(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-01
(45)【発行日】2023-11-10
(54)【発明の名称】乾癬の治療のための医薬及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 36/30 20060101AFI20231102BHJP
A61K 36/15 20060101ALI20231102BHJP
A61K 35/644 20150101ALI20231102BHJP
A61K 36/18 20060101ALI20231102BHJP
A61K 36/14 20060101ALI20231102BHJP
A61K 33/06 20060101ALI20231102BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20231102BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20231102BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231102BHJP
【ＦＩ】
A61K36/30
A61K36/15
A61K35/644
A61K36/18
A61K36/14
A61K33/06
A61K35/12
A61P17/06
A61P43/00 121
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2021523021
(86)(22)【出願日】2019-01-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(86)【国際出願番号】 TR2019050019
(87)【国際公開番号】W WO2020091703
(87)【国際公開日】2020-05-07
【審査請求日】2021-12-28
(31)【優先権主張番号】2018/16367
(32)【優先日】2018-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】TR
(73)【特許権者】
【識別番号】512081166
【氏名又は名称】イェディテペ・ウニヴェルシテシ
【氏名又は名称原語表記】ＹＥＤＩＴＥＰＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＳＩ
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】サヒン フィクレッティン
(72)【発明者】
【氏名】カサポグル ブルク
(72)【発明者】
【氏名】ターケル セスリ ネザケット
(72)【発明者】
【氏名】サフバズ シグデム ディレク
(72)【発明者】
【氏名】ターグト センギズ
【審査官】横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】特表平０４－５０１４１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭６３－２８４１３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５１５６１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７０９５９００（ＣＮ，Ａ）
【文献】独国特許出願公開第０４２３６３４６（ＤＥ，Ａ１）
【文献】独国実用新案第２０２００５００９８１３（ＤＥ，Ｕ１）
【文献】中国特許出願公開第１０４６２３３０７（ＣＮ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／００３９９９２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開昭５６－０５９７１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭５２－０４４２４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１５４３９９５（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／０７１４２６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００１－０１０９４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５３４６１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許第１０７０９５９００（ＣＮ，Ｂ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３６／００
Ａ６１Ｋ ３５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
獣脂８００～１０００ｇ、カラマツ樹脂２５０～３５０ｇ、蜜蝋４５０～５５０ｇ、マスティックガム２～３ｇ、プロポリス４０～５０ｇ、アルカンナ・ティンクトリア２００～２５０ｇ、ミョウバン２００～２５０ｇ、及びジュニパータール１５０～２００ｇを含むことを特徴とする乾癬の治療のための経口投与用医薬。
【請求項2】
請求項１に記載の乾癬の治療のための経口投与用医薬の製造方法であって、前記獣脂を前記蜜蝋と連続的に混合することにより、前記獣脂を３００℃で溶融させる工程と、
得られた溶融混合物に、まず前記マスティックガムを加え、次に前記プロポリスを加える工程と、
粉砕したカラマツ樹脂をミョウバンと一緒に前記混合物に加える工程と、
最後に、粉砕したアルカンナ・ティンクトリア及びジュニパータールを前記混合物に加える工程と、
連続的な混合によって、均質な混合物を得る工程と、
前記均質な混合物を濾過する工程と、
溶出物の形態の最終生成物である前記乾癬の治療のための経口投与用医薬を得る工程と
を備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乾癬の治療のために開発された医薬及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
乾癬は、赤みを帯びた基底部に白みを帯びた皮膚の発疹を特徴とする全身性の炎症性疾患である。乾癬は、主に膝及び肘に見られ、患者に強い痒みを引き起こす。非感染性疾患である乾癬の原因は明らかではないが、身体の生体防御機構が機能しない場合に、ストレス要因が乾癬に対する誘発効果を有することが知られている。
【0003】
２００８年に、性器疣贅の治療に外用されるイミキモド（ＩＭＱ）を活性成分とするクリーム（Ａｌｄａｒａ（アルダラ）はイミキモドを５％含有する。商品名）がヒトに乾癬様の病変を誘発する副作用を有するということが観察されたこと、及びマウスに対しても同じ効果が認められたことで、このクリームが注目されるようになった［非特許文献１］。ＩＭＱはＴｏｌｌ様ＴＬＲ７及びＴＬＲ８受容体に結合し、免疫賦活剤として全身の炎症経路を活性化するため、マウスに外用すると全身性の反応が生じ、乾癬が形成されることが研究により明らかにされている［非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６］。現在では、乾癬の前臨床試験の効率化と標準化のために、マウスモデルにおいて６つの主要なポイントを病理組織学的及び免疫組織化学的に示すことが決められている。それらは以下の通りである。
１． 表皮角化細胞の過剰増殖及び表皮の分化の変化を観察する、
２． パピローマの発生、
３． Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ及び好中球の浸潤、
４． Ｔ細胞の機能的役割を観察する、
５． 真皮の血管形成の変化、及び
６． この疾患に対する薬剤への反応を示す能力。
１． 表皮角化細胞の過剰増殖及び表皮の分化の変化を観察する、
２． パピローマの発生、
３． Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ及び好中球の浸潤、
４． Ｔ細胞の機能的役割を観察する、
５． 真皮の血管形成の変化、及び
６． この疾患に対する薬剤への反応を示す能力。
【0004】
現在、この６つのポイントを満たす理想的な前臨床モデルとして、ＩＭＱ誘導マウスモデルが用いられている。
【0005】
乾癬を完全に治す治療法はまだないが、皮膚科医は様々な薬物を用いて乾癬をコントロールしようとしている。近年使用され始めた皮下免疫剤は、重篤な副作用（免疫抑制、毒性等）、入院やフォローアップの困難さ、深刻なコスト、疾患の再発を防ぐことができないなどの理由から、残念ながらこの疾患の治療において一般的で好ましい選択肢とはなっていない［非特許文献７］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｗａｌｔｅｒ，Ａ．、Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｍ．、Ｃｅｃｃｏｎｉ，Ｖ．、Ｍａｔｔｅｒ，Ｃ．、Ｕｒｏｓｅｖｉｃ－Ｍａｉｗａｌｄ，Ｍ．、Ｂｅｌｌｏｎｉ，Ｂ．、Ｓｃｈｏｅｎｅｗｏｌｆ，Ｎ．、Ｄｕｍｍｅｒ，Ｒ．、Ｂｌｏｃｈ，Ｗ．、Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．、Ｂｅｅｒ，Ｈ．Ｄ．、Ｋｎｕｔｈ，Ａ．及びｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ，Ｍ．、２０１３． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、４、１５６０
【文献】Ｎａｄｅｅｍ，Ａ．、Ａｌ－Ｈａｒｂｉ，Ｎ．Ｏ．、Ａｌ－Ｈａｒｂｉ，Ｍ．Ｍ．、Ｅｌ－Ｓｈｅｒｂｅｅｎｙ，Ａ．Ｍ．、Ａｈｍａｄ，Ｓ．Ｆ．、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，Ｎ．、Ａｎｓａｒｉ，Ｍ．Ａ．、Ｚｏｈｅｉｒ，Ｋ．Ｍ．、Ａｔｔｉａ，Ｓ．Ｍ．、Ａｌ－Ｈｏｓａｉｎｉ，Ｋ．Ａ．及びＡｌ－Ｓｈａｒａｒｙ，Ｓ．Ｄ．、２０１５． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９９、２４８－２５７
【文献】Ａｒｏｒａ，Ｎ．、Ｓｈａｈ，Ｋ．及びＰａｎｄｅｙ－Ｒａｉ，Ｓ．、２０１６． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ、２５３（２）、５０３－５１５
【文献】Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｈ．、Ｃｈａｏ，Ｙ．Ｈ．、Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｙ．、Ｙａｎｇ，Ｄ．Ｈ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｔ．Ｗ．、Ｌｉ，Ｙ．Ｒ．及びＬｉｎ，Ｃ．Ｃ．、２０１６． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３３、７０－８２
【文献】Ｄｉ，Ｔ．Ｔ．、Ｒｕａｎ，Ｚ．Ｔ．、Ｚｈａｏ，Ｊ．Ｘ．、Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｌｉｕ，Ｘ．、Ｗａｎｇ，Ｙ．及びＬｉ，Ｐ．、２０１６． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３２、３２－３８
【文献】Ｊｉａ，Ｈ．Ｙ．、Ｓｈｉ，Ｙ．、Ｌｕｏ，Ｌ．Ｆ．、Ｊｉａｎｇ，Ｇ．、Ｚｈｏｕ，Ｑ．、Ｘｕ，Ｓ．Ｚ．及びＬｅｉ，Ｔ．Ｃ．、２０１６． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３７（２）、３５９－３６８
【文献】Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｊ．Ｇ．及びＢｏｗｃｏｃｋ，Ａ．、２００５． Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ、６４、ｉｌ３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、乾癬の治療のための薬物製剤を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の目的を達成するために開発された「乾癬の治療のための医薬及びその製造方法」は、添付の図に示されている。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の乾癬医薬は、獣脂８００～１０００ｇ、カラマツ樹脂２５０～３５０ｇ、蜜蝋４５０～５５０ｇ、マスティックガム２～３ｇ、プロポリス４０～５０ｇ、アルカンナ・ティンクトリア（Ａｌｋａｎｎａ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ）２００～２５０ｇ、ミョウバン２００～２５０ｇ、及びジュニパータール１５０～２００ｇを含む。本発明の乾癬医薬の製造方法は、
・獣脂を蜜蝋と連続的に混合することにより、３００℃で獣脂を溶融させる工程と、
・得られた溶融混合物に、まずマスティックガムを加え、次にプロポリスを加える工程と、
・粉砕したカラマツ樹脂をミョウバンと一緒に上記混合物に加える工程と、
・最後に、粉砕したアルカンナ・ティンクトリア及びジュニパータールを上記混合物に加える工程と、
・連続的な混合によって均質な混合物を得る工程と、
・上記均質な混合物を濾過する工程と、
・溶出物の形態の最終生成物である乾癬の治療のための医薬を得る工程と
を備える。
・獣脂を蜜蝋と連続的に混合することにより、３００℃で獣脂を溶融させる工程と、
・得られた溶融混合物に、まずマスティックガムを加え、次にプロポリスを加える工程と、
・粉砕したカラマツ樹脂をミョウバンと一緒に上記混合物に加える工程と、
・最後に、粉砕したアルカンナ・ティンクトリア及びジュニパータールを上記混合物に加える工程と、
・連続的な混合によって均質な混合物を得る工程と、
・上記均質な混合物を濾過する工程と、
・溶出物の形態の最終生成物である乾癬の治療のための医薬を得る工程と
を備える。
【0011】
本発明の好ましい実施形態では、得られた溶出物は、病変が観察される乾癬患者の皮膚の表面にそれを広げることにより、軟膏として施用される。
【実施例】
【0012】
実験による研究
マウスにおける乾癬のモデル化及び当該薬物の施用
８～１１週齢の成体の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部と右耳の剃毛部に、イミキモド（ＩＭＱ）を５％含有するＡｌｄａｒａという名称のクリーム（Ｍｅｄａ Ｐｈａｒｍａ（メダ・ファーマ）、３Ｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ（スリーエム・ヘルスケア））を１日１回、６日間塗布し、１匹あたり１日あたり合計６２．５ｍｇのクリームを塗布することで、この動物モデルにおいて乾癬の炎症を起こさせた。対照群の動物は、剃毛した部分にワセリンを塗布した。陽性対照群には、Ｍｔｘ（メトトレキサート）を１日１ｍｇ／ｋｇ経口投与した。実験中は、上記薬物を１日１回、５ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。当該薬物の半治療効果を検証する群の動物への当該薬物の投与は、ＩＭＱによる乾癬の誘発開始から１日後に開始し、実験期間終了まで継続した。体重、並びに皮膚の赤み、白点形成（剥がれ）及び肥厚を毎日測定し、乾癬面積及び重症度指標（ＰＡＳＩ）に従ってスコア化して、動物の全般的な健康状態及びＩＭＱによる乾癬の誘発をモニターした。モデルで必要とされるように、右耳の皮膚の肥厚も実験開始日から定期的に記録した。
マウスにおける乾癬のモデル化及び当該薬物の施用
８～１１週齢の成体の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部と右耳の剃毛部に、イミキモド（ＩＭＱ）を５％含有するＡｌｄａｒａという名称のクリーム（Ｍｅｄａ Ｐｈａｒｍａ（メダ・ファーマ）、３Ｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ（スリーエム・ヘルスケア））を１日１回、６日間塗布し、１匹あたり１日あたり合計６２．５ｍｇのクリームを塗布することで、この動物モデルにおいて乾癬の炎症を起こさせた。対照群の動物は、剃毛した部分にワセリンを塗布した。陽性対照群には、Ｍｔｘ（メトトレキサート）を１日１ｍｇ／ｋｇ経口投与した。実験中は、上記薬物を１日１回、５ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。当該薬物の半治療効果を検証する群の動物への当該薬物の投与は、ＩＭＱによる乾癬の誘発開始から１日後に開始し、実験期間終了まで継続した。体重、並びに皮膚の赤み、白点形成（剥がれ）及び肥厚を毎日測定し、乾癬面積及び重症度指標（ＰＡＳＩ）に従ってスコア化して、動物の全般的な健康状態及びＩＭＱによる乾癬の誘発をモニターした。モデルで必要とされるように、右耳の皮膚の肥厚も実験開始日から定期的に記録した。
【0013】
施用終了時に、動物をイソフルランで麻酔した後、頸椎脱臼により安楽死させた。脾臓組織のサイズ及び重量を記録した。
【0014】
表皮の厚さの分析
解剖後にマウスのＩＭＱ処置した背部から採取した皮膚試料をホルマリン中で固定し、パラフィンブロックを調製した。各動物から等間隔で厚さ１０ミクロン（１０μｍ）の切片を１０枚採取した。この切片をマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）で染色し、顕微鏡で撮影した。表皮の厚さは、各切片につき５箇所で得た測定値の平均をとって算出した。
解剖後にマウスのＩＭＱ処置した背部から採取した皮膚試料をホルマリン中で固定し、パラフィンブロックを調製した。各動物から等間隔で厚さ１０ミクロン（１０μｍ）の切片を１０枚採取した。この切片をマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）で染色し、顕微鏡で撮影した。表皮の厚さは、各切片につき５箇所で得た測定値の平均をとって算出した。
【0015】
脾臓組織からのＴリンパ球の単離、染色及び刺激
解剖後、ＲＰＭＩ培地を入れたシャーレの中で脾臓組織をメスで小分けにした後、その脾臓組織をパスツールピペットで十分に粉砕し、崩壊させないように洗浄した。この細胞懸濁液を７０μｍのフィルタに通した後、その細胞懸濁液をＰＢＳに取り込み、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を、０．０３７ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、１ｇ／Ｌ 炭酸水素カリウム及び８．２９ｇ／Ｌ 塩化アンモニウムを含む滅菌済み溶解液に溶解し、室温で１０分間インキュベートした。８００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた上清をＰＢＳに溶解し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を１０ｍｌのｃＲＰＭＩ培地に溶解し、細胞数を測定した。
解剖後、ＲＰＭＩ培地を入れたシャーレの中で脾臓組織をメスで小分けにした後、その脾臓組織をパスツールピペットで十分に粉砕し、崩壊させないように洗浄した。この細胞懸濁液を７０μｍのフィルタに通した後、その細胞懸濁液をＰＢＳに取り込み、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を、０．０３７ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、１ｇ／Ｌ 炭酸水素カリウム及び８．２９ｇ／Ｌ 塩化アンモニウムを含む滅菌済み溶解液に溶解し、室温で１０分間インキュベートした。８００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた上清をＰＢＳに溶解し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞を１０ｍｌのｃＲＰＭＩ培地に溶解し、細胞数を測定した。
【0016】
染色のため、単離した細胞にＣＦＳＥを載せた。これ以降のプロセスは、暗所環境下で行った。次いで＋４℃で６分間インキュベートした細胞をｃＲＰＭＩに入れ、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿した細胞にｃＲＰＭＩを加え、再び１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿した細胞をｃＲＰＭＩ培地に再懸濁し、細胞数を測定した。各ウェルに５５×１０５個の細胞を播種した。このリンパ球をＣＤ３及びＣＤ２８で刺激した。培養液を３７℃のインキュベーターに３日間置いた。
【0017】
リンパ球の増殖分析
単離したリンパ球を、４８ウェルプレートの各ウェルに、１ウェルあたり５×１０５細胞の濃度で散布した。ＣＦＳＥで染色したリンパ球を、増殖解析のために３日間培養した。各群のリンパ球細胞の非刺激培養と抗ＣＤ３＋ＣＤ２８（ＣＤｍｉｘ）刺激培養を行った。３日目に、リンパ球細胞の増殖分析をフローサイトメトリーで調べた。ＣＦＳＥ蛍光染色は、フローサイトメトリーにおいてＦＬ－１で表示することができる。分析後、Ｔ細胞の増殖を刺激の有無で比較した。
単離したリンパ球を、４８ウェルプレートの各ウェルに、１ウェルあたり５×１０５細胞の濃度で散布した。ＣＦＳＥで染色したリンパ球を、増殖解析のために３日間培養した。各群のリンパ球細胞の非刺激培養と抗ＣＤ３＋ＣＤ２８（ＣＤｍｉｘ）刺激培養を行った。３日目に、リンパ球細胞の増殖分析をフローサイトメトリーで調べた。ＣＦＳＥ蛍光染色は、フローサイトメトリーにおいてＦＬ－１で表示することができる。分析後、Ｔ細胞の増殖を刺激の有無で比較した。
【0018】
リンパ球培養液における制御性Ｔ細胞の分析
単離したリンパ球細胞を３日間培養した後、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞数を調べた。ウェル内でピペッティングにより細胞を均一に解した後、この均一な溶液から細胞を取り出し、フローチューブに入れた。この細胞にＰＢＳを加え、その細胞を、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＣＤ４とＣＤ２５をチューブに加えてボルテックスし、暗所にて室温で２０分間インキュベートした。その後、染色用緩衝液を加え、２５０ｇで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞にＦｏｘＰ３緩衝液を加えてそれらをボルテックスし、暗所にて室温で１０分間インキュベートした。その後、この細胞を５００ｇで５分間、遠心分離した。沈殿した細胞に染色用緩衝液を加え、ボルテックスした後、５００ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞にＦｏｘＰ３緩衝液Ｃを加え、それらをボルテックスして、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。その後、染色用緩衝液を加え、５００ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞に対して、このプロセスをもう一回繰り返した。その後、ＦｏｘＰ３抗体を加え、ゆっくりとボルテックス処理を行った。それらを暗所にて室温で３０分間インキュベートした後、染色用緩衝液を加え、５００ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞に染色用緩衝液を加え、それらをフローサイトメトリー装置で分析した。
単離したリンパ球細胞を３日間培養した後、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞数を調べた。ウェル内でピペッティングにより細胞を均一に解した後、この均一な溶液から細胞を取り出し、フローチューブに入れた。この細胞にＰＢＳを加え、その細胞を、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＣＤ４とＣＤ２５をチューブに加えてボルテックスし、暗所にて室温で２０分間インキュベートした。その後、染色用緩衝液を加え、２５０ｇで１０分間遠心分離した。沈殿した細胞にＦｏｘＰ３緩衝液を加えてそれらをボルテックスし、暗所にて室温で１０分間インキュベートした。その後、この細胞を５００ｇで５分間、遠心分離した。沈殿した細胞に染色用緩衝液を加え、ボルテックスした後、５００ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞にＦｏｘＰ３緩衝液Ｃを加え、それらをボルテックスして、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。その後、染色用緩衝液を加え、５００ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞に対して、このプロセスをもう一回繰り返した。その後、ＦｏｘＰ３抗体を加え、ゆっくりとボルテックス処理を行った。それらを暗所にて室温で３０分間インキュベートした後、染色用緩衝液を加え、５００ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞に染色用緩衝液を加え、それらをフローサイトメトリー装置で分析した。
【0019】
文献では、乾癬に伝統的な方法で調製された薬剤を使用していることが頻繁に見られる［３］。とりわけ中国やインドの医学では、ある種のハーブ混合物が何世紀にもわたってこの分野で使用されてきた。最近では、これらの伝統的な薬物がコントロールされた前臨床研究で試験されていることが観察されている。その重要な理由は、乾癬におけるエビデンスに基づく医療の実践に広く好まれるようになった、標準化されたＩＭＱ－マウスモデルの使いやすさにある。乾癬や類似の皮膚疾患に伝統的に使用されるこれらのハーブ化合物の化学的挙動を調べると、これらの混合物の強い抗炎症特性が際立っている。これらの抗炎症性の全身的特徴は、前臨床及び臨床の両方の組織病理学において、限られた数ではあるが、有望なポジティブなデータを示す［３］。本発明者らは、ＩＭＱ－マウスモデルに対して文献上の試料と同様の方法で試験することにより、乾癬の治療のために開発され上記の製剤で調製された薬物が乾癬の病態生理に有効であることを示した。
【0020】
本生成物の活性は、本発明の開発中に作成されたグラフ表示によって実証することができる。
【0021】
図１。マウスに対して行った実験では、ＩＭＱを投与した皮膚から採取した試料に対して行った測定において、当該薬剤投与の結果、対照群と比較して表皮の厚さに有意な減少が認められた。この減少は、ＭＴＸを投与したマウスに比べてより有意であると報告された。
【0022】
図２。リンパ球の増殖は乾癬の病態と一致している。当該薬物投与マウスにおける細胞増殖は、ＩＭＱ投与及びＭＴＸ投与のマウスに比べて有意に減少することが認められた。
【0023】
図３。制御性Ｔ細胞分析を行ったリンパ球培養液では、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞の数がＩＭＱ投与マウスよりも当該薬物投与マウスの方が多いことが見出された。
【0024】
図４。身体／脾臓の重量指標では、各群間に有意差は認められなかった。
【0025】
図５。実験期間中、マウスの耳のＩＭＱ投与部位で行った測定の結果、ワセリン塗布群では変化が検出されなかったのに対し、他の群では肥厚が起こったが、各群間に有意な差は認められなかった。
【0026】
図６。マウスの背部のＩＭＱ投与部位の赤みのＰＡＳＩスコア評価によれば、当該薬物投与マウスでは６日目に赤みが減少していることが確認された。マウスの背部のＩＭＱ投与部位の厚さＰＡＳＩスコア評価によれば、ＭＴＸ群（５日目）、薬物群（４日目）ともに厚さが減少していると判定された。
【0027】
図７。マウスの背部のＩＭＱ投与部位のプラーク形成ＰＡＳＩスコア評価によれば、４日目の時点でＭＴＸ群、薬物群ともに鱗屑が減少していることが認められた。
【0028】
図８。トータルＰＡＳＩスコアの評価によれば、ＭＴＸ群、薬物群ともに４日目の時点で減少が認められた。
【0029】
参考文献一覧
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［７］． Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｊ．Ｇ．及びＢｏｗｃｏｃｋ，Ａ．、２００５． Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ、６４、ｉｌ３０．
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】