特許 7086329 エリートイベントキャノーラＮＳ－Ｂ５００２７－４

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-10

(45)【発行日】2022-06-20

(54)【発明の名称】エリートイベントキャノーラＮＳ－Ｂ５００２７－４

(51)【国際特許分類】

   A01H 6/20 20180101AFI20220613BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20220613BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20220613BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220613BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220613BHJP

   A23D 9/02 20060101ALI20220613BHJP

   A61K 31/202 20060101ALI20220613BHJP

   A61K 36/31 20060101ALI20220613BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20220613BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20220613BHJP

   A61P 3/02 20060101ALN20220613BHJP

【ＦＩ】

A01H6/20 ZNA

A01H5/10

A01H5/00 A

C12N5/10

C12N15/11 Z

A23D9/02

A61K31/202

A61K36/31

C12N15/53

C12Q1/686 Z

A61P3/02

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2019518180

(86)(22)【出願日】2017-06-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-09-26

(86)【国際出願番号】 US2017038047

(87)【国際公開番号】W WO2017219006

(87)【国際公開日】2017-12-21

【審査請求日】2020-05-29

(31)【優先権主張番号】62/351,246

(32)【優先日】2016-06-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-123186

(73)【特許権者】

【識別番号】522058486

【氏名又は名称】ニューシード ニュートリショナル オーストラリア ピーティーワイ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】ガオ，ウェンシャン

(72)【発明者】

【氏名】ディヴァイン，マルコム

(72)【発明者】

【氏名】レオンフォルテ，アントニオ

(72)【発明者】

【氏名】ゴロロ，ネルソン

(72)【発明者】

【氏名】バッザ，グレッグ

(72)【発明者】

【氏名】タン，シュンシェー

(72)【発明者】

【氏名】ペトリー，ジェームス

(72)【発明者】

【氏名】シン，スリンダー

【審査官】山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５２８０２７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ０１Ｈ ６／２０

Ａ０１Ｈ ５／１０

Ａ０１Ｈ ５／００

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｑ １／６８６

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ａ２３Ｄ ９／０２

Ａ６１Ｐ ３／０２

Ａ６１Ｋ ３１／２０２

Ａ６１Ｋ ３６／３１

Ｃ１２Ｎ １５／５３

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子であって、前記同系交配のキャノーラ系統の種子は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２３１８６の下で寄託されている、種子。

【請求項2】

請求項１に記載の種子の成長により生産されたキャノーラ植物又はその一部分。

【請求項3】

前記一部分は、種子、葉、花粉、胚、根、根端、鞘、花、胚珠、柄、細胞、原形質体、あるいは組織培養物の少なくとも一つであることを特徴とする請求項２に記載のキャノーラ植物又はその一部分。

【請求項4】

請求項２に記載の植物の種子を得る工程、及びキャノーラ油を得るために種子を処理する工程を含む、キャノーラ油を生産する方法。

【請求項5】

請求項２に記載の植物の種子の中のドコサヘキサエン酸を生産する方法であって、該方法は、前記植物を栽培する工程を含む、方法。

【請求項6】

請求項５におけるように栽培された植物の種子。

【請求項7】

請求項２に記載のキャノーラ植物又はその一部分、または前記植物の誘導体あるいはハイブリッドであって、
（ａ）配列番号４３（ＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴ）及び配列番号４４（ＡＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＴＡＣＡＧＡ）、これらのいずれか、あるいは両者と少なくとも９５％一致する配列、またはその補体、
（ｂ）配列番号４５（ＧＧＣＴＡＡＧＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＴ）及び配列番号４６（ＣＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡ）、これらのいずれか、あるいは両者と少なくとも９５％一致する配列、またはその補体、
（ｃ）配列番号４７及び配列番号４８、これらのいずれか、あるいは両者と少なくとも９５％一致する配列、またはその補体、または、
（ｄ）配列番号４９及び配列番号５０、これらのいずれか、あるいは両者と少なくとも９５％一致する配列、またはその補体、
から選択される核酸分子の少なくとも一対を含み、
ここで、前記植物の誘導体あるいはハイブリッドは、請求項１に記載の同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子由来の形質を表わすことを特徴とする、
請求項２に記載のキャノーラ植物又はその一部分、または前記植物の誘導体あるいはハイブリッド。

【請求項8】

前記植物は、
（ｉ）配列番号４０の位置２０９０から１４２０１までに示される核酸配列から成る、第一の遺伝子導入の発現カセット、及び
（ｉｉ）配列番号４１の位置１２６８から４７７７３までに示される核酸配列から成る、第二の遺伝子導入の発現カセット、
を含むことを特徴とする請求項２に記載のキャノーラ植物。

【請求項9】

請求項２に記載の植物、またはそれらの誘導体あるいはハイブリッドの少なくとも９５％の種子を含む種子の集まりであって、
前記種子は、５乃至１６％のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（種子における全脂肪酸の重量％）、あるいは５乃至１７％の長鎖多不飽和脂肪酸（種子における全脂肪酸の重量％としてのエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、及びＤＨＡの合計）を含む、
種子の集まり。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１６年６月１６日出願の米国仮特許出願第６２／３５１，２４６号の利益を主張するものであり、これは全ての目的のために本明細書に完全に組み込まれるものである。

【0002】

配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれるものである。

【0003】

技術分野
本実施形態は、キャノーラの育種及び農作物の分野、具体的にはエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４に関連する。

【背景技術】

【0004】

キャノーラは、世界の多くの区域で重要な油料作物である。キャノーラ油の脂肪酸組成物は、短鎖オメガ－３を含む一不飽和及び多不飽和両方の脂肪酸が豊富であるが、長鎖オメガ－３脂肪酸は不足している。長鎖オメガ－３（ＬＣ－ω３）脂肪酸には健康上の利益が確立されているが、現在ではＬＣ―ω３脂肪酸は、主として藻類から直接、或いは藻類を食べる海水魚から得られる。食物由来のＬＣ－ω３脂肪酸、具体的にドコサヘキサエン酸（２２：６ ｎ－３；ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（２０：５ ｎ－３；ＥＰＡ）の認識は、消費可能な魚油の需要の劇的な増加に寄与した。故に、ヒトによる消費のために、ＬＣ－ω３脂肪酸の代替的で直接的なソースが必要とされている。加えて、タイセイヨウサケなどの養殖魚は食物由来の脂肪酸に比例して脂肪酸を蓄積させるので、魚用飼料のＬＣ多不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）の量を維持し、その次に、養殖魚中のこれらの脂肪酸の存在を確保する必要がある。従って、水産養殖に使用され得るＬＣ－ＰＵＦＡが豊富なソースが必要とされている。例えば、水産養殖での使用の他、ヒトによる直接消費のために、ＬＣ－ＰＵＦＡ、具体的にＤＨＡなどＬＣ－ω３脂肪酸を生産することができるキャノーラが必要とされている。しかし、分子遺伝学による植物の育種及び操作の達成にもかかわらず、野生の魚で生産されたものに近いＬＣ－ＰＵＦＡ含有量を持つキャノーラ油の商用の供給源は存在しない。更に、キャノーラ栽培品種（Ｆ１雑種ではない）は、確実な方式での商品作物の生産に有用となるように、均質であり、同型接合性であり、且つ再分化可能でなければならない。それ故、維持可能な作物として成長させることができるキャノーラ系統が必要とされ、その種子は商業上実行可能な量のＤＨＡなどのＬＣ－ω３脂肪酸をもたらすものである。

【発明の概要】

【0005】

本明細書に記載される実施形態は、同系交配の組み換え型キャノーラ系統を提供するものであり、ＮＳ－Ｂ５００２７－４が指定され、その種子はω３及びＬＣ－ω３脂肪酸の有利なレベルをもたらし、それにより、これら価値のある油を生産するための再分化可能で地上ベースのシステムをもたらす。同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子の代表的なサンプルは、２０１６年６月９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）にてブダペスト条約に従い受託され、受託番号ＰＴＡ－１２３１８６を割り当てられた（付録Ａを参照）。本明細書には、同系交配のキャノーラＮＳ－Ｂ５００２７－４系統の細胞、組織、種子、及び油も記載される。遺伝子組み換え操作を伴う選択及び育種の組み合わせにより、変異が存在しない種における変異が可能になる。例えば、本明細書に記載されるキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の脂肪酸プロファイルは、天然のＢ．ナパスには存在せず；そして、本明細書に記載される形質、具体的にＤＨＡを生産するのに都合の良い形質は、人によるかなりの技術的な介入によって発達した。

【0006】

本実施形態の態様は、キャノーラ（ブラッシカ・ナパスＬ．）系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子、即ち、全脂肪酸含有量に対するω３及びＬＣ－ω３脂肪酸の高い割合（パーセント）をその種子の中に蓄積する安定した均一な育種系統へと選択され且つ育種された、栽培品種ＡＶ Ｊａｄｅの遺伝子組み換えキャノーラを提供する。近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４は、一部の野生の魚油に見出されるものに近いレベルでＬＣ－ω３脂肪酸、具体的にＤＨＡを含む種子を生産するキャノーラ植物を提供するために開発された。ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来の食用油には、他のＢ．ナパス植物よりも著しく高いＤＨＡ含有量がある。新たな均一な育種系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４は、安定した高収量の形態学的に適当なキャノーラ系統における高いＤＨＡ形質のために、遺伝子形質転換、その後、厳格な選択及び育種によって開発された。

【0007】

従って、本明細書に記載される少なくとも１つの実施形態は、同系交配のキャノーラＮＳ－Ｂ５００２７－４系統の種子；同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子から栽培された植物、及びその花粉、胚珠、又は種子などの一部；及び、同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４を栽培することにより、又は、同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４をそれ自体或いは別のキャノーラ又はブラッシカの系統と交雑させることにより、及び成長された後代から種子を得ることによりキャノーラ植物から種子を生産するための方法に関する。

【0008】

少なくとも１つの実施形態は、本明細書に記載される方法により生産されたキャノーラ植物の集団から種子を提供するものであり、前記集団は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４からそのアレルを、平均で１０％から１００％派生させる。同様に、本実施形態は、種子、油、粉末、又はタンパク質の生産のために植物を育種、又は栽培するための、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の亜系統、ＮＳ－Ｂ５００２７－４又は亜系統の後代、或いは、ＮＳ－Ｂ５００２７－４を別のキャノーラ又はブラッシカ植物と交雑することによって生産された植物の使用を提供する。

【0009】

少なくとも１つの実施形態は、ゲノム中に同系交配のＮＳ－Ｂ５００２７－４のゲノムの少なくとも一部を含んでいる、ブラッシカ・ナパス植物などの菜種植物の種子を提供する。少なくとも１つの実施形態は、ゲノム中に同系交配のＮＳ－Ｂ５００２７－４のゲノムの少なくとも一部を含んでいる、Ｂ．ナパス植物などの植物を提供する。少なくとも１つの実施形態は、ゲノム中に同系交配のＮＳ－Ｂ５００２７－４のゲノムの少なくとも一部を含んでいる、Ｂ．ナパス植物などの菜種植物の細胞を提供する。別の実施形態は、系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４のゲノムの少なくとも一部を含んでいる、Ｂ．ナパス植物などの菜種植物のゲノムＤＮＡを提供する。少なくとも１つの実施形態は更に、受託番号ＰＴＡ－１２３１８６を持つＡＴＣＣ（登録商標）にて寄託された種子から成長される、ＮＳ－Ｂ５００２７－４のゲノムの少なくとも一部を含む植物の種子、細胞、組織、組織培養、後代、及び子孫に関連する。別の実施形態は更に、（受託番号ＰＴＡ－１２３１８６を持つＡＴＣＣ（登録商標）にて寄託された種子から成長された植物などの）ＮＳ－Ｂ５００２７－４のゲノムの少なくとも一部を含むキャノーラ植物から（その繁殖又はそれとの育種などにより）得ることが可能な植物を提供する。

【0010】

少なくとも１つの実施形態は、ゲノム中に系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントを含んでいる、Ｂ．ナパス植物などの菜種植物の種子を提供する。少なくとも１つの実施形態は、ゲノム中に近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントを含んでいる、Ｂ．ナパス植物などの植物を提供する。別の実施形態は、系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントを含んでいる、Ｂ．ナパス植物などの菜種植物のゲノムＤＮＡを提供する。少なくとも１つの実施形態は更に、受託番号ＰＴＡ－１２３１８６を持つＡＴＣＣ（登録商標）にて寄託された種子から成長される、ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントを含む植物の種子、細胞、組織、後代、及び子孫に関連する。別の実施形態は更に、（受託番号ＰＴＡ－１２３１８６を持つＡＴＣＣ（登録商標）にて寄託された種子から成長された植物などの）エリートイベントを含むキャノーラ植物から（その繁殖又はそれとの育種などにより）得ることが可能な植物を提供する。実施形態はまた、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を含むキャノーラ植物に関する。

【0011】

本実施形態の近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４の基準種子は、受託番号ＰＴＡ－１２３１８６の下でＡＴＣＣ（登録商標）により寄託されている。少なくとも１つの実施形態は、受託番号ＰＴＡ－１２３１８６として寄託されたＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子を提供し、これは、種子の全脂肪酸の重量％として、種子が従来の収穫時に少なくとも５％のＤＨＡ、約６％のＤＨＡ、約７％のＤＨＡ、約８％のＤＨＡ、約９％のＤＨＡ、約１０％のＤＨＡ、約１１％のＤＨＡ、約１２％のＤＨＡ、約１３％のＤＨＡ、約１４％のＤＨＡ、約１５％のＤＨＡ、約１６％のＤＨＡ、約１７％のＤＨＡ、又はそれ以上のＤＮＡを含んでいるキャノーラ植物へと成長する。

【0012】

少なくとも１つの実施形態において、ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ－１２３１８６の種子は、ＮＳ－Ｂ５００２７のエリートイベントの導入遺伝子を持つ少なくとも約９５％の同系交配の遺伝子導入種子から成る種子のロットであり、これは、種子の全脂肪酸の重量％として、種子が少なくとも５％のＤＨＡ、約６％のＤＨＡ、約７％のＤＨＡ、約８％のＤＨＡ、約９％のＤＨＡ、約１０％のＤＨＡ、約１１％のＤＨＡ、約１２％のＤＨＡ、約１３％のＤＨＡ、約１４％のＤＨＡ、約１５％のＤＨＡ、約１６％のＤＨＡ、約１７％のＤＨＡ、又はそれ以上のＤＮＡを含んでいるキャノーラ植物へと成長する。ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ－１２３１８６の種子は、ＮＳ－Ｂ５００２７のエリートイベントを含む、導入遺伝子ＤＮＡと同型接合性の少なくとも約９５％の遺伝子導入種子から成る種子のロットであり、これは、種子の全脂肪酸の重量％として、種子が少なくとも５％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約６％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約７％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約８％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約９％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１０％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１１％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１２％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１３％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１４％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１５％のＬＣ－ＵＦＡ、約１６％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１７％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１８％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１９％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約２０％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約２１％のＬＣ－ＰＵＦＡ、又はそれ以上のＬＣ－ＰＵＦＡを含むキャノーラ植物へと成長する。

【0013】

別の実施形態において、（例えば、同じ又は異なる遺伝的背景を持つキャノーラ又はブラッシカ植物と交雑した後に）寄託された種子から獲得可能又は獲得される種子又は後代を蒔くことができ、成長する植物にはＮＳ－Ｂ５００２７－４とほぼ同じ表現型があり得る。少なくとも１つの実施形態において、従来の収穫時に、ＮＳ－Ｂ５００２７－４－後代種子の脂肪酸含有量は、種子の全脂肪酸の重量％として、少なくとも５％のＤＨＡ、約６％のＤＨＡ、約７％のＤＨＡ、約８％のＤＨＡ、約９％のＤＨＡ、約１０％のＤＨＡ、約１１％のＤＨＡ、約１２％のＤＨＡ、約１３％のＤＨＡ、約１４％のＤＨＡ、約１５％のＤＨＡ、約１７％のＤＨＡ、約１８％のＤＨＡ、約１９％のＤＨＡ、約２０％のＤＨＡ、約２１％のＤＨＡ、約２２％のＤＨＡ、約２３％のＤＨＡ、約２４％のＤＨＡ、又はそれ以上のＤＨＡを含む。少なくとも１つの実施形態において、従来の収穫時に、ＮＳ－Ｂ５００２７－４－後代種子の脂肪酸含有量は、種子の全脂肪酸の重量％として、少なくとも５％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約６％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約７％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約８％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約９％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１０％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１１％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１２％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１３％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１４％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１５％のＬＣ－ＵＦＡ、約１６％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１７％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１８％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約１９％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約２０％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約２１％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約２２％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約２３％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約２４％のＬＣ－ＰＵＦＡ、約２５％のＬＣ－ＰＵＦＡ、又はそれ以上のＬＣ－ＰＵＦＡを含む。

【0014】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子は、従来のキャノーラ変種よりも実質的に多くのω３ ＡＬＡも含んでいる。少なくとも１つの実施形態において、従来の収穫時に、ＮＳ－Ｂ５００２７－４－後代種子の脂肪酸含有量は、種子の全脂肪酸の重量％として、少なくとも１５％のＡＬＡ、約１６％のＡＬＡ、約１７％のＡＬＡ、約１８％のＡＬＡ、約１９％のＡＬＡ、約２０％のＡＬＡ、約２１％のＡＬＡ、約２２％のＡＬＡ、約２３％のＡＬＡ、約２４％のＡＬＡ、又はそれ以上のＡＬＡを含む。

【0015】

本実施形態の別の態様は、都合のよいω３脂肪酸及びＬＣ－ω３脂肪酸レベルを持つ油を提供し、その中の脂肪酸含有量には、一般的なキャノーラ油よりも高いω３：ω６脂肪酸の比率が含まれる。例えば、ＡＶ ＪａｄｅにはＬＡ（ω６）に匹敵するＥＰＡ／ＤＰＡ／ＤＨＡ（ω３）がなく、一実施形態において、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子油には、約１．２５などの、約１から約７のＥＰＡ／ＤＰＡ／ＤＨＡ（ω３）：ＬＡ（ω６）の比率がある。ＮＳ－Ｂ５００２７－４のω３：ω６の脂肪酸の比率は、パルミチン酸に関しては特に都合がよい。親系統であるＡＶ Ｊａｄｅの油にはＤＨＡがなく、故にＤＨＡ：パルミチン酸塩の比率がなく；ＮＳ－Ｂ５００２７－４の油には、例えば約２．１２のＤＨＡ：パルミチン酸塩の比率があり；養殖のサケの油には、０．５９の報告されたＤＨＡ：パルミチン酸塩の比率があり；及び野生のサケの油には、１．０２の報告されたＤＨＡ：パルミチン酸塩の比率がある。少なくとも１つの実施形態において、ＮＳーＢ５００２７ー４の種子油におけるω３：ω６の脂肪酸の比率は、約６の比率など、約３から約７である。

【0016】

本実施形態の別の態様において、近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子の油、脂質、ω３－ＦＡ、ＬＣ－ＰＵＦＡ、又はＤＨＡは、ヒト又は動物の食料（飲料を含む食物又は食用材料）として又はその中に、或いは栄養剤（食品添加物）として使用される。少なくとも１つの実施形態において、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子の油、脂質、ω３－ＦＡ、ＬＣ－ＰＵＦＡ、又はＤＨＡは、栄養補助食品に、又は水産養殖に使用するための飼料添加物として使用される。少なくとも１つの実施形態において、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子の油、脂質、ω３－ＦＡ、ＬＣ－ＰＵＦＡ、又はＤＨＡは、医薬組成物として、又はその中に使用される。少なくとも１つの他の実施形態において、ＮＳ－Ｂ５００２７－４又はその後代の種子から得られる又は富化される種子粉末又はタンパク質は、ヒト又は動物の食料（食物又は食用材料）として又はその中に、或いは栄養剤（食品添加物）として使用される。特定の実施形態において、ＮＳ－Ｂ５００２７－４又はその後代の種子の油、脂質、粉末、又はタンパク質は、水産養殖のための飼料として使用される。

【0017】

本実施形態の態様は、ＬＣ－ＰＵＦＡの生合成経路の「フロントエンド」の幾つかの酵素を発現する遺伝子構築物の複数のコピーを植物に（例えば遺伝子形質転換又は育種により）提供することにより、植物中のＬＣ－ＰＵＦＡを増大させる方法を提供する。例えば、酵素Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、及びω３／Δ１５デサチュラーゼの全てがフロントエンド酵素として排他的に考慮され得るものではないが、特定の実施形態において、これら遺伝子は、ＬＣ－ＰＵＦＡを生産する植物中のＤＨＡなどのＬＣ－ＰＵＦＡの生産を増強する人工遺伝子座へとアセンブルされる。特定の実施形態において、幾つかのフロントエンド遺伝子を含む人工遺伝子座は、ミクロモナス・プシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・ コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、及びピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼを含んでいる。

【0018】

記載された実施形態の態様は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４が指定された新たなキャノーラ育種系統、核ゲノム中にＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントを含むブラッシカ・ナパスＬ．などの菜種植物を提供する。系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝子イベントを含むブラッシカ植物は、従来のキャノーラ植物中で生産された脂肪酸よりも不飽和で長い鎖を含む、脂肪酸の種子に特異的な生産が可能となる。同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４植物は、非遺伝子組み換えの同系のキャノーラ植物系統とほぼ同等である他の農学のパフォーマンス形質を示すが、このよう形質は、独立した系統又は栽培品種を提供するような他の系統とは異なる。同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子の代表的なサンプルは、ＡＴＣＣ（登録商標）にて受託番号ＰＴＡ－１２３１８６として寄託されている。

【0019】

少なくとも１つの実施形態は、少なくとも１つのトランスジェニックインサートをゲノムへと安定して統合する、遺伝子導入キャノーラの種子、植物、或いは植物の部分、組織、又は細胞に関するものであり、少なくとも１つのトランスジェニックインサートは１６の異種遺伝子を含む発現カセットを含み、導入遺伝子は、植物発現のためにコドンを最適化されており、且つ、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ６エロンガーゼ、ラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ、及び少なくとも１つのニコチアナ・タバカム由来のマトリックス付着領域（ＭＡＲ）、及び選択可能なマーカー遺伝子をコードし；並びに、少なくとも１つのトランスジェニックインサートは４つの異種遺伝子を含む発現カセットを含み、導入遺伝子は、植物発現のためにコドンを最適化され、且つ、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ導入遺伝子、及び少なくとも１つのニコチアナ・タバカム由来のＭＡＲをコードする。同系交配の遺伝子導入系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４はこの実施形態を例証し、これら異種遺伝子を備えた種子の代表的なサンプルは、ＡＴＣＣ（登録商標）にて受託番号ＰＴＡ－１２３１８６として寄託されている。

【0020】

本実施形態の別の態様は、同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４から得られる単離又は精製されたゲノムＤＮＡ、或いは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２３１８６として種子が寄託されている系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントを含むキャノーラ植物を提供する。このようなゲノムＤＮＡは、例えば、本明細書に記載される同定アッセイにおける基準対照物質として使用されてもよい。少なくとも１つの実施形態は、位置１１８５８９９０３－１１８５９１６７７においてＢ．ナパス基準ゲノム（２ｎ＝ＡＡＣＣ；ｖａｒ．Ｄａｒｍｏｒ）のｃｈｒＵｎ＿ｒａｎｄｏｍ上に位置するＨＰＰ遺伝子の３’ＵＴＲの中、及び位置１８５６９２９８－１８５７１０６６においてＢ．ラパ基準ゲノム（２ｎ＝ＡＡ、ｖａｒ．Ｃｈｉｉｆｕ）のクロモソームＡ０２にて欠失があるブラッシカ・ナパスＬ．のゲノムを提供し、ここで、欠失はＧＴＡＧＣＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）である。１５－ｂｐ欠失は、位置１１８５８９９２７－１１８５８９９４１においてＢ．ナパス基準ゲノムのｃｈｒＵｎ＿ｒａｎｄｏｍの上、及び、位置１８５６９３１６－１８５６９３３０においてＢ．ラパ基準ゲノムのクロモソームＡ０２の上に位置していた。少なくとも１つの実施形態は、位置１７２６７７４６－１７２７０７００においてＢ．ナパス基準（ｖａｒ．Ｄａｒｍｏｒ）ゲノムのクロモソームＡ０５に位置するＰｔｏ結合タンパク質（ＰＴＩ）をコードする遺伝子の第２のエキソンの中に欠失があるブラッシカ・ナパスＬ．植物を提供し、その欠失はＰＴＩの発現を妨害し、欠失はＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）である。これらの欠失は、同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４のゲノムの特徴であり、系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４及び系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来する後代を識別するために使用され得る。

【0021】

従って、本実施形態は更に、同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝子導入の態様（エリートイベント）を含む遺伝子導入植物、或いはその細胞又は組織を同定する方法を提供し、該方法は、特定のヌクレオチド配列を持ち又は特定のアミノ酸をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子の存在の同定に基づく。例えば、このような特徴を持つＤＮＡ分子は、１５塩基対（ｂｐ）、少なくとも１５ｂｐ、２０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２４ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、又は３０を超えるｂｐの配列を含み、当該配列は、イベントの挿入接合部位、即ち、ＬＣ－ω３脂肪酸合成遺伝子（発現のための調節配列を含む「遺伝子」など）を含む挿入された外来ＤＮＡの一部及びそれに接触するキャノーラ又はブラッシカのゲノムの一部（各挿入のための５’又は３’何れかの隣接領域）の両方を含んでおり、エリートイベントの特定の同定を可能にする。例えば、ＮＳ－Ｂ５００２７－４のクロモソームＡ０２における４－遺伝子インサートの５’末端の接合配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３を含み；クロモソームＡ０２における４－遺伝子インサートの３’末端の接合配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４を含み；ＮＳ－Ｂ５００２７－１６のクロモソームＡ０５における１６－遺伝子インサートの５’末端の接合配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５を含み；及びクロモソームＡ０５における１６－遺伝子インサートの３’末端の接合配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６を含む。この実施形態はまた、そのような方法により同定された同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントを含む植物に関連する。

【0022】

本実施形態の別の態様は、近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントの検出に有用となり、且つＮＳ－Ｂ５００２７－４を含む又は近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４に関連する植物を特徴づけるように、ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントの挿入部位、及びキャノーラのゲノムＤＮＡ及び遺伝子導入ＤＮＡの両方の十分な長さのポリヌクレオチドを含む、核酸分子（例えばポリヌクレオチド又はＤＮＡ）を提供する。そのような分子は、例えば、結合部位の各側それぞれに、キャノーラのゲノムＤＮＡの少なくとも９のヌクレオチド、及び同様の数の導入遺伝子ＤＮＡのヌクレオチドを含むこともある。例えば、そのようなＤＮＡ分子は、キャノーラのゲノムＤＮＡの少なくとも９のヌクレオチド、並びに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（例えばヌクレオチド２０８１～２０９８、及びヌクレオチド１４１９３～１４２１０）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１（例えばヌクレオチド１１５１～１１６８、及びヌクレオチド４７７６５～４７７８２）における挿入部位に隣接する遺伝子領域を含む導入遺伝子（外来）ＤＮＡの同様の数のヌクレオチドを含む。本発明の１つの態様において、キャノーラ植物はそのような特定の核酸分子を含んで提供される。

【0023】

少なくとも１つの実施形態は、少なくとも１つのトランスジェニックインサートをゲノムへと安定して統合する、ブラッシカ又はキャノーラの種子、或いはその植物細胞、植物、植物部分、又は組織に関するものであり、少なくとも１つのトランスジェニックインサートは１６の異種遺伝子を含む発現カセットを含み、導入遺伝子は、植物発現のためにコドンを最適化され、且つ、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、Δ６エロンガーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ、及びラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼ、少なくとも１つのニコチアナ・タバカム由来のマトリックス付着領域（ＭＡＲ）、及び選択可能なマーカー遺伝子をコードし；１６のトランスジェニックインサートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド１２６８～４７７７３によって特徴付けられ；及び少なくとも１つのトランスジェニックインサートは、４つの異種遺伝子の発現カセットを含み、遺伝子は、植物発現のためにコドンを最適化され、且つ、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ導入遺伝子、及び少なくとも１つのニコチアナ・タバカム由来のＭＡＲをコードし；４－遺伝子インサートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド２０９０～１４２０１によって特徴付けられる。少なくとも１つの実施形態において、２つの発現カセットは、植物ゲノムにおける２つの異なるクロモソームに位置する。

【0024】

別の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１の核酸配列、又はその補体を持つ組み換え型核酸分子を提供する。別の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０の位置２０９０～１４２０１の核酸配列、又はその補体を持つ組み換え型核酸分子を提供する。別の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１の位置１１６０～４７７７３の核酸配列、又はその補体を持つ組み換え型核酸分子を提供する。本実施形態はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド２０９０～１４２０１の核酸配列、又はその組み合わせを含む、ブラッシカ又はキャノーラ種子；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド１１６０～４７７７３の核酸配列、又はその補体を含む、ブラッシカ又はキャノーラ種子を提供する。別の実施形態は、そのような核酸分子を含む種子又は細胞を提供する。

【0025】

別の実施形態は、以下のヌクレオチド配列を順に含む、人工遺伝子座を含むＤＮＡ分子を提供する：（ａ）ヌクレオチド２７４７からヌクレオチド６２５０までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列；（ｂ）ヌクレオチド６２５７からヌクレオチド８４１４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド８４１５からヌクレオチド１０３７４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列；（ｄ）ヌクレオチド１０３７５からヌクレオチド１１５４４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列；及び（ｅ）ヌクレオチド１１５４５からヌクレオチド１４０４９までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列；（ｆ）ヌクレオチド配列（ａ）～（ｅ）との少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子；又は（ｇ）それらの補体。関連する実施形態は、この人工遺伝子座を含む植物細胞、植物材料、又は植物種子を提供する。

【0026】

別の実施形態は、以下のヌクレオチド配列を順に含む、人工遺伝子座を含むＤＮＡ分子を提供する：（ａ）ヌクレオチド１２６８からヌクレオチド５３１７までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｂ）ヌクレオチド５３２４からヌクレオチド７４８１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド７４８２からヌクレオチド９４４３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｄ）ヌクレオチド９４４４からヌクレオチド１０６１１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｅ）ヌクレオチド１０６１２からヌクレオチド１３１１６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｆ）ヌクレオチド１３１１７からヌクレオチド１７０００までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｇ）ヌクレオチド１７００１からヌクレオチド１９６０６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｈ）ヌクレオチド１９６０７からヌクレオチド２９７７３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｉ）ヌクレオチド２０７８３からヌクレオチド２２９８７までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｊ）ヌクレオチド２３０１１から２４３７０までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｋ）ヌクレオチド４２５６１からヌクレオチド２５９２０までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｌ）ヌクレオチド２５９４３からヌクレオチド２９３２４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｍ）ヌクレオチド２８１５７からヌクレオチド２９３２４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｎ）ヌクレオチド２９３２４からヌクレオチド３１８３０までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｐ）ヌクレオチド３１８３１からヌクレオチド３５８１６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｑ）ヌクレオチド３５８１７からヌクレオチド３８３１９までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｒ）ヌクレオチド３８３２０からヌクレオチド３９４８８までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｓ）ヌクレオチド３９４８９からヌクレオチド４１４４９までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｔ）ヌクレオチド４１４５０からヌクレオチド４３６０７までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｕ）ヌクレオチド４３６１４からヌクレオチド４７６６２までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｖ）ヌクレオチド配列（ａ）～（ｕ）、（ａ）～（ｊ）、（ｋ）～（ｕ）との少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子；又は（ｗ）それらの補体。関連する実施形態は、この人工遺伝子座を含む植物の細胞、材料、又は種子を提供する。

【0027】

別の実施形態は、以下のヌクレオチド配列を順に含む、人工遺伝子座を含むＤＮＡ分子を提供する：（ａ）ヌクレオチド２７４７からヌクレオチド４１４１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列；（ｂ）ヌクレオチド７２５９からヌクレオチド８０６５までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列の補体のヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド８８４１からヌクレオチド１０１２１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列；（ｄ）ヌクレオチド１２２８１からヌクレオチド１３５３１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列；（ｅ）ヌクレオチド配列（ａ）～（ｄ）との少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子；又は（ｆ）それらの補体；ここで、人工遺伝子座は、（ａ）～（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）の発現を提供するための調節領域（例えば、プロモーター、リーダー配列、ターミネーター）を含む。関連する実施形態は、この人工遺伝子座を含む植物細胞、植物材料、又は植物種子を提供する。

【0028】

別の実施形態は、以下のヌクレオチド配列を順に含む、人工遺伝子座を含むＤＮＡ分子を提供する：（ａ）ヌクレオチド１８２０からヌクレオチド３２０８までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｂ）ヌクレオチド６３２６からヌクレオチド７１２６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド７９０８からヌクレオチド９１９２までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｄ）ヌクレオチド１１３５２からヌクレオチド１２５９６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｅ）ヌクレオチド１５２１６からヌクレオチド１６５５６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｆ）ヌクレオチド１７６１９からヌクレオチド１８８６６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｇ）ヌクレオチド２１８９５からヌクレオチド２２６４７までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｈ）ヌクレオチド２５９４３からヌクレオチド２６２８３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｉ）ヌクレオチド３００６６からヌクレオチド３１３１３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｊ）ヌクレオチド３１８３１からヌクレオチド３５８１６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｋ）ヌクレオチド３６３３５からヌクレオチド３８３１９までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｌ）ヌクレオチド３９７４９からヌクレオチド４１０２３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｍ）ヌクレオチド４１８０５からヌクレオチド４２６０５までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｎ）ヌクレオチド４５７２４からヌクレオチド４７１１１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列；（ｏ）ヌクレオチド配列（ａ）～（ｕ）、（ａ）～（ｊ）、（ｋ）～（ｕ）との少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子；又は（ｐ）それらの補体；ここで、人工遺伝子座は、（ａ）～（ｎ）、（ｏ）、又は（ｐ）の発現を提供するための調節領域（例えば、プロモーター、リーダー配列、ターミネーター）を含む。関連する実施形態は、この人工遺伝子座を含む植物細胞、植物材料、又は植物種子を提供する。

【0029】

１つの実施形態において、本明細書に記載されるような近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４の導入遺伝子は、ヌクレオチド位置２０９０～１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列、又はその補体を有し、或いは、ヌクレオチド位置２０９０～ヌクレオチド位置１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列、又はその補体に対して少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子を含む。１つの実施形態において、本明細書に記載されるような近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４の導入遺伝子は、ヌクレオチド位置１２６８～４７６６２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列、又はその補体を有し、或いは、ヌクレオチド位置１２６８～ヌクレオチド位置４７６６２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列、又はその補体に対して少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子を含む。

【0030】

本明細書にはまた、ゲノム中に核酸分子を含む、ブラッシカ又はキャノーラ植物、植物細胞、組織、又は種子が提供され、前記核酸分子は、ヌクレオチド位置２０９０～１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列、又はその補体を含み、或いは、ヌクレオチド位置２０９０～ヌクレオチド位置１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列、又はその補体に対して少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子を含む。別の実施形態は、ゲノム中に核酸分子を含む、ブラッシカ又はキャノーラ植物、植物細胞、組織、又は種子を提供し、前記核酸分子は、ヌクレオチド位置１２６８～４７６６２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列、又はその補体を含み、或いは、ヌクレオチド位置１２６８～ヌクレオチド位置４７６６２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列、又はその補体に対して少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子を含む。

【0031】

本実施形態の別の態様は、キャノーラ植物が、近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４、又は系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝子エリートイベントの少なくとも一部を含むキャノーラ植物であるか、或いはそれらに関連するかを判定するためのキットと方法を提供する。生体サンプル中のエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の同定のための単純且つ明確な技術のための組成物及び方法が、本明細書に記載されている。例えば、キットには、ブラッシカクロモソームＤＮＡ及び挿入された導入遺伝子の結合に特異的なセンス（フォワード）及びアンチセンス（バックワード）プライマーの少なくとも１つセットが備わっている。例えば、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３（ＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴ）、ＮＯ：４４（ＡＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＴＡＣＡＧＡ）、ＮＯ：４５（ＧＧＣＴＡＡＧＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＴ）、及びＮＯ：４６（ＣＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡ）を含むＤＮＡ結合は、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の新たなＤＮＡ配列であり、且つキャノーラ植物ＮＳ－Ｂ５００２７－４及びその後代に特徴的（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）である。より具体的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の接合配列は、導入遺伝子配列フラグメントの挿入部位及びキャノーラのゲノムクロモソームＡ０２ ＤＮＡのそれぞれの側に９つのポリヌクレオチドを表わし；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の接合配列は、導入遺伝子配列フラグメントの挿入部位及びキャノーラのゲノムクロモソームＡ０５ ＤＮＡのそれぞれの側に９つのポリヌクレオチドを表わす。より長い又はより短いポリヌクレオチドは、本明細書に記載される隣接領域から選択され得る。

【0032】

本実施形態は更に、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝子イベントを含む外来ＤＮＡインサートの５’又は３’の隣接領域を特異的に認識するプライマー又はプローブに基づいて、生体サンプル中の同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントを同定する方法を提供する。より具体的には、例となる方法は、少なくとも２つのプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応により生体サンプル中に存在する核酸を増幅させる工程を含み、一方のプライマーはエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の挿入された外来ＤＮＡ（異種又は遺伝子導入のＤＮＡ）の５’又は３’ブラッシカ隣接領域を認識し、他方は、１００ｂｐ～８００ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るために例えば外来のデサチュラーゼ又はエロンガーゼ遺伝子を含む外来ＤＮＡ内の配列を認識する。プライマー又はプローブは、インサートに隣接するクロモソームＡ０２の５’領域：位置１～２０８９のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（又はその補体）内、或いはインサートに隣接するクロモソームＡ０２の３’領域：位置１４２０２～１５００６のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（又はその補体）内の配列；インサートに隣接するクロモソームＡ０５の５’領域：位置１～１１５９のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１（又はその補体）内、或いはインサートに隣接するクロモソームＡ０５の３’領域：位置４７７７４～４９７８９のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１（又はその補体）内の配列；及び、例えば位置２０９０～１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（又はその補体）或いは位置１１６０～４７７７３のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１（又はその補体）を含む外来ＤＮＡ内の少なくとも１つの配列の認識を介して、ＮＳ－Ｂ５００２７－４を同定する場合もある。

【0033】

少なくとも１つの実施形態は更に、競合対立遺伝子特異的（ｋｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＰＣＲ（ＫＡＳＰ）アッセイ（２つの対立遺伝子に特異的なフォワードプライマーがＳＮＰを認識する）、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイ、パラログ特異的アッセイ、又は偶発的存在（ＡＰ）検定のためのアッセイに有用な組成物を提供する。遺伝子移入研究及び雑種発生に特に役立つ、ＮＳ－Ｂ５００２７－４遺伝形質を検出するためにＫＡＳＰアッセイを実行するのに有用なプライマーの特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、又はそれらの補体のプライマーの、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドを含む。前述のプライマー又はその補体は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の後代、或いは、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の少なくとも部分的なゲノムを含む他の植物又は植物材料の同定のためのキットに含まれてもよい。関連する実施形態は、そのようなプライマーにより同定された植物材料を提供する。

【0034】

例えば、少なくとも１つの実施形態はＤＮＡ分子の単離されたプライマー対を提供し、ここで第１のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はその完全な補体の５’キャノーラ隣接ゲノム領域のヌクレオチド１～２３５の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを含み、第２のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７又はその完全な補体のヌクレオチド２３６～４７０の導入遺伝子領域の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ増幅反応に共に使用された時、ＤＮＡ分子のプライマー対は、キャノーライベントＮＳ－Ｂ５００２７－４又はその後代のためにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３を含む特徴的なアンプリコンを生産する。

【0035】

少なくとも１つの実施形態はＤＮＡ分子の単離されたプライマー対を含む組成物を提供し、ここで第１のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８又はその完全な補体の導入遺伝子領域のヌクレオチド１～２３５の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを含み、第２のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８又はその完全な補体のヌクレオチド２３６～４７０の３’キャノーラ隣接ゲノムＤＮＡの少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ増幅反応に共に使用された時、ＤＮＡ分子のプライマー対は、キャノーライベントＮＳ－Ｂ５００２７－４又はその後代のためにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４を含む特徴的なアンプリコンを生産する。

【0036】

少なくとも１つの実施形態はＤＮＡ分子の単離されたプライマー対を提供し、ここで第１のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９又はその完全な補体の５’キャノーラ隣接ゲノム領域のヌクレオチド１～２３５の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを含み、第２のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９又はその完全な補体のヌクレオチド２３６～４７０の導入遺伝子領域の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ増幅反応に共に使用された時、ＤＮＡ分子のプライマー対は、キャノーライベントＮＳ－Ｂ５００２７－４又はその後代のためにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５を含む特徴的なアンプリコンを生産する。

【0037】

少なくとも１つの実施形態はＤＮＡ分子の単離されたプライマー対を提供し、ここで第１のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０又はその完全な補体の導入遺伝子領域のヌクレオチド１～２３５の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを含み、第２のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０又はその完全な補体のヌクレオチド２３６～４７０の３’キャノーラ隣接ゲノムＤＮＡの少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ増幅反応に共に使用された時、ＤＮＡ分子のプライマー対は、キャノーライベントＮＳ－Ｂ５００２７－４又はその後代のためにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６を含む特徴的なアンプリコンを生産する。

【0038】

加えて、ＤＮＡイベントプライマー対はまた、ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントに特徴的なアンプリコンを生成するために使用され得る。これらのイベントプライマー対は例えば、ＡＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）及びＣＧＧＡＡＴＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）、又はその補体を含んでいる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２により生産されたアンプリコンは、約２５０のポリヌクレオチドである。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応において使用された時にＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントに特徴的なアンプリコンを生産する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＮＯ：４８、ＮＯ：４９、又はＮＯ：５０、或いはその補体に由来する任意のプライマー対は、本実施形態の一態様である。

【0039】

別の実施形態は、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ６エロンガーゼ、ラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼのうち１つのための、プライマーの少なくとも１つのセット；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド２０３３～２１３２の接合部、即ち４３ｂｐのインサートと５７ｂｐのブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとを含む１００ｂｐの領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとの間の５’結合に特異的なプライマーの少なくとも１つのセット、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド１４１５６～１４２５５の結合、即ち４６ｂｐのインサートと５４ｂｐのブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとを含む１００ｂｐの領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとの間の３’結合に特異的なプライマーの少なくとも１つのセット；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド４７７２４～４７８２３の結合、即ち５０ｂｐのインサートと５０ｂｐのブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡとを含む１００ｂｐの領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡとの間の５’結合に特異的なプライマーの少なくとも１つのセット、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド４７７２４～４７８２３の結合、即ち５０ｂｐのインサートと５０ｂｐのブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡとを含む１００ｂｐの領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡとの間の３’結合に特異的なプライマーの少なくとも１つのセットを提供する。

【0040】

別の実施形態は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８の配列、又はその補体を持つミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼＤＮＡ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の配列、又はその補体を持つピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２の配列、又はその補体を持つパブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６の配列、又はその補体を持つピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の配列、又はその補体を持つパブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４の配列、又はその補体を持つラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０配列、又はその補体を持つピラミモナス・コルダタ由来のΔ６エロンガーゼのうち少なくとも１つのプライマーを含む、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の外来ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーを提供する。従って、本実施形態は、特異的なプライマー及びそのようなプライマーを使用して増幅された特異的なＤＮＡ、及び、本明細書で提供される配列情報に由来し得るプライマーを提供する。

【0041】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４及びその後代を同定するための方法に従い、キットは、ＰＣＲ同定プロトコルでの使用のために、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の５’又は３’隣接領域を特異的に認識するプライマーに加えて、外来ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第２のプライマーを含んでもよく、前記外来ＤＮＡは、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来の１５／ω３デサチュラーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ６エロンガーゼ、又はラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼのうち少なくとも１つを含む。キットは、少なくとも２つの特異的なプライマーを含んでも良く、その一方はエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の５’隣接領域内の配列を認識し、他方は、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ、又はラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼのうち少なくとも１つを含む外来ＤＮＡ内の配列を認識する。

【0042】

本発明は更に、生体サンプル中のエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の同定のためのキットに関し、該キットは、本明細書に記載されるエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の同定に使用するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＮＯ：３７のヌクレオチド配列、又はその補体を含むか、或いはそれらから（実質的に）成る、ＰＣＲプライマーを含む。

【0043】

少なくとも１つの実施形態は、少なくとも１つのトランスジェニックインサートをゲノムへと安定して統合する、キャノーラの種子、その植物、植物部分、組織、又は細胞に関するものであり、少なくとも１つのトランスジェニックインサートは１６の異種遺伝子を含む発現カセットを含み、導入遺伝子は、植物発現のためにコドンを最適化され、且つ、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ６エロンガーゼ、及びラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼ、少なくとも１つのニコチアナ・タバカム由来のマトリックス付着領域（ＭＡＲ）、及び選択可能なマーカー遺伝子をコードし；並びに、少なくとも１つのトランスジェニックインサートは発現カセットである４つの異種遺伝子を含み、遺伝子は、植物発現のためにコドンを最適化され、且つ、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ導入遺伝子、及び少なくとも１つのニコチアナ・タバカム由来のＭＡＲをコードし、４つの遺伝子発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド２０９０～１４２０１として特徴付けられる。少なくとも１つの実施形態において、２つの発現カセットは、植物ゲノムにおける２つの異なるクロモソームに位置する。

【0044】

別の実施形態は、図５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）の核酸配列、又はその補体を持つ組み換え型核酸分子を提供する。別の実施形態は、図６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）の核酸配列、又はその補体を持つ組み換え型核酸分子を提供する。１つの実施形態において、本明細書に記載されるような近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４の導入遺伝子は、ヌクレオチド位置２０９０～１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列、又はその補体を有し、或いは、ヌクレオチド位置２０９０～ヌクレオチド位置１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列、又はその補体に対して少なくとも、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子を含む。本明細書にはまた、ゲノム中に核酸分子を含む、キャノーラ植物、植物細胞、組織、又は種子が提供され、前記核酸分子は、ヌクレオチド位置２０９０～１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列、又はその補体を含み、或いは、ヌクレオチド位置２０９０～ヌクレオチド位置１４２０１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列、又はその補体に対して少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるような近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４の導入遺伝子は、ヌクレオチド位置１２６８～４７６６２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列、又はその補体を有し、或いは、ヌクレオチド位置１２６８～ヌクレオチド位置４７６６２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列、又はその補体に対して少なくとも、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子を含む。本明細書にはまた、ゲノム中に核酸分子を含む、キャノーラ植物、植物細胞、組織、又は種子が提供され、前記核酸分子は、ヌクレオチド位置１２６８～４７６６２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列、又はその補体を含み、或いは、ヌクレオチド位置１２６８～ヌクレオチド位置４７６６２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列、又はその補体に対して少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子を含む。

【0045】

本実施形態の別の態様は、キャノーラ植物が、近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４、又は系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝子エリートイベントの少なくとも一部を含むキャノーラ植物であるか、或いはそれらに関連するかを判定するためのキットと方法を提供する。生体サンプル中のエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の同定のための単純且つ明確な技術のための組成物及び方法が、本明細書に記載されている。例えば、キットには、ブラッシカクロモソームＤＮＡ及び挿入された導入遺伝子の結合に特異的なセンス（フォワード）及びアンチセンス（バックワード）プライマーの少なくとも１つセットが備わっている。接合配列として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３（ＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴ）、ＮＯ：４４（ＡＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＴＡＣＡＧＡ）、ＮＯ：４５（ＧＧＣＴＡＡＧＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＴ）、及びＮＯ：４６（ＣＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡ）は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントにおける新たなＤＮＡ配列であり、且つキャノーラ植物ＮＳ－Ｂ５００２７－４及びその後代に特徴的である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の接合配列は、導入遺伝子配列フラグメントの挿入部位及びキャノーラのゲノムクロモソームＡ０２ ＤＮＡのそれぞれの側に９つのポリヌクレオチドを表わし；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の接合配列は、導入遺伝子配列フラグメントの挿入部位及びキャノーラのゲノムクロモソームＡ０５ ＤＮＡのそれぞれの側に９つのポリヌクレオチドを表わす。より長い又はより短いポリヌクレオチドは、本明細書に記載される隣接領域から選択され得る。

【0046】

加えて、ＤＮＡイベントプライマー対はまた、ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントに特徴的なアンプリコンを生成するために使用され得る。これらのイベントプライマー対は例えば、ＡＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）及びＣＧＧＡＡＴＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）、又はその補体を含んでいる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２により生産されたアンプリコンは、約２５０のポリヌクレオチドである。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応において使用された時にＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントに特徴的なアンプリコンを生産する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、ＮＯ：４４、ＮＯ：４５、又はＮＯ：４６、或いはその補体に由来する任意のプライマー対は、本発明の一態様である。

【0047】

別の実施形態は、微細藻類ミクロモナス・プシラに由来するΔ６デサチュラーゼ、微細藻類ピラミモナス・コルダタに由来するΔ５エロンガーゼ、ピラミモナス・コルダタに由来するΔ６エロンガーゼ、海洋微細藻類パブロバ・サリナに由来するΔ５デサチュラーゼ、酵母ピキア・パストリスに由来するΔ１５／ω３デサチュラーゼ、パブロバ・サリナに由来するΔ４デサチュラーゼ、又は酵母ラカンセア・クルイヴェリに由来するΔ１２デサチュラーゼのうち１つのためのプライマーの少なくとも１つのセット；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド２０３３～２１３２の結合、即ち４３ｂｐのインサートと５７ｂｐのブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとを含む１００ｂｐの領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとの間の５’結合に特異的なプライマーの少なくとも１つのセット、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド１４１５６～１４２５５の結合、即ち４６ｂｐのインサートと５４ｂｐのブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとを含む１００ｂｐの領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとの間の３’結合に特異的なプライマーの少なくとも１つのセット；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド１１１０９～１１２０９の結合、即ち５０ｂｐのインサートと５０ｂｐのブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡとを含む１００ｂｐの領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡとの間の５’結合に特異的なプライマーの少なくとも１つのセット、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド４７７２４～４７８２３の結合、即ち５０ｂｐのインサートと５０ｂｐのブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡとを含む１００ｂｐの領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡとの間の３’結合に特異的なプライマーの少なくとも１つのセットを提供する。

【0048】

本明細書に記載される実施形態の更なる態様は、生体サンプル中のエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を同定するためのキットを提供し、該キットは、外来ＤＮＡに隣接する５’又は３’ブラッシカ領域を特異的に認識する少なくとも１つのプライマー又はプローブ、及び、ＧＡＧＣＡＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、ＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＡＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）のヌクレオチド配列、又はその補体を含み得る、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ；ＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、ＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）のヌクレオチド配列、又はその補体を含み得る、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ；ＧＣＴＡＣＣＧＡＴＧＣＴＴＡＣＡＡＧＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、ＴＡＧＴＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）のヌクレオチド配列、又はその補体を含み得る、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ；ＧＡＣＧＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＧＣＡＣＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）、ＧＴＣＣＡＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）のヌクレオチド配列、又はその補体を含み得る、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ；ＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、ＣＴＣＡＧＣＣＴＴＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）のヌクレオチド配列、又はその補体を含み得る、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ；ＴＧＧＡＧＣＴＡＴＣＣＣＴＣＡＴＧＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）、ＧＡＴＣＣＴＡＧＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）のヌクレオチド配列、又はその補体を含み得る、ラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼ；ＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）、ＣＴＡＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）のヌクレオチド配列、又はその補体を含み得る、ピラミモナスＣＳ０１４０由来のΔ６エロンガーゼのうち少なくとも１つのＤＮＡインサートを特異的に認識する少なくとも１つのプライマー又はプローブを含む。

【0049】

この実施形態のキットは、ＰＣＲ同定プロトコルに使用するために、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の５’又は３’隣接領域の少なくとも１つを特異的に認識するプライマーに加えて、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ６エロンガーゼ、又はラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼのうち少なくとも１つを含む外来ＤＮＡ内の配列を特異的に認識するプライマーを含んでもよい。キットは、少なくとも２つの特異的なプライマーを含んでもよく、その一方はエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の５’隣接領域内の配列を認識し、他方は、ミクロモナス・プシラ由来のΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ５エロンガーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ５デサチュラーゼ、ピキア・パストリス由来のΔ１５／ω３デサチュラーゼ、パブロバ・サリナ由来のΔ４デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ６エロンガーゼ、又はラカンセア・クルイヴェリ由来のΔ１２デサチュラーゼのうち少なくとも１つを含む外来ＤＮＡ内の配列を認識する。

【0050】

関連する態様は、系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４のエリートイベントの少なくとも一部を含む、植物から得られる又はそこから由来するゲノムＤＮＡを提供する。このようなゲノムＤＮＡは、本明細書に記載される同定アッセイにおける基準対照物質として使用されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】ＧＡ７－ｍｏｄＢ形質転換カセットのスキーム（マップ）を提供する。

【図2】バイナリーベクターであるｐＪＰ３４１６のプラスミドマップである。

【図3】８つの栽培部位にわたる、ｋｇ／ｈａでの予測されたＤＨＡに対してプロットされた穀物収穫量を表す。◆はＤＨＡ ｋｇ／ｈａであり；－－は線形ＤＨＡ ｋｇ／ｈａであり；ｙ＝２９．２９６ｘ＋２．８３１５であり；Ｒ^２＝０．８５６７である。

【図4】８つの部位にわたる、ｋｇ／ｈａでの予測されたＬＣ－ＰＵＦＡ（ＥＰＡ、ＤＰＡ、及びＤＨＡ）に対してグラフ化された穀物収穫量を表す。◆はＬＣ－ＰＦＵ ｋｇ／ｈａであり；－－は線形ＬＣ－ＰＦＵ ｋｇ／ｈａであり；ｙ＝３４．０４３ｘ＋３．４０４９であり；Ｒ^２＝０．８６３６である。

【図5】４つのトランスジェニックインサート及びその隣接するＢ．ナパス配列（太字）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）を示す。

【図6】１６のトランスジェニックインサート及びその隣接するＢ．ナパス配列（太字）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0052】

この発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などには限定されず、これらは変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用された用語は、特定の実施形態のみについて記載するためのものであり、且つ、請求項により単独で定義される本発明の範囲を制限するようには意図されていない。

【0053】

確認された全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を記載且つ開示するために参照により本明細書に組み込まれるが、本明細書で提示されるものと一致しない用語の定義を提供するものではない。これら刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のために単独で提供される。この点に関しては何れも、先行発明により又は他の理由のためにそのような開示に先行する権利を発明者が有していないという承認として解釈されるべきでない。日付に関する声明、又はこれら文書の内容に関する表現は全て、出願人に利用可能な情報に基づくものであり、これらの文書の日付又は内容の正確さに関する承認を構成するものではない。

【0054】

本明細書及び請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、他に内容が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書の全体にわたって、他に示されていない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的よりも包括的に使用されるものであり、それにより、明言された整数又は整数の群は、１つ以上の他の明言されていない整数又は整数の群を含み得る。用語「又は」は、例えば「何れか」によって修飾されない限りは包括的である。故に、文脈が示していない限り、単語「又は」は、特定のリストの１つの員を意味し、及びそのリストの員の任意の組み合わせも含む。

【0055】

全ての値は、環境条件によって脂肪酸組成物に幾つか変動が生じるため、およそのものである。値は典型的に、全脂肪酸の重量パーセント、又は全種子の重量パーセントとして表わされる。従って、操作の例以外に、又は他に示されている場合、本明細書で使用される質量又は反応条件を表わす全ての数は、用語「約」により全ての例で修飾されると理解されたい。

【0056】

組み換えＤＮＡ技術は、当該技術分野で知られているような標準プロトコルに従い実行することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： ＬＡＢ． ＭＡＮＵＡＬ （２ｎｄ Ｅｄ． ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９８９）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＭＯＬＥＣ． ＢＩＯＬ． （１９９４ ａｎｄ ｕｐｄａｔｅｓ）； ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ： ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ， Ｖｏｌｓ． １－４ （Ｇｌｏｖｅｒ ＆ Ｈａｍｅｓ， Ｅｄｓ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９５， １９９６）， Ｃｒｏｙ， ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣ． ＢＩＯＬ． ＬＡＢＦＡＸ （ＢＩＯＳ Ｓｃｉ． Ｐｕｂ． Ｌｔｄ． ＆ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉ． Ｐｕｂ．， ＵＫ， １９９３）； ＷＯ ２０１５０８９５８７を参照。

【0057】

見出しは、利便性のためだけに提供されるものであり、任意の方法で本発明を制限すると解釈されるべきではない。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用された用語は、特定の実施形態のみについて記載するためのものであり、且つ、請求項により単独で定義される本発明の範囲を制限するようには意図されていない。本開示をより容易に理解することが可能となるために、特定の用語が最初に定義される。追加の定義は詳細な説明の全体にわたって説明される。

【0058】

「系統」は、その明示を共有する個体間の全体的な変異をほとんど表示しない植物の群である。「系統」はまた、少なくとも１つの形質のための個体間の遺伝的変異をほとんど又は全く表示しない同じ遺伝物質を実質的に運ぶ、植物の均質の集合体を指す。「変種」又は「栽培品種」は、「系統」と互換的に使用されてもよいが、一般的に、前者の２つの用語は商業上の生産に適切な系統を指す。例えば、句「親系統に遺伝的に由来する」で使用されるような、「遺伝的に由来する」は、問題の特徴が、問題の植物の遺伝的構成の態様によって全体的又は部分的に指示されることを意味する。

【0059】

本明細書で使用されるような「ブラッシカ」植物は、アブラナ科の植物を指す。ブラッシカ植物は、ブラッシカ・ナパス、Ｂ．ラパ（或いはカンペステリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、又はＢ．ジュンセアの種のうち１つに属する場合がある。代替的に、この植物は、Ｂ．ナポカンペストリス（Ｂ．ｎａｐｏｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）などのこれらブラッシカ種の交雑、或いは、これらブラッシカ種のうち１つのクルシフェラセア（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｃｅａ）の別の種との人工的な交雑から生じる種に属することができる。倍数性は、栽培品種により示されたクロモソームの数が二倍体又は四倍体であるかどうかを指す。ブラッシカ・ナパスは、ブラッシカ・ラパ（以前のＢ．カンペステリス）及びＢ．オレラセア両方のゲノムの交雑及び維持から生じる異質四倍体（複二倍体）であるので、導入遺伝子イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を含むＢ．ナパス植物は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントを導入するための育種方法、及び故に、本明細書に記載されるようなＬＣ－ω３脂肪酸をブラッシカ属の他の員へと生産する「形質」と共に使用され得る。従って、本実施形態を実行するのに有用なブラッシカ属の員の例は、限定されないが、属ブラッシカに属する他の植物と同様にＢ．ジュンセア、Ｂ．ナポブラッシカ、Ｂ．オレラセア、Ｂ．カリナタ、Ｂ．ナパス、Ｂ．ラパ、及びＢ．カンペステリスの他、ブラッシカ種間の育種を可能にするブラッシカ属に属する他の植物を含む。通常、「油料種子植物」は、Ｂ．ナパス、Ｂ．ラパ（又はカンペステリス）、又はＢ．ジュンセアの種のうち１つを指す。

【0060】

ブラッシカ・ナパスは一般的にナタネ（ｒａｐｅｓｅｅｄ）又は菜種として知られており、特定の栽培品種はキャノーラと称されることもある。本明細書で使用されるように、用語「キャノーラ」又は「キャノーラ植物」は、キャノーラ油（即ち、２％未満のエルカ酸を含む特定の品質指定を満たす油）を生産するために使用可能なブラッシカ植物を指し、ブラッシカ・ナパス、Ｂ．ナポブラッシカ、Ｂ．ラパ、Ｂ．ジュンセア、及びＢ．カンペステリスの変種が含まれる。キャノーラは、ゲノムＡＡＣＣを持つ複二倍体（異質四倍体とも称される）、各親の形態から設定される完全な二倍体クロモソームを持つ種間雑種である。

【0061】

「キャノーラ」及び「キャノーラ植物」は典型的にブラッシカ・ナパスを指すが、キャノーラで育種され得る全ての植物変種を含む。「キャノーラ」及び「キャノーラ植物」は植物部分も含む。「キャノーラ油」は２％未満のエルカ酸を含まなければならず；１グラムの大気乾燥した油の無い固形キャノーラ種子は、３０μモル未満の３－ブテニルグルコシノレート、４－ペンテニルグルコシノレート、２－ヒドロキシ－３－ブテニルグルコシノレート、２－ヒドロキシ－４－ペンテニルグルコシノレート、又はそれらの混合物を含まなければならない。例えば、ＣＯＤＥＸ ＡＬＩＭＥＮＴＡＲＩＵＳ： ＦＡＴＳ， ＯＩＬＳ ＆ ＲＥＬＡＴＥＤ ＰＲＯＤＵＣＴＳ， ＶＯＬ． ８ （２ｎｄ ｅｄ．， Ｆｏｏｄ ＆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｒｇ． Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ， Ｒｏｍｅ， Ｉｔａｌｙ， ２００１）を参照。

【0062】

「植物部分」は、植物細胞、植物器官、植物原形質体、植物が再分化可能な植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、及び、胚、花粉、胚珠、種子、鞘、葉、花、枝、果実、柄、根、根端、葯、子葉、胚軸、幼根、単細胞、生殖体、細胞培養物、組織培養物などの植物又はその部分において無傷の植物細胞を含む。子葉は子葉（ｓｅｅｄ ｌｅａｆ）の一種であり；小さな葉が植物胚上に含まれている。子葉は、種子の食品貯蔵（ｆｏｏｄ ｓｔｏｒａｇｅ）組織を含む。胚は、成熟種子内に含まれる小さな植物である。「植物細胞」はまた、非再分化可能な植物細胞を包含する。これらの部分がイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４核酸分子を含む場合、再分化された植物の後代、誘導体、変異体、及び突然変異体も、本実施形態の範囲内に含まれる。本実施形態はまた、植物の細胞培養物及び組織培養物でのエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４導入遺伝子の使用に関する。この実施形態は、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４系統からの植物及び植物部分の他、記載した方法により生産された他の植物を含む。

【0063】

「アレル」は、１つの形質又は特徴に関連する遺伝子の１つ以上の代替的な形態のうち何れかである。二倍体細胞又は生物体において、与えられた遺伝子の２つのアレルは、１組の相同クロモソーム上の対応する遺伝子座を占有する。

【0064】

「遺伝子座」は、例えば修飾された脂肪酸代謝、修飾されたフィチン酸代謝、修飾された糖質代謝、雄性不稔性、除草剤耐性、虫害耐性、耐病性、又は修飾されたタンパク質代謝などの１つ以上の形質を付与する。この形質は、例えば、戻し交雑、天然又は誘発突然変異、或いは形質転換技術を通じて導入された導入遺伝子により、系統のゲノムへと導入される自然に生じる遺伝子によって付与されることもある。遺伝子座は、単一のクロモソーム位置にて統合された１つ以上のアレルを含む場合がある。量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、少なくともある程度、通常は連続して分布する数的に表現可能な形質を制御する、遺伝子座を指す。

【0065】

「イベント」は、遺伝子操作の結果、対象の遺伝子のうち少なくとも１つのコピーを含む外来ＤＮＡを運ぶ人工遺伝子座である。イベントの典型的なアレルの状態は、外来ＤＮＡの存在又は不在である。イベントは、１つ以上の導入遺伝子の発現により表現型的に特徴とされ得る。遺伝子レベルでは、イベントは植物の遺伝的構成の一部である。分子レベルでは、イベントは、制限マップ（例えば、サザンブロッティングにより判定されるように）、導入遺伝子の上流又は下流の隣接配列、或いは導入遺伝子の分子の構成によって特徴付けられる。通常、形質転換するＤＮＡを伴う植物細胞又は植物部分の形質転換は多くのイベントにつながり、その各々は固有のものである。

【0066】

用語「遺伝子」は、共にプロモーター領域を形成するプロモーター及び５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ又は５’非コーディング配列）；コーディング領域（タンパク質のためにコードする、又はしない場合がある）；及びポリアデニル化部位を含む非翻訳３’領域（３’ＵＴＲ又は３’非コーディング配列）など、様々な操作可能に結合されたＤＮＡ領域を典型的に含むＤＮＡ分子を指す。典型的に、植物細胞において、５’ＵＴＲ、コーディング、及び３’ＵＴＲ領域は、タンパク質コード化遺伝子の場合にはタンパク質に翻訳されるＲＮＡ分子へと転写される。「コーディング配列」は故に、アミノ酸の特異的配列を翻訳するコドンを提供するＤＮＡ分子におけるヌクレオチドの配列を指す。遺伝子は、例えばイントロンなど追加のＤＮＡ領域を含む場合がある。「遺伝子型」は、細胞又は生物体の遺伝子構造を指す。「遺伝子座」は一般的に、植物のゲノムにおいて与えられた遺伝子の位置である。

【0067】

用語「導入遺伝子」は、植物のゲノムに組み込まれるような対象の遺伝子を指す。従って、「遺伝子導入植物」は、その細胞の全てのゲノムにおける少なくとも１つの導入遺伝子を含む。本実施形態の導入遺伝子は、対象の遺伝子の少なくとも１つのコピーを含み、より具体的には、パブロバ・サリナに由来するΔ４デサチュラーゼ、海洋の微細藻類パブロバ・サリナに由来するΔ５デサチュラーゼ、微細藻類ピラミモナス・コルダタに由来するΔ５エロンガーゼ、微細藻類ミクロモナス・プシラに由来するΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタに由来するΔ６エロンガーゼ、酵母ラカンセア・クルイヴェリに由来するΔ１２デサチュラーゼ、及び酵母ピキア・パストリスに由来するΔ１５／ω３デサチュラーゼのうち少なくとも１つのコピー；並びに、微細藻類ミクロモナス・プシラに由来するΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタに由来するΔ５エロンガーゼ、海洋の微細藻類パブロバ・サリナに由来するΔ５デサチュラーゼ、及び酵母ピキア・パストリスに由来するΔ１５／ω３デサチュラーゼのうち少なくとも１つの追加のコピーを含む。導入遺伝子は、適切な調節領域を含む発現カセットにおいてバイナリー様式で配置される。上述の導入遺伝子は、コドン最適化戦略を使用して設計されているという点で人工的であり、故に導入遺伝子は自然界に存在しない。遺伝子導入の発現カセットは、ニコチアナ・タバカム由来の少なくとも１つのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）を含む場合がある。導入遺伝子カセットは、選択可能なマーカー遺伝子も含む場合がある。米国特許第８，８１６，１１１号を参照。

【0068】

「外来」又は「異種」は、植物種に関して遺伝子又はＤＮＡ分子を指す時に、遺伝子又はＤＮＡ分子、或いはその部分（例えば特定の領域）がその植物種には自然に見出されず、又はその植物種の遺伝子座に自然に見出されないことを示す。用語「外来ＤＮＡ」はまた、形質転換の結果として植物のゲノムに組み込まれる又は組み込まれているＤＮＡ分子を指す。本開示の文脈において、導入遺伝子、トランスジェニックカセット、又は遺伝子導入発現カセットは、少なくとも１つの外来又は異種のＤＮＡを含む。

【0069】

用語「キメラ」は、遺伝子又はＤＮＡ分子を指す時、遺伝子又はＤＮＡ分子が、少なくとも１つのＤＮＡがキメラ分子において別のＤＮＡ領域にとって異質となるように、自然には互いに関連せず且つ異なるソースから生じる少なくとも２つの機能的に関連するＤＮＡ領域（プロモーター、５’ＵＴＲ、コーディング領域、３’ＵＴＲ、イントロンなど）を含むことを示すために使用される。

【0070】

用語「プラスミド」及び「ベクター」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を頻繁に運ぶ余分なクロモソームエレメントを指し、通常は円形の二本鎖ＤＮＡフラグメントの形態である。そのようなエレメントは、任意のソースに由来する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの自己複製配列、ゲノム統合配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線形又は円形であってもよく、そこでは、多くのヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列と共に選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメント及びＤＮＡ配列を細胞へと導入可能な固有の構造へと、結合又は再結合されている。遺伝子導入植物に関連して、そのようなプラスミド又はベクターは、植物ゲノムへの導入遺伝子に対する挿入を容易にするためにＴ－ＤＮＡの領域を含む場合がある。

【0071】

「発現カセット」は、導入遺伝子を含有し、且つ、外来宿主における遺伝子の発現を可能にする外来遺伝子を加えたエレメントを有する遺伝子構成を指し；及び植物のゲノムへの挿入前後のカセットを指すこともある。言いかえれば、遺伝子導入のインサートは発現カセットを含む。

【0072】

「形質転換ＤＮＡ」は、形質転換のために使用される組み換えＤＮＡ分子、例えば発現ベクターを指す。形質転換ＤＮＡは通常、形質転換された植物に１つ以上の特定の特徴を付与することができる、少なくとも１つの「対象の遺伝子」（例えばキメラ遺伝子）を含む。

【0073】

「形質転換」は、宿主生物体への核酸分子の移動を指し、遺伝的に安定した遺伝をもたらす。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであり、又は、宿主生物体のゲノムへと統合する場合もある。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物体は、「遺伝子導入」、「組み換え型」、又は「形質転換した」生物体として言及される。

【0074】

用語「組み換えＤＮＡ分子」は例証のために使用され、故に、ＤＮＡであり且つ合成ＤＮＡの合成又はＰＣＲなどの組み換え或いは他の手順を介して得ることができる、単離された核酸分子を含み得る。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、標的ポリヌクレオチドの複製コピーが、「上流」及び「下流」プライマーから成るプライマー、ＤＮＡポリメラーゼなどの重合の触媒、及び典型的に熱により安定するポリメラーゼ酵素を用いて作られる反応である。ＰＣＲのための方法は当該技術分野で知られている。例えば、ＰＣＲ （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＆ Ｍｏｌｌｅｒ， ｅｄｓ．， ＢＩＯＳ Ｓｃｉ． Ｐｕｂｌ． Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， ２０００）を参照。ＰＣＲはゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの上で行なわれ得る。

【0075】

「挿入ＤＮＡ」は、形質転換プロセスを介して植物材料に導入される異種ＤＮＡを指し、本明細書で説明されるような形質転換のために使用される本来のＤＮＡとは異なるＤＮＡを含んでいる。挿入ＤＮＡは典型的に遺伝子導入の発現カセットである。「エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４挿入核酸」及び「イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４挿入ＤＮＡ」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド２０９０～１４２０１の配列又はその補体から成ることを特徴とする核酸分子；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド位置９８７～１８９４の配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１～９１０の配列、或いはその補体を含むことを特徴とする核酸分子を指す。

【0076】

「適切な調節配列」は、コーディング配列の上流（例えば５’ＵＴＲ）、その中、又はその下流（３’ＵＴＲ）に位置するヌクレオチド配列を指し；これは、転写、ＲＮＡの処理又は安定、或いは関連するコーディング配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、プロモーター、エンハンサーエレメント、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡ処理部位、エフェクター結合部位、及びステムループ構造を含んでもよい。

【0077】

「プロモーター」は、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、全体的に天然の遺伝子に由来し、自然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され、或いは合成ＤＮＡセグメントをも含む場合がある。異なるプロモーターが、異なる組織又は細胞タイプにおいて、異なる開発段階にて、又は異なる環境或いは生理学的条件に応じて遺伝子の発現を方向付ける場合があることは、当業者に理解される。多くの場合に大半の細胞型にて遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。大半の場合、調節配列の正確な境界が完全には定められていないことから、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター作用を持つ場合があることが、更に認識される。

【0078】

用語「３’非コーディング配列」及び「転写ターミネーター」は、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列、及び、ｍＲＮＡ処理又は遺伝子発現に影響を与えることができる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸部分（ｔｒａｃｔｓ）の付加に影響を及ぼすことにより特徴づけられる。３’領域は、転写、ＲＮＡの処理又は安定、或いは関連するコーディング配列の翻訳に影響を及ぼすことができる。

【0079】

用語「操作可能に結合した」は、一方の機能が他方により影響を受けるような単一の核酸フラグメント上での核酸の会合を指す。例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能な場合、コーディング配列と操作可能に結合される（即ち、コーディング配列はプロモーターの転写調節の下にある）。コーディング配列は、センス又はアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に結合され得る。

【0080】

本明細書で使用されるように、用語「発現」は、本発明の核酸に由来するセンス（ｍＲＮＡ）の転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を指す場合もある。

【0081】

細胞に対する言及は、他に明示されない又は文脈から明らかでない限り、単離され、組織培養物中にあり、或いは植物又は植物の部分に組み込まれているかにかかわらず、植物細胞を含む。

【0082】

「後代」は、植物の子孫及び誘導体を含む全ての末裔を意味し、且つ、第１世代、第２世代、第３世代、及びその後の世代を含み；並びに、自家受粉、或いは、同じ又は異なる遺伝子型を持つ植物との交雑により生産され、且つ、様々な適切な遺伝子工学技術により改質されることもある。成長種は一般的に、ヒトにより意識的に変質され且つ選択された植物に関連する。「Ｔ０」は形質転換された植物材料の第１世代を指し、「Ｔ１」はＴ０植物上で生産された種子を指し、Ｔ１種子は後のＴｘ後代にＴ２種子等を生産する植物を生じさせる。

【0083】

「育種」は、植物を発育又は繁殖させる方法を全て含み、種間と種内及び系統間と系統内両方の交雑の他、全ての適切な従来の育種及び人工育種技術を含む。望ましい形質（例えばＮＳ－Ｂ５００２７－４ ＤＨＡの形質）は、従来の育種方法を介して、他のキャノーラ又はＢ．ナパスの系統、栽培品種、又は培養種へと導入され；及び、種間交雑を介してＢ．ジュンセアとＢ．ラパなどの他のブラッシカ種へと導入され得る。従来の育種方法と種間交雑方法の他、植物間で遺伝物質を導入する他の方法も、当該技術分野で周知である。

【0084】

「戻し交雑」は、育成者が繰り返し雑種後代を、親の系統、例えばＦ１雑種の親の遺伝子型のうちの１つを持つ第１世代の雑種Ｆ１に交雑させるプロセスである。

【0085】

「脂肪酸組成物」又は「脂肪酸含有量」は一般的に、成熟した全体的又は部分的に乾燥した種子の内生的に形成された油に存在する、様々な脂肪酸の重量パーセントを指す。共通の工業的手法は、絶対量ではなく、面積率（標準化された面積）として脂肪酸組成物を報告することである。面積率により、計算、及び、同じ方法を報告する産業における他に多くのものの結果との比較が容易になる。面積率は、絶対重量パーセントと同じではないが、それに近似する。絶対的な結果は、既知の濃度の個々の参照標準、及びｍｇ／ｋｇの方式で結果を計算するための内標準を使用して計算され得る。個々の脂肪酸標準を使用することなく脂肪酸の質量を計算するために補正係数を使用することも可能であるが、未だに内標準が必要な場合がある。一般的に、脂肪酸含有量は、種子を砕くことにより、及び、面積パーセントとしてデータを生成する、或いは面積パーセントが由来し得る、様々な技術によって脂肪酸含有量について分析可能な脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）として脂肪酸を抽出することによって、判定される。例となる分析手法には、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ＧＣ質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、ＮＭＲ（ＮＭＲ）、又は近赤外線反射分光法が挙げられる。脂質の合計は、例えばＴＡＧ分画などの分画を精製するための、当該技術分野で知られる技術によって分離され得る。脂肪酸組成物を特徴付ける他の方法が、当業者に知られている。例えば、Ｔｉｎｏｃｏ ｅｔ ａｌ．， ３ Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５１４ （１９６２）； ＣＡＮＯＬＡ： ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ， ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ， ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ ＆ ＵＴＩＬＩＺＡＴＩＯＮ （Ｄａｕｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｕｒｂａｎａ， ＩＬ， ２０１１） （Ｄａｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）； ＵＳ ２０１５／０１６６９２８； ＵＳ ２０１６０００２５６６を参照。

【0086】

同様に、「油含有量」は、成熟した全体的又は部分的に乾燥した種子（典型的には約６％又は７％の水分を含む）に存在する油の典型的な重量パーセントである。パーセント油は、０％の水分での種子の重量で割られる油の重量として計算される。油含有量は異なる変種の特徴であり得る。これは、ＮＭＲ（ＭＱＣ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ＮＩＲ、及びソックスレー抽出などの様々な分析技術を使用して判定され得る。例えば、キャノーラ油の含有量は、水分含有量を同時に測定する、パルス波ＮＭＳ １００ ＭｉｎｉｓｐｅｃＮＭＲ（Ｂａｌｋｅｒ Ｐｔｙ Ｌｔｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｇｅｒｍａｎｙ）による核磁気共鳴技術（Ｒｏｓｓｅｌｌ ＆ Ｐｒｉｔｃｈａｒ， ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＯＩＬＳＥＥＤＳ， ＦＡＴＳ ＆ ＦＡＴＴＹ ＦＯＯＤＳ ４８－５３ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ． Ｐｕｂ． Ｌｔｄ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９９１））によって測定され得る。種子油の含有量も、近赤外線反射（ＮＩＲ）分光法により測定され得る。Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ６７ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ． ９０４ （２００６）を参照。

【0087】

句「抽出された植物脂質」、「単離された植物脂質」、「抽出された脂質」などは、例えば、種子等の砕かれた植物又は植物部分から抽出された脂質を含む組成物を指す。抽出された脂質は、例えば種子などの植物材料を砕くことによって得られる比較的天然のままの組成物；又は、植物材料由来の水、核酸、タンパク質、又は炭水化物の全てではないが大半が油から取り除かれている、更に精製された組成物であり得る。精製方法の例は当該技術分野で知られている。幾つかの実施形態において、抽出又は単離された植物脂質は、組成物の少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、又は少なくとも約９５重量％（ｗ／ｗ）の脂質を含む。抽出された脂質は室温の固体又は液体でもよく、後者は「油」と考慮される。幾つかの実施形態において、抽出された脂質は、別のソースにより生産されたＤＨＡなどの別の脂質（例えば魚油のＤＨＡ）とは混合されていない。幾つかの実施形態において、抽出後、ＤＨＡに対するオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、又はＤＨＡに対するリノール酸の比率、或いは、総ω３脂肪酸に対する総ω６脂肪酸の比率は、無傷の種子又は細胞における比率と比較して、著しく（例えば、１０％又は５％以下の変化）変えられていない。言いかえれば、抽出された脂質は、特定の脂肪酸、例えばＤＨＡが豊富ではない。他の実施形態において、抽出された植物脂質は、無傷の種子又は細胞における比率と比較すると、ＤＨＡに対するオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、ＤＨＡに対するリノール酸、或いは総ω３脂肪酸に対する総ω６脂肪酸の比率を変える、水素化又は分画などの手順に晒されていない。言いかえれば、抽出された脂質は、特定の脂肪酸、例えばＤＨＡが豊富ではない。本実施形態の抽出された植物脂質が油である時、油はステロールなどの非脂肪酸分子を更に含むこともある。

【0088】

上述のように、句「抽出された植物油」及び「単離された植物油」は、室温では液体である抽出された植物脂質又は単離された植物脂質を含む、組成物を指す。油は、植物又は種子などの植物部分から得られる。抽出又は単離された油は、例えば種子などの植物を砕くことによって得られる比較的天然のままの組成物；又は、植物材料由来の水、核酸、タンパク質、又は炭水化物の全てではないが大半が油から取り除かれている、更に精製された組成物であり得る。組成物は、脂質、或いは非脂質、例えばステロールなどの非脂肪酸分子であり得る、他の成分を含むこともある。一実施形態において、油組成物は、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、又は少なくとも約９５重量％（ｗ／ｗ）の抽出された植物脂質を含む。一実施形態において、本発明の抽出された油は、別のソースにより生産されたＤＨＡなどの別の油又は脂肪酸（例えば魚油のＤＨＡ）とは混合されていない。一実施形態において、抽出後、脂肪酸の比率は、無傷の種子又は細胞における比率と比較して著しく（例えば、１０％又は５％以下の変化）変えられず；また、抽出された植物油は、無傷の種子又は細胞における比率と比較すると、抽出物における脂肪酸の比率を著しく変える水素化又は分画などの手順に晒されていない。言いかえれば、抽出された油は、特定の脂肪酸、例えばＤＨＡが豊富ではない。

【0089】

本明細書で使用されるように、「油」は、主に脂質を含み且つ室温では液体である組成物である。例えば、本発明の油は、好ましくは少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、又は少なくとも９０重量％の脂質を含む。典型的に、精製された植物油は、油の中に脂質の少なくとも９０重量％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リン脂質、又はステロールなどの油の小さな成分が、油に存在することもある。

【0090】

本明細書で使用されるように、用語「脂肪酸」は、飽和又は不飽和の何れかの長鎖（ｌｏｎｇ）脂肪族末端を頻繁に伴うカルボン酸を指す。典型的に、脂肪酸には、長さが少なくとも８の炭素原子、例えば長さが少なくとも１２、１６、１８、２０、又は２２の炭素の炭素炭素結合された鎖がある。大半の自然に生じる脂肪酸は、その生合成が２つの炭素原子を持つ酢酸塩を含むことから、偶数の炭素原子を持つ。脂肪酸は、遊離状態（エステル化されない）；トリグリセリド（ＴＡＧ）、ジアシルグリセリド（ＤＡＧ）、モノアシルグリセリドの一部などのエステル化形態；又はアシル－ＣｏＡ（チオ－エステル）結合の形態、或いは別の結合形態であり得る。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、又はジホスファチジルグリセロールなどのリン脂質としてエステル化され得る。

【0091】

「飽和脂肪酸」は、炭素炭素二重結合（アルケン）又は鎖に沿った他の官能基を含んでいない。「飽和した」は、あらゆる炭素（カルボン酸［－ＣＯＯＨ］基とは別）での水素の存在を指す。言いかえれば、飽和脂肪酸において、脂肪酸のオメガ（ω）末端（ｎ－末端とも呼ばれる）は、３つの水素（－ＣＨ_３）を含み、鎖内の炭素はそれぞれ２つの水素（－ＣＨ_２－）を含む。

【0092】

「不飽和脂肪酸」は、炭素鎖中に少なくとも１つのアルケン基（－ＣＨ＝ＣＨ－）を含むこと以外、飽和脂肪酸と同様の骨格を共有する。２つの隣接する炭素原子（アルケン基の一方の側に結合される）が、シス又はトランス配置に生じる場合がある。「単不飽和脂肪酸」は、炭素鎖中に少なくとも１２の炭素原子を持つがアルケン基は１つしか持たない脂肪酸を指す。「多不飽和脂肪酸」又は「ＰＵＦＡ」は、炭素鎖中に少なくとも１２の炭素原子及び少なくとも２つのアルケン基を持つ脂肪酸を指す。「長鎖多不飽和脂肪酸」及び「ＬＣ－ＰＵＦＡ」は、炭素鎖中に少なくとも２０の炭素原子及び少なくとも２つのアルケン基を持つ脂肪酸を指す。「非常に長い鎖の多不飽和脂肪酸」及び「ＶＬＣ－ＰＵＦＡ」は、炭素鎖中に少なくとも２２の炭素原子及び少なくとも３つのアルケン基を持つ脂肪酸を指す。ＬＣ－ＰＵＦＡに対する言及はＶＬＣ－ＰＵＦＡを含む。通常、脂肪酸の炭素鎖中の炭素原子の数は、非分枝炭素鎖を指す。炭素鎖が分枝される場合、炭素原子の数は側基の中のものを除外する。

【0093】

１つの実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡはω３脂肪酸であり：これは、脂肪酸のメチル末端から第３の炭素炭素結合に脱飽和（アルケン基）を有している。別の実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡはω６脂肪酸であり：これは、脂肪酸のメチル末端から第６の炭素炭素結合に脱飽和（アルケン基）を有している。脂肪酸鎖中のアルケン（二重結合）の位置はまた、Δ（又はデルタ）を使用して注釈され、そこでは、アルケンの位置は、脂肪酸のカルボン酸末端に関して番号付けされる。例えば、「シス－Δ９、シス－Δ１２のオクタデカジエン酸」、又は「Δ^９，１２のオクタデカジエン酸」といったリノール酸も指定することができる。脂肪酸はまた、「Ｃ：Ｄ」の脂質の数に関して同定することができ、ここでＣは炭素の数であり、Ｄは炭素骨格中の二重結合の番号である。例えば、アラキドン酸は、脂肪酸のカルボン酸末端から炭素５、８、１１、及び１４に位置する、４つのアルケン基を伴う１２の炭素鎖を意味する、２０：４Δ５，８，１１，１４で注釈され得る。この名称はまた、カルボン酸末端からＣ１４にて２０の炭素及び１つのアルケンがある場合にメチル末端の第１のアルケンがＣ６になければならないため、アラキドン酸がω６脂肪酸であることを示している。

【0094】

更なる実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡは以下から成る群から選択される：アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４Δ^{５，８，１１，１４}；ω６）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４Δ８，１１，１４，１７；ω３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５Δ^{５，８，１１，１４，１７}；ω３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５Δ^{７，１０，１３，１６，１９}；ω３）、又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６Δ^{４，７，１０，１３，１６，１９}；ω３）。ＬＣ－ＰＵＦＡはまた、ジホモγ－リノール酸（ＤＧＬＡ）又はエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３Δ^{１１，１４，１７}；ω３）であり得る。本実施形態に従い生産されたＬＣ－ＰＵＦＡは、上述の何れか又は全ての混合物であり、且つ、他のＬＣ－ＰＵＦＡ、又はこれらＬＣ－ＰＵＦＡの何れかの誘導体を含むこともある。しかし、エリートイベントキャノーラに生産されたＬＣ－ＰＵＦＡは一般的に、魚油に由来のものよりも純粋である。少なくとも１つの実施形態において、ω３脂肪酸は、ＤＨＡ；ＤＰＡとＤＨＡ；又は、ＥＰＡ、ＤＰＡ、及びＤＨＡのうち、少なくとも１つである。

【0095】

更に、上述のように、ＬＣ－ＰＵＦＡ及びＶＬＣ－ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸形態（エステル化されていない）、エステル化形態、又は別の結合形態であり得る。故に、本実施形態のＬＣ－ＰＵＦＡは、細胞の脂質、抽出された脂質、又は精製された油における形態の混合物として存在する場合もある。少なくとも１つの実施形態において、油は少なくとも７５％又は少なくとも８５％のトリアシルグリセロールを含み、残りは言及されるものなどの脂質の他の形態として存在し、トリアシルグリセロールは少なくとも１つのＬＣ－ＰＵＦＡを含む。油はその後、例えば遊離脂肪酸を放出するために強塩基を用いた加水分解、又は蒸留などにより、更に精製或いは処理されてもよい。

【0096】

従って、「全ω３脂肪酸」、「全ω３脂肪酸含有量」などは、文脈が定めるように、抽出された脂質、油、組み換え型細胞、植物部分又は種子において、エステル化された又はエステル化されていない全てのω３脂肪酸の合計を指し、典型的に全脂肪酸含有量のパーセンテージとして表わされる。これらω３脂肪酸は、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、又はＤＨＡを含んでおり、任意のω６脂肪酸又は単不飽和脂肪酸を除外している。「新たなω３脂肪酸」、「新たなω３脂肪酸含有量」などは、文脈が定めるように、抽出された脂質、油、組み換え型細胞、植物部分又は種子において、エステル化された又はエステル化されていない、ＡＬＡを除く全てのω３脂肪酸の合計を指し、全脂肪酸含有量のパーセンテージとして表わされる。これら新たなω３脂肪酸は、エリートイベント導入遺伝子構築物の発現によって本実施形態の細胞、植物、植物部分、及び種子に生産される脂肪酸であり、存在する場合、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、又はＤＨＡを含むが、ＡＬＡ、任意のω６脂肪酸、又は単不飽和脂肪酸を除く。典型的な総ω３脂肪酸含有量及び新たなω３脂肪酸含有量は、サンプル中の脂肪酸のＦＡＭＥへの変換、及び当該技術分野で既知の方法を用いるＧＣによる分析によって、判定され得る。例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌｓｅｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ （ＡＯＣＳ） ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｄ－９１を参照。

【0097】

同様に、「総ω６脂肪酸」、「総ω６脂肪酸含有量」などは、文脈が定めるように、抽出された脂質、油、組み換え型細胞、植物部分又は種子において、エステル化された又はエステル化されていない全てのω６脂肪酸の合計を指し、全脂肪酸含有量のパーセンテージとして表わされる。「総ω６脂肪酸」は、存在する場合、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、又はω６－ＤＰＡを含むが、任意のω３脂肪酸又は単不飽和脂肪酸を除く場合がある。「新たなω６脂肪酸」、「新たなω６脂肪酸含有量」などは、文脈が定めるように、抽出された脂質、油、組み換え型細胞、植物部分又は種子において、エステル化された又はエステル化されていない、ＬＡを除く全てのω６脂肪酸の合計を指し、全脂肪酸含有量のパーセンテージとして表わされる。これら新たなω６脂肪酸は、エリートイベント導入遺伝子の発現を介して、本明細書に記載されるような細胞、植物、植物部分、又は種子に生産される脂肪酸であり、且つ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、又はω６－ＤＰＡを含むが、ＬＡ、任意のω３脂肪酸、又は単不飽和脂肪酸を除く場合がある。

【0098】

「半分種子分析（Ｈａｌｆ－ｓｅｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）」は、２つの子葉のうちの１つ（半分の種子）に脂肪酸分析が行なわれ、且つ第２の子葉を運ぶ残りの苗木が植物を形成する、手順である。

【0099】

「タンパク質含有量」は、成熟した全体的に乾燥した種子の油の無い粉末中のタンパク質の典型的な重量パーセントであり、当該技術分野で既知の方法により判定される。例えば、Ｄａｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈ． Ｂａ ４ｅ－９３ Ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ Ｍｅｔｈ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｃｒｕｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎを参照。

【0100】

種を成長又は複製する以外の目的のために成長業者により作られた成熟種子は時に、「穀物」と称される。

【0101】

遺伝子的イベント（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｅｎｔｓ）
キャノーラにおける導入遺伝子の形質発現は、導入遺伝子カセット自体の構造、および植物ゲノムにおけるその挿入位置の両方により判定される：植物ゲノムにおいて特定の位置で導入遺伝子が存在することにより、導入遺伝子の発現および植物の全体的な表現型に影響を及ぼす可能性がある。遺伝子操作による植物への商業的に興味深い形質の農業的または工業的に成功した導入は、様々な要因に依存する長い手順である可能性がある。遺伝的に形質転換された植物の実際の形質転換および再生は、広範囲の遺伝的特徴付け、育種、および野外試験での評価を含む一連の選択段階の最初のものにすぎず、最終的にはエリートイベントの選択につながる。

【0102】

本実施形態の態様は、植物ゲノムにおける驚くべき数の発現可能な導入遺伝子のコピーを含んでいる。「発現可能」は、ＤＮＡ分子の一次構造、すなわち導入遺伝子のコード配列は、その遺伝子が活性タンパク質をコードするということを示すことを意味する。しかしながら、「遺伝子サイレンシング」がインビボで相同導入遺伝子不活性化の様々な機構を介して生じるので、発現可能なコード配列は発現されないことがある。相同導入遺伝子の不活性化は、導入遺伝子がセンス方向に挿入されている植物において記載されており、遺伝子および導入遺伝子の両方がダウンレギュレートされたという予想外の結果を伴っていた。Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２７９（１９９０）。相同遺伝子配列の不活性化のために起こりうる機構には、重複したＤＮＡ領域が遺伝子サイレンシングのための内因性メカニズムに信号を送る（ｓｉｇｎａｌ）、メチル化による転写不活性化と、内因性遺伝子および導入遺伝子の両方からのｍＲＮＡレベルの組み合わせが両方のメッセージの閾値誘導性分解（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を引き起こす、転写後サイレンシングと、を含む。ｖａｎ Ｂｏｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ６ Ｐｌａｎｔ Ｊ． ８６１（１９９４）。しかしながら、驚くべきことことに、ＮＳ－Ｂ５００２７－４にいくつかの導入遺伝子の少なくとも３つのコピーがあるが、そのうちの幾つかは同じ向きで配置され、ＮＳ－Ｂ５００２７－４は相乗的なＤＨＡ発言を示す。

【0103】

エリート遺伝子イベントは、植物ゲノムにおける組み換えＤＮＡ分子の取り込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）部位での位置および構成に特徴付けられうる。組み換えＤＮＡカセットが挿入された植物ゲノムの部位はまた「挿入部位」または「標的部位」と呼ばれる。「隣接領域」または「隣接配列」は、例えば、トランスジェニックカセットのすぐ上流に近接して、またはすぐ下流に近接して位置する植物ゲノムの少なくとも２０塩基対、少なくとも５０塩基対、または最大５０００塩基対のＤＮＡの領域である。外来ＤＮＡのランダム組み込みをもたらす形質転換は、各形質転換体について特徴的かつ独特であり、異なる隣接領域を有する形質転換体をもたらす（エリートイベント）。

【0104】

一般的に、導入遺伝子が従来の交雑を通じて植物に導入される場合、植物ゲノムにおけるその挿入部位およびその隣接領域は変更されない。「挿入領域」とは（非形質転換）植物ゲノム中の導入遺伝子の上流および下流隣接領域に包含され、挿入部位（および潜在的な標的部位欠失）を含む、少なくとも１００の塩基対または最大で１０，０００を超える塩基対などの、少なくとも４０の塩基対に対応する領域を指す。種の内の突然変異によるささいな差異を考慮に入れると、挿入領域は、その種の所与の植物における外来ＤＮＡの上流および下流の隣接領域と９０％、９５％、または１００％などの少なくとも８５％の配列同一性を保持し得る。しかしながら、植物ゲノムへのトランスジェニックカセットの挿入は、「標的部位欠失」と呼ばれる、植物ＤＮＡの欠失をしばしば伴う場合がある。

【0105】

対象の遺伝子の発現は、導入遺伝子が、（対象の遺伝子の一部または全部の構造および機能に基づいて）形質転換ＤＮＡの導入によって与えられることが意図された１つ以上の表現型形質（例えば、ＬＣ－ω３脂肪酸の産生）を植物に与える、という事実を示す。本実施形態において、いくつかの導入遺伝子は、形質転換された植物におけるＬＣ－ω３脂肪酸の産生のための生合成経路を提供する。

【0106】

「エリートイベント」は、本明細書に使用されるように、導入遺伝子構築物の発現および安定性と、それを含む植物の最適な農業特性との適合性と、望ましい表現型形質の実現とに基づいて、同じ形質転換ＤＮＡでの形質転換またはそのような形質転換によって得られる植物との戻し交雑によって得られる、イベントの群から選択されるイベントである。したがって、エリートイベント選択の基準は、以下の少なくとも１つ、および有利には全てである：
（ａ）導入遺伝子の存在は、作物的性能または商品価値に関連するものなど、植物の他の所望の特性を過度に損なうことはない；
（ｂ）イベントは、安定して受け継がれており、それに対して同一性管理のための適切な診断ツールを開発することができる、明確に定義された分子構成によって特徴付けられる；
（ｃ）導入遺伝子カセットにおける対象の遺伝子は、イベントを有する植物が通常の農学的用途に供される可能性が高い環境条件の範囲の商業的に許容されるレベルで、商業的に許容されるレベルで、イベントのヘテロ接合性（または半接合性）およびホモ接合性状態の両方において、正確で適切かつ安定な空間的および時間的な表現型発現を示す。外来ＤＮＡも、さらなる所望の商業的遺伝的背景（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ）への遺伝子移入を可能にする、植物ゲノム中の位置と関連し得る。

【0107】

エリートイベントとしてのイベントの状態は、異なる関連する遺伝的背景におけるエリートイベントの遺伝子移入および、少なくとも１つの基準、例えば上述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のへのコンプライアンスを観察することによって確認しうる。さらに、エリートイベントの選択はまた、適合性、より具体的には、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を保有する植物と少なくとも１つの他のイベントを保有する植物との交雑から生じる後代によっても決定され得る、その結果、後代が両方のイベントを保有する。従って、「エリートイベント」は、上記基準に答えるトランスジェニックカセットを含む遺伝子座を指す。植物、種子、植物材料または後代は、そのゲノムにおける１つ以上のエリートイベントを含むことができる。

【0108】

エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４は、ＬＣ－ＰＵＦＡ、特にＬＣ－ω３脂肪酸、およびさらに特にはＤＨＡを産生するキャノーラの発育におけるエリートイベントとして選択された。植物ゲノムにおける組み換えＤＮＡ分子の取り込みは、典型的には細胞または組織の形質転換（または別の遺伝子操作）に起因する。特定の取り込み部位は偶然の問題であることもあれば、または（標的とされた組み込みのプロセスが使用される場合、）事前に決定されることもある。本明細書に記載されているように、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４は安定して均一な育種系統である。これは植物の種類の均一性に細心の注意を払って育てられてきた。均一性について継続的に観察しながら系統を増やした。キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４は、系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の特許出願時に商品化されている他のキャノーラ栽培品種の親ではない。

【0109】

新しい分子生物学的技術の出現により、特定のタンパク質産物をコードするなど、特定の機能を有する遺伝要素の単離および特徴付けが可能になった。植物生物学の分野の科学者は、特定の方法で植物の形質を変えるために、植物のゲノムを遺伝子操作して、外来の遺伝要素、または追加もしくは改変バージョンの天然もしくは内因性遺伝要素を含ませおよび発現させることに強い関心を寄せた。形質転換を使用して種のゲノムに挿入される任意のＤＮＡ分子は、異なる種由来であるか同じ種由来であるかにかかわらず、本明細書においてまとめて「導入遺伝子」と呼ばれる。「形質転換する」プロセスは、ゲノムへのＤＮＡの挿入である。トランスジェニック植物を生成するいくつかの方法が開発されており、本発明は、特定の実施形態において、特許請求のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の形質転換したバージョンに関する。

【0110】

生物学的および物理的な、植物の形質転換プロトコルを含む、植物の形質転換のための多数の方法が開発されている。加えて、植物細胞または組織の形質転換および植物の再分化のための発現ベクターおよびインビトロの培養方法が利用可能である。例えば、以下を参照；Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔｓ， ｉｎ ＭＥＴＨ．ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣ．ＢＩＯＬ．＆ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ａｔ ６３（Ｇｌｉｃｋ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３）；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｉｄ．ａｔ Ｒ ８９；Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｏｌａ， ＰＲＯＣ．ＷＯＲＬＤ ＣＯＮＦ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＦＡＴＳ ＆ ＯＩＬＳ ＩＮＤＵＳ．ａｔ ４３－４６（Ａｍ． Ｏｉｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈａｍｐａｉｇｎ， ＩＬ， １９８８）。

【0111】

最も普及しているタイプの植物形質転換は、発現ベクターの構築を含んでいる。そのようなベクターは、調節領域、例えばプロモーター、の制御下にあるコード領域または調節領域に作動可能に連結されたコード領域を含むＤＮＡ分子を含む。ベクターは１つ以上の遺伝子および１つ以上の調節要素を含みうる。コーディング領域およびそれぞれの調節要素の少なくとも１つは、ベクター内で反対方向に配置され得、バイナリーベクターを提供する。理論上、遺伝子サイレンシングを受けやすい遺伝子を二元的に配置することによって、遺伝子サイレンシングを最小限に抑えることができる。

【0112】

例えば、初期の形質転換カセット（ｐＪＰ３４１６＿ＧＡ７－ｍｏｄＢ）は、キャノーラ種子中にオメガ－３脂肪酸の蓄積を促進することができる７つの遺伝子と、インビトロで推定上のトランスジェニック植物の選択を容易にする、１つの選択可能なマーカー遺伝子を含んでいた。以下を参照；ＷＯ２０１３／１８５１８４；米国特許出願公開２０１５／０３７４６５４；米国特許第８，８１６，１１１号および第８，９４６，４６０号；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， ６ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈ．８（２０１０）。

【0113】

発現された遺伝子はすべて合成－コドン最適化および合成されたもの－であり、それゆえトランスジェニックＤＮＡ分子はいかなる天然生物にも見られない。コドン最適化のための鋳型として使用された元の配列が記載されている。以下を参照；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， １２ Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ’ｇ ２３３（２０１０ａ）；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， １１ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（２０１０ｂ）；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２１ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１３９（２０１２）。

【0114】

当技術分野において周知のように、機能遺伝子プロモーターは、遺伝子転写にとって重要であるがペプチドなどの機能性産物をコードしないＤＮＡの領域である。例えば、構成的発現のための一般的なプロモーターはカリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）に由来する。Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， ２３６ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２９９（１９８７）；Ｃｏｕｔｕ ｅｔ ａｌ．， １６ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．７７１（２００７）。ポリアデニル化シグナルを含むターミネーター領域は、完全かつ安定なｍＲＮＡ分子の産生に必要とされる。例えば、Ａ．ツメファシエンスノパリンシンターゼ（Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＮＯＳ）ターミネーターは有用なターミネーターを提供する。Ｂｅｖａｎ， １２ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．８７１１（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＰＬＡＮＴ ＳＣＩ．ａｔ ２１９（Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８５）；Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５４３（１９８７）。様々な発現カセットの転写を促進（ｄｒｉｖｅ）および終結させるために、一連の調節配列を組み合わせて使用した。ＧＡ７ ｍｏｄＢにおいて使用される種子特異的プロモーターは以前から記載されている：Ａ． サリアナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）ＦＡＥ１（Ｒｏｓｓａｃｋ ｅｔ ａｌ．， ４６ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ７１７（２００１））；Ｌ． ウシタチシマム（Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）Ｃｎｌ１およびＣｎｌ２（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ２００１／０１６３４０）；および、切断型Ｂ．ナパスナピンプロモーター（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｂ． ｎａｐｕｓ ｎａｐｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（Ｓｔａｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２３ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ６７１（１９９３））。米国特許第８，８１６，１１１号も参照。

【0115】

ＬＣ－ＰＵＦＡ経路をキャノーラに導入するために使用されるトランスジェニック発現カセットのオープンリーディングフレーム５’および３’調節領域ならびに他の非コード領域を含む導入遺伝子のより詳細な記載を表１に示す。

【0116】

【表1】

【0117】

したがって、生体サンプルが、ＮＳ－Ｂ５００２７－４に存在するようなＬＣ－ＰＵＦＡ経路の少なくとも一部を含むかどうかを判定するために、プライマーおよびプローブを用いて導入遺伝子を検出することができる。導入遺伝子を検出するのに役立つ特定のプライマーが表２に示され、ここで、各プライマーは６２度のアニーリング温度を有し、そしてサイズ（ｂｐ）はＰＣＲ産物中の塩基対の数を指す。

【0118】

【表2】

【0119】

ブラッシカ・ナパスＬ．（変種ＡＶ Ｊａｄｅ）生殖細胞系から培養された初期の形質転換体は、特にＥＰＡとＤＨＡのレベルにおいて、脂肪酸産生のレベルにおいて広い変異を示した。第２世代と第３世代について、選択は主にトランスジェニック種子のＤＨＡおよびＥＰＡ含有量に基づいていた。幾つかの場合、特にＴ２またはＴ３世代において、分離パターン（１つの植物から２０～４０個の子孫まで２０～４０個の個々の種子を育て、次にそれらの子孫の個々の種子のＤＨＡおよびＥＰＡ含量を測定することによって判定される）はまた、散在した結果を示し、複雑なまたは複数コピーの挿入が行われたことを示している。したがって、植物の初期のＴ２またはＴ３世代の多くは捨てられた。初めに、トランスジェニックインサートの複数のコピーが不安定な形質転換体を産出し、およびホモ接合の遺伝子型において見られた古典的遺伝子サイレンシングも示すであろうことが結論付けられた。したがって、形質転換された植物のＰＣＲ分析が１より大きい（＞１）コピー数を示した場合、それらの形質転換体はしばしば廃棄された。

【0120】

驚いたことに、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４はマルチコピーイベントを含んでいることがわかった：バイナリー（逆位）左－境界－左－境界という様式（ｂｉｎａｒｙ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ｌｅｆｔ－ｂｏｒｄｅｒ－ｔｏ－ｌｅｆｔ－ｂｏｒｄｅｒ ｆａｓｈｉｏｎ）で配置された２つの８遺伝子－Ｔ－ＤＮＡ－境界カセットを含む１６遺伝子挿入（大量の回文構造に類似）；および、別個のより小さな４遺伝子カセット；および、導入遺伝子インサートのこの組み合わせは、近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４内でのＤＨＡの産生に相乗的に作用する。より具体的には、交雑、戻し交雑および自己交雑の組み合わせは、クロモソームＡ０５（Ｎ０５と呼ばれる）に１６遺伝子インサートに分離し、および、クロモソームＡ０２（Ｎ０２と呼ばれる）に４遺伝子インサートを分離した。個々のトランスジェニッククロモソームの寄与は、各イベントの純粋なホモ接合系統を得るために各分離個体を育種することによって判定された。例えば、１つの実験において、１６遺伝子インサートを含む分離個体は約４％のＤＨＡを生成した；また、４遺伝子インサートを含む分離個体はＤＨＡを生成しなかった；しかし、分離個体がトランスジェニッククロモソームＡ０２遺伝子座およびトランスジェニッククロモソームＡ０５遺伝子座を組み合わせるように育種された時、２つのトランスジェニックインサートの組み合わせは、その種子において、少なくとも約７％のＤＨＡから少なくとも約１４％のＤＨＡを含めたＤＨＡを生産する植物を提供した。この結果は予期されぬものだった。前述のように、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の異常な遺伝的構成にもかかわらず、この系統は脂肪酸産生において安定していて、一貫していることが証明された。

【0121】

より小さなものに関して、Ａ０２上に位置する４遺伝子インサート、このインサートは機能が未知の遺伝子（ＨＰＰ遺伝子）の３’ＵＴＲ領域の約１５ｂｐを置き換えた（ｒｅｐｌａｃｅｄ）。部分的なインサートおよびその隣接するＢ．ナパス配列は本明細書において十分に特徴付けられている。４遺伝子インサートはΔ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ５－デサチュラーゼおよびΔ１５／ω３デサチュラーゼ導入遺伝子を含む；しかし、Δ４デサチュラーゼ、Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６エロンガーゼ遺伝子、および、遺伝子選択マーカーＰＡＴを含まない。Δ４－デサチュラーゼは植物種子細胞におけるＤＨＡ産生のために必要なので、４遺伝子インサートがトランスジェニック系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４でのＤＨＡの産生に相乗的に寄与したのは予想外かつ驚くべきことであった。Ａ０２上の４遺伝子インサートおよびその隣接するＢ．ナパス領域を図５に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）。特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド１～２０８９は、小さいインサートの挿入部位の５’（上流）隣接領域であり；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド２０９０～１４２０１は、トランスジェニックカセット由来の異種の核酸を提供し；および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド１４２０２～１５００６は、挿入部位の８０８ｂｐ ３’（下流）領域である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド１～２０８９および１４２０２～１５００６は、Ｂ．ナパスクロモソームＡ０２に固有である。固有のＢ．ナパス配列および挿入部位を比較する遺伝子分析は、挿入欠失を明らかにした：導入遺伝子インサートは、位置１１８５８９９２７－１１８５８９９４１でのＢ．ナパス栽培品種Ｄａｒｍｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２ｎ＝ＡＡＣＣ）のｃｈｒＵｎ＿ｒａｎｄｏｍに、および位置１８５６９３１６－１８５６９３３０でのＢ．ラパ栽培品種（２ｎ＝ＡＡ）由来の基準ゲノムのクロモソームＡ２に、位置していたであろう１５－ｂｐ－フラグメント（ＧＴＡＧＣＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴ； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を置き換えた（ｒｅｐｌａｃｅｄ）。以下を参照；Ｃｈａｌｈｏｕｂ ｅｔ ａｌ．， ３４５ Ｓｃｉ．９５０（２０１４）；ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑ． ＮＣ＿０２４７９６．１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ４３ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０３５（２０１１）；ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑ． ＸＭ＿００９１３０６３８。

【0122】

１６遺伝子インサートは、そうでなければ過敏性応答媒介シグナル伝達に関与するであろうＰｔｏ相互作用タンパク質（ＰＴＩ）、セリン－トレオニンキナーゼをコードするブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）遺伝子に位置することが確認された。ＰＴＩ遺伝子は、位置１７２６７７４６－１７２７０７００で、参照ゲノムＢ．ナパス（栽培品種Ｄａｒｍｏｒ）のクロモソームＡ０５に位置する。このより大きなインサートも、ＰＴＩタンパク質の第２エキソン中の２０ｂｐストレッチのＤＮＡ（ＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）を置き換えた挿入欠失と関連しており；これによりＰＴＩの発現を妨害する。この２０－ｂｐ欠失は、位置１７２６９７９０ － １７２６９８０９での参照ゲノムのクロモソームＡ０５に位置する。Ａ０５上の１６遺伝子インサートおよびその隣接Ｂ．ナパス領域のＤＮＡ配列を図６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）に示す。特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド１～１１５９は、大きいインサートの挿入部位の５’（上流）隣接領域であり；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド４７７７４～４９７８９は挿入部位の３’（下流）隣接領域である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド１～１１５９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１の４７７７４～４９７８９は、ブラッシカ・ナパスのクロモソームＡ０５に固有である（ｎａｔｉｖｅ）。

【0123】

従って、別の実施形態は、以下のヌクレオチド配列を順に含む人工のバイナリー遺伝子座を含むＤＮＡ分子を提供する（矢印は、参照される５’から３’へのＤＮＡ配列に関する転写の方向を示す）：
（ａ）ヌクレオチド２７４７からヌクレオチド６２５０までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列（ＰＲＯ、リーダー（ｌｅａｄｅｒ）、ＴＥＲを含むＭｉｃｐｕ－ｄ６Ｄ←）；
（ｂ）ヌクレオチド６２５７からヌクレオチド８４１４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列（ＰＲＯ、リーダー（ｌｅａｄｅｒ）、ＴＥＲを含む→Ｐｙｒｃｏ－ｄ５Ｅ）；
（ｃ）ヌクレオチド８４１５からヌクレオチド１０３７４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列（ＰＲＯ、リーダー（ｌｅａｄｅｒ）、ＴＥＲを含む→Ｐａｖｓａ－ｄ５Ｄ）；
（ｄ）ヌクレオチド１０３７５からヌクレオチド１１５４４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列（→ＭＡＲ）；及び、
（ｅ）ヌクレオチド１１５４５からヌクレオチド１４０４９までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列（ＰＲＯ、リーダー（ｌｅａｄｅｒ）、ＴＥＲを含むＰｉｃｐａ－ｗ３／ｄ１５Ｄ←）；
（ｆ）ヌクレオチド配列（ａ）～（ｅ）との少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子；又は、
（ｇ）それらの補体。関連する実施形態は、この人工のバイナリー遺伝子座を含む植物細胞、植物材料、又は植物種子を提供する。

【0124】

別の実施形態は、以下のヌクレオチド配列を順に含む、人工のバイナリー遺伝子座を含むＤＮＡ分子を提供する：
（ａ）ヌクレオチド１２６８からヌクレオチド５３１７までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（Ｃｎｌ２ ＰＲＯ ｔｈｒｕ ｌｅａｄｅｒ ｔｈｒｕ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｐｕ－ｄ６Ｄ ← ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｂ）ヌクレオチド５３２４からヌクレオチド７４８１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ → Ｐｙｒｃｏ－ｄ５Ｅ ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｃ）ヌクレオチド７４８２からヌクレオチド９４４３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ ｌｅａｄｅｒ ａｎｄ → Ｐａｖｓａ－ｄ５Ｄ ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｄ）ヌクレオチド９４４４からヌクレオチド１０６１１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→ ＭＡＲ）；
（ｅ）ヌクレオチド１０６１２からヌクレオチド１３１１６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ ｌｅａｄｅｒ ａｎｄ Ｐｉｃｐａ－ｗ３／ｄ１５Ｄ ← ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｆ）ヌクレオチド１３１１７からヌクレオチド１７０００までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ → Ｐａｖｓａ ｄ４Ｄ ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｇ）ヌクレオチド１７００１からヌクレオチド１９６０６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ → Ｌａｃｋ－ｄ１２Ｄ ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｈ）ヌクレオチド１９６０７からヌクレオチド２９７７３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→ ＭＡＲ）；
（ｉ）ヌクレオチド２０７８３からｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ２２９８７までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ → Ｐｙｒｃｏ－ｄ６Ｅ ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｊ）ヌクレオチド２３０１１から２４３７０までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ → ＰＡＴ ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｋ）ヌクレオチド４２５６１からヌクレオチド２５９２０までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ ＰＡＴ← ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｌ）ヌクレオチド２５９４３からヌクレオチド２９３２４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ Ｐｙｒｃｏ－ｄ６Ｅ← ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｍ）ヌクレオチド２８１５７からヌクレオチド２９３２４までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＭＡＲ←）；
（ｎ）ヌクレオチド２９３２４からヌクレオチド３１８３０までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ Ｌａｃｋ－ｄ１２Ｄ ← ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｐ）ヌクレオチド３１８３１からヌクレオチド３５８１６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ Ｐａｖｓａ ｄ４Ｄ ← ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｑ）ヌクレオチド３５８１７からヌクレオチド３８３１９までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ ｌｅａｄｅｒ ａｎｄ → Ｐｉｃｐａ－ｗ３／ｄ１５Ｄ ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｒ）ヌクレオチド３８３２０からヌクレオチド３９４８８までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＭＡＲ←）；
（ｓ）ヌクレオチド３９４８９からヌクレオチド４１４４９までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ Ｐａｖｓａ－ｄ５Ｄ ← ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｔ）ヌクレオチド４１４５０からヌクレオチド４３６０７までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ ｔｈｒｕ Ｐｙｒｃｏ－ｄ５Ｅ ← ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｕ）ヌクレオチド４３６１４からヌクレオチド４７６６２までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（ＰＲＯ → Ｍｉｃｐｕ－ｄ６Ｄ ｔｈｒｕ ＴＥＲ）；
（ｖ）ヌクレオチド配列（ａ）～（ｕ）、（ａ）～（ｊ）、（ｋ）～（ｕ）との少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子；又は、
（ｗ）それらの補体。
関連する実施形態は、この人工のバイナリーの遺伝子座を含む植物の細胞、材料、又は種子を提供する。

【0125】

別の実施形態は、以下のヌクレオチド配列を順に含む、人工のバイナリー遺伝子座を含むＤＮＡ分子を提供する：
（ａ）ヌクレオチド２７４７からヌクレオチド４１４１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列（Ｍｉｃｐｕ－ｄ６Ｄ←）；
（ｂ）ヌクレオチド７２５９からヌクレオチド８０６５までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列の補体ヌクレオチド配列（→Ｐｙｒｃｏ－ｄ５Ｅ）；
（ｃ）ヌクレオチド８８４１からヌクレオチド１０１２１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列（→Ｐａｖｓａ－ｄ５Ｄ）；
（ｄ）ヌクレオチド１２２８１からヌクレオチド１３５３１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド配列（Ｐｉｃｐａ－ｗ３／ｄ１５Ｄ←）；
（ｅ）ヌクレオチド配列（ａ）～（ｄ）との少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子；又は、
（ｆ）それらの補体；ここで、人工遺伝子座は、（ａ）～（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）の発現を提供するための調節領域（例えば、プロモーター、リーダー配列、ターミネーター）を含む。関連する実施形態は、この人工バイナリー遺伝子座を含む植物細胞、植物材料、又は植物種子を提供する。

【0126】

別の実施形態は、以下のヌクレオチド配列を順に含む、人工バイナリー遺伝子座を含むＤＮＡ分子を提供する：
（ａ）ヌクレオチド１８２０からヌクレオチド３２０８までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（Ｍｉｃｐｕ－ｄ６Ｄ←）；
（ｂ）ヌクレオチド６３２６からヌクレオチド７１２６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→Ｐｙｒｃｏ－ｄ５Ｅ）；
（ｃ）ヌクレオチド７９０８からヌクレオチド９１９２までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→Ｐａｖｓａ－ｄ５Ｄ）；
（ｄ）ヌクレオチド１１３５２からヌクレオチド１２５９６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（Ｐｉｃｐａ－ｗ３／ｄ１５Ｄ←）；
（ｅ）ヌクレオチド１５２１６からヌクレオチド１６５５６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→Ｐａｖｓａ ｄ４Ｄ）；
（ｆ）ヌクレオチド１７６１９からヌクレオチド１８８６６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→Ｌａｃｋ－ｄ１２Ｄ）；
（ｇ）ヌクレオチド２１８９５からヌクレオチド２２６４７までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→Ｐｙｒｃｏ－ｄ６Ｅ）；
（ｈ）ヌクレオチド２５９４３からヌクレオチド２６２８３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（Ｐｙｒｃｏ－ｄ６Ｅ←）；
（ｉ）ヌクレオチド３００６６からヌクレオチド３１３１３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（Ｌａｃｋ－ｄ１２Ｄ←）；
（ｊ）ヌクレオチド３１８３１からヌクレオチド３５８１６までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（Ｐａｖｓａ－ｄ４Ｄ←）；
（ｋ）ヌクレオチド３６３３５からヌクレオチド３８３１９までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→Ｐｉｃｐａ－ｗ３／ｄ１５Ｄ）；
（ｌ）ヌクレオチド３９７４９からヌクレオチド４１０２３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（Ｐａｖｓａ－ｄ５Ｄ←）；
（ｍ）ヌクレオチド４１８０５からヌクレオチド４２６０５までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（Ｐｙｒｃｏ－ｄ５Ｅ←）；
（ｎ）ヌクレオチド４５７２４からヌクレオチド４７１１１までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド配列（→Ｍｉｃｐｕ－ｄ６Ｄ）；
（ｏ）ヌクレオチド配列（ａ）～（ｕ）、（ａ）～（ｊ）、（ｋ）～（ｕ）との少なくとも８０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を持つ分子；
又は、
（ｐ）それらの補体；ここで、人工遺伝子座は、（ａ）～（ｎ）、（ｏ）、又は（ｐ）の発現を提供するための調節領域（例えば、プロモーター、リーダー配列、ターミネーター）を含む。関連する実施形態は、この人工バイナリー遺伝子座を含む植物細胞、植物材料、又は植物種子を提供する。

【0127】

本明細書に記載されるような形質転換技術を用いて特定のキャノーラ植物へと遺伝子操作されているような遺伝形質を、品種改良分野において周知の従来の育種技術を使用して、別のキャノーラまたはブラッシカ系統に移すことができる。例えば、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を保有する植物は、例えばＡＴＣＣに寄託された種子から得ることができる。そのような植物はさらに、同じ植物種の別の栽培品種にエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を導入するために、従来の育種スキームにおいて使用され、及び／又は繁殖させることができる。寄託された種子はブラッシカ・ナパス種に属する。しかしながら、Ｂ．ナパスからＢ．ジュンセアまでのＡゲノムまたはＣ－ゲノムに位置するアレルまたは導入遺伝子を導入する方法は、当技術分野において周知であり、繰り返される戻し交雑を含んでいる。戻し交雑のアプローチを用いて、形質転換されたキャノーラ植物からエリート近交系に導入遺伝子を移すことができ、結果として得られた後代は導入遺伝子を含む。また、近交系が形質転換のために使用される場合、トランスジェニック植物は、トランスジェニック雑種キャノーラ植物を生産するために異なる系統へ交雑することができる。本明細書で用いられるように、「交雑」は、文脈に応じて、単純なＸとＹの交雑、または戻し交雑のプロセスを指すことができる。様々な遺伝要素は、さらに、形質転換を使用して植物ゲノムに導入することができる。これらの要素は、限定されないが、遺伝子；コード配列；誘導性で、構成的な、組織特異的プロモーター；増強配列（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）；および、シグナル配列および標的配列、を含んでいる。

【0128】

同系交配のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４
本明細書に記載されているように、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４は安定して均一な育種系統である。これは植物の種類の均一性に細心の注意を払って育てられてきており、均一性について継続的に観察しながら系統を増やした。ＮＳ－Ｂ５００２７－４は、種子におけるＬＣ－ＰＵＦＡ、特にＬＣ－ω３脂肪酸、さらに特にはＤＨＡの産生のために、特に識別される。キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４は、系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の特許出願時に商品化された他のキャノーラ栽培品種の親ではない。

【0129】

同系交配のトランスジェニックキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４は、以下の形態および生理学的特徴を有する（主として２０１５年にオーストラリアの８つの異なる場所から収集され平均されたデータに基づく）：

【0130】

【表3】

【0131】

別の態様は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のブラッシカ・ナパス植物またはその種子などの一部を生産する方法を提供し、該方法は、上記のＢ．ナパス植物またはその部分を交雑する工程、上記のブラッシカ植物を得る工程、および、ブラッシカ植物生育条件下で植物を成長させる工程を含む。別の態様は、Ｂ．ナパス系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２３１８６で寄託された前記系統の代表的な種子、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の亜系統、ＮＳ－Ｂ５００２７－４または亜系統の後代、または、ＮＳ－Ｂ５００２７－４と第２のキャノーラもしくはブラッシカ植物を交雑させることによって生産された植物、を成長させる方法を提供し、該方法は：上記のブラッシカ種子を得る工程、および、ブラッシカ植物生育条件下で植物を成長させる工程、を含む。別の態様は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４－由来のブラッシカ・ナパス植物または種子などのその部分を生産する方法を提供し、該方法は、ブラッシカ・ナパス植物をまたはその部分を交雑する工程を含む。

【0132】

ＬＣ－ω３脂肪酸
キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４植物を用いて、本実施形態に従って、ＬＣ－ω３脂肪酸をＮＳ－Ｂ５００２７－４キャノーラ種子から商業的な量で生産することができる。したがって、形質転換された植物の選択および増殖のための技術は、従来の方法で収穫され、脂肪酸が対象組織、例えば種子から抽出されるという、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の都合のよい特性を備えた複数の植物を産む。

【0133】

上述のように、「脂肪酸含有量」または「脂肪酸組成」は、概して、正規化された面積としての特定の脂肪酸のパーセントとして；または、既知の基準に対して；または、種子のグラムあたりの脂肪酸の重量比（例えばｍｇ ＤＨＡ／ｇ種子）として；計算される、成熟し部分的に乾燥した（典型的には約６％または７％の水分を含む）種子全体の内因的に形成された油中に存在する種々の脂肪酸の重量パーセントを指す。

【0134】

一般的な業界慣行では、脂肪酸組成を絶対量としてではなく、面積率（正規化された面積）として報告している。例えば、クロマトグラフィーは、しばしばピークとしてデータを生成し、各ピークの下の区域は積分され、クロマトグラムにおける脂肪酸についての全ピークの下の総面積のパーセンテージとして表示される。面積率は簡単に計算でき、業界の他の人が報告した結果と比較することも簡単にできる。面積率は絶対的ではないが、許容可能な近似値を提供する。絶対ｍｇ／ｋｇの結果は、例えば既知の濃度の参照基準と内部の基準を含めることで計算できる。補正因子も脂肪酸の質量を計算するために使用することができる。

【0135】

例えば、脂肪酸含有量を測定する際に、種子を粉砕し、オイルトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）を抽出し、続いて、メタノールとナトリウムメトキシドでの鹸化およびメチル化、または、メタノール中１．２５％の３（トリフルオロメチル）フェニル－トリメチル水酸化アンモニウム（Ｍｅｔｈ Ｐｒｅｐ ＩＩ（商標）、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ ＃ＡＴ１８００７）での反応により、脂肪酸メチルエステルを形成することができる。結果として生じる脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）は、不飽和度および脂肪酸鎖長に基づきＦＡＭＥを分離するキャピラリーカラムを使用して、気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）により分析することができる。例えばＧＣ、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ、ＮＭＲまたは近赤外反射分光法によりＦＡＭＥを分析することができる。脂肪酸組成はまた、例えば種皮を壊して破壊した種子を直接メチル化に供することにより、種子全体から測定されうる。脂質の合計は、当技術分野においてＴＡＧ画分などの画分を精製すると知られている技術により分離されうる。例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が、ＴＡＧの脂肪酸組成を特異的に測定するために、ＤＡＧ、アシルＣｏＡまたはリン脂質などの他の脂質画分からＴＡＧを分離させる分析規模で行なわれうる。当業者に知られているように、多くの他の分析技術が使用されてもよい。例えば、以下を参照；Ｔｉｎｏｃｏ ｅｔ ａｌ．， ３ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１４（１９６２）；ＣＡＮＯＬＡ：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ， ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ， ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ ＆ ＵＴＩＬＩＺＡＴＩＯＮ（Ｄａｕｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｕｒｂａｎａ， ＩＬ， ２０１１）（Ｄａｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）；ＵＳ２０１５／０１６６９２８；ＵＳ２０１６／０００２５６６。

【0136】

さらなる実施形態において、抽出された植物脂質は、全脂肪酸含有量の割合として、ＤＨＡのレベルを増大させるために処理することができる。例えば、その処理は、遊離脂肪酸を生成するエステル化脂肪酸の加水分解、またはエステル交換反応を含む。例えば、キャノーラ油は、油中の脂肪酸をメチルエステルまたはエチルエステルなどのアルキルエステルに変換するように処理することができ、次いでこれを精製または分別して脂質または油をＤＨＡについて富化することができる。複数の実施形態では、そのような処理後の脂質の脂肪酸組成は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または、少なくとも９０％、のＤＨＡを含む。

【0137】

本実施形態はまた、系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４からこれらの新しいＢ．ナパス系統の後代および子孫を含む。当業者に知られているように、後代または子孫は、育種または組織培養の方法により開発することができる。例えば、後代または子孫は、これらの系統において開発されたキャノーラ脂肪酸特性を含むことができる。従って、子孫または後代は、開発された系統から任意の数の遺伝子を有することができる。子孫または後代は、本明細書に提供されるキャノーラ脂肪酸表現型を提供する遺伝子のみ、またはさらなる遺伝子を含み得る。当業者に知られているように、これは分子分析により測定されうる。

【0138】

一態様は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の表現型と同じ表現型を有するブラッシカ・ナパス種子を開発するための方法を提供する。例えば、ＮＳ－Ｂ５００２７－４種子のＤＨＡ脂肪酸含有量は、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％のＤＨＡ、少なくとも約１１％のＤＨＡ、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、またはそれ以上のＤＨＡ（％脂肪酸）を含む。例えば、ＮＳ－Ｂ５００２７－４種子のＬＣ－ＰＵＦＡ脂肪酸含有量は、少なくとも約１０％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、またはより多くのＬＣ－ＰＵＦＡ（ＥＰＡ、ＤＰＡ、％脂肪酸としてのＤＨＡ、の合計）を含む。

【0139】

別の態様は、本明細書に記載の植物から生成された、粉砕されたブラッシカ・ナパス種子の均質な集合体を提供し、ここで、粉砕されたブラッシカ・ナパス種子は、重量にして、約３６重量％から約４０重量％などを含めた、少なくとも約３０重量％、少なくとも約３５重量％の総脂肪酸を有する（重量％種子）。特定の実施形態において、例えば、粉砕されたブラッシカ・ナパス種子の均質な集合体の脂肪酸含有量は、少なくとも約７％のＤＨＡ、少なくとも約８％のＤＨＡ、少なくとも約９％のＤＨＡ、少なくとも約１０％のＤＨＡ、少なくとも約１１％のＤＨＡ、少なくとも約１２％のＤＨＡ、少なくとも約１３％のＤＨＡ、少なくとも約１４％のＤＨＡ、少なくとも約１５％のＤＨＡまたはより多くのＤＨＡを含む（％脂肪酸）。特定の実施形態において、例えば、粉砕されたブラッシカ・ナパス種子の均質な集合体の脂肪酸含有量は、少なくとも約８％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約９％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１０％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１１％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１２％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１５％のＬＣ ＰＵＦＡ、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％またはより多くのＬＣ－ＰＵＦＡ（ＥＰＡ、ＤＰＡ、％脂肪酸としてのＤＨＡ、の合計）を含む。また、そのような粉砕された種子から油および粉末が提供される。

【0140】

粉砕された系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４種子の均質な集合体、または、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の後代または子孫のブラッシカ・ナパスの粉砕された種子の均質な集合体も提供され、ここで、粉砕された種子は、少なくとも約７％のＤＨＡ、、少なくとも約８％のＤＨＡ、少なくとも約９％のＤＨＡ、少なくとも約１０％のＤＨＡ、少なくとも約１１％のＤＨＡ、少なくとも約１２％のＤＨＡ、少なくとも約１３％のＤＨＡ、少なくとも約１４％のＤＨＡ、少なくとも約１５％のＤＨＡ、または、より多くのＤＨＡ（％脂肪酸）のＤＨＡ含有量を含む。例えば、粉砕されたブラッシカ・ナパスＮＳ－Ｂ５００２７－４種子の均質な集合体、または、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の後代または子孫のブラッシカ・ナパスの粉砕された種子の均質な集合体があり、ここで、粉砕された種子の均質な集合体は、少なくとも約８％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約９％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１０％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１１％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１２％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％のＬＣ－ＰＵＦＡ、少なくとも約１５％のＬＣ ＰＵＦＡ、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％またはより多くのＬＣ ＰＵＦＡ（ＥＰＡ、ＤＰＡ、％脂肪酸としてのＤＨＡ、の合計）を含む。また、そのような粉砕された種子から油および粉末が提供される。

【0141】

本明細書に記載されている別の態様は、ブラッシカ・ナパス系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２３１８６で寄託された前記系統の代表的な種子、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の亜系統、ＮＳ－Ｂ５００２７－４または亜系統の後代、または、ＮＳ－Ｂ５００２７－４と第２のキャノーラもしくはブラッシカ植物を交雑させることによって生産された植物、から油または粉末を生成する方法を提供し、該方法は：ブラッシカ植物生育条件下で上記の植物を成長させる工程と；種子を収穫する工程と；油または粉末を抽出する工程と、を含む。

【0142】

本明細書に記載されている別の態様は、ブラッシカ・ナパス系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２３１８６で寄託された前記系統の代表的な種子、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の亜系統、ＮＳ－Ｂ５００２７－４または亜系統の後代、または、ＮＳ－Ｂ５００２７－４と第２のキャノーラもしくはブラッシカ植物を交雑させることによって生産された植物から油を生産する方法を提供し、該方法は：ブラッシカ・ナパス系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２３１８６で寄託された前記系統の代表的な種子、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の亜系統、ＮＳ－Ｂ５００２７－４または亜系統の後代、または、ＮＳ－Ｂ５００２７－４と第２のキャノーラもしくはブラッシカ植物を交雑させることによって生産された植物の種を粉砕する工程と；前述の種子から油を抽出する工程と、を含む。

【0143】

別の態様は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４種子またはＮＳ－Ｂ５００２７－４由来の後代の種子の粉末（ｍｅａｌ）およびタンパク質、ならびに油を提供する。植物バイオマスからのタンパク質抽出は既知の方法により達成することができる。例えば、以下を参照；Ｈｅｎｅｙ ＆ Ｏｒｒ， １１４ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２（１９８１）。ＮＳ－Ｂ５００２７－４からの粉末は、少なくともいくらかのＤＨＡおよび他のω３脂肪酸を含有するので、特に有利であることが証明されうる。同様に、ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のタンパク質分画は少なくともいくらかの有益なＤＨＡおよび他のω３脂肪酸を含む。

【0144】

高オレイン酸含有量によってＤＨＡおよび他のＬＣ－ＰＵＦＡに安定性を与えると主張されている油よりもオレイン酸含有量が低いにもかかわらず、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子からのＬＣ－ＰＵＦＡω３脂肪酸油は驚くべき安定性を示す。より具体的には、ＬＣ－ＰＵＦＡω３脂肪酸は、非常に不安定で、特に酸化しやすいことで悪名高い。ＬＣ－ＰＵＦＡおよびＬＣ－ＰＵＦＡを含有する食品の貯蔵寿命を延ばすためには、カプセル化、他の油、特に高オレイン酸油とのブレンド、または酸化防止剤の添加が必要であることが、当該分野で理解されている。しかしながら、そのような処置をとらないにもかかわらず、粉砕したＮＳ－Ｂ５００２７－４種子から抽出した原油は室温で数ヶ月間新鮮さを保っていることをいくつかのエビデンスが示唆している。

【0145】

本実施形態の別の態様は、ヒトおよびヒト以外の動物のための栄養剤および食物における使用のためのＤＨＡおよびＬＣ ＰＵＦＡの供給源を提供する。特に、ＮＳ－Ｂ５００２７－４種子由来の油は、水産養殖における使用のためのＤＨＡおよびＬＣ－ＰＵＦＡの持続可能な供給源を提供する。魚に対する世界的な高い需要および結果として生じる海産物（ｔｈｅ ｓｅａｓ）の濫獲により、海洋養殖および淡水養殖はますます重要になっている。Ｂｅｔａｎｃｏｒ ｅｔ ａｌ．， ４ Ｓｃｉ．Ｒｅｐ． ８１０４（２０１４）。例えば、サケ科の魚の養殖および消費は過去２０年間に劇的に増大した。しかしながら、野生の魚の食料は、水産養殖におけるそれらの仲間の種の食料とは非常に異なる。実際、水産養殖は、魚粉と魚油などの重要な食物由来の栄養素を提供するために、海洋捕獲漁業に依然として大きく依存している。実際、魚粉と魚油は水産養殖におけるω３－ＬＣ ＰＵＦＡの主要な供給源である。海の魚油は、急成長中（一年あたり５～１０％）の養魚業の制限要因であるため、水産養殖飼料は、マメ科植物の種子、油料種子ケーキ（ｏｉｌｓｅｅｄ ｃａｋｅｓ）、葉の粉末、およびますます多くの部分を占める植物油などの、様々な代替的な植物系原料を含んでいる。従来からＬＣ－ＰＵＦＡが少ない植物油と魚油とを置き換えることは、アマニ油など幾つかの油が、限られた程度ではあるにせよ、魚のＬＣ代謝産物へと変換されうるある量のＡＬＡを含むとしても、ＬＣ ＰＵＦＡが魚の飼料にあまり利用可能でない、ということを示す。一般に、魚の飼料における現行の植物油は魚のＦＡ分布に悪影響を及ぼす可能性があり、これらはω３／ω６比率を変更する可能性がある。

【0146】

例えば、典型的な植物油は、主としてリノール酸（Ｃ１８：２ ω６； ＬＡ）として、高量のω６ ＰＵＦＡを含んでいる。ＤＨＡ：ＬＡの比率が０．９０８である養殖のサケからの油と比較して、親系統であるＡＶ Ｊａｄｅの油にはＤＨＡがなく、故にＤＨＡ：ＬＡの比率がなく；ＮＳ－Ｂ５００２７－４の油は、ＤＨＡ：ＬＡの比率が１．０４８である。Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １１ Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．１４４（２０１２）。興味深いことに、ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のω３ ＦＡの比率は、心血管疾患および脂質異常症に関連するパルミチン酸、飽和脂肪酸に関して特に有利である。Ｄｉｅｔ， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｉｓ．， ＷＨＯ Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ． Ｓｅｒｉｅｓ ９１６， Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ Ｊｏｉｎｔ ＷＨＯ／ＦＡＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ， ８８（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｅｖａ， ２００３）。親系統であるＡＶ Ｊａｄｅの油にはＤＨＡがなく、故にＤＨＡ：パルミチン酸塩の比率がなく；ＮＳ－Ｂ５００２７－４の油は、ＤＨＡ：パルミチン酸塩の比率が２．１２２であり；養殖のサケの油は、ＤＨＡ：パルミチン酸塩の比率が０．５９１であり；及び、野生のサケの油は、ＤＨＡ：パルミチン酸塩の比率が１．０１８である。Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１２。ＬＣ－ＰＵＦＡを含む水産養殖材料の調製は、当技術において他の場合には知られている。以下を参照；Ｂｅｔａｎｃｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， ９ ＰＬＯＳ ＯＮＥ １， ２０１４；Ｔｏｃｈｅｒ， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ（２０１５）。したがって、本実施形態の範囲は、水産養殖飼料のためのω３脂肪酸のソースとしてのＮＳ－Ｂ５００２７－４からの油と、ＮＳ－Ｂ５００２７－４およびその後代から得られた油を含む水産養殖飼料と、の使用を包含する。

【0147】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４およびその後代の同定
エリート遺伝子イベントは、植物ゲノムにおける組み換えＤＮＡ分子の取り込みの部位での位置と構成により特徴づけられうる。組み換えＤＮＡカセットが挿入された植物ゲノムにおける部位はまた「挿入部位」または「標的部位」と呼ばれる。「隣接領域」または「隣接配列」は、例えば、トランスジェニックカセットのすぐ上流に近接して、またはすぐ下流に近接して位置する植物ゲノムの少なくとも２０塩基対、少なくとも５０塩基対、または最大５０００塩基対のＤＮＡの領域である。 外来ＤＮＡのランダム組み込みにつながる形質転換は、各形質転換体について特徴的かつ独特であり、異なる隣接領域を有する形質転換体をもたらす（エリートイベント）。

【0148】

別の態様は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のブラッシカ・ナパス植物、またはその部分を生産するための方法を提供し、該方法は、第１世代の後代の種子を生産するために、第２の植物と上記のブラッシカ・ナパス植物またはその部分を交雑する工程；Ｆ１世代植物を生成するために前述の第一世代の後代の種子を成長させる工程；随意に、育種系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のブラッシカ・ナパス種子、植物、または、その部分を得るために、前記種子の連続した雑種世代を得るために、交雑と成長の工程を繰り返す工程、を含む。この方法により生産された（任意の雑種を含む）植物または植物の部分も提供される。一実施形態において、特定のキャノーラ植物のゲノムへと遺伝子操作された遺伝形質は、植物育種技術においてよく知られている従来の育種技術を用いて、別の栽培品種のゲノムへと移すことができる。例えば、戻し交雑アプローチは、形質転換されたキャノーラ栽培品種から既に高度に開発されたキャノーラ栽培品種へと導入遺伝子を移すために使用されてもよく、そして、得られた戻し交雑転換植物は導入遺伝子を含むであろう。

【0149】

従って、本実施形態の別の態様はＮＳ－Ｂ５００２７－４の検出のための組成物、方法およびキットを提供する。性的交雑の後代が対象の導入遺伝子を含むかどうか判断するために特定のイベントの存在を検出することができることは都合がよいだろう。加えて、特定のイベントを検出する方法は、例えば、組み換え作物に由来する食品の販売前承認や表示を要求する規制を遵守するのに有用である。核酸プローブを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションなど任意の周知の核酸検出方法により導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般に、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子等など頻繁に使用される遺伝要素に焦点を合わせる。その結果、このような方法は、異なるイベント、特に、挿入されたＤＮＡに隣接する染色体ＤＮＡ（「隣接するＤＮＡ（ｆｌａｎｋｉｎｇ ＤＮＡ）」）の配列が知られていない限り、同じＤＮＡ構築物を用いて製造されたものを区別するのに有用でないことがある。イベント特異的ＰＣＲアッセイが記載される。例えば、Ｗｉｎｄｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｄ． Ｆａｃ． Ｌａｎｄｂｏｕｗｗ， Ｕｎｉｖ． Ｇｅｎｔ ６４／５ｂ： ４５９－４６２， １９９９）を参照（インサートと隣接ＤＮＡとの間の接合部にまたがるプライマーセット、具体的にはインサート由来の配列を含む１つのプライマーおよび隣接ＤＮＡ由来の配列を含む第２のプライマー、を用いたＰＣＲによるグリフォサート耐性ダイズイベントの同定）。さらに、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の１６遺伝子インサートは、Ｐｔｏ結合タンパク質（ＰＴＩ）、クロモソームＡ０５に位置する過敏性応答媒介シグナル伝達に含まれるセリン・トレオニンキナーゼ、をコードするブラッシカ遺伝子の発現を妨害した。表現型の変化は観察されなかったが、これは、ＮＳ－Ｂ５００２７－４またはＮＳのＢ５００２７の４－由来の後代の同定のための別のマーカーを提供する。

【0150】

本明細書の方法とキットは、生体サンプル中で、特にＮＳ－Ｂ５００２７－４の導入遺伝子を含む植物材料、ならびにトランスジェニックキャノーラ植物、植物材料、およびそのようなイベントを含む種子の存在を同定するのに有用である。本明細書に記述したエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４は遺伝子型により同定することができ、遺伝子型は、同じ栽培品種または関連する栽培品種の植物を同定することができるか、または血統を判定または検証するために使用することができる、遺伝子マーカー特性を通じて特徴付けられうる。遺伝標識形質特性は、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ－ＰＣＲ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング法（ＤＡＦ）、増幅領域特徴配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ）（ＳＣＡＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、マイクロサテライトとも呼ばれる単純反復配列（ＳＳＲ）、および、一塩基多型（ＳＮＰ）、などの技術によって得られる。

【0151】

例えば、本明細書に記述したエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４は、植物材料のサンプルから遺伝子地図の生成により同定することができる。遺伝子地図は、従来のＲＦＬＰ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、または、外来タンパク質をコードする組み込まれたＤＮＡ分子のおよその染色体位置を同定するＳＳＲ、によって生成され得る。以下を参照；Ｇｌｉｃｋ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣ．ＢＩＯＬ．＆ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２６９（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９９３）。染色体位置に関するマップ情報は対象のトランスジェニック植物の専売の保護のために有用である。例えば、組み込み領域のマップは、疑わしい植物についての類似のマップと比較して、後者が対象植物と共通の起源（ｐａｒｅｎｔａｇｅ）を有するかどうかを判定することができる。マップ比較はハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲおよび配列決定を含むことができ、これらはすべて従来の技術である。

【0152】

本実施形態の別の態様は、キャノーラ植物が、近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４、または、系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝子エリートイベントの少なくとも一部を含むキャノーラ植物、であるかまたはそれらに関連するかどうかを判定するためのキットと方法を提供する。生体サンプル中のエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の同定のための単純且つ明確な技術のための組成物及び方法が、本明細書に記載されている。

【0153】

例えば、キットは、１組のセンス（フォワード）およびアンチセンス（バックワード）プライマーなどの、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の１つ以上の遺伝子マーカーの同定のための少なくとも１組のプライマーを含み得る。表２を参照。プライマーの特定の実施形態は、特に遺伝子移入研究および雑種開発に有用な、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝的形質を検出するためのＫＡＳＰアッセイを実施するためのキットに有用な、以下のプライマーを含んでいる。実施例２を参照。これらのプライマーは、以下のような配列の少なくとも１０個の連続した核酸を含む核酸分子から成りうる。ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＡＣＣＧＴＡＧＴＡＡＧＡＧＡＧＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、Ｍｉｃｏｐｕ―Δ６Ｄ）；ＧＣＴＡＡＧＡＡＧＴＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、Ｍｉｃｏｐｕ―Δ６Ｄ）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、Ｐｙｒｃｏ―Δ５Ｅ）；ＧＧＧＴＴＡＧＣＣＡＣＡＴＴＧＴＡＧＧＴＡＡＣＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、Ｐｙｒｃｏ―Δ５Ｅ）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＰａｖｓａΔ５Ｄ）；ＴＡＧＣＡＴＣＡＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、Ｐａｖｓａ―Δ５Ｄ）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＡＣＧＴＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＧＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、Ｐｉｃｐａω３Ｄ）；ＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＡＡＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、Ｐｉｃｐａ―ω３Ｄ）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＰａｖｓａΔ４Ｄ）；ＧＣＧＡＴＣＣＴＡＧＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、Ｐａｖｓａ―Δ４Ｄ）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＡＴＣＧＣＴＴＡＣＣＴＣＴＴＣＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＬａｃｋｌΔ１２Ｄ）；ＣＡＧＧＧＴＡＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＴＡＡＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、Ｌａｃｋｌ―Δ１２Ｄ）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＴＡＴＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＰｙｒｃｏΔ６Ｅ）；ＧＧＧＡＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、Ｐｙｒｃｏ―Δ６Ｅ）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＰＡＴ）；ＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＰＡＴ）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７； Ａ０５インサート接合部（Ｉｎｓｅｒｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）１）；ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＴＧＴＣＣＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、Ａ０５インサート接合部１）；ＡＴＣＣＡＣＴＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、Ａ０５インサート接合部１）；ＧＴＴＧＧＣＴＡＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、Ａ０５インサート接合部１）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、Ａ０５インサート接合部１）；ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、Ａ０５インサート接合部１）、ＧＧＴＧＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、Ａ０５インサート接合部１）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＧＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、Ａ０５インサート接合部２）；ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＧＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、Ａ０５インサート接合部２）；ＧＴＧＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、Ａ０５インサート接合部２）；ＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＡＧＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、Ａ０５インサート接合部２）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＡＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、Ａ０２インサート接合部１）；ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、Ａ０２インサート接合部１）；ＧＧＴＴＧＴＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＧＴＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、Ａ０２インサート接合部１）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＧＣＴＡＡＡＴＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＴＡＴＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、Ａ０２インサート接合部２）；ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＴＴＴＴＡＧＣＴＡＡＡＴＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＴＡＴＡＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、Ａ０２インサート接合部２）；ＧＡＴＴＧＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＣＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、Ａ０２インサート接合部２）；ＧＴＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＧＴＧＡＧＣＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、Ａ０２インサート接合部２）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＣＡＧＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、Ａ０２インサート接合部２）；ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＴＧＡＧＣＡＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、Ａ０２インサート接合部２）；ＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＡＡＴＣＴＴＴＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、Ａ０２インサート接合部２）；又はそれらの補体。

【0154】

本発明は、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４キャノーラ植物を同定する方法を提供し、該方法は：（ａ）キャノーラ植物ＤＮＡを含む生体サンプルと、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子を増幅することができる第１および第２の核酸プライマーと、を含む混合物を形成する工程と；（ｂ）第１および第２の核酸プライマーがイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子を増幅することを可能にする条件下で混合物を反応させる工程と；（ｃ）増幅フラグメント核酸分子の存在を検出する工程であって、ここで、キャノーラエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子の存在は、キャノーラ植物はＮＳ－Ｂ５００２７－４キャノーラ植物であるということを示す、工程を含む。

【0155】

別の実施形態は、生体サンプル中でエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４核酸分子を検出する方法を提供し、該方法は：（ａ）ＤＮＡを含有する生体サンプルと、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子にハイブリダイズすることができる核酸プローブと、を含む混合物を形成する工程と；（ｂ）プローブがイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４－特異的核酸分子にハイブリダイズすることを可能にする条件下で混合物を反応させる工程と；（ｃ）ハイブリダイズされた核酸分子の存在を検出する工程であって、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子の存在は、サンプルがイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４核酸分子を含んでいるということを示す、工程を含む。

【0156】

さらに別の実施形態は、生体サンプル中でイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４核酸分子の存在を検出する方法を提供し、該方法は：（ａ）ＤＮＡを含有する生体サンプルと、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４挿入核酸分子の領域にアニーリングすることができる第１のプライマーと、宿主細胞ゲノム中の隣接する核酸分子にアニーリングすることができる第２のプライマーと、を含む混合物を形成する工程と；（ｂ）第１および第２の核酸プライマーが、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４インサート核酸分子のフラグメントを含む増幅された核酸分子の産生を可能にする条件下で混合物を反応させる工程と；（ｃ）増幅された核酸分子の存在を検出する工程であって、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４インサート核酸分子のフラグメントの存在は、サンプルがイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４インサートＤＮＡを含んでいるということを示す、工程を含む。

【0157】

適切な検定はいかなる重大な欠点も検出し、現行の栽培品種を超える優位性または改善のレベルを確立せねばならない。優れたパフォーマンスを示すことに加えて、業界標準と両立する、または新しい市場を創出する、新しい栽培品種に対する需要がなければならない。新しい栽培品種の導入により、種子生産者、栽培者、加工業者と消費者に対し、特別な広告とマーケティング、変化した種子と商業的生産の慣行、および新製品の利用のために、追加の費用がかかるでしょう。新しい栽培品種の発売前の検定では、研究開発コストならびに最終品種の技術的優位性を考慮に入れるべきである。種子で増える栽培品種については、種子を簡単かつ経済的に産生することが実行可能でなければならない。

【0158】

例えば、キットは、微細藻類ミクロモナス・プシラに由来するΔ６デサチュラーゼ、微細藻類ピラミモナス・コルダタに由来するΔ５エロンガーゼ、ピラミモナス・コルダタに由来するΔ６エロンガーゼ、海洋微細藻類パブロバ・サリナに由来するΔ５デサチュラーゼ、酵母ピキア・パストリスに由来するΔ１５／ω３デサチュラーゼ、パブロバ・サリナに由来するΔ４デサチュラーゼ、または、酵母ラカンセア・クルイヴェリに由来するΔ１２デサチュラーゼ（例えば表２を参照）に特異的なセンス（フォワード）プライマーおよびアンチセンス（バックワード）プライマーの少なくとも１セットのプライマーと；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド２０３３から２１３２までの接合部、インサートの４３ｂｐおよびをブラッシカクロモソームＡ０２ＤＮＡの５７ｂｐを含む１００ｂｐ領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡの間の５’結合に特異的な少なくとも１セットのプライマー、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のヌクレオチド１４１５６から１４２５５までの接合部、インサートの４６ｂｐおよびブラッシカクロモソームＡ０２ＤＮＡの５４ｂｐを含む１００ｂｐ領域などの、天然のブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとインサートとの間の３’接合部に特異的な少なくとも１つのプライマーセットと；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のヌクレオチド１１１０から１２０９までの接合部、インサートの５０ｂｐおよびをブラッシカクロモソームＡ０５ＤＮＡの５０ｂｐを含む１００ｂｐ領域などの、インサートと天然のブラッシカクロモソームＡ０５ ＤＮＡの間の５’結合に特異的な少なくとも１セットのプライマー、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のヌクレオチド４７７２４から４７８２３までの接合部、インサートの５０ｂｐおよびブラッシカクロモソームＡ０５ＤＮＡの５０ｂｐを含む１００ｂｐ領域などの、天然のブラッシカクロモソームＡ０２ ＤＮＡとインサートとの間の３’接合部に特異的な少なくとも１つのプライマーセットと；を含む

【0159】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントに特徴的なアンプリコンを生成するためにＤＮＡプライマーを使用する方法のための増幅条件は、当技術分野の通常の技術の範囲内である。追加において、内因性のキャノーラ遺伝子の増幅のための制御プライマー対は、反応状態のための内部基準として含まれており、約１００－５０００のヌクレオチドのアンプリコンを生成する。ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベント植物組織サンプルの分析は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベント由来の正の組織対照、ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントでないキャノーラ植物由来の負の対照、および、鋳型キャノーラＤＮＡを含まない負の対照を含むべきである。追加のプライマーを、ＤＮＡ増幅方法の当業者によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＮＯ：４８、ＮＯ：４９およびＮＯ：５０において示される接合部、および、ＮＳ－Ｂ５００２７－４に特徴的なアンプリコンをもたらしうるものであり得るアンプリコンの生産のために最適化された条件、から選ぶことができる。形質転換を備えたこれらのＤＮＡプライマー配列の使用は、本明細書に記載されている実施形態の範囲内である。ＰＣＲ法で使用する際に、ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントについて特徴的なアンプリコンを生産する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に由来する少なくとも１つのプライマー配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に由来する少なくとも１つのプライマー配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に由来する少なくとも１つのプライマー配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に由来する少なくとも１つのプライマー配列、の使用により生産されたアンプリコンは、記載された方法において使用されることができ、かつ、本実施形態の一態様である。ＮＳ－Ｂ５００２７－４イベントアンプリコンの産生は、サーモサイクラーを使用することによって、または当業者に公知の方法および装置によって実施することができる。

【0160】

本発明は、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４キャノーラ植物を同定する方法を提供し、該方法は：（ａ）キャノーラ植物ＤＮＡを含む生体サンプルと、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子を増幅することができる第１および第２の核酸プライマーと、を含む混合物を形成する工程と；（ｂ）第１および第２の核酸プライマーがイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子を増幅することを可能にする条件下で混合物を反応させる工程と；（ｃ）増幅フラグメント核酸分子の存在を検出する工程であって、ここで、キャノーラエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子の存在は、キャノーラ植物はＮＳ－Ｂ５００２７－４キャノーラ植物であるということを示す、工程を含む。

【0161】

別の実施形態は、生体サンプル中でエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４核酸分子を検出する方法を提供し、該方法は：（ａ）ＤＮＡを含有する生体サンプルと、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子にハイブリダイズすることができる核酸プローブと、を含む混合物を形成する工程と；（ｂ）プローブがイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子にハイブリダイズすることを可能にする条件下で混合物を反応させる工程と；（ｃ）ハイブリダイズされた核酸分子の存在を検出する工程であって、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４特異的核酸分子の存在は、サンプルがイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４核酸分子を含んでいるということを示す、工程を含む。

【0162】

さらに別の実施形態は、生体サンプル中でイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４核酸分子の存在を検出する方法を提供し、該方法は：（ａ）ＤＮＡを含有する生体サンプルと、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４インサート核酸分子の領域にアニーリングすることができる第１のプライマーと、宿主細胞ゲノム中の隣接する核酸分子にアニーリングすることができる第２のプライマーと、を含む混合物を形成する工程と；（ｂ）第１および第２の核酸プライマーが、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４インサート核酸分子のフラグメントを含む増幅された核酸分子の産生を可能にする条件下で混合物を反応させる工程と；（ｃ）増幅された核酸分子の存在を検出する工程であって、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４インサート核酸分子のフラグメントの存在は、サンプルがイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４インサートＤＮＡを含んでいるということを示す、工程を含む。

【0163】

後代
本明細書に記述された系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４はまた、他の系統を育種するために使用することができる。例えば、原材料は自家受粉され、外交配され、戻し交雑され、倍加半数体を生産するために使用され、遺伝的形質転換のための原材料として使用され、遺伝的形質転換の対象とされ、さらに変異誘発され、当業者に知られているように他の形態の育種に使用されることができる。他の系統を育種するために原材料材料を使用する方法およびその結果も、これらの実施形態の範囲内である。

【0164】

特異的なタンパク質産物をコードする遺伝子の単離および特徴づけを可能にする分子生物学的技術の出現により、植物生物学の分野の科学者は、特定の方法で植物の形質を変えるために、植物のゲノムを遺伝子操作して、外来の遺伝子、または追加もしくは改変バージョンの天然もしくは内因性遺伝要素（おそらく異なるプロモーターによって駆動される）を含ませおよび発現させることに強い関心を寄せた。形質転換または様々な育種方法を使用してゲノムに導入される任意のＤＮＡ配列は、異なる種由来であるか同じ種由来であるかにかかわらず、本明細書においてまとめて「導入遺伝子」と呼ばれる。過去１５～２０年にわたって、トランスジェニック植物を生成するいくつかの方法が開発されており、本発明も、特定の実施形態において、特許請求の系統の形質転換バージョンに関する。

【0165】

核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、直鎖もしくは分岐、単鎖もしくは二重鎖、またはそのハイブリッド－ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む－の、ＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指す。これらの用語はまた、典型的には、遺伝子のコード領域の５’末端より上流の少なくとも約１０００ヌクレオチドの配列、およびコード領域の３’末端より下流の少なくとも約２００ヌクレオチドの配列である、３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲを包含する。イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチン、およびその他などのあまり一般的でない塩基もまた、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイムペアリングに使用することができる。例えば、ウリジンとシチジンのＣ－５プロピンアナログを含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡに高い親和性で結合し、かつ遺伝子発現の有力なアンチセンスの阻害剤であると示されてきた。ホスホジエステル骨格への修飾、またはＲＮＡのリボース糖基中の２’－ヒドロキシなどの他の修飾も行うことができる。アンチセンスポリヌクレオチドとリボザイムは完全にリボヌクレオチドからなることもでき、または、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含むこともできる。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム調製、ｃＤＮＡ調製、インビトロ合成、ＲＴ－ＰＣＲ、および、インビトロまたはインビボでの転写を含む、任意の手段によって生成されうる。

【0166】

植物形質転換は、植物細胞において機能するであろう発現ベクターの構築を含んでいる。そのようなベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーター）の制御下にあるか、またはそれに作動可能に連結された遺伝子を含むＤＮＡを含む。発現ベクターは、１つ以上のそのような作動可能に連結された遺伝子／調節エレメントの組み合わせを含み得る。ベクターはプラスミドの形態であってもよく、単独でまたは他のプラスミドと組み合わせて使用して、ＮＳ－Ｂ５００２７－４キャノーラ植物を含むキャノーラ植物の遺伝物質に導入遺伝子を組み込むための、当技術分野において公知の形質転換方法を用い、形質転換されたキャノーラ植物を提供することができる。

【0167】

形質転換技術を用いて特定のキャノーラ植物へと遺伝子操作された遺伝形質を、品種改良分野において周知の従来の育種技術を使用して、別のキャノーラまたはブラッシカ系統に移すことができるだろう。 例えば、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を保有する植物は、例えばＡＴＣＣに寄託された種子から得ることができる。 そのような植物はさらに、同じ植物種の別の栽培品種にエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を導入するために、従来の育種スキームにおいて使用され、及び／又は繁殖させることができる。寄託された種子は、ブラッシカ・ナパス種に属する。しかしながら、Ｂ．ナパスからＢ．ジュンセアまでのＡゲノムまたはＣ－ゲノムに位置するアレルまたは導入遺伝子を導入する方法は、当技術分野において周知であり、繰り返される戻し交雑を含んでいる。 戻し交雑のアプローチを用いて、形質転換されたキャノーラ植物からエリート近交系に導入遺伝子を移すことができ、結果として得られた後代は導入遺伝子を含む。 また、近交系が形質転換のために使用される場合、トランスジェニック植物は、トランスジェニック雑種キャノーラ植物を生産するために異なる系統へ交雑することができる。 本明細書で用いられるように、「交雑」は、文脈に応じて、単純なＸとＹの交雑、または戻し交雑のプロセスを指すことができる。

【0168】

様々な遺伝要素はさらに、形質転換を使用して植物ゲノムに導入することができる。これらの要素は、限定されないが：コード配列；誘導性で、構成的な、組織特異的プロモーター；増強配列（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）；およびシグナル配列および標的配列、を含む。新しい分子生物学的技術の出現により、特定のタンパク質産物をコードするなど、特定の機能を有する遺伝要素の単離および特徴付けが可能になった。植物生物学の分野の科学者は、特定の方法で植物の形質を変えるために、植物のゲノムを操作して、外来の遺伝要素、または追加もしくは改変バージョンの天然もしくは内因性遺伝要素を含ませおよび発現させることに強い関心を寄せた。形質転換を使用してゲノムに挿入された任意のＤＮＡ分子は、異なる種に由来するかまたは同じ種に由来するかにかかわらず、本明細書でまとめて「導入遺伝子」と呼ばれる。「形質転換する」プロセスは、ゲノムへのＤＮＡの挿入である。遺伝子導入植物を生成するいくつかの方法が開発されており、本発明は、特定の実施形態において、特許請求のキャノーラ株ＮＳ－Ｂ５００２７－４の形質転換したバージョンに関する。

【0169】

生物学的および物理的な、植物の形質転換プロトコルを含む、植物の形質転換のための多数の方法が開発されている。加えて、植物細胞または組織の形質転換および植物の再分化のための発現ベクターおよびインビトロの培養方法が利用可能である。例えば以下を参照；Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔｓ， ｉｎ ＭＥＴＨ．ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣ．ＢＩＯＬ．＆ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ａｔ ６３（Ｇｌｉｃｋ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３）；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｉｄ．ａｔ Ｒ ８９；Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｏｌａ， ＰＲＯＣ．ＷＯＲＬＤ ＣＯＮＦ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＦＡＴＳ ＆ ＯＩＬＳ ＩＮＤＵＳ．ａｔ ４３－４６（Ａｍ． Ｏｉｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈａｍｐａｉｇｎ， ＩＬ， １９８８）。

【0170】

最も普及しているタイプの植物形質転換は、発現ベクターの構築を含む。そのようなベクターは、調節領域、例えばプロモーター、の制御下にあるコード領域または調節領域に作動可能に連結されたコード領域を含むＤＮＡ分子を含む。ベクターは１つ以上の遺伝子および１つ以上の調節要素を含みうる。コーディング領域およびそれぞれの調節要素の少なくとも１つは、ベクター内で反対方向に配置され得、バイナリーベクターを提供する。 理論上、遺伝子サイレンシングを受けやすい遺伝子を二元的に配置することによって、遺伝子サイレンシングを最小限に抑えることができる。ベクターはプラスミドの形態であってもよく、単独でまたは他のプラスミドと組み合わせて使用して、ＮＳ－Ｂ５００２７－４植物またはＮＳ－Ｂ５００２７－４由来の植物の遺伝物質に導入遺伝子を組み込むための、当技術分野において公知の形質転換方法を用い、形質転換されたキャノーラ植物を提供することができる。

【0171】

例えば、初期の形質転換カセット（ｐＪＰ３４１６＿ＧＡ７－ｍｏｄＢ）は、キャノーラ種子中にオメガ－３脂肪酸の蓄積を促進することができる７つの遺伝子と、インビトロで推定上のトランスジェニック植物の選択を容易にする、１つの選択可能なマーカー遺伝子を含んでいた。以下を参照；ＷＯ２０１３１８５１８４；米国特許出願公開２０１５／０３７４６５４；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， ６ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈ．８（２０１０）。発現された遺伝子はすべて合成－コドン最適化およびコドン合成されたもの－であり、それゆえトランスジェニックＤＮＡ分子はいかなる天然生物にも見られない。コドン最適化のための鋳型として使用された元の配列が記載されている。以下を参照；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， １２ Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ’ｇ ２３３（２０１０ａ）；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， １１ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（２０１０ｂ）；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２１ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１３９（２０１２）。

【0172】

当技術分野において周知のように、機能遺伝子プロモーターは、遺伝子転写にとって重要であるがペプチドなどの機能性産物をコードしないＤＮＡの領域である。例えば、構成的発現のための共通のプロモーターはカリフラワーモザイクウイルスに由来する。Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， ２３６ Ｓｃｉ．１２９９（１９８７）；Ｃｏｕｔｕ ｅｔ ａｌ．， １６ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．７７１（２００７）。発生制御下のプロモーターには、種子、葉、根、繊維、木部血管、気管、または強膜などの特定の組織において優先的に転写を開始するプロモーターが含まれる。特に関連性のあるプロモーターは、主に種子内で、または種子内でのみ転写を開始する「種子優先（“ｓｅｅｄ－ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ”）」プロモーターである。「種子優先」プロモーターは、「種子特異的」プロモーター（種子貯蔵タンパク質のプロモーターのような種子発育中に活性なプロモーター）、および「種子発芽」プロモーター（種子発芽中に活性なプロモーター）の両方を含む。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １０ ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １０８（１９８９）を参照。このような種子優先プロモーターは、限定されないが、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導性メッセージ）；ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ ｋＤａ ｚｅｉｎ）；ｍｉｌｐｓ（ｍｙｏ－イノシトール－１－ホスフェートシンターゼ（ＷＯ２０００／１１１７７および米国特許第６，２２５，５２９号を参照）を含む。双子葉植物については、種子特異的プロモーターは、豆のβ－ファセオリン（β－ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）、ナピン（ｎａｐｉｎ）、β－コングリシニン（β－ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）、ダイズレクチン（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅｃｔｉｎ）、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）、コリンニン（ｃｏｎｌｉｎｉｎ）を含むがこれらに限定されない。ＧＡ７ ｍｏｄＢにおいて使用される種子特異的プロモーターは以前から記載されており：Ａ． サリアナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）ＦＡＥ１（Ｒｏｓｓａｃｋ ｅｔ ａｌ．， ４６ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ７１７（２００１））；Ｌ． ウシタチシマム（Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）Ｃｎｌ１およびＣｎｌ２（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ２００１／０１６３４０）； および、切断型Ｂ．ナパスナピンプロモーター（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｂ． ｎａｐｕｓ ｎａｐｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（Ｓｔａｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２３ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ６７１（１９９３））。米国特許第８，８１６，１１１号も参照。

【0173】

「誘導性」プロモーターは環境の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターに影響を及ぼし得る環境条件の例には、化学的制御（特定の化学物質の存在下で誘導される）、嫌気的条件、または光の存在が含まれる。組織特異的プロモーター、組織優先（例えば、種子優先）プロモーター、および誘導性プロモーターは、「非構成的」（“ｎｏｎ－ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ”）プロモーターの分類を構成する。以下を参照；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２２ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ３６１（１９９３）；Ｍｅｆｔ ｅｔ ａｌ．， ９０ ＰＮＡＳ ４５６７（１９９３）（銅誘導性）；Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２４３ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．３２（１９９４）（除草剤毒性緩和剤により誘導される）；Ｇａｔｚ， ｅｔ ａｌ．， ２２７ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２２９（１９９１）（テトラサイクリン誘導性）；Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， ８８ ＰＮＡＳ １０４２１（１９９１）（グルココルチコステロイド誘導性）。また、ＷＯ２００１／０１６３４０および該明細書に開示されたプロモーターを参照。

【0174】

「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で活性であるプロモーターである。典型的な構成的プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の３５Ｓプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ３１３ Ｎａｔｕｒｅ ８１０（１９８５））、およびイネアクチンなどの遺伝子由来のプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６３（１９９０））；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １２ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６１９（１９８９）； Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １８ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６７５９（１９９２））；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．， ８１ Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ５８１（１９９１））；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， ３ ＥＭＢＯ Ｊ． ２７２３（１９８４））およびトウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２３１ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２７６（１９９２）； Ａｔａｎａｓｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２ Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２９１（１９９２））、が含まれる。ＡＬＳプロモーター、ブラッシカ・ナパスＡＬＳ３構造遺伝子の５’側のＸｂａＩ／Ｎｃｏｌフラグメント（または前記ＸｂａＩ／Ｎｃｏｌフラグメントとのヌクレオチド配列の類似性）は別の構成的プロモーターを提供する。また、ＷＯ１９９６／３０５３０および該明細書に開示されたプロモーターを参照。ＣＭＶプロモーターも有用なエンハンサー領域に関連する。ＷＯ１９９６／３０５３０、ＷＯ２０１３／１８５１８４、および該明細書に開示されたプロモーターを参照。

【0175】

ポリアデニル化シグナルを含む終結領域は、完全かつ安定なｍＲＮＡ分子の産生に必要とされる。例えば、Ａ．ツメファシエンスノパリンシンターゼ（Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）ターミネーター（ＮＯＳ）ターミネーターは有用なターミネーターを提供する。Ｂｅｖａｎ， １２ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．８７１１（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＰＬＡＮＴ ＳＣＩ．ａｔ ２１９（Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８５）；Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５４３（１９８７）。様々な発現カセットの転写を促進および終結させるために、一連の調節配列を組み合わせて使用した。

【0176】

導入遺伝子によって産生されるタンパク質を、葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁、またはミトコンドリアなどの細胞内区画へ、またはアポプラストへの分泌のために、輸送することは、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’または３’領域に作動可能に連結することによって達成される。構造遺伝子の５’または３’末端の標的配列は、タンパク質合成およびプロセシングの間に、コードされたタンパク質が最終的に区画化される（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ）場所を決定し得る。

【0177】

シグナル配列の存在は、ポリペプチドを細胞内オルガネラもしくは細胞内区画のいずれかに、またはアポプラストへの分泌のために方向付ける。多くのシグナル配列が当技術分野で知られている。例えば、以下を参照；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４９（１９９２）；Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．， ９ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ３（１９８７）；Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ９１ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２４（１９８９）；Ｆｏｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， ３ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４８３（１９９１）；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．， ８８ ＰＮＡＳ ８３４（１９９１）；Ｃｒｅｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２ Ｐｌａｎｔ Ｊ． １２９（１９９１）；Ｋａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， ３９ Ｃｅｌｌ ４９９（１９８４）；Ｓｔｅｉｆｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７８５（１９９０）。

【0178】

発現ベクターは、典型的には、負の選択、即ち選択マーカー遺伝子を含まない細胞の増殖の阻害により、または、正の選択、すなわち遺伝子マーカーによってコードされる産物についてのスクリーニングにより、マーカーを含む形質転換細胞を回収することができる、調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された少なくとも１つの遺伝子マーカーを含む。植物形質転換のための一般的に使用される選択可能なマーカー遺伝子の多くが形質転換技術分野において周知であり、例えば、例えば、抗生物質または除草剤であり得る選択的化学物質を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、または、阻害剤に対して非感受性の改変された標的をコードする遺伝子、が挙げられる。正の選択方法も当該技術分野で周知である。

【0179】

植物形質転換のために一般的に使用される選択マーカー遺伝子の１つは、トランスポゾンＴｎ５から単離されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子であり、これは植物調節シグナルの制御下に置かれるとカナマイシン耐性を付与する。Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ８０ ＰＮＡＳ ４８０３（１９８３）。別の一般的に使用される選択マーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。Ｖａｎｄｅｎ Ｅｌｚｅｎ ｅｔ ａｌ．， ５ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９９（１９８５）。抗生物質耐性を与える細菌起源の追加の選択可能なマーカー遺伝子は、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド－３’－アデニルトランスフェラーゼ、ブレオマイシン耐性決定基を含んでいる。Ｈａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， ８６ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２１６（１９８８）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２１０ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ８６（１９８７）；Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．， １４ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９７（１９９０）；Ｈｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， ７ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １７１（１９８６）。他の選択可能なマーカー遺伝子は、グリフォサート、グルホシネートまたはブロモキシニルなど除草剤に対する耐性を与える。Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．， ３１７ Ｎａｔｕｒｅ ７４１（１９８５）；Ｇｏｒｄｏｎ－Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．， ２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６０３（１９９０）；Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２４２ Ｓｃｉ．４１９（１９８８）。細菌の起源でない植物形質転換のための選択可能なマーカー遺伝子は、例えば、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、植物５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ、および植物アセト乳酸シンターゼ、を含む。Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， １３ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６７（１９８７）；Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．， ２３３ Ｓｃｉ．４７８（１９８６）；Ｃｈａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， ８ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ６４３（１９９０）。

【0180】

植物形質転換のためのマーカー遺伝子の他のクラスは、抗生物質などの毒性物質に対する耐性のために、形質転換された細胞の直接的な遺伝的選択よりもむしろ、推定される形質転換植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、特定の組織における遺伝子の発現の分布様式を定量または視覚化するのに特に有用であり、これらは遺伝子発現の調査のために遺伝子または遺伝子調節配列に融合することができるので、しばしばレポーター遺伝子と呼ばれる。推定される形質転換細胞をスクリーニングするために一般的に使用される遺伝子は、α－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、α－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、を含む。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， Ｒ． Ａ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ５：３８７（１９８７）；Ｔｅｅｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ８：３４３（１９８９）；Ｋｏｎｃｚ， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８４：１３１（１９８７）；およびＤｅＢｌｏｃｋ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３：１６８１（１９８４）。ＧＵＳ活性を視覚化する幾つかのインビボの方法は、植物組織の破壊を必要としない。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２９０８， ＩＭＡＧＥＮＥ ＧＲＥＥＮ， １－４（１９９３）；Ｎａｌｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １１５ Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １５１ａ（１９９１）。ＧＵＳ活性を可視化するためのインビボ方法は問題が多いが、低感度、高蛍光バックグラウンド、および選択マーカーとしてのルシフェラーゼ遺伝子の使用に関連する制限を示す。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、原核生物および真核細胞における遺伝子発現のためのマーカーとして利用されうる。Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２６３ Ｓｃｉ．８０２（１９９４）。ＧＦＰおよびＧＦＰの突然変異体はスクリーニング可能なマーカーとして使用されてもよい。

【0181】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４およびＮＳ－Ｂ５００２７－４後代は、疾患または害虫への耐性を与えるためにさらに形質転換することができる。例えば、植物系統を、クローン化された耐性遺伝子を用いて、特定の病原体株に耐性のある植物を遺伝子操作するために形質転換することができる。例えば、以下を参照；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２６６ Ｓｃｉ．７８９（１９９４）（クラドスポリウム・フルバム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍ）に対する耐性のためのトマトＣｆ－９遺伝子のクローニング）；Ｍａｒｔｉｎ， ｅｔ ａｌ．， ２６２ Ｓｃｉ．１４３２（１９９３）（シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）プロテインキナーゼ耐性のトマトＰｔｏ遺伝子、）；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， ７８ Ｃｅｌｌ １０８９（１９９４）（Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）に対する耐性のためのアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＲＳＰ２遺伝子）；Ｇｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ． ４８ Ｇｅｎｅ １０９（１９８６）（バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ）δ－エンドトキシン遺伝子）；Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．， ２４ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２５（１９９４）（クリヴィア・ミニアタ（Ｃｌｉｖｉａ ｍｉｎｉａｔａ）マンノース結合レクチン）；Ｓｕｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ５７ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２４３（１９９３）（ａｍｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２６２ Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １６７９３（１９８７）（システインプロテイナーゼ阻害剤）；Ｈｕｕｂ ｅｔ ａｌ．， ２１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ９８５（１９９３）（タバコ・プロテイナーゼ阻害剤Ｉ）；Ｒｅｇａｎ， ２６９ Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ９（１９９４）（昆虫ジウレチックホルモン受容体）；Ｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ．， １６３ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２４３（１９８９）（ａｌｌｏｓｔａｔｉｎ）；Ｔｏｍａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２６６，３１７号（昆虫特異的麻痺性神経毒）；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ１９９３／０２１９７（ｃａｌｌａｓｅ遺伝子）；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２３ Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ６９１（１９９３）（タバコスズメガキチナーゼ（ｔｏｂａｃｃｏ ｈｏｒｎｗｏｒｍ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ））；Ｋａｗａｌｌｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ６７３（１９９３）（パセリｕｂｉ４－２ポリユビキチン遺伝子）；ＷＯ１９９５／１６７７６（タキプレシン（ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）の誘導体は真菌類を阻害する）；ＷＯ１９９５／１８８５５（合成抗菌ペプチド）；Ｊａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ８９ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４３（１９９３）（セクロピン－β、溶解ペプチドはトランスジェニックタバコ植物をシュードモナスソラナセラムに対し耐性にする）；Ｂｏｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２４ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２４：７５７（１９９４）（緑豆カルモジュリン）；Ｇｒｉｅｓｓ， ｅｔ ａｌ．， １０４ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４６７（１９９４）（トウモロコシカルモジュリン）；Ｔａｙｌｏｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃４９７， ７ｔｈ Ｉｎｔ’ｌ Ｓｙｍｐ．Ｍｏｌｅｃ．植物微生物相互作用（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（１９９４））（トランスジェニック単一の鎖抗体によるタバコにおける酵素の不活性化）；Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉｅｔ ａｌ．， ３６６ Ｎａｔｕｒｅ ４６９（１９９３）（トランスジェニック抗体によるウイルス耐性）；Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．， １０ Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌ． １４３６（１９９２）（真菌エンド－α－１，４ －Ｄ－ポリガラクツロナーゼフラグメントは、真菌コロニー形成を促進し、植物細胞壁ホモ－α －１，４－Ｄ－ガラクツロナーゼを可溶化することにより植物栄養素が放出される）；Ｔｏｕｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２ Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３６７（１９９２）（マメのエンドポリガラクツロナーゼ－阻害タンパク質）；Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １０ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０５（１９９２）（１０のバイオ／技術３０５（１９９２）（オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物は真菌病に対する耐性が増加している）。

【0182】

上述のように、除草剤耐性は遺伝子の修飾により導入されうる別の有用な特性である。例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素など成長点または分裂組織を阻害する除草剤に対する耐性は、突然変異体ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素により付与できる。以下を参照；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ７ ＥＭＢＯ Ｊ． １２４１（１９８８）；Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， ８０ Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．４４９（１９９０）；グリフォサート耐性はａｒｏＡおよび変異型５－エノールピルシキメート（ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ）－３－ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子によって付与される。グルホシネート耐性はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子により付与される；また、ピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘクソンに対する耐性は、ＡＣＣａｓｅ阻害剤をコードする遺伝子によって付与される。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号（ＥＰＳＰＳはグリフォサート耐性を付与する）；変異型ａｒｏＡ遺伝子、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６、Ｃｏｍａｉ、米国特許第４，７６９，０６１号を参照；また、Ｕｍａｂａｌｌａｖａ－Ｍｏｂａｐａｔｈｉｅ， ８ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１９９９）（グルホシネートに耐性を有するラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）））も参照；Ｋｕｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ ０ ３３３ ０３３；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９７５，３７４号（ＥＰＳＰＳは、Ｌホスフィノトリシンなどの除草剤に対する耐性を与える）；Ｌｅｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ０２４２２４６（ホスフィノトリシン－アセチル－トランスフェラーゼ）；ＤｅＧｒｅｅｆ ｅｔ ａｌ．， ７ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ．６１（１９８９）（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするキメラバー遺伝子）；Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ８３ Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．４３５（１９９２）（Ａｃｃ１－Ｓ１、Ａｃｃ１－Ｓ２およびＡｃｃ１－Ｓ３遺伝子は、セトキシジムとハロキシホップなどのフェノキシプロピオン酸およびシクロヘクソン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅｓ）に対する耐性を与える）；Ｐｒｚｉｂｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ３ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６９（１９９１）（ＰｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子はトリアジン耐性を与える）；Ｓｔａｌｋｅｒ、米国特許第４，８１０，６４８号（ニトリラーゼ遺伝子はベンゾニトリル耐性を付与する）；Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２８５ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３（１９９２）（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）；Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２４６ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．４１９（１９９５）（アセトヒドロキシ酸シンターゼは複数の除草剤に対する耐性を付与する）；Ｓｈｉｏｔａ ｅｔ ａｌ．， １０６ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １７（１９９４）（酵母ＮＡＤＰＨ－チトクロームＰ４５０オキシドレダクターゼ）；Ａｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， ３６ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １６８７（１９９５）（グルタチオンレダクターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ）；Ｄａｔｔａ， ｅｔ ａｌ．， ２０ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ６１９（１９９２）（様々なリン酸転移酵素）；ＷＯ２００１／１２８２５；米国特許第６，２８８，３０６号；第６，２８２，８３７号；第５，７６７，３７３号；（プロトックス（ｐｒｏｔｏｘ ）活性が変化した植物はプロトックスターゲティング除草剤に耐性がある）。

【0183】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４およびＮＳ－Ｂ５００２７－４－由来の後代は、当技術分野において知られているように、任意の数の付加価値形質を与えるためにさらに修飾することができる。例えば、以下を参照；Ｇｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， ５２１ Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ １０１（２０００）（大豆フェリチン遺伝子）；Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １８ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ８８９（１９９９）（硝酸レダクターゼ）；Ｋｎｕｌｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．， ８９ ＰＮＡＳ ２６２５（１９９２）（ステアリル－ＡＣＰデサチュラーゼ）；Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， １７０ Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１０（１９８８）（ストレプトコッカス・ミュータンスのフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２０ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２２０（１９８５）（バチルス・サブティリスレバン・スクラーゼ遺伝子）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｌｅｖａｎ－ｓｕｃｒａｓｅ ｇｅｎｅ）；Ｐｅｎ ｅｔ ａｌ．， １０ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ．２９２（１９９２）（トランスジェニック植物はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ）α－アミラーゼを発現する）；Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５１５（１９９３）（トマトインベルターゼ遺伝子）；Ｓｏｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２６８ Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２２４８０（１９９３）（大麦α－アミラーゼ遺伝子の部位特異的突然変異誘発）；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １０２ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４５（１９９３）トウモロコシ内乳デンプン分枝酵素ＩＩ）。

【0184】

キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４はまた、機械的方法、化学的方法、自己不和合性（ＳＩ）、細胞質雄性不稔性（ＣＭＳ、ｏｇｕｒａまたは別のシステム）または核雄性不稔性（ＮＭＳ）の使用を含む、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって雄性不稔であるように遺伝子操作できる。「雄性不稔であるように遺伝子操作された」という用語は、キャノーラ系統ＮＳ Ｂ ５００２７ ４の雄性不稔バージョンを製造するための任意の利用可能な技術の使用を指す。雄性不稔は部分的または完全な雄性不稔でありうる。例えば、以下を参照。ＷＯ２００１／２９２３７（タペータム特異的プロモーターの制御下および化学的Ｎ－Ａｃ－ＰＰＴの適用でのデアセチラーゼ遺伝子の導入）；ＷＯ１９９２／１３９５６、ＷＯ１９９２／１３９５７（雄しべ特異的プロモーター）；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６１１（１９９２）（バルナーゼおよびバルスター遺伝子の導入）；米国特許第５，８５９，３４１号；第６，２９７，４２６号；第５，４７８，３６９号；第５，８２４，５２４号；第５，８５０，０１４号；第６，２６５，６４０号；Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．、１６ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｓ１５４（２００４）も参照。

【0185】

生物学的および物理的な植物の形質転換プロトコルを含む、植物の形質転換のための多くの方法が開発されている。例えば、ＷＯ ２０１３１８５１８４； Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ＭＥＴＨＳ． ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣ． ＢＩＯＬ． ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ． ａｔ ６７－８８ （Ｇｌｉｃｋ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９９３）を参照。加えて、発現ベクターと、植物細胞または組織の形質転換および植物の再分化のためのインビトロ培養方法は利用可能である。例えば、ＷＯ ２０１３１８５１８４； Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＭＥＴＨＳ． ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣ． ＢＩＯＬ． ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ． ａｔ ８９－１１９ （Ｇｌｉｃｋ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９９３）を参照。植物へ発現ベクターを導入する１つの方法は、アグロバクテリウムの天然の形質転換系を使用する。Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２２７ Ｓｃｉ． １２２９ （１９８５）； Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ４５ Ｊ． Ｅｘｐｅｒ． Ｂｏｔａｎｙ １４４１ （１９９４）； Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ３４ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ２７９ （１９９３）； Ｄｉｎａｎｔ ｅｔ ａｌ．， ３ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ７５ （１９９７）； Ｋａｄｏ， １０ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １ （１９９１） （Ｔｉ ａｎｄ Ｒｉ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｃａｒｒｙ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ）； Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．； Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．； Ｍｏｌｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ８ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２３８ （１９８９） （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ， ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５９１，６１６を参照されたい。

【0186】

まとめて遺伝子直接導入と呼ばれる植物の形質転換のいくつかの方法は、アグロバクテリウムを媒介とする形質転換の代わりとして開発されてきた。植物の形質転換の一般に適用可能な方法は、１μｍ～４μｍの微小発射体の表面にＤＮＡが運ばれる、微小発射体媒介性形質転換（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）である。発現ベクターは、植物の細胞壁と細胞膜に浸透するのに十分な３００ｍ／ｓ～６００ｍ／ｓの速度へと微小発射体を加速させる遺伝子銃装置（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）によって植物組織へ導入される。Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １６５ （１９９３）； Ａｒａｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３５７ （１９９２）； Ａｒａｇａｏ ｅｔ ａｌ．， １２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ４８３ （１９９３）； Ａｒａｇａｏ， ９３ Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １４２ （１９９６）； Ｋｉｍ ＆ Ｍｉｎａｍｉｋａｗａ １１７ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １３１ （１９９６）； Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， ５ Ｐａｒｔ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２７ （１９８７）； Ｓａｎｆｏｒｄ ６ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２９９ （１９８８）； Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ６ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ． ５５９ （１９８８）； Ｓａｎｆｏｒｄ， ７ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ ２０６ （１９９０）； Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １０ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ． ２６８ （１９９２）。

【0187】

植物へのＤＮＡの物理的な送達のための方法も当該技術分野では知られている。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ９ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ． ９９６ （１９９１） （ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）； Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， ４ ＥＭＢＯ Ｊ．， ２７３１ （１９８５） （ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）； Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．， ８４ ＰＮＡＳ ３９６２ （１９８７） （ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ＮＨＷ１１９１５）； Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １６１ （１９８５） （ＣａＣ１２ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）； Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２３ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ４５１ （１９８２） （ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｒ ｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）； Ｓａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ４０ Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ， ５０７ （１９９７／９８） （ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）を参照。追加の方法としては、限定されないが、遺伝子銃装置を用いる微小発射体媒介性送達、ＤＮＡ注入、エレクトロポレーションなど、の遺伝子直接導入方法を使用して、植物組織へ導入された発現ベクターが挙げられる。形質転換後に、上記の選択可能なマーカー遺伝子の発現は、当該技術分野で周知の再分化と選択の方法を使用して、形質転換細胞、組織、または植物の優先的な選択を可能にすることもある。例えば、ＷＯ ２０１３１８５１８４を参照。

【0188】

形質転換のための前述の方法は、トランスジェニック系統を生産するために一般に使用されていた。その後、トランスジェニック系統は、新しいトランスジェニックキャノーラ系統を生産するために、別の（非形質転換または形質転換）系統と交雑可能である。代替的に、公知の形質転換技術を使用して、特定のキャノーラまたはアブラナへと遺伝子操作された遺伝形質は、従来の品種改良技術でも公知の戻し交雑技術を使用して、他の系統へと導入することがある。例えば、戻し交雑するアプローチが、遺伝子操作された形質を、一般の非エリート近交系からエリート近交系へ、またはそのゲノム中に外来遺伝子を含有している近交系からその遺伝子を含有していない近交系（複数可）へ移動させるために使用され得る。本明細書で使用されるように、「交雑」は、文脈に応じて、単純なＸとＹの交雑（ａ ｓｉｍｐｌｅ Ｘ ｂｙ Ｙ ｃｒｏｓｓ）、または戻し交雑のプロセスを指す可能性がある。

【0189】

「ＮＳ－Ｂ５００２７－４植物」という用語が本実施形態の文脈において使用される場合、この用語は、その系統のすべての遺伝子変換も含む。「遺伝子変換された植物」という用語は、戻し交雑プロセス、遺伝子操作、または突然変異により開発されるＮＳ－Ｂ５００２７－４植物を指し、ここで、本質的には、戻し交雑技術、遺伝子操作、または突然変異を介して、ＮＳ－Ｂ５００２７－４―派生系統へと伝達された１つ以上の遺伝子に加えて、品種の所望の形態学的特徴および生理学的特徴のすべてが回復する。戻し交雑方法は、その品種の特徴を改善するか導入するために現在の実施形態と共に使用できる。明細書において使用されるような「戻し交雑」という用語は、反復親に戻って雑種後代を繰り返し交雑すること、すなわち、反復親に１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の回数戻し交雑することを指す。所望の特徴のための遺伝子を提供する親のブラシカ植物は、「非反復親」または「供与親」（”ｎｏｎｒｅｃｕｒｒｅｎｔ” ｏｒ ”ｄｏｎｏｒ ｐａｒｅｎｔ”）と称される。この技術用語は、一回親が戻し交雑プロトコルにおいて１回だけ使用され、ひいては繰り返されないという事実を指す。一回親からの遺伝子（複数可）が伝達される親のブラシカ植物は、戻し交雑プロトコルにいくつかのラウンドで使用されるので、反復親として既知である。Ｐｏｅｈｌｍａｎ ＆ Ｓｌｅｐｅｒ， １９９４； Ｆｅｈｒ， １９９３。典型的な戻し交雑プロトコルでは、目的の原品種（反復親）は、伝達される予定の目的の遺伝子を保有する、第２の品種（一回親）に交雑される。その後、この交雑から結果としてもたらされる後代は、再び反復親に交雑させられ、そしてそのプロセスは、キャノーラ植物が得られるまで繰り返され、ここで、本質的には、一回親から伝達された遺伝子に加えて、反復親の所望の形態学的特徴および生理学的特徴はすべて、変換された植物中で回復する。

【0190】

適切な反復親を選択することは、戻し交雑の処理を成功させるために重要な工程である。戻し交雑プロトコルの目的は、最初の系統の形質または特徴を、変更するか置き換えることである。これを達成するために、反復栽培品種の遺伝子は、一回親の所望の遺伝子で修飾されるか置換される一方で、所望の遺伝子学的特徴、ひいては、最初の系統の所望の生理学的特徴および形態学的特徴の残りの全てを本質的に保持する。特定の一回親の選出は、戻し交雑の目的による。主な目的のうちの１つは、植物にいくらかの商業上望ましく、農業経済学的に重要な形質を加えることである。正確な戻し交雑プロトコルは、変更される特徴または形質に応じて、適切な検定プロトコルを決定する。伝達されている特徴が優性対立遺伝子である場合、戻し交雑方法は簡易化されるが、劣性対立遺伝子も伝達されることもある。この例では、後代の検査を導入して、所望の特徴が成功裡に伝達されたかどうか判定することが必要なこともある。

【0191】

新しい系統の開発では選択されないが、 戻し交雑技術により改良できる遺伝子形質が、同定されることもある。遺伝子形質は遺伝子導入のものであってもよく、そうでなくてもよい。これらの形質の例は、限定されないが、雄性不稔、炭水化物代謝の修正、除草剤抵抗性、細菌性疾患、菌類病、もしくはウイルス病に対する耐性、耐虫性、栄養価の増強、工業的使用、生産高安定性、生産高の向上が挙げられる。これらの遺伝子は、通常は核を介して遺伝する。例えば、米国特許第５，９６９，２１２号、米国特許第７，１６４，０５９号を参照されたい。

【0192】

近交系ＮＳ－Ｂ５００２７－４のさらなる再生産が、組織培養物および再分化により発生し得る。「組織培養物」という用語は、同じまたは異なるタイプの単離細胞を含む構成物、または植物の一部分へと組織化されたそのような細胞の集団を示す。例示的なタイプの組織培養物は、原形質体、カルス、分裂組織細胞、および葉、花粉、胚、根、根端、葯、雌しべ、花、種子、葉柄、吸枝、および同種のものなどの植物または植物の部分におけるそのままの組織培養物を生成できる植物細胞である。植物組織培養物を調製し維持するための手段は、当技術分野において公知である。キャノーラの様々な組織の組織培養物、およびそれからの植物の再分化は公知である。例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２７ ＨｏｒｔＳｃｉ． １０３０ （１９９２）； Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２８ ＨｏｒｔＳｃｉ． ６６９ （１９９３）； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ４６ Ｊ． Ｇｅｎｅｔ． Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ２８７ （１９９２）； Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．， ３８ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔ． ７７ （１９９４）； Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ４５ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ． １４４１ （１９９４）； Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， １２５ Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ’ｙ Ｈｏｒｔ． Ｓｃｉ． ６６９ （２０００）； Ｉｂｒａｈｉｍ，ｅｔ ａｌ．， ２８ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔ． １３９ （１９９２）； 米国特許第５，９５９，１８５号；米国特許第５，９７３，２３４号；米国特許第５，９７７，４４５号を参照されたい。キャノーラ植物の再分化のための組織培養物ならびに小胞子培養物は、成功裡に完成できる。Ｃｈｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ４ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ４ （１９８５）； Ｂａｒｓｂｙ ｅｔ ａｌ．， ５ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １０１ （１９８６）； Ｋａｒｔｈａ ｅｔ ａｌ．， ３１ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ ２１７ （１９７４）； Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ ｅｔ ａｌ．， ７ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １０４ （１９８８）； Ｓｗａｎｓｏｎ， ６ Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １５９ （１９９０）； Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈ． ＆ Ｃａｎｏｌａ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ， ６６ Ｊ． Ａｍ． Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ４５５ （１９８９）を参照されたい。その技術的現状は、植物を得るこれらの方法は、高い割合の成功で慣例的に使用されるようなものであることが、文献から明らかである。したがって、本実施形態の他の態様は、成長および分化に際して、同系交配のトランスジェニック系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の生理学的特徴および形態学的特徴を有するキャノーラ植物を生産する細胞を提供する。

【0193】

通常では、導入遺伝子が従来の交雑を通じて植物へと導入されるとき、植物ゲノム内のその挿入部位およびその隣接領域は変えられない。「挿入領域」は、（形質転換されていない）植物ゲノム中の導入遺伝子の上流および下流の隣接領域により囲まれ、かつ挿入部位（および起こり得る標的部位の欠失）を含む、少なくとも１００の塩基対、または最大１０，０００を超える塩基対などの少なくとも４０の塩基対の領域に対応する領域を指す。種内の突然変異が原因の小さな差異を考慮に入れると、挿入領域は、その種のうちの所与の植物中の外来性ＤＮＡの上流および下流の隣接領域に対して、９０％、９５％、または１００％の配列同一性などの、少なくとも８５％の配列同一性を保持することもある。しかしながら、植物ゲノムへのトランスジェニックカセットの挿入は、「標的部位欠失」と言われる植物ＤＮＡの欠失に時折関連する可能性がある。それにもかかわらず、さらなる導入遺伝子または他の遺伝子操作が、不必要な実験作業を行うことなくＮＳ－Ｂ５００２７－４中で作ることができ；そして、ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来の植物が、本明細書に記載されるように同定され得る。

【0194】

ソース材料ＮＳ－Ｂ５００２７－４は、細胞質雄性不稔ソース、または雌としての近交系を滅菌するための他のいくらかのソース上へと戻し交雑される場合、雑種種子の系統を生産するために使用できる。代替的に、その系統は直接使用できる。例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ ）系統のＮＳ－Ｂ５００２７－４は、Ｆ１植物の第一世代集団を形成するために他のキャノーラ植物で交雑できる。この方法により生産された第一世代Ｆ１植物の集団もまた、実施形態である。Ｆ１植物のこの第一世代集団は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の対立遺伝子の本質的に完全なセットを含む。典型的には、Ｆ１雑種は各親の対立遺伝子のすべてを有するものと考慮される。当業者は、育種家の本または分子法のいずれかを活用して、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４を使用して生産された特定のＦ１植物を同定でき、かついかなるそのような個々の植物も本発明により包含される。これらの実施形態はまた、ＮＳ－Ｂ５００２７－４系統のトランスジェニック遺伝子変換または単一の遺伝子変換を用いるこれらの方法の使用を含む。

【0195】

本発明の他の実施形態は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４に対する何度も繰り返される戻し交雑に関与する育種において、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４を使用する方法である。本明細書に記載されるトランスジェニック法、戻し交雑法、または当業者に既知の他の育種方法を使用して、当業者は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝子プロファイルの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％を保持する、個々の植物、および植物の集団を成長させることができる。後代中に保持された遺伝学の割合は、系統分析、または分子マーカーもしくは電気泳動などの遺伝学的技術の使用のいずれかによって測定され得る。系統分析では、平均して、他の系統に対して１度交雑した後に出発生殖質の５０％が後代系統に継代し、異なる系統に対して別の交雑を行った後に出発生殖質の２５％が後代系統に継代する。分子マーカーは、後代系統の系統図を確認および／または判定するために使用される可能性がある。

【0196】

キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来する系統を生産するための特異的な方法は、以下のとおりである。当業者は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４を、エリート系統などの別のキャノーラ植物と交雑する。この交雑に由来するＦ１種子を、均質の集団を形成するために成長させる。Ｆ１種子は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４からの対立遺伝子の５０％と、別の植物の対立遺伝子の５０％とを含有している。Ｆ１種子を成長および自己増殖させ、それによってＦ２種子を形成する。平均して、Ｆ２種子は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４系統からのその対立遺伝子の５０％と、他のキャノーラ植物からの５０％に由来するが、その集団からの様々な個々の植物は、はるかに高い割合の、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来するそれらの対立遺伝子を有する。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ４０ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ． ６５９ （２０００）； Ｂｅｒｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， １０２ Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ９８６ （２００１）。この文脈において使用されるように、集団という用語は、統計的に代表的なサンプルを指す。Ｆ２種子を成長させ、植物の選択を、形質の目視観察または目視測定に基づいて行う。選択するために使用される形質は、キャノーラの種子における高ＤＨＡ産出のキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４形質であり得る。所望のＮＳ－Ｂ５００２７－４由来の形質を表わす、イベントＮＳ－Ｂ５００２７－４由来の後代を選択し、各植物を別々に収穫する。各植物からのこのＦ３種子を、個々の列で成長させ、自己増殖させる。その後、選択された列、またはその列からの植物を、個々に収穫かつ脱穀する。選択は、再び、植物表現型の目視観察、または望ましいＮＳ－Ｂ５００２７－４由来の形質などの、植物の望ましい形質の測定に基づく。同系交配のＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のキャノーラ植物が得られるまで、成長および選択のプロセスを何度も繰り返す。

【0197】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のキャノーラ植物は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来する望ましい形質を含有しており、そのうちのいくつかは、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４が交雑された別のキャノーラ植物によって発現させられることがあり、そしてそのうちのいくつかは、両方のキャノーラ系統によって発現させられることもあるが、ここでＮＳ－Ｂ５００２７－４で発現させられたレベルに等しいか、それよりも高い。

【0198】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のＦ１キャノーラ植物またはブラシカ植物は、平均して、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の５０％に由来するそれらの遺伝子を有するが、その集団からの様々な個々の植物は、はるかに高い割合の、ＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来するそれらの対立遺伝子を有する。交雑、自家受粉、および選択の育種プロセス、平均して、ＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来するそれらの遺伝子の２５％を有するＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のキャノーラ植物の別の集団を生産するために繰り返されるが、その集団からの様々な個々の植物は、はるかに高い割合の、ＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来するそれらの対立遺伝子を有する。本発明の別の実施形態は、高ＤＨＡの望ましいＮＳ－Ｂ５００２７－４由来の形質を受け取った同系交配のＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のキャノーラ植物である。

【0199】

先の例は、多くの方法で修正でき、例えば、選択は、自家受粉した世代の全てで生じることもあれば、生じないこともあり、選択が、実際の自己受粉プロセスが生じる前または後に生じることもあり、または個々の選択が、記載された育種プロセスの任意の時点における、個々の鞘、植物、列、または区画の収穫によりなされることもある。加えて、倍加半数体の育種方法は、プロセス中のあらゆる工程で使用されてもよい。自家受粉の各世代および任意の世代で生産された植物の集団は、本実施形態の実施形態でもあり、そのような各集団は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４からのその遺伝子の５０％、交雑および選択の第２のサイクルにおけるキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４からのその遺伝子の２５％、交雑および選択の第３のサイクルにおけるキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４からのその遺伝子の１２．５％を含有している植物など、から成るだろう。

【0200】

別の実施形態は、別のキャノーラ植物と共にキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４を交雑し、Ｆ１種子もしくはＦ１植物またはこの交雑の自己増殖によって得られたキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の任意の世代に倍加半数体の方法法を適用することにより、ホモ接合体のＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のキャノーラ植物を得る方法である。系統育種は、自家受粉作物または異花受粉作物近交系を改良するために一般的に使用される。好ましく相補的な形質を所有する２つの親がＦ１を生産するために交雑させられる。Ｆ２集団は、１つまたはいくつかのＦ１集団を自己増殖させること、または ２つのＦ１集団を異系交配する（同胞交配）ことによって生産される。最良の個体の選択は、Ｆ２集団で通常着手される。その後Ｆ３に着手し、最良のファミリーにおける最良の個体を選択する。ファミリー、またはこれらのファミリーの個体に関与する雑種の組み合わせの再現検定は、低い遺伝率を有する形質を選択する実効性を向上させるために、しばしばＦ４世代の後に行われる。同系交配がかなり進行した段階（すなわちＦ６およびＦ７）において、最良の系統、または表現型的に同様の系統の混合物は、新しい栽培品種としてリリースされる可能性について検定される。

【0201】

まださらに、本実施形態は、キャノーラ植物と共にキャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４を交雑し、その後代種子成長させ、成長工程によりＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のキャノーラ植物と共に交雑を１～２回、１～３回、１～４回、または１～５回繰り返し、そして、第１、第２、第３、第４、または第５の交雑後に何回も自己増殖させることによって、ＮＳ－Ｂ５００２７－４由来のキャノーラ植物を生産する方法を対象とする。質量および反復の選択は、自家受粉作物または異花受粉作物のいずれかの集団を改良するために使用できる。ヘテロ接合個体の遺伝学的に変更可能な集団は、同定されるか、いくつかの異なる親を異系交配することにより作られる。最良の植物は、個々の優越、優秀な後代、または優れた組合せ能力に基づいて選択される。選択された植物は、選択のさらなるサイクルが継続させられる新しい集団を生産するために異系交配される。

【0202】

簡単に遺伝し、高遺伝性の形質のため遺伝子を、反復親である望ましいホモ接合栽培品種または系統へと伝達するために、戻交雑育種法を使用した。伝達される形質の源は供与親と呼ばれる。結果としてもたらされる植物は、反復親（例えば栽培品種）の特質と、供与親から伝達された望ましい形質とを有することが推測される。初めの交雑後に、供与親の表現型を所有する個体を選択し、反復親に対して繰り返し交雑（戻し交雑）する。結果としてもたらされる植物は、反復親（例えば栽培品種）の特質と、供与親から伝達された望ましい形質とを有することが推測される。

【0203】

単粒系統処理は、厳密に言えば、分離集団を植え、１つの植物当たり１つの種子のサンプルを収穫し、次世代を植えるために単粒サンプルを使用することを指す。その集団を、Ｆ２から同系繁殖の所望のレベルまで進ませた場合、系統が由来する植物は、それぞれ異なるＦ２個体にまでさかのぼる（ｔｒａｃｅ ｔｏ）であろう。集団の植物の数は、いくつかの種子が発芽するのに失敗する、またいくつかの植物が少なくとも１つの種子を生産するのに失敗することが原因で、各世代で減少する。その結果、集団において最初にサンプル収穫されたＦ２植物のすべてが、世代の進行が完了したときに、後代によって示されるとは限らない。

【0204】

さらなる実施形態は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の単一遺伝子の変換をもたらす。ＤＮＡ配列が戻し交雑などの従来の（非形質転換）育種技術によって導入されるとき、遺伝子変換が生じる。ＤＮＡ配列は、自然発生であって、も導入遺伝子であっても、これらの従来の育種技術を使用して導入され得る。このプロセスを経て伝達される所望の形質には、限定されないが、稔性の変更、脂肪酸プロファイルの変更、他の栄養素の増大、産業的増強、耐病性、耐虫性、除草剤抵抗性、および生産高増大が挙げられる。目的の形質は、供与親から反復親、この場合は、本明細書に開示されるキャノーラ植物に伝達される。単一遺伝子の形質は、優性対立遺伝子または劣性対立遺伝子のいずれかの伝達に起因し得る。目的の形質を含有している後代を選択することは、優性対立遺伝子に関連する形質を個別選択（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）することによって行われる。劣性対立遺伝子を介して伝達される形質の後代を選択するには、第１の戻し交雑世代を成長およびかつ自己増殖させて、どの植物が劣性対立遺伝子を保有するのかを判定することが求められる。劣性形質は、目的の遺伝子の存在を判定するために、連続戻し交雑世代のさらなる後代検定を必要とすることもある。目的の形質を選択すると共に、後代を、反復親の表現型のために選択する。時折、さらなるポリヌクレオチド配列または遺伝子が、目的の単一遺伝子変換形質に加えて、伝達されることが理解されるだろう。本明細書に開示されるキャノーラ植物である反復親からの遺伝子の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％を含有し、かつその遺伝子変換形質を含有している後代は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４の遺伝子変換であると考えられる。形質が２つの遺伝子によって制御されるとき（例えばいくらかの耐病性）、例えば、２つの遺伝子に対する選択が同時に行われる。

【0205】

突然変異育種は、キャノーラ品種へと新しい形質を導入する別の方法である。自然に生じる、または人為的に誘導される突然変異は、植物育種家にとって、変異性の有用な源になり得る。人工の突然変異誘発の目的は、所望の特徴のための突然変異の割合を増大させることである。突然変異率は、温度、長期の種子貯蔵、組織培養条件、放射（Ｘ線、ガンマ線、中性子、ベータ線、または紫外線など）、化学変異原（５－ブロモ－ウラシルのような塩基アナログなど）、抗生物質、アルキル化剤（サルファマスタード類、ナイトロジェンマスタード類、エポキシド類、エチレンアミン類、硫酸塩類、スルホン酸塩類、スルホン類、またはラクトン類など）、アジ化物、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、アクリジン類を含む多くの様々な手段によって増大できる。一旦、所望の形質が突然変異生成によって観察されると、その後、形質は従来の育種技術によって既存の生殖質へと組み込まれることもある。例えば、Ｆｅｈｒ， ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＣＵＬＴＩＶＡＲ ＤＥＶＥＬ．（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂ’ｌ Ｃｏ．， １９９３）を参照されたい。

【0206】

本実施形態のキャノーラ系統は、細胞質遺伝子、核内遺伝子、または他の因子のルーチン操作によって、前で議論された文献において記載されるように、雄性不稔の形態で生産されることが理解されるだろう。そのような実施形態はまた、本請求項の範囲内である。このように、本実施形態は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の使用によって生産されたＦ１雑種の種子および植物を提供する。

【0207】

植物の遺伝子型の分析、比較、およびキャラクタリゼーションが可能な、以下のような多くの研究室ベースの技術が存在する；アイソザイム電気泳動、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ－ＰＣＲ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、配列特徴化増幅領域（ＳＣＡＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、単純反復配列（ＳＳＲ、マイクロサテライトとも呼ばれる）、および一塩基多型（ＳＮＰ）。

【0208】

アイソザイム電気泳動およびＲＦＬＰは遺伝組成を判定するために広範に使用されてきた。Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＆ Ｏｌｓｅｎ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｍａｐ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）， ｐｐ． ６．１３１－６．１３８ ｉｎ Ｓ． Ｊ． Ｏ’Ｂｒｉｅｎ （ｅｄ．） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｐｓ： Ｌｏｃｕｓ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９９３））では、約３６５のＲＦＬＰ、１１のＲＡＰＤ、３つの古典的マーカー、および４つのアイソザイム遺伝子座を備えた２５の連鎖群から成る、分子の遺伝連鎖地図が開発された。Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ， Ｒ． Ｃ．， ＲＦＬＰ Ｍａｐ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ， ｐｐ． ２９９－３０９， ｉｎ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｒ． Ｌ． ａｎｄ Ｖａｓｉｌ， Ｉ． Ｋ． （ｅｄｓ．）， ＤＮＡ－Ｂａｓｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９９４）も参照されたい。

【0209】

現在では、ＳＳＲ技術が、効率的かつ実践的なマーカー技術であり；より多くのマーカー遺伝子座が慣例的に使用でき、ＲＦＬＰと比較して、ＳＳＲを使用して、標識座当たりより多くのアレルが発見され得る。例えばＤｉｗａｎ ＆ Ｃｒｅｇａｎ， ９５ Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２２ （１９９７）を参照されたい。ＳＮＰも、発明の特有の遺伝組成、およびその特有の遺伝組成を保持する後代品種を同定するために使用されることもある。様々な分子マーカー技術が、全体的な分析を増強するために併用して使用されてもよい。分子マーカーが、アイソザイム電気泳動、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＰ－ＰＣＲ、ＤＡＦ、ＳＣＡＲ、ＡＦＬＰ、ＳＳＲ、およびＳＮＰのような技術の使用によって同定されたマーカーを含み、品種改良において使用されることもある。分子マーカーを１回使用することが、量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）マッピングである。ＱＴＬマッピングは、定量的形質対する測定可能な効果を有するアレルに緊密に結合されることが知られているマーカーを使用することである。育種プロセスの選択は、好ましい効果を奏するアレルに結合されたマーカーの蓄積、または植物のゲノムからの、好ましくない効果を奏するアレルに結合されたマーカーの排除に基づく。

【0210】

分子マーカーも、育種プロセスの間に、質的形質を選択するために使用できる。例えば、アレルに緊密に結合されたマーカーまたは目的の現在のアレル内に配列を含むマーカーが、戻し交雑育種プログラムの間に、目的のアレルを含む植物を選択するために使用され得る。それらのマーカーはまた、反復親のゲノムに向けて、および供与親のマーカーに対して選択するために使用できる。この処理により、選択された植物中に残る供与親からのゲノムの量を最小化することを試みる。その処理は、戻し交雑プログラムにおいて必要であった反復親に対する交雑の数を減らすためにも使用できる。選択プロセスにおける分子マーカーの使用は、遺伝子マーカー増強選択（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、またはマーカー利用選抜（ｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）としばしば呼ばれる。分子マーカーはまた、交雑によって追跡遺伝子プロファイルの手段を提供することによって、親の品種、または植物の祖先として、生殖質の特定の源を同定し除外するために使用されることもある。

【0211】

したがって、最先端技術である、植物を得るこれらの方法は、それらが慣例的に使用され 高い成功率を有するという点で「従来のもの」であることが明らかである。キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の有用性はまた、他の種との交雑にまで及ぶ。一般的には、適切な種はアブラナ科である。従って、育種におけるキャノーラエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を使用する全ての方法は、本実施形態によって含まれ、自己増殖、系統育種、戻し交雑、雑種生産、および集団に対する交雑が挙げられる。および、親としてキャノーラ系統エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４を使用して生産された全ての植物および植物の集団は、本実施形態の範囲内にあり、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来する品種から成長させられたものを含む。特有の分子マーカープロファイルまたは育種記録は、キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４に由来する後代系統または後代の集団を同定するために当業者によって使用され得る。

【実施例】

【0212】

実施例１
圃場試験におけるＮＳ－Ｂ５００２７－４系統のキャラクタリゼーションおよび選択
植物育種における困難な作業は、遺伝学的に優秀な個々の植物の同定であるが、これは、ほとんどの形質に対して、真の遺伝子型値に、他の植物形質または環境要因が混同することによって隠されることもあるからである。優秀な植物を同定するための１つの方法が、他の実験の植物および１つ以上の広く成長させられた標準的な栽培品種と比較して、その性能を観察することである。単独観察が決定的でない場合、観察を繰り返すことによって、遺伝学的な価値のより良い評価がもたらされる。

【0213】

Ｂ００５０－０２７－１８として最初に同定された植物は、植物当たり１つの種子のサンプルを収穫し、 次世代を植えるために単粒サンプルを使用することによる、単粒系統処理に基づいて選択された。一般的には、集団中の植物の数は、ある程度の種子が発芽に、またはある程度の植物が少なくとも１つの種子を生産するのに失敗するために、各世代で減少する。その結果、世代の進行が完了したときに、集団中で最初にサンプルされた全ての植物が後代によって示されるわけではない。さらに、最初の遺伝子導入イベントは、後代の遺伝子型または表現型に関して予想ができないほど、遺伝の複雑性を悪化させる。したがって、植物を選択し、特定の系統がホモ接合体になるまで連続する世代のタイプに自家受粉させ、これによって、優れた農学的プロパティを備えた選択された形質が示され、そして純粋品種の後代の一様な集団が生産された。より具体的には、Ｎｕｓｅｅｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ （ＮＩＣ）， Ｈｏｒｓｈａｍ （Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）における育種再選択プログラムに従って、検定系統を選択した。候補の系統の選択および増進は以下に基づく：
（ａ）Ｔ－ＤＮＡインサートのコピー数；
（ｂ）ＤＨＡ発現の分離パターン；
（ｃ）ホモ接合性（脂肪酸の表現型および遺伝子型に基づく）；
（ｄ）ＬＣ－ω３－ＤＨＡの生産；および
（ｅ）冬と夏の位置での後代検定に基づいた、作物生産に関する適切な農業形質。

【0214】

オーストラリアでは、キャノーラは、南部乾燥地域の作物地域にわたって、ほとんどは主に冬に雨が降る環境で栽培される。オーストラリアでの生産は、春化処理をほとんど必要としない春まき性のキャノーラ栽培品種由来である。一般的には、オーストラリアの栽培品種は、一般的には開花の始まりが少し遅れ、冬月にわたって比較的高い草勢またはバイオマス生産を有する。オーストラリアのキャノーラ作物は、第１の主要な降雨事象の後の４月から５月まで一般的には種をまかれ、１０月から１２月まで収穫される。収穫量は、主として、栽培期の間の可利用水分および栽培品種の水使用効果率によって影響を受ける。レプトスフェリア・マクランズ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ）に起因する黒あし病に対する主要な病原型遺伝子抵抗力によって、苗の生存率および茎の腐敗の観点から、栽培品種を区別できるが、オーストラリアの栽培品種は、一般的に、推奨された農耕法の下で成長させられた場合に高耐性を有すると考えられる。種子の発育は、５～７ヶ月の栽培期の後、晩春または初夏に始まる。水利用可能性とは別に、収穫量は、種子および種子の鞘の不稔をもたらすこともある広い温度限界（＜０℃～＞３５℃）に著しく影響を受ける可能性がある。

【0215】

本明細書において留意される。キャノーラ生殖質の形質転換を、ＬＣ－ω３脂肪酸類、特にＤＨＡの、種子特異的な蓄積を結果としてもたらした８つの遺伝子構成で試みた。おおまかに言えば、表現型を、製品品質（ＰＱ）（生産されたオメガ－３脂肪酸類）によってキャラクタライズしたが、植物はマーカー遺伝子（ＭＧ）を保有した。形質転換された材料を、遺伝子座のホモ接合性、種子におけるＤＨＡの発現、および 市販品の生産に適する農業的形質および生産力に関して再度選択した。

【0216】

遺伝子導入イベントからの３つのＴ２世代由来の同胞を、８つの実験的な位置（場所）にわたる様々な重要な農学的形質および種子形質のために、８つの他のキャノーラ栽培品種（系統）と比較した。２０１５年、ビクトリアで、栽培期の降雨量は長期平均以下であり、栽培期の期間が縮小された。８つのオーストラリアの現場は、現場平均の現場収穫量内の範囲（すなわち、ＡＶ Ｇａｒｎｅｔ：０．７～２．４ｔ／ｈａ）によって示されるような広範囲の環境的な生産力を示した。トランスジェニック系統Ｂ００５０－０２７－１８－Ｘを、以下の３つのトランスジェニック系統によって表した：Ｂ００５０－０２７－１８－２０（Ｔ３）、Ｂ００５０－０２７－１８－３６－１３（Ｔ４）、およびＢ００５０－０２７－１８－１０５－１３（Ｔ４）。検定系統の農業形質変種は、検定された全ての環境にわたって評価された市販の栽培品種と同等であった。この結論は、最も高生産の検定系統の穀物収穫量が、現場間分析（ａｃｒｏｓｓ－ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＭＥＴ－ＲＥＭＬ）に基づいて、最も高生産な市販の栽培品種と統計的に同等であったという結果によって裏付けられた。さらに、各現場に対して、最も高生産な検定系統が、著しい差が無かったある現場を例外として、少なくとも１つの栽培品種よりも著しく生産が多かった。検定系統は、わずかに低い割合の種子油、および変動する脂肪酸組成物を有する種子を生産したが；これは生産高または能楽的性能には影響を与えなかった。ＬＣω３ＤＨＡ脂肪酸は、検定された環境にわたって非常に安定して発現した。

【0217】

検定系統は、形質転換された苗木（ｖａｒ． ＡＶ Ｊａｄｅ）に由来した。種子を、植物が単離環境（すなわち防虫テント）で自家受粉することを可能にすることによって大きくした。

【0218】

比較のために使用された対照の栽培品種（市販の育種系統）によって、作物地域において広範に成長させられた、農業経済学的に異なる（例えば草性、生物季節学の）範囲の、よく適した（すなわち生産力および含油量は高いが変動する）栽培品種をもたらした。これらの栽培品種を、全て自然受粉させ、例えば、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ＰｒｏｇｒａｍおよびＲｅｇｉｏｎａｌ ａｎｎｕａｌ ｃｒｏｐ ｒｅｐｏｒｔｓに記載し、大規模に評価した。「ｎｖｔｏｎｌｉｎｅ」というウェブサイトを参照されたい。さらに、植物病害抵抗性の変種は、オーストラリアの黒あし症に関してよく説明されている。Ｖａｎ Ｄｅ Ｗｏｕｗ ｅｔ ａｌ．， ６７ Ｃｒｏｐ ＆ Ｐａｓｔｕｒｅ Ｓｃｉ． ２７３ （２０１５）。オーストラリアでは、黒あし病は、最大９０％の収穫損失を引き起こす可能性がある。Ｍａｒｃｒｏｆｔ ＆ Ｂｌｕｅｔｔ， Ａｇｒｉｃｕｌ． Ｎｏｔｅｓ， ＡＧ１３５２， Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ｄｅｐｔ． Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｎｄｕｓ． （２００８）。特定の種子の脂肪酸組成物および種子油の含有量のための、市販の栽培品種のうちの遺伝変異は、経時的に実証されてきた。Ｓｅｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｃａｎｏｌａ ２０１１ （Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｏｉｌｓｅｅｄｓ Ｆｅｄ．， ２０１２）を参照されたい。栽培品種ＡＶ Ｊａｄｅからの植物を、遺伝子導入Ｔ０を生産するために形質転換し、従ってＡＶ Ｊａｄｅは、本明細書に記載された遺伝子導入イベントの形質転換されていない同質遺伝子系統と考えられ得る。

【0219】

検定系統のための表現型変異を、植物出芽草勢、開花期、開花持続時間、植物丈、種子の脱粒、耐倒伏性、黒あし症の重症度、植物収穫数、穀物収穫量、穀粒水分、種子油の割合、および特に種子ＬＣ－ω３多不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）、 具体的にはＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの収穫量に関係する脂肪酸含有量によって、キャラクタライズした。測定されたすべての形質に対して、限定的推定尤度分析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、統計ソフトウェアＧｅｎＳｔａｔ中のＡＳＲＥＭＬを使用して試みた。Ｇｉｌｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， ＡＳＲＥＭＬ ｕｓｅｒ ｇｕｉｄｅ， ｒｅｌｅａｓｅ ３．０， Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ （３） （ＶＳＶ Ｉｎｔ’ｌ， Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ Ｓｔｍ Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ， ＵＫ， ２００９）。線形混合モデルの統計的方法を、広範囲に記載されるような畑の空間的変化を考慮するために使用し、かつ畑での植物育種および遺伝子学的研究のために使用した。Ｃｕｌｌｉｓ ＆ Ｇｌｅｅｓｏｎ， ４７ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ １４４９ （１９９１）； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ５７ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ １１３８ （２００１）； Ｗｅｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｍｉｘｅｄ ｍｏｄｅｌｓ ｂｙ ＡＳＲｅｍｌ－Ｒ ｗｉｔｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ： Ｃｏｕｒｓｅ Ｎｏｔｅｓ （ＶＳＶ Ｉｎｔ’ｌ， Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ Ｓｔｍ Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ， ＵＫ， ２０１３）。Ｍｅｔａ－ＲＥＭＬ現場間分析を、穀物の収穫量（ｔ／ｈａ）のためにさらに試みて、検定系統のために現場間の最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）を測定した。

【0220】

植物出芽に関して、８つの現場全てにわたって、各区画内の２つの１平方メートル（１ｍ^２）の四分区間における播種後に、およそ１２日で出芽した植物の数を数えて出芽の数を推定した。四分区間の両方の平均を、１平方メートルごとに出芽した植物の数を推定するために使用し、形質変量として分析した。区画当たりの平均植物密度の視覚的な評価に基づく植物出芽スコアを、全ての現場にわたって、各区画について記録し、形質変量として分析した（例えば、１＝低＝０－５植物／ｍ^２；５＝中＝２５－３０植物／ｍ^２；９＝高＝４５－５０植物／ｍ^２）。１平方メートルごとの数に基づく植物出芽、および出芽スコアは、８つの現場全ての系統処理間で著しく変動した。統計的には、トランスジェニック系統の植物出芽、全ての実験にわたって、栽培品種により示された範囲内で著しく変動した。草勢を、全ての現場にわたる各区画について、植物キャベツ期（ｐｌａｎｔ ｃａｂｂａｇｅ ｓｔａｇｅ）（すなわち６枚葉期から）における植物性バイオマスの、１－９のスコアによる観察を使用して栽培期の初期に予測し、そして形質変量として分析した。

【0221】

開花期を、種まきから、区画内の植物の５０％の少なくとも１つの花が開いた時までの日数として記録した。これを、全ての試験にわたって各区画で記録し、形質変量として分析した。開花の始まり（種をまいてからの日数）は、開花した植物の５０％に基づき、すべての現場の系統処理間で著しく変動した。現場平均開花期は、９９日から１１０日まで変動し、この形質のための実験現場にわたる環境的な差異の指標である。統計的には、トランスジェニック系統の開花期は、全ての実験にわたって、栽培品種により示された範囲内で著しく変動した。

【0222】

開花持続時間は、開花期～開花期の終了（日数として示される）の算出された差とした。これを、全ての試験にわたって各区画で算出し、形質変量として分析した：開花持続時間＝開花終了日－開花期（５０％。開花の始まり（種をまいてからの日数）は、開花した植物の５０％に基づき、すべての８つの現場の系統処理間で著しく変動した。現場平均開花期は９９日から１１０日まで変動し、この形質のための実験現場にわたる環境的な差異を反映する。統計的には、トランスジェニック系統の開花期は、全ての実験にわたって、栽培品種により示された範囲内で著しく変動した。開花の終了（種をまいてからの日数）は、植物の９０％が花を持たないことに基づき、８つの現場すべての系統間で著しく変動した。開花期の終了の現場平均は１２８日から１３９日まで変動し、このことがこの形質のための実験現場にわたる環境的な差異を反映した。統計的には、トランスジェニック系統の開花期の終了は、現場全てにわたって、栽培品種により示された範囲内で著しく変動した。

【0223】

１平方メートルごとの植物に基づく収穫時の植物は、８つの現場全ての系統間で著しく変動した。統計的には、トランスジェニック系統の収穫時における植物数は、全ての植付および位置にわたって、栽培品種により示された範囲内で著しく変動した。出芽時の植物の数は、収穫時に記録された植物の数に対して有意に相関した。算出された生存割合のうちのいくつかは１００％を超過したが、これは、２つの栽培品種（ＡＴＲ ＷａｈｏｏおよびＡＶ Ｊａｄｅ）の遅い幼植物出芽を反映している：全ての苗木が、植物出芽数が記録されたときに出芽していたわけではない。

【0224】

乾燥種子成熟段階時の、底から、区画の中心にある生長点までの植物丈を測定した。区画間空間的面積に恐らく関連する交絡効果（エッジ効果）を避けるために区画の中心を使用した。これ形質を、全ての試験にわたって各区画で記録し、形質変量として分析した。成熟時の植物丈（ｃｍ）は、現場全ての系統処理間で著しく変動した。現場平均の植物丈は、６３ｃｍから１０５ｃｍ日まで変動し、この形質のための実験現場にわたる環境的な差異を示した。統計的には、成熟したトランスジェニック系統の丈は、実験全てにわたって、栽培品種により示された範囲内で著しく変動した。

【0225】

成熟時の種子の脱粒（時々鞘脱粒と呼ばれる）を、２週間にわたって記録された、１平方メートルの１／８当たり種子の脱粒の数を使用して分析した。これを、種子をまいた列の間、かつ全ての位置の各区画のキャノピーの下に、２つのトレーを配置することにより試み、形質変量として分析した。種子脱粒スコア（１（皆無）～９（高：＋４０）のスケールに基づく）を、１つの現場で、収穫直前の地面上で観察された種子の数に基づいて記録し、形質変量として分析した。収穫時の地面上の種子の数に基づく種子の脱粒は、８つの現場のうちの４つの系統処理間で著しく変動した。現場平均の種子の脱粒数は、（１平方メートルの１／８当たり）３から１５まで変動し、全ての現場にわたって低レベルの脱粒を示した。現場のうちの１つにおける種子脱粒スコアはまた、系統間で著しく変動し、現場間平均の種子脱粒数に密接に相関した。これは、スコアとして記録された脱粒が種子脱粒の良好な予測因子であったことを示す。統計的には、トランスジェニック系統の、種子数に基づく種子脱粒およびスコアは、実験全てにわたって、栽培品種により示された範囲内で著しく変動した。

【0226】

成熟時の植物の底から傾く植物の角度に基づいてスコア付けされる耐倒伏性を、１（抵抗力がある）～９（感染しやすい）として記録した。植物倒伏に関する統計的に著しい変動は存在しなかった。この形質に関する変動が無かったのは、恐らく、遅い結莢期（ｌａｔｅ ｐｏｄ ｆｉｌｌ ｓｔａｇｅ）において平均雨量が少なかったことに関連する。

【0227】

レプトスフェリア・マクランズおよびレプトスフェリア・ビッグロボサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｂｉｇｌｏｂｏｓａ）の代表的な黒あし症葉の重症徴候を、５つの現場にわたる１つの繰り返しについて、１（低＜５％）～９（高＞４０％）スコアとして記録した。顕著な変動が無かったので、全ての区画がスコア付けされたわけではない。腐敗および茎の折損に関連する症状は観察されなかった。黒あし病の葉の症状は、８つの現場全てにおいて、非常に低レベルでしか観察されなかった。むき出しの種子（ｂａｒｅ ｓｅｅｄ）（殺菌剤で未処理の種子）を使用して、１つの現場に種子をまいた。この現場と、種子殺菌剤で処理された他の現場との間では、検定された系統間の植物出芽の相対的な差異はなかった。葉の症状によって、Ｌ．マクランズ（Ｌ．ｍａｃｕｌａｎｓ）（収穫量の減少の主要因であり、オーストラリアの抵抗力レーティングの基礎、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ３３ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ． ４０１ （２００４）を参照されたい。）により引き起こされる茎の腐敗の程度を、常に予測できるとは限らない。いくつかの試験で、子葉、葉、茎（がん腫病）に対する病原体感染、および現場条件下の植物生存率に基づいて黒あし症の抵抗力が評価された。腐敗および茎の折損が無いと仮定して、キャノーラ系統は、本明細書に記載された目的のための、現行の病害圧力（ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）に耐性があるとみなされ得る。

【0228】

植物収穫数を、８つの現場全ての各区画内の、２つの１平方メートルの四分区間における植物を数えることにより推定した。その後、四分区間の両方の平均を、１平方メートルごとの植物の数を推定するために使用し、形質変量として分析した。植物数の現場平均を、植物出芽数の現場平均の％として表すことにより、植物生存率（％）を算出した：植物生存率％ ＝（植物収穫数×１００）／植物出芽数。

【0229】

穀物を、種子が生理学上成熟し、かつ乾燥した（～７％）時に、区画収穫機を使用して収穫した。収穫方向を、各試験で一貫（すなわち各列で前後の範囲）させて、収穫方向よる誤差を避けた。各区画の乾燥穀物重量を測定し、区画面積に基づく単位ｔ／ｈａに変換し、形質変量として分析した。

【0230】

収穫時および研究所サンプルの穀粒水分を記録し、形質変量として分析した。ハンドヘルドの水分計を使用して、現場の収穫点でバルクサンプルを直接分析した。Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｏｉｌｓｅｅｄ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ（ＡＯＦ）メソッド４－１．５に基づき、オーブン乾燥法を使用して、水分の割合を測定した。この方法は、開いた缶内で、１３０℃で１時間、５グラムのサンプルをオーブン乾燥することを含んだ。そのサンプルを、４０分間デシケーター中で冷却し、重さを測り、水分の割合を、質量のパーセント損失として測定した。収穫時の穀粒水分（％）は、８つの現場全ての系統処理間で著しく変動した。収穫時の現場平均の穀粒水分は９％から１２％まで変動し、このことが、種子が同様の穀物期で収穫されたことを示す。統計的には、トランスジェニック系統の収穫時の穀粒水分は、実験全てにわたって、栽培品種により示された範囲内で著しく変動した。収穫時の穀粒水分％は、後の開花系統（すなわちＡＴＲ ＷａｈｏｏとＭｏｎｏｌａ５１５ＴＴ）の種子が、全ての現場にわたって、収穫期において著しく高い穀粒水分％を有するように、開花期と相関した。研究室の種子水分は、全ての現場にわたって、系統間で著しく変動した。しかしながら、系統間および現場間の差異は非常に低く、平均して約７％であった。これは、種子貯蔵の交絡効果を示さない。トランスジェニック系統に関する研究室における種子水分は、非トランスジェニック系統により示された範囲内で著しく（Ｐ＜０．０５）変動した。

【0231】

種子含油量（％）を、６％の水分まで調節された種子上でスピンロック核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定を使用して分析した。簡潔に言えば、５グラム～１０グラムの種子のサンプルをＮＭＲ管へと量り取り、核磁気共鳴分光計により分析した。種子油の結果を、重量測定による油抽出により測定されるように、既知の割合の含油量の２０の標準サンプルを使用して最初に作られたソフトウェア較正によって測定した。種子含油量は、８つの現場全てにわたって系統間で著しく（Ｐ＜０．０５）変動した。現場平均の種子油％は、３７．０％から４１．５％まで変動したが、これは、概して植付位置の平均以下であった。これは恐らく、登熟期の間に雨量が平均以下であり、気温が平均より高かった結果である。相対的な系統差は、現場にわたって十分に一致していた。トランスジェニック系統に関する種子含油量の変動は、全ての現場にわたって、非トランスジェニック系統と比較して、わずかに小さく、平均の約２％上であったが、これによって、遺伝学的改良の目標を提供することもある。より低い含油量は、遺伝子導入イベントに遺伝学的に関係しないこともあるが、より低い含油量の栽培品種（すなわちＡＶ Ｊａｄｅ）を形質転換した結果である可能性もある。

【0232】

非遺伝子導入栽培品種のものと比較したイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の農業形質のキャラクタリゼーションの概要を、表４に示す（分析ＲＥＭＬ；全ての形質についてＦ ｐｒ＜０．００１Ｓｉｇ）。

【0233】

【表4】

【0234】

脂肪酸を、溶剤抽出を用いて測定し、その後に、同時に鹸化およびメチル化を実施し、ＧＣ－ＦＩＤにより分析した。簡潔に言えば、これは、種子サンプルを粉砕し、 粉砕された種子の副サンプルから溶媒へと油を抽出することを含んだ。その溶媒を窒素下で蒸発させ、油の副サンプルを新しい溶媒で希釈した。アリコートをＭｅｔｈ Ｐｒｅｐ ＩＩ（鹸化／メチル化剤）と反応させた。サンプルを、反応を促進させるために４０℃で加熱し、その後脂肪酸を測定するためのＢＰＸ－７０カラムを使用するＧＣ－ＦＩＤ上に注入した。脂肪酸を、各脂肪酸ピークの領域が、クロマトグラムにおける脂肪酸ピークの合計のパーセンテージとして測定された油の組成物％として算出した。これらの推定量を形質変量として個々に分析した。以下特定の脂肪酸の％を推定した：パルミチン酸；ステアリン酸；オレイン酸＆シス－バクセン酸；リノール酸；αリノレン酸（ＡＬＡ）；アラキジン酸（エイコサン酸としても知られる）およびステアリドン酸（ＳＤＡ）；パウリン酸、ゴンドイン酸、およびガドレイン酸；エルカ酸およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）イコサペンタエン酸（ＥＰＡ）；ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）；、ならびにドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）。表５は、種子脂肪酸含有量の現地缶分析を示す（全ての値はパーセントである；分析ＲＥＭＬ；全ての形質についてＦｐｒ＜０．００１Ｓｉｇ）。

【0235】

【表5】

【0236】

ステアリン酸として存在する、種子中の脂肪酸のパーセントは、ＧＣ－ＦＩＤにより分析されたように、８つの現場全てにわたって系統間で著しく変動した。現場平均の％のステアリン酸は、非常に小さな変動を示し、その範囲は１．６％から２．２％までであった。統計的には、トランスジェニック系統の％のステアリン酸は、現場全てにわたって、非トランスジェニック系統により示された範囲内で著しく変動した。

【0237】

オレイン酸およびシス－バクセン酸としての種子中の脂肪酸の％は、ＧＣ－ＦＩＤにより分析されたように、８つの現場全てにわたって、系統間で著しく変動した。現場平均の％のオレイン酸およびシス－バクセン酸は、５１％から５８％まで変動した。統計的には、トランスジェニック系統の％のオレイン酸およびシス－バクセン酸の変動は、現場全てにわたって、非トランスジェニック系統により示された範囲よりも著しく小さかった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、市販の農学的生産または穀物生産に影響を与えない。

【0238】

リノール酸として存在する、種子中の脂肪酸の％は、ＧＣ－ＦＩＤを使用して分析されるように、８つの現場全てにわたって系統間で著しく変動した。現場当たりの平均％リノール酸は、１３．４％から１４．７％まで変動した。１つのＴ２イベント（植物Ｂ００５０－０２７－１８）に由来する遺伝子導入同胞系統の％リノール酸に関する変動は、全ての現場にわたる栽培品種、および他のイベント同胞に由来する同胞により示された範囲よりも著しく（Ｐ＜０．０５）小さかった。％リノール酸が著しく異なるのは、恐らく導入遺伝子の発現に関連する。％リノール酸の減少は、恐らくトランスジェニックインサートに関連するが、工業規模の農学的生産または穀物生産には影響を与えない。

【0239】

ＡＬＡ、アラキジン酸、およびＳＤＡとして存在する脂肪酸の％は、８つの現場全ての系統間で著しく変動した。％のＡＬＡ、アラキジン酸、およびＳＤＡの現場平均は、５％～１１％の範囲であった。トランスジェニック系統に対する、％のＡＬＡ、アラキジン酸、およびＳＤＡの変動は、全ての実験にわたって、非遺伝子導入栽培品種により示された変動よりも著しく（Ｐ＜０．０５）大きかった。いくつかの現場でこの形質に関して見られた著しい差は、導入遺伝子の発現に関連した。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、市販の農学的生産または穀物生産に影響を与えない。高オレイン酸油特化栽培品種（Ｍｏｎｏｌａ５１５ ＴＴ）は、他の栽培品種と比較されて著しく（Ｐ＜０．０５）低い％のＡＬＡを生産したが、これはＦａｄ遺伝子内のＳＮＰが原因である。

【0240】

パウリン酸、ゴンドイン酸、およびガドレイン酸として存在する脂肪酸の％は、８つの現場全てにわたって系統間で著しく変動した。％のパウリン酸、ゴンドイン酸、およびガドレイン酸に関する現場平均は、２．０％から２．５％までの範囲であった。トランスジェニック系統に対する、％のパウリン酸、ゴンドイン酸、およびガドレイン酸の変動は、全ての実験にわたって、非遺伝子導入栽培品種により示された変動よりも著しく（Ｐ＜０．０５）大きかった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、市販の農学的生産または穀物生産に影響を与えない。

【0241】

エルカ酸とＥＴＡとして存在する脂肪酸存在の％を５つの現場で記録したが、変動は概して０％ほどであった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、農学的生産または穀物生産に商業的には影響を与えない。

【0242】

種子ＬＣ－ω３多不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）、具体的にはＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを、各区画サンプルに対するパーセントとして算出し、ＬＣ ＰＵＦＡ＝ＥＰＡ％＋ＤＰＡ％＋ＤＨＡ％である、形質変量として分析した。予測されたＤＨＡを、ｋｇ／ｈａの単位として、各区画に対して算出し、形質変量として分析した：ＤＨＡ ｋｇ／ｈａ＝（油％×０．０１）×（ＤＨＡ％×０．０１）×穀物収穫量（ｔ／ｈａ）×１０００。予測されたＬＣ－ＰＵＦＡを、ｋｇ／ｈａの単位として、各区画に対して算出し、形質変量として分析した：ＤＨＡ ｋｇ／ｈａ＝（油％×０．０１）×（ＬＣ－ＰＵＦＡ％×０．０１）×穀物収穫量（ｔ／ｈａ）×１０００。

【0243】

ＥＰＡとしての脂肪酸の％は、８つの現場全てにわたって系統の間で著しく（Ｐ＜０．０５）変動した。トランスジェニック系統に対するその％の変動は、非遺伝子導入栽培品種により示された変動よりも著しく（Ｐ＜０．０５）大きかった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、農学的生産または穀物生産に影響を与えず、実際のところ穀物の価値をさらに高くすることもある。

【0244】

ＤＰＡとしての脂肪酸の％は、全ての現場にわたって系統間で著しく（Ｐ＜０．０５）変動した。トランスジェニック系統に対する％の変動は、全ての現場にわたって、非遺伝子導入栽培品種により示された変動よりも著しく（Ｐ＜０．０５）大きかった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、農学的生産または穀物生産に商業的に影響を与えないだろう。

【0245】

ＤＨＡとしての脂肪酸の％は、８つの現場全てにわたって系統間で著しく変動した。トランスジェニック系統のその％の変動は、全ての位置における、非遺伝子導入栽培品種により示された変動よりも著しく（Ｐ＜０．０５）大きかった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、市販の農学的生産または穀物生産に影響を与えない。遺伝子導入同胞系統間の変動を、選択の基準として使用した。現場にわたる、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４と非遺伝子導入栽培品種とを比較したＤＨＡのパーセントを表６に示す（分析ＲＥＭＬ；全ての位置についてＦ ｐｒ＜０．００１Ｓｉｇ）。

【0246】

【表6】

【0247】

ｋｇ／ｈａとして表された予測されたＤＨＡは、脂肪酸プロファイル、種子油％、および穀物収穫量に基づいて算出され、全ての現場にわたって系統間で著しく（Ｐ＜０．０５）変動した。トランスジェニック系統のその％の変動は、全ての位置における、非トランスジェニック系統により示された変動よりも著しく（Ｐ＜０．０５）大きかった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、穀物の価値をさらに高くすること以外は、市販の農学的生産または穀物生産に影響を与えない。遺伝子導入同胞系統間の変動を、選択の基準として使用した。面積当たりの生産の単位（ｋｇ／ｈａ）の点で、ＤＨＡの安定性は高かったが、これは、種子中で生産された種子油および％のＤＨＡの現場間変動が小さかったためである。現場にわたる、エリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４と非遺伝子導入栽培品種とを比較する、ＤＨＡの予測された収穫量（ｋｇ／ｈａ）を表７に示す（分析ＲＥＭＬ、全ての位置についてＦ ｐｒ＜０．００１Ｓｉｇ）：

【0248】

【表7】

【0249】

種子ＬＣ－ＰＵＦＡオメガ３である、パーセントのＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡに関して、パーセントのＬＣ ＰＵＦＡは、８つの現場全てにわたって系統の間で著しく（Ｐ＜０．０５）変動した。トランスジェニック系統に対する％の変動は、全ての実験にわたって、栽培品種により示された変動よりも著しく（Ｐ＜０．０５）大きかった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、穀物の価値を増大させること以外は、農学的生産または商業的穀物生産に影響を与えない。遺伝子導入同胞系統間の変動を、選択の基準として使用した。非トランスジェニック系統において観察されるＬＣ－ＰＵＦＡのトレースレベルは、恐らく、花粉の流れ、種子の移動、またはＧＣ－ＦＩＤのエラーに関連する。

【0250】

表８は、ＧＣ－ＦＩＤにより測定されるようなパーセントの値を示す（分析ＲＥＭＬ；全ての位置についてＦ ｐｒ＜０．００１Ｓｉｇ）：

【0251】

【表8】

【0252】

ｋｇ／ｈａとして表された予測されたＬＣ－ＰＵＦＡは、脂肪酸プロファイル、種子油％、および穀物収穫量に基づいて算出され、全ての現場にわたって処理系統間で著しく変動した。統計的には、トランスジェニック系統のその％の変動は、全ての実験にわたって、栽培品種により示された変動よりも著しく高かった。この結果は、トランスジェニックインサートに関連し、農学的生産または穀物生産に商業的には影響を与えない。遺伝子導入同胞系統間の変動を、選択の基準として使用した。栽培品種の種子のトレースレベルは、恐らく、花粉の流れ、種子の移動、またはＧＣ－ＦＩＤのエラーに関連する。面積当たりの生産の単位（ｋｇ／ｈａ）の点で、ＬＣ－ＰＵＦＡの安定性は高いが、これは、種子中で生産された種子油および％のＤＨＡの現場間変動が小さいからである。表９は予測されたｋｇ／ｈａのＬＣ－ＰＵＦＵを示す（全ての現場についてＦ ｐｒ＜０．００１）。

【0253】

【表9】

【0254】

ＮＭＲを使用して測定された種子含油量はまた、栽培現場の各々に関して表にされ、表１０に示される。（単位はパーセント；分析ＲＥＭＬ；全ての現場に対して、Ｆ ｐｒ＜０．００１Ｓｉｇ）：

【0255】

【表10】

【0256】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４種子の脂肪酸含有量の更なる分析を表１１に示す：

【0257】

【表11-1】

【0258】

【表11-2】

【0259】

表１１のデータによって、ＬＣ－ω３脂肪酸に加えて、 ＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子は、従来のキャノーラ変種よりも実質的に多くのω３ ＡＬＡも含んでいることが確認される。表５を参照されたい。ＡＬＡはＬＣ－ＰＵＦＡではないが、ω３脂肪酸である。表１１におけるＮＳ－Ｂ５００２７－４の種子油中のω３：ω６脂肪酸の比率は、約３．５９～約６．１２であり；従来のキャノーラ油のω３：ω６脂肪酸の比率は約０．５である。Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｔｒ． Ｍｅｔａｂ． （２０１２）。

【0260】

表１２は、オーストラリアの実験的な栽培で成長させられたエリートイベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の１６世代からの種子の、パーセントのＤＨＡおよびＬＣ－ＰＵＦＡに関するデータを示す。オーストラリアの更なる圃場試験では、９．６％のＤＨＡおよび１０．１％のＬＣ ＰＵＦＡを有するバルク種子を生成した：

【0261】

【表12】

【0262】

さらに、カナダで成長させる予定のＮＳ－Ｂ５００２７－４の性能を、２０１６年に、２つの異なる現場において、制御された実験条件下で検定した。表１３は、ＮＳ－Ｂ５００２７－４といくつかの非遺伝子導入キャノーラ系統を比較する農学的データおよび収穫量データを示す：

【0263】

【表13】

【0264】

キャノーラ系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４は、実質的に均質であるので、そのような系統の種子を植え、 十分に単離された自家受粉条件または同胞受粉条件下で結果としてもたらされるキャノーラ植物を成長させ、そして 従来の農耕法を使用して、結果としてもたらされる種子を収穫することによって再生産できる。

【0265】

実施例２
Ｋｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ（ＫＡＳＰ）アッセイ
キャノーラの導入遺伝子の表現型発現を、導入遺伝子カセット自体の構造、および植物ゲノムのそのインサート位置の両方により測定する：植物ゲノムの特定の位置における導入遺伝子の存在は、導入遺伝子の発現および植物の全体の表現型に影響を及ぼすこともある。植物ゲノムの組換えＤＮＡ分子の取り込みは、一般的には、細胞もしくは組織の形質転換（または別の遺伝子操作）に起因する。取り込みの特定の現場は、（標的とされた組み込みのプロセスを使用する場合）運任せか、予め決められていてもよい。遺伝子操作による植物における商業上関心をそそる形質の農業経済学的にまたは産業上成功した導入は、様々な因子に依存する長い処理である可能性がある。遺伝学的に形質転換された植物の実際の形質転換および再分化は、単に一連の選択工程における第１の工程であり、これらの工程は、圃場試験における広範な遺伝学的なキャラクタリゼーション、育種、および評価を含み、最終的には、エリートイベントの選択につながる。

【0266】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４を、広範な選択育種および圃場試験の後に発育させ、少なくとも約７％－１５％のＤＨＡを生産するキャノーラ栽培品種をもたらす。遺伝子分析によって、ＮＳ－Ｂ５００２７－４がクロモソームＡ０２上にトランスジェニックインサートを、クロモソームＡ０５上に別のトランスジェニックインサートを有していたことが示された。Ａ０５上のインサートは、向かい合って整列された（ＲＢ－ＬＢ：ＬＢ－ＲＢ）、８つの遺伝子（Ｍｉｃｐｕ－Δ６Ｄ、Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅ、Ｐａｖｓａ－Δ５Ｄ、Ｐｉｃｐａ－ω３Ｄ、Ｐａｖｓａ－Δ４Ｄ、Ｌａｃｋｌ－Δ１２Ｄ、Ｐｙｒｃｏ－Δ６Ｅ、およびＰＡＴマーカー）の２つの完全なＴ－ＤＮＡボーダーカセットを含む。クロモソームＡ０２上のインサートは、４つの遺伝子であるＭｉｃｐｕ－Δ６Ｄ、Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅ、Ｐａｖｓａ－Δ５Ｄ、およびＰｉｃｐａ－ω３Ｄのセットから構成される。驚いたことに、分離交雑（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｃｒｏｓｓｉｎｇ）によって、約１１％のＤＨＡ生産を達成するために、クロモソームＡ０２およびクロモソームＡ０５の両方の上にインサートが必要であったことが示された。

【0267】

８つの様々なＢＣからの約１２００の後代、およびＤＨＡキャノーラ遺伝子移入育種のＦ_２集団を、ＷｏｏｄｌａｎｄのＮｕｓｅｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌａｂで開発されたＬＧＣ Ｏｃｔｏｐｕｒｅ ＳＯＰに基づいてＤＮＡを抽出するために使用した。簡潔に言えば、直径０．２５インチの２つの凍結乾燥された葉ディスクを、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒを用いて、８分間１４００ｒｐｍで、３００μＬのＤＮＡ抽出バッファ（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ８．０；２５ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＨ８．０；０．５％のＳＤＳ、１．５ＭのＮａＣｌ）中で細かく砕いた。５５℃の水槽での４５分間のインキュベーション、および４５００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離の後に、５０μＬの上澄みを、磁気ｓｂｅａｄｅｘビーズを用いて、１００μＬのＬＧＣ結合バッファに移動させた。結合と洗浄の後に、ＤＮＡを、ＬＧＣ ８０μＬのＤＮＡ溶出バッファに溶出させた。

【0268】

ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＤＮＡ濃度を測定すると、５．０－２０．０ｎｇ／μＬの範囲であり、平均は１０．０ｎｇ／μＬであった。ＤＮＡサンプルを１×に希釈した。各反応のために、２．０μＬ（～５．０ｎｇ／μＬ）のゲノムＤＮＡサンプル、およびプライマーを有する２μＬのマスターミックスを、ＫＡＳＰ遺伝子型判定のための３８４ウェルプレートに分配した。

【0269】

ＤＨＡキャノーラ遺伝子移入の集団からの後代に加えて、８つの対照を遺伝子型判定に含ませた。これらは、２つの非ＧＭＯ対照（ＤｗａｒｆおよびＡＶ Ｊａｄｅ）、２つのヘミ接合性の対照（２．５ｎｇのＡｖ Ｊａｄｅまたは２．５ｎｇのＤｗａｒｆ ＋ ２．５ｎｇのＢ００５０－０２７－１８－２０－１２－１９）；２つのイベント陽性対照（Ｂ００５０－０２７－１８－２０－１２－１９）、ならびに４つの非鋳型対照（ＮＴＣ）、を含んだ。陽性対照（Ｔ５植物Ｂ００５０－０２７－１８－２０－１２－１９）を、配列決定によるＤＨＡキャノーライベントのキャラクタリゼーションのために、前もって使用した。

【0270】

ＫＡＳＰアッセイを、単純で、費用対効果の高く、ハイスループットで、柔軟な方法を提供し、８つの導入遺伝子および４つのＮＳ Ｂ５００２７ ４―特異的な接合を検出しモニタリングし、そして育種プログラムにおけるＮＳ－Ｂ５００２７－４遺伝子移入をさらに容易とするために、開発した。ＫＡＳＰ（商標）の遺伝子型判定化学、アッセイデザイン、遺伝子型判定、およびスコア化を、製造業者（ＬＧＣ Ｌｔｄ．，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）の変更した標準プロトコルに従って実施した。

【0271】

ＬＧＣ Ｋｒａｋｅｎ Ｗｏｒｋｆｌｏｗ Ｍａｎａｇｅｒへと配列情報をアップロードし、そのアッセイデザインプログラムであるＰｒｉｍｅｒ Ｐｉｃｋｅｒを使用して、ＫＡＳＰアッセイを設計した。典型的なＫＡＳＰアッセイは、２つの対立遺伝子特異的プライマー（遺伝子導入アレルのためのＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｘ、および非遺伝子導入野生型アレルのためのＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｙ）と、１つの一般的な遺伝子座特異的プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ＿Ｃｏｍｍｏｎ）とを含む。Ｐｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｘは、蛍光性のＦＡＭに関連し、Ｐｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｙは、蛍光性のＨＥＸに関連する。

【0272】

接合を標的とするほとんどのアッセイは、このタイプの３つのプライマーアッセイ（表１４）だった。ＤＨＡキャノーラを検出するために、上記された従来の３つのプライマーのアッセイに加えて、４つのプライマーのアッセイも開発した。４つのプライマーのアッセイは、反応において、遺伝子導入アレルに特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｘ、野生型アレルに特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｙ、オメガ３遺伝子に特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ｃｏｍｍｏｎ、および野生型に特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ｃｏｍｍｏｎ ２を有する。オメガ３カセット中の８つの遺伝子を検出するために、２つのプライマーである、Ｐｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ ＸおよびＰｒｉｍｅｒ＿Ｃｏｍｍｏｎだけを、各アッセイ（２つのプライマーのアッセイ）に使用し；両方のプライマーはオメガ３遺伝子に特異的であった（表１４）：

【0273】

【表14-1】

【0274】

【表14-2】

【0275】

ＫＡＳＰ遺伝子型判定システムは、以下の２つの成分を必要とする：アッセイミックスおよびマスターミックス。アッセイミックスは必要とされたプライマーの混合物であり、マスターミックスは、ＰＣＲバッファと、ユニバーサル蛍光性レポーティングシステムと、Ｔａｑポリメラーゼとを含む、他の必要とされた構成要素の全てを含む。

【0276】

２．０μＬ（１０．０ｎｇ）のゲノムＤＮＡ、 ２．０μＬの２×ＫＡＳＰマスターミックス、および ０．０６μＬのアッセイ（プライマー）ミックスから成る、４．０μＬの体積中でＫＡＳＰ反応を実行した。アッセイ（プライマー）ミックスは、２つのプライマーのアッセイのためには、１２μＭのアレルに特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｘ、および１２μＭのＰｒｉｍｅｒ＿Ｃｏｍｍｏｎの組み合わせ、３つのプライマーのアッセイのためには、１２μＭのアレルに特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｘ、１２μＭのアレルに特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｙ、および３０μＭのＰｒｉｍｅｒ＿Ｃｏｍｍｏｎの組み合わせ、ならびに４つのプライマーのアッセイのためには、１２μＭのアレルに特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｘ、１２μＭのアレルに特異的なＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ Ｙ、１２μＭのＰｒｉｍｅｒ＿Ｃｏｍｍｏｎ、および１２μＭのＰｒｉｍｅｒ＿Ｃｏｍｍｏｎ２の組み合わせである。

【0277】

それらの反応を、以下のサイクリングパラメーターを用いて、ＬＧＣ Ｈｙｄｒｏｃｙｃｌｅｒ１６中３８４ウェルプレートにおいて実行した：１５分間９４℃で１サイクル、その後、３０秒間９４℃と、６０秒間６４℃－５７℃（１サイクル当たり１．０℃低下）との８サイクル、そしてその後、３０秒間９４℃と、６０秒間５７℃との３０サイクル。透明な遺伝子型判定クラスタが得られていない場合、そのプレートをさらに、３０秒間９４℃と６０秒間５７℃との追加の３サイクルで熱的サイクリングに晒した。

【0278】

ＫＡＳＰ反応が完了した後に、遺伝子導入アレルをＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ ＸによってＦＡＭで標識し、非遺伝子導入野生型アレルをＰｒｉｍｅｒ＿Ａｌｌｅｌｅ ＹによってＨＥＸで標識した。蛍光シグナルを、ＰｈｅｒａＳｔａｒ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ中で、ＦＡＭのためには４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を、 ＨＥＸのためには５３５ｎｍ／５５６ｎｍを読み取った。ＬＧＣ Ｋｒａｋｅｎ ｄａｔａｂａｓｅを使用して、データを分析した。

【0279】

遺伝子特異的優性（Ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｄｏｍｉｎａｎｔ）（ＮＢＮ０１－ＮＢＮ０８；１アッセイ／遺伝子）を、構成物カセット中の８つの遺伝子を検出するために開発した。Ａ０２上のインサートの上流（ＮＢＮ５７、ＮＢＮ６８、ＮＢＮ５８、ＮＢＮ８５およびＮＢＮ１４）ならびに下流（ＮＢＮ１６、ＮＢＮ６２およびＮＢＮ６４）の接合部、および、Ａ０５上のインサートの上流（ＮＢＮ５２、ＮＢＮ５１、ＮＢＮ０９、ＮＢＮ５０、ＮＢＮ４８およびＮＢＮ１０）ならびに下流（ＮＢＮ８３、ＮＢＮ８２、ＮＢＮ８４、ＮＢＮ６６、ＮＢＮ４１およびＮＢＮ４３）の接合部を標的とした、インサート特異的共優性ＫＡＳＰアッセイを、ＮＳ－Ｂ５００２７－４遺伝子移入集団からの１２００の後代を用いて開発し、実証した（表１４）。１０，０００を超えるサンプルの遺伝子型をこれらのマーカーを用いて同定した。

【0280】

ＤＨＡキャノーライベントＮＳ－Ｂ５００２７－４の２つのインサートの、８つの遺伝子および４つの接合部を標的とする、Ｔｈｉｒｔｙ Ｋｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ（ＫＡＳＰ）アッセイを開発および実証した。これらのアッセイは、検出し、かつ育種プログラム中のＮＳ－Ｂ５００２７－４をモニタリングするために単純で、費用対効果の高く、ハイスループットで、柔軟なアプローチを提示した。

【0281】

実施例３
ＮＳ－Ｂ５００２７－４と非遺伝子導入キャノーラとの詳細な比較
２０１４－２０１６年の実験用畑区画におけるキャノーラ種子生産からのデータを表した。ＤＨＡの範囲、およびＥＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡの合計は、いくつかの検定圃の観察に基づいた。ＮＳ－Ｂ５００２７－４および非遺伝子導入「対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）」キャノーラの両方の主要な脂肪酸の含有量は、成長条件に応じていくつかのパーセントポイントにより変動することもある。以下の表１５では、「０．０」は、成分の量を正確に測定するのに必要な量未満として識別される微量を指すこともある：

【0282】

【表15】

【0283】

ＮＳ－Ｂ５００２７－４の実験的な栽培から収穫された種子を粉砕し、冷搾によって油を得た。親の同質遺伝子系統から収穫された種子であるＡＶ Ｊａｄｅを同様に処理し、各油の含有量を表１６で示されるように比較した：

【0284】

【表16-1】

【0285】

【表16-2】

【0286】

ブダペスト条約に従って、出願人は、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖａ．， ２０１１０－２２０９ Ｕ．Ｓ．Ａ．にあるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ登録商標）に、キャノーラＮＳ－Ｂ５００２７－４の少なくとも２５００粒の種子を、受託番号ＰＴＡ１２３１８６で寄託し、ＡＴＣＣ（登録商標）が種子の生存を確認した。本出願の係属中に、本発明へのアクセスが、求めに応じて長官に付与される可能性があり；公衆に対する利用可能性に際する全ての制限は、特許付与時に取り消しできないように取り消され；系統ＮＳ－Ｂ５００２７－４の寄託は、公共の貯蔵場であるＡＴＣＣ貯蔵場において、３０年の期間、最近の依頼の５年の期間、または本特許の有効期間のうちのいずれか長い期間維持され；その期間に育成不可能になれば交換される。寄託の時点で種子の生産能力を検定した。出願人は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §§ １．８０１－１．８０９の要件を全て満たした。出願人は、ＡＴＣＣからの寄託資料の利用可能性に対する制約を加えないが；しかしながら、出願人は、生体物質の運搬または商業目的のその輸送に対する法律により課されたいかなる制限も放棄する権限がない。出願人は、本特許の下、または植物新種保護法（７ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § ２３２１ ｅｔ ｓｅｑ．）の下で許可されたその権利の侵害を放棄しない。

【0287】

明確性と理解の目的のために、例示および例として前述の実施形態をある程度詳細に記載したが、単一遺伝子の改変および突然変異、ソマクローン変異体、本近交系の植物の大規模な集団からの選択された変異個体、ならびに同種のものなどの特定の変更および修正が、もっぱら添付の請求項により限定された本発明の範囲内で実施されることもあることは、当業者に明白である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【図6-8】

【図6-9】

【図6-10】

【図6-11】

【図6-12】

【配列表】

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