特許 7261349 ピリミジン－５－カルボキサミド化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-11

(45)【発行日】2023-04-19

(54)【発明の名称】ピリミジン－５－カルボキサミド化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 239/48 20060101AFI20230412BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230412BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20230412BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230412BHJP

   A61K 31/505 20060101ALI20230412BHJP

【ＦＩ】

C07D239/48 CSP

A61P3/10

A61P3/00

A61P13/12

A61K31/505

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2022506924

(86)(22)【出願日】2020-07-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-11

(86)【国際出願番号】 US2020044394

(87)【国際公開番号】W WO2021025975

(87)【国際公開日】2021-02-11

【審査請求日】2022-02-03

(31)【優先権主張番号】19382686.4

(32)【優先日】2019-08-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】19382744.1

(32)【優先日】2019-09-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100126778

【弁理士】

【氏名又は名称】品川 永敏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(72)【発明者】

【氏名】ルエノ プラサ，セニョーラ，ヘマ

【審査官】柴田 昌弘

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２１／１６３６８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５１４３２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０７８４６８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ ２３９／４８

Ａ６１Ｐ ３／１０

Ａ６１Ｐ ３／００

Ａ６１Ｐ １３／１２

Ａ６１Ｋ ３１／５０５

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式の化合物

【化1】

［式中、
Ｒが、シクロプロピルおよびジェミナルシクロプロピルからなる群から選択される］、
またはその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

前記化合物が、

【化2】

またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記化合物が、

【化3】

またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

前記化合物が、

【化4】

またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。

【請求項6】

請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、哺乳動物における２型糖尿病の治療剤。

【請求項7】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項６に記載の治療剤。

【請求項8】

請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、哺乳動物におけるメタボリックシンドロームの治療剤。

【請求項9】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項８に記載の治療剤。

【請求項10】

請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、哺乳動物における慢性腎疾患の治療剤。

【請求項11】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１０に記載の治療剤。

【請求項12】

前記化合物が、経口投与される、請求項６～１１のいずれか一項に記載の治療剤。

【請求項13】

２型糖尿病の治療のための薬剤の製造における、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項14】

血糖値を低下させるための薬剤の製造における、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項15】

高血糖の治療のための薬剤の製造における、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項16】

慢性腎疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、ピリミジン－５－カルボキサミド化合物、その薬学的に許容される塩、薬学的組成物、および化合物の治療的使用に関する。

【0002】

ニコチンアミドＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）は、普遍的なメチル供与体Ｓ－（５’－アデノシル）－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）からニコチンアミド（ＮＡＭ）へのメチル基の転移を触媒して、１－メチルニコチンアミド（１－ＭｅＮＡＭ）の形成をもたらす酵素である。ＮＮＭＴは、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の治療のための潜在的な治療標的である。

【0003】

ＷＯ２０１８／１８３６６８は、ＮＮＭＴ阻害剤として記載されているある特定のキノリン誘導体を開示している。ＮＮＭＴの二基質小分子阻害剤についても記載されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｎ．Ｉ．；ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＮＮＭＴ）ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１９，６２，６５９７－６６１４）。ニコチンアミドの類似体もＮＮＭＴ阻害剤として報告されている（Ｒａｊａｇｏｐａｌ，Ｓ．；Ｒｕｆ，Ｓ．；ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇ ａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ”，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１８，２８，９２２－９２５、およびＤｈａｋｓｈｉｎａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｓ．；Ｋａｎｎｔ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．“Ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，８，３６６０．参照）。現在まで、治療的使用について承認されているＮＮＭＴ阻害剤は存在しない。

【0004】

代替のＮＮＭＴ阻害剤化合物およびそれを使用する治療方法が望まれる。具体的には、有効かつ経口で生物学的に利用可能なＮＮＭＴ阻害剤化合物が望まれる。

【0005】

そのために、ある実施形態では、本発明は、Ｔ２ＤＭを治療するための強力なＮＮＭＴ阻害剤である新規の化合物を提供する。

【0006】

ある実施形態では、本発明は、以下の式Ｉの化合物を提供し、

【化1】

式中、
Ｒは、シクロプロピルおよびジェミナルシクロプロピル、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される。式Ｉは、それらの全ての個々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにエナンチオマーの混合物およびラセミ体を含む。

【0007】

ある実施形態では、本発明は、以下の式Ｉａの化合物、

【化2】

またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0008】

ある実施形態では、本発明は、以下の式Ｉｂの化合物、

【化3】

またはその薬学的に許容される塩を提供する。式Ｉｂは、それらの全ての個々のエナンチオマー、ならびにエナンチオマーの混合物およびラセミ体を含む。

【0009】

別の実施形態では、本発明は、式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤のうちの少なくとも１つを含む薬学的組成物を提供する。好ましい実施形態では、薬学的に許容される組成物は、経口投与用に製剤化される。

【0010】

別の実施形態では、本発明は、Ｔ２ＤＭについて哺乳動物を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする哺乳動物に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤のうちの少なくとも１つを含む薬学的に許容される組成物を投与することを含む。一実施形態では、薬学的に許容される組成物は、経口投与用に製剤化される。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。

【0011】

別の実施形態では、本発明はまた、Ｔ２ＤＭについて哺乳動物を治療するための方法を提供し、この方法は、治療を必要とする哺乳動物に、有効量の式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。

【0012】

別の実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるメタボリックシンドロームを治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする哺乳動物に、有効量の式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。

【0013】

別の実施形態では、本発明はまた、哺乳動物における慢性腎疾患（ＣＫＤ）を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする哺乳動物に、有効量の式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。

【0014】

ある実施形態では、本発明は、療法に使用するための、式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0015】

別の実施形態では、本発明はまた、哺乳動物におけるＴ２ＤＭの治療に使用するための、式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0016】

別の実施形態では、本発明はまた、哺乳動物におけるメタボリックシンドロームの治療に使用するための、式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0017】

別の実施形態では、本発明はまた、哺乳動物におけるＣＫＤの治療に使用するための、式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0018】

ある実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＴ２ＤＭの治療のための薬剤の製造のための、式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

【0019】

ある実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるメタボリックシンドロームを治療するための薬剤の製造のための、式Ｉによる化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

【0020】

ある実施形態では、本発明はまた、哺乳動物におけるＣＫＤを治療するための薬剤の製造における、式Ｉによる化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

【0021】

好ましい実施形態では、式Ｉによる化合物は、経口投与される。別の好ましい実施形態では、治療される哺乳動物は、ヒトである。

【0022】

本明細書で使用される場合、「ジェミナル」という用語は、熟練した化学者によって認識される通常の意味を有する。すなわち、シクロプロピルの炭素は、置換点で炭素に直接結合し、結合したシクロプロピル基を形成する。

【0023】

本明細書で使用される場合、「治療している」、「治療する」、または「治療」という用語は、既存の症状、障害、または状態の進行または重症度を低下、低減、または逆転させることを指す。このような状態には、Ｔ２ＤＭおよびメタボリックシンドロームが含まれ得る。

【0024】

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、哺乳動物を指す。好ましくは、患者は、ヒトである。

【0025】

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者への単回用量または複数回用量の投与の際に、診断中または治療中の患者に所望の効果を提供する、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩の量または用量を示す。

【0026】

有効量は、既知の技法の使用によって、かつ同様の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、患者の人種；患者の大きさ、年齢、および健康状態全般；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の関与度または重症度の程度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される調製物の生物学的利用能特性；選択された投与計画；併用薬の使用；ならびに他の関連する状況を含むがこれらに限定されない、多数の要因が考慮される。

【0027】

本発明の化合物は、化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される薬学的組成物として製剤化される。好ましくは、そのような組成物は、経口投与用である。そのような薬学的組成物およびそれを調製するためのプロセスは、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．，”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２参照）。

【0028】

式Ｉの化合物は、薬学的に許容される塩に容易に変換され、薬学的に許容される塩として単離され得る。塩の形成は、薬学的に許容される酸を付加して酸付加塩を形成するとき、または薬学的に許容される塩基を付加して塩基付加塩を形成することによって行うことができる。塩はまた、窒素または酸素の脱保護、すなわち、保護基の除去時に同時に形成することができる。塩形成の例、反応、および条件は、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１－２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７－４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９，（１９７７）に見出され得る。

【0029】

ＮＮＭＴの発現および活性の増加は、メタボリックシンドローム、心血管疾患、神経変性、およびがんを含む様々な疾患の病態に関連している。特に興味深いのは、脂肪ＮＮＭＴ活性とインスリン抵抗性との間に示される相関関係である。このメカニズムは、インスリン抵抗性を改善する介入の後に脂肪ＮＮＭＴ活性が低減するため、可逆的であるように思われる（すなわち、肥満手術およびライフスタイル介入、Ｋａｎｎｔ，Ａ．；Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ａ．；Ｔｅｉｃｈｅｒｔ，Ｌ；ｅｔ ａｌ．“Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔ，１－ｍｅｔｈｙｌｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ，ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ”．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２０１５，５８，７９９－８０８参照）。マウスにおけるＮＮＭＴ遺伝子の遺伝子ノックダウンは、食餌性肥満に対する保護効果を示し、動物は、インスリン感作の増強を示し、代謝障害および２型糖尿病の治療標的としてのその潜在的な有用性を検証した（Ｋｒａｕｓ Ｄ，Ｙａｎｇ Ｑ，Ｋｏｎｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ”．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，５０８，２５８－２６２）。

【0030】

代謝障害における目的の治療標的としてのＮＮＭＴ阻害剤の追加の有用性は、ＳＡＭ利用を介した細胞のメチル化能力の調節におけるその役割である。ＮＮＭＴを介したＮＡＭのメチル化は、普遍的なメチル供与体ＳＡＭからのメチル基を利用して、ＳＡＭをその脱メチル化型のＳ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（ＳＡＨ）に変換する。ＳＡＨは、ＳＡＨをホモシステインに変換する酵素アデノシルホモシステイナーゼの基質である。ホモシステインのレベルの上昇（高ホモシステイン血症）は、慢性および末期の腎疾患患者で観察され、細胞恒常性および酸化還元の不均衡に寄与し、酸化ストレスの増加をもたらすと考えられている（Ｏｓｔｒａｋｈｏｖｉｔｃｈ，Ｅ．Ａ．；Ｔａｂｉｂｚａｄｅｈ Ｓ．“Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，７２，７７－１０６）。ＮＮＭＴ阻害を介したこれらの患者の高ホモシステイン血症の改善は、慢性腎疾患の治療のための貴重な治療メカニズムとして役立ち得る。

【0031】

本発明の化合物、またはその塩を、様々な手順によって調製してもよく、それらのいくつかを以下の調製および実施例に例示する。以下の調製および実施例における各工程の生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、および結晶化を含む、従来の方法によって回収することができる。個々の異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマーを、合成における任意の好都合な時点で、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィー（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．，”Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１およびＥ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４参照）のような方法によって分離または分解し得る。

【0032】

ある特定の略語は、以下のように定義される。「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指し、「ＮＭＰ」はＮ－メチル－２－ピロリジノンを指し、「ＲＴ」は室温を指し、「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィーを指す。

【0033】

調製１

【化4】

ＲＴでＮＭＰ（５０ｍＬ）中の２，４－ジクロロピリミジン－５－カルボキサミド（１０ｇ、５２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２７ｍＬ、１５５ｍｍｏｌ）、次に（１－アミノシクロプロピル）メタノール塩酸塩（６．９５ｇ、５６．２ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、添加中わずかな発熱を観察する（１０分以内で最大３２℃）。懸濁液を窒素下でＲＴで撹拌する。１時間１５分後、反応混合物を水および氷の混合物（５００ｍＬ）に注ぎ、１時間撹拌する。固体を濾過し、水で３回洗浄し、次に４５℃で真空オーブン内で一晩乾燥させて、表題化合物（１１．０５ｇ、８５％）をベージュ色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２４３（Ｍ＋Ｈ）。

【0034】

実施例１

【化5】

ＲＴでＮＭＰ（４５０ｍＬ）中の２－クロロ－４－［［１－（ヒドロキシメチル）シクロプロピル］アミノ］ピリミジン－５－カルボキサミド（８８．３ｇ、３４６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（１４３ｇ、１０３４ｍｍｏｌ）、次に４－フルオロ－４－メチル－ペンタン－１－アミン酢酸塩（６８．５ｇ、３８２ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を窒素下で８０℃に加熱する。２時間後、反応混合物をＲＴに冷却し、氷／水の混合物（２０００ｍＬ）に注ぐ。混合物を一晩撹拌する。固体を濾別し、水で洗浄し、４５℃で真空オーブン内で一晩乾燥させて、ベージュ色の固体を得る。固体をエタノール（８５０ｍＬ）およびヘプタン（８５０ｍＬ）と混合し、９５℃の浴を使用して溶液が得られるまで加熱し、次に混合物を一晩ゆっくりとＲＴに冷却する。混合物を氷水浴で３０分間冷却し、固体を濾過し、ヘプタンで洗浄する。固体を真空オーブン内で乾燥させる。残留エタノールを除去するために、ＥｔＯＡｃ（８５０ｍＬ）を添加し、混合物を７５℃の浴で２時間加熱する。混合物を一晩ゆっくりとＲＴに冷却する。真空中で濃縮して、混合物をその元の体積の約３分の１に低減させる。混合物にヘプタン（２５０ｍＬ）を添加し、氷水浴で３０分間撹拌する。固体を濾過し、ヘプタンで洗浄し、４５℃で真空オーブン内で２日間乾燥させて、表題化合物（７８．４ｇ、６８％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３２６（Ｍ＋Ｈ）。

【0035】

実施例２

【化6】

ＲＴでＮＭＰ（１．５ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）中の２，４－ジクロロピリミジン－５－カルボキサミド（３００ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ、２ｍｍｏｌ）、次にラセミ２－アミノ－２－シクロプロピル－エタノール（１５８ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を添加する。懸濁液を窒素下でＲＴで撹拌する。１時間後、４－フルオロ－４－メチル－ペンタン－１－アミン酢酸塩（１８６ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を窒素下で８０℃で１６時間加熱する。混合物をＲＴに冷却し、水およびＥｔＯＡｃを添加する。有機相を分離し、水および飽和水性ＮａＣｌで洗浄する。有機物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。２５～５５％のアセトニトリル／（２０ｍＭ水性ＮＨ_４ＨＣＯ_３）を使用して逆相ＨＰＬＣによって残留物を精製して、１６３ｍｇ（４０％）の表題化合物を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３４０（Ｍ＋Ｈ）。

【0036】

実施例２ａ

【化7】

ラセミ４－［（１－シクロプロピル－２－ヒドロキシ－エチル）アミノ］－２－［（４－フルオロ－４－メチル－ペンチル）アミノ］ピリミジン－５－カルボキサミド（１４８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）をキラルＳＦＣ（カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＩＧ２５×２ｃｍ、５μｍ粒径、カラム温度：４０℃、流速：６５ｍＬ／分、溶離液：３０％（イソプロパノール中の０．２％ジメチルエチルアミン）／ＣＯ_２、８分毎に１０ｍｇ注入）によって精製し、第１の溶出する異性体が、５２ｍｇの表題化合物を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３４０（Ｍ＋Ｈ）。

【0037】

実施例２ｂ

【化8】

実施例２ａについて記載したキラルＳＦＣから第２の異性体を溶出して、４９ｍｇの表題化合物を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３４０（Ｍ＋Ｈ）。

【0038】

生物学的アッセイ
生化学的ＮＮＭＴ阻害
ヒトおよびマウスのＮＮＭＴ酵素を阻害する本発明の化合物の生化学的活性を、質量分析に基づくアッセイで定量化する。試験化合物を希釈し、アッセイプレートに音響的に移し、アッセイで２％の最終ＤＭＳＯ濃度を達成する。アッセイ緩衝剤は、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５５６７－０２７）および０．０５ｍｇ／ｍＬの脂肪酸を含まないＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ６００３）を含有する。ヒトＮＮＭＴアッセイを、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｉｍｂｕｓを使用して組み立て、１０μＭのＳＡＭ（Ｓ－（５’－アデノシル）－Ｌ－メチオニン）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ０７６８）、１５μＭのＮＡＭ（ニコチンアミド）（Ｓｉｇｍａ ７２３４０）、および全長１０ｎＭのｎ末端ｈｉｓタグヒトＮＮＭＴを、希釈された試験化合物を含有するアッセイプレートへ送達する。対応するマウスＮＮＭＴアッセイは、２０μＭのＳＡＭ、２０μＭのＮＡＭ、および１０ｎＭのマウスＮＮＭＴを含む。完全な酵素活性を反映する最大対照ウェルは、試験化合物を含まないＤＭＳＯを含有する。酵素活性を反映しない最小対照ウェルは、最大対照ウェルと同一であるが、ＮＮＭＴを含まない。室温で２時間インキュベートした後、１５８．５ｎＭの^１３Ｃ－ＳＡＨ（Ｓ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（アデノシン－^１３Ｃ_１０））（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＣＬＭ－８９０６）および５０ｎＭのｄ_７－メチルニコチンアミド（ＢＤＧ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １４０１３８－２５）を内部標準として含有する６部の停止溶液で１部の反応を停止する。ＭｅＮＡＭ（１－メチルニコチンアミド）およびＳＡＨ（Ｓ－アデノシルホモシステイン）レベルは、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ質量分析によって測定され、生成物レベルを対応する内部標準レベルで割ることによって面積比に変換される。生成物面積比は、以下の方程式を使用して阻害率に変換される。阻害％＝１００－［（試験化合物－中央値最小）／（中央値最大－中央値最小）×１００］。ＩＣ_５０は、各阻害剤濃度での阻害率を、Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｒｅｌ－ＩＣ_５０を使用して以下の方程式に当てはめることにより決定され、データを、４パラメータ非線形ロジスティック方程式ｙ＝（Ａ＋（（Ｂ－Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））））を使用して分析し、式中、ｙ＝特異的阻害％、Ａ＝曲線の底部、Ｂ＝曲線の頂部、Ｃ＝相対ＩＣ_５０＝頂部から底部へのデータの範囲に基づく５０％の阻害を引き起こす濃度、Ｄ＝ヒル勾配＝曲線の勾配、である。

【0039】

本アッセイでは、実施例１は、７４ｎＭの相対ＩＣ_５０でヒトＮＮＭＴおよび２１ｎＭの相対ＩＣ_５０でマウスＮＮＭＴを阻害する。実施例２ａは、３８５ｎＭの相対ＩＣ_５０でヒトＮＭＭＴを阻害し、実施例２ｂは、５７ｎＭの相対ＩＣ_５０でヒトＮＮＭＴを阻害する。

【0040】

インビボＰＤアッセイ
Ｃ５７Ｂｌ／６オスのマウスを、食物（Ｔｅｋｌａｄ ２０１４）および水を自由に摂取できる状態で、２２℃で１２時間の明暗サイクルで維持する。２５ｍｇ／ｋｇの重水素化ニコチンアミド（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＤＬＭ－６８８３）を皮下注射する前に、３つの濃度（１、３、および１０ｍｇ／ｋｇ）の試験化合物を動物に経口投与する。血漿を、重水素化ニコチンアミド（ｄ_４－ＮＡＭ）の注射後０、６０、１２０、および２４０分で収集し、標識されたｄ_４－１－メチルニコチンアミドを、以下の方法に従ってＬＣ／ＭＳを介して定量化する。試験化合物の阻害プロファイルを、２４０分間のアッセイにおける血漿ｄ_４－１－ＭｅＮＡＭ変動域の曲線下面積（ＡＵＣ）として計算し、一元ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３）を介して統計的に試験する。得られたＡＵＣ計算は、ビヒクル対照と比較した、実施例１の投与後のマウス血漿中の血漿ｄ_４－１－ＭｅＮＡＭの用量依存的低減を示す（表１）。

【表1】

【0041】

ＮＮＭＴ反応生成物重水素化１－メチルニコチンアミドの定量化のためのＬＣ／ＭＳ方法。
５マイクロリットルのマウス血漿を、０．１％ギ酸を含む水中で１００ｎｇ／ｍＬのｄ_７－１－ＭｅＮＡＭを含有する４５マイクロリットルの内部標準溶液と混合する。次に、アセトニトリル中の２００マイクロリットルの１％水酸化アンモニウムを各試料に添加し、２７００×ｇ（４℃）で１０分間遠心分離によって回転させる。上部の液体層を、９５％水／５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）中の７２％アセトニトリルおよび２８％の２０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび１％水酸化アンモニウムから構成されるアイソクラティックＨＩＬＩＣ ＨＰＬＣ方法（Ｓｈｉｍａｄｚｕシリーズ３０ ＬＣシステムを使用）を介するＬＣ／ＭＳ分析のために除去する。カラムは、Ｗａｔｅｒｓ ｘＢｒｉｄｇｅアミド、３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ（部品番号１８６００４８５９）である。移動相の流速は、周囲の室温で０．７ｍＬ／分である。３．６分の注入サイクルを使用して、６マイクロリットルの試料を、質量分析（Ｓｃｉｅｘ ６５００三連四重極）のために注入する。非標識１－ＭｅＮＡＭについて１３７．０／９４．０、ｄ_７－１－ＭｅＮＡＭについて１４４．１／１０１．０、ｄ_４－１－ＭｅＮＡＭについて１４１．１／９８．１の遷移を使用して、ポジティブＳＲＭモードで１－ＭｅＮＡＭを検出する。分析対象物のピーク面積の決定および定量化を、Ｓｃｉｅｘ ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔバージョン２．１ソフトウェアを使用して達成する。