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特許7007796ＡＢＬ遺伝子増幅用プライマー、核酸増幅方法及び核酸増幅用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-12
(45)【発行日】2022-02-10
(54)【発明の名称】ＡＢＬ遺伝子増幅用プライマー、核酸増幅方法及び核酸増幅用キット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220203BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20220203BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6844 Z
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2016208695
(22)【出願日】2016-10-25
(65)【公開番号】P2018068140
(43)【公開日】2018-05-10
【審査請求日】2019-05-09
(73)【特許権者】
【識別番号】000141897
【氏名又は名称】アークレイ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(74)【代理人】
【識別番号】100099025
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 浩志
(72)【発明者】
【氏名】細見 敏也
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０１６２４６２３（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２８２７９３５（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／１１５７７９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／０９
Ｃ１２Ｑ １／６８４４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡと相補的な核酸を増幅するための、下記（ａ）又は（ｂ）から選択されるいずれか１つのフォワードプライマーであって、配列番号１～配列番号６のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：（ａ）配列番号１の（２１－ｍ）位～３５位の塩基配列からなり、ｍは０～２０の整数であるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２の（１８－ｎ）位～３２位の塩基配列からなり、ｎは０～１７の整数であるオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
請求項１に記載フォワードプライマーを用いて、ＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅することを含む、核酸増幅方法。
【請求項3】
（１）請求項１に記載のフォワードプライマーを用いてＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡと相補的な核酸の増幅を行うこと、及び、（２）（１）により得られる増幅産物とは異なる増幅産物を得るためのプライマーセットを用いて核酸増幅を行うこと、
を含む核酸増幅方法。
【請求項4】
前記（１）に記載の核酸増幅が、前記（２）に記載の核酸増幅の内部標準として行われる、請求項３に記載の核酸増幅方法。
【請求項5】
前記（１）及び（２）に記載の核酸増幅を一反応液中で行う、請求項３又は請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項6】
前記（２）に記載の核酸増幅が、ＷＴ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅するものである、請求項３～請求項５のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項7】
請求項１に記載のフォワードプライマーを含む、キット。
【請求項8】
（１）請求項１に記載のフォワードプライマー、及び、（２）（１）により得られる増幅産物とは異なる増幅産物を得るためのプライマー、
を含む請求項７に記載のキット。
【請求項9】
前記（２）のプライマーが、ＷＴ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅するためのものである、請求項８に記載のキット。
【請求項10】
前記（２）のプライマーが、配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー、及び／又は、配列番号１８～配列番号２０のいずれか１つに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーを含む、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＢＬ遺伝子増幅用プライマー、核酸増幅方法及び核酸増幅用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
核酸増幅を行う際には、核酸増幅が正常に行われたか否かをモニターするために、常時発現しており発現量に変動が少ないハウスキーピング遺伝子と称される遺伝子を標的とする核酸増幅を、内部標準として行うことがしばしば行われる。発現量を調べるために核酸増幅を行う場合には、内部標準とする遺伝子の選択は非常に重要である。特にリアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏn）など、定量値を得るための核酸増幅を行う場合には、内部標準によって補正を行うことによってより正確な定量値を得ることができる。一方、適切でない内部標準を選択した場合には、定量値に大きな誤差を生じる結果となる。
内部標準として用いるハウスキーピング遺伝子としては、特許文献１において用いられているＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子の他、ベータアクチン遺伝子等が多く用いられている。特許文献１においては、ウィルムス腫瘍－１（ＷＴ１）遺伝子ｍＲＮＡの発現量定量の内部標準としてＧＡＰＤＨが用いられている。
内部標準として用いるハウスキーピング遺伝子としては、特許文献１において用いられているＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子の他、ベータアクチン遺伝子等が多く用いられている。特許文献１においては、ウィルムス腫瘍－１（ＷＴ１）遺伝子ｍＲＮＡの発現量定量の内部標準としてＧＡＰＤＨが用いられている。
【0003】
しかし、近年では核酸増幅の高感度化が進み、ＧＡＰＤＨやベータアクチン等の従来用いられて来たハウスキーピング遺伝子は、組織や細胞の活動性の相違による発現量の相違があり、発現量は一定ではないことが明らかになってきた。
そこで、より発現量の変動が少ない内部標準が求められていた。
そこで、より発現量の変動が少ない内部標準が求められていた。
【0004】
非特許文献１及び非特許文献２においては、より発現量の変動が少ない内部標準としてＡＢＬ遺伝子（Ａｂｅｌｓｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ）が用いられている。非特許文献１では、白血病患者の診断や微小残存病変のモニタリングに利用するＷＴ１遺伝子ｍＲＮＡ発現量の定量において、内部標準として用いる遺伝子を検討した結果、ＡＢＬ遺伝子が適切な内部標準として推薦されている。非特許文献２では、急性白血病（ＡＭＬ）患者の末梢血や骨髄から採取した試料のＷＴ１遺伝子ｍＲＮＡ発現量を、リアルタイム定量ＰＣＲ法によって検出及び定量している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開公報ＷＯ２０１４／１１５７７９号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｖｏｌ．１７、２００３、ｐｐ２４７４-２４８６
【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．３１、２００９、ｐｐ５１９５－５２０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
発明者は、非特許文献１及び非特許文献２においてＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により調製された核酸（つまり、ｃＤＮＡ）の増幅に用いられているプライマーが、反応液中に微量であってもゲノムＤＮＡが存在している場合には、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子も増幅することを見出した。ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅は、少量であれば臨床的な使用に影響はないと考えらえるが、ある程度の増幅が行われれば結果に誤差を生じる。被験試料が、ＲＮＡ抽出を経たものであっても微量のゲノムＤＮＡが混入することは考えられ、高感度の検出系ではゲノムＤＮＡの混入が検出の信頼性上の問題となる。
そこで、本発明は、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅が少なく、かつ、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを効率良く増幅するＡＢＬ遺伝子増幅用プライマーを提供することを課題とする。
そこで、本発明は、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅が少なく、かつ、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを効率良く増幅するＡＢＬ遺伝子増幅用プライマーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記の課題は以下の手段により解決することができる。
＜１＞ 下記（ａ）又は（ｂ）から選択されるいずれか１つのＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー：
（ａ）配列番号１の（２１－ｍ）位～３５位の塩基配列からなり、ｍは０～２０の整数であるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２の（１８－ｎ）位～３２位の塩基配列からなり、ｎは０～１７の整数であるオリゴヌクレオチド。
＜２＞ ｍが１０～２０の整数であり、ｎが７～１７の整数である、＜１＞に記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー。
＜３＞ 配列番号１～配列番号６のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、＜１＞又は＜２＞に記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー。
＜４＞ ＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いて、ＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅することを含む、核酸増幅方法。
＜５＞ （１）＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いて核酸増幅を行うこと、及び、
（２）（１）により得られる増幅産物とは異なる増幅産物を得るためのプライマーセットを用いて核酸増幅を行うこと、
を含む核酸増幅方法。
＜６＞ 前記（１）に記載の核酸増幅が、前記（２）に記載の核酸増幅の内部標準として行われる、＜５＞に記載の核酸増幅方法。
＜７＞ 前記（１）及び（２）に記載の核酸増幅を一反応液中で行う、＜５＞又は＜６＞に記載の核酸増幅方法。
＜８＞ 前記（２）に記載の核酸増幅が、ＷＴ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅するものである、＜５＞～＜７＞のいずれか１つに記載の核酸増幅方法。
＜９＞ ＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを含む、キット。
＜１０＞（１）＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー、及び、
（２）（１）により得られる増幅産物とは異なる増幅産物を得るためのプライマー、
を含む＜９＞に記載のキット。
＜１１＞ 前記（２）のプライマーが、ＷＴ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅するためのものである、＜１０＞に記載のキット。
＜１２＞ 前記（２）のプライマーが、配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー、及び／又は、配列番号１８～配列番号２０のいずれか１つに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーを含む、＜１１＞に記載のキット。
＜１＞ 下記（ａ）又は（ｂ）から選択されるいずれか１つのＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー：
（ａ）配列番号１の（２１－ｍ）位～３５位の塩基配列からなり、ｍは０～２０の整数であるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２の（１８－ｎ）位～３２位の塩基配列からなり、ｎは０～１７の整数であるオリゴヌクレオチド。
＜２＞ ｍが１０～２０の整数であり、ｎが７～１７の整数である、＜１＞に記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー。
＜３＞ 配列番号１～配列番号６のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、＜１＞又は＜２＞に記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー。
＜４＞ ＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いて、ＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅することを含む、核酸増幅方法。
＜５＞ （１）＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いて核酸増幅を行うこと、及び、
（２）（１）により得られる増幅産物とは異なる増幅産物を得るためのプライマーセットを用いて核酸増幅を行うこと、
を含む核酸増幅方法。
＜６＞ 前記（１）に記載の核酸増幅が、前記（２）に記載の核酸増幅の内部標準として行われる、＜５＞に記載の核酸増幅方法。
＜７＞ 前記（１）及び（２）に記載の核酸増幅を一反応液中で行う、＜５＞又は＜６＞に記載の核酸増幅方法。
＜８＞ 前記（２）に記載の核酸増幅が、ＷＴ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅するものである、＜５＞～＜７＞のいずれか１つに記載の核酸増幅方法。
＜９＞ ＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを含む、キット。
＜１０＞（１）＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー、及び、
（２）（１）により得られる増幅産物とは異なる増幅産物を得るためのプライマー、
を含む＜９＞に記載のキット。
＜１１＞ 前記（２）のプライマーが、ＷＴ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応によって得られた核酸を増幅するためのものである、＜１０＞に記載のキット。
＜１２＞ 前記（２）のプライマーが、配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー、及び／又は、配列番号１８～配列番号２０のいずれか１つに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーを含む、＜１１＞に記載のキット。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅が少なく、かつ、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを効率良く増幅するＡＢＬ遺伝子増幅用プライマー、核酸増幅方法及び核酸増幅用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0012】
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において組成物中のある成分の量について言及する場合、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において組成物中のある成分の量について言及する場合、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
【0013】
＜ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー＞
本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーは、（ａ）配列番号１の（２１－ｍ）位～３５位の塩基配列からなり、ｍが０～２０の整数であるオリゴヌクレオチド、及び、（ｂ）配列番号２の（１８－ｎ）位～３２位の塩基配列からなり、ｎが０～１７の整数である塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、から選択されるいずれか１つのＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーである。
本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーは、（ａ）配列番号１の（２１－ｍ）位～３５位の塩基配列からなり、ｍが０～２０の整数であるオリゴヌクレオチド、及び、（ｂ）配列番号２の（１８－ｎ）位～３２位の塩基配列からなり、ｎが０～１７の整数である塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、から選択されるいずれか１つのＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーである。
【0014】
上記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーは、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子と比べて、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡに対する特異性が高い、ゲノムＤＮＡのＡＢＬ遺伝子の誤増幅が少ないフォワードプライマーである。
配列番号１の２１位～３５位の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号２の１８位～３２位の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを少なくとも含むことによって、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの特異性が高く、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅を少なく抑えつつ、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡの効率的な増幅を可能とするフォワードプライマーが得られる。
配列番号１の２１位～３５位の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号２の１８位～３２位の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを少なくとも含むことによって、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの特異性が高く、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅を少なく抑えつつ、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡの効率的な増幅を可能とするフォワードプライマーが得られる。
【0015】
（ａ）のフォワードプライマーにおいて、ｍは５～２０の整数であることが好ましく、６～２０又は７～２０の整数であることがさらに好ましく、８～２０又は９～２０の整数であることがさらに好ましく、１０～２０の整数であることが一層好ましい。また、前記それぞれのｍの範囲において、ｍの上限値を１５又は１４に変更した範囲も好ましく、１３又は１２に変更した範囲はさらに好ましく、１１又は１０に変更した範囲は特に好ましい。
【0016】
本発明の一実施形態にかかる、（ａ）配列番号１の（２１－ｍ）位～３５位の塩基配列からなり、ｍが０～２０の整数であるオリゴヌクレオチドであるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーのうち、好ましく用いられるプライマーの例としては、配列番号１、３及び４のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーが挙げられる。
【0017】
（ｂ）のフォワードプライマーにおいて、ｎは３～１７の整数であることが好ましく、４～１７又は５～１７の整数であることがさらに好ましく、６～１７の整数であることがさらに好ましく、７～１７の整数であることが一層好ましい。また、前記それぞれのｎの範囲において、ｎの上限値を１２又は１１に変更した範囲も好ましく、１０又は９に変更した範囲がさらに好ましく、８又は７に変更した範囲が特に好ましい。
【0018】
本発明の一実施形態にかかる、（ｂ）配列番号２の（１８－ｎ）位～３２位に示され、ｎが０～１７の整数である塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーのうち、好ましく用いられるプライマーの例としては、配列番号２、５及び６のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーが挙げられる。
【0019】
なお、本発明の一実施形態において、ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーは、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅が臨床上の判定に問題が無い程度に抑えられる限りは、各ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーの塩基配列に対して１個～３個程度の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列からなる改変オリゴヌクレオチドであってもよい。
【0020】
＜核酸増幅方法＞
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法は、（ａ）配列番号１の（２１－ｍ）位～３５位に示され、ｍが０～２０の整数である塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、（ｂ）配列番号２の（１８－ｎ）位～３２位に示され、ｎが０～１７の整数である塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、から選択されるいずれか１つのＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いて核酸増幅を行うことを少なくとも含む、核酸増幅方法である。
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法によれば、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅を少なく、かつ、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを効率良く増幅することができる。
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法は、（ａ）配列番号１の（２１－ｍ）位～３５位に示され、ｍが０～２０の整数である塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、（ｂ）配列番号２の（１８－ｎ）位～３２位に示され、ｎが０～１７の整数である塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、から選択されるいずれか１つのＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いて核酸増幅を行うことを少なくとも含む、核酸増幅方法である。
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法によれば、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の増幅を少なく、かつ、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを効率良く増幅することができる。
【0021】
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法は、被験対象とする試料からＲＮＡを抽出すること、ＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡと相補的なＤＮＡ（つまり、ｃＤＮＡ）を逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＲＴ）反応により調製すること、及び、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーで核酸増幅を行うこと、を含むことが好ましい。核酸増幅においては、前記ｃＤＮＡを鋳型として、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーと、前記ｃＤＮＡの領域の少なくとも一部を増幅するためのリバースプライマーとを用いて核酸増幅を行うこと、を含むことが望ましい。前記フォワードプリマーとリバースプライマーを組み合わせて用いて目的とするｃＤＮＡの領域の核酸を増幅することができる。
【0022】
ＲＮＡの抽出は当業者に公知の方法、例えば、Acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform extraction（AGPC 法）（Chomczynski & Sacchi (1987) Analytical Biochemistry, 162: 156-159）により行うことができる。あるいは、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）のようなシリカメンブレンを用いたスピンカラムによるＲＮＡ抽出方法、又は、Maxwell 16 LEV simplyRNA Blood Kit（プロメガ社製）のような磁性体シリカレジンや磁性体粒子を用いたＲＮＡ抽出方法により行うことができる。
【0023】
抽出したＲＮＡから、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡを調製することは、逆転写酵素を用いて行うことができる。逆転写酵素としては、Moloney Murine Leukemia Virus（M-MVL）、Avian Myeloblastosis Virus （AMV）などのレトロウイルスに由来する逆転写酵素などを例示することができるが、これらに限定されない。
ｃＤＮＡの調製は公知の方法、例えば、Cleveland, D.L. and Ihle, J.H. (1995) Cell 81, 479.又はTartaglia, L.A. and Goeddel, D.V. (1992) Immunol. Today 13,151.に記載の方法によって行うことができる。
ｃＤＮＡの調製は公知の方法、例えば、Cleveland, D.L. and Ihle, J.H. (1995) Cell 81, 479.又はTartaglia, L.A. and Goeddel, D.V. (1992) Immunol. Today 13,151.に記載の方法によって行うことができる。
【0024】
ｃＤＮＡの調製は、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーで核酸増幅と一反応液中で行ってもよいし、別個に行ってもよい。一反応液中で行う例として、逆転写ＰＣＲ法を挙げることができる。
逆転写反応の条件は、例えば、４０℃～８０℃、１分間～１２０分間が好ましく、５０℃～７０℃、５分～３０分間がより好ましい。また、逆転写ＰＣＲ法を行う場合には、耐熱性の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてホットスタート法を採用してもよい。ホットスタート法においては、逆転写反応の直前に、例えば、５５℃～９９℃、１秒間～１０分間のような、プライマーの非特異的なアニーリングを抑制する温度での処理条件が付加される。ホットスタート法においては、予め不活性化したＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼを不活性化するためには、一般に、ＤＮＡポリメラーゼの中和抗体やアプタマーを加える方法、ＤＮＡポリメラーゼを化学修飾する方法などが行われる。ＤＮＡポリメラーゼを予め不活性化することにより、ホットスタートの温度条件でのポリメラーゼ活性によるプライマーダイマーや非特異的な増幅産物の生成を抑制し、良好なリアルタイム定量ＰＣＲ結果を得ることができる。
逆転写反応の条件は、例えば、４０℃～８０℃、１分間～１２０分間が好ましく、５０℃～７０℃、５分～３０分間がより好ましい。また、逆転写ＰＣＲ法を行う場合には、耐熱性の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてホットスタート法を採用してもよい。ホットスタート法においては、逆転写反応の直前に、例えば、５５℃～９９℃、１秒間～１０分間のような、プライマーの非特異的なアニーリングを抑制する温度での処理条件が付加される。ホットスタート法においては、予め不活性化したＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼを不活性化するためには、一般に、ＤＮＡポリメラーゼの中和抗体やアプタマーを加える方法、ＤＮＡポリメラーゼを化学修飾する方法などが行われる。ＤＮＡポリメラーゼを予め不活性化することにより、ホットスタートの温度条件でのポリメラーゼ活性によるプライマーダイマーや非特異的な増幅産物の生成を抑制し、良好なリアルタイム定量ＰＣＲ結果を得ることができる。
【0025】
核酸増幅の方法は、増幅の対照とする核酸配列又はその近傍にハイブリダイズするプライマーを用いて行う方法であれば、特に限定はされない。例えばポリメラーゼを用いる方法等によって行うことができる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。
【0026】
ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４８８９８１８号明細書及び米国特許第５０７９３５２号明細書を参照）（Ｔａｑポリメラーゼ（商品名））、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９１／０９９５０号を参照）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９２／９６８９号を参照）（Pfu DNA polymerase；Strategene社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０４５５４３０号明細書を参照）（Ｖｅｎｔ（商標）；New England Biolabs社製）、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、等が商業的に入手可能である。
【0027】
ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとして、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてもよい。逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成してＰＣＲ法により増幅し、検出する逆転写リアルタイムＰＣＲ法を一反応液中において１ステップで実施することができる。逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｔｈポリメラーゼ（東洋紡社製など）、HawkZ05 Fast DNA ポリメラーゼ（ロシュ社製）等を挙げることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼが好ましい。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲの増幅過程において、ＤＮＡに結合した蛍光標識プローブを５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解する。蛍光物質と消光物質とで標識したプローブを用いれば、前記分解により蛍光物質が遊離し、蛍光物質のシグナル強度変化によりＤＮＡ増幅量をリアルタイムに測定するリアルタイム定量ＰＣＲ法を行うことができる。
【0028】
ＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択して行えばよい。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μＬに対して０．０１Ｕ～１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、検出感度が高まるなどの傾向がある。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μＬに対して０．０１Ｕ～１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、検出感度が高まるなどの傾向がある。
【0029】
増幅反応において、増幅反応液における試料の添加割合は特に制限されない。具体例として、上記試料が生体試料（例えば、抽出されたＲＮＡ試料）の場合、添加割合の下限は、０．０１体積％以上であることが好ましく、０．１体積％以上であることがより好ましく、１体積％以上であることがさらに好ましい。また、上記試料が生体試料（例えば、抽出されたＲＮＡ試料）の場合、添加割合の上限は、５０体積％以下であることが好ましく、３０体積％以下であることがより好ましく、１５体積％以下であることがさらに好ましい。
【0030】
また、増幅反応の開始前に、上記増幅反応液にさらにアルブミンを添加してもよい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物又は濁りの発生による影響をより一層低減でき、且つ、増幅効率もさらに向上する。
上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％～２質量％であり、好ましくは０．１質量％～１質量％であり、より好ましくは０．２質量％～０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％～２質量％であり、好ましくは０．１質量％～１質量％であり、より好ましくは０．２質量％～０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
【0031】
以下、増幅についてＰＣＲ法、逆転写ＰＣＲ法又は逆転写リアルタイムＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本発明は、この例に制限されない。
【0032】
まず、鋳型核酸と本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーと、目的とする遺伝子領域の核酸を増幅するためのリバースプライマーとを少なくとも含むＰＣＲ反応液を調製する。
ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。例えば、フォワードプライマー及びリバースプライマーの添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０２μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．０５μｍｏｌ／Ｌ～１μｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。例えば、フォワードプライマー及びリバースプライマーの添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０２μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．０５μｍｏｌ／Ｌ～１μｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
【0033】
ＰＣＲ反応液におけるその他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。他の組成成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチド、溶媒等が挙げられる。ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
【0034】
ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等）が挙げられる。ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）、Bicine buffer等の緩衝液が挙げられ、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。
また、ＰＣＲ又は逆転写ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、酢酸マンガン（II)、酢酸カリウム等が含まれていてもよい。
溶媒としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）、Bicine buffer等の緩衝液が挙げられ、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。
また、ＰＣＲ又は逆転写ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、酢酸マンガン（II)、酢酸カリウム等が含まれていてもよい。
【0035】
ＰＣＲは、通常、（ｉ）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（解離工程）、（ｉｉ）プライマーの鋳型核酸へのアニーリング（アニーリング工程）、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（伸長工程）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程の条件は、例えば、８５℃～９９℃、１秒間～１２０秒間が好ましく、８８℃～９５℃、１秒間～６０秒間がより好ましい。アニーリング工程の条件は、例えば、４０℃～７０℃、１秒間～３００秒間が好ましく、５０℃～７０℃、５秒間～６０秒間がより好ましい。また、伸長工程の条件は、例えば、５０℃～８０℃、１秒間～３００秒間が好ましく、５０℃～８０℃、５秒間～６０秒間がより好ましい。
サイクル数は特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。
以上のようにして、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅が少ない増幅産物を得ることができる。
サイクル数は特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。
以上のようにして、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅が少ない増幅産物を得ることができる。
【0036】
本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーと組み合わせて用いるリバースプライマーは、目的とする領域を増幅するように従来技術により設計すればよい。ＡＢＬ遺伝子のゲノム配列及びｍＲＮＡ（又は、ｃＤＮＡ）配列は、公開されている遺伝子配列情報を含むデータベース、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Geneから入手することができる。例としては、ＮＣＢＩ ＧＥＮＥのＩＤ：２５からＡＢＬ遺伝子のゲノム配列及びｍＲＮＡの配列を取得可能である。リバースプライマーの設計等に利用可能なＡＢＬ遺伝子のゲノム配列の一部及びｍＲＮＡの配列を配列番号１２及び配列番号１３に示す。配列番号１２はゲノム上のＡＢＬ遺伝子の一部（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳｅｑｕｅｎｃｅのＮＧ＿０１２０３４＿の１４０００１位～１４１４４０位に相当する）であり、配列番号１３はＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡの一部（１位～１０２０位）配列を示す。当業者は、これらの配列を参照して、適宜リバースプライマーを設計することができる。
【0037】
リバースプライマーは、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーと組み合わせて核酸増幅を行うことができれば特に限定はされない。好ましいリバースプライマーは、前記フォワードプライマーがＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（又は、その増幅産物）にハイブリダイズする領域から３’側に１０ｂｐ～１０００ｂｐの領域にハイブリダイズするものであり、３’側に２０ｂｐ～３００ｂｐの領域にハイブリダイズするものがさらに好ましく、３’側に３０ｂｐ～２００ｂｐの領域にハイブリダイズするものが特に好ましい。リバースプライマーのＴｍ値はフォワードプライマーと近いＴｍ値に設定することが好ましい。例えば、フォワードプライマーのＴｍ値との差が１０℃以内に設定することが好ましく、５℃以内に設定することがより好ましい。プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ～４０ｍｅｒ及び４０℃～７０℃、又は１５ｍｅｒ～３０ｍｅｒ及び５０℃～６０℃にしてもよい。このようなプライマーの設計手法は当業者に公知である。例えば、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ（http://sg.idtdna.com/calc/analyzer）などの設計ツールが公開されており、これらを用いることもできる。
増幅産物の塩基長は特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ～１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ～２００ｍｅｒに設定することができる。
増幅産物の塩基長は特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ～１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ～２００ｍｅｒに設定することができる。
【0038】
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法に好適に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーの例を以下に示す。フォワードプライマーとリバースプライマーはいずれの組み合わせで用いてもよい。
－フォワードプライマー－
・配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ５＋１０ｍｅｒ）
・配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ６＋１０ｍｅｒ）
・配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ５）
・配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ５＋５ｍｅｒ）
・配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ６）
・配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ６＋５ｍｅｒ）
－リバースプライマー－
・配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｒ１）
・配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｒ９）
・配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｒ１０）
－フォワードプライマー－
・配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ５＋１０ｍｅｒ）
・配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ６＋１０ｍｅｒ）
・配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ５）
・配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ５＋５ｍｅｒ）
・配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ６）
・配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｆ６＋５ｍｅｒ）
－リバースプライマー－
・配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｒ１）
・配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｒ９）
・配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＡＢＬ－Ｒ１０）
【0039】
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法は、核酸増幅と増幅産物の検出を一反応液中で行ってもよいし、別個に行ってもよい。増幅産物の検出方法は特に限定はされないが、特異性の観点から、増幅産物に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプローブを用いることが好ましい。ＡＢＬ遺伝子の核酸増幅によって得られる増幅産物の検出に好適なプローブは、当業者であれば適宜設計可能である。当業者は増幅産物にハイブリダイズする相補的な塩基配列を有するプローブを、増幅産物の塩基配列に基づいて作成することができる。
【0040】
プローブは、検出の効率性の観点から標識物質を用いて標識することが好ましい。標識物質としては従来公知のいずれの標識物質を用いてもよいが、高感度かつ操作性が良好な蛍光色素を用いることが好ましい。上記蛍光色素としては、特に制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）等が挙げられる。
プローブの標識は、通常の方法に従って行うことができる。Ｍｅｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＯｌｉＧｒｏ（登録商標）等の市販のラベリングキットを用いて行うこともできる。
プローブの標識は、通常の方法に従って行うことができる。Ｍｅｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＯｌｉＧｒｏ（登録商標）等の市販のラベリングキットを用いて行うこともできる。
【0041】
蛍光標識されたプローブの具体例として、Ｄｕａｌ Ｌａｂｅｌｅｄプローブを挙げることができる。Ｄｕａｌ Ｌａｂｅｌｅｄプローブは、片方の末端が蛍光色素で修飾され、もう片方の末端がクエンチャーで修飾されている。Ｄｕａｌ Ｌａｂｅｌｅｄプローブが鋳型核酸にハイブリダイズした状態ではクエンチャーによって蛍光が抑制されているが、プライマーの伸長反応の際に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼによりプローブが分解され、クエンチャーと蛍光色素が分離することで蛍光発光し、蛍光を検出することができる。
【0042】
Ｄｕａｌ Ｌａｂｅｌｅｄプローブは、リアルタイムＰＣＲとして知られる方法に主に用いられる。リアルタイムＰＣＲ法によれば、核酸増幅を経時的にモニタリングし、被験試料に含まれる標的配列のコピー数の相対的な比較をすることができる。また、標的配列のコピー数が既知である試料を標準物質として利用して検量線を作成することによって、標的配列のコピー数が未知である試料に含まれる標的配列のコピー数を定量値として得ることもできる。
【0043】
蛍光標識されたプローブのさらなる具体例として、蛍光色素で標識され、単独（相補配列にハイブリダイズしていないとき）で蛍光を示し且つハイブリッド形成（相補配列にハイブリダイズしているとき）により蛍光が減少（例えば、消光）する、蛍光消光プローブが挙げられる。例として、グアニン消光プローブであるＱ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）を挙げることができる。このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシン（Ｃ）が検出目的配列におけるグアニン（Ｇ）に近づくことによって、蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなグアニン消光プローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。標識物質は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
【0044】
なお、上記検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、サイクリングプローブ法、ＲＦＬＰ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法、ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ法等が挙げられる。
【0045】
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法によって得られる増幅産物の検出に好適なプローブの例として、以下に示す配列番号２１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに標識物質としてＴＡＭＲＡ、クエンチャーとしてＢＨＱ２を付加したプローブ（名称：ｐｒｏｂｅ－ＡＢＬ）を挙げることができる。
・ＡＢＬ遺伝子の増幅産物を検出するためのプローブの一例（配列番号２１）
ＴＡＭＲＡ-ＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴ-ＢＨＱ２
ｐｒｏｂｅ－ＡＢＬは、逆転写リアルタイム定量ＰＣＲ法においても好適に使用し得るプローブである。
・ＡＢＬ遺伝子の増幅産物を検出するためのプローブの一例（配列番号２１）
ＴＡＭＲＡ-ＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴ-ＢＨＱ２
ｐｒｏｂｅ－ＡＢＬは、逆転写リアルタイム定量ＰＣＲ法においても好適に使用し得るプローブである。
【0046】
逆転写及び核酸増幅は、一反応として逆転写ＰＣＲ法により行ってもよい。逆転写ＰＣＲ法は公知の方法で行うことができる。例えば、プロメガ社製の市販キット（Evans, H., and Sillibourne, J. Promega Notes 57, p21.）、クロンテック社製の市販キット（J. Biol. Chem., 2008; 283: 17175-17183.）などを使用して逆転写ＰＣＲ法を行うことができる。
【0047】
本発明の核酸増幅方法の一実施形態において、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いる核酸増幅（以下、ＡＢＬの核酸増幅と称する場合がある）は、前記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象とする核酸増幅（以下、他の核酸増幅と称する場合がある）と一反応液中で行ってもよいし、異なる反応液中で行ってもよい。他の核酸増幅は１つであってもよいし、複数であってもよい。
【0048】
ＡＢＬの核酸増幅は、他の核酸増幅の内部標準としてもよい。他の核酸増幅における内部標準としての使用は、例えば、被験試料の間で実質的に量の差が無い核酸の増幅（本発明においては、ＡＢＬの核酸増幅）を他の核酸増幅と並行して行うことを指す。内部標準は、他の核酸増幅が正常に行われているか否かを判定するために用いることができる。さらに、内部標準から得られるシグナル強度やコピー数などの数値によって、他の核酸増幅のシグナル強度やコピー数などの数値の補正を行うことができる。
補正方法は当業者に周知である。例えば、簡易な補正方法の一例として、他の核酸増幅で得られたコピー数を、ＡＢＬの核酸増幅で得られたコピー数で除する方法を挙げることができる。
補正方法は当業者に周知である。例えば、簡易な補正方法の一例として、他の核酸増幅で得られたコピー数を、ＡＢＬの核酸増幅で得られたコピー数で除する方法を挙げることができる。
【0049】
他の核酸増幅により増幅される領域は特に限定されない。他の核酸増幅において、ＡＢＬ遺伝子領域の核酸増幅が行われる場合もある。他の核酸増幅において、ＡＢＬの核酸増幅によって増幅される領域と異なるＡＢＬ遺伝子領域が増幅される場合には、ＡＢＬの核酸増幅によって増幅される領域と異なるＡＢＬ遺伝子領域の核酸増幅は「他の核酸増幅」に相当する。
【0050】
他の核酸増幅により増幅される領域の例として、ＷＴ１遺伝子領域を挙げることができる。ＷＴ１遺伝子は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の白血病細胞において高率に高発現しており、ＷＴ１遺伝子のｍＲＮＡの上昇は白血病細胞の増加に特異的であるといわれている。このような特性から、ＷＴ１遺伝子のｍＲＮＡ測定はＡＭＬの腫瘍マーカーとしてＡＭＬの早期発見や残存病変のモニタリングの目的で既に臨床的に使用されている。ＷＴ１ｍＲＮＡの定量測定の内部標準としては従来用いられているハウスキーピング遺伝子がしばしば用いられているが、ハウスキーピング遺伝子に代えてＡＢＬ遺伝子をレファレンス遺伝子とすることによって細胞の活動性に依存しないより正確なＷＴ１ｍＲＮＡ発現量を決定することができる。
【0051】
ＷＴ１遺伝子の核酸増幅は上記ＡＢＬ遺伝子の核酸増幅の記載に準じて行うことができる。ＷＴ１遺伝子を増幅するためのプライマーセット、逆転写及び核酸増幅の条件を当業者は適宜決定することができる。ＷＴ１遺伝子の増幅に好適なフォワードプライマーとリバースプライマーの例を以下に示す。以下のプライマーは、いずれもＡＢＬ遺伝子の核酸増幅と同一反応液中で核酸増幅を行う場合にも好適に用いることができる。さらには、逆転写反応及び増幅産物の検出についても、ＡＢＬ遺伝子の逆転写反応、核酸増幅及び増幅産物の検出に好適に使用することができる。
－フォワードプライマー－
・配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＷＴ１－Ｆ１０）
－リバースプライマー－
・配列番号１８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＷＴ１－Ｒ１１）
・配列番号１９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＷＴ１－Ｒ１５）
・配列番号２０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＷＴ１－Ｒ１６）
－フォワードプライマー－
・配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＷＴ１－Ｆ１０）
－リバースプライマー－
・配列番号１８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＷＴ１－Ｒ１１）
・配列番号１９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＷＴ１－Ｒ１５）
・配列番号２０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（名称：ＷＴ１－Ｒ１６）
【0052】
ＷＴ１遺伝子の核酸増幅によって得られる増幅産物の検出に好適なプローブは、当業者であれば適宜設計可能である。増幅産物にハイブリダイズする相補的な塩基配列を有するプローブを、増幅産物の塩基配列に基づいて作成することができる。好適なプローブの一例として、以下に示す配列番号２２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに標識物質としてＦＡＭ、クエンチャーとしてＢＨＱ１を付加したプローブ（名称：ｐｒｏｂｅ－ＷＴ１）を挙げることができる。
・ＷＴ１遺伝子の増幅産物を検出するためのプローブの一例（配列番号２２）
ＦＡＭ－ＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＧＡ－ＢＨＱ１
・ＷＴ１遺伝子の増幅産物を検出するためのプローブの一例（配列番号２２）
ＦＡＭ－ＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＧＡ－ＢＨＱ１
【0053】
他の核酸増幅により増幅される領域の例として、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子領域を挙げることができる。ＡＢＬ－ＢＣＲ融合遺伝子のｍＲＮＡ測定は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の早期発見や残存病変のモニタリングに使用されている。ＡＢＬ－ＢＣＲ融合遺伝子の検出のために増幅される領域がＡＢＬの核酸増幅により増幅される領域と異なっていれば、ＡＢＬの核酸増幅は内部標準として好適に使用することができる。
【0054】
本発明の一実施形態において、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーによる核酸増幅と、前記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象とする核酸増幅とを一反応液中で行う前に、同じ反応液中で逆転写反応を行ってもよい。前記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーの増幅対象となる核酸領域と、前記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーの増幅対象とは異なる核酸領域の逆転写反応も一反応液中で行うことができる。
前述のＡＢＬ遺伝子増幅用プライマー及びＷＴ１遺伝子増幅用プライマーは、いずれもＡＢＬ遺伝子とＷＴ１遺伝子の逆転写反応、核酸増幅及び増幅産物の検出を一反応液中で行う場合にも好適に使用することができる。
前述のＡＢＬ遺伝子増幅用プライマー及びＷＴ１遺伝子増幅用プライマーは、いずれもＡＢＬ遺伝子とＷＴ１遺伝子の逆転写反応、核酸増幅及び増幅産物の検出を一反応液中で行う場合にも好適に使用することができる。
【0055】
異なる増幅産物が得られる複数の核酸増幅反応を一反応液中で行う場合には、複数のフォワードプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０２μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．０５μｍｏｌ／Ｌ～１μｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。リバースプライマーの添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０２μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．０５μｍｏｌ／Ｌ～１μｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
【0056】
異なる増幅産物が得られる複数の核酸増幅反応を一反応液中で行う場合には、それぞれの増幅産物に特異的なプローブを用いて検出することが好ましい。プローブは、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識によって標識化されていることがさらに好ましい。このように、異なる標識を使用することによって、同一反応液であっても、検出条件を変えることによって各増幅産物を別個に解析することが可能となる。
複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは特に制限されないが、例えば、ＦＡＭ（検出波長：５０５ｎｍ～５１５ｎｍ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長：４５０ｎｍ～４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長：５８５ｎｍ～７００ｎｍ）、及びＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長：５１５ｎｍ～５５５ｎｍ）の組み合わせ等が挙げられる。
複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは特に制限されないが、例えば、ＦＡＭ（検出波長：５０５ｎｍ～５１５ｎｍ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長：４５０ｎｍ～４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長：５８５ｎｍ～７００ｎｍ）、及びＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長：５１５ｎｍ～５５５ｎｍ）の組み合わせ等が挙げられる。
【0057】
異なる増幅産物が得られる複数の核酸増幅反応を一反応液中で行う場合の具体例として、ＷＴ１遺伝子ｍＲＮＡとＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡとを一反応液中で逆転写ＰＣＲ法によって行う方法を挙げることができる。反応液には、例えば、逆転写酵素、ＷＴ１遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＷＴ１遺伝子増幅産物を検出するためのプローブ及びＡＢＬ遺伝子増幅産物を検出するためのプローブ等が含まれる。逆転写反応、核酸増幅反応および増幅産物の検出は全て一反応液中で行うことができる。このとき、プローブの標識は異なる条件で検出される物質で標識されていることが好ましい。例えば、ＷＴ１検出用プローブがＦＡＭ、ＡＢＬ検出用プローブがＴＡＭＲＡで標識されていれば、検出波長を変えることによって一反応液中のＷＴ１遺伝子増幅産物とＡＢＬ遺伝子増幅産物を検出することが可能である。
【0058】
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅方法の被験試料は、核酸を含む試料であれば特に限定されない。例えば、生体、好ましくは人体から採取した組織又は血液からＲＮＡを抽出して被験試料として使用することができる。被験試料としては、骨髄液又は血液からＲＮＡを抽出した試料が好ましいが、採取の際の侵襲性が低いことから、血液からＲＮＡを抽出し被験試料として使用することが特に好ましい。ＲＮＡを抽出するための血液には全血を用いることもできるが、血液を遠心分離して生じる白血球の層（つまり、バフィーコート）を用いることが好ましい。
【0059】
＜核酸増幅用キット＞
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを含む、核酸増幅用キットである。
本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを含むことにより、ゲノム上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅が少ないキットとすることができる。加えて、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーによる核酸増幅と、前記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象とする核酸増幅とを一反応液中で行い得られたＡＢＬ遺伝子発現量を補正に用いれば、ゲノム上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅が少ないことによって、より正確な補正を行うことができる。このため、前記核酸増幅用キットを用いることによって、核酸増幅についてのより正確な内部標準が得られる。
また、内部標準としては、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーによる核酸増幅だけではなく、例えば、従来知られるハウスキーピング遺伝子等の、他の遺伝子を対象とする核酸増幅を組み合わせて行ってもよい。
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを含む、核酸増幅用キットである。
本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを含むことにより、ゲノム上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅が少ないキットとすることができる。加えて、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーによる核酸増幅と、前記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象とする核酸増幅とを一反応液中で行い得られたＡＢＬ遺伝子発現量を補正に用いれば、ゲノム上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅が少ないことによって、より正確な補正を行うことができる。このため、前記核酸増幅用キットを用いることによって、核酸増幅についてのより正確な内部標準が得られる。
また、内部標準としては、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーによる核酸増幅だけではなく、例えば、従来知られるハウスキーピング遺伝子等の、他の遺伝子を対象とする核酸増幅を組み合わせて行ってもよい。
【0060】
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーと組み合わせて使用して１つの領域の核酸増幅を行うリバースプライマーを含んでいてもよい。好適なリバースプライマーは前述の通りである。
また、本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、前記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いる核酸増幅の増幅産物を検出するためのプローブをさらに含んでいてもよい。増幅産物の検出を行うためのキットであっても、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いて核酸増幅を行う限りは、本発明の核酸増幅キットに包含される。
プローブ及びプライマーについては、プローブ及びプライマーについて前述した事項をそのまま適用することができる。
また、本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、前記ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いる核酸増幅の増幅産物を検出するためのプローブをさらに含んでいてもよい。増幅産物の検出を行うためのキットであっても、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いて核酸増幅を行う限りは、本発明の核酸増幅キットに包含される。
プローブ及びプライマーについては、プローブ及びプライマーについて前述した事項をそのまま適用することができる。
【0061】
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象として核酸増幅を行うためのプライマーセットをさらに含んでいてもよい。このようなプライマーセットの例として、ＷＴ１遺伝子増幅用のプライマーセット、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子増幅用のプライマーセットなどを挙げることができる。
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象とする核酸増幅の増幅産物を検出するためのプローブをさらに含んでいてもよい。
本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象として核酸増幅を行うためのプライマー、及び、前記異なる領域の増幅産物を検出するためのプローブについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象とする核酸増幅の増幅産物を検出するためのプローブをさらに含んでいてもよい。
本発明の一実施形態にかかるＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとは異なる領域を対象として核酸増幅を行うためのプライマー、及び、前記異なる領域の増幅産物を検出するためのプローブについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
【0062】
また、本発明の一実施形態にかかる核酸増幅用キットは、プローブ、プライマー及びその他の試薬類が、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
試薬類は、例えば、緩衝液中に溶解された状態で含まれていてもよいし、凍結乾燥品として含まれていてもよい。試薬類を収容する容器としては、例えば、ガラス製やプラスチック製のバイアル等を用いることができる。
本発明の一実施形態において、複数のプライマー及び／又はプローブを含む場合、それらは混合された状態で含まれていても、それぞれ別個に含まれていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
試薬類は、例えば、緩衝液中に溶解された状態で含まれていてもよいし、凍結乾燥品として含まれていてもよい。試薬類を収容する容器としては、例えば、ガラス製やプラスチック製のバイアル等を用いることができる。
本発明の一実施形態において、複数のプライマー及び／又はプローブを含む場合、それらは混合された状態で含まれていても、それぞれ別個に含まれていてもよい。
【実施例】
【0063】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【0064】
［試薬等］
ＡＢＬ遺伝子増幅用の各フォワードプライマーの評価は、ＷＴ１遺伝子とＡＢＬ遺伝子について、逆転写から検出までの一連の操作を一反応液中で行うマルチプレックス系の逆転写リアルタイム定量ＰＣＲで行った。表１に示す反応液を用いた。
使用したＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー（ＡＢＬ-Ｆ-Ｐｒｉｍｅｒ）を表２、ＡＢＬ遺伝子増幅用リバースプライマー（ＡＢＬ-Ｒ-Ｐｒｉｍｅｒ）を表３に示す。
使用したＷＴ１遺伝子増幅用フォワードプライマー（ＷＴ１-Ｆ-Ｐｒｉｍｅｒ）及びＷＴ１遺伝子増幅用リバースプライマー（ＷＴ１-Ｒ-Ｐｒｉｍｅｒ）を表４に示す
使用したＡＢＬ遺伝子検出用プローブ及びＷＴ１遺伝子検出用プローブを表５に示す。これらのプローブは全ての実験において使用された。
また、表１においてｔｅｍｐｌａｔｅは遺伝子増幅が行われ得るＲＮＡ又はＤＮＡを示す。
ＡＢＬ遺伝子増幅用の各フォワードプライマーの評価は、ＷＴ１遺伝子とＡＢＬ遺伝子について、逆転写から検出までの一連の操作を一反応液中で行うマルチプレックス系の逆転写リアルタイム定量ＰＣＲで行った。表１に示す反応液を用いた。
使用したＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマー（ＡＢＬ-Ｆ-Ｐｒｉｍｅｒ）を表２、ＡＢＬ遺伝子増幅用リバースプライマー（ＡＢＬ-Ｒ-Ｐｒｉｍｅｒ）を表３に示す。
使用したＷＴ１遺伝子増幅用フォワードプライマー（ＷＴ１-Ｆ-Ｐｒｉｍｅｒ）及びＷＴ１遺伝子増幅用リバースプライマー（ＷＴ１-Ｒ-Ｐｒｉｍｅｒ）を表４に示す
使用したＡＢＬ遺伝子検出用プローブ及びＷＴ１遺伝子検出用プローブを表５に示す。これらのプローブは全ての実験において使用された。
また、表１においてｔｅｍｐｌａｔｅは遺伝子増幅が行われ得るＲＮＡ又はＤＮＡを示す。
【0065】
【表1】
【0066】
【表2】
【0067】
【表3】
【0068】
【表4】
【0069】
【表5】
【0070】
逆転写及びリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）は、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ（アブライドバイオシステムズ社製）にて行った。逆転写及びＲＴ-ｑＰＣＲの条件は、表６に示すＲＴ-ｑＰＣＲ条件（１）又はＲＴ-ｑＰＣＲ条件（２）の通りである。
【0071】
【表6】
【0072】
［参考例１］
非特許文献１及び２で用いられたＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーである、ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｆ１と、新たに調製したフォワードプライマーＡＢＬ－Ｆ２、ＡＢＬ－Ｆ３及びＡＢＬ－Ｆ４のＡＢＬ遺伝子について、ゲノム上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅を評価した。
ＡＢＬ遺伝子増幅用リバースプライマーとして、非特許文献１及び２で用いられたＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｒ１を使用した。ＷＴ１遺伝子増幅用フォワードプライマーはＷＴ１－Ｆ１０、ＷＴ１遺伝子増幅用リバースプライマーはＷＴ１－Ｒ１１を使用した。
非特許文献１及び２で用いられたＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーである、ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｆ１と、新たに調製したフォワードプライマーＡＢＬ－Ｆ２、ＡＢＬ－Ｆ３及びＡＢＬ－Ｆ４のＡＢＬ遺伝子について、ゲノム上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅を評価した。
ＡＢＬ遺伝子増幅用リバースプライマーとして、非特許文献１及び２で用いられたＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｒ１を使用した。ＷＴ１遺伝子増幅用フォワードプライマーはＷＴ１－Ｆ１０、ＷＴ１遺伝子増幅用リバースプライマーはＷＴ１－Ｒ１１を使用した。
【0073】
また、ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２より定法に従ってＲＮＡを抽出し、下記表７の通りに蒸留水で希釈した希釈物を調製した。各希釈物について、ＲＴ-ｑＰＣＲ条件（１）でＲＴ－ｑＰＣＲを行い、ＷＴ１遺伝子及びＡＢＬ遺伝子転写物の検量線を作製した。
【0074】
【表7】
【0075】
ゲノムＤＮＡとして、１テスト当たり５０００コピーのＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（ロシュ社、表８中に＃１ゲノムとして示す）を用い、作製した検量線を用いてゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅を定量値として求めた。結果を表８に示す。ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｆ１を用いた場合には７３４コピーが検出された。ＡＢＬ－Ｆ２、ＡＢＬ－Ｆ３及びＡＢＬ－Ｆ４を用いた場合には、それぞれ４９５、４８４及び３９７コピーが検出された。新たに作成したＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーは、ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｆ１と比較して誤増幅の程度は改善されていたが、さらに改善の余地があると考えられた。
【0076】
【表8】
【0077】
［参考例２］
参考例１において、ＲＴ-ｑＰＣＲ条件（１）に代えてＲＴ-ｑＰＣＲ条件（２）としたこと以外は、実験例１と同様にしてゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅を評価した。また、＃１ゲノムの他に、ヒト白血球より定法により抽出したゲノムＤＮＡである１テスト当たり３０００コピーの＃２ゲノム及び１テスト当たり７０００コピーの＃３ゲノムについても、＃１ゲノムと同じ条件でＡＢＬ遺伝子の誤増幅を評価した。＃２ゲノムと＃３ゲノムは別の個人から由来する検体である。結果を表９に示す。
＃１ゲノムの検出結果はいずれのＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いた場合にも参考例１より誤増幅の程度が改善したが、さらに改善の余地があると考えられた。
参考例１において、ＲＴ-ｑＰＣＲ条件（１）に代えてＲＴ-ｑＰＣＲ条件（２）としたこと以外は、実験例１と同様にしてゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅を評価した。また、＃１ゲノムの他に、ヒト白血球より定法により抽出したゲノムＤＮＡである１テスト当たり３０００コピーの＃２ゲノム及び１テスト当たり７０００コピーの＃３ゲノムについても、＃１ゲノムと同じ条件でＡＢＬ遺伝子の誤増幅を評価した。＃２ゲノムと＃３ゲノムは別の個人から由来する検体である。結果を表９に示す。
＃１ゲノムの検出結果はいずれのＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーを用いた場合にも参考例１より誤増幅の程度が改善したが、さらに改善の余地があると考えられた。
【0078】
【表9】
【0079】
［実施例１］
ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーＡＢＬ－Ｆ５、ＡＢＬ－Ｆ６及びＡＢＬ－Ｆ７を作製し、ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｆ１との比較を行った。ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとしてＡＢＬ－Ｆ５、ＡＢＬ－Ｆ６及びＡＢＬ－Ｆ７を用いたこと以外は、参考例２と同様にしてＡＢＬ遺伝子の誤増幅を評価した。
ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーＡＢＬ－Ｆ５、ＡＢＬ－Ｆ６及びＡＢＬ－Ｆ７を作製し、ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｆ１との比較を行った。ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとしてＡＢＬ－Ｆ５、ＡＢＬ－Ｆ６及びＡＢＬ－Ｆ７を用いたこと以外は、参考例２と同様にしてＡＢＬ遺伝子の誤増幅を評価した。
【0080】
結果を表１０に示す。ＡＢＬ－Ｆ５又はＡＢＬ－Ｆ６を用いた場合には、いずれのゲノムＤＮＡを用いた場合にも、ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｆ１、ＡＢＬ－Ｆ２～Ｆ４及びＡＢＬ－Ｆ７と比較して、ゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅が大きく減少した。ＡＢＬ－Ｆ５及びＡＢＬ－Ｆ６では、１テストあたり０～３４コピーとゲノムＤＮＡの誤増幅が少なかった。ＡＢＬ－Ｆ５又はＡＢＬ－Ｆ６をフォワードプライマーとして用いることによって、ゲノムＤＮＡの誤増幅が非常に少なくなることが確認された。
【0081】
【表10】
【0082】
［実施例２］
ＡＢＬ－Ｆ５及びＡＢＬ－Ｆ６の５’側に、ＡＢＬ遺伝子のｃＤＮＡに相補性を有する５塩基又は１０塩基を付加したフォワードプライマーである、ＡＢＬ－Ｆ５＋５ｍｅｒ、ＡＢＬ－Ｆ５＋１０ｍｅｒ、ＡＢＬ－Ｆ６＋５ｍｅｒ及びＡＢＬ－Ｆ６＋１０ｍｅｒを作製した。
ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとしてＡＢＬ－Ｆ５＋１０ｍｅｒ、ＡＢＬ－Ｆ６＋５ｍｅｒ又はＡＢＬ－Ｆ６＋１０ｍｅｒを用いた以外は、参考例２と同様にしてゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅について評価した。
ＡＢＬ－Ｆ５及びＡＢＬ－Ｆ６の５’側に、ＡＢＬ遺伝子のｃＤＮＡに相補性を有する５塩基又は１０塩基を付加したフォワードプライマーである、ＡＢＬ－Ｆ５＋５ｍｅｒ、ＡＢＬ－Ｆ５＋１０ｍｅｒ、ＡＢＬ－Ｆ６＋５ｍｅｒ及びＡＢＬ－Ｆ６＋１０ｍｅｒを作製した。
ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとしてＡＢＬ－Ｆ５＋１０ｍｅｒ、ＡＢＬ－Ｆ６＋５ｍｅｒ又はＡＢＬ－Ｆ６＋１０ｍｅｒを用いた以外は、参考例２と同様にしてゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅について評価した。
【0083】
結果を表１１に示す。いずれのフォワードプライマーを用いてもゲノムＤＮＡの誤増幅は少なかった。この結果から、ゲノムＤＮＡの誤増幅は、ＡＢＬ－Ｆ５又はＡＢＬ－Ｆ６を５’側に延長しても臨床的な使用に十分に少ないコピー数に抑えられることがわかる。
【0084】
ＡＢＬ－Ｆ５及びＡＢＬ－Ｆ６の３’端は、ゲノムＡＢＬ遺伝子と、ｍＲＮＡとの配列が異なる箇所を含んでいる。ＡＢＬ－Ｆ５及びＡＢＬ－Ｆ６の３’側の配列によって、ｍＲＮＡに高い特異性を有する結果となったと考えられる。しかし、ＡＢＬ－Ｆ２、ＡＢＬ－Ｆ３、ＡＢＬ－Ｆ４及びＡＢＬ－Ｆ７も、ゲノムＡＢＬ遺伝子の増幅産物と、ｍＲＮＡの増幅産物との配列が異なる箇所を３’側に含んでいるが、ゲノムＤＮＡの誤増幅はＡＢＬ－Ｆ５及びＡＢＬ－Ｆ６と比較して非常に高い。したがって、詳細な機序は不明であるが、ＡＢＬ－Ｆ５及びＡＢＬ－Ｆ６の３’側の塩基配列がＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡに高い特異性をもたらすと考えられる。
【0085】
【表11】
【0086】
［実施例３］
ＡＢＬ遺伝子増幅用リバースプライマーを、ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｒ１に代えてＡＢＬ－Ｒ９又はＡＢＬ－Ｒ１０を用いた以外は、実施例１と同様にしてゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅について評価した。
ＡＢＬ遺伝子増幅用リバースプライマーを、ＥＡＣ－ＡＢＬ－Ｒ１に代えてＡＢＬ－Ｒ９又はＡＢＬ－Ｒ１０を用いた以外は、実施例１と同様にしてゲノムＤＮＡ上のＡＢＬ遺伝子の誤増幅について評価した。
【0087】
結果を表１２に示す。ＡＢＬ－Ｒ９又はＡＢＬ－Ｒ１０を用いた場合にもゲノムＤＮＡの誤増幅は少なかった。フォワードプライマーがＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡに高い特異性を有することによって、遺伝子増幅が高い感度で行われると考えられる。
【0088】
【表12】
【0089】
［実施例４］
ＷＴ１遺伝子のｍＲＮＡとＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡとを同時に定量するための検量線を作成した。ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとしてＡＢＬ-Ｆ５のみを用いたこと、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として検量線作成用の検量物質を変更したこと、及び、ＷＴ１遺伝子増幅用のプライマーセットを変更したこと、以外は実施例１と同様にＲＴ-ｑＰＣＲを行った。プライマーの組み合わせは、表１３に示す通りセットＡ～Ｃの３通りで試験した。検量線作成用の検量物質は、ＷＴ１遺伝子及びＡＢＬ遺伝子それぞれから転写されたｍＲＮＡをクローニングして得たｃＤＮＡから転写して得られたＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡのクローニングおよびインビトロでの転写は定法に従って行った。ネガティブコントロールとして、検量物質の代わりに蒸留水を用いてＲＴ-ｑＰＣＲを行った。
ＷＴ１遺伝子のｍＲＮＡとＡＢＬ遺伝子のｍＲＮＡとを同時に定量するための検量線を作成した。ＡＢＬ遺伝子増幅用フォワードプライマーとしてＡＢＬ-Ｆ５のみを用いたこと、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として検量線作成用の検量物質を変更したこと、及び、ＷＴ１遺伝子増幅用のプライマーセットを変更したこと、以外は実施例１と同様にＲＴ-ｑＰＣＲを行った。プライマーの組み合わせは、表１３に示す通りセットＡ～Ｃの３通りで試験した。検量線作成用の検量物質は、ＷＴ１遺伝子及びＡＢＬ遺伝子それぞれから転写されたｍＲＮＡをクローニングして得たｃＤＮＡから転写して得られたＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡのクローニングおよびインビトロでの転写は定法に従って行った。ネガティブコントロールとして、検量物質の代わりに蒸留水を用いてＲＴ-ｑＰＣＲを行った。
【0090】
検量物質に含有されるＷＴ１遺伝子ｍＲＮＡ及びＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡそれぞれのコピー数、及び、セットＡ～Ｃを用いたＲＴ-ｑＰＣＲの結果として得られた各検量点でのＣｔ値を表１４に示す。セットＡ～Ｃにより作成した検量線を図１Ａ～図１Ｃにそれぞれ示す。
【0091】
【表13】
【0092】
【表14】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【配列表】