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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-01
(45)【発行日】2022-03-09
(54)【発明の名称】ニューロピリン機能調節剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/164 20060101AFI20220302BHJP
A61K 36/889 20060101ALI20220302BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20220302BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220302BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20220302BHJP
A61P 17/08 20060101ALI20220302BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20220302BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20220302BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20220302BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220302BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220302BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20220302BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220302BHJP
【ＦＩ】
A61K31/164
A61K36/889
A61P5/14
A61P17/00
A61P17/04
A61P17/08
A61P19/00
A61P19/08
A61P19/10
A61P25/00
A61P35/00
A61P35/04
A61P43/00 111
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2021000976
(22)【出願日】2021-01-06
(62)【分割の表示】P 2016209868の分割
【原出願日】2016-10-26
(65)【公開番号】P2021054860
(43)【公開日】2021-04-08
【審査請求日】2021-02-04
(73)【特許権者】
【識別番号】000002901
【氏名又は名称】株式会社ダイセル
(73)【特許権者】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(73)【特許権者】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100124431
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 順也
(74)【代理人】
【識別番号】100174160
【弁理士】
【氏名又は名称】水谷 馨也
(72)【発明者】
【氏名】向井 克之
(72)【発明者】
【氏名】臼杵 靖剛
(72)【発明者】
【氏名】五十嵐 靖之
(72)【発明者】
【氏名】田村 具博
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 貴士
【審査官】伊藤 幸司
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－１９５５５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－１７３８１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－６７８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－１８７３９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－２７０１０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－１７７１５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】S Usuki et al，Chemoenzymatically prepared konjac ceramide inhibits NGF-induced neurite outgrowth by a semapholin 3，Biochemistry and Biophysics Reports，2015年11月19日，5(2016)，160-167，on line
【文献】T Yabu et al.，Thalidomide-induced anti-angiogenic action is mediated by ceramide through depletion of VEGF recepto，Blood，2005年，DOI: 10.1182/blood-2004-09-3679
【文献】R R. Bansode et al.，Coupling in vitro and in vivo paradigm reveals a dose dependent inhibition of angiogenesis followed，Int. J. Biol. Sci，2011年，7，629-644
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
植物由来セラミドを含むニューロピリン機能調節剤であり、前記植物由来セラミドが、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン、シス４－シス８－スフィンガジエニン、トランス４－トランス８－スフィンガジエニン、シス４－トランス８－スフィンガジエニン、４－ヒドロキシ－シス－８－スフィンゲニン、又は４－ヒドロシキ－トランス８－スフィンゲニンに、炭素数１４～２４の脂肪酸が結合している構造を有する、ニューロピリン機能調節剤。
【請求項2】
セマフォリン３Ａのアンタゴニストとして使用される、請求項１に記載のニューロピリン機能調節剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ニューロピリンの機能調節に優れた薬剤に関する。具体的には、ニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａの機能の亢進又は抑制する目的で使用される薬剤に関する。
【背景技術】
【0002】
セマフォリンは、セマドメインという共通のアミノ酸配列をもち、構造の違いにより、７つのサブファミリーに分類されるタンパク質である。なかでも、セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ，Ｓｅｍａ３Ａ）は、これまで最もよく研究されており、生体内において、神経軸索ガイダンス、血管新生、免疫応答、骨代謝などの様々な生体機能に幅広く関与していることが知られている。
【0003】
例えば、セマフォリン３Ａが存在すると神経細胞の軸索伸長が抑制されることが知られている。セマフォリン３Ａのそのような作用を利用して、例えば、皮膚組織でのそう痒を抑制する方法が提案されている（特許文献１）。また、セマフォリン３Ａが、骨吸収の阻害と骨形成の促進とを同時に行うことによって、強い骨保護作用を発揮することが知られている（特許文献２）。また、セマフォリン３Ａの活性を阻害することによって、軸索の伸長を促進し、損傷した骨髄の再生等を促進し得ることが知られている（特許文献３）。
【0004】
このようにセマフォリン３Ａは生体内において、種々の重要な役割を果たしており、生体内でのセマフォリン３Ａの機能の亢進又は抑制を調整することは重要である。例えば、特許文献４には、転写因子を利用したセマフォリン３Ａの発現を増強又は抑制する剤、及び特定の転写因子の阻害又は促進を指標として、セマフォリン３Ａの発現を増強又は抑制する化合物のスクリーニング方法が開示されている。
【0005】
セマフォリン３Ａは、ニューロピリンを直接の受容体とする。ニューロピリンは、Ｔ細胞、樹状細胞、神経細胞、上皮細胞等、様々な細胞の表面に存在する膜貫通糖タンパク質であり、ニューロピリン１とニューロピリン２が知られている。ニューロピリンはプレキシンＡと複合体と形成し、セマフォリン３Ａの機能的な受容体を形成する。セマフォリン３Ａが前記複合体に結合することにより、細胞内情報伝達機構が活性化される。例えば、図１に、軸索の伸長の作用機序に関する、セマフォリン３Ａと神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）によるシグナル伝達経路を示した模式図を示す。
【0006】
図１に示されるように、セマフォリン３Ａが、ニューロピリン１（Ｎｒｐ １）と結合した後、その複合体にプレキシンＡ（Ｐｌｅｘ Ａ）が結合することにより、ＦｙｎによるＲａｃ１の活性化を介して、タンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡによるＧＳＫ－３βの脱リン酸化が促される。そうすると、ＧＳＫ－３βが活性化され、ＣＲＭＰ２のリン酸化が促進される。その結果、ＣＲＭＰ２は不活性となり、軸索の伸長が抑制される。一方、神経成長因子（ＮＧＦ）が受容体Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ Ａ（ｔｒｋ Ａ）と結合することにより、ＡｋｔによるＧＳＫ－３βのリン酸化が促進される。それにより、ＧＳＫ－３βによるＣＲＭＰ２のリン酸化が抑制され、ＣＲＭＰ２の活性が高まり、軸索を伸長させる。このようにセマフォリン３Ａの受容体への結合と、神経成長因子の受容体ｔｒｋ Ａへの結合との作用のバランスにより、軸索の伸長が制御される。
【0007】
ニューロピリンは、セマフォリン３Ａの受容体であるので、セマフォリン３Ａの機能の
亢進又は抑制に深く関わる。そのため、ニューロピリンに結合してニューロピリンの機能を調節することにより、セマフォリン３Ａの機能の亢進又は抑制できる薬剤の開発は、セマフォリン３Ａが関与する疾患の治療又は予防に非常に有効である。しかしながら、ニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａのアゴニスト、アンタゴニストとして機能し得る薬剤は未だ十分に知られていない。
亢進又は抑制に深く関わる。そのため、ニューロピリンに結合してニューロピリンの機能を調節することにより、セマフォリン３Ａの機能の亢進又は抑制できる薬剤の開発は、セマフォリン３Ａが関与する疾患の治療又は予防に非常に有効である。しかしながら、ニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａのアゴニスト、アンタゴニストとして機能し得る薬剤は未だ十分に知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特開２００８－２９７２４３号公報
【文献】国際公開第２０１３／１２９６２０号パンフレット
【文献】特開２０１１－４６７３４号公報
【文献】国際公開第２０１４／１７８４２７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、上記現状に鑑みて、セマフォリン３Ａ受容体であるニューロピリンとの結合作用を有し、セマフォリン３Ａのアゴニスト及び／又はアンタゴニストとして機能し得るニューロピリン機能調節剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、植物由来セラミドがニューロピリンと結合し得ることを見出した。また、植物由来セラミドがニューロピリンと結合して、軸索の伸長を抑制し得ることを見出した。更に、植物由来セラミドがニューロピリンに結合することにより、セマフォリン３Ａの機能を亢進したり、抑制したりし得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【0011】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 植物由来セラミドを含むニューロピリン機能調節剤。
項２． 植物由来セラミドがコンニャク由来である、項１に記載のニューロピリン機能調節剤。
項３． セマフォリン３Ａのアンタゴニストとして使用される、項１又は２に記載のニューロピリン機能調節剤。
項４． セマフォリン３Ａのアゴニストとして使用される、項１又は２に記載のニューロピリン機能調節剤。
項１． 植物由来セラミドを含むニューロピリン機能調節剤。
項２． 植物由来セラミドがコンニャク由来である、項１に記載のニューロピリン機能調節剤。
項３． セマフォリン３Ａのアンタゴニストとして使用される、項１又は２に記載のニューロピリン機能調節剤。
項４． セマフォリン３Ａのアゴニストとして使用される、項１又は２に記載のニューロピリン機能調節剤。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、セマフォリン３Ａ受容体であるニューロピリンと結合し、セマフォリン３Ａの機能を亢進又は抑制し得るニューロピリン機能調節剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】軸索の伸長と退縮の作用機序に関する、セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）と神経成長因子（ＮＧＦ）によるシグナル伝達経路を示す模式図である。
【図2】実験例１の実験の流れを示す図である。
【図3】実験例２の実験の流れを示す図である。
【図4】実験例３の実験の流れを示す図である。
【図5】（Ａ）は、実験例１における、濃度の異なるＫ２５２ａと、ＮＧＦ、又はＮＧＦとｋＣｅｒを添加した場合の、神経突起伸長活性を示すグラフである。（Ｂ）は、実験例１において、濃度の異なるＫ２５２ａと、ＮＧＦとαＮｒｐ１、又はＮＧＦとαＮＲＰ１とｋＣｅｒを添加した場合の、神経突起伸長活性を示すグラフである。（Ｃ）は、培地へのｋＣｅｒの添加の有無と、１μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬのαＮｒｐ１の添加の有無による、神経突起伸長活性を示すグラフである。
【図6】（Ａ）は、実験例２における、ＣＲＭＰ２のリン酸化活性を示すグラフである。（Ｂ）は、実験例３におけるウエスタンブロット法による各標的蛋白質のバンドの様子を示す画像である。
【図7】実験例４における濃度の異なるＳｅｍａ３ＡとｋＣｅｒの同時添加による神経突起伸長活性を示すグラフである。
【図8】実験例４における濃度の異なるＳｅｍａ３ＡとｋＣｅｒの同時添加によるＣＲＭＰ２のリン酸化活性を示すグラフである。
【図9】（Ａ）は、実験例５における蛍光画像である。（Ｂ）は、実験例５におけるＳｅｍａ３Ａ又は各セラミドの濃度に対するＰＣ１２細胞に結合した蛍光量を示すグラフである。
【図10】実験例６におけるバイオレイヤー干渉法により測定した分子間相互作用の値を示すグラフである。
【図11】実験例７におけるｋＣｅｒ、ＢＳＡ、ｋＧｌｃＣｅｒの昇温比熱変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明のニューロピリン機能調節剤は、植物由来セラミドを含むことを特徴とする。以下、本発明のニューロピリン機能調節剤について詳述する。
【0015】
セラミド
本発明のニューロピリン機能調節剤は、植物由来セラミドを有効成分として含む。
セラミドは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造を有する。
本発明において使用されるセラミドは、植物由来である。そのため、本発明のニューロピリン機能調節剤は安全性が高く、簡便に適用できる。本発明で使用されるセラミドの由来植物としては、具体的には、アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマクサ、アマチャ、アマチャヅル、アマナツ、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンコール、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イヨカン、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オウゴンカン、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カクテルフルーツ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カラマンダリン、カリン、ガルシニア、カルダモン、カワチバンカン、カンペイ、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キヨミ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クレメンタイン、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、コンニャク（コンニャク芋）（こんにゃくトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スイートスプリング、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、セトカ、ゼニアオイ、セミノール、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンカン、タンゴール、タンジン、タンゼロ、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、デコポン、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツミ、ナツミカン、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッサク、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ハルカ、ハルミ、ハレヒメ、バンペイユ、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ヒメノツキ、ヒュウガナツ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ブンタン、ヘチマ、ベニバナ、ベニマドンナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、ポンカン、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マーコット、マタタビ、マリーゴールド、マリヒメ、マンゴー、ミツバ、ミネオラ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイコウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコンニャク、サツマ芋、ジャガ芋、サト芋、ヤマ芋、ナガ芋等の芋類由来、更に好ましくはコンニャクが挙げられる。
本発明のニューロピリン機能調節剤は、植物由来セラミドを有効成分として含む。
セラミドは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造を有する。
本発明において使用されるセラミドは、植物由来である。そのため、本発明のニューロピリン機能調節剤は安全性が高く、簡便に適用できる。本発明で使用されるセラミドの由来植物としては、具体的には、アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマクサ、アマチャ、アマチャヅル、アマナツ、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンコール、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イヨカン、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オウゴンカン、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カクテルフルーツ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カラマンダリン、カリン、ガルシニア、カルダモン、カワチバンカン、カンペイ、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キヨミ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クレメンタイン、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、コンニャク（コンニャク芋）（こんにゃくトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スイートスプリング、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、セトカ、ゼニアオイ、セミノール、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンカン、タンゴール、タンジン、タンゼロ、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、デコポン、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツミ、ナツミカン、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッサク、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ハルカ、ハルミ、ハレヒメ、バンペイユ、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ヒメノツキ、ヒュウガナツ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ブンタン、ヘチマ、ベニバナ、ベニマドンナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、ポンカン、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マーコット、マタタビ、マリーゴールド、マリヒメ、マンゴー、ミツバ、ミネオラ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイコウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコンニャク、サツマ芋、ジャガ芋、サト芋、ヤマ芋、ナガ芋等の芋類由来、更に好ましくはコンニャクが挙げられる。
【0016】
本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分の構造については、特に限定されないが、具体的には、４－スフィンゲニン（スフィンゴシン）、４－ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）、４－ヒドロキシ－トランス－８－スフィンゲニン、４－ヒドロキシ－シス－８－スフィンゲニン、スフィンガニン、トランス－８－スフィンゲニン、シス－８－スフィンゲニン、トランス－４－スフィンゲニン、トランス－４，トランス－８－スフィンガジエニン、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、コンニャク由来のセラミドを構成しているスフィンゴイド、具体的にはトランス－４，シス－８－スフィンガジエニン、シス４－シス８－スフィンガジエニン、トランス４－トランス８－スフィンガジエニン、シス４－トランス８－スフィンガジエニン、４－ヒドロキシ－シス－８－スフィンゲニン、４－ヒドロシキ－トランス８－スフィンゲニンが挙げられる。
【0017】
本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸の炭素数については、特に制限されないが、２～３０、好ましくは１４～２６、更に好ましくは１８～２４が挙げられる。また、当該脂肪酸は、飽和脂肪酸、炭素－炭素二重結合及び／又は炭素－炭素三重結合を含む不飽和脂肪酸、並びにα－ヒドロキシ脂肪酸のいずれであってもよい。
【0018】
本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸として、具体的には、ヘキサデカン酸（Ｃ１６：０）、オクタデカン酸（Ｃ１８：０）、イコサン酸（Ｃ２０：０）、ヘネイコサン酸（Ｃ２１：０）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）、トリコサン酸（Ｃ２３：０）、テトラドコサン酸（Ｃ２４：０）、ペンタコサン酸（Ｃ２５：０）、ヘキサドコサン酸（Ｃ２６：０）、ヘプタコサン酸（Ｃ２７：０）、オクタドコサン酸（２８：０）、シス－９－オクタデセン酸（Ｃ１８：１）等が挙げられる。なお、前記脂肪酸の括弧内に示す表記「ＣＸ：Ｙ」において、ＣＸは１分子当たりの炭素数を示し、Ｙは１分子当たりの不飽和結合の数を示し、例えば「Ｃ１６：０」とは炭素数１６且つ不飽和結合数が０の脂肪酸を表す。これらの脂肪酸の中でも、好ましくは、コンニャク由来のセラミドを構成している脂肪酸、具体的にはオクタデカン酸、ドコサン酸、イコサン酸が挙げられる。
【0019】
セラミドは、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、セラミドは、スフィンゴ糖脂質の酵素処理物として得られたものであってもよい。また、セラミドは商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。
【0020】
前記スフィンゴ糖脂質の酵素処理物としては、前述の由来植物の抽出液、その濃縮液、又は前記濃縮液を精製処理した精製物の酵素処理物などが挙げられる。
【0021】
前記スフィンゴ糖脂質は、グルコシルセラミド又はラクトシルセラミド等の、セラミドの第１級アルコール性ヒドロキシ基に糖が結合した糖脂質である。スフィンゴ糖脂質としては、前述したセラミドが得られるのであれば、特に限定されず、セラミドに、グルコース、ガラクトース、又は糖鎖等、いずれの糖が結合したものであってもよい。スフィンゴ糖脂質は、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、スフィンゴ糖脂質は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。
【0022】
スフィンゴ糖脂質の酵素処理に使用する酵素としては、スフィンゴ糖脂質の糖鎖－セラミド間の結合を加水分解する酵素であれば特に限定されず、例えば、エンドグリコセラミダーゼ（ＥＧＣａｓｅ）が挙げられる。
【0023】
ＥＧＣａｓｅは、等電点及び分子量が異なる３つの分子種（ＥＧＣａｓｅ Ｉ、ＥＧＣａｓｅ ＩＩ、及びＥＧＣａｓｅ ＩＩＩ）が知られており、分子種に応じて基質特異性が異なることが知られている。使用するＥＧＣａｓｅの分子種は、基質となるスフィンゴ糖脂質の構造に応じて適宜設定すればよい。例えば、スフィンゴ糖脂質として、セレブロシド、特にコンニャク由来のスフィンゴ糖脂質の場合であれば、ＥＧＣａｓｅ Ｉが好適に使用される。酵素処理の条件は、所望の酵素反応が行われるよう適宜選択するとよい。
【0024】
前記抽出液の濃縮方法としては、エバポレーターのような減圧濃縮装置を用いた公知の濃縮方法が挙げられる。また精製方法としては、アルカリ処理、溶媒分画、シリカゲルクトマトグラフィーなどの公知の精製方法が挙げられる。
【0025】
酵素処理後、酵素処理物そのままを用いてもよいし、酵素処理物を固液分離した残渣、固液分離した残渣を乾燥させたもの、反応物そのままを乾燥させたもの等を用いてもよい。また、酵素処理物を固液分離し、更に水を添加した後、再度固液分離することにより酵素処理物を洗浄して不純物を除去したものでもよい。
【0026】
本発明のニューロピリン機能調節剤において、セラミドは、１種の構造又は由来のものを単独して使用してもよく、２種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。
【0027】
本発明のニューロピリン機能調節剤におけるセラミドの含有量としては、本発明の効果を奏するのであれば、特に限定されず、用途、剤型、投与形態等に応じて適宜調整することができる。
【0028】
添加成分
本発明のニューロピリン機能調節剤は、前述した植物由来セラミド以外に、本発明の効
果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のニューロピリン機能調節剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のニューロピリン機能調節剤の剤型等に応じて適宜設定される。
本発明のニューロピリン機能調節剤は、前述した植物由来セラミド以外に、本発明の効
果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のニューロピリン機能調節剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のニューロピリン機能調節剤の剤型等に応じて適宜設定される。
【0029】
剤型・製剤形態・用途
本発明のニューロピリン機能調節剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、ニューロピリン機能調節剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。
本発明のニューロピリン機能調節剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、ニューロピリン機能調節剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。
【0030】
本発明のニューロピリン機能調節剤の投与方法としては、特に限定されず、適用する疾患の種類に応じて適宜選択すればよく、全身投与であっても、局所投与であってもよい。具体的には、経口、経血管内（動脈内又は静脈内）、経皮、経腸、経肺、経鼻投与等が挙げられる。血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。なかでも、投与が容易な点で、経皮投与、経口投与、経鼻投与、又は経直腸投与が好ましい。
【0031】
本発明のニューロピリン機能調節剤の製剤形態については、特に限定されず、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができ、投与形態に応じて適宜選択すればよい。例えば、本発明のニューロピリン機能調節剤の投与形態が経皮投与である場合は、経皮投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、化粧料、外用医薬品などの皮膚外用剤が挙げられる。
【0032】
例えば、本発明のニューロピリン機能調節剤を化粧料に使用する場合、本発明のニューロピリン機能調節剤を香粧学的に許容される基材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような化粧料の形態としては、特に限定されないが、具体的には、クリーム剤、乳液、化粧水（ローション）、パック、洗浄剤、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品、オイル、リップ、口紅、ファンデーション、アイライナー、頬紅、マスカラ、アイシャドー、マニキュア・ペディキュア（及び除去剤）、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、パーマネント剤、染毛料、ひげ剃り剤、石けん（ハンドソープ、ボディソープ、洗顔料）などが挙げられる。
【0033】
また、本発明のニューロピリン機能調節剤を外用医薬品に使用する場合、本発明のニューロピリン機能調節剤を単独で、又は他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤や添加成分等と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような外用医薬品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、パップ剤、リニメント剤などの経皮投与製剤などが挙げられる。
【0034】
また、本発明のニューロピリン機能調節剤の製剤形態について、例えば、本発明のニューロピリン機能調節剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、飲食品及び内服用医薬品が挙げられる。
【0035】
本発明のニューロピリン機能調節剤を飲食品の製剤形態にする場合、本発明のニューロピリン機能調節剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的にはカプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤
、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；栄養ドリンク、果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；団子、アイス、シャーベット、グミ、キャンディー等の嗜好品；等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくはサプリメント、より好ましくはカプセル剤、リポソーム製剤が挙げられる。
、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；栄養ドリンク、果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；団子、アイス、シャーベット、グミ、キャンディー等の嗜好品；等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくはサプリメント、より好ましくはカプセル剤、リポソーム製剤が挙げられる。
【0036】
本発明のニューロピリン機能調節剤を内服用医薬品の製剤形態にする場合、本発明のニューロピリン機能調節剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用の医薬品の中でも、好ましくはリポソーム製剤が挙げられる。
【0037】
本発明のニューロピリン機能調節剤は、ニューロピリンと結合し得る。本発明のニューロピリン機能調節剤は、ニューロピリンに結合して、セマフォリン３Ａの機能を制御することができる。セマフォリン３Ａがニューロピリンに結合して複合体を形成し、前記複合体がプレキシンＡと結合するか否かで、セマフォリン３Ａの機能が発現されるか否かを制御すると考えられる。本発明のニューロピリン機能調節剤は、ニューロピリンに結合して、ある閾値まではセマフォリン３Ａの機能を亢進し、セマフォリン３Ａがある閾値を超えるとニューロピリンの機能を抑制することができる。すなわち、本発明のニューロピリン機能調節剤は、疾患部位において、セマフォリン３Ａが過剰に機能している場合は、その機能を抑制するように働き、一方、セマフォリン３Ａの機能が不十分な場合は、その機能を促進するように働いて、正常な機能を維持しようとする作用を有すると考えられる。本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａの機能を亢進又は抑制することによって症状が改善される疾患の治療又は予防目的で使用することができる。このように、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａのアゴニスト又はアンタゴニストとして使用することができる。
【0038】
また、本発明のニューロピリン機能調節剤は、ニューロピリンが介在する複合体の形成を阻害する機能を有すると考えられるので、前述のセマフォリン３Ａの機能以外にも、ニューロピリンが関与する機能の制御に有用であると考えられる。例えば、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）は、ニューロピリンに結合して血管新生を亢進し得る。そのため、本発明のニューロピリン機能調節剤は、ＶＥＧＦによる血管新生機能の制御等にも有用であると考えられる。
【0039】
本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａ受容体であるニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａの機能を亢進することができる。すなわち、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａのアゴニストとして機能し得る。本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａの機能を亢進することによって症状が改善される疾患の治療又は予防用途に使用することができる。そのような疾患としては、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、汗疱などのそう痒性皮膚疾患；骨粗鬆症、原発性副甲状腺機能亢進症、骨軟化症、くる病、骨形成不全症、軟骨無形成症、大理石骨病などの骨代謝低下による骨関連疾患；等が挙げられる。
【0040】
また、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａ受容体であるニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａの機能を抑制することができる。すなわち、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａのアンタゴニストとしても機能し得る。本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａの機能を抑制することによって症状が改善される疾患の治療用途に使用することができる。そのような用途としては、骨髄損傷等、損傷した神経組織の再生、癌転移の抑制、癌血管の新生の抑制などの抗腫瘍等
が挙げられる。
が挙げられる。
【0041】
本発明のニューロピリン機能調節剤の使用量としては、特に限定されず、製剤形態、用途、投与対象等に応じて適宜設定するとよい。
【0042】
以上のように、植物由来セラミドを含む本発明のニューロピリン機能調節剤は、植物由来セラミドがニューロピリンと結合して、セマフォリン３Ａの機能を亢進したり、又はセマフォリン３Ａの機能を抑制することができる。本発明のニューロピリン機能調節剤は、特にニューロピリン１に結合することが好ましく、ニューロピリン１の機能調節剤であることが好ましい。そのため、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａの機能を亢進又は抑制することにより、症状が改善される疾患の治療又は予防用途に使用することができる。具体的には、本発明のニューロピリン機能調節剤は、そう痒抑制、骨代謝改善、神経組織再生、抗腫瘍等に好適に適用することができる。本発明のニューロピリン機能調節剤は、特にセマフォリン３Ａのアンタゴニストとして機能することにより有効な疾患の治療用途に適用することができる。
【実施例】
【0043】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
【0044】
＜コンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）の調製＞
コンニャク由来グルコシルセラミド（ｋＧｌｃＣｅｒ，ＮＳ１７０３０２ Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ｆｒｏｍ Ｋｏｎｊａｃ，純度≧９９％（ＴＬＣ），株式会社長良サイエンス）に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ Ｍ－７５０株由来のエンドグリコセラミダーゼＩを用いて加水分解を行って、グルコースを遊離させ、精製して、コンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）を得た。
コンニャク由来グルコシルセラミド（ｋＧｌｃＣｅｒ，ＮＳ１７０３０２ Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ｆｒｏｍ Ｋｏｎｊａｃ，純度≧９９％（ＴＬＣ），株式会社長良サイエンス）に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ Ｍ－７５０株由来のエンドグリコセラミダーゼＩを用いて加水分解を行って、グルコースを遊離させ、精製して、コンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）を得た。
【0045】
＜ＰＣ１２細胞の調製＞
ラットの副腎髄質由来の褐色細胞腫（ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ＨＳ）はヒューマンサイエンス研究資源バンクより分譲された。細胞は炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）で培養した。培養には１０ｍＬの１０％牛胎児血清、１０％馬血清、及びｘ１００希釈ペニシリン・ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ・１０ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、１０－ｃｍ プラスチック培養デッシュに接着させて培養した。プレコンフルエント細胞密度（５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で幡種して３～４日後にコンフルエントになった時に、０．０５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）で接着した細胞を剥離させて分散した細胞をプレコンフルエントに新培地で希釈して新しい１０－ｃｍデッシュに幡種することにより継代培養しながら細胞を得た。得られた細胞を以下の各実験に用いた。
ラットの副腎髄質由来の褐色細胞腫（ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ＨＳ）はヒューマンサイエンス研究資源バンクより分譲された。細胞は炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）で培養した。培養には１０ｍＬの１０％牛胎児血清、１０％馬血清、及びｘ１００希釈ペニシリン・ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ・１０ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、１０－ｃｍ プラスチック培養デッシュに接着させて培養した。プレコンフルエント細胞密度（５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で幡種して３～４日後にコンフルエントになった時に、０．０５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）で接着した細胞を剥離させて分散した細胞をプレコンフルエントに新培地で希釈して新しい１０－ｃｍデッシュに幡種することにより継代培養しながら細胞を得た。得られた細胞を以下の各実験に用いた。
【0046】
＜Ｎｒｐ１遺伝子発現が抑制されたＰＣ１２細胞の調製＞
セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）の細胞膜レセプターであるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の遺伝子発現を、そのｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉によりノックダウンさせたＰＣ１２細胞を調製した。具体的には、ｓｉＮＲＰ１（ＲＳＳ３３２４２７：５’－ＧＣＡＣＣＵＡＣＡＵＣＡＵＣＵＵＵＧＣＡＣＣＡＡＡ－３’（配列番号１）、５’－ＵＵＵＧＧＵＧＣＡＡＡＧＡＵＧＡＵＧＵＡＧＧＵＧＣ－３’（配列番号２），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ネガテイブコントロールｓｉＮＧＣＴＲＬ（ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ Ｄｕｐｌｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、遺伝子導入試薬 ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションプロトコールに従って細胞を調製した。このような方法で調製した細胞（ｓｉＮＲＰ１処理した細胞）は、Ｎｒｐ１遺伝子発現およびタンパク発現が抑制されることを確認してから実験に用いた。
セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）の細胞膜レセプターであるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の遺伝子発現を、そのｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉によりノックダウンさせたＰＣ１２細胞を調製した。具体的には、ｓｉＮＲＰ１（ＲＳＳ３３２４２７：５’－ＧＣＡＣＣＵＡＣＡＵＣＡＵＣＵＵＵＧＣＡＣＣＡＡＡ－３’（配列番号１）、５’－ＵＵＵＧＧＵＧＣＡＡＡＧＡＵＧＡＵＧＵＡＧＧＵＧＣ－３’（配列番号２），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ネガテイブコントロールｓｉＮＧＣＴＲＬ（ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ Ｄｕｐｌｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、遺伝子導入試薬 ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションプロトコールに従って細胞を調製した。このような方法で調製した細胞（ｓｉＮＲＰ１処理した細胞）は、Ｎｒｐ１遺伝子発現およびタンパク発現が抑制されることを確認してから実験に用いた。
【0047】
実験例１
シグナル伝達阻害剤を用いたｋＣｅｒの突起伸長阻害の作用点について、図２に示すように検討した。具体的には、以下の通りに行った。
シグナル伝達阻害剤を用いたｋＣｅｒの突起伸長阻害の作用点について、図２に示すように検討した。具体的には、以下の通りに行った。
【0048】
＜神経突起伸張阻害活性の測定＞
あらかじめ０．０１％ポリＬ－リジンで表面処理した１２－ウェル培養プレートに、ＰＣ１２細胞を７．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬで１ｍＬの血清を含むＤＭＥＭ培地とともに播種して一晩培養した。培養後に無血清のＤＭＥＭで接着細胞を洗浄した後、細胞をｔｒｋＡ経路の特異的阻害剤Ｋ２５２ａ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）、Ｓｅｍａ３Ａ経路の特異的阻害剤ａｎｔｉ－ＮＲＰ１ ｒｐＡｂ 抗Ｎｒｐ１ラビット抗体（αＮｒｐ１）（Ｓｉｇｍａ）、上記で調製したｋＣｅｒ、及びＳｅｍａ３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｅ ３Ａ）を用いて処理した。この処理は、Ｋ２５２ａ（０～１０．０ｎＭ）、αＮｒｐ１（５μｇ／ｍＬ）、ｋＣｅｒ（５０μＭ）、Ｓｅｍａ３Ａ（５μｇ／ｍＬ）をそれぞれ所定量で含む無血清のＤＭＥＭで細胞を洗浄することにより行った。各群４ウェルとした。 前記処理の３０分後に、１００ｎｇ／ｍＬ 神経成長因子（ＮＧＦ，２．５Ｓ マウス由来，Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）と０．０２５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地１ｍＬに置換して、３日間培養した。
培養後に、１ｍＬの２％ グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液を各ウェルに重層して２０分間固定処理を行った。その後、１ｍＬのＣＢＢ染色液（１％クマシーブリリアントブルー／５０％メタノールのＰＢＳ溶液）で２時間染色した。染色後、２ｍＬの１０％メタノール／ＰＢＳ溶液、ＰＢＳ溶液、脱イオン水で脱染して風乾した。
得られた細胞について、オールインオン蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、キーエンス）を用いて各ウェルから×２０倍率で明視野カラー撮影し、得られた細胞画像を、色相抽出プログラムによって染色性の高い細胞体と神経突起を含む細胞周囲部分に分離し、その相対比より比率（％）を算出して神経突起伸張活性を求めた。
あらかじめ０．０１％ポリＬ－リジンで表面処理した１２－ウェル培養プレートに、ＰＣ１２細胞を７．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬで１ｍＬの血清を含むＤＭＥＭ培地とともに播種して一晩培養した。培養後に無血清のＤＭＥＭで接着細胞を洗浄した後、細胞をｔｒｋＡ経路の特異的阻害剤Ｋ２５２ａ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）、Ｓｅｍａ３Ａ経路の特異的阻害剤ａｎｔｉ－ＮＲＰ１ ｒｐＡｂ 抗Ｎｒｐ１ラビット抗体（αＮｒｐ１）（Ｓｉｇｍａ）、上記で調製したｋＣｅｒ、及びＳｅｍａ３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｅ ３Ａ）を用いて処理した。この処理は、Ｋ２５２ａ（０～１０．０ｎＭ）、αＮｒｐ１（５μｇ／ｍＬ）、ｋＣｅｒ（５０μＭ）、Ｓｅｍａ３Ａ（５μｇ／ｍＬ）をそれぞれ所定量で含む無血清のＤＭＥＭで細胞を洗浄することにより行った。各群４ウェルとした。 前記処理の３０分後に、１００ｎｇ／ｍＬ 神経成長因子（ＮＧＦ，２．５Ｓ マウス由来，Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）と０．０２５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地１ｍＬに置換して、３日間培養した。
培養後に、１ｍＬの２％ グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液を各ウェルに重層して２０分間固定処理を行った。その後、１ｍＬのＣＢＢ染色液（１％クマシーブリリアントブルー／５０％メタノールのＰＢＳ溶液）で２時間染色した。染色後、２ｍＬの１０％メタノール／ＰＢＳ溶液、ＰＢＳ溶液、脱イオン水で脱染して風乾した。
得られた細胞について、オールインオン蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、キーエンス）を用いて各ウェルから×２０倍率で明視野カラー撮影し、得られた細胞画像を、色相抽出プログラムによって染色性の高い細胞体と神経突起を含む細胞周囲部分に分離し、その相対比より比率（％）を算出して神経突起伸張活性を求めた。
【0049】
＜統計処理＞
得られたデータについて、統計解析ソフトＧａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．ｍ ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による有意差検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）を行った。
得られたデータについて、統計解析ソフトＧａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．ｍ ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による有意差検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）を行った。
【0050】
結果を図５（Ａ）～図５（Ｃ）に示す。図５（Ａ）によれば、Ｋ２５２ａ処理によりＮＧＦ誘導神経突起伸張活性は用量依存的に阻害されることが示された（図５（Ａ） 黒の棒グラフ）。同条件でさらに５０μＭ ｋＣｅｒを添加することによって、ｋＣｅｒはＫ２５２ａの神経突起伸張阻害作用に対して相乗的阻害作用を示した（図５（Ａ） 白の棒グラフ）。一方、５μｇ／ｍＬ αＮｒｐ１の添加により、Ｋ２５２ａの神経突起伸張阻害作用は影響を受けなかったが（図５（Ｂ） 黒の棒グラフ）、ｋＣｅｒの相乗的阻害作用はαＮｒｐ１を添加することによって減弱して消失した（図５（Ｂ） 白の棒グラフ）。次に、αＮｒｐ１添加のみでは神経突起伸張作用に影響しなかったが（図５（Ｃ） 黒の棒グラフ）、ｋＣｅｒによる神経突起伸長阻害はαＮｒｐ１によって用量依存的に減弱して消失した（図５（Ｃ） 白の棒グラフ）。図５に示した結果より、ｋＣｅｒはｔｒｋＡシグナル経路ではなくＳｅｍａ３Ａ経路で作用していることが示唆された。
【0051】
実験例２
シグナル伝達阻害剤を用いたｋＣｅｒのＣＲＭＰ２リン酸化の作用点について、図３に示すように検討した。具体的には、以下の方法で行った。
シグナル伝達阻害剤を用いたｋＣｅｒのＣＲＭＰ２リン酸化の作用点について、図３に示すように検討した。具体的には、以下の方法で行った。
【0052】
＜ＣＲＭＰ２のリン酸化活性の測定＞
６－ウェルプレートに４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．５ｍＬの血清含有ＤＭＥＭ培地に播種して２４時間培養したＰＣ１２細胞を、次いで１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含む培地に交換して４８時間分化させた。その後、所定の５０μＭ ｋＣｅｒ、５００ｎｇ／ｍＬ Ｓｅｍａ３Ａ、５μｇ／ｍＬ αＮｒｐ１をそれぞれ含む無血清ＤＭＥＭ培地に置換して２４時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ｃＣｏｍｐｌｅｔｅ（ロッシェ）とＰｈｏｓＳＴＯＰフォスファターゼインヒビターカクテル（ロッシェ）を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液（和光純薬工業）で細胞タンパク質を溶解して回収した。
タンパク液はビシコニン酸－タンパク定量キット（ナカライテスク）により定量した。細胞タンパクを電気泳動用Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２ＭＥ＋ｘ４，和光純薬工業）と水で希釈して１μｇ／μＬに調製して、１００℃で５分間の変性処理を行った後に、ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，和光純薬工業、ＳｕｐｅｒＳｅｐＴＭＡｃｅ，５－２０％）で１０μｇのタンパクを泳動分離した。泳動したゲルはＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ０．４５μｍ、ミリポア）にトランスブロットＳＤセミドライ転写セル（バイオラッド）で転写した。その後、メンブレンはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク）で１時間処理した後に一次抗体液（１０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ・Ｔｒｉｓ・Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳＴ））中で振とうした。翌日に、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄して、二次抗体液（ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を１０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ／ＴＢＳＴで１：２０００～４０００に希釈）中で室温で１時間振とうした。その後、ＴＢＳＴで洗浄後にケミルミワンＳｕｐｅｒ（ナカライテスク）を用いて蛍光・化学ルミネッセンスイメージングシステム（ケンブリッジ）により標的タンパク質を検出した。タンパク量はＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＤＰＨ）に対する相対量比で定量化した。得られた値について、実験例１と同じ方法で統計処理を行った。一次抗体としてはａｎｔｉ－ＣＲＭＰ２ ｒｐＡｂ、ａｎｔｉ－ｐＣＲＭＰ２ ｒｐＡｂ（ｐｔｈｒ５０９）、ａｎｔｉ－ＮＲＰ１ ｒｐＡｂ（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ－β－ａｃｔｉｎ ｍＡｂ（和光純薬工業）、ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ ｍＡｂ（コスモバイオ）を用いた。
６－ウェルプレートに４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．５ｍＬの血清含有ＤＭＥＭ培地に播種して２４時間培養したＰＣ１２細胞を、次いで１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含む培地に交換して４８時間分化させた。その後、所定の５０μＭ ｋＣｅｒ、５００ｎｇ／ｍＬ Ｓｅｍａ３Ａ、５μｇ／ｍＬ αＮｒｐ１をそれぞれ含む無血清ＤＭＥＭ培地に置換して２４時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ｃＣｏｍｐｌｅｔｅ（ロッシェ）とＰｈｏｓＳＴＯＰフォスファターゼインヒビターカクテル（ロッシェ）を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液（和光純薬工業）で細胞タンパク質を溶解して回収した。
タンパク液はビシコニン酸－タンパク定量キット（ナカライテスク）により定量した。細胞タンパクを電気泳動用Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２ＭＥ＋ｘ４，和光純薬工業）と水で希釈して１μｇ／μＬに調製して、１００℃で５分間の変性処理を行った後に、ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，和光純薬工業、ＳｕｐｅｒＳｅｐＴＭＡｃｅ，５－２０％）で１０μｇのタンパクを泳動分離した。泳動したゲルはＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ０．４５μｍ、ミリポア）にトランスブロットＳＤセミドライ転写セル（バイオラッド）で転写した。その後、メンブレンはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク）で１時間処理した後に一次抗体液（１０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ・Ｔｒｉｓ・Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳＴ））中で振とうした。翌日に、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄して、二次抗体液（ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を１０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ／ＴＢＳＴで１：２０００～４０００に希釈）中で室温で１時間振とうした。その後、ＴＢＳＴで洗浄後にケミルミワンＳｕｐｅｒ（ナカライテスク）を用いて蛍光・化学ルミネッセンスイメージングシステム（ケンブリッジ）により標的タンパク質を検出した。タンパク量はＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＤＰＨ）に対する相対量比で定量化した。得られた値について、実験例１と同じ方法で統計処理を行った。一次抗体としてはａｎｔｉ－ＣＲＭＰ２ ｒｐＡｂ、ａｎｔｉ－ｐＣＲＭＰ２ ｒｐＡｂ（ｐｔｈｒ５０９）、ａｎｔｉ－ＮＲＰ１ ｒｐＡｂ（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ－β－ａｃｔｉｎ ｍＡｂ（和光純薬工業）、ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ ｍＡｂ（コスモバイオ）を用いた。
【0053】
結果を図６（Ａ）に示す。図６（Ａ）から、Ｓｅｍａ３又はｋＣｅｒの添加によりＣＲＭＰ２のリン酸化が誘導されることが示され、また、Ｓｅｍａ３Ａ又はｋＣｅｒの添加と同時にαＮｒｐ１を添加すると、リン酸化が減弱消失されることが示された。これらの結果より、ｋＣｅｒはＳｅｍａ３Ａシグナル経路のＮｒｐ１に作用している可能性が示唆された。
【0054】
実験例３
Ｎｒｐ１遺伝子発現をｓｉＲＮＡで抑制することによるｋＣｅｒのＣＲＭＰリン酸化の作用点の検討について、図４に示すように、具体的には以下の方法で行った。すなわち、６－ウェルプレートに４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．５ｍＬの血清含有ＤＭＥＭ培地に播種して２４時間培養したＰＣ１２細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含む培地に交換して２４時間分化させた。そして、前述のようにｓｉＮＲＰ１、ｓｉＮＧＣＴＲＬで細胞を処理して、その細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、５０μＭ ｋＣｅｒ、５００ｎｇ／ｍＬ Ｓｅｍａ３Ａをそれぞれ含む無血清ＤＭＥＭ培地に置換して２４時間培養した。培養後、実験例２の方法と同様にして、細胞タンパク質を溶解して回収し、ウエスタンブロットを行った。
Ｎｒｐ１遺伝子発現をｓｉＲＮＡで抑制することによるｋＣｅｒのＣＲＭＰリン酸化の作用点の検討について、図４に示すように、具体的には以下の方法で行った。すなわち、６－ウェルプレートに４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．５ｍＬの血清含有ＤＭＥＭ培地に播種して２４時間培養したＰＣ１２細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含む培地に交換して２４時間分化させた。そして、前述のようにｓｉＮＲＰ１、ｓｉＮＧＣＴＲＬで細胞を処理して、その細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、５０μＭ ｋＣｅｒ、５００ｎｇ／ｍＬ Ｓｅｍａ３Ａをそれぞれ含む無血清ＤＭＥＭ培地に置換して２４時間培養した。培養後、実験例２の方法と同様にして、細胞タンパク質を溶解して回収し、ウエスタンブロットを行った。
【0055】
結果を図６（Ｂ）に示す。ｓｉＮＲＰ１で細胞を処理することによりＮｒｐ１タンパクの発現がウエスタンブロットメンブレン上から減弱消失した（図６（Ｂ）、レーン３）。また、ｓｉＮＲＰ１処理細胞ではＳｅｍａ３Ａ又はｋＣｅｒで誘導されるＣＲＭＰ２のリン酸化も減弱消失した（図６（Ｂ）、レーン５、７）。図６（Ｂ）に示した結果より、ｋＣｅｒの作用はＮｒｐ１と直接に作用することで活性を有することが示唆された。
【0056】
実験例４
あらかじめ０．０１％ポリＬ－リジンで表面処理した１２－ウェル培養プレートにＰＣ１２細胞を７．５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬで、血清を含む１ｍＬのＤＭＥＭ培地とともに播種して一晩培養した。培養後に無血清のＤＭＥＭで接着細胞を洗浄した後に、１００ｎｇ／ｍＬ 神経成長因子（ＮＧＦ，２．５Ｓ マウス由来，Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）と、０．０２５％ＢＳＡと、Ｓｅｍａ３Ａ（０、０．０１、０．１、１又は１０μＭ）と、ｋＣｅｒ（０、０．０１、５又は２５μＭ）をそれぞれ所定量含むＤＭＥＭ培地１ｍＬに置換して３日間培養した。各群４ウェルとした。培養後、実験例１と同様の方法で、細胞を染色し、蛍光顕微鏡で画像を得て、神経突起伸長活性を算出し、統計処理した。結果を図７に示す。
あらかじめ０．０１％ポリＬ－リジンで表面処理した１２－ウェル培養プレートにＰＣ１２細胞を７．５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬで、血清を含む１ｍＬのＤＭＥＭ培地とともに播種して一晩培養した。培養後に無血清のＤＭＥＭで接着細胞を洗浄した後に、１００ｎｇ／ｍＬ 神経成長因子（ＮＧＦ，２．５Ｓ マウス由来，Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）と、０．０２５％ＢＳＡと、Ｓｅｍａ３Ａ（０、０．０１、０．１、１又は１０μＭ）と、ｋＣｅｒ（０、０．０１、５又は２５μＭ）をそれぞれ所定量含むＤＭＥＭ培地１ｍＬに置換して３日間培養した。各群４ウェルとした。培養後、実験例１と同様の方法で、細胞を染色し、蛍光顕微鏡で画像を得て、神経突起伸長活性を算出し、統計処理した。結果を図７に示す。
【0057】
また、培養後の細胞について、実験例２と同様の方法で、ＰＢＳで洗浄した後、細胞タンパク質を溶解して回収し、ＣＲＭＰ２のリン酸化活性を測定した。統計処理は、実験例１と同様の方法で行った。結果を図８に示す。
【0058】
図７によれば、低濃度０．０１μＭ Ｓｅｍａ３Ａに対してはｋＣｅｒは突起伸張阻害の相乗作用を示したが、高濃度１０μＭ Ｓｅｍａ３Ａに対してはｋＣｅｒはＳｅｍａ３Ａの突起伸張阻害を減弱する相反的作用を示した。図８によれば、Ｓｅｍａ３Ａの用量依存的な作用に対して、ｋＣｅｒはＳｅｍａ３Ａシグナル伝達経路の下流にあるＣＲＭＰ２のリン酸化作用においても高濃度１０μＭ Ｓｅｍａ３Ａでは逆にＣＲＭＰ２のリン酸化作用を減弱する相反作用を示した。図７、図８に示した結果より、ｋＣｅｒはＳｅｍａ３Ａのパーシャルアゴニストとして、高濃度Ｓｅｍａ３Ａに対してはアンタゴニスト作用を示すことが認められた。
【0059】
実験例５
ｋＣｅｒのＳｅｍａ３ＡレセプターＮｒｐ１との結合作用について、以下の方法で測定した。
＜細胞膜レセプターＮｒｐ１との結合の測定＞
Ｓｅｍａ３Ａの細胞膜レセプターであるＮｒｐ１への結合を調べるために、ヒト組み換え体Ｓｅｍａ３Ａ（ｒｈＳＥＭＡ３Ａ、和光純薬工業）を、フルオレセイン標識キットＮＨ２（同仁化学）を用いて、標識したＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａを調製した。ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａのタンパク量に対する相対蛍光単位は３２，１００ ＲＦＵ／ｐｍｏｌであった。ポリＬ－リジンで表面処理した９６－ウェル蛍光測定用培養マイクロプレートに１×１０5個のＰＣ１２細胞を播種して一晩３７℃で培養後、１％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、その後、終濃度０．３７５μＭから１０μＭのＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａを含む１％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で置換して、２２℃で９０分間インキュベートした。その後に、細胞を１％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄して、各ウェルの蛍光量を、蛍光ウェルリーダー（ＡｐｐｌｉｓｋａｎＴＭ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２５ｎｍで測定した。
ｋＣｅｒ及びその他のセラミドのリガンド置換効果の測定には１０μＭ ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａと、ｋＣｅｒ、Ｃ１６セラミド（Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｎ－Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ１８セラミド（Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｎ－ｓｔｅａｒｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ２４セラミド（Ｃ２４Ｃｅｒ、Ｎ－Ｌｉｎｇｏｃｅｒｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、又はＣ２セラミド（Ｃ２Ｃｅｒ、Ｎ－Ａｃｅｔｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）を、０．０５、０．１８７５、０．３７５、０．７５、１．０、１．２５、２．５、５．０、１０、２０、５０、又は１００μＭを含む１％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で，ウェルプレートの細胞を上記と同様に処理した後に、蛍光量を測定した。
また、１０μＭ ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａと、１０μＭ Ｓｅｍａ３Ａ又は１００μＭ ｋＣｅｒで細胞を処理した場合について、共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ１０ｉ，ＥＸ４９０，ＥＭ５２５，オリンパス）で観察した。コントロールとして、１０μＭ ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａのみで細胞を処理した場合を観察した。
ｋＣｅｒのＳｅｍａ３ＡレセプターＮｒｐ１との結合作用について、以下の方法で測定した。
＜細胞膜レセプターＮｒｐ１との結合の測定＞
Ｓｅｍａ３Ａの細胞膜レセプターであるＮｒｐ１への結合を調べるために、ヒト組み換え体Ｓｅｍａ３Ａ（ｒｈＳＥＭＡ３Ａ、和光純薬工業）を、フルオレセイン標識キットＮＨ２（同仁化学）を用いて、標識したＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａを調製した。ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａのタンパク量に対する相対蛍光単位は３２，１００ ＲＦＵ／ｐｍｏｌであった。ポリＬ－リジンで表面処理した９６－ウェル蛍光測定用培養マイクロプレートに１×１０5個のＰＣ１２細胞を播種して一晩３７℃で培養後、１％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、その後、終濃度０．３７５μＭから１０μＭのＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａを含む１％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で置換して、２２℃で９０分間インキュベートした。その後に、細胞を１％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄して、各ウェルの蛍光量を、蛍光ウェルリーダー（ＡｐｐｌｉｓｋａｎＴＭ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２５ｎｍで測定した。
ｋＣｅｒ及びその他のセラミドのリガンド置換効果の測定には１０μＭ ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａと、ｋＣｅｒ、Ｃ１６セラミド（Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｎ－Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ１８セラミド（Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｎ－ｓｔｅａｒｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ２４セラミド（Ｃ２４Ｃｅｒ、Ｎ－Ｌｉｎｇｏｃｅｒｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、又はＣ２セラミド（Ｃ２Ｃｅｒ、Ｎ－Ａｃｅｔｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）を、０．０５、０．１８７５、０．３７５、０．７５、１．０、１．２５、２．５、５．０、１０、２０、５０、又は１００μＭを含む１％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で，ウェルプレートの細胞を上記と同様に処理した後に、蛍光量を測定した。
また、１０μＭ ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａと、１０μＭ Ｓｅｍａ３Ａ又は１００μＭ ｋＣｅｒで細胞を処理した場合について、共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ１０ｉ，ＥＸ４９０，ＥＭ５２５，オリンパス）で観察した。コントロールとして、１０μＭ ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａのみで細胞を処理した場合を観察した。
【0060】
結果を図９（Ａ）～図９（Ｂ）、表１及び表２に示す。図９（Ａ）は、蛍光画像であり、図９（Ｂ）は、各セラミドの量に対する細胞に結合した蛍光量を示すグラフである。１０μＭ ＦＩＴＣ（フルオレセイン標識）－Ｓｅｍａ３Ａを用いたＰＣ１２細胞との結合を調べた結果、図９（Ａ）のコントロールのような結合が蛍光画像で観察された。１０μＭ ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａに加えて、１０μＭ Ｓｅｍａ３Ａ又は１００μＭ ｋＣｅｒで細胞を処理すると、コントロールに比べてＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａの蛍光量の顕著な減弱が起きた。蛍光の減弱はＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａが細胞膜レセプターであるＮｒｐ１に結合する際の置換効果と考えられた。さらに、ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａ（０．３７５、０．７５、１．２５、２．５、５．０、１０μＭ）で細胞を処理することで、ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａの細胞への用量依存的な結合が観察されたが、２．５μＭ以上では結合量に飽和が見られた。ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａ用量曲線からスキャッチャードプロットすることにより下記の表１の結合定数が算出された。
【0061】
【表1】
【0062】
次に、１０μＭ Ｓｅｍａ３Ａの細胞への結合に対してＳｅｍａ３Ａ、ｋＣｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒの置換効果を調べた結果、Ｓｅｍａ３ＡとｋＣｅｒは用量依存的置換効果を示したが、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒにはそのような効果は認められなかった（図９（Ｂ））。Ｓｅｍａ３ＡとｋＣｅｒの置換効果によるＩＣ50を表２に示した。Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆの変換式に従って算出した置換効果のＫｉは３μＭであった。
【0063】
【表2】
【0064】
図９に示した結果より、ｋＣｅｒはＳｅｍａ３ＡのＮｒｐ１結合に対して置換効果を示すことが明らかになった。
【0065】
実験例６
＜バイオレイヤー干渉法によるＮｒｐ１との分子間結合の測定＞
０．３％ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ－ｆｒｅｅ ＢＳＡ／ＤＰＢＳ緩衝液により可溶化したｋＣｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒをアナライトとして、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１（Ｎｒｐ， Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ６－Ｈｉｓ ｔａｇ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）をリガンドとして、Ｂｌｉｚ（プライムテック）を用いてバイオレイヤー干渉法による分子間結合測定を行った。０．６、０．３、又は０．１５μＭ Ｓｅｍａ３Ａ（ｒｈＳＥＭＡ３Ａ、和光純薬工業）をアナライトとして結合相と解離相からｃｕｒｖｅ－ｆｉｔｔｉｎｇで求めた反応速度定数（結合速度Ｋａ，解離速度Ｋｄ）及び解離定数ＫＤを、ｋＣｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒと比較検討した。リガンドの固相化にはＮｉ－ＮＴＡセンサー（１４８２０２１４、プライムテック）を用いた。結果を表３及び図１０に示す。
＜バイオレイヤー干渉法によるＮｒｐ１との分子間結合の測定＞
０．３％ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ－ｆｒｅｅ ＢＳＡ／ＤＰＢＳ緩衝液により可溶化したｋＣｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒをアナライトとして、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１（Ｎｒｐ， Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ６－Ｈｉｓ ｔａｇ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）をリガンドとして、Ｂｌｉｚ（プライムテック）を用いてバイオレイヤー干渉法による分子間結合測定を行った。０．６、０．３、又は０．１５μＭ Ｓｅｍａ３Ａ（ｒｈＳＥＭＡ３Ａ、和光純薬工業）をアナライトとして結合相と解離相からｃｕｒｖｅ－ｆｉｔｔｉｎｇで求めた反応速度定数（結合速度Ｋａ，解離速度Ｋｄ）及び解離定数ＫＤを、ｋＣｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒと比較検討した。リガンドの固相化にはＮｉ－ＮＴＡセンサー（１４８２０２１４、プライムテック）を用いた。結果を表３及び図１０に示す。
【0066】
【表3】
【0067】
図１０から、Ｒｍａｘでは弱いながらｋＣｅｒが直接にＮｒｐ１に結合できることが示された。その結合定数は表３に示したようにｋＣｅｒのＫＤ値が５．０５７μＭであり、Ｓｅｍａ３Ａの３．６倍であった。他方の反応速度定数で比較を行うと、Ｋａは６７１２．０と５８２６．３であり大きな差異はなかったが、Ｋｄが４．３倍であり、ｋＣｅｒのＫＤ値は解離速度の寄与が大きいと考えられた。他方、Ｃ１６ＣｅｒとＣ１８ＣｅｒではＲｍａｘがＳｅｍａ３Ａの１／５０以下であり、ＫＤの算出は不可能（Ｎ／Ａ）であった。しかしながら、結合相と解離相から各々算出された反応速度定数で比較検討したところ、Ｋａが１０5以上であり、Ｋａも０．１と比較的大きかったので、その結合は非特異的な吸着によって起きており解離も容易であるということが考察された。図１０の結果より、ｋＣｅｒはＮｒｐ１分子に対して結合する活性を持っていることが確認された。
【0068】
実験例７
＜示差走査熱量測定による熱安定性の測定＞
ｋＣｅｒ、ｋＧｌｃＣｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ８Ｃｅｒ（Ｃ８セラミド、Ｎ－Ｏｃｔａｎｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ２Ｃｅｒを、０．３％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ緩衝液で１００μＭに調製した。測定はＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ （Ｍａｌｖｅｒｎ）で行い、２０℃から９０℃まで走査速度０．２℃／分で昇温した。測定結果はＤＰＢＳ緩衝液の測定値を差し引くことで補正を行った。測定チャートを用いてＭｉｃｒｏ ｃａｌ ： Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓにより解析し、融解温度（Ｔｍ）とエントロピー変化量（ΔＨ）を求めた。
＜示差走査熱量測定による熱安定性の測定＞
ｋＣｅｒ、ｋＧｌｃＣｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ８Ｃｅｒ（Ｃ８セラミド、Ｎ－Ｏｃｔａｎｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ２Ｃｅｒを、０．３％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ緩衝液で１００μＭに調製した。測定はＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ （Ｍａｌｖｅｒｎ）で行い、２０℃から９０℃まで走査速度０．２℃／分で昇温した。測定結果はＤＰＢＳ緩衝液の測定値を差し引くことで補正を行った。測定チャートを用いてＭｉｃｒｏ ｃａｌ ： Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓにより解析し、融解温度（Ｔｍ）とエントロピー変化量（ΔＨ）を求めた。
【0069】
【表4】
【0070】
ｋＣｅｒ、ＢＳＡ、ｋＧｌｃＣｅｒの昇温比熱変化の結果を図１１に示し、各サンプルの解析結果を表４に示した。ｋＣｅｒはＢＳＡ単独に比べＴｍの温度が上昇していた。すなわちＢＳＡにｋＣｅｒが結合したことで、ＢＳＡの安定性が増したことを示している。また、ΔＨがＢＳＡやｋＧｌｃＣｅｒがｋＣｅｒより減少していることから、ＢＳＡと複合体を形成する際にグルコースが外れることで熱力学的パラメータに違いが出来ると考えられる。脂肪酸側鎖長の異なるセラミドと比較するとＴｍとΔＨともに、炭化水素の短いＣ８セラミドやＣ２セラミドにより近い傾向を示した（表４）。この結果から、ＫＣｅｒはＣ１６ＣｅｒやＣ１８Ｃｅｒとは一部異なる形でＢＳＡと複合体を形成し、Ｎｒｐ１への特異的な結合活性を示すと考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
