(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-03
(45)【発行日】2023-03-13
(54)【発明の名称】線虫自動移行装置
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20230306BHJP
【FI】
C12M1/00 A
C12M1/00 C
(21)【出願番号】P 2022008491
(22)【出願日】2022-01-24
【審査請求日】2022-07-06
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522031973
【氏名又は名称】大和酸素工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100098545
【氏名又は名称】阿部 伸一
(74)【代理人】
【識別番号】100189717
【氏名又は名称】太田 貴章
(72)【発明者】
【氏名】一色 貴志
(72)【発明者】
【氏名】増田 純弥
【審査官】幸田 俊希
(56)【参考文献】
【文献】特開2021-193918(JP,A)
【文献】特開2021-069301(JP,A)
【文献】特表2020-527721(JP,A)
【文献】特開2020-068682(JP,A)
【文献】国際公開第2021/019622(WO,A1)
【文献】国際公開第2019/159524(WO,A1)
【文献】国際公開第2019/150756(WO,A1)
【文献】国際公開第2019/150755(WO,A1)
【文献】S. Brenner,The Genetics of Caenorhabditis elegans.,Genetics,1974年05月,Vol.77, No.1,p.71-94,doi: 10.1093/genetics/77.1.71
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
C12M 1/00
C12M 3/00
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
寒天培地上に大腸菌などで培養された複数の線虫が載っているシャーレが供給され、
制御部では、
ピックバーを前記シャーレの上方より下降することにより前記シャーレ内の前記寒天培地の表面に近づける第1動作と、
前記ピックバーが前記寒天培地の上に接触する前に、あらかじめ前記シャーレの上方から撮像装置で前記シャーレ内の前記線虫を撮像する第2動作と、
前記撮像装置で撮像した画像
から、卵を持った雌雄同体でかつ所定の大きさである前記線虫を選別する第3動作と、
選別された前記線虫に対して、前記ピックバーを、前記線虫の動きから予想された位置の近傍に位置制御する第4動作と、
前記ピックバーを、降下させ、選別された前記線虫に向かって移動させる第5動作と、
前記ピックバーによって前記線虫を捕まえた後に、前記ピックバーを、前記シャーレから離れるように上昇させる第6動作と、
前記線虫を捕まえた前記ピックバーを、前記シャーレとは別の場所の平面に移動し、移動後に前記平面にほぼ接触するように下降させる第7動作と、
前記線虫を前記ピックバーから前記平面に放す第8動作と、
前記線虫を放した前記ピックバーを上昇させて前記シャーレの上方に移動させる第9動作と
を行い、
前記第9動作の後に前記第1動作に戻り、
前記第1動作から前記第9動作を繰り返し行わせる
ことを特徴とする線虫自動移行装置 。
【請求項2】
前記制御部では、
前記線虫を前記ピックバーで捕獲した状態
で撮像し、又は前記線虫が移された前記平面の上部から前記線虫を撮像し、
撮像された画像より前記線虫の、雌雄同体・前記卵の有無・大きさ
が条件に合致しているかを
判断する
ことを特徴とする請求項1に記載の線虫自動移行装置。
【請求項3】
前記線虫が移された前記平面は、前記平面自体が移動できるような構造で、かつ前記平面は水平面で回転できる回転体に取り付けられており、
前記制御部では、
前記線虫
が前記条件に合致している場合と前記条件に合致していない場合とで前記平面の移動方向を異ならせるように前記回転体
を回転し、
その後前記平面を移動し、
前記平面に載っている前記線虫が、前記平面より離れるようになっている
ことを特徴とする請求項2に記載の線虫自動動移行装置。
【請求項4】
前記シャーレから前記線虫を捕まえて前記平面に下すという一連の動作を繰り返し行う場合、検査工程用線虫を培養する場合と、線虫自動移行装置投入用線虫を培養する場合で繰り返し回数を変更することを特徴とする請求項1に記載の線虫自動移行装置。
【請求項5】
前記シャーレより前記線虫を捕まえて前記平面に下す場合に、前記ピックバーの上部から液滴を垂らすことを特徴とする請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の線虫自動移行装置。
【請求項6】
前記線虫をシャーレからピックアップする動作および前記平面に放す動作両方に影響しない場所に、前記ピックバーを消毒する場所があり、前記場所に前記ピックバーが移動可能になっていることを特徴とする請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の線虫自動移行装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
線虫の、匂いに反応する性質を生かし、特定の物質の検査を行う線虫を培養する場合に、えさの入った寒天培地に線虫を数匹投入し、その後培養装置に投入する作業において、えさの入った寒天培地への線虫の投入作業を自動化する線虫自動移行装置に関するものである。
【背景技術】
【0002】
現在本分野の作業は、人の手で行われており自動化されていないのが現状である。人の手で行うにあたり、作業の効率化も試みられており、特許文献1にあるように、線虫がバッファー液の中に存在しており、バッファー液ごと線虫を吸い取り、紙製ウエスを敷いた別のシャーレに移す方法も提案されているが、紙製ウエスでバッファー液を吸い取る際、紙製ウエスが線虫に触れると、線虫を傷つけてしまったり、線虫にストレスを与えてしまったりする。この結果 、線虫の行動が鈍化し、検査精度を低下させてしまうことがあるなどの問題があり、特に、大量の検査を行うために、機械による自動化を導入しようとすると、繊細な作業を機械で行うことが困難であり、従来、本分野の作業は、人の手で行われており、自動化されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
たくさんの線虫がいるシャーレから、決められた数の線虫をピックアップして、線虫培養用のシャーレに移す工程において、線虫にストレスを与えてしまうことが最大の課題である。人の手で行う場合においても、人によっては、線虫を無用に触ったり、長時間追い回したりして、線虫が弱ってしまい、その後うまく増殖しないという問題がある。経験の必要な作業で、人の確保、育成も容易ではない。また、目視による雌雄判別、雌の卵の有無および線虫の元気よさ判断は微妙で難しい。さらに、人が介在することにより、培養用のシャーレの中にカビなどが発生する場合もある。以上述べたような状況のため、人手によらない、線虫にストレスを与えない、大量生産のやり方が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
第1の発明においては、寒天培地上に大腸菌などで培養された複数の線虫が載っているシャーレが供給され、制御部では、ピックバーを前記シャーレの上方より下降することにより前記シャーレ内の前記寒天培地の表面に近づける第1動作と、前記ピックバーが前記寒天培地の上に接触する前に、あらかじめ前記シャーレの上方から撮像装置で前記シャーレ内の前記線虫を撮像する第2動作と、前記撮像装置で撮像した画像から、卵を持った雌雄同体でかつ所定の大きさである前記線虫を選別する第3動作と、選別された前記線虫に対して、前記ピックバーを、前記線虫の動きから予想された位置の近傍に位置制御する第4動作と、前記ピックバーを、降下させ、選別された前記線虫に向かって移動させる第5動作と、前記ピックバーによって前記線虫を捕まえた後に、前記ピックバーを、前記シャーレから離れるように上昇させる第6動作と、前記線虫を捕まえた前記ピックバーを、前記シャーレとは別の場所の平面に移動し、移動後に前記平面にほぼ接触するように下降させる第7動作と、前記線虫を前記ピックバーから前記平面に放す第8動作と、前記線虫を放した前記ピックバーを上昇させて前記シャーレの上方に移動させる第9動作とを行い、前記第9動作の後に前記第1動作に戻り、前記第1動作から前記第9動作を繰り返し行わせることを特徴とする線虫自動移行装置である。
【0006】
第2の発明においては、第1の発明において、前記制御部では、前記線虫を前記ピックバーで捕獲した状態で撮像し、又は前記線虫が移された前記平面の上部から前記線虫を撮像し、撮像された画像より前記線虫の、雌雄同体・前記卵の有無・大きさが条件に合致しているかを判断する
ことを特徴とする線虫自動移行装置である。
【0007】
第3の発明においては、第2の発明において、前記線虫が移された前記平面は、前記平面自体が移動できるような構造で、かつ前記平面は水平面で回転できる回転体に取り付けられており、前記制御部では、前記線虫が前記条件に合致している場合と前記条件に合致していない場合とで前記平面の移動方向を異ならせるように前記回転体を回転し、その後前記平面を移動し、前記平面に載っている前記線虫が、前記平面より離れることを特徴とする線虫自動移行装置である。
【0008】
第4の発明においては、第1の発明において、前記シャーレから前記線虫を捕まえて前記平面に下すという一連の動作を繰り返し行う場合、検査工程用線虫を培養する場合と、線虫自動移行装置投入用線虫を培養する場合で繰り返し回数を変更することを特徴とする線虫自動移行装置である。
【0009】
第5の発明においては、第1の発明から第4の発明おいて、前記シャーレより前記線虫を捕まえて平面に下す場合に、前記ピックバーの上部から液滴を垂らすことを特徴とする線虫自動移行装置。
【0010】
第6の発明においては、第1の発明から第4の発明おいて、前記線虫を前記シャーレからピックアップする動作および平面に放す動作両方に影響しない場所に、前記ピックバーを消毒する場所があり、前記場所にピックバーが移動可能になっていることを特徴とする線虫自動移行装置である。
【発明の効果】
【0011】
このように、自動化された環境で、画像処理を用いて線虫の行動を把握し、短時間で、線虫に極力負荷のない採取を行うと同時に、培養に必要な卵を持った雌雄同体のみを選択することにより、線虫を無用に触ったり、長時間追い回したりして、線虫が弱ってしまい、その後うまく増殖しないという課題をなくすことができ、線虫増殖の効率を上げ、線虫の大量生産に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【
図3】第1の実施例のピックバーが下りる前の側面図
【
図4】第1の実施例のピックバーが下りた状態の側面図
【
図5】第1の実施例のピックバーが下りた状態の平面図
【
図6】第1の実施例のピックバーが下りた後、移動した平面図
【
図7】第1の実施例のピックバーが平面表面にほぼ接触した状態の平面図
【
図8】第1の実施例のピックバーが平面に線虫を放した後の平面図
【
図9】第2の実施例で平面が第1の方向を向いている状態の平面図
【
図10】第2の実施例で平面が第1の方向を向いている状態の側面図
【
図11】第2の実施例で平面が第2の方向を向いている状態の平面図
【
図12】第2の実施例で平面が第2の方向を向いている状態の側面図
【
図13】第2の実施例のピックバーが平面表面にほぼ接触した状態の平面図
【
図14】第2の実施例のピックバーが平面に線虫を放した後の平面図
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の線虫移送装置を具体化した実施例について、図で示し説明する。
図1は第1の実施例の平面図である。寒天培地で培養された自動移行装置用線虫培養済みシャーレ12が、回転機構付きコンベア9にセットされている。ロボットX軸2、ロボットY軸3、ロボットZ軸4で構成される直行ロボットのロボットZ軸4にピックバー保持装置5が取り付けられてある。また、ロボットZ軸4には上から線虫を撮像できるようにカメラ6が、ピックバー20に液滴を噴射できるようノズル21を持った液滴噴射装置7が搭載されている。カメラ6は、図には示していないが、画像処理用コンピューターに接続されており、ロボットX軸2、Y軸3、Z軸4を駆動することにより、シャーレ12のほとんどの場所の線虫を撮像できるようになっている。シャーレ12の線虫をカメラ6で撮影した後、画像処理において、ある一定以上の大きさで、卵を持った雌雄同体の線虫を選別し、選別された線虫の動きを予測し、その予想された近傍にピックバー20を下すようになっている。
図2で示すように、ピックバー保持装置5には、ピックバー回転機構19があり、ピックバー20は、任意の角度で水平方向に回転できるようになっている。ピックバー20を下す場合は、選別された線虫にピックバー20がほぼ平行になるように制御する。ピックバー20と選別された線虫33の長手方向の平行を実現するためには、ピックバー回転機構19を使用する代わりに、回転コンベア9を回転制御することによりピックバー20と、選別された線虫33の長手方向と平行にすることもできる。ピックバー20を選別された線虫33の近傍に下した後は、線虫33の方向にピックバー20を移動することにより、選別された線虫をピックアップし、ロボットZ軸4の上昇により、ピックバー20が上昇し、ロボットX軸2,Y軸3の移動により、別の平面、本実施例では線虫培養用シャーレ10、の上方にピックバー20が移動し、ロボットZ軸4の降下により、ピックバー20が降下し、選別された線虫33を線虫培養用シャーレ10におろすことができる。
【0014】
実施例1で具体的にどのようにシャーレ12の中にいる線虫をピックアップするのかを図で説明する。
図3はピックバー20を下す前のシャーレ12の側面図、
図4はピックバー20を下した後のシャーレ12の側面図である。32は線虫群で、31は線虫を培養するための寒天のうえに養分となる大腸菌などが塗布された培地である。ピックバー20を下した後の、ピックバー20の動きを示したのが
図5,
図6である。
図5は、画像処理で選別された線虫33の近傍にピックバー20が下りた状態を示しており、ピックバー20を選別された線虫33の方向に移動させた後が
図6であり、ピックバー20に選択された線虫33が絡まっている状態を示している。
【0015】
ピックバー20を下す高さは、シャーレ12の寒天培地のほぼ上面の高さであるが、寒天にコンタクトしてもいい。シャーレ12の寒天培地31の高さは、寒天培地31を作成するとき一定になるように寒天などの量をコントロールすることにより、決まった高さになるようにしてもよいし、シャーレ12の上方に、カメラ6による画像処理に影響がないように、寒天培地31の表面までの距離を計測する装置をロボットZ軸4、もしくはロボットY軸3に搭載しても構わない。さらに、ピックバー20に垂直にかかる荷重を計測し、寒天培地の表面への接触を確認しても構わない。荷重を計測するものとしては、例えばロードセルなどがある。
【0016】
図7は培養用シャーレ10の表面にピックバー20を下した状態で、
図8はピックバー20から捕獲された線虫30が放たれ、ピックバー20が培地34から離れた状態を表している。
選別された線虫33が捕獲できなかったときは、次の候補、例えば2番目の大きさの線虫33など、が捕獲されるため、最初に選別された線虫33が、捕獲された線虫30と一致しない場合があるため、
図7,
図8では捕獲された線虫30とする。
捕獲された線虫30がピックバー20から離れない場合は、もしくは歩留まりよく放すため、線虫30にストレスを与えない程度に洗浄液を掛けてもかまわない。その場合は、液滴噴射装置7に接続している液滴ノズル21よりピックバー20に載っている線虫30に対して液を垂らすことができる。また捕獲された線虫30がのったピックバー20と培地34の距離を判断するために、シャーレ10の寒天培地34の高さを、寒天培地34を作成するとき一定になるように寒天などの量をコントロールすることにより、決まった高さになるようにしてもよいし、シャーレ10の上方に、カメラ6による画像処理に影響がないように、寒天培地34の表面までの距離を計測する装置をロボットZ軸4、もしくはロボットY軸3に搭載しても構わない。さらに、ピックバー20に垂直にかかる荷重を計測し、寒天培地34の表面への接触を確認しても構わない。荷重を計測するものとしては、例えばロードセルなどがある。
【0017】
ピックバー20に捕獲された線虫30が、ロボットZ軸4に搭載されたカメラ6、もしくは図には記載していないがピックバー20にいる線虫を撮影できるカメラ6にて、線虫30を撮像し、画像処理にて、線虫30が条件に合っていることを確認する。確認時にて条件に合わないことが判明したのちは、線虫30を廃棄する。廃棄の方法は、ピックバー20の洗浄用工程にて、アルコールの炎22にて焼却する方法などがある。また、ピックバー20に捕獲された線虫30をシャーレ10に移行したのち、ロボットZ軸4に搭載されたカメラ6、もしくは図には記載していないがシャーレ10にいる線虫を撮影できるカメラ6にて線虫30を撮像し、画像処理にて、線虫30が条件に合っていることを確認する。確認時にて条件に合わないことが判明したのちは、線虫30を廃棄する。廃棄の方法は、シャーレ10のすべての線虫を廃棄する。廃棄の方法は、図には示していないが、例えばコンベア17を通過したのちに分岐コンベアがあり、廃棄工程へ分岐されるようにする方法などがある。
【0018】
ピックバー20が汚れたり、条件に合わない線虫が捕獲されたりした場合、ピックバー20を洗浄するため、ロボットX軸2、Y軸3、Z軸4が移動し、ピックバー20が洗浄位置18に移動できるようになっている。洗浄位置18には例えばアルコールランプがあり、その炎22の中にピックバー20を数秒間置くことにより洗浄される。洗浄されるタイミングは、捕獲した線虫30が条件に合わなかった場合や捕獲した線虫がシャーレ10に放たれた後に行ってもいいし、決められた回数線虫をピックアップしたのち行っても構わない。
【0019】
以上述べたように、シャーレ12から選択された線虫をシャーレ10に移行する動作を制御部によって複数回繰り返し、動作回数が決められた数に達したら、回転機構付きコンベア9が、90度回転し、シャーレ10がコンベア17を経由して排出される。シャーレ10が排出された後は、回転機構付きコンベア11が90度回転し、コンベア15から線虫培養用シャーレ13が供給される。すなわち、線虫の載っていない新しい培養用シャーレ13が、シャーレ10のあった位置に供給される。シャーレ12に載っている線虫の数が決められた数量より少なくなると、回転機構付きコンベア9が90度回転し、シャーレ12がコンベア16に排出される。シャーレ12が排出されると、回転機構付きコンベア9が90度回転し、培養された線虫がいるシャーレ12がコンベア14を通って、シャーレ12のあった位置に供給される。
【0020】
図9、
図10、
図11、
図12、
図13、
図14,
図15は本発明の第2の実施例である。実施例1との違いは、シャーレ12から捕獲された線虫30を、シャーレ10に移すかわりに、振り分け装置40の移動可能な平面42、に移すということである。
図15に振り分け装置40の仕組みを示している。線虫30を捕獲したピックバー20は振り分け装置40の移動可能な平面42におろされ、線虫30を放す。おろし方、放し方は、実施例1と同様である。シャーレ10の寒天の表面高さが、振り分け装置40の移動可能な平面42の高さに相当している。移動可能な平面42の上方にあるカメラ6にて線虫30を撮像する。撮像用のカメラ6は、ピックバー20の移動を邪魔しないところに新たに設置してもいいし、直行ロボットに搭載されているカメラ6を使用してもかまわない。線虫30の画像を処理し、条件に合致しているかどうかを判断し、条件に合致している場合は回転機能付き支柱41の回転により、移動可能な平面42の移動方向がシャーレ10になるように制御を行う。その後、移動可能な平面42が稼働し、その上に載っている線虫30は、シャーレ10の中に落とされる。条件に合致しなかった場合は回転機能付き支柱41の回転により、移動可能な平面42の移動方向が不良線虫回収装置43になるように制御を行う。その後、移動可能な平面42が稼働し、その上に載っている線虫30は、不良線虫回収装置43の中に落とされる。
【0021】
図16は本発明を利用した、自動培養システムの例である。コンベア17の後には、線虫培養器51が接続されている。培養器51の中は、線虫の数を増やすように快適にコントロールされている。培養器51で一定時間経過すると、コンベア47に検査工程用もしくは自動移行装置用線虫培養済みシャーレ48が出てくる。検査工程用もしくは自動移行装置用線虫培養済みシャーレ48は、振り分けコンベア35に進む。ここでは、決められた量に線虫が増えているか、線虫の動きが適当かなどを、図には示していないが、コンベア47の上方もしくは振り分けコンベア35の上方にあるカメラ6にて画像処理を行い、その判断を行う。その際、不良と判断されたシャーレ48は、振り分けコンベア35により、シャーレ回収用ストッカー44に移動し、その後の工程には使用されないようにする。良品と判断されたシャーレ48は、検査工程に進むコンベア37もしくは、自動移行装置に投入されるコンベア36のどちらかに振り分けられる。
【0022】
振り分ける方法としては、シャーレ48の枚数をカウントし、カウントされた枚数のバランスを取りながら振り分ける方法がある。例えば、100枚に1枚自動移行装置に投入し、残りは検査工程に投入する。ほかの方法として、シャーレ48の線虫の数が規定内ではあるが、ほかに比べて少ない場合は自動移行装置投入用のコンベア35に振り分けられ、その他は検査工程用のコンベア37に振り分ける方法がある。さらにほかの方法としては、シャーレ48にあらかじめ識別するための例えばバーコードをはりつけて振り分ける方法もある。すなわち、線虫自動移行装置にて線虫を培養用シャーレ10に振り分ける際に、検査用の線虫を培養するときは、培養後例えば500匹程度増えるような線虫の数を移行し、自動移行装置に投入するシャーレ12用に線虫を培養するときは、培養後例えば100匹程度増えるような線虫の数をシャーレ10に移行するという方法がある。その際、検査用の線虫が入ったシャーレと自動移行装置用の線虫が入ったシャーレを区別するなどのためにバーコードを利用する。自動移行装置投入用シャーレの中の線虫は、線虫を画像処理や捕獲する場合、線虫同士が重なっていなほうが扱いやすい。直径5センチメートル程度のシャーレであれば、50から200匹くらいが適当であるが、線虫の種類や大きさなどにより変化する。
【産業上の利用可能性】
【0023】
生きている小さな線形動物を、形状等外観による判断を行いながら、1匹ずつ対象動物にストレス与えないように採取するような作業に利用可能である。
【符号の説明】
【0024】
1 線虫自動移行装置の第1の実施例
2 ロボットX軸
3 ロボットY軸
4 ロボットZ軸
5 Z軸に取り付けたピックバー保持装置
6 Z軸に取り付けた撮像用カメラ
7 Z軸に取り付けた液滴噴射装置
8 培養された線虫がいるシャーレ
9 回転機構付きコンベア
10 線虫培養用シャーレ
11 回転機構付きコンベア
12 自動移行装置用線虫培養済みシャーレ
13 線虫培養用シャーレ
14 コンベア
15 コンベア
16 コンベア
17 コンベア
18 ピックバー消毒用アルコールランプ
19 ピックバー回転機構
20 ピックバー
21 液滴噴射ノズル
22 炎
23 線虫移行装置が載った架台
30 捕獲された線虫
31 線虫を培養するための寒天+養分(大腸菌など)が塗布された培地
32 線虫群
33 選択された線虫
34 線虫を培養するための寒天+養分(大腸菌など)が塗布された培地
35 振り分けコンベア
36 コンベア
37 コンベア
38 シャーレ回収用ストッカー
40 振り分け装置
41 回転機能付き支柱
42 移動可能な平面
43 不良線虫回収装置
44 シャーレ回収用ストッカー
45 コンベア
46 検査工程用線虫培養済みシャーレ
47 コンベア
48 検査工程用もしくは自動移行装置用線虫培養済みシャーレ
49 線虫培養用シャーレストッカー
50 線虫自動移行装置の第2の実施例
51 線虫培養装置
【要約】
【課題】たくさんの線虫がいるシャーレから、決められた数の線虫をピックアップして、線虫培養用の別のシャーレに移す工程において、人の手で行うと、人によっては、線虫を無用に触ったり、長時間追い回したりして、線虫が弱ってしまい、その後うまく増殖しないなどの問題がある。
【解決手段】線虫30の載ったシャーレ8の上方から撮像装置でシャーレ8内の線虫30を撮像し、画像処理により雌雄同体・卵の有無・サイズなどを判断し、捕まえるべき線虫33を特定し、線虫33の近傍にピックバー20を降ろし、ピックバー20を線虫33のほうに移動することで線虫33を捕まえ、別の培養用シャーレ10に移動するという動作を複数回繰り返し行う線虫自動移行装置。
【選択図】
図2