は「リンカー配列」ともいう）」とは、２以上のタンパク質又はその部分配列若しくはドメイン等の間に存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基を有する任意の配列を意味する。スペーサー配列は、例えば、２以上のタンパク質又はその部分配列若しくはドメイン等を連結する際に使用されうる。スペーサー配列は、アミノ酸残基の長さとして、通常、１～約５０であり、好ましくは、約２～約２８であり、より好ましくは、約４～約２５である。スペーサー配列としては、これらに限定されるものではないが、例えば、（ＧＧＧＸＳ）ｎＧｍ（式中、Ｘは出現するごとに独立して、Ａ又はＧであり、ｎは、１～８であり、ｍは、０～３である）；ＴａＳｂ（ＧＧＸ）ｎＧｍ（式中、Ｘは出現するごとに独立して、Ｓ又はＴであり、ｎは、１～８であり、ｍは、０～３であり、ａは、０又は１であり、ｂは、０又は１である）；等が挙げられる。
【0045】
本明細書中で用いられる「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ－ＲＮＡキメラ分子等を意味する。ポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ等、及びこれらの全ての天然に存在するか又は人工的に修飾された誘導体等が含まれる。ポリヌクレオチドは、鎖状であっても、環状であってもよい。
【0046】
本発明の一実施態様では、少なくとも１つ（１、２、３、４又は５種）のサイトカイン（各々のサイトカインを識別するために、以下、第一のサイトカイン、第二のサイトカイン、それ以上のサイトカイン等と呼称する場合がある）を膜外に提示する細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、少なくとも１つ（１、２、３、４又は５種）のターゲット因子（各々のターゲット因子を識別するために、以下、第一のターゲット因子、第二のターゲット因子、それ以上のターゲット因子等と呼称する場合がある）を膜外に提示する細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、少なくとも１つ（１、２、３、４又は５種）のサイトカインとすくなくとも１つ（１、２、３、４又は５種）のターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、少なくとも１つ（１、２、３、４又は５種）のターゲット因子（各々のターゲット因子を識別するために、以下、第一のターゲット因子、第二のターゲット因子、それ以上のターゲット因子等と呼称する場合がある）を膜外に提示する細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、少なくとも１つ（１、２、３、４又は５種）のサイトカインとすくなくとも１つ（１、２、３、４又は５種）のターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞を提供する。
【0047】
本発明の一実施態様では、すくなくとも１つのサイトカインを膜外に提示する細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）すくなくとも１つのサイトカイン又はそのサブユニットを含む、該サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、すくなくとも１つのターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｂ）すくなくとも１つのターゲット因子又はそのサブユニットを含む、該ターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、すくなくとも１つのサイトカインとすくなくとも１つのターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）すくなくとも１つのサイトカイン又はそのサブユニットを含む、該サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）すくなくとも１つのターゲット因子又はそのサブユニットを含む、該ターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞を提供する。
（Ａ）すくなくとも１つのサイトカイン又はそのサブユニットを含む、該サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、すくなくとも１つのターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｂ）すくなくとも１つのターゲット因子又はそのサブユニットを含む、該ターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、すくなくとも１つのサイトカインとすくなくとも１つのターゲット因子を膜外に提示する細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）すくなくとも１つのサイトカイン又はそのサブユニットを含む、該サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）すくなくとも１つのターゲット因子又はそのサブユニットを含む、該ターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、細胞外小胞を提供する。
【0048】
本発明の一実施態様では、Ｔ細胞刺激性サイトカインと抗原を膜外に提示する細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｃ）第１のサイトカイン又はそのサブユニット及びターゲット因子を含む、該第１のサイトカイン及びターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質を含む、細胞外小胞を提供する。
（Ｃ）第１のサイトカイン又はそのサブユニット及びターゲット因子を含む、該第１のサイトカイン及びターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質を含む、細胞外小胞を提供する。
【0049】
構成要件（Ａ）
上記（Ａ）の「サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質」は、サイトカインを細胞外小胞の膜外に提示可能なタンパク質である限り、他のタンパク質又はそのドメイン等を含んでいてもよい。
上記（Ａ）の「サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質」は、サイトカインを細胞外小胞の膜外に提示可能なタンパク質である限り、他のタンパク質又はそのドメイン等を含んでいてもよい。
【0050】
本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、サイトカイン又はそのサブユニットと、細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体である。
【0051】
本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）第１のサイトカイン又はそのサブユニットと、テトラスパニンの部分配列とを含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のサイトカイン又はそのサブユニットが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、融合タンパク質、又は
（Ａ）第１のサイトカイン又はそのサブユニットと、ＭＦＧ－Ｅ８又はそのドメインとを含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
（Ａ）第１のサイトカイン又はそのサブユニットと、テトラスパニンの部分配列とを含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のサイトカイン又はそのサブユニットが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、融合タンパク質、又は
（Ａ）第１のサイトカイン又はそのサブユニットと、ＭＦＧ－Ｅ８又はそのドメインとを含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
【0052】
本明細書中で用いられる「テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のサイトカイン又はそのサブユニットが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている」とは、例えば、テトラスパニンの部分配列がテトラスパニンのＴＭ１とＴＭ２とを少なくとも含み、かつ該第１のサイトカイン又はそのサブユニットがＴＭ１とＴＭ２との間に配置されている場合、テトラスパニンの部分配列がテトラスパニンのＴＭ３とＴＭ４とを少なくとも含み、かつ該第１のサイトカイン又はそのサブユニットがＴＭ３とＴＭ４との間に配置されている場合等が挙げられる。
【0053】
本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
１．（Ａ）Ｎ末端側から、
（Ａ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
（Ａ－３）第１のサイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（Ａ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
２．（Ａ）Ｎ末端側から、
（Ａ－３）第１のサイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ａ－５）ＭＦＧ－Ｅ８のアミノ酸配列；
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
又は
３．（Ａ）Ｎ末端側から、
（Ａ－３）第１のサイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（Ａ－５）任意の膜貫通ドメインとテトラスパニンを含む配列；
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能なタンパク質
である。
１．（Ａ）Ｎ末端側から、
（Ａ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
（Ａ－３）第１のサイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（Ａ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
２．（Ａ）Ｎ末端側から、
（Ａ－３）第１のサイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ａ－５）ＭＦＧ－Ｅ８のアミノ酸配列；
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
又は
３．（Ａ）Ｎ末端側から、
（Ａ－３）第１のサイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（Ａ－５）任意の膜貫通ドメインとテトラスパニンを含む配列；
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のサイトカインを膜外に提示可能なタンパク質
である。
【0054】
国際公開第２０１６／１３９３５４号で開示されているとおり、テトラスパニンは、その大型細胞外ループ（ＬＥＬ）が全体的に又は部分的に異なるアミノ酸配列に置き換えられていても、膜に発現しうることが報告されている。したがって、（Ａ－３）の第１のサイトカイン又はそのサブユニットは、存在していてもよいスペーサー配列を介して、テトラスパニンのＬＥＬに替えて挿入されていてもよいし、テトラスパニンのＬＥＬ中又はその部分配列中の任意の位置に挿入されていてもよい。
【0055】
（Ａ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、通常、テトラスパニンの膜貫通ドメイン４を含まない。（Ａ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、大型細胞外ループ又はその部分配列を含んでいてもよい。（Ａ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３の各ドメインは、それぞれ別のテトラスパニン由来の配列であってもよいし、全て同じテトラスパニン由来の配列であってもよい。好ましくは、（Ａ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３の各ドメインは、全て同じテトラスパニン由来の配列である。
【0056】
本発明の一実施態様では、（Ａ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列が、全て、ＣＤ９由来、ＣＤ６３由来又はＣＤ８１由来の部分配列である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）の膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列は、全てＣＤ６３又はＣＤ８１由来の部分配列である。
【0057】
（Ａ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」は、通常、テトラスパニンの膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含まない。（Ａ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」は、大型細胞外ループ又はその部分配列を含んでいてもよい。（Ａ－５）における膜貫通ドメイン４は、（Ａ－１）とは別のテトラスパニン由来の配列であってもよいし、（Ａ－１）と同じテトラスパニン由来の配列であってもよい。好ましくは、（Ａ－５）における膜貫通ドメイン４は、（Ａ－１）と同じテトラスパニン由来の配列である。本発明の一実施態様では、（Ａ－５）における、膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列が、ＣＤ９由来、ＣＤ６３由来又はＣＤ８１由来の部分配列である。本発明の一実施態様では、（Ａ－５）の膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列は、ＣＤ６３又はＣＤ８１由来の部分配列である。
【0058】
本発明の一実施態様では、（Ａ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、ＣＤ６３由来の部分配列であり、かつ、（Ａ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」が、ＣＤ６３由来の部分配列である。本発明の一実施態様では、（Ａ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、ＣＤ８１由来の部分配列であり、かつ、（Ａ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」が、ＣＤ８１由来の部分配列である。
【0059】
上記（Ａ－５）の「ＭＦＧ－Ｅ８」は、好ましくは、配列番号３７、６３、７３、８３等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである。
【0060】
テトラスパニンのＮ端は細胞外小胞の内側に存在する。それ故、（Ａ－３）のサイトカイン又はそのサブユニットが、細胞外小胞の外側に提示されるように、上記（Ａ－５）の「任意の膜貫通ドメインとテトラスパニンを含む配列」は、（Ａ－５）のＮ端が細胞外小胞の外側に存在するように、任意の奇数（１，３，５）の膜貫通ドメインをコードするアミノ酸配列とテトラスパニンの配列が融合したものであることが好ましい。
本発明の一実施態様では、ＣＤ８（一回膜貫通型タンパク質）（配列番号５、２１、５３等；又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである）とＣＤ８１（配列番号７、１３、２３、５５、９９等；又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである）の融合タンパク質をコードする配列である。
本発明の一実施態様では、ＣＤ８（一回膜貫通型タンパク質）（配列番号５、２１、５３等；又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである）とＣＤ８１（配列番号７、１３、２３、５５、９９等；又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである）の融合タンパク質をコードする配列である。
【0061】
本明細書中に記載の細胞外小胞は、第１のサイトカインに加えて、第２（又はそれ以上）のサイトカインを更に含んでいてもよい。したがって、本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の細胞外小胞は、第２（又はそれ以上）のサイトカインを更に含んでもよい。
【0062】
第２（又はそれ以上）のサイトカインは、例えば、上記（Ａ）中に挿入されていてもよい（例えば、（Ａ－３）の「第１のサイトカイン」のＮ末端側及び／又はＣ末端側に、必要に応じてスペーサー配列等を介して、第２（又はそれ以上）のサイトカインが連結されていてもよい）。或いは、第２（又はそれ以上）のサイトカインは、本明細書中に記載の構成要件（Ａ）と同様の構成を有することにより、本明細書中に記載の構成要件（Ａ）のタンパク質（又は融合タンパク質）とは別個のタンパク質（又は融合タンパク質）として、第１のサイトカインと同様に、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれていてもよい。
【0063】
上記各実施態様の（Ａ－２）及び（Ａ－４）における「存在していてもよいスペーサー配列」は、存在する場合、独立して選択されうる。（Ａ－２）は、存在する場合、例えば、配列番号３１、３５、４５、４９、６１，７１，８１、８７等のスペーサー配列であってもよい。（Ａ－４）は、存在する場合、例えば、配列番号３１、３５、４５、４９、６１，７１，８１、８７等のスペーサー配列であってもよい。
【0064】
本発明の一実施態様では、サイトカインが複数のサブユニットとマルチマー（ホモ／ヘテロマー）を形成して活性を有する場合、
（Ａ－６）活性を有するために必要なサブユニット
を、細胞外小胞はさらに含んでもよい。
（Ａ－６）活性を有するために必要なサブユニット
を、細胞外小胞はさらに含んでもよい。
【0065】
構成要件（Ｂ）
上記（Ｂ）の「ターゲット因子又はそのサブユニットを含む、該ターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質」は、ターゲット因子を細胞外小胞の膜外に提示可能なタンパク質である限り、他のタンパク質又はそのドメイン等を含んでいてもよい。
上記（Ｂ）の「ターゲット因子又はそのサブユニットを含む、該ターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質」は、ターゲット因子を細胞外小胞の膜外に提示可能なタンパク質である限り、他のタンパク質又はそのドメイン等を含んでいてもよい。
【0066】
本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、ターゲット因子又はそのサブユニットと、細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体である。
【0067】
本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、ターゲット因子又はそのサブユニットと、細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体である。
【0068】
本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、
（Ｂ）第１のターゲット因子又はそのサブユニットと、テトラスパニンの部分配列とを含む、該第１のターゲット因子又はそのサブユニットを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のサイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、融合タンパク質、又は
（Ｂ）第１のターゲット因子又はそのサブユニットと、ＭＦＧ－Ｅ８又はそのドメインとを含む、該第１のターゲット因子を膜外に提示可能な融合タンパク質である。
（Ｂ）第１のターゲット因子又はそのサブユニットと、テトラスパニンの部分配列とを含む、該第１のターゲット因子又はそのサブユニットを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のサイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、融合タンパク質、又は
（Ｂ）第１のターゲット因子又はそのサブユニットと、ＭＦＧ－Ｅ８又はそのドメインとを含む、該第１のターゲット因子を膜外に提示可能な融合タンパク質である。
【0069】
本明細書中で用いられる「テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のターゲット因子又はそのサブユニットが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている」とは、例えば、テトラスパニンの部分配列がテトラスパニンのＴＭ１とＴＭ２とを少なくとも含み、かつ該第１のターゲット因子又はそのサブユニットがＴＭ１とＴＭ２との間に配置されている場合、テトラスパニンの部分配列がテトラスパニンのＴＭ３とＴＭ４とを少なくとも含み、かつ該第１のターゲット因子又はそのサブユニットがＴＭ３とＴＭ４との間に配置されている場合等が挙げられる。
【0070】
本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、
１．（Ｂ）Ｎ末端側から、
（Ｂ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
（Ｂ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
（Ｂ－３）第１のターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（Ｂ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のターゲット因子を膜外に提示可能な融合タンパク質；
２．（Ｂ）Ｎ末端側から、
（Ｂ－３）第１のターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８のアミノ酸配列
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のターゲット因子を膜外に提示可能な融合タンパク質；
又は
３．（Ｂ）Ｎ末端側から、
（Ｂ－３）第１のターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（Ｂ－５）任意の膜貫通ドメインとテトラスパニンを含む配列；
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のターゲット因子を膜外に提示可能な融合タンパク質である。
１．（Ｂ）Ｎ末端側から、
（Ｂ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
（Ｂ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
（Ｂ－３）第１のターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（Ｂ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のターゲット因子を膜外に提示可能な融合タンパク質；
２．（Ｂ）Ｎ末端側から、
（Ｂ－３）第１のターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８のアミノ酸配列
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のターゲット因子を膜外に提示可能な融合タンパク質；
又は
３．（Ｂ）Ｎ末端側から、
（Ｂ－３）第１のターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（Ｂ－５）任意の膜貫通ドメインとテトラスパニンを含む配列；
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のターゲット因子を膜外に提示可能な融合タンパク質である。
【0071】
国際公開第２０１６／１３９３５４号で開示されているとおり、テトラスパニンは、その大型細胞外ループ（ＬＥＬ）が全体的に又は部分的に異なるアミノ酸配列に置き換えられていても、膜に発現しうることが報告されている。したがって、（Ｂ－３）の第１のターゲット因子又はそのサブユニットは、存在していてもよいスペーサー配列を介して、テトラスパニンのＬＥＬに替えて挿入されていてもよいし、テトラスパニンのＬＥＬ中又はその部分配列中の任意の位置に挿入されていてもよい。
【0072】
（Ｂ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、通常、テトラスパニンの膜貫通ドメイン４を含まない。（Ｂ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、大型細胞外ループ又はその部分配列を含んでいてもよい。（Ｂ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３の各ドメインは、それぞれ別のテトラスパニン由来の配列であってもよいし、全て同じテトラスパニン由来の配列であってもよい。好ましくは、（Ａ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３の各ドメインは、全て同じテトラスパニン由来の配列である。
【0073】
本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列が、全て、ＣＤ９由来、ＣＤ６３由来又はＣＤ８１由来の部分配列である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）の膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列は、全てＣＤ６３又はＣＤ８１由来の部分配列）である。
【0074】
（Ｂ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」は、通常、テトラスパニンの膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含まない。（Ｂ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」は、大型細胞外ループ又はその部分配列を含んでいてもよい。（Ｂ－５）における膜貫通ドメイン４は、（Ｂ－１）とは別のテトラスパニン由来の配列であってもよいし、（Ｂ－１）と同じテトラスパニン由来の配列であってもよい。好ましくは、（Ｂ－５）における膜貫通ドメイン４は、（Ｂ－１）と同じテトラスパニン由来の配列である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－５）における、膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列が、ＣＤ９由来、ＣＤ６３由来又はＣＤ８１由来の部分配列である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－５）の膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列は、ＣＤ６３又はＣＤ８１由来の部分配列である。
【0075】
本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、ＣＤ６３由来の部分配列であり、かつ、（Ｂ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」が、ＣＤ６３由来の部分配列である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、ＣＤ８１由来の部分配列であり、かつ、（Ｂ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」が、ＣＤ８１由来の部分配列である。
【0076】
上記（Ｂ－５）の「ＭＦＧ－Ｅ８」は、好ましくは、配列番号３７、６３、７３、８３等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである。
【0077】
テトラスパニンのＮ端は細胞外小胞の内側に存在する。それ故、（Ｂ－３）のターゲット因子又はそのサブユニットが、細胞外小胞の外側に提示されるように、上記（Ｂ－５）の「任意の膜貫通ドメインとテトラスパニンを含む配列」は、（Ｂ－５）のＮ端が細胞外小胞の外側に存在するように、任意の奇数（１，３，５）の膜貫通ドメインをコードするアミノ酸配列とテトラスパニンの配列が融合したものであることが好ましい。
本発明の一実施態様では、ＣＤ８（一回膜貫通型タンパク質；例えば配列番号５又は２１、あるいはこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである）とＣＤ８１の融合タンパク質をコードする配列である。
本発明の一実施態様では、ＣＤ８（一回膜貫通型タンパク質；例えば配列番号５又は２１、あるいはこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである）とＣＤ８１の融合タンパク質をコードする配列である。
【0078】
本明細書中に記載の細胞外小胞は、第１のターゲット因子に加えて、第２（又はそれ以上）のターゲット因子を更に含んでいてもよい。したがって、本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の細胞外小胞は、第２（又はそれ以上）のターゲット因子を更に含んでもよい。
【0079】
第２（又はそれ以上）のターゲット因子又はそのサブユニットは、例えば、上記（Ｂ）中に挿入されていてもよい（例えば、（Ｂ－３）の「第１のターゲット因子又はそのサブユニット」のＮ末端側及び／又はＣ末端側に、必要に応じてスペーサー配列等を介して、第２（又はそれ以上）のターゲット因子又はそのサブユニットが連結されていてもよい）。或いは、第２（又はそれ以上）のターゲット因子又はそのサブユニットは、本明細書中に記載の構成要件（Ｂ）と同様の構成を有することにより、本明細書中に記載の構成要件（Ｂ）のタンパク質（又は融合タンパク質）とは別個のタンパク質（又は融合タンパク質）として、第１のターゲット因子と同様に、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれていてもよい。
【0080】
上記各実施態様の（Ｂ－２）及び（Ｂ－４）における「存在していてもよいスペーサー配列」は、存在する場合、独立して選択されうる。（Ｂ－２）は、存在する場合、例えば、配列番号３１、３５、４５、４９、６１，７１，８１、８７等のスペーサー配列であってもよい。（Ｂ－４）は、存在する場合、例えば、配列番号３１、３５、４５、４９、６１，７１，８１、８７等のスペーサー配列であってもよい。
【0081】
本発明の一実施態様では、ターゲット因子が複数のサブユニットとマルチマー（ホモ／ヘテロマー）を形成して活性を有する場合、
（Ｂ－６）活性を有するために必要なサブユニット
を、細胞外小胞はさらに含んでもよい。
（Ｂ－６）活性を有するために必要なサブユニット
を、細胞外小胞はさらに含んでもよい。
【0082】
本発明の一実施態様では、上記（Ａ）及び（Ｂ）について、（Ａ）と（Ｂ）が融合して、１分子となっていてもよい。かかる融合分子は、（Ａ）及び（Ｂ）間にスペーサー配列を含む又は含まない形で１つのタンパク質分子として翻訳されていてもよいし、（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質が化学的に架橋されること（たとえばシステイン残基間のジスルフィド結合）によって融合して１分子となっていてもよい。
あるいは、上記（Ａ）及び（Ｂ）は、そのタンパク質が細胞外小胞に局在するための要素、すなわち、「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」の部分を共有することにより、機能的に融合していてもよい。
あるいは、上記（Ａ）及び（Ｂ）は、そのタンパク質が細胞外小胞に局在するための要素、すなわち、「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」の部分を共有することにより、機能的に融合していてもよい。
【0083】
構成要件（Ｃ）
上記（Ｃ）の「サイトカイン又はそのサブユニット及びターゲット因子又はそのサブユニットを含む、該サイトカイン及び該ターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質」は、サイトカイン及びターゲット因子を細胞外小胞の膜外に提示可能なタンパク質である限り、他のタンパク質又はそのドメイン等を含んでいてもよい。
本発明の一実施態様では、上記（Ｃ）は、サイトカイン又はそのサブユニットと、ターゲット因子又はそのサブユニットと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含んでもよい。
上記（Ｃ）の「サイトカイン又はそのサブユニット及びターゲット因子又はそのサブユニットを含む、該サイトカイン及び該ターゲット因子を膜外に提示可能なタンパク質」は、サイトカイン及びターゲット因子を細胞外小胞の膜外に提示可能なタンパク質である限り、他のタンパク質又はそのドメイン等を含んでいてもよい。
本発明の一実施態様では、上記（Ｃ）は、サイトカイン又はそのサブユニットと、ターゲット因子又はそのサブユニットと、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含んでもよい。
【0084】
本発明の一実施態様では、前記細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質は、テトラスパニン又はＭＦＧ－Ｅ８であってもよい。
前記融合タンパク質は、Ｎ末端側から、
（Ｃ－３）ターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ｃ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のサイトカインを含む融合ペプチドを、この順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
前記融合タンパク質は、Ｎ末端側から、
（Ｃ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のサイトカインを含む融合ペプチド
（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－３）ターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列を、
この順にコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
ここで、前記融合ペプチドは、Ｎ末端側から、
（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
（２）存在していてもよいスペーサー配列、
（３）前記すくなくとも１つのサイトカインのアミノ酸配列、
（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
前記融合ペプチドは、Ｎ末端側から、
（１）前記すくなくとも１のサイトカインのアミノ酸配列、
（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（３）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
前記融合タンパク質は、Ｎ末端側から、
（Ｃ－３）ターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
（Ｃ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のサイトカインを含む融合ペプチドを、この順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
前記融合タンパク質は、Ｎ末端側から、
（Ｃ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のサイトカインを含む融合ペプチド
（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（Ｃ－３）ターゲット因子又はそのサブユニットのアミノ酸配列を、
この順にコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
ここで、前記融合ペプチドは、Ｎ末端側から、
（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
（２）存在していてもよいスペーサー配列、
（３）前記すくなくとも１つのサイトカインのアミノ酸配列、
（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
前記融合ペプチドは、Ｎ末端側から、
（１）前記すくなくとも１のサイトカインのアミノ酸配列、
（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
（３）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
【0085】
本発明の一実施態様では、サイトカイン又は／及びターゲット因子が複数のサブユニットとマルチマー（ホモ／ヘテロマー）を形成して活性を有する場合、
（Ｃ－６）活性を有するために必要なサブユニット
を、細胞外小胞はさらに含んでもよい。
（Ｃ－６）活性を有するために必要なサブユニット
を、細胞外小胞はさらに含んでもよい。
【0086】
本発明の一実施態様では、上記各実施態様のサイトカインは、Ｔ細胞刺激性サイトカインである。本発明の一実施態様では、Ｔ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２（好ましくは、配列番号８９、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）、ＩＬ－４、ＴＧＦ－β、ＩＬ－７（好ましくは、配列番号９３、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。これらのうち、ホモ若しくはヘテロのサブユニットの多量体を形成しうるもの（例えば、ＩＬ－１２、ＴＧＦ－β等）は、機能的である限り（即ち、所望の薬理活性を有しうる限り）、場合によりペプチドリンカー等を介して連結された、連続したアミノ酸配列のものであってもよい。これらのＴ細胞刺激性サイトカインは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などの細胞表面に存在する対応する受容体と結合し、細胞内へシグナルが伝達されることで、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージなどを分化・増殖させる。
【0087】
本発明の一実施態様では、上記各実施態様のサイトカインは、トロンボポエチン（ＴＰＯ；Megakaryocyte Stimulating Factorともいう）及び／又は幹細胞因子（ＳＣＦ；Kit ligandともいう）である。本発明の一実施態様では、上記各実施態様における第１のサイトカインが、ＴＰＯ（好ましくは、配列番号１９、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）であり、第２のサイトカインが、ＳＣＦ（好ましくは、配列番号２９又は３３、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
ＴＰＯ遺伝子は３５３アミノ酸残基のタンパク質をコードするが、２１残基がシグナル配列であり、除去された後に６０－７０ｋＤａの糖タンパク質として分泌される。ＴＰＯ受容体であるｃ－ｍｐｌと結合し、細胞内へシグナルが伝達されることで、造血幹細胞の増殖、巨核球の成熟・増殖を刺激、血小板の形成促進等をする。本明細書においては受容体結合ドメインのみをもつＴＰＯの断片ペプチドもＴＰＯに含まれる。
ＳＣＦ遺伝子は２７３残基のタンパク質をコードするが、Ｎ端２５残基がシグナル配列であり、２６～２７３残基が糖修飾された膜タンパク型のＳＣＦとして分泌され、その細胞外ドメインがプロセシングにより、可溶型ＳＣＦとして遊離する。ＳＣＦは、ホモダイマーでｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）として知られる受容体（２分子）に結合し（ヘテロテトラマー化）、ＫＩＴ分子が自己リン酸化して細胞内へシグナルが伝達されることで、造血幹細胞の増殖および維持等を行う。本明細書においては、膜タンパク型、可溶型、リンカーで結合したそれらのホモダイマー、いずれもＳＣＦに含まれる。
ＴＰＯ遺伝子は３５３アミノ酸残基のタンパク質をコードするが、２１残基がシグナル配列であり、除去された後に６０－７０ｋＤａの糖タンパク質として分泌される。ＴＰＯ受容体であるｃ－ｍｐｌと結合し、細胞内へシグナルが伝達されることで、造血幹細胞の増殖、巨核球の成熟・増殖を刺激、血小板の形成促進等をする。本明細書においては受容体結合ドメインのみをもつＴＰＯの断片ペプチドもＴＰＯに含まれる。
ＳＣＦ遺伝子は２７３残基のタンパク質をコードするが、Ｎ端２５残基がシグナル配列であり、２６～２７３残基が糖修飾された膜タンパク型のＳＣＦとして分泌され、その細胞外ドメインがプロセシングにより、可溶型ＳＣＦとして遊離する。ＳＣＦは、ホモダイマーでｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）として知られる受容体（２分子）に結合し（ヘテロテトラマー化）、ＫＩＴ分子が自己リン酸化して細胞内へシグナルが伝達されることで、造血幹細胞の増殖および維持等を行う。本明細書においては、膜タンパク型、可溶型、リンカーで結合したそれらのホモダイマー、いずれもＳＣＦに含まれる。
【0088】
本発明の一実施態様では、上記各実施態様のサイトカインは、アクチンビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）又はそのサブユニットである。アクチンビンは、inhibin βＡ chain preproprotein（inhibin βＡ subunit precousorともいう）遺伝子産物からプロセシング酵素により切断されたそのＣ末端側ペプチドであるβＡサブユニットがＳＳ結合によりホモダイマー化したアクチンビンＡ；inhibin βＢ chain preproprotein（inhibin βＢ subunit precousorともいう）遺伝子産物からプロセッシング酵素により切断されたそのＣ末端側ペプチドであるβＢサブユニットがＳＳ結合によりホモダイマー化したアクチンビンＢ；βＡサブユニットとβＢサブユニットがＳＳ結合によりヘテロダイマー化したアクチンビンＡＢが存在する。本発明の一実施態様では、サイトカインは、変異を有しているためプロセシングを受けなくてもアクチンビンとして機能しうるinhibin β Ａ chain preproprotein遺伝子産物そのもの又はその断片（たとえば、配列番号５９、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）；あるいはβＡサブユニット（たとえば配列番号６９、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）であってよい。これらは細胞内で活性型のアクチンビンＡとなり機能しうる。アクチビンＡは、アクチビンＩ型受容体の２形態（ＲＩ－ＡおよびＲＩ－Ｂ）およびアクチビンＩＩ型受容体の２形態（ＲＩＩ－ＡおよびＲＩＩ－Ｂ）に特異的に結合して細胞内へシグナルが伝達されることで、ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）／ＥＳＣ（胚性幹細胞）を分化誘導する。
【0089】
本発明の一実施態様では、上記各実施態様のターゲット因子は抗原である。本発明の一実施態様では、ターゲット因子は抗原ペプチドである。本発明の一実施態様では、ターゲット因子は、ＨＥＲ２又はその断片（好ましくは、配列番号７７又は９７、又はこれらに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。抗原ペプチドのうち、ホモ若しくはヘテロのサブユニットの多量体を形成しうるものは、機能的である限り（即ち、所望の薬理活性を有しうる限り）、場合によりペプチドリンカー等を介して連結された、連続したアミノ酸配列のものであってもよい。
【0090】
本発明の一実施態様では、上記各実施態様のターゲット因子は、Ｌ－セレクチン及び／又はＣＸＣＬ１２である。本発明の一実施態様では、ターゲット因子が、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌともいう）（好ましくは、配列番号１１、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）又はＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１ともいう）（好ましくは、配列番号３、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。また、本発明の一実施態様では、第１のターゲット因子が、Ｌ－セレクチンであり、第２のターゲット因子が、ＣＸＣＬ１２であってもよい。Ｌ－セレクチンは造血幹細胞（ＣＤ３４陽性）上のＣＤ３４を認識し、ＣＸＣＬ１２はケモカイン (C-X-C motif) 受容体４を認識する。
【0091】
本発明の一実施態様では、上記各実施態様のターゲット因子はレシチン又はそのサブユニットである。本発明の一実施態様では、Burkholderia cenocepacia菌のレクチン（糖鎖結合タンパク質）Ｂｃ２Ｌｃである。本発明の一実施態様では、ターゲット因子は、Ｂｃ２Ｌｃ遺伝子産物又はリンカーを介して結合したその多量体（たとえば配列番号４３、４７、５１；又はこれらに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの；あるいはこれらの多量体）であってもよい。Ｂｃ２Ｌｃは多量体でｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）／ＥＳＣ（胚性幹細胞）細胞表面の糖鎖修飾タンパク質(たとえばFucα１－2Galβ1－3GalNAcのついたポドカリキシン)を認識する。
【0092】
本発明の一実施態様では、細胞外小胞が、エクソソームである。
【0093】
本明細書中に記載の細胞外小胞は、その膜内又は膜中に、治療上有益でありうる物質（例えば、低分子化合物、核酸等）が包含されていてもよいし、結合されていてもよい。細胞外小胞の膜内に該物質を封入する方法は、これらに限定されるものではないが、例えば、該物質と本明細書中に記載の細胞外小胞とを好適な溶媒中で混合する方法等が挙げられる。
本発明の一実施態様では、細胞外小胞は、任意のタンパク製剤を含んでもよい。タンパク製剤としては、特に限定しないが、エリスロポエチンなどの天然にも存在しうるタンパク質でも、イムノグロブリン－ＣＴＬＡ４融合タンパクのように天然には存在しない合成タンパク質であってもよく、モノクローナル抗体またはその活性断片でもよい。これらのタンパク製剤は、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとの融合タンパク質として細胞外小胞の表面に局在させてもよい。かかる細胞外小胞は、融合タンパク質を発現させるためのベクターを細胞外小胞を産生する細胞にトランスフェクションし、その細胞から細胞外小胞を分泌させることにより得られる。
本発明の一実施態様では、細胞外小胞は、任意のタンパク製剤を含んでもよい。タンパク製剤としては、特に限定しないが、エリスロポエチンなどの天然にも存在しうるタンパク質でも、イムノグロブリン－ＣＴＬＡ４融合タンパクのように天然には存在しない合成タンパク質であってもよく、モノクローナル抗体またはその活性断片でもよい。これらのタンパク製剤は、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとの融合タンパク質として細胞外小胞の表面に局在させてもよい。かかる細胞外小胞は、融合タンパク質を発現させるためのベクターを細胞外小胞を産生する細胞にトランスフェクションし、その細胞から細胞外小胞を分泌させることにより得られる。
【0094】
本明細書中に記載の細胞外小胞の膜に含まれる各融合タンパク質又はタンパク質複合体あるいはタンパク製剤は、１つ又は複数の検出可能な標識を含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質又はタンパク質複合体あるいはタンパク製剤は、従来の方法で、特定のリポータ分子、発蛍光団、放射性材料、又は酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ）等で標識されていてもよい。これらは、例えば、融合タンパク質又はタンパク質複合体あるいはタンパク製剤の構成要素として、該融合タンパク質又はタンパク質複合体あるいはタンパク製剤のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていてもよい。
【0095】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の細胞外小胞の膜に含まれる（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）における各タンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の一実施態様では、
（ａ） すくなくとも１種のサイトカイン又はそのサブユニットを含む、サイトカインを細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ａ）をコードする配列；
（ｂ） すくなくとも１種のターゲット因子又はそのサブユニットを含む、ターゲット因子を細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｂ）をコードする配列；
（ｃ） すくなくとも１種のサイトカイン又はそのサブユニットと、すくなくとも１種のターゲット因子またはそのサブユニットを含み、該サイトカインと該ターゲット因子を細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｃ）をコードする配列；
からなる群から選択されるすくなくとも１つの配列を含むポリヌクレオチド
を提供する。
上記配列は（ａ）～（ｃ）は本願明細書に具体的記載された配列及び相同性の高い配列（好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性）を含むが、特に限定しない。同等の機能を有するものであればパラログ（遺伝子重複によって生じた遺伝子配列）やオーソログ（異なる生物に存在する相同な機能を持った遺伝子群）であってもよく、配列情報の改変（不可、欠失、置換など）された配列も含むものとする。
本発明の一実施態様では、
（ａ） すくなくとも１種のサイトカイン又はそのサブユニットを含む、サイトカインを細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ａ）をコードする配列；
（ｂ） すくなくとも１種のターゲット因子又はそのサブユニットを含む、ターゲット因子を細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｂ）をコードする配列；
（ｃ） すくなくとも１種のサイトカイン又はそのサブユニットと、すくなくとも１種のターゲット因子またはそのサブユニットを含み、該サイトカインと該ターゲット因子を細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｃ）をコードする配列；
からなる群から選択されるすくなくとも１つの配列を含むポリヌクレオチド
を提供する。
上記配列は（ａ）～（ｃ）は本願明細書に具体的記載された配列及び相同性の高い配列（好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性）を含むが、特に限定しない。同等の機能を有するものであればパラログ（遺伝子重複によって生じた遺伝子配列）やオーソログ（異なる生物に存在する相同な機能を持った遺伝子群）であってもよく、配列情報の改変（不可、欠失、置換など）された配列も含むものとする。
【0096】
上述した（Ａ）～（Ｃ）における各タンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドは、当業者であれば、上記融合タンパク質又はタンパク質複合体のアミノ酸配列を参考に適宜決定しうる。なお、（Ａ）～（Ｃ）における各融合タンパク質又はタンパク質複合体のアミノ酸配列は、各融合タンパク質又はタンパク質複合体における各構成要素（例えば、（Ａ）の場合であれば、（Ａ－１）～（Ａ－５）又は（Ａ－３）～（Ａ－５）、場合により（Ａ－６））のアミノ酸配列を参考に適宜決定しうる。ポリヌクレオチドを決定する際に使用されるコドンの種類は、任意のものを選択することができる。例えば、該ポリヌクレオチドを含むベクターを使用して形質転換させる細胞のコドンの頻度等を考慮して、ポリヌクレオチドを決定してもよい。
【0097】
上述した（Ａ）～（Ｃ）における各タンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドのＮ末端側には、必要に応じてシグナルペプチド（シグナルシークエンス）をコードするポリヌクレオチドを付加してもよい。
【0098】
シグナルペプチドのアミノ酸配列は、任意のものを使用することができ、例えば、発現させようとする融合タンパク質のアミノ酸配列等を考慮して決定してもよい。シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、ＣＤ８のシグナルペプチド（例えば、配列番号１、１７、４１）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２、１８、４２）、ＭＥＧ－Ｅ８のシグナルペプチド（例えば、配列番号２７）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２８）等が挙げられる。
【0099】
上述した（Ａ）～（Ｃ）における各タンパク質（又は融合タンパク質）の各構成要素（例えば、（Ａ）の場合であれば、（Ａ－１）～（Ａ－５）又は（Ａ－３）～（Ａ－５）、場合により（Ａ－６））、及びシグナルペプチド等のアミノ酸配列、並びにこれらをコードするポリヌクレオチドの情報は、例えば、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手してもよい。また、テトラスパニンの部分配列におけるアミノ酸配列及びこれをコードするポリヌクレオチドは、国際公開第２０１６／１３９３５４号を参考にしてもよい。
【0100】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載のポリヌクレオチドから選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0101】
本明細書中で用いられる「ベクター」とは、任意のベクター（これらに限定されるものではないが、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、人工染色体ベクター等を含む）を意味する。ベクターは、発現ベクター、クローニングベクター等を含む。発現ベクターは、一般的に、所望のコード配列、及び宿主生物（例えば、植物、昆虫、動物等）又はインビトロでの発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なポリヌクレオチドを含有していてもよい。クローニングベクターは、所望のポリヌクレオチド断片を操作及び／又は増幅させるために使用してもよい。クローニングベクターは、所望のポリヌクレオチド断片の発現に必要とされる機能的な配列を欠失していてもよい。
【0102】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、これらが作動可能に挿入されうる限り、全て同一のベクター内に挿入されていてもよし、２以上のポリヌクレオチドが別個のベクターに挿入されていてもよい。本発明の一実施態様では、本明細書中に記載のポリヌクレオチドから選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含んでなる２種以上のベクターを組み合わせたキットを提供する。
【0103】
形質転換細胞
本発明の一実施態様では、以下：
（ｉ）本明細書中に記載のすくなくとも１つの（Ａ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉ）本明細書中に記載のすくなくとも１つの（Ｂ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、及び／又は
（ｉｉｉ）本明細書中に記載のすくなくとも１つの（Ｃ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞を提供する。
本発明の一実施態様では、以下：
（ｉ）本明細書中に記載のすくなくとも１つの（Ａ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉ）本明細書中に記載のすくなくとも１つの（Ｂ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、及び／又は
（ｉｉｉ）本明細書中に記載のすくなくとも１つの（Ｃ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞を提供する。
【0104】
本発明の一実施態様では、以下：
（ｉ） 本明細書中に記載のすくなくとも１つの（ａ）のポリヌクレオチド、
（ｉｉ） 本明細書中に記載のすくなくとも１つの（ｂ）のポリヌクレオチド、及び／又は
（ｉｉｉ）本明細書中に記載のすくなくとも１つの（ｃ）のポリヌクレオチド
を含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞を提供する。
（ｉ） 本明細書中に記載のすくなくとも１つの（ａ）のポリヌクレオチド、
（ｉｉ） 本明細書中に記載のすくなくとも１つの（ｂ）のポリヌクレオチド、及び／又は
（ｉｉｉ）本明細書中に記載のすくなくとも１つの（ｃ）のポリヌクレオチド
を含む、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞を提供する。
【0105】
「単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された」とは、例えば、細胞が、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドが全て同一のベクター内に挿入されたものにより形質転換されてもよいし、これらのうち２以上が別個のベクターに挿入された２以上のベクターの組み合わせにより形質転換されてもよいことを意味する。
【0106】
形質転換させる細胞は、形質転換させた後に本明細書中に記載の細胞外小胞を得ることができるものである限り特段限定されるものではなく、初代培養細胞であっても、継代細胞であっても、株化細胞であってもよく、これらは正常細胞であっても、がん化又は腫瘍化した細胞を含む病変細胞であってもよい。また、形質転換させる細胞の由来は、特段限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等の哺乳動物等の動物由来の細胞；植物由来の細胞；昆虫由来の細胞等が挙げられる。形質転換させる細胞としては、好ましくは動物由来の細胞である。動物由来の細胞としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等を含む）、ヒトＦＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ－７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３等が挙げられる。
【0107】
細胞を形質転換させる方法は、細胞に目的のポリヌクレオチドを導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法、リポソームを使用する方法、ポリエチレンイミン等の非リポソーム性のものを使用する方法、ウイルス感染法等であってもよい。
【0108】
形質転換された細胞は、（Ａ）、（Ｂ）及び／又は（Ｃ）のタンパク質（又は融合タンパク質）を、一過性に発現する形質転換細胞であってもよいし、安定的に発現する形質転換細胞（安定細胞株）であってもよい。
【0109】
形質転換された細胞の培養条件は、特段限定されるものではない。例えば、形質転換された細胞が動物由来の細胞である場合、例えば、細胞培養等に一般に使用されている培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、Ｈａｍ Ｆ１２培地、又はこれらの任意の組み合わせ等）、又はこれにウシ胎児血清、抗生物質、アミノ酸等の他の成分を添加した培地等を使用し、例えば、約１～約１０％（好ましくは約２～約５％）ＣＯ２の存在下、約３０～約４０℃（好ましくは約３７℃）で、所望の時間（例えば、約０．５時間～約２４０時間（好ましくは、約５～約１２０時間、より好ましくは、約１２～約７２時間））、培養（例えば、静置下又は振盪下）してもよい。
【0110】
形質転換された細胞を培養して得られてなる培養上清中には、本明細書中に記載の細胞外小胞が含まれうる。そのため、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を得る目的で形質転換細胞を培養する際、必要に応じて、エクソソーム等の細胞外小胞を除去した培地（例えば、エクソソームを除去した約１～約５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地等）を用いてもよい。
【0111】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の形質転換された細胞を培養して得られてなる、培養上清を提供する。
【0112】
本明細書中に記載の培養上清中に含まれる細胞外小胞は、例えば、該培養上清を精製（例えば、遠心分離、クロマトグラフィー等）、濃縮、単離等をすることにより、回収することができる。
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の培養上清から得られる、細胞外小胞を提供する。
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の培養上清から得られる、細胞外小胞を提供する。
【0113】
本明細書中に記載の細胞外小胞は、これらに限定されるものではないが、例えば、当業者に公知の遺伝子組み換え技術等の手段により（例えば、以下に記載の方法により、若しくは実施例に記載の方法により、又はこれらに類似する方法により、得てもよい。
通常の遺伝子組み換え技術により、上記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をそれぞれコードするポリヌクレオチド（あるいは上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチド）を得、これらを同一の又は別個のベクターに作動可能に挿入することができる。２種以上のポリヌクレオチドを同一のベクターに挿入する場合、それぞれが同一の又は別個のプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。
得られた単一の又は２以上のベクターを、細胞に同時に又は逐次的に形質転換させ、形質転換細胞（これら融合タンパク質を、一過性に発現する形質転換細胞であってもよいし、安定的に発現する形質転換細胞（安定株）であってもよい）を得ることができる。得られた形質転換細胞を所望の条件下で培養して培養上清を得、得られた培養上清を必要に応じて精製（例えば、遠心分離、抗体（例えば、細胞外小胞の膜に含まれるタンパク質等を認識する抗体）、クロマトグラフィー、フローサイトメトリー等を用いた精製）、濃縮（例えば、限外濾過等）、乾燥等することで、本明細書中に記載の細胞外小胞を得ることができる。
通常の遺伝子組み換え技術により、上記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をそれぞれコードするポリヌクレオチド（あるいは上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチド）を得、これらを同一の又は別個のベクターに作動可能に挿入することができる。２種以上のポリヌクレオチドを同一のベクターに挿入する場合、それぞれが同一の又は別個のプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。
得られた単一の又は２以上のベクターを、細胞に同時に又は逐次的に形質転換させ、形質転換細胞（これら融合タンパク質を、一過性に発現する形質転換細胞であってもよいし、安定的に発現する形質転換細胞（安定株）であってもよい）を得ることができる。得られた形質転換細胞を所望の条件下で培養して培養上清を得、得られた培養上清を必要に応じて精製（例えば、遠心分離、抗体（例えば、細胞外小胞の膜に含まれるタンパク質等を認識する抗体）、クロマトグラフィー、フローサイトメトリー等を用いた精製）、濃縮（例えば、限外濾過等）、乾燥等することで、本明細書中に記載の細胞外小胞を得ることができる。
【0114】
本明細書中に記載の細胞外小胞は、例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング等の手法により、（Ａ）及び/又は（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｃ））が膜に含まれていることを確認してもよい。
【0115】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を製造するための方法であって、本明細書中に記載の形質転換された細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することを含む、方法を提供する。
【0116】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の細胞外小胞を製造するための方法であって、
（ｉ）本明細書中に記載の（Ａ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（あるいは（ａ）のポリヌクレオチド）、
（ｉｉ）本明細書中に記載の（Ｂ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（あるいは（ｂ）のポリヌクレオチド）、及び／又は
（ｉｉｉ）本明細書中に記載の（Ｃ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（あるいは（ｃ）のポリヌクレオチド）、
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させることと、
得られた形質転換細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することと
を含む、方法を提供する。
（ｉ）本明細書中に記載の（Ａ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（あるいは（ａ）のポリヌクレオチド）、
（ｉｉ）本明細書中に記載の（Ｂ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（あるいは（ｂ）のポリヌクレオチド）、及び／又は
（ｉｉｉ）本明細書中に記載の（Ｃ）のタンパク質（又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（あるいは（ｃ）のポリヌクレオチド）、
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させることと、
得られた形質転換細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することと
を含む、方法を提供する。
【0117】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞、又は本明細書中に記載の培養上清を含む医薬及び試薬を提供する。
【0118】
本明細書中に記載の組成物（例えば、医薬用や試薬用）は、これらに限定されるものではないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、界面活性剤等の添加剤を含むことができる。これら添加剤の種類、その使用量等は、目的に応じて当業者が適宜選択しうる。医薬組成物として用いる場合、これらの添加剤は薬理学的に許容できる担体であることが好ましい。さらに、本明細書中に記載の組成物がポリヌクレオチドを含む場合、必須ではないが、核酸のＤＤ（ドラッグデリバリー）に適した担体を含むことが好ましく、これらの担体として脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及びポリマー（たとえばＰＥＩ）が挙げられる。
【0119】
本明細書中に記載の組成物（例えば、医薬用や試薬用）は、上述した添加剤と共に、自体公知の方法により、例えば、錠剤、被覆錠剤、口腔内崩壊錠、チュアブル剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、液剤（例えば、シロップ剤、注射剤、ローション剤等を含む）、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、吸入剤、坐剤等に製剤化することができる。これらは、経口剤であってもよいし、非経口剤であってもよい。製剤化されたものは、その目的に応じて、有益な他の成分（例えば、治療上有益な他の成分）を更に含んでいてもよい。
【0120】
本発明の一実施態様である組成物は、実施例３が示すように、ターゲット因子として抗原を用いた場合、その抗原を認識する遺伝子改変Ｔ細胞、たとえば、その抗原を認識して結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を強制発現させたＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）；その抗原を認識して結合する領域（たとえば、ＶＨおよびＶＬを含む単鎖可変領域ｓｃＦｖ（single chain Fv）や重鎖のみから成る免疫グロブリン（抗体）の可変領域を含むナノボディのような抗体の標的抗原認識部分）とリンパ球活性化分子（たとえば、ＣＤ２８の細胞内ドメインやｍＣＤ３ｚの細胞内ドメイン）を含む融合蛋白(Chimeric antigen receptor：ＣＡＲ）を強制発現させたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）等を特異的に増殖可能である。従って、本発明の一実施態様である医薬組成物の対象への投与によって、ＴＣＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ―Ｔ細胞を投与された対象の体内において、ＴＣＲ－Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記抗原が反応し、好ましくは更にＴＣＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴ細胞刺激性サイトカイン受容体と細胞外小胞の膜外に提示された前記Ｔ細胞刺激性サイトカインが反応することにより、ＴＣＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞が対象内で活性化及び／又は増殖する。活性化及び／又は増殖したＴＣＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞がその抗原又はその断片を表面に発現するがん細胞を攻撃することにより、がん細胞の増殖を抑制してがんを治療する。
【0121】
がんとしては、何れの固形がん及び血液がんが含まれ、これらに限定されるものではないが、例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、小腸がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、骨髄がん、腎臓がん（腎細胞がん等を含む）、副甲状腺がん、副腎がん、尿管がん、肝がん、胆管がん、子宮頸がん、卵巣がん（例えば、その組織型が、漿液性腺がん、粘液性腺がん、明細胞腺がん等）、精巣がん、膀胱がん、外陰部がん、陰茎がん、甲状腺がん、頭頸部がん、頭蓋咽頭がん、咽頭がん、舌がん、皮膚がん、メルケル細胞がん、黒色腫（悪性黒色腫等）、上皮がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、小児がん、原発不明がん、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原生肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、脳腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、骨髄芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、脊椎腫瘍、悪性リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫等）、慢性又は急性リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病等が挙げられる。
【0122】
また、本発明の一実施態様である組成物は、実施例１が示すように、in vitro又はin vivoで、内在する又は外部から移植された造血幹細胞の活性／増殖が可能である。従って、再生不良性貧血やがん放射線治療後においての血球細胞減少に対する、造血幹細胞の回復治療に用いることができる。
再生不良性貧血では赤血球、好中球、血小板が減少することによって、さまざまな症状が現れる。健常な造血幹細胞を移植して、患者の造血力を再生することにより再生不良性貧血を治療又は予防する。
造血幹細胞移植は、通常の化学療法や免疫抑制療法だけでは治すことが難しい血液がんや免疫不全症などに対して、完治させることを目的としても行われる。造血幹細胞移植では、大量の化学療法や全身への放射線治療などからなる移植前処置のあとに、自分またはドナーから事前に採取した造血幹細胞を点滴で投与する。血液やリンパのがんなど化学療法や放射線治療が効きやすいがんが治療に好適である。移植前処置の目的は、腫瘍細胞を減少させ、患者自身の免疫細胞を抑制することである。これによって、移植された造血幹細胞が患者の骨髄に根づき（生着する）、正常な造血機能が回復する。また、ドナーから提供された造血幹細胞を移植する同種造血幹細胞移植（同種移植）の場合は、ドナーのリンパ球が患者の腫瘍細胞を攻撃する移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）も期待できる。
再生不良性貧血では赤血球、好中球、血小板が減少することによって、さまざまな症状が現れる。健常な造血幹細胞を移植して、患者の造血力を再生することにより再生不良性貧血を治療又は予防する。
造血幹細胞移植は、通常の化学療法や免疫抑制療法だけでは治すことが難しい血液がんや免疫不全症などに対して、完治させることを目的としても行われる。造血幹細胞移植では、大量の化学療法や全身への放射線治療などからなる移植前処置のあとに、自分またはドナーから事前に採取した造血幹細胞を点滴で投与する。血液やリンパのがんなど化学療法や放射線治療が効きやすいがんが治療に好適である。移植前処置の目的は、腫瘍細胞を減少させ、患者自身の免疫細胞を抑制することである。これによって、移植された造血幹細胞が患者の骨髄に根づき（生着する）、正常な造血機能が回復する。また、ドナーから提供された造血幹細胞を移植する同種造血幹細胞移植（同種移植）の場合は、ドナーのリンパ球が患者の腫瘍細胞を攻撃する移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）も期待できる。
【0123】
また、本発明の一実施態様である組成物は、実施例２が示すように、in vitro又はin vivoで、ｉＰＳ細胞／胚性幹細胞の分化誘導が可能である。
【0124】
上述した各種疾患を処置又は予防する対象となる被験体は、これらに限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類；等の哺乳動物等の動物、或いは植物が挙げられるが、好ましくは動物であり、より好ましくはげっ歯類又は霊長類であり、更に好ましくはマウス又はヒトである。
【0125】
本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物又はこれを製剤化したものの投与量は、投与する被験体の性別、年齢、体重、健康状態、病状の程度若しくは食事；投与時間；投与方法；他の薬物との組み合わせ；その他の要因を考慮して適宜決定することができる。
【実施例0126】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【0127】
実施例１．造血幹細胞への影響
１．１．プラスミドの調製
ＣＤ８Ａのシグナルペプチド（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、ＣＸＣＬ１２の全長配列（配列番号３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）、シグナルペプチドを除いたＣＤ８Ａの全長配列（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）、ＣＤ８１の全長配列（配列番号７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Thermo Fisher Scientific社製）に挿入し、ＣＸＣＬ－１２を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
同様の方法で、Ｌ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎの全長配列（配列番号１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）、ＣＤ８１の全長配列（配列番号１３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号１５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Thermo Fisher Scientific社製）に、ＣＤ８Ａのシグナルペプチド（配列番号１７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）、Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ）の全長配列（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、シグナルペプチドを除いたＣＤ８Ａの全長配列（配列番号２１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２２）、ＣＤ８１の全長配列（配列番号２３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号２５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｚｅｏ （＋） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Thermo Fisher Scientific社製）に、ＭＦＧ－Ｅ８のシグナルペプチド（配列番号２７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）の全長配列（配列番号２９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）、ペプチドリンカー１（配列番号３１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３２）、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）の全長配列（配列番号３３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３４）、ペプチドリンカー２（配列番号３５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３６）、ＭＦＧ－Ｅ８の４８番目のＤをＥに変更したシグナルペプチドを除いた全長配列（配列番号３７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３８）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号３９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Thermo Fisher Scientific社製）にそれぞれ挿入し、Ｌ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＴＰＯ、ＳＣＦを細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
構築した各ベクターはＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に形質転換した。形質転換した大腸菌に関してＬＢ培地を用いて増幅し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてベクターの大量調製を行った。
用いた配列情報を以下の表１～３に示す。
１．１．プラスミドの調製
ＣＤ８Ａのシグナルペプチド（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、ＣＸＣＬ１２の全長配列（配列番号３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）、シグナルペプチドを除いたＣＤ８Ａの全長配列（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）、ＣＤ８１の全長配列（配列番号７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Thermo Fisher Scientific社製）に挿入し、ＣＸＣＬ－１２を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
同様の方法で、Ｌ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎの全長配列（配列番号１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）、ＣＤ８１の全長配列（配列番号１３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号１５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Thermo Fisher Scientific社製）に、ＣＤ８Ａのシグナルペプチド（配列番号１７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）、Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ）の全長配列（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、シグナルペプチドを除いたＣＤ８Ａの全長配列（配列番号２１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２２）、ＣＤ８１の全長配列（配列番号２３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号２５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｚｅｏ （＋） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Thermo Fisher Scientific社製）に、ＭＦＧ－Ｅ８のシグナルペプチド（配列番号２７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）の全長配列（配列番号２９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）、ペプチドリンカー１（配列番号３１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３２）、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）の全長配列（配列番号３３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３４）、ペプチドリンカー２（配列番号３５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３６）、ＭＦＧ－Ｅ８の４８番目のＤをＥに変更したシグナルペプチドを除いた全長配列（配列番号３７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３８）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号３９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Thermo Fisher Scientific社製）にそれぞれ挿入し、Ｌ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＴＰＯ、ＳＣＦを細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
構築した各ベクターはＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に形質転換した。形質転換した大腸菌に関してＬＢ培地を用いて増幅し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてベクターの大量調製を行った。
用いた配列情報を以下の表１～３に示す。
【0128】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【0129】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0130】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【0131】
１．２．細胞外小胞の調製
１．２．１．ＨＥＫ２９３細胞由来細胞外小胞の取得及び細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク製）は１０％ＦＢＳ含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて前培養を行った。１×１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるようにＨＥＫ２９３を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ベクター未導入群（サンプル１）、ＳＣＦ及びＴＰＯ発現ベクター導入群（サンプル２）、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＬ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ発現ベクター導入群（サンプル３）、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＣＸＣＬ１２発現ベクター導入群（サンプル４）を５μｇずつ導入し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２４時間培養した。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した各１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ， ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ， Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）を１０ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４８時間培養した。４８時間後、培養上清を回収した。回収した培養上清は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０（１００ｋ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）を用いて濃縮し、濃縮した溶液を用いてＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色時間は１次抗体、２次抗体共に６０分間、４℃で反応させた。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
１．２．１．ＨＥＫ２９３細胞由来細胞外小胞の取得及び細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク製）は１０％ＦＢＳ含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて前培養を行った。１×１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるようにＨＥＫ２９３を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ベクター未導入群（サンプル１）、ＳＣＦ及びＴＰＯ発現ベクター導入群（サンプル２）、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＬ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ発現ベクター導入群（サンプル３）、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＣＸＣＬ１２発現ベクター導入群（サンプル４）を５μｇずつ導入し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２４時間培養した。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した各１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ， ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ， Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）を１０ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４８時間培養した。４８時間後、培養上清を回収した。回収した培養上清は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０（１００ｋ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）を用いて濃縮し、濃縮した溶液を用いてＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色時間は１次抗体、２次抗体共に６０分間、４℃で反応させた。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
【0132】
【表4】
【0133】
結果を図１に示す。ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＬ―ＳｅｌｅｃｔｉｎもしくはＣＸＣＬ１２の３つのベクターを発現させた細胞外小胞において、各分子の発現が認められた。
【0134】
１．２．２．ＨＥＫ２９３細胞由来細胞外小胞の取得並びにＳＣＦ及びＴＰＯ定量評価
ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク製）は１０％ＦＢＳ含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて前培養を行った。１×１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるようにＨＥＫ２９３を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ベクター未導入群（サンプル１）、ＳＣＦ及びＴＰＯ発現ベクター導入群（サンプル２）、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＬ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ発現ベクター導入群（サンプル３）、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＣＸＣＬ１２発現ベクター導入群（サンプル４）を５μｇずつ導入し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２４時間培養した。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳで洗浄した各１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ， Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）を１０ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４８時間培養した。４８時間後、培養上清を回収した。回収した培養上清は２０００ｘｇで１０分間遠心し上清を回収後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を通過させた。処理を行った培養上清をＵＣチューブ（ベックマン・コールター社製）に添加し、ＳＷ４１Ｔｉ（ベックマン・コールター社製）にセットし、Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ（ベックマン・コールター社製）を用いて３５０００ｒｐｍ、４℃の条件で７０分間遠心した。遠心後、上清を除去し、ＵＣチューブにＤ－ＰＢＳを１０ｍＬ添加し、３５０００ｒｐｍ、４℃の条件で７０分間遠心した。遠心後、上清を除去し、５０μＬのＤ－ＰＢＳに懸濁した。
細胞外小胞上に発現したＳＣＦ及びＴＰＯを定量するために、Ｈｕｍａｎ ＳＣＦ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社製）及びＨｕｍａｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社製）を用いた。それぞれ用いるプレートに１０倍希釈した細胞外小胞溶液もしくは段階希釈した検量線溶液を５０μＬ添加した。そこへＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＣＰＩもしくはＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ ５ＢＩで終濃度が１×Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙと１×Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙとなるように調製したＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌを５０μＬ添加し、１時間室温下で振とうした。１時間後に、溶液を捨て３５０ｕＬの１×Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＴで３回洗浄を行った。続いて、１００μＬのＴＭＢ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ室温で１０分間振とうした。最後に、１００μＬのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。各検量線の吸光度からサンプル１からサンプル４に含まれるＳＣＦ及びＴＰＯ濃度を算出した。
ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク製）は１０％ＦＢＳ含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて前培養を行った。１×１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるようにＨＥＫ２９３を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ベクター未導入群（サンプル１）、ＳＣＦ及びＴＰＯ発現ベクター導入群（サンプル２）、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＬ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ発現ベクター導入群（サンプル３）、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＣＸＣＬ１２発現ベクター導入群（サンプル４）を５μｇずつ導入し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２４時間培養した。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳで洗浄した各１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ， Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）を１０ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４８時間培養した。４８時間後、培養上清を回収した。回収した培養上清は２０００ｘｇで１０分間遠心し上清を回収後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を通過させた。処理を行った培養上清をＵＣチューブ（ベックマン・コールター社製）に添加し、ＳＷ４１Ｔｉ（ベックマン・コールター社製）にセットし、Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ（ベックマン・コールター社製）を用いて３５０００ｒｐｍ、４℃の条件で７０分間遠心した。遠心後、上清を除去し、ＵＣチューブにＤ－ＰＢＳを１０ｍＬ添加し、３５０００ｒｐｍ、４℃の条件で７０分間遠心した。遠心後、上清を除去し、５０μＬのＤ－ＰＢＳに懸濁した。
細胞外小胞上に発現したＳＣＦ及びＴＰＯを定量するために、Ｈｕｍａｎ ＳＣＦ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社製）及びＨｕｍａｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社製）を用いた。それぞれ用いるプレートに１０倍希釈した細胞外小胞溶液もしくは段階希釈した検量線溶液を５０μＬ添加した。そこへＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＣＰＩもしくはＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ ５ＢＩで終濃度が１×Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙと１×Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙとなるように調製したＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌを５０μＬ添加し、１時間室温下で振とうした。１時間後に、溶液を捨て３５０ｕＬの１×Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＴで３回洗浄を行った。続いて、１００μＬのＴＭＢ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ室温で１０分間振とうした。最後に、１００μＬのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。各検量線の吸光度からサンプル１からサンプル４に含まれるＳＣＦ及びＴＰＯ濃度を算出した。
【0135】
その結果、サンプル２からサンプル４では表５に示すような発現量が認められた。一方、サンプル１ではいずれも定量下限値未満となった。
【表5】
【0136】
１．３．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果
１．３．１. ヒト骨髄ＣＤ３４陽性前駆細胞を用いた細胞増殖評価
ヒト骨髄ＣＤ３４陽性前駆細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を３７℃の湯浴で溶解させ、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０ｍＬに懸濁した。３００ｘｇで１０分間遠心後、上清を除き、培地で再懸濁し、５０００ｃｅｌｌｓ／８０ｕＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル透明平底未処理セルカルチャープレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種した。ＳＣＦ及びＴＰＯが終濃度でＳＣＦ：３ｐｇ／ｍＬ、ＴＰＯ：１．６３ｐｇ／ｍＬ（サンプル２）；ＳＣＦ：３ｐｇ／ｍＬ、ＴＰＯ：３．６９ｐｇ／ｍＬ（サンプル３）及びＳＣＦ：３ｐｇ／ｍＬ、ＴＰＯ：２．９２ｐｇ／ｍＬ（サンプル４）となるように上記１．２．２で調製した各細胞外小胞溶液を添加した。また、最も添加量が多かったサンプル２に合わせる形でサンプル１の添加を行った。さらに、サンプル２からサンプル４と同様の終濃度となるようにレコンビナントＳＣＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）及びレコンビナントＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）の処置も行った（サンプル５～７）。対照として、Ｄ―ＰＢＳ処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を置いた。いずれの群も最終的な容量は１００μＬとなるように培地及びＤ―ＰＢＳ溶液で調節した。処置を行ったプレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて９６時間培養した。９６時間後に１００ｕＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１０分間反応させたのち、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて発光度を測定することで各時点における細胞数を測定した。算出された発光度をもとに、controlに対する値を% of controlとして各群で求めた。
１．３．１. ヒト骨髄ＣＤ３４陽性前駆細胞を用いた細胞増殖評価
ヒト骨髄ＣＤ３４陽性前駆細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を３７℃の湯浴で溶解させ、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０ｍＬに懸濁した。３００ｘｇで１０分間遠心後、上清を除き、培地で再懸濁し、５０００ｃｅｌｌｓ／８０ｕＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル透明平底未処理セルカルチャープレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種した。ＳＣＦ及びＴＰＯが終濃度でＳＣＦ：３ｐｇ／ｍＬ、ＴＰＯ：１．６３ｐｇ／ｍＬ（サンプル２）；ＳＣＦ：３ｐｇ／ｍＬ、ＴＰＯ：３．６９ｐｇ／ｍＬ（サンプル３）及びＳＣＦ：３ｐｇ／ｍＬ、ＴＰＯ：２．９２ｐｇ／ｍＬ（サンプル４）となるように上記１．２．２で調製した各細胞外小胞溶液を添加した。また、最も添加量が多かったサンプル２に合わせる形でサンプル１の添加を行った。さらに、サンプル２からサンプル４と同様の終濃度となるようにレコンビナントＳＣＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）及びレコンビナントＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）の処置も行った（サンプル５～７）。対照として、Ｄ―ＰＢＳ処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を置いた。いずれの群も最終的な容量は１００μＬとなるように培地及びＤ―ＰＢＳ溶液で調節した。処置を行ったプレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて９６時間培養した。９６時間後に１００ｕＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１０分間反応させたのち、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて発光度を測定することで各時点における細胞数を測定した。算出された発光度をもとに、controlに対する値を% of controlとして各群で求めた。
【0137】
その結果、サンプル２、サンプル３及びサンプル４を処置した群においてcontrol、サンプル１及びサンプル５、サンプル６及びサンプル７と比較して発光度の増加が認められた（図２）。
【0138】
実施例２．ｉＰＳＣ分化誘導
２．１．プラスミドの調製
ＣＤ８のシグナルペプチド（配列番号４１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４２）、Ｂｃ２ｌ－Ｃのフラグメント１（配列番号４３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４４）、ペプチドリンカー（配列番号４５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４６）、Ｂｃ２ｌ－Ｃのフラグメント２（配列番号４７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４８）、ペプチドリンカー（配列番号４９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５０）、Ｂｃ２ｌ－Ｃのフラグメント３（配列番号５１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５２）、ＣＤ８の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン（配列番号５３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５４）、ＣＤ８１の全長配列（配列番号５５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５６）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号５７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５８）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に挿入し、Ｂｃ２ｌ－Ｃを細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
同様の方法で、Ｃ３５Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、Ｃ２４７Ｓの変異をさせたＭｕｔａｔｉｏｎ ＡｃｔｉｖｉｎＡの全長配列（配列番号５９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６０）、ペプチドリンカー（配列番号６１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６２）、シグナルペプチドを除いたＭＦＧＥ８の全長配列（配列番号６３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６４）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号６５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６６）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｚｅｏ（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に、ＭＦＧＥ８のシグナルペプチド（配列番号６７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６８）、Ｍａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａのうちアミノ酸 ３０６～４２６（配列番号６９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７０）、ペプチドリンカー（配列番号７１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７２）、シグナルペプチドを除いたＭＦＧＥ８の全長配列（配列番号７３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７４）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号７５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７６）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｚｅｏ（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にそれぞれ挿入し、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｎ ＡおよびＭａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａを細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。構築した各ベクターはＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に形質転換した。形質転換した大腸菌に関してＬＢ培地を用いて増幅し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてベクターの大量調製を行った。
用いた配列情報を以下の表６～８に示す。
２．１．プラスミドの調製
ＣＤ８のシグナルペプチド（配列番号４１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４２）、Ｂｃ２ｌ－Ｃのフラグメント１（配列番号４３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４４）、ペプチドリンカー（配列番号４５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４６）、Ｂｃ２ｌ－Ｃのフラグメント２（配列番号４７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４８）、ペプチドリンカー（配列番号４９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５０）、Ｂｃ２ｌ－Ｃのフラグメント３（配列番号５１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５２）、ＣＤ８の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン（配列番号５３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５４）、ＣＤ８１の全長配列（配列番号５５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５６）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号５７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５８）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に挿入し、Ｂｃ２ｌ－Ｃを細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
同様の方法で、Ｃ３５Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、Ｃ２４７Ｓの変異をさせたＭｕｔａｔｉｏｎ ＡｃｔｉｖｉｎＡの全長配列（配列番号５９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６０）、ペプチドリンカー（配列番号６１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６２）、シグナルペプチドを除いたＭＦＧＥ８の全長配列（配列番号６３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６４）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号６５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６６）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｚｅｏ（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に、ＭＦＧＥ８のシグナルペプチド（配列番号６７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６８）、Ｍａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａのうちアミノ酸 ３０６～４２６（配列番号６９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７０）、ペプチドリンカー（配列番号７１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７２）、シグナルペプチドを除いたＭＦＧＥ８の全長配列（配列番号７３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７４）から構成される人工合成した遺伝子配列（配列番号７５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７６）をｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｚｅｏ（＋）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にそれぞれ挿入し、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｎ ＡおよびＭａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａを細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。構築した各ベクターはＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に形質転換した。形質転換した大腸菌に関してＬＢ培地を用いて増幅し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてベクターの大量調製を行った。
用いた配列情報を以下の表６～８に示す。
【0139】
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表6-4】
【表6-5】
【0140】
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【表7-4】
【0141】
【表8-1】
【表8-2】
【表8-3】
【0142】
２．２．細胞外小胞の調製
２．２．１．ＨＥＫ２９３細胞由来細胞外小胞の取得及び細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク製）は１０％ＦＢＳ含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて前培養を行った。８×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるようにＨＥＫ２９３を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群、Ｍａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群を７．５μg、となるように導入し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２４時間培養した。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した各１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ， ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ， Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）を１０ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４８時間培養した。４８時間後、培養上清を回収した。回収した培養上清は、Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｘｉ）（タカラバイオ社製）を用いて細胞外小胞を精製し、得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５，ＰＬＧＣ Ｕｌｔｒａｃｅｌ，１０ｋＤａ（メルクミリポア社製）を用いて濃縮し、Ｄ－ＰＢＳ（－）に置換した。濃縮した溶液を用いてＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色には、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート抗ヒトＡｃｔｉｖｉｎ Ａ抗体（Ｂｉｏｓｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）を用い、室温にて６０分反応させた。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
２．２．１．ＨＥＫ２９３細胞由来細胞外小胞の取得及び細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク製）は１０％ＦＢＳ含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて前培養を行った。８×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるようにＨＥＫ２９３を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群、Ｍａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群を７．５μg、となるように導入し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２４時間培養した。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した各１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ， ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ， Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）を１０ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４８時間培養した。４８時間後、培養上清を回収した。回収した培養上清は、Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｘｉ）（タカラバイオ社製）を用いて細胞外小胞を精製し、得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５，ＰＬＧＣ Ｕｌｔｒａｃｅｌ，１０ｋＤａ（メルクミリポア社製）を用いて濃縮し、Ｄ－ＰＢＳ（－）に置換した。濃縮した溶液を用いてＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色には、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート抗ヒトＡｃｔｉｖｉｎ Ａ抗体（Ｂｉｏｓｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）を用い、室温にて６０分反応させた。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
【0143】
結果を図３に示す。２通りのベクターにてＡｃｔｉｖｉｎ Ａを発現させた細胞外小胞において、いずれもＡｃｔｉｖｉｎ Ａの発現が認められた。
【0144】
２．２．２．ＨＥＫ２９３細胞由来細胞外小胞の取得及びＡｃｔｉｖｉｎ Ａ定量評価
ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク製）は１０％ＦＢＳ含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて前培養を行った。８×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるようにＨＥＫ２９３を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群（実施例条件１）では７．５μg、Ｂｃ２ｌ－Ｃ及びＭｕｔａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群（実施例条件２）では各ベクター３．７５ｕｇ、Ｍａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群（実施例条件３）ではベクター７．５μgとなるように導入し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２４時間培養した。同様に操作したベクター未導入群を比較例とした。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳで洗浄した各１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ， ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ， Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）を１０ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４８時間培養した。４８時間後、培養上清を回収した。回収した培養上清は、Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｘｉ）（タカラバイオ社製）を用いて細胞外小胞を精製し、得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５，ＰＬＧＣ Ｕｌｔｒａｃｅｌ，１０ｋＤａ（メルクミリポア社製）を用いて濃縮し、Ｄ－ＰＢＳ（－）に置換した。細胞外小胞上に発現したＡｃｔｉｖｉｎ Ａを定量するために、濃縮した溶液をＨｕｍａｎ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ＥＬＩＳＡ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）にて測定した。また、同溶液中に含まれる細胞外小胞の粒子数および平均粒子径をナノ粒子トラッキング解析装置ＺｅｔａＶｉｅｗ（ＤＫＳＨジャパン社製）にて測定した。
ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク製）は１０％ＦＢＳ含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて前培養を行った。８×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるようにＨＥＫ２９３を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群（実施例条件１）では７．５μg、Ｂｃ２ｌ－Ｃ及びＭｕｔａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群（実施例条件２）では各ベクター３．７５ｕｇ、Ｍａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現ベクター導入群（実施例条件３）ではベクター７．５μgとなるように導入し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２４時間培養した。同様に操作したベクター未導入群を比較例とした。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳで洗浄した各１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ， ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ， Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有Ｅ－ＭＥＭ培地（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）を１０ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４８時間培養した。４８時間後、培養上清を回収した。回収した培養上清は、Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｘｉ）（タカラバイオ社製）を用いて細胞外小胞を精製し、得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５，ＰＬＧＣ Ｕｌｔｒａｃｅｌ，１０ｋＤａ（メルクミリポア社製）を用いて濃縮し、Ｄ－ＰＢＳ（－）に置換した。細胞外小胞上に発現したＡｃｔｉｖｉｎ Ａを定量するために、濃縮した溶液をＨｕｍａｎ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ＥＬＩＳＡ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）にて測定した。また、同溶液中に含まれる細胞外小胞の粒子数および平均粒子径をナノ粒子トラッキング解析装置ＺｅｔａＶｉｅｗ（ＤＫＳＨジャパン社製）にて測定した。
【0145】
その結果、いずれのサンプルにおいても平均粒子径が５０～１５０ｎｍの細胞外小胞が得られた。Ａｃｔｉｖｉｎ Ａの定量結果はサンプル２からサンプル５では表に示すような発現量が認められた一方で、サンプル１ではいずれも定量下限値未満となったことから、ベクターの導入により、細胞外小胞にＡｃｔｉｖｉｎＡを発現させることができたことが明らかとなった。
【0146】
【表9】
【0147】
２．３．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果
２．３．１．ＨＥＫ２９３細胞由来Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を用いたｉＰＳＣ分化誘導実験
上記で得られたＡｃｔｉｖｉｎ Ａを発現させた細胞外小胞がヒトｉＰＳＣを分化誘導できるか検証した。ヒトｉＰＳＣ（ＲＰＣｈｉＰＳ７７１株、リプロセル社製）をｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ（マトリクソーム社製）を０．５μｇ／ｃｍ２となるようにコーティングした６ウェルプレートにてＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素ヘルシーサプライ社製）にて培養した。得られた細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えて３７℃で１０分間インキュベートし、シングルセルにて剥離した。得られた細胞を１０μＭ Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地に懸濁し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１を０．５μｇ／ｃｍ２となるようにコーティングした２４ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。（Ｄａｙ－１）。播種翌日、細胞が接着していることを確認し、分化培地に培地を交換し分化を開始した（Ｄａｙ０）。分化培地には、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＤＳファーマバイオメディカル社製)、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（×１００)（富士フイルム和光純薬社製）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、２％Ｂ－２７サプリメントＸｅｎｏＦｒｅｅＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）（富士フイルム和光純薬社製）を用いた。この分化培地に実施例２．２．１．にて得られたＨＥＫ２９３由来Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。比較対象として、用いたＨＥＫ２９３由来Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞のＥＬＩＳＡ定量結果と同じ濃度になるように、リコンビナントＡｃｔｉｖｉｎ Ａタンパク質（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ社製）を加え、３日間培養した。
分化３日後に得られた細胞よりＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＲＮＡを回収し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ)（タカラバイオ社製）を用いて逆転写後、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒc Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子発現を解析した。遺伝子発現の解析には表１０のＴａｑＭａｎプローブ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、各遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量で補正した。その結果を表１１に示す。
２．３．１．ＨＥＫ２９３細胞由来Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を用いたｉＰＳＣ分化誘導実験
上記で得られたＡｃｔｉｖｉｎ Ａを発現させた細胞外小胞がヒトｉＰＳＣを分化誘導できるか検証した。ヒトｉＰＳＣ（ＲＰＣｈｉＰＳ７７１株、リプロセル社製）をｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ（マトリクソーム社製）を０．５μｇ／ｃｍ２となるようにコーティングした６ウェルプレートにてＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素ヘルシーサプライ社製）にて培養した。得られた細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えて３７℃で１０分間インキュベートし、シングルセルにて剥離した。得られた細胞を１０μＭ Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地に懸濁し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１を０．５μｇ／ｃｍ２となるようにコーティングした２４ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。（Ｄａｙ－１）。播種翌日、細胞が接着していることを確認し、分化培地に培地を交換し分化を開始した（Ｄａｙ０）。分化培地には、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＤＳファーマバイオメディカル社製)、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（×１００)（富士フイルム和光純薬社製）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、２％Ｂ－２７サプリメントＸｅｎｏＦｒｅｅＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）（富士フイルム和光純薬社製）を用いた。この分化培地に実施例２．２．１．にて得られたＨＥＫ２９３由来Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。比較対象として、用いたＨＥＫ２９３由来Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞のＥＬＩＳＡ定量結果と同じ濃度になるように、リコンビナントＡｃｔｉｖｉｎ Ａタンパク質（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ社製）を加え、３日間培養した。
分化３日後に得られた細胞よりＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＲＮＡを回収し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ)（タカラバイオ社製）を用いて逆転写後、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒc Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子発現を解析した。遺伝子発現の解析には表１０のＴａｑＭａｎプローブ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、各遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量で補正した。その結果を表１１に示す。
【0148】
【表10】
【0149】
【表11】
【0150】
その結果、同じ添加濃度となるようにリコンビナントタンパク質とＨＥＫ２９３由来Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を用いてｉＰＳＣの分化誘導をしたところ、細胞外小胞を用いた群において、中胚葉マーカーＴや内胚葉マーカーＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２の発現が顕著に増加することが明らかとなった。したがって、リコンビナントタンパク質と比べてＡｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞はより低濃度でｉＰＳＣの分化を誘導できることが示唆された。
【0151】
２．３．２．ＨＥＫ２９３細胞由来Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を用いたｉＰＳＣ分化誘導実験
上記の条件３と同様にして、ＨＥＫ２９３細胞にＭａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａベクターを導入して得られた細胞外小胞を得た。ｉＰＳＣの分化誘導において、この細胞外小胞の添加量と分化マーカーの発現について評価した。
ヒトｉＰＳＣ（ＲＰＣｈｉＰＳ７７１株、リプロセル社製）を上記と同様にしてシングルセルにて剥離した。得られた細胞を１０μＭ Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地に懸濁し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１を０．５μｇ／ｃｍ２となるようにコーティングした４８ウェルプレートに２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。（Ｄａｙ－１）。播種翌日、細胞が接着していることを確認し、分化培地に培地を交換し分化を開始した（Ｄａｙ０）。分化培地には、ＥＬＩＳＡにてＡｃｔｉｖｉｎＡ濃度を定量したＨＥＫ２９３由来Ｍａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を０．０５、０．１、０．２、０．５ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、３日間培養した。比較対象として、ＡｃｔｉｖｉｎＡリコンビナントタンパク質（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ社製）を０、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬになるように加え、比較対照群では毎日培地交換を実施した。上記と同様にして、分化３日後の遺伝子発現を評価した結果を図４に示す。
上記の条件３と同様にして、ＨＥＫ２９３細胞にＭａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａベクターを導入して得られた細胞外小胞を得た。ｉＰＳＣの分化誘導において、この細胞外小胞の添加量と分化マーカーの発現について評価した。
ヒトｉＰＳＣ（ＲＰＣｈｉＰＳ７７１株、リプロセル社製）を上記と同様にしてシングルセルにて剥離した。得られた細胞を１０μＭ Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地に懸濁し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１を０．５μｇ／ｃｍ２となるようにコーティングした４８ウェルプレートに２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で２４時間培養した。（Ｄａｙ－１）。播種翌日、細胞が接着していることを確認し、分化培地に培地を交換し分化を開始した（Ｄａｙ０）。分化培地には、ＥＬＩＳＡにてＡｃｔｉｖｉｎＡ濃度を定量したＨＥＫ２９３由来Ｍａｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ発現細胞外小胞を０．０５、０．１、０．２、０．５ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、３日間培養した。比較対象として、ＡｃｔｉｖｉｎＡリコンビナントタンパク質（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ社製）を０、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬになるように加え、比較対照群では毎日培地交換を実施した。上記と同様にして、分化３日後の遺伝子発現を評価した結果を図４に示す。
【0152】
その結果、リコンビナントタンパク質と比較して低濃度で中胚葉マーカーＴや内胚葉マーカーＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２の発現が増加することが明らかとなった。特に内胚葉マーカーＴについては、今回の細胞外小胞の添加濃度でリコンビナントタンパク質での発現量を大きく超えて高い発現が確認され、特に中胚葉への分化に有用である可能性が示唆された。また、リコンビナントタンパク質の場合は、３日間の分化期間において、培地交換を行い、都度リコンビナントタンパク質の添加が必要であるが、細胞外小胞の場合は、初日の添加のみで培地交換をせずにｉＰＳＣの分化誘導が可能であった。これらの点から、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａを発現させた細胞外小胞は、低濃度で安定的にｉＰＳＣの分化を誘導できることが示唆された。
【0153】
実施例３．ＣＡＲ－Ｔ細胞への影響
３．１． プラスミドの調製
３．１．０．ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－Ｖｅｎｕｓ
Ｈｅｒ２を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（配列番号１０５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０６）、２Ａペプチドの１つであるＰ２Ａ（配列番号１０７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０８）、Ｖｅｎｕｓ（配列番号１０９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１０）から構成される人工合成した遺伝子配列ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－Ｖｅｎｕｓ（配列番号１１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１２）をｐＭＸベクターに挿入し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するためのベクターを作製した。２Ａペプチド配列はリボソームスキッピングを起こすので、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－Ｖｅｎｕｓをコードする配列が実際に翻訳された場合、独立したＣＡＲを含むタンパク質と独立したＶｅｎｕｓを含むタンパク質が翻訳される。
３．１．１．Ｈｅｒ２－ＭＥＧＥ８
Ｈｅｒ２のシグナルペプチド（配列番号７９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８０）、Ｈｅｒ２（細胞外ドメイン）（配列番号７７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７８）、ペプチドリンカー（配列番号８１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８２）、及び、ＭＦＧ－Ｅ８（配列番号８３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８４）から構成される人工合成した遺伝子配列Ｈｅｒ２－ＭＦＧ－Ｅ８（配列番号８５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８６）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクター挿入し、Ｈｅｒ２を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
３．１．２．Ｈｅｒ２－ＭＥＧＥ８－ＩＬ－２及びＨｅｒ２－ＭＥＧＥ８－ＩＬ－７
上記で構成したＨｅｒ２－ＭＦＧ－Ｅ８に更にリンカー（配列番号８７）を介してＩＬ－２（配列番号８９）又はＩＬ－７（配列番号９３）をＣ端に融合させた遺伝子配列Ｈｅｒ２－ＭＥＧＥ８－ＩＬ－２（配列番号９１）又はＨｅｒ２－ＭＥＧＥ８－ＩＬ－７（配列番号９５）を各々コードするポリヌクレオチド（配列番号９２又は９６）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入し、Ｈｅｒ２及びＩＬ－２、又はＨｅｒ２及びＩＬ－７を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
２．１．３．Ｈｅｒ２－ＣＤ８１
Ｈｅｒ２（シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び一部の細胞内ドメインを含む）（配列番号９７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９８）、及び、ＣＤ８１（配列番号９９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１００）から構成される人工合成した遺伝子配列Ｈｅｒ２－ＣＤ８１（配列番号１０１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０２）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入し、Ｈｅｒ２を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
２．１．３．Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２
上記で構成したＨｅｒ２－ＣＤ８１の２ｎｄ ｌｏｏｐにリンカー８（配列番号８７）～シグナルペプチドを除いたＩＬ－２の配列～リンカー８（配列番号８７）からなる配列を導入して、Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２（配列番号１０３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９２又は９６）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入し、Ｈｅｒ２及びＩＬ－２を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
図５に各遺伝子構成の模式図を示し、表１２～１４にその配列情報を示す。
３．１． プラスミドの調製
３．１．０．ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－Ｖｅｎｕｓ
Ｈｅｒ２を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（配列番号１０５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０６）、２Ａペプチドの１つであるＰ２Ａ（配列番号１０７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０８）、Ｖｅｎｕｓ（配列番号１０９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１０）から構成される人工合成した遺伝子配列ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－Ｖｅｎｕｓ（配列番号１１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１２）をｐＭＸベクターに挿入し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するためのベクターを作製した。２Ａペプチド配列はリボソームスキッピングを起こすので、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－Ｖｅｎｕｓをコードする配列が実際に翻訳された場合、独立したＣＡＲを含むタンパク質と独立したＶｅｎｕｓを含むタンパク質が翻訳される。
３．１．１．Ｈｅｒ２－ＭＥＧＥ８
Ｈｅｒ２のシグナルペプチド（配列番号７９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８０）、Ｈｅｒ２（細胞外ドメイン）（配列番号７７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７８）、ペプチドリンカー（配列番号８１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８２）、及び、ＭＦＧ－Ｅ８（配列番号８３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８４）から構成される人工合成した遺伝子配列Ｈｅｒ２－ＭＦＧ－Ｅ８（配列番号８５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８６）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクター挿入し、Ｈｅｒ２を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
３．１．２．Ｈｅｒ２－ＭＥＧＥ８－ＩＬ－２及びＨｅｒ２－ＭＥＧＥ８－ＩＬ－７
上記で構成したＨｅｒ２－ＭＦＧ－Ｅ８に更にリンカー（配列番号８７）を介してＩＬ－２（配列番号８９）又はＩＬ－７（配列番号９３）をＣ端に融合させた遺伝子配列Ｈｅｒ２－ＭＥＧＥ８－ＩＬ－２（配列番号９１）又はＨｅｒ２－ＭＥＧＥ８－ＩＬ－７（配列番号９５）を各々コードするポリヌクレオチド（配列番号９２又は９６）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入し、Ｈｅｒ２及びＩＬ－２、又はＨｅｒ２及びＩＬ－７を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
２．１．３．Ｈｅｒ２－ＣＤ８１
Ｈｅｒ２（シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び一部の細胞内ドメインを含む）（配列番号９７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９８）、及び、ＣＤ８１（配列番号９９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１００）から構成される人工合成した遺伝子配列Ｈｅｒ２－ＣＤ８１（配列番号１０１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０２）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入し、Ｈｅｒ２を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
２．１．３．Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２
上記で構成したＨｅｒ２－ＣＤ８１の２ｎｄ ｌｏｏｐにリンカー８（配列番号８７）～シグナルペプチドを除いたＩＬ－２の配列～リンカー８（配列番号８７）からなる配列を導入して、Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２（配列番号１０３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９２又は９６）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入し、Ｈｅｒ２及びＩＬ－２を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
図５に各遺伝子構成の模式図を示し、表１２～１４にその配列情報を示す。
【0154】
【表12-1】
【表12-2】
【表12-3】
【表12-4】
【表12-5】
【表12-6】
【表12-7】
【表12-8】
【表12-9】
【表12-10】
【表12-11】
【表12-12】
【表12-13】
【表12-14】
【表12-15】
【表12-16】
【表12-17】
【0155】
【表13-1】
【表13-2】
【表13-3】
【表13-4】
【表13-5】
【表13-6】
【表13-7】
【表13-8】
【表13-9】
【表13-10】
【0156】
【表14-1】
【表14-2】
【表14-3】
【表14-4】
【表14-5】
【0157】
３．２． ＣＡＲ－Ｔ細胞と細胞外小胞の調製
３．２．１．ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
ＰＬＡＴ―Ｅ細胞（レトロウイルスパッケージング細胞株）を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＶｅｎｕｓをコードするｐＭＸベクターをＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの６０時間後、上清を回収し、３００ｇで５分間遠心分離した。回収した上清をウイルス粒子として用いた。回収したウイルス粒子を製造業者の指示にしたがってＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｏｎをｃｏａｔしたプレートに撒いた。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。リンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌ ｍＩＬ－２を加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、製造業者の指示にしたがってＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｏｕｓｅ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を加え２日間培養した．培養後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを取り除き、２×１０５個の細胞を上記ウイルス粒子がｃｏａｔされたプレートに撒き、５００ｇ １０分間遠心した後、Ｏ／Ｎで培養したものをＣＡＲ－Ｔ細胞とした。
３．２．１．ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
ＰＬＡＴ―Ｅ細胞（レトロウイルスパッケージング細胞株）を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＶｅｎｕｓをコードするｐＭＸベクターをＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの６０時間後、上清を回収し、３００ｇで５分間遠心分離した。回収した上清をウイルス粒子として用いた。回収したウイルス粒子を製造業者の指示にしたがってＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｏｎをｃｏａｔしたプレートに撒いた。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。リンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌ ｍＩＬ－２を加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、製造業者の指示にしたがってＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｏｕｓｅ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を加え２日間培養した．培養後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを取り除き、２×１０５個の細胞を上記ウイルス粒子がｃｏａｔされたプレートに撒き、５００ｇ １０分間遠心した後、Ｏ／Ｎで培養したものをＣＡＲ－Ｔ細胞とした。
【0158】
３．２．２．Ｈｅｒ２分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む細胞外小胞の調製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、プラスミド（Ｈｅｒ２－ＣＤ８１、Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２、Ｈｅｒ２－ＭＦＧ－Ｅ８またはＨｅｒ２－ＭＦＧ－Ｅ８－ＩＬ－２をコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例３の細胞外小胞として用いた。細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。コントロールとしてプラスミドをトランスフェクトしないＨＥＫ２９３細胞から同様の条件で細胞外小胞を回収した（以下コントロールエクソソーム又は２９３エクソソームと呼称する）。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、プラスミド（Ｈｅｒ２－ＣＤ８１、Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２、Ｈｅｒ２－ＭＦＧ－Ｅ８またはＨｅｒ２－ＭＦＧ－Ｅ８－ＩＬ－２をコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例３の細胞外小胞として用いた。細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。コントロールとしてプラスミドをトランスフェクトしないＨＥＫ２９３細胞から同様の条件で細胞外小胞を回収した（以下コントロールエクソソーム又は２９３エクソソームと呼称する）。
【0159】
３．２．３．細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
３．２．２で調製した抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各融合タンパク質の発現を、以下の抗体を用いてフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ３４０（ＨＥＲ２）抗体（２４Ｄ２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
結果を図６に示す。
３．２．２で調製した抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各融合タンパク質の発現を、以下の抗体を用いてフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ３４０（ＨＥＲ２）抗体（２４Ｄ２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
結果を図６に示す。
【0160】
３．３．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果
ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化細胞外小胞がＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
実施例３．２．１．で作製したＣＡＲ－Ｔ細胞２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、実施例３．２．２．の細胞外小胞（Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２）又コントロールの細胞外小胞(２９３exosome)を最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を加え、９６穴丸底プレートで４日間培養した後、Ｖｅｎｕｓの発現をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
結果を図７に示す。Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２を発現する細胞外小胞はＶｅｎｕｓを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を顕著に増殖させた。
ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化細胞外小胞がＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
実施例３．２．１．で作製したＣＡＲ－Ｔ細胞２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、実施例３．２．２．の細胞外小胞（Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２）又コントロールの細胞外小胞(２９３exosome)を最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を加え、９６穴丸底プレートで４日間培養した後、Ｖｅｎｕｓの発現をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
結果を図７に示す。Ｈｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２を発現する細胞外小胞はＶｅｎｕｓを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を顕著に増殖させた。
【0161】
３．４．Ｉｎ ｖｉｖｏでの効果
３．４．１．Ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ細胞活性化
ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化用の細胞外小胞がＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて以下の試験を実施した。
ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに実施例３．２．１．で作製したＣＡＲ－Ｔ細胞４×１０６個を移入し、同時にＣＡＲ－Ｔ細胞活性化用の細胞外小胞（Ｈｅｒ２ＭＦＧＥ８又はＨｅｒ２ＣＤ８１）又はコントロールの細胞外小胞(Control exosome)２００μｇをレシピエントマウスの尾静脈から移入した。細胞移入４日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行った。染色には以下の抗体を用いる（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、移入したＣＡＲ－Ｔ細胞増殖見るためにＶｅｎｕｓをフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
・ＡＰＣｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４５．１抗体（Ａ２０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・Ｐｅｒｃｐｃｙ５ コンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２抗体（１０４ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
結果を図８に示す。Ｈｅｒ２ＭＦＧＥ８又はＨｅｒ２ＣＤ８１を発現する細胞外小胞はＶｅｎｕｓを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を顕著に活性化及び増殖させた。
３．４．１．Ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ細胞活性化
ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化用の細胞外小胞がＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて以下の試験を実施した。
ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに実施例３．２．１．で作製したＣＡＲ－Ｔ細胞４×１０６個を移入し、同時にＣＡＲ－Ｔ細胞活性化用の細胞外小胞（Ｈｅｒ２ＭＦＧＥ８又はＨｅｒ２ＣＤ８１）又はコントロールの細胞外小胞(Control exosome)２００μｇをレシピエントマウスの尾静脈から移入した。細胞移入４日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行った。染色には以下の抗体を用いる（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、移入したＣＡＲ－Ｔ細胞増殖見るためにＶｅｎｕｓをフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
・ＡＰＣｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４５．１抗体（Ａ２０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・Ｐｅｒｃｐｃｙ５ コンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２抗体（１０４ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
結果を図８に示す。Ｈｅｒ２ＭＦＧＥ８又はＨｅｒ２ＣＤ８１を発現する細胞外小胞はＶｅｎｕｓを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を顕著に活性化及び増殖させた。
【0162】
３．４．２．Ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果
ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに、マウス大腸がん由来のＨｅｒ２を発現するＭＣ３８細胞を１×１０５個を移植する。その後、実施例３．２．１．で作製したＣＡＲ－Ｔ細胞４×１０６個を移入し、同時にＣＡＲ－Ｔ細胞活性化用の細胞外小胞（Ｈｅｒ２ＭＦＧＥ８、Ｈｅｒ２ＣＤ８１又はＨｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２）又はコントロールの細胞外小胞(Control exosome)２００μｇをレシピエントマウスの尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウス体内に形成されたＭＣ３８細胞を含む主要組織の大きさを測定する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化用の細胞外小胞をＣＡＲ－Ｔ細胞と共投与すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞がレシピエントマウス体内で活性化し、Ｈｅｒ２を発現するがん細胞に対する抗腫瘍効果が増強して、腫瘍組織の大きさがＣＡＲ－Ｔ細胞単独投与に比して減ずる。
ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに、マウス大腸がん由来のＨｅｒ２を発現するＭＣ３８細胞を１×１０５個を移植する。その後、実施例３．２．１．で作製したＣＡＲ－Ｔ細胞４×１０６個を移入し、同時にＣＡＲ－Ｔ細胞活性化用の細胞外小胞（Ｈｅｒ２ＭＦＧＥ８、Ｈｅｒ２ＣＤ８１又はＨｅｒ２－ＣＤ８１－ＩＬ－２）又はコントロールの細胞外小胞(Control exosome)２００μｇをレシピエントマウスの尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウス体内に形成されたＭＣ３８細胞を含む主要組織の大きさを測定する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化用の細胞外小胞をＣＡＲ－Ｔ細胞と共投与すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞がレシピエントマウス体内で活性化し、Ｈｅｒ２を発現するがん細胞に対する抗腫瘍効果が増強して、腫瘍組織の大きさがＣＡＲ－Ｔ細胞単独投与に比して減ずる。
【0163】
以下表１５に実施例で用いた配列情報の詳細を示す。
【表15-1】
【表15-2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】