(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-30
(45)【発行日】2023-07-10
(54)【発明の名称】長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230703BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20230703BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230703BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20230703BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12P19/34 A
C12N15/63 Z
C12M1/00 A
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022000190
(22)【出願日】2022-01-04
(62)【分割の表示】P 2018528117の分割
【原出願日】2016-07-19
(65)【公開番号】P2022048163
(43)【公開日】2022-03-25
【審査請求日】2022-01-27
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０１月２０日、ｓｓＯＤＮ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｆｏｒｌａｒｇｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｚｙｇｏｔｅｓ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０；７：１０４３１にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０２月０９日、株式会社バイオダイナミクス研究所の販売担当者が、自社にて、長洞 仁が発明した長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法に係るキット（ＤＳ６２０ Ｌｏｎｇ ｓｓＤＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ３．０ｋｂ（ＬｓＯＤＮ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ））を販売
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０４月１５日、フナコシニュース２０１６年０４月１５日号（Ｎｏ．６０９），ｐｐ．３，３２にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０６月０１日、フナコシニュース２０１６年０６月０１日号（Ｎｏ．６１２），ｐ．９にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０５月２６日、ゲノム編集２０１６（Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ２０１６の可能性）中央大学駿河台記念館２階２８１号室にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０２月２６日、ウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎａｋｏｓｈｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／６４８０３にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０２月１６日、ウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎａｋｏｓｈｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／８０４７９にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０４月、ウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｆｎｋｐｒｄｄａｔａ．ｂｌｏｂ．ｃｏｒｅ．ｗｉｎｄｏｗｓ．ｎｅｔ／ｄｏｍｅｓｔｉｃ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｐｄｆ／ＢＤＬ．＿ｓｌＯＤＮ＿ｅｘ＿ｆｌｙｅｒ．ｐｄｆにて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０４月、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉａｇｎｏｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｌｓＯＤＮｋｉｔ．ｐｄｆにて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０４月、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ－ｒｅｖ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１０／１１／ＢＤＬ＿１６０４０１＿ＢＲ＿ｌｓＯＤＮｋｉｔ．ｐｄｆにて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０３月１５日、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｍ．ｂｌｏｇ．ｎａｖｅｒ．ｃｏｍ／ｏｓｔｒｉｃｈ７４／２２０６５５３１９３９５にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０３月１５日、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｇ．ｎａｖｅｒ．ｃｏｍ／ｏｓｔｒｉｃｈ７４／２２０６５５３１９３９５にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０５月１７日、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｍ．ｂｌｏｇ．ｄａｕｍ．ｎｅｔ／ｃｏｒｅｓｃｉｅｎｃｅｓ／１０８？ｃａｔｅｇｏｒｙＩｄ＝２にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０３月、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂｒｉｃ．ｏｒｇ／ｍｙｂｏａｒｄ／ｒｅａｄ．ｐｈｐ？Ｂｏａｒｄ＝ｎｅｗ＿ｐｒｏｔｅｃｈ＆ｉｄ＝１３５２５１にて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０３月１１日、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｄｙｎａｍｉｃｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｄ＿ｄｓ６１０．ｈｔｍにて公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１６年０３月１１日、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｄｙｎａｍｉｃｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｅ／ｐｒｄ＿ｄｓ６１０．ｈｔｍにて公開
(73)【特許権者】
【識別番号】502418929
【氏名又は名称】株式会社バイオダイナミクス研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】長洞 仁
【審査官】松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】特表２００５－５２３７００（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００８／０２６８５０７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３２３７９５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５１１３０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】実験医学 2008年4月号、連載 効率の上がる核酸実験法、第4回 電気泳動における変性剤としての尿素の役割、[online]，[検索日:２０２２年１２月２７日]、インターネット：<https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/nucleic_acid/vol4.html>
【文献】生物物理化学、２００８，５２，１３３－１３８頁
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡを調製する方法であって、（１）（ａ）両端にそれぞれ少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を有する目的のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡであって、前記目的のＤＮＡ鎖は前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼによって同一鎖が切断される前記二本鎖ＤＮＡ、または（ｂ）一端に少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位と、他端に少なくとも１つの配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位とを有する目的のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡを提供する工程と、
（２）前記ニッキングエンドヌクレアーゼによって（ａ）の二本鎖ＤＮＡを切断し、または前記ニッキングエンドヌクレアーゼ及び前記配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位を認識する配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼによって（ｂ）の二本鎖ＤＮＡを切断し、分子量の異なる少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを生成する工程と、
（３）前記少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡに適当量の変性剤を添加して、前記一本鎖ＤＮＡを変性させる工程と、
（４）前記変性させた少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡと前記変性剤とを電気泳動ゲルへロードし、該電気泳動ゲル中でのゲル電気泳動によって一本鎖の状態で分離させ、目的の一本鎖ＤＮＡを含むバンドから一本鎖ＤＮＡを抽出することで目的の一本鎖ＤＮＡを調製する工程と
を有し、前記（１）～（４）までの工程において、前記目的の一本鎖ＤＮＡを調製するゲル電気泳動は前記（４）の工程のみで行う、方法。
【請求項2】
請求項１記載の方法において、二本鎖ＤＮＡが環状二本鎖ＤＮＡである方法。
【請求項3】
請求項１記載の方法において、二本鎖ＤＮＡがＯｒｉを有する環状二本鎖ＤＮＡである方法。
【請求項4】
請求項１記載の方法において、二本鎖ＤＮＡがプラスミドＤＮＡである方法。
【請求項5】
請求項１記載の方法において、
前記（１）の工程は、前記（ａ）であり、ここで、前記両端にそれぞれ少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位は、互いにタイプの異なるニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位であり、
前記（２）の工程は、タイプの異なるニッキングエンドヌクレアーゼによって（ａ）の二本鎖ＤＮＡを切断する方法。
【請求項6】
請求項１記載の方法において、目的のＤＮＡ鎖の長さが２００塩基以上である方法。
【請求項7】
請求項１記載の方法において、前記（４）の工程は、前記目的の一本鎖ＤＮＡを、非変性ゲルを用いたアクリルアミドゲル電気泳動又は非変性ゲルを用いたアガロースゲル電気泳動によって調製する工程である、方法。
【請求項8】
請求項１記載の方法において、前記ゲル電気泳動が、変性剤を含まない非変性アガロースゲル電気泳動、変性剤を含む変性アガロースゲル電気泳動、変性剤を含まない非変性アクリルアミドゲル電気泳動、または変性剤を含む変性アクリルアミドゲル電気泳動である、方法。
【請求項9】
請求項１記載の方法において、前記ゲル電気泳動が、アガロースゲル電気泳動である方法。
【請求項10】
請求項７記載の方法において、前記非変性ゲルは、前記（２）の工程で切断した二本鎖ＤＮＡの水素結合を切断して一本鎖へ乖離させる作用を持たないゲルである、方法。
【請求項11】
請求項７記載の方法において、前記（３）の工程の前に脱塩を行う、方法。
【請求項12】
請求項１記載の方法において、前記変性剤が、ホルムアミド、グリセロール、ウレア、チオウレア、エチレングリコール、または水酸化ナトリウムである、方法。
【請求項13】
請求項１２記載の方法において、前記変性剤が、５０％以上のグリセロールである、方法。
【請求項14】
請求項１２記載の方法において、前記変性剤が、２５％のホルムアミド又は６Ｍのウレアである、方法。
【請求項15】
請求項１記載の方法に用いるキットであって、（ａ）クローニング部位の両端にそれぞれ少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を有するプラスミドであって、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼによって同一鎖が切断されるプラスミド、及び（ｂ）クローニング部位の一端に少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位と、前記クローニング部位の他端に少なくとも１つの配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位と、を有するプラスミドから選択される少なくとも１つのプラスミドと、ＤＮＡの変性のための変性剤を含有する試薬と、を有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、長鎖の一本鎖ＤＮＡを調製する方法に関する。具体的には、本発明は、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を有するベクターまたは目的のＤＮＡ鎖を用いて、当該認識部位を切断することにより、長鎖の一本鎖ＤＮＡを調製する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
一本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡシークエンス、ＳＮＰ解析、ＤＮＡチップ、ＳＳＣＰ分析ＳＥＬＥＸなど、多くの分子生物学的実験に用いられている。その調製にはいくつかの手法が用いられており、大別して４種類の手法が知られている。１つ目は化学合成であり、近年、ＤＮＡの化学合成法が改善され、一本鎖のＤＮＡも安価に作成できるようになっている（非特許文献１）。２つ目はλエキソヌクレアーゼを用いる手法であり、リン酸化ＤＮＡオリゴマーを用いたＰＣＲ反応によって一方の鎖の５’末端のみにリン酸を導入し、λエキソヌクレアーゼによって当該リン酸化した一方の鎖のみを分解することにより、分解されずに残ったもう一方の一本鎖ＤＮＡを取得できる（非特許文献２）。３つ目はビオチンを用いる手法であり、ビオチン化ＤＮＡオリゴマーを用いたＰＣＲ反応によって一方の鎖のみにビオチンを導入し、アルカリ変性した後、アビジン被覆磁性ビーズで目的の鎖のみを回収できる（非特許文献３）。４つ目はＲＮＡを用いる手法であり、ＲＮＡを出発材料にして、逆転写酵素によって一本鎖ＤＮＡを取得した後、ＲＮＡをＲＮａｓｅで分解することにより、一本鎖ＤＮＡを取得できる（非特許文献４）。
【0003】
しかし、上述の各手法には、実際の分子生物学的実験に用いる際にいくつかの問題点があった。例えば、１つ目の化学合成を用いた場合には、合成可能な塩基の長さは２００塩基程度が限界であり（非特許文献１）、この長さは、一般的な大きさの遺伝子全体（１，０００塩基前後）をコードさせるには短すぎる（非特許文献５）。また、化学合成はエラー率が非常に高いことが知られており、原核生物や真核生物の複製機構のエラー率は１０－７～１０－８であるものの、化学合成で作成した典型的な人工遺伝子のエラー率は１０－２～１０－３である（非特許文献６）。この値から計算すると、生物が２００塩基の２本鎖ＤＮＡを作った場合は、９９．９９８％～９９．９９９８％が正しい配列であるが、同じく２００塩基の２本鎖ＤＮＡを化学合成オリゴマーから作成した場合には、正しい配列を持つものはわずか１３．４％～８１．９％しかない。また、この人工合成遺伝子のエラー率は、現在用いることのできる種々のエラー除去技術を駆使した上での結果であり、単純に２００塩基の長鎖一本鎖ＤＮＡを化学合成した場合には、この数値よりも高いエラー率となってしまう（非特許文献６）。
【0004】
また、２つ目のλエキソヌクレアーゼを用いる手法では、上記のとおり正確性の高いわけではない合成ＤＮＡオリゴマーを用いなくてはならないことに加えて、ＰＣＲを行うことに伴って目的の一本鎖ＤＮＡに変異が導入されてしまう、λエキソヌクレアーゼの副反応によって目的の一本鎖ＤＮＡも分解を受けてしまう、及びλエキソヌクレアーゼの反応が完結せずに２本鎖ＤＮＡが残存してしまうなどの問題がある（非特許文献２）。
【0005】
３つ目のビオチンを用いる方法では、２つ目の手法と同様に、正確性の高いわけではない合成ＤＮＡオリゴマーを用いなくてはならないことに加えて、ＰＣＲを行うことに伴って目的の一本鎖ＤＮＡに変異が導入されてしまう可能性があり、また、アルカリ変性後のアビジン被覆磁性ビーズで目的の鎖のみを回収する際に、変性が十分ではなく２本鎖ＤＮＡが残存してしまうなどの問題がある（非特許文献３）。
【0006】
４つ目のＲＮＡを用いる手法でも、上記の手法と同様に、正確性の高いわけではない合成ＤＮＡオリゴマーを逆転写反応のプライマーとして用いなくてはならないことに加えて、逆転写酵素による逆転写反応の正確性は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅを用いた場合の正確性と同程度であり、決して高いものではなく、変異が導入されてしまう可能性があり、また、その全体の工程は、転写によるＲＮＡの取得、逆転写酵素によるｃＤＮＡの作出、及びＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解となっており、複雑かつ煩雑な手順が必要となっており、その工程の途中において、逆転写反応が完結せずに途中で止まってしまったもの、すなわち５’末端に欠失を有するものができあがってしまい、正常なものと欠失を有するものとの混合物になるなどの問題があった（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Kosuri S, Church GM (2014) Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications. Nat Methods. 11(5):499-507.
【文献】Wakimoto Y, Jiang J, Wakimoto H. (2014) Isolation of single-stranded DNA. Curr Protoc Mol Biol. 1;107:2.15.1-9.
【文献】Avci-Adali M, Paul A, Wilhelm N, Ziemer G, Wendel HP. (2009) Upgrading SELEX technology by using lambda exonuclease digestion for single-stranded DNA generation. Molecules. 24;15(1):1-11.
【文献】Miura H, Gurumurthy CB, Sato T, Sato M, Ohtsuka M. (2015) CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Sci Rep. 10.1038/srep12799.
【文献】Mashiko D1, Young SA, Muto M, Kato H, Nozawa K, Ogawa M, Noda T, Kim YJ, Satouh Y, Fujihara Y, Ikawa M. (2014) Feasibility for a large scale mouse mutagenesis by injecting CRISPR/Cas plasmid into zygotes. Dev Growth Differ. 56(1):122-9
【文献】Ma S, Saaem I, Tian J. (2012) Error correction in gene synthesis technology. Trends Biotechnol. 30(3):147-54.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ところで、近年、ゲノム編集技術の発展に伴い、上述の手法では取得できない長鎖の一本鎖ＤＮＡの需要が高まっている（非特許文献４）。例えば、ラットやマウスを含む動物の受精卵を用いたゲノム編集においては、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳまたはＴＡＬＥＮを用いて、ゲノム上の特定の位置や特定の遺伝子を破壊（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）したり、さらにはｓｓＯＤＮ（single-strand oligodeoxynucleotide; 短鎖一本鎖ＤＮＡ）をドナーとして用いることによって、塩基置換やＳＮＰ変異などの小さな領域における正確な改変や導入（ｋｎｏｃｋ ｉｎ）が行われるようになっている。その一方で、より大きな領域の改変、すなわち特定の遺伝子全体を導入したり、機能解析のためのＧＦＰやＣｒｅリコンビナーゼなどの遺伝子全体を導入したいといった要望も存在している。
【0009】
受精卵を用いたゲノム編集の場合、細胞を用いたゲノム編集の場合のような薬剤による選択を行うことができないことから、効率よくゲノム編集を行うためには、ｋｎｏｃｋ ｉｎ自体の効率を上げる必要がある。しかし、従来のｓｓＯＤＮをドナーとして用いる方法は、確かに二本鎖ＤＮＡをドナーとして用いる方法に比べて導入効率が非常に高く、有用であるものの、上述のように２００塩基以上の長さの一本鎖ＤＮＡを正確に作製することは技術的に困難であるため（非特許文献４）。そのため、仮に２００塩基以上の長さの一本鎖ＤＮＡを作成できたとしても、二本鎖ＤＮＡが混入していたり、末端や内部に変異が導入されていたり、不均一なものであったりと、受精卵に導入するためには質的な問題を乗り越える必要があった。
【0010】
また、ゲノム編集によって目的のＤＮＡをｋｎｏｃｋ ｉｎする場合、二本鎖ＤＮＡが混入していると、ゲノム上の目的箇所以外の場所への二本鎖ＤＮＡの組み込みが起こってしまうという問題が指摘されている（非特許文献５）。
【0011】
さらに、ゲノム編集によって目的のＤＮＡをｋｎｏｃｋ ｉｎする場合、その導入効率は高くても１０％～２０％程度であり、受精卵を用いる場合には、個体を得るのに１ヶ月～２ヵ月を要する。また、細胞ではなく個体を扱うものであるため、手間も余計にかかってしまう。したがって、受精卵を用いたゲノム編集の基礎となるはずの一本鎖ＤＮＡに高い割合で変異や欠失が起きてしまっていては、正確なｋｎｏｃｋ ｉｎ個体を得るためには、大きな労力を費やしてしまうことになる。
【0012】
そのため、正確な配列を有し、均一かつ二本鎖ＤＮＡが混入しない、長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する際に、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を用いることにより、分子生物学的実験において多用され、また、ゲノム編集の分野でも望まれている正確な長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法を提供することを目的とする。
【0014】
本発明者らは、このような課題を解決するために、二本鎖ＤＮＡを元にして目的の長鎖一本鎖ＤＮＡを調製できるかどうかを検討した。そして鋭意研究を重ねた結果、目的の一本鎖ＤＮＡを有する二本鎖ＤＮＡをクローニングしたベクターに、ニッキングエンドヌクレアーゼを用いてニックを導入することにより、二本鎖ＤＮＡを変性ないし分離させて目的の長鎖一本鎖ＤＮＡを調製することができることを見出した。
【0015】
具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法であって、（１）（ａ）クローニング部位の両端にそれぞれ少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を有するベクターであって、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼによって同一鎖が切断されるベクター、または（ｂ）クローニング部位の一端に少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位と、前記クローニング部位の他端に少なくとも１つの配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位とを有するベクターに、目的のＤＮＡ鎖をクローニングする工程と、（２）前記ニッキングエンドヌクレアーゼによって、前記目的のＤＮＡ鎖がクローニングされた（ａ）のベクターを切断し、または前記ニッキングエンドヌクレアーゼ及び前記配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位を認識する配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼによって、前記目的のＤＮＡ鎖がクローニングされた（ｂ）のベクターを切断し、分子量の異なる少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを生成する工程と、（３）前記少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡに適当量の変性剤を添加して、前記一本鎖ＤＮＡを変性させる工程と、
（４）前記変性させた少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを任意の分離手段によって分離させ、目的の一本鎖ＤＮＡを調製する工程とを有する、方法が提供される。
（４）前記変性させた少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを任意の分離手段によって分離させ、目的の一本鎖ＤＮＡを調製する工程とを有する、方法が提供される。
【0016】
また、本願発明の第二の主要な観点によれば、長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法であって、（１）（ａ）両端にそれぞれ少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を有する目的のＤＮＡ鎖であって、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼによって同一鎖が切断される目的のＤＮＡ鎖、または（ｂ）一端に少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位と、他端に少なくとも１つの配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位とを有する目的のＤＮＡ鎖を、ベクターにクローニングする工程と、（２）前記ニッキングエンドヌクレアーゼによって、（ａ）の目的のＤＮＡ鎖がクローニングされたベクターを切断し、または前記ニッキングエンドヌクレアーゼ及び前記配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位を認識する配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼによって、（ｂ）の目的のＤＮＡ鎖がクローニングされたベクターを切断し、分子量の異なる少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを生成する工程と、（３）前記少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡに適当量の変性剤を添加して、前記一本鎖ＤＮＡを変性させる工程と、（４）前記変性させた少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを任意の分離手段によって分離させ、目的の一本鎖ＤＮＡを調製する工程とを有する、方法が提供される。
【0017】
このような構成によれば、変異や末端の欠失がなく、正確な配列を有し、二本鎖ＤＮＡを混入することなく、数千塩基までの均一の長さの形の一本鎖ＤＮＡを提供することができる。
【0018】
また、本願発明の一実施形態によれば、上述の方法において、前記目的のＤＮＡ鎖が２００塩基以上であることが好ましい。また、本発明の他の一実施形態によれば、前記目的のＤＮＡ鎖は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、少なくとも７００塩基、少なくとも８００塩基、少なくとも９００塩基、または少なくとも１０００塩基である。
【0019】
また、本願発明の別の一実施形態によれば、前記任意の分離手段はゲル電気泳動である。この場合、ゲル電気泳動としては、変性剤を含まない非変性アガロースゲル電気泳動、変性剤を含む変性アガロースゲル電気泳動、変性剤を含まない非変性アクリルアミドゲル電気泳動、または変性剤を含む変性アクリルアミドゲル電気泳動が好ましい。
【0020】
さらに、本発明の別の一実施形態によれば、前記任意の分離手段はゲルカラムクロマトグラフィーである。この場合、本発明の一実施形態によれば、ゲルカラムクロマトグラフィーとしては、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、イオン交換ゲルカラムクロマトグラフィー、またはアフィニティーゲルカラムクロマトグラフィーが好ましい。
【0021】
また、本発明の一実施形態によれば、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位の塩基数は、少なくとも３塩基である。また、本発明の他の一実施形態によれば、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位の塩基数は、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、または７塩基が好ましい。この場合、本発明の一実施形態によれば、ニッキングエンドヌクレアーゼとしては、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．Ｍｖａ１２６９Ｉ、Ｎｔ．Ｂｐｕ１０Ｉ、またはＮｂ．ＢｓｓＳＩが好ましい。
【0022】
また、本発明の他の一実施形態によれば、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位には、ガイドＲＮＡが結合することができる。この場合、前記ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９のＤ１０Ａ変異体であることが好ましい。
【0023】
さらに、本発明の他の一実施形態によれば、前記配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位は、制限酵素およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される酵素、またはＴＡＬＥＮの認識部位とすることができる。この場合、前記メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、またはＰＩ－ＳｃｅＩであることが好ましい。
【0024】
さらに、本発明の他の一実施形態によれば、前記配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位には、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡが結合することができる。この場合、
前記配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＡｒｇｏｎａｕｔｅであることが好ましい。
前記配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＡｒｇｏｎａｕｔｅであることが好ましい。
【0025】
また、本発明の別の一実施形態によれば、前記変性剤は、ホルムアミド、グリセロール、ウレア、チオウレア、エチレングリコール、または水酸化ナトリウムである。また、この場合、前記変性剤は、ホルムアミドまたはグリセロールが好ましい。
【0026】
また、本願発明の第三の主要な観点によれば、上述の本願発明の第一または第二の主要な観点の方法に用いるキットであって、（ａ）クローニング部位の両端にそれぞれ少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を有するベクターであって、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼによって同一鎖が切断されるベクター、及び（ｂ）クローニング部位の一端に少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位と、前記クローニング部位の他端に少なくとも１つの配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位とを有するベクターから選択される少なくとも１つのベクターを有する、キットが提供される。
【0027】
また、本願発明の一実施形態によれば、上述のキットであって、さらに、ＤＮＡの変性のための変性剤を含有する試薬を有する、キットが提供される。
【0028】
さらに、本願発明の第四の主要な観点によれば、上述の本願発明の第二の主要な観点の方法に用いるキットであって、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を含まないベクターを有する、キットが提供される。
【0029】
また、本願発明の別の一実施形態によれば、上述のキットであって、さらに、ＤＮＡの変性のための変性剤を含有する試薬を有する、キットが提供される。
【0030】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図2】図２は、本願発明の一実施形態に係る方法において用いられるベクターのプラスミドマップ（図２Ａ）、当該ベクターにおけるマルチクローニングサイト（図２Ｂ）、一本鎖ＤＮＡを取得するためのクローニングの際の酵素の組合せ（図２Ｃ）、及び全配列（図２Ｄ、配列ＩＤ番号１）を示す模式図である。
【図4】図４は、本願発明の一実施形態に係る方法を用いて得た電気泳動の結果である。２ヶ所のニックを導入したpLSODN-1（１．５ｋｂ断片）プラスミドにホルムアミドを加え、熱変性の後、１．２％濃度の非変性のアガロースゲルで１×ＴＡＥ緩衝液を泳動液として電気泳動した。レーン１には１０μｇ、レーン２には５μｇのプラスミドをロードした。
【図5】図５は、本願発明の一実施形態に係る方法を用いて得た電気泳動の結果である。各レーンは、それぞれ、２ヶ所のニックを導入したpLSODN-1（１．５ｋｂ断片）プラスミド（２００ｎｇ：レーン１）、及び精製した１．５ｋｂ長鎖一本鎖ＤＮＡ（２００ｎｇ：レーン２）である。
【図6】図６は、本願発明の一実施形態に係る方法において用いられるクローニングベクターpETUK (del)のプラスミドマップ（図６Ａ）、マルチクローニングサイトの配列（図６Ｂ）、及び全配列（図６Ｃ、配列ＩＤ番号３）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【0032】
以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。
本願発明の一実施形態に係る長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法は、上述したように、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位、またはニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位および配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位を有するベクターを用いて目的ＤＮＡをクローニングし、適切な酵素を用いて切断し、電気泳動し、その後、目的の一本鎖ＤＮＡを含むゲルを切り出すことにより、目的の長鎖一本鎖ＤＮＡを調整する。
本願発明の一実施形態に係る長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法は、上述したように、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位、またはニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位および配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位を有するベクターを用いて目的ＤＮＡをクローニングし、適切な酵素を用いて切断し、電気泳動し、その後、目的の一本鎖ＤＮＡを含むゲルを切り出すことにより、目的の長鎖一本鎖ＤＮＡを調整する。
【0033】
また、本願発明の他の一実施形態に係る長鎖一本鎖ＤＮＡを調製する方法では、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位、またはニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位および配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位を有する目的ＤＮＡを用いて、クローニングベクターにクローニングし、適切な酵素を用いて切断し、電気泳動し、その後、目的の一本鎖ＤＮＡを含むゲルを切り出すことにより、目的の長鎖一本鎖ＤＮＡを調整する。
【0034】
上述の従来の一本鎖ＤＮＡ調製の４種類の手法の問題点を整理すると、（１）長鎖一本鎖ＤＮＡの取得の困難さの問題、（２）内部変異や末端の欠失など配列の正確性とサイズの不均一性の問題、（３）二本鎖ＤＮＡの混入の問題、（４）操作工程の煩雑さの問題、が挙げられる。本願発明に係る方法よれば、以下のように、いずれも従来の手法よりも優れたものであることが容易に理解できる。
【0035】
まず、（１）の一本鎖ＤＮＡの長さの問題については、本願発明に係る方法では、ニッキングエンドヌクレアーゼ、またはニッキングエンドヌクレアーゼと配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼとにより分子量の異なる３種類のＤＮＡ分子を生成し、その後、変性ないし分離することよって、目的の長鎖一本鎖ＤＮＡの調製を可能にしている。そして、後述の問題（３）のとおり、本願発明に係る方法では、目的の長鎖一本鎖ＤＮＡに他のＤＮＡ分子が混入することを防ぐため、分離のためにゲル電気泳動を用いる場合、目的の長鎖一本鎖ＤＮＡの大きさは、ベクターの約半分程度の大きさとすることが好ましい。すなわち、目的の長鎖一本鎖ＤＮＡが電気泳動の際にゲルの先端まで流れ、他のＤＮＡ分子と十分な距離が得られるようにして、目的のバンドのみを切り出すことを可能にしている。このような長さの制約があったとしても、例えば１万２千塩基程度のベクターを使用する場合、６千～７千塩基程度の長さの一本鎖ＤＮＡを調製することができる。このような長さの一本鎖ＤＮＡは、上述の従来の方法では得られない長さであり、また１つの構造遺伝子をコードする配列として充分な長さである。また理論的には、コスミドベクター（３０ｋｂｐ～４５ｋｂｐ）、ＢＡＣベクター（～３００ｋｂｐ）、またはＹＡＣベクター（数Ｍｂｐ）を使用する場合には、本願発明に係る方法によって、より大きな長鎖一本鎖ＤＮＡを調製することができる。
【0036】
次に、（２）の内部変異や末端の欠失の問題について、本願発明に係る方法によって調製される一本鎖ＤＮＡは、ベクターにクローニングされたＤＮＡ由来であるため、そのエラー率は、原核生物の複製機構のエラー率１０－７～１０－８と同程度であり、一本鎖ＤＮＡの通常の使用には無視できるほど小さい（非特許文献６）。また、本願発明に係る方法によって調製される一本鎖ＤＮＡが、塩基認識の正確性の高い制限酵素などの配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼや、制限酵素に由来するニッキングエンドヌクレアーゼによって調製されるものであるため、変異や末端の不均一性も通常の実験には無視できる範囲である。
【0037】
また、（３）の二本鎖ＤＮＡの混入の問題については、本願発明に係る方法によれば、電気泳動に際して、目的の一本鎖ＤＮＡの大きさをベクターの半分程度の大きさとし、かつ目的の一本鎖ＤＮＡがゲルの先端まで流れるように目的の一本鎖ＤＮＡの分子量を調製し、目的の一本鎖ＤＮＡと他のＤＮＡとが充分に分離するように電気泳動を行えば、二本鎖ＤＮＡの混入は起こらない。
【0038】
そして、（４）の操作工程の煩雑さの問題については、本願発明に係る方法は非常に単純な原理を利用するものあるため、本願発明によれば、ベクターにクローニングさえされていれば、ニッキングエンドヌクレアーゼによる切断から電気泳動、バンドの切り出し抽出までを、半日、長くても一日で終えることができる。
【0039】
本願発明の一実施形態に係る方法の一連の流れを示す模式図を図１に示した。まず、図１Ａにおいて、同一鎖側を切断できる向きでニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を有するベクターＤＮＡに、長鎖一本鎖ＤＮＡとなる目的のＤＮＡを、その両端に前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位が配置されるようにクローニングし、または同一鎖側を切断できる向きでニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位および配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位を有するベクターＤＮＡに、長鎖一本鎖ＤＮＡとなる目的のＤＮＡを、その両端に前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位および配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位がそれぞれ配置されるようにクローニングする。この際、ベクターＤＮＡは、そのクローニング部位の両端に、複数のニッキングエンドヌクレアーゼまたは配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼの認識部位を有していてもよい。
【0040】
また、本願発明の一実施形態において、ニッキングエンドヌクレアーゼまたは配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼの認識部位は、ベクターＤＮＡの代わりに、クローニングされる目的のＤＮＡの両端に備えるようにすることもできる。
【0041】
続いて、図１Ｂにおいて、ベクターＤＮＡまたは目的のＤＮＡが有するニッキングエンドヌクレアーゼ、またはニッキングエンドヌクレアーゼ及び配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼを用いて、上述の目的のＤＮＡがクローニングされたベクターを切断する。これにより、分子量の異なる３つの一本鎖ＤＮＡが生成される。なお、切断のための酵素としてニッキングエンドヌクレアーゼのみを用いた場合には２つの直鎖状配列および１つの環状配列が生成され、ニッキングエンドヌクレアーゼと配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼとを用いた場合には３つの直鎖状配列が生成されることになる。
【0042】
ニッキングエンドヌクレアーゼや配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼを用いてベクターを切断しただけでは、その切断された配列は完全な一本鎖の状態になっているわけではなく、その相補鎖と水素結合によって結合している状態である。そのため、ニッキングエンドヌクレアーゼや配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼを用いてベクターを処理した後、上記のようにして得た試料に変性剤を加え、適当な処理を行い変性させて完全な一本鎖ＤＮＡの状態にさせる。そして、分子量の異なる３つの一本鎖ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供し、分子量によって分離させる（図１Ｃ）。この際、「適当な処理」としては、熱処理、インキュベーション、オーバーナイトで静置などが挙げられるが、変性剤によって分子量の異なる３つの一本鎖ＤＮＡが変性ないし分離するものであれば、これらに限られるものではない。このようにして分子量の異なる３つの一本鎖ＤＮＡを分離させた後、目的の一本鎖ＤＮＡのバンドを含むゲル片を切り出し、抽出することによって目的の一本鎖ＤＮＡを調製することができる（図１Ｄ）。図１Ｂからも明らかなとおり、本願発明によって分子量の異なる３つの一本鎖ＤＮＡを生成すると、目的の一本鎖ＤＮＡは、必ず一番分子量の小さい配列となるため、電気泳動後のゲルの切り出しは、一番下まで流れてきたバンドを切り出せばよい。
【0043】
本願発明において、「ニッキングエンドヌクレアーゼ」とは、ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼであって、特定のヌクレオチド配列を認識して、当該ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸のいずれか一方の鎖のみを切断することができるものをいう。このニッキングエンドヌクレアーゼにより、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のホスホジエステル結合が開裂する。このような活性を示す多くのエンドヌクレアーゼは、その認識配列とともに知られており、当業者であれば、これらのエンドヌクレアーゼの中から適宜選択して本願発明に使用することができる。なお、本願明細書では、ニッキングエンドヌクレアーゼを「ニッキング酵素」または「ニッカーゼ」と呼ぶことがあるが、いずれも同意である。
【0044】
本願発明の一実施形態において、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識部位の塩基数は、少なくとも３塩基であり、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基であっても良い。このようなエンドヌクレアーゼとしては、例えば、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ（認識部位の塩基数７：5'-GC/TGAGG-3'）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（認識部位の塩基数６：5'-NG/CATTC-3'）、Ｎｂ．ＢｔｓＩ（認識部位の塩基数６：5'-NN/CACTGC-3'）、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ（認識部位の塩基数６：5'-NN/CATTGC-3'）、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（認識部位の塩基数７：5'-GCTCTTCN/-3'）、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（認識部位の塩基数７：5'-CC/TCAGC-3'）、Ｎｔ．ＡｌｗＩ（認識部位の塩基数５：5'-GGATCNNNN/N-3'）、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ（認識部位の塩基数５：5'-GTCTCN/N-3'）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（認識部位の塩基数５：5'-GAGTCNNNN/N-3'）、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ（認識部位の塩基数３：5'-/CCD-3'）、Ｎｂ．Ｍｖａ１２６９Ｉ（認識部位の塩基数６：5'-G/CATTC-3'）、Ｎｔ．Ｂｐｕ１０Ｉ（認識部位の塩基数７：5'-CC/TNAGC-3'）、及びＮｂ．ＢｓｓＳＩ（認識部位の塩基数６：5'-C/TCGTG-3'）が挙げられるが（括弧内に認識部位の塩基数、およびその配列を示した。）、これらの酵素に限られるものではない。ここで、「/」は切断箇所を、「N」はA、T、G、またはCのいずれかのヌクレオチドを、「D」はA、T、またはGのいずれかのヌクレオチドを、それぞれ示す。
【0045】
また、近年、新たに人工的なニッキングエンドヌクレアーゼとしてゲノム編集に用いられるＣＡＳ９タンパク質にＤ１０Ａ変異を導入した、ＣＡＳ９ Ｄ１０Ａニッカーゼが開発された（Ran FA, Hsu PD, Lin CY, Gootenberg JS, Konermann S, Trevino AE, Scott DA, Inoue A, Matoba S, Zhang Y, Zhang F.（2013）Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 12;154(6):1380-9.）。本願発明の一実施形態においては、このような人工的に作製されたニッカーゼ（ニッキングエンドヌクレアーゼ）も用いることができる。
【0046】
ニッキングエンドヌクレアーゼとしてＣＡＳ９のＤ１０Ａ変異型を用いる場合、ＤＮＡ二本鎖を切断することなく、一本鎖のみを切断してニックを入れるというＣＡＳ９のＤ１０Ａ変異型の特性を利用して、目的の一本鎖ＤＮＡを調製できる。また、ＣＡＳ９のＤ１０Ａ変異型を用いる場合、「ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位」には、その塩基配列と相補的な配列を有するガイドＲＮＡが結合することができる。そして、ガイドＲＮＡとＣＡＳ９のＤ１０Ａ変異型との複合体が、ガイドＲＮＡを介して二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を認識してニックを入れる。本願発明の一実施形態において、ガイドＲＮＡの認識配列の長さは少なくとも５塩基であり、好ましくは約２０塩基である。
【0047】
また、本願発明において、「配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ」とは、特定のＤＮＡの配列を認識して二本鎖を切断させることができるものであれば良く、種々の既知の酵素や、エンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を用いることができる。また、その切断の態様は、粘着末端および平滑末端のいずれを生成するものであっても良い。例えば、本願発明の一実施形態において、「配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ」としては、種々の制限酵素や、Ｉ-ＣｅｕＩ、Ｉ-ＳｃｅＩ、ＰＩ-ＰｓｐＩ、またはＰＩ-ＳｃｅＩなどのメガヌクレアーゼ、または制限酵素であるＦｏｋＩをＤＮＡ切断ドメインとし、かつＴＡＬＥタンパク質をＤＮＡ結合ドメインとして融合させた人工ヌクレアーゼであるＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）(Cermak T1, Doyle EL, Christian M, Wang L, Zhang Y, Schmidt C, Baller JA, Somia NV, Bogdanove AJ, Voytas DF. (2011) Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. Jul;39(12):e82.)を用いることができ、これらに限られるものではない。
【0048】
さらに、本願発明の一実施形態においては、「配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ」として、ＤＮＡ切断能のみを有し、ＤＮＡ結合能を有する他の分子とともに機能するタンパク質を用いることもできる。例えば、ＤＮＡ結合能をガイドＲＮＡに依存するＣＡＳ９タンパク質（Jinek M1, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 17;337(6096):816-21.）や、ＤＮＡ結合能をガイドＤＮＡに依存するＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（Gao F, Shen XZ, Jiang F, Wu Y, Han C (2016) DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. Nat Biotechnol. 34(7):768-73.）なども用いることができるが、これらに限られるものではない。また、本願発明の一実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡの認識配列の長さは少なくとも５塩基であり、好ましくは約２０塩基である。
【0049】
本願発明においては、上述のようなニッキングエンドヌクレアーゼを用いて、またはニッキングエンドヌクレアーゼ及び配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼの組み合せを用いて、目的のＤＮＡ鎖がクローニングされたベクターを切断し、分子量の異なる少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを生成することができる。この際、ニッキングエンドヌクレアーゼまたは配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼの認識部位は、ベクター側、または目的のＤＮＡ側のいずれに存在していても良い。
【0050】
本願発明の一実施形態において、「目的のＤＮＡ鎖」、「目的の一本鎖ＤＮＡ」、または「長鎖一本鎖ＤＮＡ」とは、少なくとも２００塩基を有する配列をいう。また、本願発明の一実施形態において、「目的のＤＮＡ鎖」、「目的の一本鎖ＤＮＡ」、または「長鎖一本鎖ＤＮＡ」としては、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、少なくとも７００塩基、少なくとも８００塩基、少なくとも９００塩基、少なくとも１，０００塩基、少なくとも１，５００塩基、少なくとも２，０００塩基、少なくとも２，５００塩基、少なくとも３，０００塩基、少なくとも３，５００塩基、少なくとも４，０００塩基、少なくとも４，５００塩基、少なくとも５，０００塩基、少なくとも５，５００塩基、少なくとも６，０００塩基、少なくとも６，５００塩基、少なくとも７，０００塩基、少なくとも７，５００塩基、少なくとも８，０００塩基、少なくとも８，５００塩基、少なくとも９，０００塩基、少なくとも９，５００塩基、少なくとも１０，０００塩基とすることができる。
【0051】
本願発明において、「任意の分離手段」とは、分子量の異なる少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを変性させた後に、当該変性した少なくとも３種類の一本鎖ＤＮＡを、個々の一本鎖ＤＮＡに分離し得る任意の手段を指す。例えば、任意の分離手段としては、ゲル電気泳動およびゲルカラムクロマトグラフィーが挙げられるが、これに限られるものではない。
【0052】
また、本願発明の一実施形態において、ゲル電気泳動は、ゲルやバッファーに変性剤を含んでいても良く、また含まなくても良い。例えば、本願発明の一実施形態において用いられるゲル電気泳動としては、変性剤を含まない非変性アガロースゲル電気泳動、変性剤を含む変性アガロースゲル電気泳動、変性剤を含まない非変性アクリルアミドゲル電気泳動、または変性剤を含む変性アクリルアミドゲル電気泳動が挙げられるが、これに限られるものではない。
【0053】
本願発明の一実施形態において、ゲル電気泳動を用いる場合、数千塩基もの大きさの二本鎖ＤＮＡに、Ｔｍを低下させる物理的変性剤を加えて加熱変性させ、一本鎖ＤＮＡの状態に分離させ、通常の非変性ゲルにロードするだけで、ＤＮＡを一本鎖の状態に維持したまま電気泳動することができる。例えば、後述の実施例では、４，７５１塩基の二本鎖ＤＮＡを用いている。また、本発明者らは、９，５４７塩基の二本鎖ＤＮＡを用いた場合にも、調製された一本鎖ＤＮＡが、一本鎖の状態で電気泳動可能であることを確認している。この際、電気泳動ゲルにロードするプラスミドの濃度は、１μｇ／μｌという高い濃度であっても、一本鎖に変性し、充分な解像度をもって、分子量の違いによって分離可能である。
【0054】
本願発明の一実施形態において、「任意の分離手段」としてゲルカラムクロマトグラフィーを用いる場合、ゲルカラムクロマトグラフィーは、任意のものを使用することができる。例えば、本願発明の一実施形態において用いられるゲルカラムクロマトグラフィーとしては、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、イオン交換ゲルカラムクロマトグラフィー、またはアフィニティーゲルカラムクロマトグラフィーが挙げられるが、これに限られるものではない。
【0055】
また、本願発明の一実施形態において、「変性剤」とは、物理的または化学的作用によって二本鎖ＤＮＡの水素結合を切断し、一本鎖へ乖離させる作用をもつ試薬を指す。本願発明においては、上述したように、ニッキングエンドヌクレアーゼを用いて、またはニッキングエンドヌクレアーゼ及び配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼの組み合せを用いてベクターを処理して得た試料は、ニックが入っているものの、完全な一本鎖ＤＮＡに分離しているわけではない。そのため、分子量の異なる３種類の一本鎖ＤＮＡに個々に分離させるため、ニックを入れたベクターに変性剤を加える。本願発明の一実施形態において、物理的変性剤としては、例えば、溶媒の極性を下げ、核酸の塩基部分のスタッキング等の疎水性相互作用を弱めるホルムアミド、グリセロール、若しくはウレアなど、または塩基の脱プロトン化による水素結合形成の阻害を誘導するアルカリ性試薬である水酸化ナトリウムなどが挙げられるが、これに限られるものではない。また、本願発明の一実施形態において、化学的変性剤としては、例えば、核酸とシッフ塩基を形成するホルムアルデヒドやグリオキサールなどが挙げられるが、これに限られるものではない。さらに、本願発明の一実施形態において、電気泳動の際の変性剤としては、チオウレアやエチレングリコールなども使用することが可能である。
【0056】
ここで、長鎖のＲＮＡの電気泳動の場合は、ホルムアミドなどの物理的変性剤で変性させた後、ホルムアルデヒドやグリオキサールなどの化学的変性剤によって、変性状態を共有結合的に固定化してから、同じくホルムアルデヒドを含むアガロースゲル中で電気泳動を行う。すなわち、変性状態を維持するためローディングバッファー中ばかりでなく、ゲル中でも、ＲＮＡを化学的変性剤に暴露しておく必要がある。このＲＮＡの電気泳動の場合から推測すると、一本鎖ＤＮＡの変性ゲル電気泳動においても、電気泳動前に化学的変性剤によって変性を固定化した後、同じ化学的変性剤を加えたアガロースゲルを用いないと、相補鎖との再アニールを防ぎ、一本鎖状態を保ったままで電気泳動することはできないと考えられる。しかしながら、共有結合性の変性剤は、可逆的に結合を外すことはできるが、何らかの副反応を伴う可能性が否定できない。すなわち、化学的な変性剤を用いると、ＤＮＡ中に変異を起こさせる可能性を排除できない。また、これらの化学的変性剤は極めて毒性や刺激性が強く、実際に実験を行う際には、扱いに注意が必要であり、危険かつ簡便性に欠ける。
【0057】
以上によれば、安全性、簡便性、およびＤＮＡの損傷を防ぐという観点から、本願発明の一実施形態において、物理的変性剤のみによって長鎖一本鎖ＤＮＡを変性させた後、非変性ゲルを用いてゲル電気泳動することが好ましい。
【0058】
物理的変性剤を用いて電気泳動を行う場合、電気泳動ゲルのウエル中にある一本鎖ＤＮＡは、電気泳動が開始されると、ローディングバッファーに含まれている物理的変性剤の元を離れて、非変性ゲルの中に入っていく。本願発明者らは、非変性ゲル中に入った後の一本鎖ＤＮＡが、従来考えられていたほど容易には相補鎖と再アニールすることはないということを発見している。つまり、本発明者らは、変性した一本鎖ＤＮＡは、非変性ゲル中においても、一本鎖のまま安定的に電気泳動されるという知見を得ている。
【0059】
また、本発明者らは、非変性ゲル中で電気泳動される一本鎖ＤＮＡも、分子量に基づいて泳動され、その解像度は、一本鎖ＤＮＡの調製という本発明の用途としては、必要かつ充分であるという知見を得ている。すなわち、ゲル中の一本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡや化学的変性剤によって変性が固定化したＲＮＡと同様に、安定した構造ではないことから、ゲル中で二次的な構造を形成するはずである。そのため、電気泳動の移動度と分子量の対数値（ｌｏｇ１０ Ｍ）との間にある単純で正確な比例関係は成立しないものの、本願発明は微妙な分子量の違いを分析するものではないため、そのような精緻な数学的関係性までは必要としない。
【0060】
また、本願発明の一実施形態に係る方法を実施するためのキットには、（ａ）クローニング部位の両端にそれぞれ少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を有するベクターであって、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼによって同一鎖が切断されるベクター、及び（ｂ）クローニング部位の一端に少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位と、前記クローニング部位の他端に少なくとも１つの配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼ認識部位とを有するベクターから選択される少なくとも１つのベクターが包含される。すなわち、上述の（ａ）及び（ｂ）のいずれのベクターも、ベクター自体に少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位が存在しているため、目的の一本鎖ＤＮＡの元となる、クローニングされる二本鎖ＤＮＡにはニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位があってもなくても良い。
【0061】
一方で、本願発明の一実施形態においては、上述のとおり、ニッキングエンドヌクレアーゼまたは配列特異的二本鎖切断エンドヌクレアーゼの認識部位を、ベクターＤＮＡの代わりに、クローニングされる目的のＤＮＡの両端に備えるようにすることもでき、この場合、キットに包含されるベクターとしては、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を含まないものが好ましい。
【0062】
また、本願発明の一実施形態において、上述のキットにはＤＮＡの変性のための変性剤を含有することもできる。
【実施例】
【0063】
以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0064】
後述の実施例１ではマルチクローニングサイトにニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を配置したクローニングベクターを用いた場合の目的ＤＮＡのクローニング手順を、実施例２は目的ＤＮＡをクローニングしたベクターのニッキングエンドヌクレアーゼによる消化手順（図１Ｂ）を、実施例３はニッキングエンドヌクレアーゼ処理した目的ＤＮＡをクローニングしたベクターを、変性剤により加熱変性し、非変性条件でのアガロースゲル電気泳動を行い、目的長鎖一本鎖ＤＮＡの抽出精製までの手順（図１Ｃ及び図１Ｄ）を、それぞれ示す。実施例４では、全域からニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を除いたベクターを用いて、ＧＦＰ遺伝子全域を含む長鎖一本鎖ＤＮＡの調製を行った例を示す。実施例５では、２ヶ所のニックを導入したpLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）プラスミドの種々の変性剤による変性の効果を示す。
【実施例1】
【0065】
クローニングベクターへの目的ＤＮＡのクローニング
実施例１では、長鎖一本鎖ＤＮＡを調製するためのモデルＤＮＡ断片としてλファージ由来の１．５ｋｂ ＤＮＡ断片（λファージDNA 38,951-40,450、図３）を用いた。クローニングベクターとしてはマルチクローニングサイトに複数のニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を配置したpLSODN-1を用いた。図２ＡにクローニングベクターpLSODN-1のプラスミドマップを、図２Ｂにマルチクローニングサイトの配列を、図２Ｃに一本鎖ＤＮＡを取得するためのクローニングの際の酵素の組合せを、図２Ｄに全域の塩基配列を示す。図２Ｂでは、ボックスで示すサイトがニッキングエンドヌクレアーゼサイトであり、そのニック導入位置を矢印で示す。図２Ｂに示すように、中央に４種類のＮｂタイプのニッキングエンドヌクレアーゼサイトと１種のＮｔタイプのニッキングエンドヌクレアーゼサイトが、同一側のＤＮＡ鎖を切断できるように、向き合う形で配置してある。Ｎｂタイプのニッキング酵素サイトの外側上流には、５’オーバーハング粘着末端を生じる６塩基または８塩基認識の制限酵素サイトが、Ｎｔタイプのニッキング酵素サイトの外側下流には３’オーバーハングの粘着末端を生じる６塩基認識の制限酵素サイトが配置してある。図２Ｃに示すように、長鎖一本鎖ＤＮＡを取得するための目的のＤＮＡ断片は、ＮｂタイプとＮｔタイプの二つのニッキング酵素サイトの間（丸数字１、中央図）か、Ｎｔタイプのニッキング酵素サイトと５’オーバーハング粘着末端を生じる６塩基認識の制限酵素サイトの間（丸数字２、左図）、Ｎｂタイプのニッキング酵素と３’オーバーハングの粘着末端を生じる６塩基認識の制限酵素サイトの間（丸数字３、右図）にクローニングした。ここでは、Nb.BsrDIとNt.BspQIの2つのニッキングエンドヌクレアーゼサイトを利用した。
実施例１では、長鎖一本鎖ＤＮＡを調製するためのモデルＤＮＡ断片としてλファージ由来の１．５ｋｂ ＤＮＡ断片（λファージDNA 38,951-40,450、図３）を用いた。クローニングベクターとしてはマルチクローニングサイトに複数のニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を配置したpLSODN-1を用いた。図２ＡにクローニングベクターpLSODN-1のプラスミドマップを、図２Ｂにマルチクローニングサイトの配列を、図２Ｃに一本鎖ＤＮＡを取得するためのクローニングの際の酵素の組合せを、図２Ｄに全域の塩基配列を示す。図２Ｂでは、ボックスで示すサイトがニッキングエンドヌクレアーゼサイトであり、そのニック導入位置を矢印で示す。図２Ｂに示すように、中央に４種類のＮｂタイプのニッキングエンドヌクレアーゼサイトと１種のＮｔタイプのニッキングエンドヌクレアーゼサイトが、同一側のＤＮＡ鎖を切断できるように、向き合う形で配置してある。Ｎｂタイプのニッキング酵素サイトの外側上流には、５’オーバーハング粘着末端を生じる６塩基または８塩基認識の制限酵素サイトが、Ｎｔタイプのニッキング酵素サイトの外側下流には３’オーバーハングの粘着末端を生じる６塩基認識の制限酵素サイトが配置してある。図２Ｃに示すように、長鎖一本鎖ＤＮＡを取得するための目的のＤＮＡ断片は、ＮｂタイプとＮｔタイプの二つのニッキング酵素サイトの間（丸数字１、中央図）か、Ｎｔタイプのニッキング酵素サイトと５’オーバーハング粘着末端を生じる６塩基認識の制限酵素サイトの間（丸数字２、左図）、Ｎｂタイプのニッキング酵素と３’オーバーハングの粘着末端を生じる６塩基認識の制限酵素サイトの間（丸数字３、右図）にクローニングした。ここでは、Nb.BsrDIとNt.BspQIの2つのニッキングエンドヌクレアーゼサイトを利用した。
【0066】
まず、クローニングベクターpLSODN-1を、以下に示した配列から成る２つの合成ＤＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲを行うことによって、直鎖状のクローニングベクターｐＬＳＯＤＮ－１を取得した。以下の配列における下線部分は、目的ＤＮＡをベクターにクローニングするために導入した目的ＤＮＡとのホモロジー配列である。
【0067】
具体的には、４００ｎｇのクローニングベクターpLSODN-1に、上記２つの合成ＤＮＡオリゴマーを各８０ｐｍｏｌ、１×ＧＸＬバッファー（タカラバイオ株式会社）、５ユニットのPrimeSTAR GXL DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）、それぞれ８０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを加えた、計４００μｌの反応液中で、ＰＣＲを行った。反応温度及び時間は、最初に９５℃で１分、次に９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で６分をこの順にそれぞれ１６回繰り返し、最後に７２℃で１０分である。このＰＣＲ反応物を、１．６μｇ／ｍｌのCrystal Violetを含む０．８％のアガロースゲル電気泳動に供与した。電気泳動後、青色に染まった３．２ｋｂのＤＮＡのバンドをカミソリで切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン）にて精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、これを直鎖状のクローニングベクターpLSODN-1として保存した。
【0068】
一方、長鎖一本鎖ＤＮＡを取得するための目的ＤＮＡは、λファージＤＮＡから、以下に示した配列から成る２つの合成ＤＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲを行うことによって取得した。以下の配列における下線部分は、目的ＤＮＡをベクターにクローニングするために導入したベクターとのホモロジー配列である。λファージＤＮＡ由来の目的ＤＮＡの配列を図３に示す。
【0069】
具体的には、４００ｎｇのλファージＤＮＡ（プロメガ社）に、上記２つの合成ＤＮＡオリゴマーを各８０ｐｍｏｌ、１×ＧＸＬバッファー（タカラバイオ株式会社）、５ユニットのPrimeSTAR GXL DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）、それぞれ８０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを加えた、計４００μｌの反応液中で、ＰＣＲを行った。反応温度及び時間は、最初に９５℃で１分、次に９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で３分をこの順にそれぞれ１６回繰り返し、最後に７２℃で１０分である。このＰＣＲ反応物を、１．６μｇ／ｍｌのCrystal Violetを含む０．８％のアガロースゲル電気泳動に供与した。電気泳動後、青色に染まった１．５ｋｂのＤＮＡのバンドをカミソリで切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン）にて精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、これを長鎖一本鎖ＤＮＡを取得するための目的ＤＮＡとして保存した。
【0070】
次に、ＰＣＲ増幅によって得られた直鎖状クローニングベクターpLSODN-1とλファージＤＮＡ由来の１．５ｋｂの目的ＤＮＡを、ＰＣＲ反応に用いた合成ＤＮＡオリゴマーによって導入した末端のホモロジー配列をもとに連結した。
【0071】
具体的には、ＰＣＲ増幅によって得られた４０ｎｇの直鎖状クローニングベクターpLSODN-1に、同様にＰＣＲ増幅によって得られたλファージＤＮＡ由来の７５ｎｇの１．５ｋｂの目的ＤＮＡ、０．５μｌの1 x Cloning EZ Buffer（ジーンスクリプト社）、０．５μｌのClone EZ Enzyme（ジーンスクリプト社）、をそれぞれ加えた、計５μｌの反応液中で２２℃で２０分間反応させた後、氷上に５分間静置し、連結反応を完結させた。
【0072】
続いて、連結反応液を１μｌ用いて、以下のようにコンピテントセル（Jet Competent Cell、株式会社バイオダイナミクス研究所）の形質転換操作を行った。まず、凍結コンピテントセル（２５μｌ）を氷上に置いて融解した後、直ちに１μｌの連結反応溶液をコンピテントセルに加え、５分後、室温の０．２５ｍｌのRecovery Medium（Jet Competent Cellに付属）にコンピテントセルを移した。そして、５分間このまま静置した後、Recovery Mediumに懸濁された菌液を、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（直径８．５ｃｍ、寒天培地量２５ｍｌ）に接種し、３７℃で１８時間、保温した。この培養によって上記ＬＢ寒天プレート上に生じた大腸菌コロニーを取り出し、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。この振盪培養によって得られた菌体からQiagen Plasmid Purification Kit（株式会社キアゲン）によってプラスミドを調製した。
【0073】
上述のようにして得られたプラスミドをBsrDIおよびBspQIで消化し、アガロースゲル電気泳動分析にて１．５ｋｂのλファージ由来の目的ＤＮＡ断片が挿入され、かつABI PRISM Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムジャパン株式会社）によりその塩基配列を調べることによりpLSODN-1ベクターのBsrDIサイトとBspQIサイトの間に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列を有するものを選んだ。この選択されたプラスミドを、pLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）プラスミドとした。
【実施例2】
【0074】
目的ＤＮＡをクローニングしたベクターのニッキング酵素による消化
実施例１で作成したプラスミドpLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）を、ニッキングエンドヌクレアーゼで消化することによって、環状二本鎖ＤＮＡの構造を持つ上記プラスミド上の、λファージ由来の目的ＤＮＡである１．５Ｋｂ断片の両端かつ一方の側の鎖のみを切断しニックを導入した。
実施例１で作成したプラスミドpLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）を、ニッキングエンドヌクレアーゼで消化することによって、環状二本鎖ＤＮＡの構造を持つ上記プラスミド上の、λファージ由来の目的ＤＮＡである１．５Ｋｂ断片の両端かつ一方の側の鎖のみを切断しニックを導入した。
【0075】
具体的には、１００μｌのプラスミドpLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）に、1 x 3.1 NEBuffer (ニュー・イングランド・バイオラブズ社)、５０ユニットのNt.BspQI、５０ユニットのNb.BsrDIを加えた、計５０μｌの反応液中で５０℃で６０分間、続けて６０℃で６０分間反応させた。反応後は脱塩操作としてエタノール沈殿を行った。
【0076】
具体的には、２ヶ所のニックを導入した５０μｌのpLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）プラスミド反応溶液に、１２５μｌのエタノールを加えて混合した。そして、この混合液を微量高速遠心分離機にセットし、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で回転させ、沈殿させた。チューブから上清を除去した後、沈殿物に５００μｌの７０％冷エタノールを加え、ボルテックスし、再び微量高速遠心分離機を用いて、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で回転させ、再び沈殿させた。チューブから上精を吸引除去し、さらにチューブをバキュームエバポレーターにかけ、乾固させた後、５０μｌの滅菌水を加えて、バッファー交換し、脱塩した２ヶ所のニックを導入したpLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）プラスミドを得た。
【実施例3】
【0077】
変性剤による加熱変性と非変性アガロースゲル電気泳動による分離、ゲルからの抽出精製
実施例２で得られた、２ヶ所のニックを導入した２０μｇのpLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）プラスミドを含む１０μｌ水溶液に、３０μｌのブロモフェノールブルーを含む９５％ホルムアミドを加え、終濃度７１％ホルムアミド溶液とした。これを７０℃で５分間熱処理した後、直ちに氷上に置き急冷した。１分間氷上に置いた後、２０μｌ（１０μｇ）と１０μｌ（５μｇ）を１．２％濃度の非変性のアガロースゲルで１×ＴＡＥ緩衝液を泳動液として電気泳動を行った。ここにおいて、ウレアやホルムアミドを含む変性アガロースゲルを用いる必要はないことに留意したい。電気泳動はブロモフェノールブルー色素が、ゲル中で適当な位置まで移動したところで止めた。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、臭化エチジウムで染色し、紫外線下で撮影した（図４）。撮影後、３本現れるバンドのうち、先端にくる最も分子量の小さい目的の１．５ｋｂの一本鎖ＤＮＡのバンドを含むゲル片を切り出した。先端にあることから、他のバンドが混入している可能性はない。ゲル片の重量を測定した後、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いて目的の１．５ｋｂ一本鎖ＤＮＡを抽出した。目的の１．５ｋｂ一本鎖ＤＮＡの収率は約３０％であった。精製した１．５ｋｂ一本鎖ＤＮＡは、その少量を同様の方法にて、分析スケールでの非変性アガロースゲル電気泳動を行い、他のバンドの混入はなく、高い精製度を有していることが確認された（図５）。
実施例２で得られた、２ヶ所のニックを導入した２０μｇのpLSODN-1（１．５Ｋｂ断片）プラスミドを含む１０μｌ水溶液に、３０μｌのブロモフェノールブルーを含む９５％ホルムアミドを加え、終濃度７１％ホルムアミド溶液とした。これを７０℃で５分間熱処理した後、直ちに氷上に置き急冷した。１分間氷上に置いた後、２０μｌ（１０μｇ）と１０μｌ（５μｇ）を１．２％濃度の非変性のアガロースゲルで１×ＴＡＥ緩衝液を泳動液として電気泳動を行った。ここにおいて、ウレアやホルムアミドを含む変性アガロースゲルを用いる必要はないことに留意したい。電気泳動はブロモフェノールブルー色素が、ゲル中で適当な位置まで移動したところで止めた。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、臭化エチジウムで染色し、紫外線下で撮影した（図４）。撮影後、３本現れるバンドのうち、先端にくる最も分子量の小さい目的の１．５ｋｂの一本鎖ＤＮＡのバンドを含むゲル片を切り出した。先端にあることから、他のバンドが混入している可能性はない。ゲル片の重量を測定した後、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いて目的の１．５ｋｂ一本鎖ＤＮＡを抽出した。目的の１．５ｋｂ一本鎖ＤＮＡの収率は約３０％であった。精製した１．５ｋｂ一本鎖ＤＮＡは、その少量を同様の方法にて、分析スケールでの非変性アガロースゲル電気泳動を行い、他のバンドの混入はなく、高い精製度を有していることが確認された（図５）。
【実施例4】
【0078】
クローニングベクターpETUK (del)へのＧＦＰ遺伝子のクローニング
実施例４では、ベクター骨格に加えてマルチクローニングサイトにもニッキング酵素認識部位を持たないベクターpETUK (del)を用いた。ここでは、ベクターと目的ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する際に用いる合成ＤＮＡオリゴマー内にニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を組み込むことによって、目的のＤＮＡ断片の両側にニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を導入した。また、本施例では、ＧＦＰ遺伝子全体をコードする一本鎖ＤＮＡを調製した。このＧＦＰ遺伝子には、ゲノム編集によるラットのチロシナーゼ（Ｔｙｒ）遺伝子へのｋｎｏｃｋ ｉｎの目的箇所の上流側１９塩基および下流側２０塩基から成るホモロジーアームが結合する。また、本実施例では一本鎖ＤＮＡの分離調製には変性ゲルであるウレアアガロースゲルを用いた。
実施例４では、ベクター骨格に加えてマルチクローニングサイトにもニッキング酵素認識部位を持たないベクターpETUK (del)を用いた。ここでは、ベクターと目的ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する際に用いる合成ＤＮＡオリゴマー内にニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を組み込むことによって、目的のＤＮＡ断片の両側にニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を導入した。また、本施例では、ＧＦＰ遺伝子全体をコードする一本鎖ＤＮＡを調製した。このＧＦＰ遺伝子には、ゲノム編集によるラットのチロシナーゼ（Ｔｙｒ）遺伝子へのｋｎｏｃｋ ｉｎの目的箇所の上流側１９塩基および下流側２０塩基から成るホモロジーアームが結合する。また、本実施例では一本鎖ＤＮＡの分離調製には変性ゲルであるウレアアガロースゲルを用いた。
【0079】
図６Ａに、クローニングベクターpETUK (del)のプラスミドマップを、図６Ｂにマルチクローニングサイトの配列を、図６Ｃに全塩基配列を示した。ここでは、長鎖一本ＤＮＡの調製にはNb.BsrDIとNt.BspQIの２つのニッキング酵素サイトを利用したが、前述したようにベクター自体のマルチクローニングサイトにはこのニッキングエンドヌクレアーゼサイトがないものを用いて、ＰＣＲを行う際に用いる合成ＤＮＡオリゴマーの中に組み込むことによって、目的ＤＮＡの両側にニッキング酵素認識部位を導入した。
【0080】
まず、クローニングベクターpETUK (del)をテンプレートとして、以下に示した配列から成る２つの合成ＤＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲを行うことによって、直鎖状のクローニングベクターpETUK (del)を取得した。下記配列の下線部分は、目的ＤＮＡをベクターにクローニングするために導入した目的ＤＮＡとのホモロジー配列である。また、ボックスで囲った配列が、目的ＤＮＡの両側に導入されるニッキングエンドヌクレアーゼNb.BsrDIとNt.BspQIの認識配列である。
【0081】
具体的には、４００ｎｇのクローニングベクターpETUK (del)に、上記２つの合成ＤＮＡオリゴマーを各８０ｐｍｏｌ、１×ＧＸＬバッファー（タカラバイオ株式会社）、５ユニットのPrimeSTAR GXL DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）、それぞれ８０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを加え、計４００μｌの反応液中で、ＰＣＲを行った。反応温度及び時間は、最初に９５℃で１分、次に９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で６分をこの順にそれぞれ１６回繰り返し、最後に７２℃で１０分である。このＰＣＲ反応物を、１．６μｇ／ｍｌのCrystal Violetを含む０．８％のアガロースゲル電気泳動に供与した。電気泳動後、青色に染まった２．６７ｋｂのＤＮＡのバンドをカミソリで切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン）で精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、これを直鎖状のクローニングベクターpETUK (del)として保存した。
【0082】
一方、長鎖一本鎖ＤＮＡを取得するための目的ＧＦＰ遺伝子をpCMV-GFP-LC3 Expression Vector (Cell Biolabs. Inc)から、以下に示した配列から成る２つの合成ＤＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲを行うことによって取得した。以下の配列における下線部分は、ＧＦＰ遺伝子をベクターにクローニングするために導入したベクター側とのホモロジー配列である。ＧＦＰ遺伝子断片はベクターのマルチクローニングサイトのBamHIサイトとNotIサイトとの間にクローニングする。pCMV-GFP-LC3 Expression Vector由来のＧＦＰ遺伝子の配列を図７に示した。また、ボックスで囲った部分は、それぞれＧＦＰタンパク質の開始コドンと終始コドンである。
【0083】
具体的には、４００ｎｇのpCMV-GFP-LC3 Expression Vectorに、上記２つの合成ＤＮＡオリゴマーを各８０ｐｍｏｌ、１×ＧＸＬバッファー（タカラバイオ株式会社）、５ユニットのPrimeSTAR GXL DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）、それぞれ８０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを加えた、計４００μｌの反応液中で、ＰＣＲを行った。反応温度及び時間は、最初に９５℃で１分、次に、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で３分をこの順にそれぞれ１６回繰り返し、最後に７２℃で１０分である。このＰＣＲ反応物を、１．６μｇ／ｍｌのCrystal Violetを含む０．８％のアガロースゲル電気泳動に供与した。電気泳動後、青色に染まった０．７５ｋｂのＤＮＡのバンドをカミソリで切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン）で精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、これを長鎖一本鎖ＤＮＡを取得するための目的ＧＦＰ遺伝子全域ＤＮＡ断片として保存した。
【0084】
次に、上記ＰＣＲ増幅によって得られた直鎖状クローニングベクターpETUK (del)断片とＧＦＰ遺伝子全域ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応に用いた合成ＤＮＡオリゴマーによって導入した末端のホモロジー配列をもとに連結した。
【0085】
具体的には、ＰＣＲ増幅によって得られた４０ｎｇの直鎖状クローニングベクターpETUK (del)に、同様にＰＣＲ増幅によって得られた７５ｎｇのＧＦＰ遺伝子、０．５μｌの1 x Cloning EZ Buffer（ジーンスクリプト社）、０．５μｌのClone EZ Enzyme（ジーンスクリプト社）を加えた、計５μｌの反応液中で２２℃で２０分間反応後、氷上で５分間静置し、連結反応を完結させた。
【0086】
続いて、連結反応液を１μｌ用いて、以下のようにコンピテントセル（Jet Competent Cell、株式会社バイオダイナミクス研究所）の形質転換操作を行った。まず、凍結コンピテントセル（２５μｌ）を氷上に置いて融解した後、直ちに１μｌの連結反応溶液をコンピテントセルに加え、５分後、室温の０．２５ｍｌのRecovery Medium（Jet Competent Cellに付属）にコンピテントセルを移した。そして、５分間このまま静置した後、Recovery Mediumに懸濁された菌液を、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（直径８．５ｃｍ、寒天培地量２５ｍｌ）に接種し、３７℃で１８時間、保温した。この培養によって上記ＬＢ寒天プレート上に生じた大腸菌コロニーを取り出し、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。この振盪培養によって得られた菌体からQiagen Plasmid Purification Kit（株式会社キアゲン）によりプラスミドを調製した。
【0087】
上述のようにして得られたプラスミドについてBsrDIおよびBspQIで消化し、アガロースゲル電気泳動分析にて７５９塩基の目的ＧＦＰ遺伝子ＤＮＡ断片が挿入され、かつABI PRISM Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムジャパン株式会社）によりその塩基配列を調べ、pETUK(del)ベクターにBsrDIサイトとBspQIサイトと伴にGFP遺伝子が正しく挿入された配列を有するものを選んだ。この選択されたプラスミドを、pETUK（GFP-Tyr）プラスミドとした。
【0088】
次に、pETUK（GFP-Tyr）プラスミドを２つのニッキングエンドヌクレアーゼ（Nb.BsrDIおよびNt.BspQI）で消化し、ＧＦＰ遺伝子の両端において、一方の側の鎖のみにニックを導入した。具体的には、１００μｇのプラスミドpETUK（GFP-Tyr）に、1 x 3.1 NEBuffer （ニュー・イングランド・バイオラブズ社）、５０ユニットのNt.BspQI、及び５０ユニットのNb.BsrDIを加えた、計５０μｌ反応液中で、５０℃で６０分、続けて６０℃で６０分反応させた。反応後は脱塩操作としてエタノール沈殿を行った。
【0089】
具体的には、２ヶ所のニックを導入した５０μｌのpETUK（GFP-Tyr）プラスミド反応溶液に、１２５μｌのエタノールを加えて混合した。そして、この混合液を微量高速遠心分離機にセットし、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で回転させ、沈殿させた。チューブから上清を除去した後、沈殿物に５００μｌの７０％冷エタノールを加え、ボルテックスし、再び微量高速遠心分離機で、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で回転させ、再び沈殿させた。チューブから上精を吸引除去し、さらにチューブをバキュームエバポレーターにかけ、乾固させた後、５０μｌの滅菌水を加えて、バッファー交換し、脱塩した２ヶ所のニックを導入したpETUK（GFP-Tyr）プラスミドを得た。
【0090】
２ヶ所のニックを導入した２０μｇのpETUK（GFP-Tyr）プラスミドを含む１０μｌ水溶液に、３０μｌのブロモフェノールブルーを含む９５％ホルムアミドを加え、終濃度７１％ホルムアミド溶液とした。これを７０℃で５分間熱処理した後、直ちに氷上に置き急冷した。１分間氷上に置いた後、その一部である１００ｎｇについて、１．０％濃度の４Ｍウレアアガロースゲルで、４Ｍウレア含有１×ＴＡＥ緩衝液を泳動液として分析を目的とした電気泳動を行った。電気泳動はブロモフェノールブルー色素が、ゲル中で適当な位置まで移動したところで止めた。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、臭化エチジウムで染色し、紫外線下で撮影した（図８）。分析的電気泳動で問題なく分離されることが確認されたことから、残りの全量を４Ｍウレアアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、臭化エチジウムで染色し、３本現れるバンドのうち、先端にくる最も分子量の小さい目的の７５９塩基のＧＦＰ一本鎖ＤＮＡのバンドを含むゲル片を切り出した。先端にあることから、他のバンドが混入している可能性はない。ゲル片の重量を測定した後、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いて目的の７５９塩基のＧＦＰ一本鎖ＤＮＡを抽出した。目的の７５９塩基のＧＦＰ一本鎖ＤＮＡの収率は約３０％であった。精製した７５９一本鎖ＤＮＡは、同様の方法にて４Ｍウレアアガロースゲルにて電気泳動を行い、他のバンドの混入はなく、高い精製度を有していることが確認された（図９）。
【実施例5】
【0091】
種々の変性剤を用いた場合の、２ヶ所のニックを導入したpLSODN-1（１．５ｋｂ断片）プラスミドの変性ゲルおよび非変性ゲルでの電気泳動による個々の一本鎖ＤＮＡの分離
以下に、いくつかの物理的変性剤による、ニックを導入したpLSODN-1（１．５ｋｂ断片）プラスミドの変性および非変性ゲルでの電気泳動による一本鎖ＤＮＡの出現および分離の例を示す。物理的な変性剤としてホルムアミド、グリセロール、及びウレアの例を、対照としてスクロースの場合を示す。ホルムアミド、グリセロール、及びウレアは、核酸の電気泳動用変性剤として通常用いられる試薬である。
以下に、いくつかの物理的変性剤による、ニックを導入したpLSODN-1（１．５ｋｂ断片）プラスミドの変性および非変性ゲルでの電気泳動による一本鎖ＤＮＡの出現および分離の例を示す。物理的な変性剤としてホルムアミド、グリセロール、及びウレアの例を、対照としてスクロースの場合を示す。ホルムアミド、グリセロール、及びウレアは、核酸の電気泳動用変性剤として通常用いられる試薬である。
【0092】
具体的には、種々の濃度の、２ヶ所のニックを導入したpLSODN-1（１．５ｋｂ断片）プラスミドを、種々の濃度のホムアミド、グリセロール、ウレア、またはスクロースと混合した。次に７０℃で５分加熱後、氷上にて急冷した。氷上で１分間放置した後、１．２％非変性アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後は、ゲルを取出し、１．６％ Crystal Violetで一晩振盪染色した。図１０にその結果を示した。
【0093】
ホルムアミドは、２５％の濃度で、２ヶ所のニックを導入したpLSODN-1（１．５ｋｂ断片）プラスミドを、１μｇ／μｌの高濃度のプラスミドであっても完全に変性させ、１．５ｋｂの目的一本鎖ＤＮＡを与えた。グリセロールは、５０％以上の濃度で、プラスミドを完全に変性させる能力があることがわかった。ウレアは６Ｍ濃度で、０．２５μｇ／μｌ濃度のプラスミドを変性させることができたが、０．５μｇ／μｌ以上の濃度のプラスミドに関しては限定的であった。スクロースでは、全く変性の効果はなかった。
【0094】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】