(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-01-10
(45)【発行日】2023-01-18
(54)【発明の名称】標的細胞捕捉フィルター及び標的細胞捕捉方法
(51)【国際特許分類】
G01N 1/10 20060101AFI20230111BHJP
G01N 1/04 20060101ALI20230111BHJP
C12M 3/06 20060101ALI20230111BHJP
C12M 1/26 20060101ALI20230111BHJP
C12N 5/07 20100101ALI20230111BHJP
【ＦＩ】
G01N1/10 B
G01N1/04 H
C12M3/06
C12M1/26
C12N5/07
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021522245
(86)(22)【出願日】2020-05-19
(86)【国際出願番号】 JP2020019715
(87)【国際公開番号】W WO2020241365
(87)【国際公開日】2020-12-03
【審査請求日】2021-07-19
(31)【優先権主張番号】P 2019098037
(32)【優先日】2019-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】598062952
【氏名又は名称】株式会社オジックテクノロジーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100116573
【弁理士】
【氏名又は名称】羽立 幸司
(72)【発明者】
【氏名】中島 雄太
(72)【発明者】
【氏名】北村 裕介
(72)【発明者】
【氏名】安田 敬一郎
【審査官】草川 貴史
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１７－０８３２６５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５０９８２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－５０３７９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０４３１２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１５０９５５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０３０８７８９９（ＣＮ，Ａ）
【文献】中竹拳志郎、外９名，核酸アプタマーと３次元変形能を持つマイクロフィルタを用いた標的細胞捕捉，電気学会研究会資料，日本，2018年，19-21
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ １／１０－ １／４４
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
Ｃ１２Ｍ ３／０６
Ｃ１２Ｍ １／２６
Ｃ１２Ｎ ５／０７
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
液体の中の標的細胞を捕捉する捕捉面を有する標的細胞捕捉フィルターであって、前記標的細胞捕捉フィルターは、前記捕捉面の一部が前記捕捉面に対して垂直な方向に弾性変形して隙間を形成することを可能とする切り込みを複数備え、
複数の前記切り込みのうち少なくとも一部は、
複数の前記切り込みであって、前記切り込みの最大変形箇所から前記捕捉面の外縁までの最短距離が互いに異なる複数の切り込みである第１切り込み群であり、
単位面積当たりの力積に対する弾性変形の変形量が等しいことを特徴とし、
前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みのそれぞれが円を形成するように配置され、
前記円は、少なくとも、半径が小さい順に第１半径を有する第１円、第２半径を有する第２円及び第３半径を有する第３円を有し、
前記第２半径と前記第１半径の長さの差は、第３半径と第２半径の長さの差よりも大きい、標的細胞捕捉フィルター。
【請求項2】
前記第１円、前記第２円及び前記第３円は、１つの中心を共有する同心円群である、請求項１記載の標的細胞捕捉フィルター。
【請求項3】
液体の中の標的細胞を捕捉する捕捉面を有する標的細胞捕捉フィルターであって、
前記標的細胞捕捉フィルターは、前記捕捉面の一部が前記捕捉面に対して垂直な方向に弾性変形して隙間を形成することを可能とする切り込みを複数備え、
複数の前記切り込みのうち少なくとも一部は、
複数の前記切り込みであって、前記切り込みの最大変形箇所から前記捕捉面の外縁までの最短距離が互いに異なる複数の切り込みである第１切り込み群であり、
単位面積当たりの力積に対する弾性変形の変形量が等しいことを特徴とし、
前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みのそれぞれが円を形成するように配置され、
前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みは、
入れ子状の図形形状を形成するように配置され、
前記図形形状は複数であり、
前記各図形形状は、少なくとも半径が小さい順に第ｎ（ｎ≧２）半径を有するｎ（ｎ≧２）個の第ｎ（ｎ≧２）円を有して１つの中心を共有する同心円群であり、
前記同心円群の中心は互いに異なり、
前記複数の図形形状が、フィルターの中心と前記複数の同心円群の中心とはいずれも異なって前記フィルターの中心と任意のいずれかの前記同心円群の中心とを結ぶ直線に関して線対称に配置されている、標的細胞捕捉フィルター。
【請求項4】
前記図形形状は、内側から外側に向かうほど密に配置されている、請求項３記載の標的細胞捕捉フィルター。
【請求項5】
前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みの長さが等しい、請求項１から４のいずれかに記載の標的細胞捕捉フィルター。
【請求項6】
液体の中の標的細胞を捕捉する捕捉面を有する標的細胞捕捉フィルターを用いた標的細胞捕捉方法であって、
前記標的細胞捕捉フィルターは、前記捕捉面の一部が前記捕捉面に対して垂直な方向に弾性変形して隙間を形成することを可能とする切り込みを複数備え、
複数の前記切り込みのうち少なくとも一部は、
複数の前記切り込みであって、前記切り込みの最大変形箇所から当該標的細胞捕捉フィルターの外縁までの最短距離が互いに異なる複数の切り込みである第１切り込み群であり、
単位面積当たりの力積に対する弾性変形の変形量が等しいものであり、
前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みのそれぞれが円を形成するように配置され、
前記円は、少なくとも、半径が小さい順に第１半径を有する第１円、第２半径を有する第２円及び第３半径を有する第３円を有し、
前記第２半径と前記第１半径の長さの差は、第３半径と第２半径の長さの差よりも大きく、
前記標的細胞捕捉フィルターが、前記液体の中で前記標的細胞を捕捉する標的細胞捕捉ステップを含む、標的細胞捕捉方法。
【請求項7】
液体の中の標的細胞を捕捉する捕捉面を有する標的細胞捕捉フィルターを用いた標的細胞捕捉方法であって、前記標的細胞捕捉フィルターは、前記捕捉面の一部が前記捕捉面に対して垂直な方向に弾性変形して隙間を形成することを可能とする切り込みを複数備え、
複数の前記切り込みのうち少なくとも一部は、
複数の前記切り込みであって、前記切り込みの最大変形箇所から前記捕捉面の外縁までの最短距離が互いに異なる複数の切り込みである第１切り込み群であり、
単位面積当たりの力積に対する弾性変形の変形量が等しいものであり、
前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みのそれぞれが円を形成するように配置され、
前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みは、
入れ子状の図形形状を形成するように配置され、
前記図形形状は複数であり、
前記各図形形状は、少なくとも半径が小さい順に第ｎ（ｎ≧２）半径を有するｎ（ｎ≧２）個の第ｎ（ｎ≧２）円を有して１つの中心を共有する同心円群であり、
前記同心円群の中心は互いに異なり、
前記複数の図形形状が、フィルターの中心と前記複数の同心円群の中心とはいずれも異なって前記フィルターの中心と任意のいずれかの前記同心円群の中心とを結ぶ直線に関して線対称に配置され、
前記標的細胞捕捉フィルターが、前記液体の中で前記標的細胞を捕捉する標的細胞捕捉ステップを含む、標的細胞捕捉方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的細胞捕捉フィルター及び標的細胞捕捉方法に関し、特に、液体の中の標的細胞を捕捉する捕捉面を有する標的細胞捕捉フィルター等に関する。
【背景技術】
【0002】
液体中のターゲット物質（主に細胞や微生物、たんぱく質、エクソソームなど）を選択的に取り出すことは医療、健康、農業などのライフサイエンスやバイオテクノロジー分野において非常に重要な課題となっており、ターゲット物質のみを簡便に短時間でかつ効率よく捕捉する手法が望まれている。
【0003】
本願発明者らは、これまでに血液等の生体試料中に含まれる標的細胞を簡便に短時間で効率よく分離捕捉する標的細胞捕捉装置を提案してきた（特許文献１）。
【0004】
また、特許文献２には、「細胞捕獲通路内においてアビディンを固定しマイクロ流体チップ」を用いて、予め「サンプルにビオチンが修飾されている核酸アプタマを加え、孵化」し、「孵化後の混合溶液をマイクロ流体チップ中に充填し、混合溶液中の目標ガン細胞がビオチンを介してアビディンに結合され、目標ガン細胞の分離を実現する」方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１７－８３２６５号公報
【文献】中国特許出願公開第１０３０８７８９９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、従来の捕捉方法（特許文献１及び特許文献２）では、ターゲット細胞の捕捉は可能であるが、単位面積あたりの捕捉率が向上しない問題点を有していた。
【0007】
そこで、本発明は、単位面積あたりの捕捉率を向上させた標的細胞捕捉フィルターを提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本願発明の第１の観点は、液体の中の標的細胞を捕捉する捕捉面を有する標的細胞捕捉フィルターであって、前記標的細胞捕捉フィルターは、前記捕捉面の一部が前記捕捉面に対して垂直な方向に弾性変形して隙間を形成することを可能とする切り込みを複数備え、複数の前記切り込みのうち少なくとも一部は、複数の前記切り込みであって、前記切り込みの最大変形箇所から前記捕捉面の外縁までの最短距離が互いに異なる複数の切り込みである第１切り込み群であり、単位面積当たりの力積に対する弾性変形の変形量が等しいことを特徴とする、標的細胞捕捉フィルターである。
【0009】
本願発明の第２の観点は、第１の観点の標的細胞捕捉フィルターであって、前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みは、図形形状を形成するように配置され、さらに、前記図形形状は入れ子状に形成されており、入れ子状に配置されている前記図形形状は、内側から外側に向かうほど密に配置されている、標的細胞捕捉フィルターである。
【0010】
本願発明の第３の観点は、第２の観点の標的細胞捕捉フィルターであって、前記入れ子状に配置されている図形形状を複数備える、標的細胞捕捉フィルターである。
【0011】
本願発明の第４の観点は、第１から第３のいずれかの観点の標的細胞捕捉フィルターであって、前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みの前記線分の長さが等しい、標的細胞捕捉フィルターである。
【0012】
本願発明の第５の観点は、第１から第４のいずれかの観点の標的細胞捕捉フィルターであって、前記第１切り込み群に属する複数の前記切り込みが、同心円を形成するように配置されている、標的細胞捕捉フィルターである。
【0013】
本願発明の第６の観点は、第５の観点の標的細胞捕捉フィルターであって、前記同心円は、半径が小さい順に第１半径を有する第１円、第２半径を有する第２円及び第３半径を有する第３円を有し、前記第２半径と前記第１半径の長さの差は、第３半径と第２半径の長さの差よりも大きい、標的細胞捕捉フィルターである。
【0014】
本願発明の第７の観点は、液体の中の標的細胞を捕捉する捕捉面を有する標的細胞捕捉フィルターを用いた標的細胞捕捉方法であって、前記標的細胞捕捉フィルターは、前記捕捉面の一部が前記捕捉面に対して垂直な方向に弾性変形して隙間を形成することを可能とする切り込みを複数備え、複数の前記切り込みのうち少なくとも一部は、複数の前記切り込みであって、前記切り込みの最大変形箇所から前記捕捉面の外縁までの最短距離が互いに異なる複数の切り込みである第１切り込み群であり、単位面積当たりの力積に対する弾性変形の変形量が等しいものであり、前記標的細胞捕捉フィルターが、前記液体の中で前記標的細胞を捕捉する標的細胞捕捉ステップを含む、標的細胞捕捉方法である。
【発明の効果】
【0015】
本発明の第１の観点によれば、標的細胞捕捉フィルターが弾性変形した際の隙間の変形量を等しくしたことにより、標的細胞捕捉フィルターの全面に渡り均等に液体が通過し、フィルター全面での捕捉が可能となる。そのため、フィルターの単位面積あたりの捕捉率を向上させることが可能となる。
【0016】
また、本発明の第２又は第３又は第５の観点によれば、標的細胞捕捉フィルターの剛性を均等にし、従来のフィルターよりも弾性変形した際の変形量が等しくなることによって、フィルター全面での捕捉をさらに容易とする。
【0017】
発明者らは、従来の標的細胞捕捉フィルターの外側部分での捕捉量が極端に少ないことを発見し、その不具合がフィルターの構造的な剛性のアンバランスさにあり、弾性変形した際の隙間に問題があると考えたことから想到したものである。
【0018】
さらに、本発明の第４の観点によれば、切り込みの線分の長さを等しくすることにより、弾性変形する際の隙間の変形量を等しくして、フィルター全面での捕捉をさらに容易とする。
【0019】
本発明の第５の観点によれば、同心円を形成する切り込みにすることによって、通常用いられる円錐形状の容器に適した標的細胞捕捉フィルターの全面に偏りなく隙間を配置することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
以下では、図面を参照して、本願発明の実施例について説明する。なお、本願発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0022】
本発明は、主に液体中に存在する目的物質をサイズ選択的かつアフィニティ特異的に分類する３次元フィルター及びこれを用いた標的細胞捕捉方法に関し、特に、液体中に存在する標的細胞を効果的に捕捉する３次元フィルター等に関する。
【0023】
図１（Ａ）は、本実施例に係る標的細胞捕捉フィルター１及び標的細胞捕捉フィルター２１を例示した図である。標的細胞捕捉フィルター１及び標的細胞捕捉フィルター２１は、使用時以外は板状の形状をしている。また、標的細胞捕捉フィルター１及び標的細胞捕捉フィルター２１は、それぞれ、本願請求項における「標的細胞捕捉フィルター」の一例である。
【0024】
図１（Ａ）に示す標的細胞捕捉フィルター１（以下、「複合３Ｄフィルター１」と称する）は、１つの面（本願請求項における「捕捉面」の一例）内に異なる複数の同心円（本願請求項における「図形形状」及び「同心円」の一例）の形状の切り込み３（本願請求項における「切り込み」の一例）を有する。また、図１（Ｂ）の標的細胞捕捉フィルター２１（以下、「等間隔フィルター２１」と称する）は、１つの同心円（本願請求項における「図形形状」及び「同心円」の一例）の形状の切り込み３を有する。切り込み３があることにより、面の一部が面に対して垂直な方向に弾性変形して隙間を形成することが可能となる。中心から同心状に隙間が外側にいくほど、面内にて隙間を形成する間隔を狭くすることにより、流体力により弾性変形した際の隙間の幅が等間隔になるようになっている。
【0025】
図２は、標的細胞捕捉フィルターの切り込みの違いによる標的細胞の捕捉密度を測定した結果を示すグラフである。ここで、測定について説明する。ターゲット細胞に予め核酸アプタマ―を修飾し、フィルターとの結合はビオチン－アビディン結合を利用することを考えており、具体的には、ターゲット細胞を含むサンプル溶液中に末端にビオチンを修飾した核酸アプタマ―を導入し、ターゲット細胞と核酸アプタマ―を結合させ、フィルターにアビディンを修飾させるようにしている。そして、フィルターにサンプル溶液を導入することにより、ビオチン－アビディン結合によりターゲット細胞が捕捉される仕組みになっている。図２に示すように、本実施例に係る等間隔フィルター２１と従来のフィルター５１を比較すると、等間隔フィルター２１においてターゲット細胞の捕捉密度が３倍以上に向上している。さらに、複合３Ｄフィルター１と従来のフィルター５１では、複合３Ｄフィルター１において、標的細胞の捕捉密度が約２０倍に向上していることが分かる。
【0026】
標的細胞捕捉フィルター１及び２１は、弾性変形して隙間を形成する切り込み３を複数備え、複数の切り込み３のうち少なくとも一部は、以下の特徴を備える。すなわち、
（１）複数の切り込みであり、
（２）各切り込みの最大変形箇所から標的細胞捕捉フィルターの外縁５までの最短距離が互いに異なる
という特徴を備えている。以下、このような特徴を備える複数の切り込みを「第１切り込み群」（本願請求項における「第１切り込み群」の一例）と称する。
（１）複数の切り込みであり、
（２）各切り込みの最大変形箇所から標的細胞捕捉フィルターの外縁５までの最短距離が互いに異なる
という特徴を備えている。以下、このような特徴を備える複数の切り込みを「第１切り込み群」（本願請求項における「第１切り込み群」の一例）と称する。
【0027】
また、第１切り込み群は、フィルターの中心を含む領域である中心部７における単位面積当たりの力積に対する弾性変形の変形量と、フィルターの外縁に接する領域である外縁部９における単位面積当たりの力積に対する弾性変形の変形量とが等しい、という特徴も備えている。
【0028】
ここで、変形量は、隙間の面積で表され、隙間の長さと変形した距離の積でおおよそ求めることが可能である。
【0029】
また、標的細胞捕捉フィルター２１については、切り込み３の長さを等しくそろえている。外側の同心円ほど切り込みの長さが長い従来のフィルター５１と比べて、フィルターの剛性を上げたことにより、３次元形状に変形する前の目詰まりが起こりやすくなり、標的細胞捕捉フィルタ－２１上に捕捉対象物が滞留しやすくなった。この点も標的細胞の捕捉率向上につながったと考えられる。
【0030】
他方、標的細胞捕捉フィルター１は、小さな円弧の切り込みほど切り込みの長さが短くなっている。
【0031】
本実施例に係る細胞捕捉フィルターは、中心部と外縁部で同程度にフィルターが弾性変形するため、フィルター全面にわたり液体が均等に通過しやすくなった。このため、中心部も外縁部も単位面積当たりにフィルターが接触する捕捉対象物の量が同程度となり、従来のフィルターに比べて捕捉対象物の大幅な捕捉率向上を可能とした。
【0032】
なお、本実施例では、標的細胞捕捉フィルターが板状であるとしたが、捕捉面を有する形状であれば、板状以外の形状、例えば、薄膜状の形状であってもよい。また、捕捉面は、平面であることに限定されず、曲面であってもよい。
【符号の説明】
【0033】
１；標的細胞捕捉フィルター、３；切り込み、５；外縁、７；中心部、９；外縁部、２１；標的細胞捕捉フィルター
【図1】
【図2】
