特許 7280949 タンパク質チロシン－チロシン類縁体およびそれを使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-16

(45)【発行日】2023-05-24

(54)【発明の名称】タンパク質チロシン－チロシン類縁体およびそれを使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/575 20060101AFI20230517BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20230517BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20230517BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230517BHJP

【ＦＩ】

C07K14/575 ZNA

A61K38/22

A61K45/00

A61K47/54

A61P3/04

A61P3/10

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021523228

(86)(22)【出願日】2019-10-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-17

(86)【国際出願番号】 US2019058259

(87)【国際公開番号】W WO2020092191

(87)【国際公開日】2020-05-07

【審査請求日】2021-04-27

(31)【優先権主張番号】62/754,244

(32)【優先日】2018-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/793,544

(32)【優先日】2019-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100103182

【弁理士】

【氏名又は名称】日野 真美

(74)【代理人】

【識別番号】100139310

【弁理士】

【氏名又は名称】吉光 真紀

(72)【発明者】

【氏名】ブリエール，ダニエル アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】ロペス，ダニエル クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】ムッピディ，アビナッシュ

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５０５２８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１９１３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５０５２２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１０８２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５２０８４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Journal of Peptide Science，2010年，Vol.16，pp.664-673

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含むペプチドチロシン－チロシン（ＰＹＹ）類縁体：

【化1】

【請求項2】

前記ＰＹＹ類縁体が、－２を超える電荷を有する、請求項１に記載のＰＹＹ類縁体。

【請求項3】

前記ＰＹＹ類縁体が、ＰＹＹ_３－３６（配列番号２）の結合親和性よりも大きいＮＰＹ２受容体での結合親和性を有する、請求項１に記載のＰＹＹ類縁体。

【請求項4】

前記ＰＹＹ類縁体が、ヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）の半減期よりも長い半減期を有する、請求項１に記載のＰＹＹ類縁体。

【請求項5】

請求項１に記載の少なくとも１つのペプチドチロシン－チロシン（ＰＹＹ）類縁体またはその塩と、
１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤と、を含む医薬組成物。

【請求項6】

追加の治療薬をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記追加の治療薬が、グルカゴン（ＧＣＧ）、ＧＣＧ類縁体、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、ＧＬＰ－１_{７－３６－アミド}、ＧＬＰ－１類縁体、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、ＧＩＰ類縁体、オキシントモジュリン（ＯＸＭ）、ＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、および三重受容体活性を有するインクレチン類縁体からなる群から選択されるインクレチンである、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記追加の治療薬がジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害剤である、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項9】

請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチドチロシン－チロシン（ＰＹＹ）類縁体またはその薬学的に許容される塩を含む、肥満の治療用医薬組成物。

【請求項10】

請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチドチロシン－チロシン（ＰＹＹ）類縁体またはその薬学的に許容される塩を含む、肥満関連の疾患または障害の治療用医薬組成物。

【請求項11】

請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチドチロシン－チロシン（ＰＹＹ）類縁体またはその薬学的に許容される塩を含む、ＩＩ型糖尿病の治療用医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、概して、生物学および医学に関連し、より具体的には、ＮＰＹ２受容体などのニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体に結合することができるペプチドチロシン－チロシン（ＰＹＹ）類縁体と並んで、それを含む組成物、ならびに肥満およびＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）などの肥満関連の疾患および障害の治療における、それらの治療的使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＰＹＹは、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）ファミリーのメンバーであり、食事（Ｔａｔｅｍｏｔｏ（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：２５１４－２５１８を参照）の後の食物摂取量およびエネルギー消費の調節に関与している。ＰＹＹは消化管のＬ細胞によって分泌され、２つの主要な内因性形態－ＰＹＹ_１－３６（配列番号１）およびＰＹＹ_３－３６（配列番号２）を有している。ＰＹＹ_１－３６は空腹時のＰＹＹ_３－３６に対して優勢であるのに対して、摂食後はＰＹＹ_３－３６がＰＹＹ_１－３６に対して優勢である。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）は、Ｐｒｏ^２－Ｉｌｅ^３結合でＰＹＹ_{１－３６を}加水分解して、ＰＹＹ_１－３６よりＮＰＹ２受容体に対してより選択的であるＰＹＹ_３－３６を生成する。

【0003】

血漿ＰＹＹ_３－３６濃度は、典型的には、食物摂取の１５分以内に増加して、６０～９０分以内にピークに達し、ベースラインに戻る前最大６時間にわたり上昇したままである（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８９：１０７０－１０７７；およびＤｅ Ｓｉｌｖａ＆Ｂｌｏｏｍ（２０１２）Ｇｕｔ Ｌｉｖｅｒ ６：１０－２０を参照）。このように、ＰＹＹ_３－３６は、その直接的な中心効果、また腸の運動性への影響（すなわち、食欲抑制効果）を介して食欲に影響を与えると考えられている。さらに、ＰＹＹ_３－３６はインスリン感受性を媒介し、それによって血糖値の低下を助けると考えられている（すなわち、その感作効果）。

【0004】

ＰＹＹ_３－３６は、その食欲抑制効果に鑑みて、体重調節のため、特に肥満およびそれに関連する疾患および障害（Ｔ２ＤＭおよび心血管疾患を含む）を治療するための潜在的な治療薬として調査されてきた（例えば、国際特許出願公開第２００２／４７７１２、およびＳｃｈｗａｒｔｚ＆Ｍｏｒｔｏｎ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１８：５９５－５９７を参照）。

【0005】

残念ながら、プロテアーゼおよび他のクリアランス機構により、外因的に投与されたＰＹＹ_３－３６は半減期が短く（例えば、約１０～１５分）（Ｌｌｕｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｒｅｖ．Ｅｓｐ．Ｆｉｓｉｏｌ．４５：３７７－３８４；およびＴｏｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３１０：Ｒ８６６－Ｒ８７４を参照）、これは治療薬として使用する際に課題を提示する。このように半減期が短いため、治療効果を発揮するために、ＰＹＹ_３－３６を少なくとも１日１回投与する必要があるが、これはそれを必要とする個体にとっては不便である。したがって、ＰＹＹ_３－３６の半減期を延長する、および／またはそのＮＰＹ２受容体の選択性を高めるための努力がなされてきた。例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．は、半減期を延長させるために９－フルオレカルボニルカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２－スルホ－９－フルオレニル－メトキシカルボニル（ＦＭＳ）のラジカルを有するＰＹＹ類縁体を記載する（国際特許出願公開第２００４／０８９２７９号を参照）。さらに、ＤｅＣａｒｒ ｅｔ ａｌ．は、半減期を増加させるためにアミノ末端結合ＰＥＧ部分を有するＰＹＹ類縁体を記載している（ＤｅＣａｒｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７：１９１６－１９１９を参照；またＯｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３２３：６９２－７００も参照）。さらに、Ｋｏｆｏｅｄ ｅｔ ａｌ．は、アルブミン結合側鎖、ＰＹＹの切断部位に近い少なくとも１つの修飾残基（例えば、目的のアミノ酸残基のＮ－メチルアミノ酸類縁体）、Ｎ－グリシン、および／または半減期を増加するためのアルギニン模倣物を有するＰＹＹ類縁体を記載している（国際特許出願公開第２０１１／０３３０６８号を参照）。

【0006】

代謝におけるＰＹＹ_３－３６の役割の理解が大幅に増加したにもかかわらず、さらなるＰＹＹ類縁体、特にＮＰＹ２受容体における効力および選択性が改善されたＰＹＹ類縁体が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記のように、治療用途のための追加のＰＹＹ類縁体が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

この必要性に対処するために、本開示は、最初に、（天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）の番号付けに関して）次の塩基アミノ酸配列を含むＰＹＹ類縁体を記載する：
^３ＰＫＰＥＸ_７ＰＸ_９Ｘ_１０ＤＡＳＰＥＥＸ_１７Ｘ_１８ＲＹＹＸ_２２Ｘ_２３ＬＲＨＹＬＮＸ_３０ＬＴＲＱＲＹ^３６（式Ｉ）、式中、Ｘ_７は、接合に利用できる官能基を持つ任意のアミノ酸であり、官能基はＣ_１６～Ｃ_２２脂肪酸に接合され、Ｘ_９はＥまたはＧであり、Ｘ_１０はＥまたはＫであり、Ｘ_１７はＬまたはＷであり、Ｘ_１８はＮまたはＱであり、Ｘ_２２はＡまたはＩであり、Ｘ_２３はＥ、ＤまたはＳであり、Ｘ_３０はＥまたはＷであり（配列番号３）、ここで、カルボキシ末端（Ｃ末端）アミノ酸はアミド化されていてもよい。
特定の例では、位置Ｘ_７で接合に利用可能な官能基を有するアミノ酸は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＫまたはＱであり得る。特定の例では、位置Ｘ_７で接合に利用可能な官能基を有するアミノ酸はＫであり、アミノ酸配列は次のいずれかとなり得る：
^３ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＡＥＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号４）、
^３ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＡＥＬＲＨＹＬＮＥＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号５）、
^３ＰＫＰＥＫＰＥＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＩＥＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号６）；
^３ＰＫＰＥＫＰＧＫＤＡＳＰＥＥＷＮＲＹＹＡＤＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号７）、または
^３ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＱＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号８）

【0009】

いくつかの例では、Ｃ_１６～Ｃ_２２脂肪酸がリンカーを介して接合に利用可能な官能基を有するアミノ酸に接合される。特定の例では、Ｃ_１６～Ｃ_２２脂肪酸は、－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ａ－ＣＯ_２Ｈの構造を有し、ここで、_ａは１６～２２の整数である。特定の例では、脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸またはエイコサン酸などのＣ_１８二酸またはＣ_２０二酸、特に飽和Ｃ_１８二酸またはＣ_２０二酸である。同様に、場合によっては、リンカーは、［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ）］－酢酸（ＡＥＥＡ）、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、グルタミン酸（Ｅ）、γ－グルタミン酸（γＥ）またはそれらの組み合わせの１つ以上の単位であり得る。

【0010】

特定の例では、ＰＹＹ類縁体は以下のいずれかであり得る：

【化1】

【化2】

【0011】

場合によっては、本明細書のＰＹＹ類縁体の塩基構造は、天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）の２つのアミノ末端（Ｎ末端）アミノ酸をさらに含むことができ、これは、その後、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＹＹ_３－３６類縁体へと処理され得る（すなわち、配列番号１のＮ末端「ＹＰ」残基は、ＰＹＹ類縁体のいずれか１つからｉｎ ｖｉｖｏで切断され得る）。

【0012】

場合によっては、ＰＹＹ類縁体の電荷は－２を超え、特に－３または－４になる。

【0013】

場合によっては、ＰＹＹ類縁体は、ヒトＮＰＹ２受容体において、ヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）の結合親和性よりも大きい、例えば、約２倍～約１０倍大きい、特に約２倍～約３倍大きい結合親和性を有する。

【0014】

場合によっては、ＰＹＹ類縁体は、ヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）よりも長い半減期、例えば、約５時間～約２４時間長い、特に約１２時間の半減期を有する。

【0015】

第２に、本明細書の少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはその薬学的に許容される塩（例えば、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩または塩酸塩）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が記載される。場合によっては、医薬組成物は、担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含むことができる。

【0016】

さらに、医薬組成物は、例えば、他の抗糖尿病薬または体重減少剤、特にインクレチンなどの追加の治療薬を含むことができる。場合によっては、インクレチンはグルカゴン（ＧＣＧ）またはＧＣＧ類縁体であり得る。他の例では、インクレチンは、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミド、またはＧＬＰ－１類縁体であり得る。他の例では、インクレチンは胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）またはＧＩＰ類縁体であり得る。他の例では、インクレチンは、オキシントモジュリン（ＯＸＭ）またはＯＸＭ類縁体、ＧＬＰ－１／ＧＣＧまたはＧＩＰ／ＧＬＰ－１などの二重受容体アゴニストであり得る。他の例では、インクレチンは、三重受容体活性を有するインクレチン類縁体（すなわち、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１およびＧＣＧのそれぞれの受容体で活性を有するインクレチン類縁体）であり得る。他の例では、追加の治療薬は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤であり得る。

【0017】

第３に、本明細書において、ＰＹＹ類縁体を使用する方法、特に肥満および肥満関連の疾患および障害（Ｔ２ＤＭなど）を治療するためにＰＹＹ類縁体を使用する方法が記載される。この方法は、少なくとも、それを必要とする個体に、本明細書に記載の有効量のＰＹＹ類縁体またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む。

【0018】

場合によっては、ＰＹＹ類縁体を個体に皮下（ＳＱ）投与することができる。同様に、場合によっては、ＰＹＹ類縁体は、毎日、隔日、週３回、週２回、週１回（すなわち、毎週）、隔週（すなわち、１週間おきに）、または毎月投与することができる。特定の例では、ＰＹＹ類縁体を、ＳＱで隔日に、ＳＱで週に３回、ＳＱで週に２回、ＳＱで週に１回、ＳＱで１週間おきに、またはＳＱで月に１回投与することができる。特定の例では、ＰＹＹ類縁体は週に１回ＳＱで（ＱＷ）投与される。

【0019】

あるいは、ＰＹＹ類縁体を個体に経口投与することができる。上記のように、ＰＹＹ類縁体は、毎日、隔日、週３回、週２回、週１回（すなわち、毎週）、隔週（すなわち、１週間おきに）、または毎月投与することができる。特定の例では、ＰＹＹ類縁体を、経口で隔日に、経口で週に３回、経口で週に２回、経口で週に１回、経口で１週間おきに、または経口で月に１回投与することができる。特定の例では、ＰＹＹ類縁体は週に１回経口投与される。

【0020】

該方法はまた、有効量のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤またはインクレチンなどの追加の治療薬（例えば、ＧＣＧもしくはＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミドもしくはＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰもしくはＧＩＰ類縁体、ＯＸＭもしくはＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、または三重受容体活性を有するインクレチン）と組み合わせて、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体を投与することを含み得る。ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤またはインクレチンは、ＰＹＹ類縁体と同時に、別々に、または順次に投与することができる。

【0021】

場合によっては、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤またはインクレチンをＰＹＹ類縁体と同じ頻度で（すなわち、隔日、週に２回、または週に１回）投与することができる。他の例では、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤またはインクレチンはＰＹＹ類縁体とは異なる頻度で投与される。他の例では、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤またはインクレチンはＱＷで投与される。さらに他の例では、ＰＹＹ類縁体をＳＱで投与し、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤またはインクレチンを経口投与することができる。

【0022】

場合によっては、個体は肥満または太りすぎである。他の例では、個体は糖尿病（ＰｗＤ）、特にＴ２ＤＭの人である。特定の例では、個体はＴ２ＤＭで肥満であるか、Ｔ２ＤＭで太りすぎである。

【0023】

該方法はまた、個体の体重および／または血糖および／またはヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を測定または取得し、そのような得られた値を１つ以上のベースライン値または以前に得られた値と比較して治療の有効性を評価するなどの工程を含み得る。

【0024】

これらの方法はまた、食餌療法および運動と組み合わせることができ、および／または上記で論じたもの以外の追加の治療薬と組み合わせることができる。

【0025】

第４に、ＰＹＹ類縁体に関して、肥満、ならびにＴ２ＤＭなどの肥満関連の疾患および障害の治療における使用が本明細書において記載され、これは、任意に、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤および／またはＧＣＧもしくはＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミドもしくはＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰもしくはＧＩＰ類縁体、ＯＸＭもしくはＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、またはさらには三重受容体活性を有するインクレチンなどのインクレチンと同時に、別々にまたは順次に（すなわち、組み合わせて）投与され得る。

【0026】

第５に、ＰＹＹ類縁体に関して、肥満、ならびにＴ２ＤＭなどの肥満関連の疾患および障害の治療用薬剤の製造における使用が本明細書において記載され、この場合、該薬剤は、任意に、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤および／またはＧＣＧもしくはＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミドもしくはＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰもしくはＧＩＰ類縁体、ＯＸＭもしくはＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、またはさらには三重受容体活性を有するインクレチンなどのインクレチンをさらに含み得る。

【発明の効果】

【0027】

本明細書におけるＰＹＹ類縁体の１つの利点は、それらが体重減少を促進することができるだけでなく、グルコースを低下させることもできることである。このようにして、個体、特にＴ２ＤＭに罹患しやすい、またはＴ２ＤＭを罹患している個体は、外因性インスリンへの進行を遅らせることができ、標的とするＨｂＡ１ｃの目標を維持することができる。さらに、本明細書のＰＹＹ類縁体は、インスリン感作を改善することによって血糖コントロールを強化することができる。合わせると、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１とＰＹＹ類縁体は、グルコース制御（インクレチン＋潜在的なインスリン感作物質）と体重減少（相乗的）の両方に使用できる。特に、本明細書のＰＹＹ類縁体は、それを必要とする個体に投与した場合、単独で最大約１２％の体重減少を引き起こすことができ、それを必要とする個体に投与した場合、インクレチンなどの追加の治療薬に関連して最大約２５％の体重減少を引き起こすことができる。

【0028】

本明細書におけるＰＹＹ類縁体の別の利点は、それらが最大約２４時間の半減期を有することができ、それにより週に１回の投与を可能にすることである。

【0029】

本明細書におけるＰＹＹ類縁体の別の利点は、天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）と比較した場合に物理化学的安定性および適合性が高められ、天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）と比較した場合にインクレチンを含む製剤における適合性が高められたことである。

【発明を実施するための形態】

【0030】

別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、ＰＹＹ類縁体、医薬組成物、および方法の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料は、本明細書に記載されている。

【0031】

また、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈が１つおよび１つのみの要素があることを明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。

【0032】

定義

【0033】

本明細書で使用される場合、「約」は、例えば、明記された濃度、長さ、分子量、ｐＨ、配列同一性、時間枠、温度、体積などの値（複数の場合がある）の統計学的に意味のある範囲内を意味する。このような値または範囲は、所定の値または範囲の典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、さらにより典型的には５％以内の大きさの範囲内であり得る。「約」によって包含される許容される変動は、研究での特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。

【0034】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、化学的観点から、１つ以上のアミン基および１つ以上のカルボン酸基の存在を特徴とし、他の官能基を含み得る分子を意味する。当該技術分野で知られているように、標準アミノ酸として指定され、あらゆる生物によって産生されるほとんどのペプチド／タンパク質の構成要素として使用される２０個のアミノ酸のセットが存在する。

【0035】

本明細書で使用される場合、「接合に利用可能な官能基を有するアミノ酸」とは、例えば、リンカーによって脂肪酸に接合され得る官能基を有する任意の天然または非天然アミノ酸を意味する。そのような官能基の例としては、アルキニル基、アルケニル基、アミノ基、アジド基、ブロモ基、カルボキシル基、クロロ基、ヨード基、およびチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、そのような官能基を含む天然アミノ酸の例としては、Ｃ（チオール）、Ｄ（カルボキシル）、Ｅ（カルボキシル）、Ｋ（アミノ）およびＱ（アミド）が挙げられる。

【0036】

本明細書で使用される場合、「類縁体」は、標的受容体を活性化し、その受容体の天然アゴニストによって誘発される少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を誘発する、合成のペプチドまたはポリペプチドなどの化合物を意味する。

【0037】

本明細書で使用される場合、「食欲抑制効果」は、食欲を減少させ、結果として食物摂取量を低下させ、最終的に体重減少をもたらす、本明細書のＰＹＹ類縁体の能力を意味する。食欲抑制効果はまた、腸の運動性を増加させる本明細書のＰＹＹ類縁体の能力を指す場合もある。

【0038】

本明細書で使用される場合、「Ｃ_１６～Ｃ_２２脂肪酸」とは、１６～２２個の炭素原子を有するカルボン酸を意味する。本明細書での使用に好適なＣ_１６～Ｃ_２２脂肪酸は、飽和一酸または飽和二酸であり得る（「二酸」は、各末端にカルボキシル基を有する）。

【0039】

本明細書で使用される場合、「ＡＵＣ」は、曲線下面積を意味する。

【0040】

本明細書で使用される場合、「有効量」は、それを必要とする個体への単回または複数回投与により、診断または治療中のそのような個体において所望の効果（すなわち、例えば、血糖の低下、ＨｂＡ１ｃの低下、および／または体重もしくは体脂肪の低下など、個体の状態に臨床的に測定可能な差異を生じさせ得る）を提供する、本明細書の１つ以上のＰＹＹ類縁体、またはその薬学的に許容される塩の量、濃度または用量を意味する。有効量は、既知の手法の使用によって、および同様の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により容易に決定されることができる。個体についての有効量を決定する際には、哺乳動物の種、そのサイズ、年齢、および全身の健康状態、関与する特定の疾患または障害、疾患または障害の関与の程度または重症度、個体の応答、投与される特定のＰＹＹ類縁体、投与の様式、投与される調製物の生物学的利用能の特性、選択される投薬レジメン、併用薬の使用、ならびに他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の因子が考慮される。

【0041】

本明細書で使用される場合、「半数効果濃度」または「ＥＣ_５０」は、用量反応曲線（例えば、ｃＡＭＰ）などのアッセイエンドポイントの５０％の活性化／刺激をもたらす化合物の濃度を意味する。

【0042】

本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」は、本明細書の少なくとも１つのＰＹＹ類縁体を、１つ以上の追加の治療薬と同時に、順次に、または１つ以上の追加の治療薬と組み合わせた単一の製剤で投与することを意味する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「インクレチン類縁体」は、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、ＧＣＧおよびＯＸＭ、特に天然のヒトＧＩＰ、ＧＬＰ－１、ＧＣＧおよびＯＸＭのそれぞれと構造的類似性を有するが、それらとは複数の違いを有するペプチドまたはポリペプチドを意味する。いくつかのインクレチン類縁体はまた、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１およびＧＣＧ受容体の２つまたはさらにはそれぞれにおいて親和性および活性を有する（すなわち、ＯＸＭ、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１もしくはＧＬＰ－１／ＧＣＧなどの２つの受容体でのアゴニスト活性、またはさらには３つすべての受容体でのアゴニスト活性）。

【0044】

本明細書で使用する場合、「それを必要とする個体」とは、例えば、本明細書に列挙されるものを含む、治療または治療法を必要とする状態、疾患、障害、または症状を有する、ヒトなどの哺乳動物を意味する。特に、治療される好ましい個体はヒトである。

【0045】

本明細書で使用される場合、「長時間作用型」は、本明細書でのＰＹＹ類縁体の結合親和性および活性が、天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）および／または天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）よりも長い期間継続することを意味し、少なくとも１日１回またはさらには週３回、週２回、週１回、もしくは月１回と同じくらいの頻度で投与することを可能にする。本明細書でのＰＹＹ類縁体の時間作用プロファイルは、以下の実施例で利用されるものなどの既知の薬物動態試験方法を使用して測定され得る。

【0046】

本明細書で使用される場合、「非標準アミノ酸」は、細胞内で自然に発生し得るが、ペプチド合成には関与しないアミノ酸を意味する。非標準アミノ酸はペプチドの構成要素である可能性があり、多くの場合、ペプチド内の標準アミノ酸の修飾によって（すなわち、翻訳後修飾を介して）生成される。非標準アミノ酸には、上記の標準アミノ酸とは反対の絶対キラリティーを有するＤ－アミノ酸が含まれる場合がある。

【0047】

本明細書で使用される場合、「太りすぎ」または「肥満」は、その個体が３０．０ｋｇ／ｍ^２超であるボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）を有する状態を意味する。一般には、ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｏｂｅｓｉｔｙ／ａｄｕｌｔ／ｄｅｆｉｎｉｎｇ．ｈｔｍｌで利用可能な疾病管理予防センターによる「Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ＆Ｏｂｅｓｉｔｙ」；およびｉｄｄｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｗｅｉｇｈｔ－ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ／ａｄｕｌｔ－ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ－ｏｂｅｓｉｔｙ／ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ－ｆａｃｔｓにある米国国立衛生研究所による「Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ＆Ｆａｃｔｓ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔ Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ＆Ｏｂｅｓｉｔｙ」を参照。

【0048】

本明細書で使用される場合、「肥満関連の疾患または障害」は、狭心症、心血管疾患、胆嚢炎、胆石症、うっ血性心不全、脂質異常症、脂肪性肝疾患、不妊の合併症、耐糖能異常、痛風、高血圧、甲状腺機能低下症、高インスリン血症、インスリン抵抗性、骨関節炎、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、妊娠合併症、精神障害、睡眠時無呼吸およびその他の呼吸器系の問題、腹圧性尿失禁、脳卒中、Ｔ２ＤＭ、尿酸腎結石症（腎臓結石）、ならびに乳房、結腸、子宮内膜、食道、胆嚢、腎臓、前立腺および直腸の癌などを含むがこれらに限定されない、肥満によって誘発／悪化される疾患または障害を意味する。

【0049】

本明細書で使用する場合、「過体重」は、個体が２５．０ｋｇ／ｍ^２から３０ｋｇ／ｍ^２未満程度であるＢＭＩを有する状態を意味する。ｉｄを参照。

【0050】

本明細書で使用される場合、「ＰＹＹ」は、哺乳動物種、特にヒトなどの任意の種から得られた、またはそれに由来するペプチドＹＹを意味する。ＰＹＹは、天然ＰＹＹ（すなわち、全長）およびそのバリエーション（すなわち、天然ＰＹＹの付加、欠失、および／または置換）の両方を含む。特定のＰＹＹには、天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）および天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）が含まれるが、これらに限定されない。

【0051】

本明細書で使用される場合、「ＰＹＹ類縁体」（単数または複数）は、ＮＰＹ２受容体などの１つ以上のＮＰＹ受容体において天然ＰＹＹの１つ以上の効果を誘発するＰＹＹ様ペプチドまたはポリペプチドを意味する。いくつかの例では、本明細書のＰＹＹ類縁体は、ＮＰＹ受容体、特にヒトＮＰＹ２受容体に対してより高いまたは低い親和性で結合することができるが、天然ＰＹＹ、特に天然ヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）および天然ヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）などのヒトＰＹＹと比較した場合、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてより長い半減期を示すことができる。このように、本明細書のＰＹＹ類縁体は、ＮＰＹ２受容体アゴニストとして作用する合成化合物である。

【0052】

本明細書で使用される場合、「飽和」とは、脂肪酸が炭素－炭素二重結合または三重結合を含まないことを意味する。

【0053】

本明細書で使用される場合、「感作効果」は、インスリンの効果を増加させ、それによって血糖を低下させるのを助ける本明細書のＰＹＹ類縁体の能力を意味する。

【0054】

本明細書で使用される場合、「治療する、治療すること」または「治療すること、治療するため」とは、既存の状態、疾患、障害または症状の進行または重症度を軽減、抑制、逆転、減速または停止することを意味する。

【0055】

特定の略語は次のように定義される：「ＡＣＲ」は尿中アルブミン／尿中クレアチニン比を指す；「ａｍｕ」は原子質量単位を指す；「ｔＢｏｃ」はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルを指す；「ｃＡＭＰ」はサイクリックアデノシン一リン酸を指す；「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指す；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指す；「ＥＩＡ／ＲＩＡ」とは、酵素イムノアッセイ／ラジオイムノアッセイを指す；「ｈｒ」は時間を指す；「ＨＴＲＦ」は、ホモジナス時間分解蛍光を指す；「ＩＶ」は静脈内を指す；「ｋＤａ」はキロダルトンを指す；「ＬＣ－ＭＳ」は液体クロマトグラフィー－質量分析を指す；「ＭＳ」は質量分析を指す；「ＯｔＢｕ」はＯ－ｔｅｒｔ－ブチルを指す；「Ｐｂｆ」は、ＮＧ－２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニルを指す；「ＲＰ－ＨＰＬＣ」とは、逆相高速液体クロマトグラフィーを指す；「ＳＱ」は皮下を指す；「ＳＥＭ」は平均の標準誤差を指す；「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指す；「Ｔｒｔ」はトリチルを指す。

【0056】

ＰＹＹ類縁体

【0057】

本明細書のＰＹＹ類縁体は、天然のＰＹＹペプチドと構造的に類似しているが、多くの構造上の違いがある。例えば、天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）および／または天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）と比較した場合、本明細書に記載のＰＹＹ類縁体は、天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）の番号付けに関して３位、７位、９位、１０位、１７位、１８位、２２位、２３位、３０位および３１位の１つ以上における修飾を含む。特定の例では、本明細書におけるＰＹＹ類縁体の例示的なアミノ酸配列には、以下が含まれる（天然のヒトＰＹＹ（配列番号１）の対応する残基に対する特定の変化は太字で示されている）：
^３ＰＫＰＥＸ_７ＰＸ_９Ｘ_１０ＤＡＳＰＥＥＸ_１７Ｘ_１８ＲＹＹＸ_２２Ｘ_２３ＬＲＨＹＬＮＸ_３０ＬＴＲＱＲＰＹ^３６（配列番号３）
^３ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＡＥＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号４）、
^３ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＡＥＬＲＨＹＬＮＥＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号５）、
^３ＰＫＰＥＫＰＥＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＩＥＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号６）、
^３ＰＫＰＥＫＰＧＫＤＡＳＰＥＥＷＮＲＹＹＡＤＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号７）、および
^３ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＱＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ^３６（配列番号８）。

【0058】

本明細書のＰＹＹ類縁体は、ヒトＮＰＹ２受容体では十分な活性をもたらすが、ＮＰＹ１、ＮＰＹ４およびＮＰＹ５受容体では活性が不十分である。同様に、本明細書のＰＹＹ類縁体は、水溶液への溶解性の改善、化学的および物理的製剤の安定性の改善、薬物動態プロファイルの拡張、および免疫原性の可能性の最小化を含む、治療的処置としてのそれらの開発可能性に関連する有益な属性を有する。

【0059】

場合によっては、本明細書のＰＹＹ類縁体は、安定性に影響を与えるためにＣ末端アミノ酸でアミド化されている。本明細書に記載される変化に加えて、類縁体は、類縁体がヒトＮＰＹ２受容体に結合し、これを活性化することができるままであるという条件で、１つ以上の追加のアミノ酸修飾を含み得る。

【0060】

本明細書のＰＹＹ類縁体は、例えば、リンカーによって、接合に利用可能な官能基を有する天然または非天然アミノ酸に接合された（すなわち、「アシル化」）脂肪酸をさらに含む。場合によっては、接合に利用可能な官能基を有するアミノ酸は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＱであり得る。特定の例では、接合に利用可能な官能基を有するアミノ酸は、Ｋであり、ここで、接合は、Ｋ側鎖のε－アミノ基に対するものである。

【0061】

ここで、ＰＹＹ類縁体のアシル化は、天然のヒトＰＹＹ_１～３６（配列番号１）と比較した場合、７位にある。このようにして、脂肪酸は、より長時間作用する類縁体を提供するためのアルブミン結合剤として作用することができる。

【0062】

脂肪酸に関しては、直接結合またはリンカーのいずれかによって、接合に利用可能なアミノ酸の官能基に化学的に接合させることができる。脂肪酸の長さおよび組成は、ＰＹＹ類縁体の半減期、ＰＹＹ類縁体のｉｎ ｖｉｖｏでの効力、ならびにＰＹＹ類縁体の溶解性および安定性に影響を与える。Ｃ_１６～Ｃ_２２飽和脂肪一酸または二酸への接合は、望ましい半減期、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおける望ましい効力、ならびに望ましい可溶性および安定性の特性を示すＰＹＹ類縁体をもたらす。

【0063】

本明細書の使用のための例示的な飽和Ｃ_１６～Ｃ_２２脂肪酸としては、ヘキサデカン酸（すなわち、パルミチン酸、Ｃ_１６一酸）、ヘキサデカン酸（Ｃ_１６二酸）、ヘプタデカン酸（すなわち、マルガリン酸、Ｃ_１７一酸）、ヘプタデカン二酸（Ｃ_１７二酸）、ステアリン酸（Ｃ_１８一酸）、オクタデカン二酸（Ｃ_１８二酸）、ノナデシル酸（すなわち、ノナデカン酸、Ｃ_１９一酸）、ノナデカン二酸（Ｃ_１９二酸）、エイコサン酸（すなわち、アラキドン酸（ａｒａｃｈａｄｉｃ ａｃｉｄ）、Ｃ_２０一酸）、エイコサン酸（Ｃ_２０二酸）、ヘンエイコサン酸（すなわち、ヘンイコシル酸、Ｃ_２１一酸）、ヘンエイコサン二酸（Ｃ_２１二酸）、ドコサン酸（すなわち、ベヘン酸、Ｃ_２２一酸）、ドコサン二酸（Ｃ_２２二酸）、ならびにそれらの分岐および置換誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、Ｃ_１６～Ｃ_２２脂肪酸は、飽和Ｃ_１８一酸、飽和Ｃ_１８二酸、飽和Ｃ_１９一酸、飽和Ｃ_１９二酸、飽和Ｃ_２０一酸、飽和Ｃ_２０二酸、ならびにそれらの分岐および置換誘導体であり得る。特定の例では、Ｃ_１６～Ｃ_２２脂肪酸は、パルミチン酸またはヘキサデカン酸（ｈｅｘａｄｅｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸もしくはオクタデカン酸（ｏｃｔａｄｅｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、またはアラキジン酸もしくはエイコサン酸であり得る。

【0064】

脂肪酸を、接合に利用可能な官能基を有する天然または非天然アミノ酸に接合させるのを助けるために、本明細書のＰＹＹ類縁体はリンカーを含むことができる。場合によっては、リンカーは、ＡＥＥＡ、Ａｈｘ、ＥまたはγＥのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの組み合わせであり得る。

【0065】

リンカーがアミノ酸を含む場合、１～４個のＥまたはγＥアミノ酸残基を持つことができる。場合によっては、リンカーは、１つまたは２つのＥおよび／またはγＥアミノ酸残基を含むことができる。例えば、リンカーは、１つまたは２つのＥおよび／またはγＥのいずれかのアミノ酸残基を含むことができる。他の例では、リンカーは、ＡＥＥＡまたはＡｈｘと組み合わせて使用される１～４個のアミノ酸残基（例えば、ＥまたはγＥアミノ酸など）を含むことができる。具体的には、リンカーは、ＥおよびγＥアミノ酸残基とＡＥＥＡまたはＡｈｘとの組み合わせであり得る。さらに他の例では、リンカーは、１つまたは２つのγＥアミノ酸残基と１つまたは２つのＡＥＥＡまたはＡｈｘとの組み合わせであり得る。特定の例では、リンカーは、（ＡＥＥＡ）_２・γＥ部分、Ａｈｘ・Ｅ・γＥ部分、またはＡＥＥＡ・γＥ部分であり得る。

【0066】

例示的なリンカー脂肪酸部分としては_、（ＡＥＥＡ）_２・γＥ・Ｃ_２０二酸、Ａｈｘ・Ｅ・γＥ・Ｃ_１８二酸、またはＡＥＥＡ・γＥ・Ｃ_１８二酸が挙げられる。天然ヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）または天然ヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）と比較した場合、これらのリンカー脂肪酸部分の構造的特徴は、改善された半減期を有する類縁体を生じる。

【0067】

まとめると、例示的なＰＹＹ類縁体は次の通りである：

【化3】

【化4】

【0068】

ＰＹＹ類縁体は、天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）のものと同様の３４個のアミノ酸を有すると記載されているが、本明細書のＰＹＹ類縁体は、天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）に基づくアミノ酸配列を有し得ることが企図される。すなわち、ＰＹＹ類縁体は、天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）の２つのＮ末端アミノ酸（すなわち、配列番号１の１位および２位の「ＹＰ」残基）を含むことができ、これは、その後、天然のヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）が内因的に放出されるときに起こるように、個体に投与されるとｉｎ ｖｉｖｏで切断され得る。

【0069】

本明細書のＰＹＹ類縁体の半減期は、例えば、以下の実施例に記載されるものを含む、当該技術分野で知られている手法を使用して測定することができる。同様に、さまざまなヒトＮＰＹ受容体（例えば、ＮＰＹ２Ｒ、ＮＰＹ５Ｒ）のそれぞれに対する本明細書のＰＹＹ類縁体の親和性は、例えば、以下の実施例に記載されるものを含む、受容体結合レベルを測定するための当該技術分野で知られる手法を使用して測定され得て、一般的には阻害定数（Ｋ_ｉ）値として表される。さらに、受容体の各々での本明細書に記載されるＰＹＹ類縁体の活性はまた、例えば、以下に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイを含む、当該技術分野で知られる手法を使用して測定され得て、一般的にはＥＣ_５０値として表される。

【0070】

上記の修飾の結果として、本明細書のＰＹＹ類縁体は、天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）の半減期よりも長い半減期を有する。例えば、ＰＹＹ類縁体は、約５時間～約２４時間、約６時間～約２３時間、約７時間～約２２時間、約８時間～約２１時間、約９時間～約２０時間、約１０時間～約１９時間、約１１時間～約１８時間、約１２時間～約１７時間、約１３時間～約１６時間、またはさらには約１４時間～約１５時間の半減期を有することができる。あるいは、本明細書のＰＰＹ類縁体は、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、さらには約２４時間、特に約１２時間である半減期を有し得る。

【0071】

同様に、本明細書のＰＹＹ類縁体は、ＮＰＹ２受容体において、天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）の結合親和性よりも大きい、例えば、約２倍～約１０倍の結合親和性を有する。あるいは、本明細書のＰＹＹ類縁体は、天然ヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）よりも最大約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍約、またはさらには１０倍大きい、特に２倍～３倍大きい結合親和性を有することができる。

【0072】

医薬組成物

【0073】

本明細書に記載されるＰＹＹ類縁体を、非経口経路（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または経皮）によって投与することができる医薬組成物として配合することができる。そのような医薬組成物およびそれを調製するための手法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，「Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ ｅｄ．，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）を参照されたい。特定の例では、ＰＹＹ類縁体はＳＱで投与される。しかしながら、代替的には、ＰＹＹ類縁体は、例えば、錠剤または経口投与のための他の固体；徐放性カプセル；およびクリーム、ローション、吸入剤などを含む現在使用されている任意のその他の形態などの他の薬学的に許容される経路のための形態で製剤化され得る。

【0074】

それらのｉｎ ｖｉｖｏ適合性および有効性を改善するため、本明細書のＰＹＹ類縁体は、いくつかの無機および有機酸／塩基のいずれかと反応して、薬学的に許容される酸／塩基付加塩を形成し得る。薬学的に許容される塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，」２^ｎｄ Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２０１１）を参照）。本明細書での使用のための薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、および／または酢酸塩が挙げられる。

【0075】

本明細書のＰＹＹ類縁体は、医師によって投与されるか、または注射を使用して自己投与され得る。ゲージサイズおよび注入量は、当業者によって容易に決定され得ることが理解される。ただし、注入量は約２ｍＬ以下、さらには約１ｍＬ以下であり、ニードルゲージは約２７Ｇ以上または約２９Ｇ以上であり得る。

【0076】

本開示はまた、本明細書に記載されるＰＹＹ類縁体、またはその薬学的に許容される塩を合成する新規な中間体および方法を提供し、したがってこれらを包含する。本明細書の中間体およびＰＹＹ類縁体は、当該技術分野でよく知られているさまざまな方法論によって調製することができる。例えば、化学合成を使用する方法は、以下の実施例に例示される。本明細書に記載されるＰＹＹ類縁体を調製するために、記載される経路の各々についての具体的な合成工程を種々の方法で組み合わせることができる。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。

【0077】

本明細書に記載される特定のＰＹＹ類縁体は、一般に、広い投与量範囲にわたって有効である。本明細書のＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物の例示的な用量は、個体１キログラム（ｋｇ）あたりのミリグラム（ｍｇ）、マイクログラム（μｇ）、ナノグラム（ｎｇ）またはピクログラム（ｐｇ：ｐｉｃｒｏｇｒａｍ）の量であり得る。このようにして、１日用量は約１μｇ～約１００ｍｇとなり得る。

【0078】

ここで、医薬組成物中のＰＹＹ類縁体の有効量は、約０．２５ｍｇ～約５．０ｍｇの用量であり得る。ただし、当業者は、場合によっては、有効量（すなわち、用量／投薬量）が前述の範囲の下限を下回ってかつ十分すぎる可能性があるのに対し、他の場合には、有効量は、より多くの用量となり得てかつ許容できる副作用を伴って使用され得ることを理解している。

【0079】

ＰＹＹ類縁体に加えて、医薬組成物はまた、追加の治療薬、特に他の抗糖尿病薬または減量剤を含むことができる。場合によっては、追加の治療薬は、インクレチンまたはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤のうちの少なくとも１つであり得る。例示的なインクレチンとしては、ＧＣＧ、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミド、ＧＩＰ、ＯＸＭ、ＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰ類縁体、ＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、または三重受容体活性を有するインクレチン類縁体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0080】

このように、医薬組成物は、有効量の配列番号９のＰＹＹ類縁体およびインクレチンもしくはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、有効量の配列番号１０のＰＹＹ類縁体およびインクレチンもしくはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、有効量の配列番号１１のＰＹＹ類縁体およびインクレチンもしくはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、有効量の配列番号１２のＰＹＹ類縁体およびインクレチンもしくはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、または有効量の配列番号１３のＰＹＹ類縁体およびインクレチンもしくはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含むことができる。

【0081】

インクレチンがＧＬＰ－１またはＧＬＰ－１類縁体である場合、それは、アルビグルチド、デュラグルチド、リラグルチド、セマグルチド、またはそれらの組み合わせなどのＧＬＰ－１またはＧＬＰ－１類縁体、特にデュラグルチドであり得る。

【0082】

ＰＹＹ類縁体の作製および使用方法

【0083】

本明細書のＰＹＹ類縁体は、標準的な手動または自動化された固相合成手順を使用して、当該技術分野で知られている任意の数のペプチド合成方法を介して合成することができる。自動ペプチド合成装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（アリゾナ州ツーソン）から市販されている。固相合成用の試薬は、商業的供給源から容易に入手できる。固相合成装置を、干渉基のブロック、反応中のアミノ酸の保護、カップリング、脱保護、および未反応のアミノ酸のキャッピングに関する製造業者の指示に従って使用することができる。

【0084】

通常、Ｎ－α－カルバモイルで保護されたアミノ酸と、樹脂に結合した成長中のペプチド鎖のＮ末端アミノ酸は、ＤＭＦ、Ｎ－メチルピロリドン、塩化メチレンなどの不活性溶媒中において、ジイソプロピル１－カルボジイミドや１－ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのカップリング剤の合成存在下で、室温でカップリングされる。得られたペプチド樹脂からＴＦＡまたはピペリジンなどの試薬を用いてＮ－α－カルバモイル保護基を除去し、ペプチド鎖に付加するために次に必要なＮ－α保護アミノ酸を用いてカップリング反応を繰り返す。適切なアミン保護基は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｗｕｔｓ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。最も一般的に使用される例としては、ｔＢｏｃおよびＦｍｏｃが挙げられる。合成の完了後、ペプチドは、酸性条件下で標準的な処理方法を使用して、同時の側鎖の脱保護により固相支持体から切断される。

【0085】

当業者は、本明細書に記載のペプチド鎖がＣ末端カルボキサミドで合成されることを理解するであろう。Ｃ末端アミドペプチドの合成では、典型的には、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡまたはＲｉｎｋアミドＡＭリンカーが組み込まれた樹脂がＦｍｏｃ合成で使用されるが、ＭＢＨＡ樹脂は一般にｔＢｏｃ合成で使用される。

【0086】

通常、Ｃ８またはＣ１８カラムでＲＰ－ＨＰＬＣを使用し、０．０５％～０．１％ＴＦＡの水－アセトニトリル勾配を使用して粗ペプチドを精製する。純度は分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで確認できる。ペプチドの同一性はＭＳによって確認できる。ペプチドは、広いｐＨ範囲で水性緩衝液に可溶化できる。

【0087】

本明細書におけるＰＹＹ類縁体の１つの使用は、個体、特に太りすぎまたは肥満でＴ２ＤＭを罹患している個体の血糖および／または体重を減少させるためのものである。本明細書に記載されるようにＰＹＹ類縁体を投与することは、インスリン感作および体重減少を改善することによって血糖コントロールをもたらすことができる。このように、本明細書のＰＹＹ類縁体は、個体がインスリンへの進行することを遅らせ、標的ＨｂＡ１ｃ目標を維持することができるように、体重減少のさらなる利点とともにグルコース低下効果を示す。

【0088】

これらの方法は、本明細書に記載の工程を含むことができ、これらは、必ずしもではないが、記載された順序で実行され得る。しかしながら、他の順序も考えられる。さらに、個々のまたは複数の工程は、時間的に並行しておよび／または重複して、および／または個別に、または複数回繰り返される工程で実施され得る。さらに、これらの方法は、追加の不特定の工程を含み得る。

【0089】

したがって、そのような方法には、太りすぎでＴ２ＤＭを罹患している、またはその素因がある個体を選択することが含まれ得る。あるいは、該方法は、肥満であり、Ｔ２ＤＭを有するか、または同じ素因を有する個体を選択することを含み得る。

【0090】

該方法はまた、本明細書に記載されるような医薬組成物の形態であり得る、本明細書に記載されるような有効量の少なくとも１つのＰＹＹ類縁体を個体に投与することを含み得る。場合によっては、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体／医薬組成物は、インクレチンまたはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤などの追加の治療薬を含むことができる。

【0091】

少なくとも１つのＰＹＹ類縁体および任意のインクレチンまたはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の濃度／用量／投薬量は、本明細書の他の場所で論じられている。

【0092】

投与経路に関して、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物は、例えば、経口；注射（すなわち、動脈内、静脈内、腹腔内、脳内、脳室内、筋肉内、眼内、門脈内または病変内）；徐放システム、または埋め込みデバイスなどによる既知の方法に従って投与することができる。特定の例において、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物は、ボーラス注射によってまたは連続的にＳＱ投与することができる。

【0093】

投薬頻度に関して、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物は、毎日、隔日、週に３回、週に２回、週に１回（すなわち、毎週）、隔週（すなわち、１週間おきに）、または毎月投与することができる。特定の例において、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物は、ＳＱで１日おきに、ＳＱで週に３回、ＳＱで週に２回、ＳＱで週に１回、ＳＱで１週間おきに、またはＳＱで毎月投与される。特定の例において、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物は、週に１回ＳＱ投与（ＱＷ）される。

【0094】

あるいは、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物を経口投与することができる。上記のように、また投薬頻度に関して、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物は、毎日、隔日、週に３回、週に２回、週に１回（すなわち、毎週）、隔週（すなわち、１週間おきに）、または毎月投与することができる。特定の例では、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物は、経口で１日おきに、経口で週に３回、経口で週に２回、経口で週に１回、または経口で１週間おきに投与される。特定の例では、ＰＹＹ類縁体は週に１回経口投与される。

【0095】

少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物が有効量のインクレチンと組み合わせて投与される場合に関して、インクレチンは、ＧＣＧもしくはＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７）－３６）_アミドもしくはＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰもしくはＧＩＰ類縁体、ＯＸＭもしくはＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、またはさらには三重受容体活性を有するインクレチンであり得る。ＧＣＧ、ＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミド、ＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰ、ＧＩＰ類縁体、ＯＸＭ、ＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、またはインクレチン三重受容体活性は、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物とともに、同時に、別々に、または順次に投与することができる。

【0096】

さらに、ＧＣＧ、ＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミド、ＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰ、ＧＩＰ類縁体、ＯＸＭ、ＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、または三重受容体活性を有するインクレチンは、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物と同じ頻度で（すなわち、隔日、週に２回、またはさらには毎週）投与することができる。あるいは、ＧＣＧ、ＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミド、ＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰ、ＧＩＰ類縁体、ＯＸＭ、ＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、または三重受容体活性を有するインクレチンは、少なくとも１つのＰＹＹ類縁体またはそれを含む医薬組成物とは異なる頻度で投与することができる。他の例では、ＧＣＧ、ＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミド、ＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰ、ＧＩＰ類縁体、ＯＸＭ、ＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、または三重受容体活性を有するインクレチンはＱＷで投与される。さらに他の例では、ＰＹＹ類縁体はＳＱで投与され、ＧＣＧ、ＧＣＧ類縁体、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１（７－３６）_アミド、ＧＬＰ－１類縁体、ＧＩＰ、ＧＩＰ類縁体、ＯＸＭ、ＯＸＭ類縁体、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１／ＧＣＧ、または三重受容体活性を有するインクレチンは、経口投与され得る。

【0097】

この方法は、食事療法および運動と組み合わせることができ、および／または上記で論じたもの以外の追加の治療薬と組み合わせることができることがさらに企図される。

【実施例】

【0098】

以下の非限定的な実施例は、限定ではなく例示の目的で提供される。

【0099】

実施例１：ＰＹＹ類縁体１．

【0100】

本発明の概念を組み込んだ１つのＰＹＹ類縁体は、以下の構造を有し得る

【化5】

【0101】

ここで、Ｎ末端はフリーであり、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化される。７位のＫは、（Ａｈｘ－Ｅ－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ_２）_１６－ＣＯＯＨによる７位のＫ側鎖のε－アミノ基への接合により化学的に修飾されている。

【0102】

配列番号９によるＰＹＹ類縁体は、ＲＡＰＰ ＡＭ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂（Ｈ４００２３ポリスチレンＡＭ ＲＡＭ、Ｒａｐｐ ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ）から開始するＳｙｍｐｈｏｎｙＸ自動ペプチド合成装置（ＰＴＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）でのＦｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ戦略を使用した固相ペプチド合成によって生成される。アミノ酸カップリングは、１０当量のアミノ酸、０．９Ｍジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）および０．９Ｍ オキシマ（１：１：１モル比）をＤＭＦ中で使用し、２５℃で３時間行う。ＤＭＦ中の２５％ピペリジン溶液を使用して脱保護を行う。

【0103】

上記のようにペプチド樹脂を伸長した後、７位のＫに存在するＭＴＴ保護基を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３０％ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を使用して除去する。Ｆｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ戦略を使用して７位の側鎖でＫを延長する追加のカップリング／脱保護サイクルには、Ｆｍｏｃ－６－アミノヘキサン酸（Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ カタログ番号０２４９０）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕ（ＣｈｅｍＰｅｐ カタログ＃１００７０３）およびＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_１６－ＣＯＯｔＢｕが含まれる。すべてのカップリングで、３当量のビルディングブロックを、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３当量）およびＤＩＥＡ（６当量）とともに２５℃で３時間使用する。

【0104】

樹脂からの切断および側鎖保護基の除去を同時に、ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジチオール：メタノール：チオアニソール８０：５：５：５：５（ｖ／ｖ）を含む溶液中で２５℃で２時間行い、続いて冷エーテルで沈殿させる。粗ペプチドを、フェニルヘキシルカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ；５μｍ、１００Ａ）でのＲＰ－ＨＰＬＣによって９９％超の純度（１５～２０％の精製収率）に精製し、適切な画分をプールして凍結乾燥する。

【0105】

ＰＹＹ類縁体の純度を分析ＲＰ－ＨＰＬＣで調べ、ＬＣ／ＭＳを使用して同一性を確認する（観測：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１６５９．２（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１６５９．２；観測：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２４４．６（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２４４．６；観測：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝９９５．９（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝９９５．９）。

【0106】

実施例２：ＰＹＹ類縁体２．

【0107】

本発明の概念を組み込んだ１つのＰＰＹ類縁体は、以下の構造を有し得る

【化6】

【0108】

実施例１のように、Ｎ末端はフリーであり、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化される。しかしながら、対照的に、７位のＫは、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）_２－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ_２）_１８－ＣＯＯＨによるＫ側鎖のε－アミノ基への接合によって化学的に修飾されている。

【0109】

配列番号１０によるＰＹＹ類縁体は、上記の実施例１に記載されたものと同様の固相ペプチドによって生成される。したがって、ＦＭＯＣ－ＮＨＰＥＧ_２－ＣＨ_２ＣＯＯＨおよびＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_１８－ＣＯＯｔＢｕは、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３当量）およびＤＩＥＡ（６当量）を含む３当量のビルディングブロックを使用した２５℃で３時間のＭＴＴ切断後に側鎖に結合する。

【0110】

ＰＹＹ類縁体の純度を分析ＲＰ－ＨＰＬＣで調べ、ＬＣ／ＭＳを使用して同一性を確認する（観測：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１６６５．４（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１６６５．５；観測：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２４９．３（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２４９．４；観測：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝９９９．７（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝９９９．７）。

【0111】

実施例３：ＰＹＹ類縁体３．

【0112】

本発明の概念を組み込んだ１つのＰＹＹ類縁体は、以下の構造を有し得る

【化7】

【0113】

実施例１のように、Ｎ末端はフリーであり、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化される。しかしながら、対照的に、７位のＫは、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ_２）_１６－ＣＯＯＨによるＫ側鎖のε－アミノ基への接合によって化学的に修飾されている。

【0114】

配列番号１１によるＰＹＹ類縁体は、上記の実施例１に記載されたものと同様の固相ペプチドによって生成される。したがって、ＦＭＯＣ－ＮＨＰＥＧ_２－ＣＨ_２ＣＯＯＨおよびＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_１６－ＣＯＯｔＢｕは、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３当量）およびＤＩＥＡ（６当量）を含む３当量のビルディングブロックを使用した２５℃で３時間のＭＴＴ切断後に側鎖に結合する。

【0115】

ＰＹＹ類縁体の純度を分析ＲＰ－ＨＰＬＣで調べ、ＬＣ／ＭＳを使用して同一性を確認する（観測：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１６６４．７（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１６６４．９；観測：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２４８．９（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２４８．９；観測：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝９９９．３（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝９９９．３）。

【0116】

実施例４：ＰＹＹ類縁体４．

【0117】

本発明の概念を組み込んだ１つのＰＹＹ類縁体は、以下の構造を有し得る

【化8】

【0118】

実施例１のように、Ｎ末端はフリーであり、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化される。しかしながら、対照的に、７位のＫは、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）_２－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ_２）_１６－ＣＯＯＨによるＫ側鎖のε－アミノ基への接合によって化学的に修飾されている。

【0119】

配列番号１２によるＰＹＹ類縁体は、上記の実施例１に記載されたものと同様の固相ペプチドによって生成される。したがって、ＦＭＯＣ－ＮＨＰＥＧ_２－ＣＨ_２ＣＯＯＨおよびＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_１６－ＣＯＯｔＢｕは、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３当量）およびＤＩＥＡ（６当量）を含む３当量のビルディングブロックを使用した２５℃で３時間のＭＴＴ切断後に側鎖に結合する。

【0120】

ＰＹＹ類縁体の純度を分析ＲＰ－ＨＰＬＣで調べ、ＬＣ／ＭＳを使用して同一性を確認する（観測：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１６６４．８（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１６６５．５；観測：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２４８．９（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２４９．４；観測：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝９９８．９（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝９９５．７）。

【0121】

実施例５：ＰＹＹ類縁体５．

【0122】

本発明の概念を組み込んだ１つのＰＹＹ類縁体は、以下の構造を有し得る

【化9】

【0123】

実施例１のように、Ｎ末端はフリーであり、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化される。しかしながら、対照的に、７位のＫは、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）_２－（γＥ）_３－ＣＯ－（ＣＨ_２）_１８－ＣＯＯＨによるＫ側鎖のε－アミノ基への接合によって化学的に修飾されている。

【0124】

配列番号１３によるＰＹＹ類縁体は、上記の実施例１に記載されたものと同様の固相ペプチドによって生成される。したがって、ＦＭＯＣ－ＮＨＰＥＧ_２－ＣＨ_２ＣＯＯＨおよびＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_１８－ＣＯＯｔＢｕは、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３当量）およびＤＩＥＡ（６当量）を含む３当量のビルディングブロックを使用した２５℃で３時間のＭＴＴ切断後に側鎖に結合する。

【0125】

ＰＹＹ類縁体の純度を分析ＲＰ－ＨＰＬＣで調べ、ＬＣ／ＭＳを使用して同一性を確認する（観測：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１７３２．２（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋３Ｈ^＋／３＝１７３２．３；観測：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２９９．４（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋４Ｈ^＋／４＝１２９９．５；観測：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝１０３９．７（＋／－０．２）；計算：Ｍ＋５Ｈ^＋／５＝１０３９．８）。

【0126】

実施例６：ＰＹＹ類縁体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性。

【0127】

（１）ｈＮＰＹ１、ｈＮＰＹ２、ｈＮＰＹ４、およびｈＮＰＹ５受容体への ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合

【0128】

目的：

【0129】

次のヒト（ｈ）受容体：ｈＮＰＹ１Ｒ、ｈＮＰＹ２Ｒ、ｈＮＰＹ４ＲおよびｈＮＰＹ５Ｒに対するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の非存在下での実施例１～５のＰＹＹ類縁体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合親和性（Ｋ_ｉ）を評価する。膜との競合的放射性リガンド結合アッセイを、各組換え受容体を過剰発現する細胞株から調整し、関連する^［１２５Ｉ］標識ペプチドを各シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）法で使用する。関連する天然ペプチド、ＰＹＹ_１－３６（配列番号１）、ＰＹＹ_３－３６（配列番号２）および膵臓ポリペプチド_１－３６（ＰＰ_１－３６；配列番号１４）に対する結合親和性を、対照として各アッセイで決定する。

【0130】

方法：

【0131】

ＰＹＹ類縁体、天然、ヒトＰＹＹ_１－３６および対照ＰＹＹ_３－３６を、Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国インディアナ州インディアナポリス）で合成し、ＬＣ／ＭＳ、ＮＭＲ、およびＬＣ／ＵＶ分析（純度９９．５％）によって特性評価する。ペプチド含有量は８０％粉末質量と推定される。ペプチドを、１００％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液として調製し、アッセイで試験する直前まで－２０℃で凍結保存する。

【0132】

ｈＮＰＹ１Ｒの場合、ＣＨＯ細胞を使用して一過性の過剰発現を行う。受容体ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドにサブクローニングし、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトした後、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）で選択することにより、ｈＮＰＹ２ＲおよびｈＮＰＹ４Ｒ用に安定的にトランスフェクトされた細胞株を調製する。ｈＮＰＹ５Ｒクローニングは、Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード）で実施される。

【0133】

ｈＮＰＹ１Ｒ、ｈＮＰＹ２Ｒ、ｍＮＰＹ２ＲおよびｈＮＰＹ４Ｒの粗細胞膜の調製のため、２つの異なる方法（以下に記載される）を利用する。ｈＮＰＹ５Ｒ膜をＭｕｌｔｉｐａｎ，Ｉｎｃ．（＃ＭＣＧ１２７５）から購入する。

【0134】

方法１－ｈＮＰＹ２ＲおよびｈＮＰＹ４Ｒ膜の場合、凍結細胞ペレットを、湿潤させた細胞ペースト１グラムあたり５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、およびＥＤＴＡを含むＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^（商標）プロテアーゼ阻害剤（＃１１６９７４９００１）を含む低張ホモジナイゼーション緩衝液１０ｍＬ中において氷上で溶解する。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）乳棒を備えた、ガラス製Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用して、２５ストロークで細胞懸濁液を破壊する。ホモジネートを４℃、１１００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を回収し、氷上で保存する一方で、ペレットを均質化緩衝液に再懸濁し、上述のように再ホモジナイズする。ホモジネートを１１００×ｇで１０分間、遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせ、３５０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離する。得られた膜ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を約１～３ｍｇ／ｍＬで含有する均質化緩衝液に再懸濁し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまでアリコートとして－８０℃の冷凍庫内で保存する。タンパク質濃度を、ＢＳＡを標準としてＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２５）を使用して決定する。

【0135】

方法２－ｈＮＰＹ１Ｒ膜の場合、凍結細胞ペレットを、湿った細胞ペースト１グラムあたり、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２５単位／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１８０４７－０１９）およびＥＤＴＡを含まないＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^（商標）プロテアーゼ阻害剤＃１１８３６１７０００１）を含む５ｍＬの低張均質化緩衝液中において氷上で溶解する。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）乳棒を備えた、ガラス製Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用して、２５ストロークで細胞懸濁液を破壊する。ホモジネートを、５０ｍＬのコニカルチューブ内で４℃、１８００×ｇで１５分間遠心分離する。上清を回収し、氷上で保存する一方で、ペレットを均質化緩衝液に再懸濁し、上述のように再ホモジナイズするが、ＤＮａｓｅ Ｉは均質化緩衝液には使用されていない。ホモジネートを１８００×ｇで１５分間、遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせ、２５０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離する。得られた膜ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を約２ｍｇ／ｍＬで含む均質化緩衝液に再懸濁し、等分して、使用するまで－８０℃の冷凍庫に保存する。タンパク質濃度を、ＢＳＡを標準としてＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２５）を使用して決定する。

【0136】

一般的な結合アッセイ法－さまざまな受容体／放射性リガンド相互作用の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）を、化合物試験について以下に説明するのと同じ試薬と緩衝液を使用する飽和結合分析から決定する。この研究で使用された受容体調製物について決定したＫ_ｄ値は以下の通りである：ｈＮＰＹ２Ｒ、０．００４７ｎＭ；ｈＮＰＹ１Ｒ、０．０７ｎＭ；ｈＮＰＹ４Ｒ、０．０８４ｎＭ；およびｈＮＰＹ５Ｒ、０．８９６ｎＭ。

【0137】

ｈＮＰＹ１Ｒ受容体結合プロトコル－ｈＮＰＹ１Ｒに対するＰＹＹ類縁体ペプチドおよびＰＹＹ_１－３６の受容体結合親和性（Ｋ_ｉ）を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手したヒト組換え［１２５^Ｉ］－ＰＹＹ_１－３６（＃ＮＥＸ３４１ ２２００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）との競合放射性リガンド結合アッセイから決定する。アッセイを、ポリビニルトルエン（ＰＶＴ）小麦胚芽凝集素結合ＳＰＡビーズ（＃ＲＰＮＱ０００１、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用するＳＰＡ法で実施する。アッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、および０．２％ｗ／ｖバシトラシン（ＲＰＩ＃３２０００））を試薬の調製に使用する。ＰＹＹ類縁体およびＰＹＹ_１－３６を解凍し、Ｔｅｃａｎ Ｅｖｏ液体ハンドラーを使用して、１００％ＤＭＳＯ中で３倍ずつ段階希釈する（１０ポイント濃度応答曲線）。アッセイ緩衝液中へのペプチドの２０倍段階希釈を行って、アッセイプレートに添加する前にＤＭＳＯのレベルおよびペプチド濃度を低下させる。次に、５μＬの段階希釈ペプチドまたはＤＭＳＯを、４５μＬのアッセイ緩衝液または非標識ＰＹＹ_１－３６対照（非特異的結合またはＮＳＢ、最終濃度１０ｎＭ）を含むＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２透明底アッセイプレートに移す。次に、５０μＬの［^１２５Ｉ］－ＰＹＹ_１－３６（最終濃度０．０５ｎＭ）および５０μＬのｈＮＰＹ１Ｒ膜（１．０μｇ／ウェル）を添加する。最後に添加するのは５０μＬのＷＧＡ ＳＰＡビーズ（５０μｇ／ウェル）である。ＤＭＳＯの最終濃度は０．１２５％である。プレートを密封し、プレートシェーカー上で１分間混合し（設定６）、室温で１０時間インキュベート／静置した後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーションカウンターでプレートを読み取る。応答曲線で試験したペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、ＰＹＹ類縁体（２．５μＭ～０．１３ｎＭ）およびＰＹＹ_１－３６（１０ｎＭ～０．５ｐＭ）である。

【0138】

ｈＮＰＹ２受容体結合プロトコル－ｈＮＰＹ２Ｒに対するＰＹＹ類縁体ペプチドおよびＰＰ_１－３６の受容体結合親和性（Ｋ_ｉ）を、ｈＮＰＹ１Ｒについて上記したように、競合放射性リガンド結合アッセイから決定する。応答曲線における試験したペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、ＰＹＹ類縁体（０．１μＭ～５ｐＭ）およびＰＹＹ_３－３６（１０ｎＭ～０．５ｐＭ）である。

【0139】

ｈＮＰＹ４Ｒ受容体結合プロトコル－ｈＮＰＹ１Ｒについて上述したように、ｈＮＰＹ４Ｒに対するＰＹＹ類縁体ペプチドおよびＰＰ_１－３６の受容体結合親和性（Ｋ_ｉ）を競合放射性リガンド結合アッセイから決定する。応答曲線における試験したペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、ＰＹＹ類縁体（２．５μＭ～０．１３ｎＭ）およびＰＹＹ_１－３６（１０ｎＭ～０．５ｐＭ）である。

【0140】

ｈＮＰＹ５Ｒ受容体結合プロトコル－ｈＮＰＹ１Ｒについて上述したように、ｈＮＰＹ５Ｒに対するＰＹＹ類縁体ペプチドおよびＰＹＹ_１－３６の受容体結合親和性（Ｋ_ｉ）を競合放射性リガンド結合アッセイから決定する。応答曲線における試験したペプチドの最終的なアッセイ濃度範囲は、ＰＹＹ類縁体（１μＭ～１０ｐＭ）およびＰＹＹ_１－３６（１μＭ～１０ｐＭ）である。

【0141】

ＮＰＹ受容体結合アッセイのデータ分析－ＰＹＹ類縁体、ＰＹＹ_１－３６、ＰＹＹ_３－３６、またはＰＰ_１－３６の濃度曲線のカウント毎分（ＣＰＭ）の生データを、以下の等式に示すように、個々のＣＰＭ値から非特異的結合（ＮＳＢ、それぞれ、過剰な非標識ＰＹＹ_１－３６、ＰＹＹ_３－３６、またはＰＰ_１－３６の存在下での結合）を差し引いて、総結合シグナル（これも非特異的結合を差し引くことで補正される）で除算することによりパーセント特異的阻害に変換する。

【数1】

【0142】

４パラメータ（曲線最大値、曲線最小値、ＩＣ_５０、ヒル勾配）非線形回帰ルーチン（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ、バージョン１３．０．５、Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ、スイス国バーゼル）を用いてデータを解析する。親和性定数（Ｋ_ｉ）を、等式Ｋ_ｉ＝ＩＣ_５０／（１＋Ｄ／Ｋ_ｄ）に基づき相対ＩＣ_５０値から計算し、式中、Ｄ＝実験における放射性リガンドの濃度、ＩＣ_５０は結合の５０％阻害を引き起こす濃度であり、Ｋ_ｄは飽和結合分析（上に収載される）から決定される放射性リガンドの平衡結合解離定数である。修飾子（＞）は、競合物質が存在しない場合の最大結合と比較して、データが５０％阻害に達しなかったことを示し、これにより、Ｋ_ｉをアッセイで試験した化合物の最高濃度を使用して計算する。

【0143】

Ｋ_ｉの報告値を、以下に示すように幾何平均として計算する。

【数2】

【0144】

平均の標準誤差（ＳＥＭ）を、以下に示すようにデルタ法を使用して計算する；

【数3】

ここで、ＳＤは標準偏差、ｎは独立した実施の数、ｌｎ（１０）は１０の自然対数である。

【0145】

ｈＮＰＹ２Ｒ（Ｙ２）対ｈＮＰＹ５Ｒ（Ｙ５）、ｈＮＰＹ４Ｒ（Ｙ４）、および／またはｈＮＰＹ１Ｒ（Ｙ１）に対するペプチドの選択性を、ｎＭ単位のｈＮＰＹ２Ｒの結果で割ることによって計算する。

【0146】

結果：

【0147】

【表1】

【0148】

上に示したように、実施例１～５のＰＹＹ類縁体は、ｈＮＰＹ２受容体に対して非常に選択的であり、さらに、天然のヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）と比較して、ｈＮＰＹ５、ｈＮＰＹ４およびｈＮＰＹ１受容体への結合親和性の低下を示す。

【0149】

（２）ヒトＮＰＹ２受容体に対する ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰ活性

【0150】

目的：

【0151】

組換えヒトＮＰＹ２受容体を過剰発現するＨＥＫ ２９３細胞におけるフォルスコリン誘導性細胞内ｃＡＭＰ産生の阻害を測定することによって、天然のヒトＰＹＹ_３－３６と比較して実施例１～５のＰＹＹ類縁体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能活性を決定する。

【0152】

方法：

【0153】

ＰＹＹ類縁体およびヒトＰＹＹ_３－３６（配列番号２）は、受容体結合アッセイにおいて上記のように合成され、特性評価され、そして保存される。

【0154】

受容体のクローニング－安定的にトランスフェクトされた細胞株を、ｈＮＰＹ２受容体ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドにサブクローニングし、ＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクトした後、ジェネティシンで選択することにより調製する。９継代での細胞（１×１０^７細胞／ｍＬ）のアリコートを作製し、液体窒素タンクの気相中で凍結保存する。これらの凍結アリコートを、アッセイ時に使用する。細胞は数ヶ月間にわたって９５％以上の生存率を維持する。

【0155】

ｈＮＰＹ２Ｒ ｃＡＭＰアッセイ－ＰＹＹ類縁体またはＰＹＹ_３－３６によるフォルスコリン誘導性のｃＡＭＰ産生の阻害は、組換えｈＮＰＹ２Ｒを過剰発現するＨＥＫ ２９３細胞を使用して測定される。細胞の凍結アリコートを３７℃の水浴で解凍する。細胞を１０ｍＬの培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ １００８２－１４７の１０％ＦＢＳを含むＬｉｆｅ Ｔｅｃｈ １１０９０－０８１のＭＥＭ細胞培養培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ ２５０３０－０８１の１ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ １１１４０－０５０の１×ＮＥＡＡ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ １１３６０－０７０の１ｍＭピルビン酸ナトリウム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ １５２４０－０６２の１×抗生物質－抗真菌剤）を含む５０ｍＬチューブに移し、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機で１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを１０ｍＬの細胞培養液に再懸濁した後、４０μｍのストレーナーに通する。細胞数および細胞生存率の正確な数を、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＶｉ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ ２．０３）を使用して決定する。Ｃｏｍｂｉ－Ｔｉｐ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１ウェルあたり８０００個の細胞を白色の３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ポリ－Ｄ－リジンコーティング、白色／不透明、カタログ番号３５６６６１）にプレーティングする。プレートを１０００ｒｐｍで１秒間遠心分離し、５％ＣＯ_２管理したインキュベーター内で３７℃で１８～２０時間インキュベートする。ペーパータオル上で軽くはじくことにより、アッセイプレートから培地を除去する。１０μＬのアッセイバッファー［１Ｘ ＨＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３０２６８０１）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃ＳＨ３０２３７．０１）、０．１％ｗ／ｖカゼイン（ＣＴＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏｒｐ．、＃４４０２０３Ｈ）、５００μＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｉ５８７６）］をウェルに添加した後、Ｃｏｍｂｉ－Ｔｉｐ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒを使用して、１５００ｒｐｍで１０秒間遠心分離する。２倍希釈での濃度応答曲線（２０ポイント）を、アコースティックディスペンシングテクノロジー（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ５５０）を使用して１００％ＤＭＳＯで作成する。細胞を３７℃（最終ＤＭＳＯ濃度＝１％）で４５分間、ＰＹＹ類縁体またはヒトＰＹＹ_３－３６で処理し、次いで３７℃で４５分間、１μＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｆ６８８６）で刺激する。ＣｉｓＢｉｏ ｃＡＭＰ－Ｇ_ｉ Ｄｙｎａｍｉｃキット（＃６２ＡＭ９ＰＥＢ）を使用して、細胞内ｃＡＭＰを定量する。簡潔には、細胞溶解バッファー（１０μＬ）中のｃＡＭＰ－ｄ２コンジュゲートを添加し、続いて同様に細胞溶解バッファー（１０μＬ）中の抗体、抗ｃＡＭＰ－Ｅｕ^３＋－クリプテートを添加することによって、ＨＴＲＦキット試薬を使用して、細胞内のｃＡＭＰレベルを検出する。結果として得られる競合アッセイを、室温で少なくとも６０分間インキュベートし、その後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ^（商標）機器（３２０ｎｍでの励起ならびに６６５ｎｍおよび６２０ｎｍで発光）を使用して検出する。応答曲線で試験したペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、ＰＹＹ類縁体（０．１μＭ～０．２ｐＭ）およびヒトＰＹＹ_３－３６（１０ｎＭ～０．０２ｐＭ）である。既知のｃＡＭＰ濃度（０．５μＭ～１ｐＭ）の標準曲線をアッセイバッファーで作成する。競合物質が添加されていないウェル、またはヒトＰＹＹ_３－３６が添加されているウェルが、それぞれ最大応答および阻害剤対照として各プレートに含まれている。

【0156】

ｈＮＰＹ２受容体ｃＡＭＰアッセイに関するデータ解析－時間分解蛍光発光を使用して、存在するｃＡＭＰの量に反比例する蛍光比（６６５ｎＭ／６２０ｎｍ）を計算する。ＰＹＹ類縁体およびヒトＰＹＹ_３－３６のシグナルを、相対応答単位（６６５ｎｍ／６２０ｎｍ＊１０，０００での発光、ｙ軸）対ｃＡＭＰの濃度（ｘ軸）としてプロットされたｃＡＭＰ標準曲線を使用してウェルあたりのｎＭ ｃＡＭＰに変換する。

【0157】

各ウェルで生成されたｃＡＭＰの量（ｎＭ）を、以下の等式に示されるように、フォルスコリンのみで観察された最大応答のパーセントに変換する。

【数4】

ここで、阻害剤対照は、添加された過剰なヒトＰＹＹ_３－３６の存在下で生成されたｃＡＭＰであり、最大応答は、フォルコリンのみの存在下で生成されたｃＡＭＰであり、ペプチドは、試験ペプチドの存在下で生成されたｃＡＭＰである。

【0158】

特異的阻害率（ｙ軸）を競合物質の濃度（ｘ軸）に対してプロットし、以下に定義されるように、４パラメータ（曲線上部、曲線下部、ＩＣ_５０、ヒル勾配）非線形回帰ルーチン（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ、バージョン１３．０．５、Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ、スイス国バーゼル）を使用して分析する：

【数5】

【0159】

相対ＩＣ_５０値は、フォルスコリンによって誘発されるｃＡＭＰ産生を５０％阻害する濃度を表す。

【0160】

ＩＣ_５０の報告値を、以下に示すように幾何平均として計算する。

【数6】

【0161】

平均の標準誤差（ＳＥＭ）を、以下に示すようにデルタ法を使用して計算する；

【数7】

ここで、ＳＤは標準偏差、ｎは独立した実施の数、ｌｎ（１０）は１０の自然対数である。

【0162】

結果：

【0163】

【表2】

【0164】

上記のように、ｃＡＭＰアッセイによる結果は、ｈＮＰＹ２受容体に対する実施例１～５のＰＹＹ類縁体の機能活性を実証し、実施例２はヒトＰＹＹ_３－３６よりも１２倍低い効力の最も弱い効力を示している。

【0165】

（３）ｈＮＰＲ２受容体に対する ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＴＰγＳの活性

【0166】

目的：

【0167】

実施例１～５のＰＹＹ類縁体によるＧタンパク質の受容体媒介性活性化を評価する。受容体媒介性活性化は、非加水分解性ＧＴＰ類縁体、ＧＴＰγ［^３５Ｓ］を用いて測定することができる。アゴニストを介したＧタンパク質接合型受容体の刺激は、膜結合型Ｇαβγタンパク質ヘテロ三量体複合体の活性化をもたらす。これは、細胞外シグナルを伝達して細胞内経路を改変する最初の工程である。本明細書では、ＧＴＰγ［^３５Ｓ］機能アッセイを使用して、ｈＮＰＹ２受容体でのさまざまなＰＹＹ類縁体の効力を評価する。

【0168】

方法：

【0169】

ＰＹＹ類縁体、ヒトＰＹＹ_１－３６（配列番号１）および対照ペプチドＰＹＹ_３－３６（配列番号２）は、受容体結合アッセイにおいて上記のように合成され、特性評価され、そして保存される。

【0170】

各試験ペプチドについて、１／３ ｌｏｇ希釈（対数濃度－６．５２～－１２．５２）の濃度応答曲線（ＣＲＣ）を、０．２％バシトラシン（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ＃１１８０５）および０．５％ＤＭＳＯを補充したアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ）において、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＮＩＭＢＵＳ液体ハンドラーを用いて完了する。バシトラシンおよびＤＭＳＯの最終アッセイ濃度はそれぞれ０．０５％と０．１２５％である。ｈＮＰＹ２Ｒ膜（Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ＃ＨＴＳ０６６Ｍ）を２０ ｕＭ ＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ－７１２７）および６ ｕｇ／ｍＬサポニン（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ－４５２１）を添加したアッセイバッファーで７．５ｕｇ／ｍＬの濃度に調製し、ｈＮＰＹ２Ｒ膜をアッセイに加える前に室温で２０分間インキュベートする。^{ＧＴＰγＳ［３５}Ｓ］（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ＃ＮＥＧ０３０Ｈ）を０．６ｎＭの濃度で、アッセイ緩衝液中に調製する。ＷＧＡ ＳＰＡビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ＃ＲＰＮＱ０００１）を、アッセイ緩衝液で１２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製する。最終容量２００ｕＬに対して最初に１００ｕＬをｈＮＰＹ２Ｒ膜に添加し、次にＣＲＣの溶液５０ｕＬ、次にＧＴＰγＳ［^３５Ｓ］溶液５０ｕＬを添加することにより、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３６０４）においてアッセイを行う。プレートを覆い、室温でオービタルシェーカー（１７５ｒｐｍで４５分間）に置く。次に、２５ｕＬのＳＰＡビーズを加え、プレートを再度密封し、ボルテックスして混合した後、オービタルシェーカーに室温で３時間戻す。次にプレートを５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ２４５０マイクロプレートカウンターでウェルあたり１分間カウントする。基礎結合（ＣＰＭ）を、ＰＹＹ類縁体またはヒトＰＹＹ_３－３６の不在下で決定し、次の等式により、ペプチドの各濃度の基礎値を超えるパーセントを計算するために使用する：（ＰＹＹ類縁体、またはヒトＰＹＹ_３－３６、ＣＰＭ－基礎ＣＰＭ）／（基礎ＣＰＭ）＊１００。ＥＣ_５０（ｎＭ）値は、濃度の対数および基礎値のパーセントを、次の等式を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０の非線形回帰分析（対数（アゴニスト）対応答－変数の傾き（４つのパラメータ））にかけることによって決定される：Ｙ＝ボトム＋（トップ－ボトム）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ_５０－Ｘ）＊ヒル勾配））。平均値の幾何平均および標準誤差をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０の列の統計関数を使用してＥＣ_５０（ｎＭ）値から計算する。

【0171】

結果：

【0172】

【表3】

【0173】

上記のように、ＧＴＰγ［^３５Ｓ］機能アッセイによる結果は、ｈＮＰＹ２受容体に対するＰＹＹ類縁体の活性を実証し、実施例２は、ヒトＰＹＹ_３－３６に対して４倍低い効力の最も弱い効力を示している。

【0174】

（４）薬物動態

【0175】

目的：

【0176】

ＰＹＹ類縁体の薬物動態特性を調査する。

【0177】

方法：

【0178】

ＬＣ／ＭＳ－さまざまなＰＹＹ類縁体の血漿中濃度をＬＣ／ＭＳ法によって決定する。該方法は化合物全体、ペプチドおよび関連付けられた時間延長を測定する。アッセイでは、０．１％ギ酸を含むメタノールを使用して、マウス、ラット、またはサルの血漿（５０μＬ）からＰＹＹ類縁体および内部標準を抽出する。サンプルを遠心分離し、上清をＴｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅに移す。サンプルを、メタノールおよび水中の０．１％ギ酸で調整したＳｅｐ－Ｐａｋ ｔＣ１８ ＳＰＥ μＥｌｕｔｉｏｎプレートにロードする。ＳＰＥカラムを、水中の０．１％ギ酸で２回洗浄する。次に、ギ酸／水／アセトロニチル（０．１：１５：８５）を使用して化合物を溶出した後、これを乾燥して再構成してから、アリコート（１０μＬ）をＴｈｅｒｍｏ Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８、３００μｍ×５ｍｍ捕捉カラム、およびＴｈｅｒｍｏ Ｅａｓｙ Ｓｐｒａｙ ＰｅｐＭａｐ Ｃ１８、ＬＣ／ＭＳ分析用の７５μｍ×１５ｃｍカラムに注入した。カラム流出液を、検出および定量のためにＴｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計へと向ける。

【0179】

ＣＤ－１マウスにおけるＰＹＹ類縁体の薬物動態－ＰＹＹ類縁体の血漿薬物動態を、２００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後の雄性ＣＤ－１マウスで評価する。血液サンプルを、１６８時間にわたって各時点で２匹の動物から収集する。非連続サンプリングを使用してマウスのＰＹＹ類縁体の動態を評価するため、平均濃度対時間のデータを使用して、２００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後のＰＹＹ類縁体の薬物動態パラメータを表にする。ＰＹＹ類縁体の血漿中濃度を、２００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後１２０時間まで検出する。

【0180】

ＳＤラットにおけるＰＹＹ類縁体の薬物動態－ＰＹＹ類縁体の血漿薬物動態を、５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価する。血液サンプルを、１６８時間にわたって各時点で２匹の動物から収集する。連続サンプリングを使用してラットのＰＹＹ類縁体の動態を評価するため、個々の動物の平均濃度対時間のデータを使用して、５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後のＰＹＹ類縁体の薬物動態パラメータを表にする。ＰＹＹ類縁体の血漿中濃度を、５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後１２０時間まで検出する。

【0181】

カニクイザルにおけるＰＹＹ類縁体の薬物動態－ＰＹＹ類縁体の血漿薬物動態を、５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後の雄性および雌性カニクイザルで評価する。血液サンプルを５０４時間にわたって収集する。連続サンプリングを使用してカニクイザルのＰＹＹ類縁体の動態を評価するため、個々の動物の平均濃度対時間のデータを使用して、５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後のＰＹＹ類縁体の薬物動態パラメータを表にする。ＰＹＹ類縁体の血漿中濃度を、５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後５０４時間まで検出する。

【0182】

結果：

【0183】

【表4】

【0184】

【表5】

【0185】

【表6】

【0186】

結果：

【0187】

これらのデータは、上記の化合物が週１回の投与に適した薬物動態プロファイルを有することを示している。

【0188】

（５）溶解性および安定性

【0189】

目的：

【0190】

ＰＹＹ類縁体の可溶性ｐＨ範囲および安定性を決定する。

【0191】

方法：

【0192】

視覚的溶解度範囲の評価－凍結乾燥したＰＹＹ類縁体粉末を４ｍｇ／ｍＬの濃度で水中で再構成し、クエン酸／リン酸緩衝液でｐＨをｐＨ４に調整する。系のｐＨを０．５Ｎ ＮａＣｌでｐＨ８に調整した後、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨ４に滴定した。

【0193】

熱安定性評価－１ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬ濃度の１０ｍＭまたは２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中のＰＹＹ類縁体溶液を調製し、４℃および４０℃で４週間インキュベートする。４週間の時点でのサンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＲＰ－ＨＰＬＣによって分析する。

【0194】

ＳＥＣ法－ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷｘｌ、内径７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５ ｕｍカラムを使用し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、２０％アセトニトリルの移動相組成物により、流速０．５ｍＬ／分、λ－２１４ｎｍで３０分間かけて行った。

【0195】

ＲＰ法－Ｃｏｒｔｅｃｓ Ｃ１８、２．７ ｕｍ、４．６×５０ｍｍカラム、０．０８５％ＴＦＡを含む２０％～４５％アセトニトリル／水を使用して、流速１ｍＬ／分、λ－２１４ｎｍで１０分間かけて行った。

【0196】

結果：

【0197】

【表7】

【0198】

上に示したように、すべてのペプチドはｐＨ７．０超で溶解する。ＲＰおよびＳＥＣによって評価される安定性は、これらのペプチドが攻撃的な熱ストレス下で比較的安定していることを示唆している。

【0199】

実施例７：ＰＹＹのＩｎ Ｖｉｖｏでの効果。

【0200】

（１）正常なマウスの食物摂取量および体重に対する ｉｎ ｖｉｖｏでの効果

【0201】

目的：

【0202】

単回注射後の正常なマウスの体重を減らし、食物摂取を抑制する実施例１～５のＰＹＹ類縁体の効果を比較する。

【0203】

方法：

【0204】

Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ（インディアナ州インディアナポリス）からの雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、固形飼料（５００８；ＬａｂＤｉｅｔ、ミズーリ州セントルイス）で飼育し、通常の１２：１２時間の光サイクルで、餌および水を自由に摂取できる温度管理された施設（７４．０°Ｆ；２３．３℃）内で１匹ずつ収容した。９～１０週齢で、絶食していない体重および初期の食物重量を記録し、動物にビヒクルまたはペプチドの単回皮下注射を行い、その後、投与後３日間にわたり体重および食物摂取量を毎日測定する。曲線下面積分析（ＡＵＣ）を、ビヒクルに対する体重および食物摂取量の両方について計算する。３０ｎｍｏｌ／ｋｇでの実施例４を、アッセイの各実施における体重および食物摂取に対する１００％の効力のベンチマークとして使用する。

【0205】

結果：

【0206】

【表8】

【0207】

上に示したように、体重および食物摂取量の両方の減少は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＹＹ類縁体の有効性を示し、完全な有効性に必要な用量の比較は、有効性の改善を実証している。

【0208】

（２）食餌誘発性肥満マウスの食物摂取量および体重に対するｉｎ ｖｉｖｏでの効果

【0209】

目的：

【0210】

食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおいて、２週間にわたって、単独で、またはＧＬＰ－１受容体アゴニストと組み合わせて、体重を減少させる実施例１～５のＰＹＹ類縁体の毎日の投与の効果を調査する。

【0211】

方法：

【0212】

２０週齢のＤＩＯ雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）は、到着時に６０％脂肪食で飼育されている（Ｄ１２４９２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、ニュージャージー州ニューブランズウィック）。１２時間の明／暗サイクル（２２：００に点灯）で、食餌および水を自由に摂取できる、温度管理された施設（７４．０°Ｆ；２３．３℃）内で動物を個々に収容する。毎日のビヒクル投与の１週間の順応期間の後、非絶食時の体重を測定し、動物を体重によって実験群に無作為化し（ｎ＝６）、ビヒクル、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（ＧＬＰ－１ ＲＡ；配列番号１５）、ＰＹＹ類縁体、またはＰＹＹ類縁体とＧＬＰ－１ ＲＡの組み合わせの毎日の皮下注射を投与する。投与の２週間後、非絶食時の体重を記録し、ビヒクルに対する平均体重の変化を計算する。ＧＬＰ－１ ＲＡと組み合わせたＰＹＹ類縁体の相加効果または相乗効果を決定するために、ＧＬＰ－１ ＲＡ単独の効果（正味の効果）を超える効果が計算される。

【0213】

結果：

【0214】

【表9】

【0215】

上に示したように、ＰＹＹ類縁体を単独で、またはＧＬＰ－１ ＲＡと組み合わせて使用した場合の体重の減少は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＹＹ類縁体の有効性を示し、ここでは体重減少の大きさを比較している。

【0216】

（３）糖尿病および肥満（ｄｂ／ｄｂ）マウスにおける体重およびグルコースに対する ｉｎ ｖｉｖｏでの効果

【0217】

目的：

【0218】

肥満および糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）において１０日間にわたって体重および血糖値を低下させる実施例１～５のＰＹＹ類縁体の毎日の投与の効果を調査する。

【0219】

方法：

【0220】

Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ（インディアナ州インディアナポリス）からのＬｅｐｒ^{ｄｂ／ｄｂ}（ｄｂ／ｄｂ）雄性マウスを、固形飼料（５００８；ＬａｂＤｉｅｔ、ミズーリ州セントルイス）で飼育し、通常の１２：１２時間の光サイクルで、餌および水を自由に摂取できる温度管理された施設（７４．０°Ｆ；２３．３℃）内でケージごとに５匹の動物を収容した。８～９週齢で、Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｃｋ（登録商標）血糖値計（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ、Ｉｎｃ．、インディアナ州インディアナポリス）を使用して体重および血糖値を測定し、続いてビヒクルまたはペプチドを毎日皮下注射する。投与の１０日後、体重および血糖値を測定し、ビヒクル治療に対する変化を計算す。

【0221】

結果：

【0222】

【表10】

【0223】

上に示したように、ＰＹＹ類縁体による体重および血糖値の低下は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＹＹ類縁体の有効性を示しており、ここでは、体重減少およびグルコース低下の大きさを比較している。

【0224】

結論として、本明細書のＰＹＹ類縁体は、ＮＰＹ２Ｒに対して選択性を示す。それらはまた、最も効果的である実施例１、３および４のＰＹＹ類縁体で正常マウス、食餌誘発性肥満マウスおよびｄｂ／ｄｂマウスにおいて反映されるように、体重の用量依存的減少、ならびにｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖の用量依存的改善を示し、これらはｉｎ ｖｉｔｒｏプロファイルと一致している。
配列
配列番号１－ヒトＰＹＹ _１－３６
ＹＰＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ
配列番号２－ヒトＰＹＹ _３－３６
ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ
配列番号３－ＰＹＹ類縁体
ＰＫＰＥＸ_７ＰＸ_９Ｘ_１０ＤＡＳＰＥＥＸ_１７Ｘ_１８ＲＹＹＸ_２２Ｘ_２３ＬＲＨＹＬＮＸ_３０ＬＴＲＱＲＹ
配列番号４－ＰＹＹ類縁体
ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＡＥＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ
配列番号５－ＰＹＹ類縁体
ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＡＥＬＲＨＹＬＮＥＬＴＲＱＲＹ
配列番号６－ＰＹＹ類縁体
ＰＫＰＥＫＰＥＥＤＡＳＰＥＥＷＱＲＹＹＩＥＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ
配列番号７－ＰＹＹ類縁体
ＰＫＰＥＫＰＧＫＤＡＳＰＥＥＷＮＲＹＹＡＤＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ
配列番号８－ＰＹＹ類縁体
ＰＫＰＥＫＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＱＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＷＬＴＲＱＲＹ

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

配列番号１４－ＰＰ _１－３６
ＡＰＬＥＰＶＹＰＧＤＮＡＴＰＥＱＭＡＱＹＡＡＤＬＲＲＹＩＮＭＬＴＲＰＲＹ
配列番号１５－ＧＬＰ－１ ＲＡ
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ

【配列表】

0007280949000001.app