特許 7032756 有機酸分解方法、新規な有機酸分解微生物及びコンポスト製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-01

(45)【発行日】2022-03-09

(54)【発明の名称】有機酸分解方法、新規な有機酸分解微生物及びコンポスト製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220302BHJP

   C05F 17/20 20200101ALI20220302BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 F ZNA

C12N1/20 A

C05F17/20

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2018048112

(22)【出願日】2018-03-15

(65)【公開番号】P2019154366

(43)【公開日】2019-09-19

【審査請求日】2021-01-29

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-02597

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-02598

(73)【特許権者】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(73)【特許権者】

【識別番号】511133679

【氏名又は名称】山梨罐詰株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100081271

【弁理士】

【氏名又は名称】吉田 芳春

(74)【代理人】

【識別番号】100162189

【弁理士】

【氏名又は名称】堀越 真弓

(72)【発明者】

【氏名】中崎 清彦

(72)【発明者】

【氏名】山梨 裕一郎

【審査官】北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】特開平７－２４６３８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－２３０３０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】廃棄物資源循環学会論文誌，2011年，Vol.22, No.2, pp.141-148

【文献】Extremophiles，2006年，Vol.10, pp.363-372

【文献】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2017年，Vol.67, No.11, pp.4830-4835，<http://dx.doi.org/10.1099/ijsem.0.002391>

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８

Ｃ０５Ｆ １７／００－１７／９９３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲオバチルス ｓｐ．（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）又はエアリバチルス ｓｐ．（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）を用いて、有機酸を分解することを特徴とする有機酸分解方法。

【請求項2】

前記有機酸の分解は、５０℃以上の温度条件下で行われることを特徴とする請求項１に記載の有機酸分解方法。

【請求項3】

前記有機酸が、酢酸、プロピオン酸、酪酸及び乳酸からなる群より選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の有機酸分解方法。

【請求項4】

ゲオバチルス ｓｐ．（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）又はエアリバチルス ｓｐ．（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）。

【請求項5】

有機物にゲオバチルス ｓｐ．（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）又はエアリバチルス ｓｐ．（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）を接種し、５０℃以上の温度条件下で好気性発酵を行う工程を有することを特徴とするコンポスト製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、有機酸を分解する方法、有機酸を分解することができる新規微生物及び当該微生物を用いたコンポスト製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生活様式が大量生産、大量消費、大量廃棄に変化することにより廃棄物の増加が大きな問題となっている。日本では廃棄物の多くが最終的に埋め立てられて処理されているが、埋め立て用地の不足への懸念から廃棄物の資源化が求められている。廃棄物の中でも、家庭やレストラン、食品加工工場などから廃棄される食品廃棄物は、重金属等の有害な物質を含まない有機物であることから、コンポスト（堆肥）化することにより農業利用への資源化が可能である。そのため、コンポスト化は食品廃棄物リサイクルのための重要な技術として注目を集めている。

【0003】

しかしながら、コンポスト化は現在まで普及とは程遠い状況が続いている。この原因の１つに、コンポストを製造するのに長時間がかかることが挙げられる。食品廃棄物からなるコンポストは、微生物の好気性発酵により食品廃棄物を分解することにより得られるが、通常の自然発酵方式での食品廃棄物のコンポスト化は３ヵ月程度を要する（特許文献１参照）。そのため、特許文献１では、食品廃棄物に微生物を含む戻し堆肥及び水を加えて撹拌し、所定の大きさに造粒することで、有機物の分解速度を増加させて効率的にコンポストを生産する方法が記載されている。

【0004】

他方、自然発酵方式での食品廃棄物のコンポスト化に長時間を要する主な原因として、有機酸の影響があることが確認されている（非特許文献１～３参照）。食品廃棄物では、その回収時若しくはコンポスト化の初期に高濃度の酢酸や乳酸等の有機酸が生成してｐＨが低下すること、及びコンポスト化における有機物の分解に伴い有機酸が生成してｐＨが低下する現象が生じるために、その都度コンポスト化微生物の活性が阻害され、それゆえ、コンポスト化に長い時間がかかる、というものである。このため、コンポスト化にかかる時間を短縮する目的で、コンポスト原料中のｐＨの低下を抑制する様々な方法が試みられてきた。

【0005】

そこで、非特許文献１～３では、それぞれ水酸化カルシウム、石炭と石灰または酢酸ナトリウムのようなアルカリ性を呈する物質をコンポスト原料中に添加することで、ｐＨの低下を防ぎ、コンポスト化を促進する方法が記載されている。しかしながら、アルカリ性の化学物質を添加する方法は、コストがかかることに加え、コンポスト製造時に化学物質を用いることで、そのコンポストを用いて栽培した野菜が有機栽培の条件を満たせなくなってしまうという問題もある。

【0006】

そこで、有機酸を分解する微生物を利用して、コンポスト化の過程におけるｐＨを調整する技術が注目されるようになっている。例えば、非特許文献４には、食品残渣のコンポスト化にあたり、酵母のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ Ｙ６０株をコンポスト原料に接種することにより、コンポスト原料中の有機酸が分解され、コンポスト化が促進されたことが記載されている。また、非特許文献５には、コンポスト原料に酵母であるＰｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ ＲＢ１株を接種することにより、コンポスト原料中の有機酸が分解され、それに伴って有機物分解の促進効果が確認されたことが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特許第４７８２５９５号公報

【非特許文献】

【0008】

【文献】Process Biochem.，１９７１年，Vol.6，p.32-36

【文献】Bioresour. Technol.，２００９年，Vol.100，p.3324-3331

【文献】Bioresour. Technol.，２００９年，Vol.100，p.2005-2011

【文献】Lett. Appl. Microbiol.，１９９８年，Vol.26，p.175-178

【文献】Bioresour. Technol.，２０１３年，Vol.144，p.521-528

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、非特許文献４及び非特許文献５で開示された有機酸を分解する微生物は、いずれも生育温度が３０℃程度である酵母に属しており、好熱性微生物ではないため、コンポスト化の過程において有機物分解が活発に行われる６０℃付近の高温環境下では死滅してしまう。それゆえ、コンポスト化の初期（コンポスト開始時～昇温期前まで）においては、上述した酵母等の有機酸分解微生物が有機酸の分解を行うため、コンポスト原料中に元から存在する有機酸は分解されるものの、コンポスト化が促進され、有機物分解が活発に生じる高温期においては、有機物分解に伴って生成する有機酸を分解してｐＨの低下を抑制し、高温期の活発な有機物分解を維持することは困難であった。

【0010】

本発明は上述した点に鑑み案出されたもので、その目的は、コンポスト化過程における高温期の環境、すなわち、高温かつ好気の条件下で有機酸を活発に分解する新規な微生物を提供すること、並びにこの新規な微生物を用いて有機酸を活発に分解する方法及び有機物分解を促進させて効率的にコンポストを製造する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記課題を解決するため、本発明の有機酸の分解方法は、ゲオバチルス ｓｐ．（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）又はエアリバチルス ｓｐ．（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）を用いて、有機酸を分解するものである。

【0012】

ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）は、好気性の高温耐性を有する好熱菌であり、５０℃以上の高温環境下であっても生育が阻害されず、有機酸を分解する能力を有した微生物である。そのため、好気かつ高温条件下においても、これらの微生物は活発に活動し、有機酸を迅速に分解することができる。

【0013】

また、本発明において、有機酸の分解は、５０℃以上の温度条件下で行われることも好ましい。これにより、好熱性細菌であるゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株の好適な培養温度が選択される。

【0014】

また、本発明の有機酸分解方法における有機酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸及び乳酸からなる群より選ばれる１種以上の化合物であることも好ましい。ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株が分解する有機酸として好適なものが選択される。

【0015】

また、本発明にかかる有機酸を分解する微生物は、ゲオバチルス ｓｐ．（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）又はエアリバチルス ｓｐ．（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）である。

【0016】

また、本発明のコンポスト製造方法は、有機物にゲオバチルス ｓｐ．（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）又はエアリバチルス ｓｐ．（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）を接種し、５０℃以上の温度条件下で好気性発酵を行う工程を有している。

【0017】

コンポスト化の過程においてコンポスト化微生物により有機物が分解されると有機酸が生じるが、ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株をコンポスト原料である有機物に接種しておくことによって、生じた有機酸が速やかにゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株により分解される。そのため、コンポスト環境中のｐＨの低下が抑制され、コンポスト化微生物の活発な活動が維持される。ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株は好気性の好熱菌であるため、有機物が活発に分解され、高温の発酵熱が生じている温度条件下においても活発に活動することができる。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、以下のような優れた効果を有する有機酸分解方法、有機酸分解微生物及びコンポスト製造方法を提供することができる。
（１）有機酸分解能を備えた新規な微生物により、高温かつ好気の条件下で有機酸を効率的に分解することができる。
（２）有機物の分解により生成した酢酸等の有機酸を効率的に分解することができるため、環境中のｐＨの低下が抑制され、有機物を分解するコンポスト化微生物の活動が維持される。それゆえ、有機物分解が迅速に進行し、コンポスト化期間が短縮され、コンポスト製造を効率良く行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】実施例１におけるＲｕｎ Ａ（破線）及びＲｕｎ Ｂ（実線）の装置内温度の経時変化を示すグラフである。

【図2】実施例１におけるＲｕｎ Ａ（破線）及びＲｕｎ Ｂ（実線）のｐＨの経時変化を示すグラフである。

【図3】実施例１におけるＲｕｎ Ａ（破線）及びＲｕｎ Ｂ（実線）の有機酸濃度の経時変化を示すグラフである。菱形のマーカーは酢酸（ＡＡ）、四角形のマーカーは乳酸（ＬＡ）、三角形のマーカーはプロピオン酸（ＰＡ）、丸形のマーカーは酪酸（ＢＡ）を示す。

【図4】実施例１におけるＲｕｎ Ａ（破線）及びＲｕｎ Ｂ（実線）の微生物濃度の経時変化を示すグラフである。三角形のマーカーは酵母、丸形のマーカーは常温性細菌、四角形のマーカーは好熱性細菌を示す。

【図5】実施例１におけるＲｕｎ Ａ（破線）及びＲｕｎ Ｂ（実線）の炭酸ガス発生速度の経時変化を示すグラフである。

【図6】実施例２における（ａ）Ｒｕｎ Ａの微生物叢の変化を示すグラフ、及び（ｂ）Ｒｕｎ Ｂの微生物叢の変化を示すグラフである。

【図7】実施例３における（ａ）ＡＤ５（ＡＤ１～ＡＤ７）株のＢＬＡＳＴ解析結果を示す図、及び（ｂ）ＡＤ８株のＢＬＡＳＴ解析結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明の有機酸分解方法は、有機酸分解能を有するゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）を用いて、有機酸分解することにより行われる。本発明者らは後述する実施例に示すように、さまざまな条件下でコンポスト化試験を行ったところ、５０℃～７０℃の高温環境下において、コンポスト原料中の有機酸濃度が低下してｐＨが上昇し、有機物分解が促進されて炭酸ガスの発生が活発に行われる試験区（後述する実施例１のＲｕｎ Ｂ参照）があることを発見した。この試験区のコンポスト試料から高温かつ好気条件下で有機酸の分解能を有するゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株が単離された。

【0021】

ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）の培養温度は５０℃以上が好ましく、５０℃～８０℃がより好ましく、６０℃～７０℃が特に好ましい。このような培養条件でゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株を培養することにより好熱性微生物であるこれらの菌が増殖し、培養環境中に存在する有機酸が分解される。

【0022】

また、有機酸の分解にあたっては、あらかじめ培養・増殖させた相当量のゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株の培養物、芽胞等を有機酸を含む分解対象物中に添加してもよい。ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株はいずれもＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科に属する微生物であり、ＴＳ液体培地（（トリプチケースペプトン１７ｇ／Ｌ、ファイトンペプトン３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２．５ｇ／Ｌ、Ｄ－グルコース２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．３）やＴＳ寒天培地（ＴＳ液体培地に寒天２０ｇ／Ｌを加えたもの）で好適に培養され、増殖される。

【0023】

ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株が分解する有機酸としては、特に限定されないが、一例としてギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、乳酸、コハク酸、オキサロ酢酸、マロン酸、フマル酸等が挙げられる。これらの有機酸は、コンポスト製造時において、食品残渣等のコンポスト原料がコンポスト化微生物により、有機物分解されることにより生成する。そのため、ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株をコンポスト製造時における有機酸の分解に用いることができる。

【0024】

次に、ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株を用いたコンポスト製造方法について説明する。食品残渣等の主に食品廃棄物からなるコンポスト原料に対し、ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株を接種し、好気性発酵を行う工程について説明する。接種にあたっては、ゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株もしくはエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株のいずれか、またはこれらを組み合わせて接種してもよい。あらかじめ培養・増殖させた相当量のゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株の培養物又は芽胞等をコンポスト原料に添加し、混合することにより容易に接種することができる。接種後、コンポスト化温度は５０℃以上が好ましく、５０℃～８０℃がより好ましく、６０℃～７０℃とすることが特に好ましい。このような培養条件でゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株を培養することにより、これらの微生物がコンポスト環境中に増殖する。

【0025】

コンポスト化が開始すると、コンポスト化初期には環境温度は室温程度であるため、コンポスト原料中に元々存在する常温菌の有機酸分解微生物、あるいは、コンポスト原料に別途接種されたＰｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ ＲＢ１株のような有機酸分解微生物（いずれも高温では生育できない微生物）によって、コンポスト原料中に元から含まれる有機酸が分解されるが、これにともなって、有機物分解を担うコンポスト化微生物が活性化され、コンポスト化温度は次第に上昇し昇温期を経て高温期となるため、高温で生育できないこれらの有機酸分解微生物は死滅する。また、有機物を分解するコンポスト化微生物に好適な培養環境である好気かつ高温条件下では、有機物の活発な分解が起こると同時に有機酸が大量に生産されるが、本発明では、高温かつ好気の条件で生育可能なゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株又はエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株がコンポスト原料中に接種されているので、これらの微生物が、高温条件下において生産された有機酸を活発に分解し、有機酸の蓄積を防ぐ。それゆえ、コンポスト環境中のｐＨの低下が抑制され、有機物を分解する微生物の活発な活動も維持され、コンポスト化が効率的に進行する。コンポスト化期間は、３日～２１日程度とすることが好ましく、５日～１４日間程度とすることが好ましい。

【0026】

上述したコンポスト製造方法により、微生物が活発に有機物分解を行う高温期が維持され、通常、３ヶ月間程度要していた有機物のコンポスト化を２週間以下程度に短縮することができる。また、高温での発酵期間が安定して得られるため、発酵が充分に行われ、コンポスト製品のばらつきを低減できるという効果を有する。

【0027】

本発明の有機酸分解能を有するゲオバチルス ｓｐ．ＡＤ５株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７）及びエアリバチルス ｓｐ．ＡＤ８株（ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８）は、上述したようなコンポスト化の際に使用されるだけでなく、あらゆる目的での有機酸の分解の際にも使用され得る。特に限定されないが、例えば、工場排水中に含まれる有機酸を分解するような場合にも好適に使用することが可能である。

【実施例】

【0028】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に特に限定されるものではない。

【0029】

［実施例１］
１．コンポスト混合原料のコンポスト化
本実施例で使用したコンポスト原料及びコンポスト混合原料は下記の通りである。
（コンポスト原料）
コンポスト原料としては、一般的にはさまざまな食品残渣や食品廃棄物が用いられるが、本実施例においては、再現性のあるデータを得るために、モデル的な食品残渣として市販のラビットフード（ラビットフード チモシー、イースター株式会社製品）と米飯（サトウのごはん、佐藤食品工業株式会社製品）を用いた。各材料中に含まれる炭素の元素含有率は、ラビットフードが４４．０％、米飯が４３．２％であり、窒素の元素含有率はラビットフードが２．４％、米飯が０．８９％であった。Ｃ／Ｎ比はラビットフードが１８．１、米飯が４８．５であった。

【0030】

（コンポスト混合原料）
上述したコンポスト原料であるラビットフードと米飯を乾燥重量比で７：３に混合した。このラビットフードと米飯からなる原料と、通気性改良材であるおがくずと、種菌として市販の微生物資材（オーレスＧ、株式会社松本微生物研究所）とを、乾燥重量比で１０：９：１に混合し、コンポスト混合原料とした。微生物資材中の常温性および好熱性細菌濃度はそれぞれ１．２８×１０^６ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ、３．９８×１０^４ＣＦＵ／ｇ－ｄｓであった。これに、有機酸を分解可能な酵母Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ ＲＢ１株（非特許文献５参照）をコンポスト混合原料中で１０^５ＣＦＵ／ｇ－ｄｓとなるように接種した。通常、家庭や飲食店、食品加工工場などから排出された食品残渣は、コンポスト化されるまでに酸敗が進んで多くの有機酸が含まれているため、ｐＨが低くなっている。本実施例では、Ｓｕｎｄｂｅｒｇらの文献（Bioresour. Technol.，２０１１年，Vol.102，p.2859-2867）の記載を参考にして、４種類の有機酸、具体的には、酢酸を２．９０ｇ／ｋｇ－ｄｓ、プロピオン酸を３．０２ｇ／ｋｇ－ｄｓ、酪酸を２．４３ｇ／ｋｇ－ｄｓ、乳酸を１２．４５ｇ／ｋｇ－ｄｓの濃度になるようにコンポスト混合原料に添加した。これらの有機酸を添加した後のコンポスト混合原料のｐＨは５．０付近と、一般的な食品残渣のｐＨの値と同等になった。また、コンポスト化開始時には、蒸留水を加えてコンポスト混合原料の含水率が６０％になるように調整した。

【0031】

（コンポスト化）
コンポスト化にあたっては、研究室規模のコンポスト化装置（円筒形、容積約３０Ｌ）を用いた。コンポスト混合原料を収容する装置本体は、耐熱性のポリ塩化ビニルで形成されており、装置本体には装置内温度を調節するためのリボンヒータが巻き付けられ、発泡スチロールからなる断熱材に埋設されている。装置にコンポスト混合原料を湿重量で約３ｋｇ投入し、底部より通気しながらコンポスト化を行った。コンポスト化にあたってはＲｕｎ ＡとＲｕｎ Ｂの２つのコンポスト条件にて試験を行った。Ｒｕｎ Ａは有機物分解に伴う昇温過程を制御せずにコンポスト化を行うものであり、Ｒｕｎ Ｂは昇温過程において、いったん４０℃に装置内温度を制御し、コンポスト混合原料中に含まれる酵母Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ ＲＢ１株での有機酸分解を促した後に６０℃に昇温させてコンポスト化を行うものである。

【0032】

具体的に、Ｒｕｎ Ａでは、コンポスト化開始時の装置温度は室温（２５℃付近）とし、通気流量は好気条件を維持するために最低限必要である４５Ｌ／ｈに調整した。微生物の有機物分解にともなう自己発熱によってコンポスト内部の温度が上昇し、６０℃に達した後は自己発熱と外部加熱の調整によって６０℃に制御した。コンポスト化期間は１０日間とした。一方、Ｒｕｎ Ｂでは、コンポスト化開始時の装置温度は室温（２５℃付近）とし、通気流量は４５Ｌ／ｈに調整した。コンポスト内部の温度が上昇する昇温過程で４０℃に達した時に、通気量を増加させてコンポスト内部を冷却しながら２４時間４０℃を維持し、コンポスト混合原料中に含まれる酵母Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ ＲＢ１株での有機酸分解を促した。その後、通気量を４５Ｌ／ｈに戻してコンポスト内部の温度を６０℃に昇温させ、自己発熱と外部加熱の調整によって６０℃に制御した。コンポスト化期間は１０日間とした。

【0033】

コンポスト化過程における均一な有機物分解のために、コンポスト化期間中は１日に１度、装置のふたを開け、装置内部のコンポスト混合原料を混合攪拌する切り返しの操作をおこなった。切り返し時には、コンポスト化物の含水量が低下し過ぎないように、適宜蒸留水を添加した。また、切り返し時には、分析試料としてコンポスト試料を約１５ｇずつ採取した。

【0034】

また、本実施例で行ったコンポスト試料のｐＨ、含水率、有機酸濃度、微生物濃度及びコンポスト化における炭酸ガス発生速度の測定は以下のように行った。

【0035】

（１）ｐＨ
採取した２ｇのコンポスト試料をホモジナイズカップの中に取り、滅菌水を１８ｇ加えて、１００００ｒｐｍで１０分間、ホモジナイザー（株式会社日本精機製作所製品、製品名：ＡＭ－５）で均一な懸濁液にした。懸濁液のｐＨをｐＨメータ（株式会社堀場製作所製品、製品名：Ｄ－５１）で測定した。

【0036】

（２）含水率
約１ｇのコンポスト試料を３つの秤量瓶にそれぞれ採取して秤量した後、定温乾燥機（ヤマト科学株式会社製品、製品名；ＤＳ－６００）で２４時間、１０５℃で乾燥させた。乾燥後のコンポスト試料の重量を測定し、乾燥後の減少重量を乾燥前の重量で除した値を含水率として求めた。

【0037】

（３）有機酸濃度
上記ｐＨ測定の際に作成した試料の懸濁液を０．２０μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過し、ろ液を得た。このろ液中に含まれる有機酸について、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ；日本分光株式会社製品、ＣｈｒｏｍＮＡＶ）により分析を行った。カラムにはＳＵＧＡＲ ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製品）を用い、カラム温度は５０℃とした。ＨＰＬＣの移動相には、脱気した５ｍＭの硫酸水溶液を用い、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。ＨＰＬＣの検出器は日本分光株式会社製品、型番；ＵＶ－２０７５を用い、検出波長は２１０ｎｍとした。

【0038】

（４）微生物濃度
コンポスト試料中の酵母、常温性細菌及び好熱性細菌の濃度は寒天培地を用いた希釈平板法で求めた。採取したコンポスト試料２ｇに９倍量の滅菌水を加え１００００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズ処理したものを適宜希釈して培地上に塗抹した。酵母濃度の測定にはＰＤ寒天培地（栄研化学株式会社製品）を用い、培養温度３０℃、培養期間３日間とした。なお、細菌の増殖を抑制するために、１ｍＬのクロラムフェニコール溶液（クロラムフェニコール１００ｍｇをエタノール１ｍＬに溶解）を１ＬのＰＤ寒天培地に加えた。常温性細菌及び好熱性細菌濃度の測定には、ＴＳ寒天培地（トリプチケースペプトン１７ｇ／Ｌ、ファイトンペプトン３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２．５ｇ／Ｌ、Ｄ－グルコース２．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．３）を用い、培養温度は常温性細菌が３０℃、好熱性細菌が６０℃、培養期間は３日間とした。なお、常温性細菌を計測するときには、糸状菌の増殖を抑制するため、１００μＬのアンホテリシンＢ溶液（アンホテリシンＢ２５ｍｇをジメチルスルホキシド１ｍＬに溶解）を１ＬのＴＳ寒天培地に加えた。菌体濃度は、コンポスト試料の乾燥重量１ｇ当たりのコロニー形成数であるＣＦＵ／ｇ－ｄｓで表した。

【0039】

（５）炭酸ガス発生速度
コンポスト化における有機物分解の速度は、有機物が分解されると炭酸ガスが生成することから、コンポスト化に伴って生成した炭酸ガス量を測定し、炭酸ガス発生速度（単位時間及び単位コンポスト試料の乾燥重量あたりの炭酸ガスの発生量；ｍｏｌ／ｈ／ｇ－ｄｓ）として定量した。炭酸ガス発生速度は、排気ガス中の炭酸ガス濃度を赤外線ガス分析装置（理研計器株式会社製品、型式；ＲＩ－５５５）で測定し、通気速度をガスメーター（株式会社シナガワ製品、型式；ＤＣ－２）で連続的に測定して算出した。また、有機物分解量は、食品残渣中の炭素量に対して炭酸ガスとして失われた炭素量の比と定義した炭素変化率で定量した。

【0040】

コンポスト化開始後、装置内の温度を測定した。また、分析試料として採取したコンポスト試料を用いてｐＨ、含水率、有機酸濃度及び微生物濃度を測定した。加えて、コンポスト化に伴って生成した炭酸ガス量を測定し、単位時間あたりの炭酸ガス発生速度を求めた。これらの結果を図１～５にそれぞれ示す。横軸はコンポスト化開始後のコンポスト化日数（日）を示している。Ｒｕｎ Ａ（破線）は有機物分解に伴う昇温過程を制御せずにコンポスト化を行った試験条件での結果を示しており、Ｒｕｎ Ｂ（実線）は、昇温過程において、いったん装置内温度を４０℃で２４時間維持し、コンポスト混合原料中に含まれる酵母Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ ＲＢ１株での有機酸分解を促した後に６０℃に昇温させてコンポスト化を行った試験条件での結果を示している。

【0041】

図１に装置内温度の経時変化を示す。Ｒｕｎ Ａでは、最初に温度が３０℃以上に上昇し、一旦、低下した後に５３℃付近に達した。その後、再び室温にまで低下したが、試験開始から５日過ぎには６０℃となり、以降は外部加熱により６０℃を維持した。一方、Ｒｕｎ Ｂでは、昇温期に４０℃に達した後は通気流量を増加させて冷却することにより、２４時間、４０℃の状態が維持された。その後、通気流量を４５Ｌ／ｈに戻すと、試験開始から４日までに６０℃となり、それ以降は、自己発熱と外部加熱を組み合わせることにより６０℃を維持した。

【0042】

図２にｐＨの経時変化を示す。Ｒｕｎ Ａ、Ｒｕｎ Ｂのいずれの試験条件におけるコンポスト化においてもｐＨはすみやかに５から６．５付近まで上昇し、試験開始から２日後までその値を保った。その後、Ｒｕｎ ＡではｐＨは約４．５まで低下し、５日付近で一旦僅かに上昇するものの、再び低下して５付近の低いｐＨをコンポスト化終了まで維持した。一方、Ｒｕｎ ＢではｐＨは試験開始から３日後に５．３付近に低下した後、６日付近から徐々に上昇し、最終的には約８．５という高い値を示した。この結果によれば、Ｒｕｎ ＢではｐＨが最終的に弱アルカリ性を示すことから、有機酸が分解されるだけでなく、タンパク質の分解によってアルカリ性物質であるアンモニアが生成した、すなわち、タンパク質の分解が活発に行われたと考えられる。以上の結果、昇温期に４０℃の温度制御を行ったＲｕｎ Ｂと温度制御しないＲｕｎ Ａとでは、ｐＨの変化に大きな差が生じ、Ｒｕｎ Ｂの方がタンパク質分解が活発に行われたことがわかった。なお、Ｒｕｎ Ａ、Ｒｕｎ Ｂのいずれのコンポスト化においても、コンポスト化物の含水率は６０％付近を維持しており、コンポスト化において、活発な有機物分解がおこる条件を満たしていた。

【0043】

図３に有機酸濃度の経時変化を示す。Ｒｕｎ Ａ、Ｒｕｎ Ｂのいずれの試験条件におけるコンポスト化においても、コンポスト混合原料中の酢酸（ＡＡ）、乳酸（ＬＡ）、プロピオン酸（ＰＡ）及び酪酸（ＢＡ）はコンポスト化開始後直ちに分解された。しかしながら、Ｒｕｎ Ａでは試験開始から３日後に２４ｇ／ｋｇ－ｄｓの酢酸が蓄積した。これは有機物が分解することにより炭酸ガスが発生するだけでなく、分解中間体である酢酸の一部が、炭酸ガスにまで分解されずに蓄積したものと考えられる。その後、Ｒｕｎ Ａに含まれる酢酸は試験開始から５日目には一旦減少したが、その後、再び２０～２５ｇ／ｋｇ－ｄｓの高濃度の酢酸が蓄積した。一方、Ｒｕｎ Ｂでは、Ｒｕｎ Ａと比べて、試験開始４日後まで酢酸濃度は低い値に維持された。これは、昇温過程において、ＲＢ１株の活性に適した４０℃付近に装置内温度が維持された結果、ＲＢ１株が酢酸を分解し、酢酸濃度が低く抑えられたものと考えられる。その後、Ｒｕｎ Ｂでは、装置内温度が６０℃に達すると酵母であるＲＢ１株は活性を失うため、酢酸が徐々に蓄積し、酢酸濃度は約１５ｇ／ｋｇ－ｄｓに上昇するが、試験開始６日を過ぎる頃から再び酢酸の活発な分解が始まり、最終的には酢酸を含めたすべての有機酸は分解され、有機酸はまったく残存しなかった。

【0044】

図４に微生物（酵母、常温性細菌、好熱性細菌）の濃度の経時変化を示す。Ｒｕｎ Ａ、Ｒｕｎ Ｂのいずれの試験条件におけるコンポスト化においても、酵母は速やかに増殖し酵母濃度は１０^９ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ以上に達した。なお、酵母の計数に用いた培地は真菌用の培地であるが、出現するコロニーのほとんどはＰｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ ＲＢ１株であることが確認された。その後、Ｒｕｎ ＡではＲＢ１株は減少・増加と濃度が変化するが、高温では生存できないために、温度が６０℃に維持された６日以降には濃度が検出限界以下にまで低下した。他方、Ｒｕｎ Ｂでは昇温期の装置内温度を４０℃に維持したため、高濃度を数日維持した後、温度が６０℃に達した試験開始４日以降に検出限界以下にまで濃度が低下した。常温性細菌については、Ｒｕｎ Ａでは１０^８ＣＦＵ／ｇ－ｄｓにまで増殖した後、一定値を保ったが、Ｒｕｎ Ｂでは１０^９ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ付近まで増殖し、Ｒｕｎ Ａに比べて高い最終濃度を示した。また、好熱性細菌についても、４０℃での温度制御を行ったＲｕｎ Ｂの方が温度制御を行わなかったＲｕｎ Ａよりも一桁高い濃度となった。これらの微生物濃度の差は、Ｒｕｎ ＢがＲｕｎ Ａに比べて有機物分解が促進されたことに対応している。また、Ｒｕｎ Ａ及びＲｕｎ Ｂの両方ともに試験後半には、常温性細菌及び好熱性細菌の濃度の変化は少なくなり、微生物濃度は略一定となった。

【0045】

図５に炭酸ガス発生速度の経時変化を示す。Ｒｕｎ ＡとＲｕｎ Ｂのいずれについても、まず、コンポスト混合原料に含まれる有機酸の分解に対応すると考えられる炭酸ガス発生速度のピークが観察された。Ｒｕｎ Ａでは、続いて試験開始２日過ぎから炭酸ガス発生速度の第２のピークが観察されたが、ピーク形状はシャープであり、炭酸ガスの発生は長期に亘って継続しなかった。なお、このとき、Ｒｕｎ Ａではこの第２のピークに対応する温度上昇のピークが観察された（図１参照）。その後、試験開始５日付近で、炭酸ガス発生速度の第３のピークが観察されたが、この第３のピークも、図１に示すＲｕｎ Ａの５日目の温度の急激な上昇に対応していることがわかった。この結果は、有機物が活発に分解された際に発生した代謝熱が蓄積し、温度が上昇するためと考えられる。他方、Ｒｕｎ Ｂでは、第２のピークがブロードとなっている。このことは、昇温期に酵母ＲＢ１株の活性に適した４０℃を維持することで有機酸の分解が継続され、コンポスト化物中のＲＢ１株以外の微生物の活性も高められ、有機物分解が進んだことを示している。その後、炭酸ガス発生速度は減少したが、Ｒｕｎ Ｂでは試験開始から７日以降になると再び炭酸ガス発生速度が増加し、第３のピークが観察された。この結果は、７日より前に、好熱性微生物による活発な有機物分解のための環境が整ったことを表している。

【0046】

図１～５に示すデータを総合的に分析すると、Ｒｕｎ Ａでは、まず、コンポスト混合原料中の有機酸が酵母ＲＢ１株により分解されるため、有機酸濃度は低下し、ｐＨは上昇し、炭酸ガスが発生している。ｐＨが上昇するとコンポスト化物中に含まれるＲＢ１株以外の他の微生物の活性も上昇するため、有機物分解が進み、試験開始から２日後には、炭酸ガス発生速度も大きくなると共に有機物分解の中間体である有機酸が生成している。ここで有機酸が蓄積するとｐＨは低下し、微生物（酵母ＲＢ１株及び他の微生物）の活性も低下するため、炭酸ガス発生速度も低下している。これにより、発熱量が減少し、温度が低下するため、生き残っていたＲＢ１株が再び増殖することができるようになり、それゆえ、蓄積されていた有機酸が分解され、ｐＨがわずかに上昇したものと考えられる。ｐＨが上昇すると再び炭酸ガスも発生するようになるため、代謝熱が生成され、温度は上昇して６０℃に達している。有機物分解が進むと、有機酸と炭酸ガスの生成が進行するが、６０℃もの高温条件下のためＲＢ１株は死滅しており、また、有機酸の蓄積によりｐＨは低下するので、微生物全体の活性も低下して、炭酸ガスは全く発生しなくなっている。そして、このとき代謝熱はほとんど発生していないが、温度は外部加熱で維持されているため６０℃が保たれている。

【0047】

一方、Ｒｕｎ Ｂでは、まず、コンポスト混合原料中の有機酸が酵母ＲＢ１株により分解されるため、有機酸濃度は低下し、ｐＨは上昇し、炭酸ガスが発生している。試験開始から２日目以降には有機物分解の中間体である有機酸も生成するが、装置内温度を４０℃に維持している間に酵母ＲＢ１株が有機酸を分解するため、炭酸ガスはＲｕｎ Ａに比べて多く発生している。装置内の４０℃の温度制御が終了すると代謝熱の蓄積によって、装置内温度は徐々に昇温し、試験開始４日目には６０℃まで達するが、６０℃では酵母ＲＢ１株が死滅するため、有機酸が徐々に蓄積し、ｐＨも低下し、微生物全体の活性が阻害されて、炭酸ガス発生速度は極めて小さくなっている。しかしながら、装置内温度が６０℃に維持されている試験開始から６日目以降に有機酸の分解が開始し、ｐＨも併せて上昇し、炭酸ガスも大量に発生している。この一連のＲｕｎ Ｂの結果は、４０℃での温度制御を行うことで有機酸の蓄積量を低減させ、有機物分解を促進できることを示している。また、さらに重要なこととして、好気条件で６０℃もの高温条件に維持されているコンポスト化において、有機酸の分解が行われたことが挙げられる。このことは、高温かつ好気条件下で有機酸を分解する微生物が存在することを意味している。酵母ＲＢ１株のように、常温の条件で有機酸を分解する微生物は存在が確認されており、高温かつ嫌気条件下でのメタン発酵において、脂肪酸を分解してメタンを生成する微生物が存在することも知られている。しかしながら、これまで、高温かつ好気条件下のコンポスト化の過程で、有機酸を活発に分解できる微生物の存在は知られていなかった。そこで以下実施例２及び３において、Ｒｕｎ Ｂで確認された有機酸を分解する微生物の解析及び単離を試みた。

【0048】

［実施例２］
２．コンポスト試料中の微生物叢の解析
実施例１におけるコンポスト混合原料のコンポスト化の過程における微生物叢の変化を、次世代シーケンシング（Next Generation Sequencing，ＮＧＳ）の方法により解析した。実施例１において、コンポスト混合原料の切り返しの際に、分析試料として装置内部から採取したコンポスト試料０．２ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ISOIL for Beads Beating；株式会社ニッポンジーン）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部（Ｖ３、Ｖ４領域を含む遺伝子領域）をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲには、ホットスタートＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq（登録商標） Hot Start Version、ＲＲ００６Ａ；タカラバイオ株式会社）を用い、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Standard、ＴＰ６００；タカラバイオ株式会社）にて行った。ＰＣＲ試薬の組成、プライマーの配列と増幅条件をそれぞれ表１および表２に示す。なお、表２の各プライマー配列のうちの下線部は各サンプルを識別するインデックス付与のための配列であり、下線部以外の配列が原核生物１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ３、Ｖ４領域を含む遺伝子領域に対応している。各ＰＣＲ産物について、１．０×Ｔｒｉｓ－ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アガロースゲル（寒天濃度２％）電気泳動を行い、目的配列である原核生物１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ３、Ｖ４領域を含む遺伝子領域が増幅されたことを確認した。

【0049】

【表1】

【0050】

【表2】

【0051】

各ＰＣＲ産物は、ＤＮＡ精製キット（Agencourt AMPure XP；ベックマン・コールター株式会社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対し、Nextera XT Index kit（イルミナ株式会社）及びＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq（登録商標） Hot Start Version；タカラバイオ株式会社）を用いて多サンプル解析のためのインデックスを付与した。インデックス付与のための試薬の組成を表３に示す。また、インデックス付与のためのＰＣＲ条件は表２に示したＰＣＲ条件と同じとした。その後、インデックスを付与したＤＮＡ断片を精製し、塩基配列を決定した。

【0052】

【表3】

【0053】

得られた塩基配列データの解析は、データ解析ツールであるＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ（ＱＩＩＭＥ） ｖｅｒ １．９．１（Caporaso et al.，Nature Methods，２０１０年，Vol.7，p.335-336）を用いて行った。アダプター配列を取り除き、フォワードとリバースそれぞれのプライマーから読み取った約３００塩基の配列をアラインメントした後に配列を補完し、約４６５塩基の配列にした。その後、１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンスデータをＯＴＵ解析し、細菌分類群に振り分け、微生物叢分布を得た。以下表４に解析された微生物分類群の一覧表を示す。

【0054】

【表4】

【0055】

また、実施例１のコンポスト化の過程で変化する微生物叢をＮＧＳ解析した結果を図６に示す。まず、Ｒｕｎ Ａにおける微生物叢の変化を図６（ａ）に示す。コンポスト化の過程全般に亘り、ＮＯ．１１３のＢａｃｉｌｌｕｓ属の微生物が圧倒的に優勢となっている。しかし、Ｒｕｎ Ａでは、コンポスト化物中に有機酸が蓄積され、ｐＨも低いままであったため、ＮＯ．１１３のＢａｃｉｌｌｕｓ属の微生物は、好気かつ高温のコンポスト化条件下における有機酸の分解活性は極めて低いものと考えられた。

【0056】

そして、有機酸を分解する微生物の存在が確認されたＲｕｎ Ｂにおける微生物叢の変化を図６（ｂ）に示す。コンポスト化開始から１日後ではＮＯ．１１０のＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科の微生物の存在度が高いが、コンポスト化３～４日目にはＮＯ．１１３のＢａｃｉｌｌｕｓ属の微生物が圧倒的に優勢となっており、特に４日目にはＮＯ．１１３の微生物の相対存在度は８０％を示した。その後、コンポスト化開始から６日以降にはＮＯ．１１３の微生物の存在度は２０～３０％に低減するが、他の微生物に比べて高い存在度が維持された。また、コンポスト化開始から６日以降には、ＮＯ．１１４のＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科の微生物、ＮＯ．２０２のＳｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物、ＮＯ．１０８のＢａｃｉｌｌａｌｅｓ目の微生物及びＮＯ．１３７等のＵｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物等の存在度が際立って大きくなっている。このうち、ＮＯ．１１４のＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科の微生物はコンポスト化６日目で存在度が２０％と最大となり、その後、コンポスト化の進行とともに存在度が次第に低下した。実施例１のＲｕｎ Ｂの結果によれば、コンポスト化開始から６日目以降に６０℃もの高温下で活発な有機物分解が観察されることから、ＮＯ．１１３以外の微生物であって、コンポスト化６日目及び６日目以降に高い存在度を示した微生物、すなわち、ＮＯ．１１４（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）、ＮＯ．２０２（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ＮＯ．１０８（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目）及びＮＯ．１３７（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）の微生物のうちのいずれか又は複数が有機酸を分解している可能性が高いと考えられた。

【0057】

［実施例３］
３．有機酸分解微生物の単離及び同定
（微生物の単離）
実施例１におけるコンポスト混合原料の切り返しの際に、分析試料として装置内部から採取したＲｕｎ Ｂのコンポスト試料のうち、活発な有機酸分解が生じていた６日目のコンポスト試料から有機酸分解微生物の単離を試みた。コンポスト試料を滅菌水で１／１００に希釈したのち、酢酸が唯一の炭素源として含まれている以下表５及び６に示す無機塩酢酸培養液に接種し、培養温度６０℃にて３日間の集積培養を行った。この培養液１００μＬを無機塩酢酸培養液の寒天培地に塗抹して、培養温度６０℃、培養期間５日間で培養した。培養後の寒天培地には８つのコロニーが観察された。この８つのコロニーのＡＤ１～ＡＤ８株を有機酸分解微生物としてそれぞれ回収し、単離した。

【0058】

【表5】

【0059】

【表6】

【0060】

（微生物の同定）
単離された８つの微生物株ＡＤ１～ＡＤ８から、ＤＮＡ抽出キット（ISOIL for Beads Beating；株式会社ニッポンジーン）を用いてＤＮＡを抽出した。微生物から抽出したＤＮＡについて、その１６Ｓ ｒＲＮＡ領域をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲには、ホットスタートＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq（登録商標） Hot Start Version、ＲＲ００６Ａ；タカラバイオ株式会社）を用い、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Standard、ＴＰ６００；タカラバイオ株式会社）にて行った。ＰＣＲ試薬の組成、プライマーの配列と増幅条件をそれぞれ表７および表８に示す。各ＰＣＲ産物について、１．０×Ｔｒｉｓ－ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アガロースゲル（寒天濃度２％）電気泳動を行い、目的配列である１６Ｓ ｒＲＮＡ領域が増幅されたことを確認した。

【0061】

【表7】

【0062】

【表8】

【0063】

目的領域の増幅が確認された各ＰＣＲ産物は、ＤＮＡ精製キット（Wizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up System；プロメガ株式会社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対し、プライマー３５７Ｆおよびプライマー９０７Ｒを用いてＶ３、Ｖ４領域を含む１６Ｓ ｒＲＮＡの一部を増幅した。プライマーの配列と増幅条件を表９に示す。

【0064】

【表9】

【0065】

増幅されたＰＣＲ産物について、ＤＮＡシークエンス反応キット（BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit；アプライドバイオシステムズ株式会社）を用いてシークエンシング反応を行った。塩基配列の解析はＤＮＡシークエンサー（ABI Prism（登録商標）310 Genetic Analyzer；アプライドバイオシステムズ株式会社）により行った。決定した塩基配列について、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に登録されている配列に対してＢＬＡＳＴ解析を行い、最も近縁な微生物を特定した。

【0066】

有機物分解微生物として単離したＡＤ１～ＡＤ８のＤＮＡを解析したところ、ＡＤ１～ＡＤ７の７つの微生物株は塩基配列が一致し、ＡＤ１～ＡＤ７はすべて同じ微生物であることが分かった。他方、ＡＤ８の塩基配列はＡＤ１～ＡＤ７のものとは異なっており、ＡＤ８とＡＤ１～ＡＤ７とは別の微生物であることがわかった。図７にＡＤ５（ＡＤ１～ＡＤ７）株及びＡＤ８株のＢＬＡＳＴ解析結果を示す。これによれば、ＡＤ５（ＡＤ１～ＡＤ７）株はＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌であり、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓと最も相同性が高かった（相同性９８％）。一方、ＡＤ８株はＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌であり、Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ（相同性９９％）と近縁であることがわかった。この「ＡＤ５」及び「ＡＤ８」は特許微生物寄託センターに、ＡＤ５：ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７、ＡＤ８：ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８として寄託された。

【0067】

ＡＤ５（ＡＤ１～ＡＤ７）株及びＡＤ８株の微生物同定結果を、実施例２におけるＮＧＳ解析結果に反映させるべく、ＡＤ５及びＡＤ８の塩基配列情報を用いて、ＡＤ５（ＡＤ１～ＡＤ７）株及びＡＤ８株が実施例２における表４及び図６等に示されたどの微生物分類群に分類されるかを確かめた。その結果、本実施例でＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物と同定されたＡＤ５（ＡＤ１～ＡＤ７）株は、実施例２におけるＮＯ．１１４のＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科の微生物分類群に分類されることがわかった。この結果より、実施例１のＲｕｎ Ｂにおいて、ＮＯ．１１４の微生物、すなわち、ＡＤ５株がコンポスト化６日目に多く存在し、有機酸分解を好気かつ高温条件下で活発に行ったことが明らかとなった。他方、本実施例でＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属と同定されたＡＤ８株は、実施例２におけるＮＯ．１３７のＰｌａｎｏｃｏｃａｓｅａｅ科の微生物分類群に分類された。ＡＤ８株はＡｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓと近縁であるが、このＡｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓは、２０１０年にＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属から再分類されている。それゆえ、ＡＤ８株は少なくともＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科に属する微生物分類群に分類されるものと予想されたが、予想とは異なり、異なる微生物群に分類された（なお、目（Ｏｒｄｅｒ）レベルでは、ＡＤ８株もＮＯ．１３７の微生物共にＢａｃｉｌｌａｌｅｓ目に分類されるため、一致している）。この理由としては、ＢＬＡＳＴ検索とＮＧＳ解析に用いた微生物データベースが異なっているためと考えられる。このＡＤ８株と対応する微生物分類群であるＮＯ．１３７は、実施例１のＲｕｎ Ｂにおいて、コンポスト化６日目に多く存在し、有機酸分解に関与すると推測されていた微生物であった。よって、実施例１のＲｕｎ Ｂにおいて、ＮＯ．１３７の微生物、すなわち、ＡＤ８株がコンポスト化６日目に多く存在し、有機酸分解を好気かつ高温条件下で活発に行ったことが推測された。これらの結果より、ＡＤ５（ＡＤ１～ＡＤ７）株及びＡＤ８株が、コンポスト化において、好気かつ高温条件下で増殖し、活発な有機酸の分解を行うことが明らかとなった。

【0068】

本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含まれるものである。

【受託番号】

【0069】

ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９７
ＮＩＴＥ Ｐ－０２５９８

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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