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特許7168160米の収量を増加させる方法、米の栽培用植物体を栽培する方法、米の収量増加用組成物及び菌体細胞壁を含む組成物又は死菌体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-31
(45)【発行日】2022-11-09
(54)【発明の名称】米の収量を増加させる方法、米の栽培用植物体を栽培する方法、米の収量増加用組成物及び菌体細胞壁を含む組成物又は死菌体
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20221101BHJP
A01G 7/00 20060101ALI20221101BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 E
C12N1/20 C
C12N1/20 A
A01G7/00 605Z
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2018078786
(22)【出願日】2018-04-17
(65)【公開番号】P2019180361
(43)【公開日】2019-10-24
【審査請求日】2021-02-22
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-02628
(73)【特許権者】
【識別番号】591118775
【氏名又は名称】白鶴酒造株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】太田 淳
(72)【発明者】
【氏名】山内 隆寛
(72)【発明者】
【氏名】明石 貴裕
(72)【発明者】
【氏名】阪井 康能
(72)【発明者】
【氏名】由里本 博也
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１０１３７３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】韓国公開特許第１０－２００７－０１０６８６７（ＫＲ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２００７－０１０６８６８（ＫＲ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５１９９０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７８４１４７９（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／０９３６７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００９－０６７７１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０００－０５０７３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－２０３１６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０４－１２１１２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, Vol.32, No.120, pp.1-9
【文献】Biology and Fertility of Soils, 2005, Vol.41, pp.350-358
【文献】APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2005, Vol. 71, No. 11, pp. 7245-7252
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を米の栽培用植物体に接種することを含み、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物が、死菌体及び前記メタノール資化性細菌から調製した菌体細胞壁の少なくともいずれかを含むことを特徴とする米の収量を増加させる方法。
【請求項2】
メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を米の栽培用植物体に接種することを含み、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物が、死菌体及び前記メタノール資化性細菌から調製した菌体細胞壁の少なくともいずれかを含むことを特徴とする米の栽培用植物体を栽培する方法。
【請求項3】
前記接種が、出穂前３０日から出穂後３０日の間に行われる請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項4】
前記メタノール資化性細菌が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を米の栽培用植物体の地上部に接種する請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記米が酒米である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を含み、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物が、死菌体及び前記メタノール資化性細菌から調製した菌体細胞壁の少なくともいずれかを含むことを特徴とする米の収量増加用組成物。
【請求項8】
前記メタノール資化性細菌が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株である請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
米の栽培用植物体の地上部に接種するためのものである請求項７から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
出穂前３０日から出穂後３０日の間に接種するためのものである請求項７から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項11】
メタノール資化性細菌から調製した菌体細胞壁を含む組成物又はメタノール資化性細菌の死菌体であって、
前記メタノール資化性細菌が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株であることを特徴とする菌体細胞壁を含む組成物又は死菌体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、穀物類の収量を増加させる方法、穀物類の栽培用植物体を栽培する方法、穀物類の収量増加用組成物及び微生物に関する。
【背景技術】
【0002】
イネ科植物等の穀物類の収量を増加させることは、非常に重要であり、従来、多量の肥料を使用したり、肥料を栄養価の高いものにしたり、植物成長調節剤が使われたり、遺伝子導入などによる品種改良が行われたりしてきた。
しかしながら、これらの技術では、合成品を用いることによる土壌に対する影響の問題や、組換え植物は一般に受け入れ難いという問題などがあり、新たな技術が求められている。
しかしながら、これらの技術では、合成品を用いることによる土壌に対する影響の問題や、組換え植物は一般に受け入れ難いという問題などがあり、新たな技術が求められている。
【0003】
これまでに、イネの生育促進と種子増量効果を得るために、窒素固定細菌をイネに感染させる技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、前記提案では、生きた菌を使用しなければならないため、製剤化や品質管理が難しく、また、使用した際の環境安全面でのリスクもあるという問題がある。
【0004】
したがって、簡易、かつ安全に穀物類の収量を増加させることができる新たな技術の速やかな提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２００３－２７４７７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、簡易、かつ安全に穀物類の収量を増加させることができる穀物類の収量を増加させる方法及び穀物類の栽培用植物体を栽培する方法、並びに穀物類の収量増加用組成物及び新規微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、メタノール資化性細菌の細胞壁を含有する組成物を穀物類の栽培用植物体に接種することにより、不稔籾を減少させ、穀物類の収量を増加させることができることを知見した。
【0008】
本発明は、本発明者らの前記知見等に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を穀物類の栽培用植物体に接種することを含むことを特徴とする穀物類の収量を増加させる方法である。
＜２＞ メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を穀物類の栽培用植物体に接種することを含むことを特徴とする穀物類の栽培用植物体を栽培する方法である。
＜３＞ 前記接種が、出穂前３０日から出穂後３０日の間に行われる前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞ 前記接種が出穂の前と後に行われる前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜５＞ 前記メタノール資化性細菌が植物体の表面から単離された前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞ 前記メタノール資化性細菌の単離が、前記メタノール資化性細菌を前記植物体の表面から洗い流して得た洗浄液又は前記植物体を液体培地に入れて培養して得られた液を、培地に接種し、増殖してきたコロニーを同定し、前記メタノール資化性細菌のコロニーを単離することにより行われる前記＜５＞に記載の方法である。
＜７＞ 前記メタノール資化性細菌の単離に用いる植物体が、茎及び籾の少なくともいずれかである前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞ 前記接種が、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を含む液を前記栽培用植物体に噴霧することにより行われる前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞ 前記メタノール資化性細菌が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株である前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の方法である。
＜１０＞ 前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物が、死菌体及び菌体細胞壁の少なくともいずれかを含む前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の方法である。
＜１１＞ 前記死菌体が破砕菌体を含む前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１２＞ 前記穀物類が米である前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の方法である。
＜１３＞ 前記米が酒米である前記＜１２＞に記載の方法である。
＜１４＞ 前記酒米が白鶴錦である前記＜１３＞に記載の方法である。
＜１５＞ メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を含むことを特徴とする穀物類の収量増加用組成物である。
＜１６＞ 前記メタノール資化性細菌が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株である前記＜１５＞に記載の組成物である。
＜１７＞ 前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物が、死菌体及び菌体細胞壁の少なくともいずれかを含む前記＜１５＞から＜１６＞のいずれかに記載の組成物である。
＜１８＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株であることを特徴とする微生物である。
＜１＞ メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を穀物類の栽培用植物体に接種することを含むことを特徴とする穀物類の収量を増加させる方法である。
＜２＞ メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を穀物類の栽培用植物体に接種することを含むことを特徴とする穀物類の栽培用植物体を栽培する方法である。
＜３＞ 前記接種が、出穂前３０日から出穂後３０日の間に行われる前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞ 前記接種が出穂の前と後に行われる前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜５＞ 前記メタノール資化性細菌が植物体の表面から単離された前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞ 前記メタノール資化性細菌の単離が、前記メタノール資化性細菌を前記植物体の表面から洗い流して得た洗浄液又は前記植物体を液体培地に入れて培養して得られた液を、培地に接種し、増殖してきたコロニーを同定し、前記メタノール資化性細菌のコロニーを単離することにより行われる前記＜５＞に記載の方法である。
＜７＞ 前記メタノール資化性細菌の単離に用いる植物体が、茎及び籾の少なくともいずれかである前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞ 前記接種が、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を含む液を前記栽培用植物体に噴霧することにより行われる前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞ 前記メタノール資化性細菌が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株である前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の方法である。
＜１０＞ 前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物が、死菌体及び菌体細胞壁の少なくともいずれかを含む前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の方法である。
＜１１＞ 前記死菌体が破砕菌体を含む前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１２＞ 前記穀物類が米である前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の方法である。
＜１３＞ 前記米が酒米である前記＜１２＞に記載の方法である。
＜１４＞ 前記酒米が白鶴錦である前記＜１３＞に記載の方法である。
＜１５＞ メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を含むことを特徴とする穀物類の収量増加用組成物である。
＜１６＞ 前記メタノール資化性細菌が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株である前記＜１５＞に記載の組成物である。
＜１７＞ 前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物が、死菌体及び菌体細胞壁の少なくともいずれかを含む前記＜１５＞から＜１６＞のいずれかに記載の組成物である。
＜１８＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８のメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株であることを特徴とする微生物である。
【発明の効果】
【0009】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、簡易、かつ安全に穀物類の収量を増加させることができる穀物類の収量を増加させる方法及び穀物類の栽培用植物体を栽培する方法、並びに穀物類の収量増加用組成物及び新規微生物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の穀物類の収量を増加させる方法（以下、「穀物類の増収方法」と称することがある。）及び本発明の穀物類の栽培用植物体を栽培する方法（以下、「穀物類の栽培方法」と称することがある。）は、いずれもメタノール資化性細菌の細胞壁含有物を穀物類の栽培用植物体に接種する工程（以下、「接種工程」と称することがある。）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。そのため、以下では、穀物類の増収方法及び穀物類の栽培方法について、まとめて説明する。
また、本発明の微生物は本発明の穀物類の収量増加用組成物に好適に用いることができ、本発明の穀物類の収量増加用組成物は本発明の穀物類の増収方法及び穀物類の栽培方法に好適に用いることができる。そのため、本発明の微生物及び本発明の穀物類の収量増加用組成物についても、本発明の穀物類の増収方法及び穀物類の栽培方法の説明と併せて説明する。
また、本発明の微生物は本発明の穀物類の収量増加用組成物に好適に用いることができ、本発明の穀物類の収量増加用組成物は本発明の穀物類の増収方法及び穀物類の栽培方法に好適に用いることができる。そのため、本発明の微生物及び本発明の穀物類の収量増加用組成物についても、本発明の穀物類の増収方法及び穀物類の栽培方法の説明と併せて説明する。
【0011】
（穀物類の増収方法及び穀物類の栽培方法）
前記穀物類の増収方法及び穀物類の栽培方法は、接種工程を含む限り、特に制限はなく、通常の穀物類の栽培方法を目的に応じて適宜選択することができる。
前記穀物類の増収方法及び穀物類の栽培方法は、接種工程を含む限り、特に制限はなく、通常の穀物類の栽培方法を目的に応じて適宜選択することができる。
【0012】
＜接種工程＞
前記接種工程は、メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を穀物類の栽培用植物体に接種する工程である。
前記接種工程は、メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を穀物類の栽培用植物体に接種する工程である。
【0013】
＜＜メタノール資化性細菌の細胞壁含有物＞＞
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物は、メタノール資化性細菌の細胞壁を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物は、メタノール資化性細菌の細胞壁を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【0014】
－メタノール資化性細菌－
前記メタノール資化性細菌は、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌であり、シソやイネ等の植物表面上に生育し、植物由来のメタノールを利用するとともに、植物へはビタミンや植物ホルモンなどを供給し、共生関係にあることが知られている。
前記メタノール資化性細菌は、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌であり、シソやイネ等の植物表面上に生育し、植物由来のメタノールを利用するとともに、植物へはビタミンや植物ホルモンなどを供給し、共生関係にあることが知られている。
【0015】
前記メタノール資化性細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物体の表面から単離されたものを用いることができる。
【0016】
前記メタノール資化性細菌の単離の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地の炭素源としてメタノールのみを使用する集積培養などが挙げられる。
前記単離の方法の具体例としては、例えば、前記メタノール資化性細菌を前記植物体の表面から洗い流して得た洗浄液を、培地に接種し、増殖してきたコロニーを同定し、前記メタノール資化性細菌のコロニーを単離することにより行う方法、前記植物体を液体培地に入れて培養して得られた液を、培地に接種し、増殖してきたコロニーを同定し、前記メタノール資化性細菌のコロニーを単離することにより行う方法などが挙げられる。
前記単離の方法の具体例としては、例えば、前記メタノール資化性細菌を前記植物体の表面から洗い流して得た洗浄液を、培地に接種し、増殖してきたコロニーを同定し、前記メタノール資化性細菌のコロニーを単離することにより行う方法、前記植物体を液体培地に入れて培養して得られた液を、培地に接種し、増殖してきたコロニーを同定し、前記メタノール資化性細菌のコロニーを単離することにより行う方法などが挙げられる。
【0017】
前記メタノール資化性細菌の単離に用いる植物体の部位としては、メタノール資化性細菌が生育している部位であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、穀物類の茎、籾などが挙げられる。前記部位は、１箇所を用いてもよいし、２箇所以上を用いてもよい。
【0018】
前記培地の組成、培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0019】
前記メタノール資化性細菌の中でも、本発明の新規微生物であるメチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株が好適に挙げられる。前記Ｒｓｔ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託申請し、ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８として、２０１８年２月７日に受託されている。
【0020】
－菌体細胞壁－
前記メタノール資化性細菌の細胞壁を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、培養し、回収した培養菌体を５０ｍＭ ＥＤＴＡと２％ ＳＤＳを含有する水溶液に懸濁し、３７℃程度で６０分間程度インキュベートした後遠心分離し、その上清に３Ｍ酢酸ナトリウムとエタノールを加え混和し、遠心分離を行い、ペレット状の菌体細胞壁を調製する方法などが挙げられる。
前記菌体細胞壁成分の有無を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フェノール－硫酸法を用い、多糖を指標として確認する方法などが挙げられる。
前記メタノール資化性細菌の細胞壁を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、培養し、回収した培養菌体を５０ｍＭ ＥＤＴＡと２％ ＳＤＳを含有する水溶液に懸濁し、３７℃程度で６０分間程度インキュベートした後遠心分離し、その上清に３Ｍ酢酸ナトリウムとエタノールを加え混和し、遠心分離を行い、ペレット状の菌体細胞壁を調製する方法などが挙げられる。
前記菌体細胞壁成分の有無を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フェノール－硫酸法を用い、多糖を指標として確認する方法などが挙げられる。
【0021】
前記菌体細胞壁のメタノール資化性細菌の細胞壁含有物における含有量としては、特に制限はなく、植物体への接種量などに応じて適宜選択することができる。
【0022】
－その他の成分－
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、乳化剤、湿潤剤、分散剤、可溶化剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、安定剤等の公知の製剤用添加剤などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、殺菌剤、殺虫剤、植物生長調節剤などを配合してもよい。
前記その他の成分のメタノール資化性細菌の細胞壁含有物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、乳化剤、湿潤剤、分散剤、可溶化剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、安定剤等の公知の製剤用添加剤などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、殺菌剤、殺虫剤、植物生長調節剤などを配合してもよい。
前記その他の成分のメタノール資化性細菌の細胞壁含有物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0023】
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記メタノール資化性細菌の生菌体を含む態様、前記メタノール資化性細菌の死菌体を含む態様、前記メタノール資化性細菌の菌体細胞壁を含む態様などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記メタノール資化性細菌の死菌体及び菌体細胞壁の少なくともいずれかを含む態様が、製剤化や品質管理が容易であり、使用した際の環境安全面でのリスクも少ない点で、好ましい。
【0024】
前記メタノール資化性細菌の生菌体の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養した菌体を回収する方法などが挙げられる。
【0025】
前記メタノール資化性細菌の死菌体の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養し、回収した培養菌体をオートクレーブで滅菌する方法などが挙げられる。前記死菌体は、破砕処理された破砕菌体であってもよい。
前記破砕処理の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができる。前記破砕の程度としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記破砕処理の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができる。前記破砕の程度としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0026】
前記メタノール資化性細菌の菌体細胞壁の調製方法の例は、上述したとおりである。
【0027】
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉状、液体状などが挙げられる。
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物の剤型としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液剤、乳剤、油剤、水溶液、懸濁液、水和剤、フロアブル、粉剤、微粒剤、粒剤、エアゾール、ペースト剤などが挙げられる。
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物の剤型としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液剤、乳剤、油剤、水溶液、懸濁液、水和剤、フロアブル、粉剤、微粒剤、粒剤、エアゾール、ペースト剤などが挙げられる。
【0028】
＜＜穀物類の栽培用植物体＞＞
前記穀物類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イネ科植物、マメ科植物などが挙げられる。
前記イネ科植物の具体例としては、例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハダカムギ等のムギ類、イネ、モロコシ、トウモロコシ、アワ、キビ、ヒエ、シコクビエ、トウジンビエなどが挙げられる。
前記マメ科植物の具体例としては、例えば、ダイズ、アズキ、リョクトウ、ササゲ、インゲンマメ、ライマメ、ラッカセイ、エンドウ、ソラマメなどが挙げられる。
前記穀物類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イネ科植物、マメ科植物などが挙げられる。
前記イネ科植物の具体例としては、例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハダカムギ等のムギ類、イネ、モロコシ、トウモロコシ、アワ、キビ、ヒエ、シコクビエ、トウジンビエなどが挙げられる。
前記マメ科植物の具体例としては、例えば、ダイズ、アズキ、リョクトウ、ササゲ、インゲンマメ、ライマメ、ラッカセイ、エンドウ、ソラマメなどが挙げられる。
【0029】
前記穀物類の中でも、本発明の方法は、イネ（米）に好適に用いることができる。
【0030】
前記米の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白鶴錦、山田錦、五百万石、美山錦、雄町、八反、八反錦、吟風、ゆめさんさ、若水、夢の香等の酒米、日本晴、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、キヌヒカリ、ななつぼし、はえぬき等の食用米などが挙げられる。これらの中でも、本発明の方法は、酒米に好適に用いることができる。
【0031】
前記穀物類の栽培用植物体の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、播種前の種子、発芽又は定植などにより栽培場所で生育するときの通常の態様などが挙げられる。
【0032】
＜＜接種＞＞
前記接種の時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、播種前の種子の段階、出穂前の段階、出穂後の段階などが挙げられる。前記接種の時期は、１つの時期であってもよいし、２つ以上の時期であってもよい。これらの中でも、出穂前３０日から出穂後３０日の間が好ましく、出穂の前と後の両方で行われることがより好ましく、出穂前１日～３０日の間と、出穂後１日～３０日の間とに行われることが更に好ましく、出穂前１５日～３０日の間と、出穂後５日～２５日の間とに行われることが特に好ましい。前記好ましい時期に接種を行うと、穀物類の収量をより増加させることができる点で、有利である。
前記接種の時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、播種前の種子の段階、出穂前の段階、出穂後の段階などが挙げられる。前記接種の時期は、１つの時期であってもよいし、２つ以上の時期であってもよい。これらの中でも、出穂前３０日から出穂後３０日の間が好ましく、出穂の前と後の両方で行われることがより好ましく、出穂前１日～３０日の間と、出穂後１日～３０日の間とに行われることが更に好ましく、出穂前１５日～３０日の間と、出穂後５日～２５日の間とに行われることが特に好ましい。前記好ましい時期に接種を行うと、穀物類の収量をより増加させることができる点で、有利である。
【0033】
前記接種の回数としては、１回であってもよいし、複数回であってもよい。また、接種時期が複数の場合における、各接種時期における接種の回数としても、１回であってもよいし、複数回であってもよい。
【0034】
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物の前記穀物類の栽培用植物体への接種量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＯＤ６００換算でＯＤが０．５相当になるように調製したメタノール資化性細菌の細胞壁含有物の栽培用植物体１株あたりの接種量として、１ｍＬ以上が好ましく、２ｍＬ以上がより好ましく、３ｍＬ以上が特に好ましい。前記好ましい接種量であると、穀物類の収量をより増加させることができる点で、有利である。なお、前記接種量は、各接種時において、等量を接種してもよいし、異なる量を接種してもよい。
【0035】
前記接種の方法としては、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を前記穀物類の栽培用植物体の少なくとも一部分に接触させ得る限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、噴霧、塗布、浸漬などが挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を組み合わせて行ってもよい。これらの中でも、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を含む液を前記栽培用植物体に噴霧することにより行われることが好ましい。
【0036】
前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を接種する前記穀物類の栽培用植物体の部位としては、特に制限はなく、接種する時期に応じて適宜選択することができ、例えば、種子に接種したり、出穂の前に接種する場合は栽培用植物体の地上部に接種したり、出穂の後に接種する場合は栽培用植物体の地上部に接種したりするなどが挙げられる。本発明によれば、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物の接種が、根圏まで行き渡らなくても、栽培用植物体の地上部に接種することで、穀物類の増収効果を得ることもできる。そのため、肥料として加えるよりも簡便で、農薬との併用も可能な点で、有利である。
【0037】
前記接種では、殺菌剤、殺虫剤、植物生長調節剤などを併用してもよい。
【0038】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、通常の穀物類の栽培における工程を目的に応じて適宜選択することができる。
前記栽培は、水耕であってもよいし、土耕であってもよい。
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、通常の穀物類の栽培における工程を目的に応じて適宜選択することができる。
前記栽培は、水耕であってもよいし、土耕であってもよい。
【0039】
＜穀物類の収量増加用組成物＞
本発明の穀物類の収量増加用組成物は、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の穀物類の収量増加用組成物は、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【0040】
前記穀物類の収量増加用組成物における前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記穀物類の収量増加用組成物は、前記メタノール資化性細菌の細胞壁含有物のみからなるものであってもよい。
【0041】
前記穀物類の収量増加用組成物におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、上記したメタノール資化性細菌の細胞壁含有物におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。前記穀物類の収量増加用組成物におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【0042】
以下、製造例及び試験例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの製造例及び試験例に何ら限定されるものではない。
【0043】
（製造例１：メタノール資化性細菌の単離）
イネの茎を試料とし、ＮＭＳ培地（Ｗｈｉｔｔｅｎｂｕｒｙ， Ｒ．， Ｋ． Ｃ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｆ． Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ． １９７０． Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｅ－ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６１：２０５－２１８．）に０．０１％イーストエクストラクトと０．５％メタノールを添加した培地で集積培養を行った。集積培養後の培養液を同組成の平板培地に画線し、生じたコロニーを単離し、メチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株を得た。
イネの茎を試料とし、ＮＭＳ培地（Ｗｈｉｔｔｅｎｂｕｒｙ， Ｒ．， Ｋ． Ｃ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｆ． Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ． １９７０． Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｅ－ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６１：２０５－２１８．）に０．０１％イーストエクストラクトと０．５％メタノールを添加した培地で集積培養を行った。集積培養後の培養液を同組成の平板培地に画線し、生じたコロニーを単離し、メチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株を得た。
【0044】
前記メチロバクテリウム エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｒｓｔ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託申請し、ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８として、２０１８年２月７日に受託された。
【0045】
（製造例２：メタノール資化性細菌の細胞壁含有物の調製）
＜前培養＞
前記製造例１で得られたメチロバクテリウム エスピーＲｓｔ株を、Ｈｙｐｈｏ最少培地（Ｄｅｌａｎｅｙ Ｎ．Ｆ．， Ｋａｃｚｍａｒｅｋ Ｍ．Ｅ．， Ｗａｒｄ Ｌ．Ｍ．， Ｓｗａｎｓｏｎ Ｐ．Ｋ．， Ｌｅｅ Ｍ．Ｃ． ＆ Ｍａｒｘ Ｃ．Ｊ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ， ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６２９５７ （２０１３））に０．２％コハク酸ナトリウムを添加した培地５ｍＬを用い、試験管にて、２８℃で４８時間培養した。
＜前培養＞
前記製造例１で得られたメチロバクテリウム エスピーＲｓｔ株を、Ｈｙｐｈｏ最少培地（Ｄｅｌａｎｅｙ Ｎ．Ｆ．， Ｋａｃｚｍａｒｅｋ Ｍ．Ｅ．， Ｗａｒｄ Ｌ．Ｍ．， Ｓｗａｎｓｏｎ Ｐ．Ｋ．， Ｌｅｅ Ｍ．Ｃ． ＆ Ｍａｒｘ Ｃ．Ｊ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ， ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６２９５７ （２０１３））に０．２％コハク酸ナトリウムを添加した培地５ｍＬを用い、試験管にて、２８℃で４８時間培養した。
【0046】
＜本培養＞
Ｈｙｐｈｏ最少培地に０．５％メタノールを添加した培地１００ｍＬに、前記前培養した培養液をＯＤ６００が０．００２となるように加え、５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコ（２個）にて、２８℃、１８０ｒｐｍで７２時間培養した。なお、集菌時のＯＤ６００は２．９～３．３であった。
Ｈｙｐｈｏ最少培地に０．５％メタノールを添加した培地１００ｍＬに、前記前培養した培養液をＯＤ６００が０．００２となるように加え、５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコ（２個）にて、２８℃、１８０ｒｐｍで７２時間培養した。なお、集菌時のＯＤ６００は２．９～３．３であった。
【0047】
＜製造例２－１：生菌体＞
前記本培養を行った後、遠心分離により培養菌体を回収した。その後、滅菌水で２回洗浄し、ペレットをＯＤ６００換算でＯＤが０．５相当になるように下記組成の展着剤にて調製した。
－展着剤－
・ ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル ０．２ｇ／Ｌ
・ カルボキシメチルセルロースナトリウム １ｇ／Ｌ
※ 超純水にて調製
前記本培養を行った後、遠心分離により培養菌体を回収した。その後、滅菌水で２回洗浄し、ペレットをＯＤ６００換算でＯＤが０．５相当になるように下記組成の展着剤にて調製した。
－展着剤－
・ ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル ０．２ｇ／Ｌ
・ カルボキシメチルセルロースナトリウム １ｇ／Ｌ
※ 超純水にて調製
【0048】
＜製造例２－２：死菌体＞
前記本培養を行った後、遠心分離により培養菌体を回収した。その後、滅菌水で２回洗浄した。洗浄後の菌体をオートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。滅菌後のペレットを菌液時のＯＤ６００換算でＯＤが０．５相当になるように前記展着剤にて調製した。
前記本培養を行った後、遠心分離により培養菌体を回収した。その後、滅菌水で２回洗浄した。洗浄後の菌体をオートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。滅菌後のペレットを菌液時のＯＤ６００換算でＯＤが０．５相当になるように前記展着剤にて調製した。
【0049】
＜製造例２－３：菌体細胞壁＞
前記本培養を行った後、遠心分離により培養菌体を回収した。その後、５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した。培養液量と当量（１００ｍＬ）の５０ｍＭ ＥＤＴＡと２％ ＳＤＳを含有する水溶液に懸濁した。５０ｍＬのコーニングチューブ２本に前記懸濁液を分け、３７℃の湯浴で６０分間インキュベートした。８，０００×ｇで５分間遠心し、上清を１０ｍＬずつ５０ｍＬコーニングチューブに分けた。コーニングチューブ１本に対し１ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウムと３０ｍＬのエタノールを加え混和した。－２０℃で一晩保存した。８，０００×ｇで５分間遠心し、ペレット状にし、７０％エタノールで１回洗浄した。ペレットを菌液時のＯＤ６００換算でＯＤが０．５相当になるように前記展着剤にて調製した。
なお、細胞壁成分の有無は、フェノール－硫酸法を用い、多糖を指標として確認した。具体的には、サンプル１００μＬに対して１００μＬの５％フェノールと５００μＬの硫酸を加え混和し、溶液の黄色への変色により、多糖の存在を確認した。
前記本培養を行った後、遠心分離により培養菌体を回収した。その後、５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した。培養液量と当量（１００ｍＬ）の５０ｍＭ ＥＤＴＡと２％ ＳＤＳを含有する水溶液に懸濁した。５０ｍＬのコーニングチューブ２本に前記懸濁液を分け、３７℃の湯浴で６０分間インキュベートした。８，０００×ｇで５分間遠心し、上清を１０ｍＬずつ５０ｍＬコーニングチューブに分けた。コーニングチューブ１本に対し１ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウムと３０ｍＬのエタノールを加え混和した。－２０℃で一晩保存した。８，０００×ｇで５分間遠心し、ペレット状にし、７０％エタノールで１回洗浄した。ペレットを菌液時のＯＤ６００換算でＯＤが０．５相当になるように前記展着剤にて調製した。
なお、細胞壁成分の有無は、フェノール－硫酸法を用い、多糖を指標として確認した。具体的には、サンプル１００μＬに対して１００μＬの５％フェノールと５００μＬの硫酸を加え混和し、溶液の黄色への変色により、多糖の存在を確認した。
【0050】
（試験例１）
穀物類の一例として酒米の１つである白鶴錦を用い、以下のようにして穀物類の増収を試験した。
穀物類の一例として酒米の１つである白鶴錦を用い、以下のようにして穀物類の増収を試験した。
【0051】
＜試料の散布＞
兵庫県多可町東安田地区の圃場にて、各試験区（下記参照）につき約１１０株の白鶴錦に対して試料を散布した。１回目の散布は８月初旬の穂肥前（出穂の約２０日前）に行い、２回目の散布は１回目の散布の１ヵ月後（出穂の約１０日後）に実施した。１回あたりの散布量は約４００ｍＬであり、噴霧器を用いて稲全体に均一に散布した。
－試験区－
・ 対照散布試験区 ・・・ 展着剤のみ
・ 生菌体散布試験区 ・・・ 製造例２－１で調製した生菌体
・ 死菌体散布試験区 ・・・ 製造例２－２で調製した死菌体
・ 菌体細胞壁散布試験区 ・・・ 製造例２－３で調製した菌体細胞壁
兵庫県多可町東安田地区の圃場にて、各試験区（下記参照）につき約１１０株の白鶴錦に対して試料を散布した。１回目の散布は８月初旬の穂肥前（出穂の約２０日前）に行い、２回目の散布は１回目の散布の１ヵ月後（出穂の約１０日後）に実施した。１回あたりの散布量は約４００ｍＬであり、噴霧器を用いて稲全体に均一に散布した。
－試験区－
・ 対照散布試験区 ・・・ 展着剤のみ
・ 生菌体散布試験区 ・・・ 製造例２－１で調製した生菌体
・ 死菌体散布試験区 ・・・ 製造例２－２で調製した死菌体
・ 菌体細胞壁散布試験区 ・・・ 製造例２－３で調製した菌体細胞壁
【0052】
＜各試験区の解析＞
稲刈りは通常時期に行い、各試験区の株数と面積を算出した。圃場にて３週間乾燥した後に脱穀、籾摺り、小型米選機による選別を行い、精玄米重を算出した。結果を表１に示す。
稲刈りは通常時期に行い、各試験区の株数と面積を算出した。圃場にて３週間乾燥した後に脱穀、籾摺り、小型米選機による選別を行い、精玄米重を算出した。結果を表１に示す。
【0053】
【表1】
【0054】
表１に示されるように、各試料の面積あたりの精玄米重、株あたりの精玄米重を比較したところ、生菌体散布試験区、死菌体散布試験区、及び菌体細胞壁散布試験区は、対照試験区より増加していた。また、菌体細胞壁散布試験区で最も増加したことから、メタノール資化性細菌の菌体成分のうち細胞壁が穀物類の増収に関わっている可能性が示唆された。
【受託番号】
【0055】
ＮＩＴＥ Ｐ－０２６２８