特許 7387899 細胞外基質及び抗ガン剤からなる接合体及びその医学的用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-17

(45)【発行日】2023-11-28

(54)【発明の名称】細胞外基質及び抗ガン剤からなる接合体及びその医学的用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/78 20060101AFI20231120BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231120BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20231120BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231120BHJP

【ＦＩ】

C07K14/78 ZNA

C07K19/00

A61K47/64

A61P35/00

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2022537781

(86)(22)【出願日】2020-11-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-13

(86)【国際出願番号】 KR2020015525

(87)【国際公開番号】W WO2021145543

(87)【国際公開日】2021-07-22

【審査請求日】2022-06-24

(31)【優先権主張番号】10-2020-0005659

(32)【優先日】2020-01-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0144881

(32)【優先日】2020-11-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】522345423

【氏名又は名称】エクセラモール インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(72)【発明者】

【氏名】ジョン ウォンべ

【審査官】飯濱 翔太郎

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５２５９８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５２５９４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Saxena R., et al.，Elastin-like polypeptides and their applications in anticancer drug delivery systems: a review，Drug Delivery，米国，2015年，Vol.22, No.2，P.156-167

【文献】Jeon W. B., et al.，Journal of biomedical materials research A，2011年，Vol.97A, No.2，P.152-157

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外基質（ＲＥＰ）及びドキソルビシンからなる接合体を有効成分として含有する、癌疾患治療用薬学組成物において、
前記細胞外基質は、エラスチン類似ポリペプチドとインテグリン受容体リガンドとからなり、配列番号３で表されるアミノ酸配列である［ＶＧＲＧＤ（ＶＧＶＰＧ） _６ ］ _ｎ (前記ｎは、配列番号３の反復回数であって、５～２０の整数である)で構成されるか、配列番号２で表されるアミノ酸配列であるＴＧＰＧ［ＶＧＲＧＤ（ＶＧＶＰＧ） _６ ］ _ｎ ＷＰＣ(前記ｎは、［ＶＧＲＧＤ（ＶＧＶＰＧ） _６ ］の反復回数であって、５、１０、１２、１５または２０の整数である)で構成され、
前記細胞外基質及びドキソルビシンは、リンカーによって互いに連結され、前記リンカーは、ＯＨ－、ＮＨ _２ －及びＳＨ－からなる群からそれぞれ異なる２個の官能基を有するＣ２～Ｃ５の化合物であり、
前記癌疾患は、肝癌、大腸癌、及び膵臓癌からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、癌疾患治療用薬学組成物。

【請求項2】

前記接合体は、細胞外基質とリンカーのＳＨ－官能基とが結合し、ドキソルビシンとリンカーのＯＨ－またはＮＨ_２－官能基とが結合して、接合体を成すことを特徴とする、請求項１に記載の癌疾患治療用薬学組成物。

【請求項3】

前記薬学組成物は、腫瘍細胞の細胞死を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の癌疾患治療用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エラスチン類似ポリペプチドとインテグリン受容体リガンドとからなる細胞外基質と抗ガン剤接合体及びその医学的用途に関する。

【背景技術】

【0002】

癌とは、一般的に人体組織を成している細胞周期に異常が生じて細胞が正常に分化せず、細胞分裂を続ける疾患であって、開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）、促進（ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ）及び進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）の３つの段階を経て発生する。癌の原因は、環境や食べ物内に含まれた発ガン物質によって、正常な細胞の遺伝子や癌抑制遺伝子に突然変異が起こり、このような細胞が発ガン物質の継続的な刺激を受けながら非正常に増殖して、癌組織を形成すると知られているが、癌の発生原因については、まだ明確に明らかになっていない。

【0003】

癌は、良性腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ ｔｕｍｏｒ）と悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）とに区分されるが、良性腫瘍は、比較的成長速度が遅く、腫瘍の原発生部位から他の組織に移動する転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）が表われないことに対して、悪性腫瘍は、原発部を離れて他の組織に浸潤されて迅速に成長する特徴を有することにより、生命を脅かし、死亡に至る非常に重要な原因となる。

【0004】

このような癌の治療のためには、手術療法、放射線治療療法及び化学療法などが使われているが、多くの研究にも拘らず、癌患者全体の５０％以上が結局癒されず、死亡すると報告されている。それによる理由は、外科的に切除したとしても、微細に転移した癌細胞を除去することができず、癌が再発するか、多様な抗ガン剤の開発にも拘らず、抗ガン剤を利用した癌治療時に、抗ガン剤に対する癌の細胞死が誘導されないか、初期には反応を示して腫瘍が減るように示すが、治療途中や治療が終わった後、抗ガン剤に対する耐性が生じた癌細胞が急激に増殖するためである。

【0005】

化学療法である低分子量抗ガン剤の治療は、多様な類型の癌治療に広く使われてきたが、癌細胞と正常細胞との間の差異点を区別することができない抗ガン剤の非特異性によって、化学療法の臨床的効能は制限的である。

【0006】

また、抗ガン剤の臨床的効果のために、副作用を誘発させる最大許容量で投与されるが、化学療法の長期的な副作用の１つは、多剤耐性であって、Ｐ糖タンパク質が癌細胞で抗ガン剤をポンピングさせて、多剤耐性を誘導すると知られている。

【0007】

このような問題点を解決するために、Ｐ糖タンパク質媒介薬物流出メカニズムを克服したり、抗ガン剤を変形させて癌細胞に特異的に薬物を伝達する治療戦略が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、腫瘍組織に対する抗ガン剤の接近性を大きく高めて、正常組織に対する副作用を最小化し、癌細胞に対する抗ガン治療の効果を向上させるために、エラスチン類似ポリペプチドとインテグリン受容体リガンドとからなる細胞外基質と抗ガン剤からなる接合体とを抗ガン治療用薬学組成物または薬剤耐性抑制用薬学組成物として提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、細胞外基質（ＲＥＰ）及び抗ガン剤からなる接合体において、

【0010】

前記細胞外基質は、エラスチン類似ポリペプチドとインテグリン受容体リガンドとからなり、

【0011】

前記細胞外基質及び抗ガン剤は、リンカーによって互いに連結されることを特徴とする抗ガン治療用細胞外基質及び抗ガン剤接合体を提供する。

【0012】

本発明は、前記細胞外基質及び抗ガン剤接合体を有効成分として含有する癌疾患治療用薬学組成物を提供する。

【0013】

また、本発明は、前記細胞外基質及び抗ガン剤接合体を有効成分として含有する薬剤耐性抑制用薬学組成物を提供する。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、エラスチン類似ポリペプチドとインテグリン受容体リガンドとからなる細胞外基質（ＲＥＰ）－ドキソルビシン接合体が、ドキソルビシンまたはＲＥＰ及びドキソルビシン混合物と比較して、非常に向上した抗ガン活性を示し、ドキソルビシン抵抗性を示す癌細胞の薬物抵抗性を抑制させる効果が確認されることによって、前記細胞外基質（ＲＥＰ）－ドキソルビシン接合体は、癌疾患の治療のための効果的な抗ガン治療剤及び抗ガン剤に対する薬物耐性を示す癌細胞の薬剤耐性抑制用薬学組成物として提供されうる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】非共役薬物/非接合的薬物(an unconjugated drug)の非特異的内在化とＲＥＰ－薬物接合体の収容体媒介エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）とを比較する模式図であって、ＲＥＰ－薬物接合体は、癌細胞外にポンプアウトされないので、多重薬物耐性は回避される。

【図2】ＲＥＰ遺伝子のヌクレオチド配列である。

【図3】ＲＥＰタンパク質のアミノ酸配列である。

【図4】ＲＥＰ－薬物接合体の一般的な構造である。

【図5】温度によって誘導された転移によるＲＥＰ－ドキソルビシンの精製結果を確認した図面である。

【図6】４９０ｎｍで最大吸光度を有するＲＥＰ－ドキソルビシンのＵＶ－可視スペクトル（ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒａ）を示した結果である。

【図7】ＲＥＰ－ドキソルビシンの逆温度転移を確認した結果であって、ＰＢＳ内のタンパク質濃度は、２０μＭ（ドキソルビシン接合体の比率は、０．８６７）であり、冷却速度は、１℃／ｍｉｍである。

【図8】２４時間培養後、ＰＡＮＣ－１細胞でＲＥＰ－ドキソルビシンの濃度依存的蓄積を確認した結果である。

【図9】ＲＥＰ－ドキソルビシン５μＭとＰＡＮＣ－１細胞とを１及び３時間培養した後、時間依存的にＰＡＮＣ－１細胞内のＲＥＰ－ドキソルビシン蓄積を確認した結果である。

【図10】ＲＥＰ－ドキソルビシン５μＭとＰＡＮＣ－１細胞とを３時間培養し、ＲＥＰ－ドキソルビシンの内在化位置を確認した結果であって、ＲＥＰ－ドキソルビシンは、細胞質（黄色矢印）、核（緑色矢印）及び細胞質と核（青色矢印）いずれもに内在化されることを確認した結果である。

【図11】ＰＡＮＣ－１細胞でＲＥＰ－ドキソルビシンの内在化に対するエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の抑制効果を確認した結果であって、ＲＥＰ－ドキソルビシンは、インテグリン収容体媒介メカニズムを通じて癌細胞に内在化されることを確認した結果である。

【図12】ＰＡＮＣ－１細胞でＲＥＰ－ドキソルビシンとＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－２６の同一位置（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を確認した結果である。

【図13】ＰＡＮＣ－１細胞でＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭでＲＥＰ－ドキソルビシンの同一位置を確認した結果である。

【図14】ＰＡＮＣ－１細胞でドキソルビシン、ＲＥＰ及びドキソルビシン混合物及びＲＥＰ－ドキソルビシン接合体の細胞毒性を比較した結果であって、ドキソルビシンの抗ガン効果は、ＲＥＰ併用処理時に、４倍増加した一方、ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体をドキソルビシンと比較して２０倍以上高い抗ガン活性を示したことを確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、細胞表面のインテグリン受容体リガンドを通じて癌細胞内に効率的に内在化されて癌細胞の死滅を誘導し、癌細胞のＰ糖タンパク質媒介多剤耐性を克服するために、熱反応性ペプチド配列からなる細胞外基質タンパク質－薬物接合体を確認することによって、本発明を完成した。

【0017】

本発明は、細胞外基質（ＲＧＤ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｅｌａｓｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ＲＥＰ）及び抗ガン剤からなる接合体において、

【0018】

前記細胞外基質は、エラスチン類似ポリペプチドとインテグリン受容体リガンドとからなるポリペプチドであり、前記細胞外基質及び抗ガン剤は、リンカーによって互いに連結されることを特徴とするガン治療用細胞外基質及び抗ガン剤接合体を提供することができる。

【0019】

前記細胞外基質は、バリン（ｖａｌｉｎｅ）－グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）－バリン－プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）－グリシン（ＶＧＶＰＧ）ポリペプチドであり、前記インテグリン受容体リガンドは、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン－アスパルテート（ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＲＧＤ）である。

【0020】

より詳細には、前記細胞外基質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列である［ＶＧＲＧＤ（ＶＧＶＰＧ）_６］_ｎで構成され、前記ｎは、配列番号３の反復回数であって、５～２０の整数であることを特徴とする抗ガン治療用細胞外基質及び抗ガン剤接合体である。

【0021】

より望ましくは、前記細胞外基質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列であるＴＧＰＧ［ＶＧＲＧＤ（ＶＧＶＰＧ）_６］_ｎＷＰＣで構成され、前記ｎは、［ＶＧＲＧＤ（ＶＧＶＰＧ）_６］の反復回数であって、５、１０、１２、１５または２０の整数である。

【0022】

前記リンカーは、ＯＨ－、ＮＨ_２－及びＳＨ－からなる群からそれぞれ異なる２個以上の官能基を有するＣ２～Ｃ５の化合物でもある。

【0023】

より詳細には、前記リンカーは、３－スルホニルプロパンヒドラジド（３－Ｓｕｌｆａｎｙｌｐｒｏｐａｎｅｈｙｄｒａｚｉｄｅ）及び３－メルカプトプロピオン酸（３－Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択されるものである。

【0024】

前記接合体は、細胞外基質とリンカーのＳＨ－官能基とが結合し、抗ガン剤とリンカーのＯＨ－またはＮＨ_２－官能基とが結合して、接合体を成すものである。

【0025】

前記抗ガン剤は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ベロテカン（ｂｅｌｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、グリベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メイタンシン（ＤＭ１）、ソラブタンシン（ＤＭ４）、及びビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）からなる群から選択されるものである。

【0026】

本発明は、前記細胞外基質及び抗ガン剤接合体を有効成分として含有する癌疾患治療用薬学組成物を提供することができる。

【0027】

前記癌疾患は、肝癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、胃癌、卵巣癌、及び子宮癌からなる群から選択されるものである。

【0028】

前記薬学組成物は、腫瘍細胞の細胞死を増加させ、抗ガン剤の薬剤耐性を阻害するものである。

【0029】

本発明は、前記細胞外基質及び抗ガン剤接合体を有効成分として含有する薬剤耐性抑制用薬学組成物を提供することができる。

【0030】

前記薬剤耐性は、腫瘍細胞の抗ガン剤耐性である。

【0031】

本発明の一具体例において、前記薬学組成物は、通常の方法によって注射剤、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、坐剤、ゲル、懸濁剤、乳剤、点滴剤または液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型を使用することができる。

【0032】

本発明の他の具体例において、前記薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、被覆剤、膨張剤、滑沢剤、香味剤、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含みうる。

【0033】

具体的に、担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を使用し、経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、前記組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。

【0034】

本発明の一実施例によれば、前記薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で対象体に投与することができる。

【0035】

前記細胞外基質及び抗ガン剤接合体の望ましい投与量は、対象体の状態及び体重、疾患の種類及び程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択されうる。本発明の一実施例によれば、これに制限されるものではないが、１日投与量が０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ、具体的には、０．１～２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１～１００ｍｇ／ｋｇである。投与は、一日一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない。

【0036】

本発明において、前記「対象体」は、ヒトを含む哺乳動物であるが、これらの例に限定されるものではない。

【0037】

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。

【0038】

＜実施例１＞ＲＥＰ（ＲＧＤ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｅｌａｓｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）タンパク質の準備
１．ＲＥＰ遺伝子クローニング及び発現

【0039】

単位遺伝子に対するオリゴヌクレオチド（５’－ａａｔｔｃａｔａｔｇｇｇｃｃａｃｇｇｃｇｔｇｇｇｔｃｇｔｇｇｃｇａｔｇｔａｇｇｔｇｔｃｃｃａｇｇｔｇｔｇｇｇｃｇｔａｃｃｇｇｇｃｇｔｔｇｇｔｇｔｔｃｃｔｇｇｔｇｔｃｇｇｃｇｔｇｃｃｇｇｇｃｇｔａｇｇｔｇｔｃｃｃａｇｇｔｇｔｇｇｇｃｇｔｇｃｃｇｇｇｃｔｇｇｃａ－３’）を化学的に合成して、ｐＵＣ１９ベクターのＥｃｏＲＩ及びＨｉｄＩＩＩ部位に挿入した。ＲＥＰ遺伝子の生成のために、ＲＤＬ（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）方式で単位遺伝子のオリゴマー化を行った。発現ベクターｐＥＴ－２５ｂ（＋）をＮｄｅＩ及びＨｉｎＤＩＩＩに分解し、ＣＩＰで脱リン酸化させた。

【0040】

オリゴヌクレオチド（５’－ｔａｔｇａｃｃｇｇｇｃｃｇｇｇｃｔｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇａｔａ－３’）と線形ｐＥＴ－２５ｂ（＋）とを連結して新規な発現ベクターｐＥＴ－２５ｂ（＋）－１を生成した。ＲＥＰ遺伝子をｐＥＴ－２５ｂ（＋）－１プラスミドベクターにクローニングし、熱衝撃方法でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬＲ（ＤＥ３）に形質転換させた。

【0041】

スターター培養液（２５０ｍＬ ｆｌａｓｋｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５０ｍＬ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ １００μｇ／ｍＬ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）に－８０℃で保管した形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を接種し、３７℃で一晩撹拌し、培養した。スターター培養液を３，０００ｇで４℃で１５分間遠心分離し、新鮮な培地１０ｍＬで再懸濁させた。発現培養液（４Ｌ ｆｌａｓｋｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １Ｌ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ １００μｇ／ｍＬ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）に懸濁されたスターター培養液５ｍＬを接種し、３７℃で撹拌して培養した。

【0042】

ＯＤ６００が約０．８に到達すれば、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加して発現を誘導した。誘導３時間後、３，０００ｇで４℃で２０分間遠心分離して細胞を収集した。

【0043】

２．ＲＥＰタンパク質の精製
収集されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を冷たいＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）３５ｍＬに再懸濁させ、４℃で音波破壊した。細胞溶解物を１５，０００ｇで４℃で１５分間遠心分離し、溶解されていない細胞の残骸を除去した。細胞溶解物にＮａＣｌ（０．５Ｍ）を添加した後、４２℃に加熱してＲＥＰを凝集させた。

【0044】

凝集されたタンパク質を１０，０００ｇで４０℃で１５分間遠心分離して溶液から分離した。上澄み液を除去し、ペレットを冷たいＰＢＳ緩衝液に溶解させ、高純度のＲＥＰタンパク質を得るために、追加的にＩＴＣ（ｉｎｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｃｙｃｌｉｎｇ）を行った。

【0045】

＜実施例２＞ＲＥＰタンパク質－薬物接合体の製造
１．ドキソルビシンヒドラゾン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）の合成

【0046】

ドキソルビシン塩酸塩（５８．０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ内の無水メタノール（１０ｍＬ）に溶解させた。無水メタノール（２ｍＬ）に溶解させた３－（２－ピリジルジチオ）プロパン酸ヒドラジド［３－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ、２７．５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌｅ］をドキソルビシン溶液に添加した。トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）３滴を前記反応混合物に添加し、室温で一晩反応物を撹拌した。

【0047】

回転蒸発濃縮機を用いて過量のＭｅＯＨを除去し、無水アセトニトリルで溶媒沈殿させて試料を精製した。

【0048】

２．ＲＥＰタンパク質－ドキソルビシン接合体の合成及び精製
図４のような構造のＲＥＰタンパク質－ドキソルビシン接合体を製造した。

【0049】

まず、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にＲＥＰを最終濃度１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解させた。１５倍モルの過量のドキソルビシンヒドラゾンをジメチルホルムアミドに溶解させ、ＲＥＰタンパク質溶液を添加した後、室温で一晩反応させた。

【0050】

結合後、反応溶液を４２℃に加熱し、３，０００ｒｐｍで３５℃で１０分間遠心分離して、ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体を他の反応物から分離し、温度によって可逆的に相変化が表われる特徴を用いてＩＴＣを１回行って、図５のように、ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体を精製した。

【0051】

また、ＰＢＳで平衡化されたＰＤ－１０カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーで追加精製し、該精製されたＲＥＰ－ドキソルビシン接合体の最終濃度を１００μＭで濃縮させ、－８０℃に保管した。

【0052】

３．２’－［３－（２－ピリジルジチオ）プロパンオイル］－パクリタキセル｛２’－［３－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］－Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ｝の合成
パクリタキセル（１．２８ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸［３－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、６４．６ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ］及びＤＭＡＰ（ｃａｔ．）をジクロロメタンに溶解させた溶液に１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド［１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、４１．６ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ］を処理し、前記混合物を室温で１２時間撹拌させた。

【0053】

有機層を水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ_４を用いて乾燥させた後、生産物を得るために真空濃縮した。

【0054】

４．ＲＥＰタンパク質－パクリタキセル接合体の合成及び精製
図４のような構造のＲＥＰタンパク質－パクリタキセル接合体を製造した。

【0055】

まず、最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるようにＲＥＰ（６０ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を１ｍＭ ＥＤＴＡと共に１００ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた。１５倍モル過量の２’－［３－（２－ピリジルジチオ）プロパンオイル］－パクリタキセルをジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解させ、ＲＥＰ溶液を添加して室温で一晩反応させた。ＰＢＳ－ＥＤＴＡが含まれた除塩カラムをＰＢＳ－ＥＤＴＡ溶液で平衡化させ、ＲＥＰ－パクリタキセル接合体の反応緩衝液に交換して副産物と過量の未反応試薬とを除去した。

【0056】

ＲＥＰ－パクリタキセル接合体を１回ＩＴＣ行って、精製した後、ＰＢＳで平衡化されたＰＤ－１０カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーで追加精製した。

【0057】

精製されたＲＥＰ－パクリタキセル接合体を最終１００μＭの濃度で濃縮し、－８０℃に保管した。

【0058】

＜実施例３＞ドキソルビシン接合体の比率確認
ＲＥＰのモル吸光係数５，６９０Ｌｍｏｌ^－１ｃｍ^－１を用いてＲＥＰ濃度を決定し、ドキソルビシンの濃度は、４９５ｎｍでドキソルビシンの吸光度及び吸光係数９，２５０Ｌｍｏｌ^－１ｃｍ^－１を用いて決定した。

【0059】

ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体のＲＥＰ濃度を決定するために、２８０ｎｍでのドキソルビシンの吸光度を除き、下記式によって２８０ｎｍの吸光度を用いてＲＥＰ濃度を計算した。

【0060】

［ＲＥＰ］＝［Ａｂｓ_２８０－（０．９ｘＡｂｓ_４９５）］／５，６９０Ｌｍｏｌ^－１ｃｍ^－１・ｃｍ

【0061】

［ＲＥＰ］は、ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体内のＲＥＰの濃度である。

【0062】

ドキソルビシン接合体の比率は、ドキソルビシンの濃度をＲＥＰ濃度で割って計算した。

【0063】

＜実施例４＞ＲＥＰ－薬物接合体の分光学的特性の確認
実施例３で合成したＲＥＰ－ドキソルビシン接合体の分光学的特性を確認するために、Ｃａｒｙ １００ ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて１５℃で８００ｎｍから２００ｎｍまでＲＥＰ－ドキソルビシン接合体のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを確認した。

【0064】

その結果、図６のように、ＵＶ－可視スペクトルでＲＥＰは、可視領域で吸収ピークが表われない一方、最大吸収である２８０ｎｍでＵＶ吸収光線が確認された。

【0065】

＜実施例５＞ＲＥＰ－薬物接合体の熱的特性の確認
ＲＥＰ－薬物接合体の熱転移特性は、温度勾配が１℃／ｍｉｎであるＣａｒｙ １００ ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて温度関数で３５０ｎｍでの接合体溶液の濁度を観察して確認した。転移温度（Ｔ_ｔ）を最大濁度の５０％地点と定義し、ＲＥＰ－薬物転移温度は、下記方程式に適した。

【0066】

Ｔ_ｔ＝ａ・Ｌｎ（［ＲＥＰ－Ｄｒｕｇ］）＋ｂ

【0067】

前記式において、［ＲＥＰ－Ｄｒｕｇ］は、ＲＥＰ－薬物濃度であり、ａは、勾配、ｂは、ＲＥＰ－薬物１μＭのＴ_ｔである。

【0068】

その結果、図７のように、ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体の逆温度転移が確認された。ＰＢＳ内のタンパク質濃度は、２０μＭ（ドキソルビシン接合体の比率は、０．８６７）であり、冷却速度は、１℃／ｍｉｍであった。

【0069】

＜実施例６＞ＲＥＰ－薬物接合体内在化の確認
ＰＣＮＡ－１ヒト膵臓癌細胞を９６ウェルプレート内の１０％ ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地にウェル当たり２×１０^４細胞密度で分注し、３７℃及び５％ ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。２４時間付着させた後、培養培地を多様な濃度のＲＥＰ－ドキソルビシンが含まれたＤＭＥＭ（１００μＬ、ｗｉｔｈｏｕｔ ＦＢＳ）培地に交換した。

【0070】

指定された時間ごとに細胞を冷たいＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、細胞を４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｅ－２’－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅで１時間染色した後、ＲＥＰ－ドキソルビシンの内在化をＬｅｉｃａ ＤＭＩ３０００Ｂ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで確認した。

【0071】

前記過程で０．５、１、２．５、５及び１０μＭの濃度のＲＥＰ－ドキソルビシン接合体をＰＣＮＡ－１細胞に処理した結果、図８のように、濃度依存的にＲＥＰ－ドキソルビシン接合体の細胞内蓄積が増加したことを確認することができた。

【0072】

また、前記過程でＲＥＰ－ドキソルビシン５μＭをＰＡＮＣ－１細胞に処理し、１及び３時間培養した後、ＰＡＮＣ－１細胞内のＲＥＰ－ドキソルビシン蓄積を確認した結果、図９のように、時間依存的にＰＡＮＣ－１細胞内のＲＥＰ－ドキソルビシン蓄積が増加することが確認された。

【0073】

ＲＥＰ－ドキソルビシン５μＭとＰＡＮＣ－１細胞とを３時間培養し、ＲＥＰ－ドキソルビシンの内在化位置を確認した。

【0074】

その結果、図１０のように、ＲＥＰ－ドキソルビシンは、細胞質（黄色矢印）、核（緑色矢印）及び細胞質と核（青色矢印）いずれもに内在化されることを確認することができた。

【0075】

ＲＥＰ－ドキソルビシンエンドサイトーシスを測定するために、ＲＥＰ－ドキソルビシン処理前、ＧＲＧＤＮＰ（１００μＭ）、アミロライド塩酸塩（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、１ｍＭ）、クロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ、５０μＭ）、ｄｙｎａｓｏｒｅ（８０μＭ）及びゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、２００μＭ）を３０分間ＰＡＮＣ－１細胞に前処理し、ＰＡＮＣ－１細胞でＲＥＰ－ドキソルビシン接合体の内在化に対するエンドサイトーシスの抑制効果を確認した。

【0076】

その結果、図１１のように、ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体は、インテグリン収容体媒介メカニズムを通じて癌細胞に内在化されることを確認することができた。

【0077】

一方、対照染色法を用いて細胞内の特定小器官を染色してＲＥＰ－ドキソルビシンの内在化機転、細胞内の移動過程及び作用位置を確認した。

【0078】

インテグリン収容体媒介メカニズムを通じてＲＥＰ－ドキソルビシンを捕集した小胞体が腫瘍細胞の内部に移動した後、ＲＥＰ－ドキソルビシンをリソソームに運ぶことを確認するために、ＲＥＰ－ドキソルビシンを処理した細胞にリソゾームのみに特異的に反応するリソトラッカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）を処理して蛍光顕微鏡で観察した。

【0079】

その結果、図１２のように、ＲＥＰ－ドキソルビシンが染色された赤色蛍光と膵臓癌細胞のリソゾームの内部を染色したリソトラッカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）の緑色蛍光、膵臓癌細胞核を染色した青色蛍光が五番目のイメージでいずれも合わせられて黄色蛍光と確認されることによって、内在化されたＲＥＰ－ドキソルビシンがリソソームの内部に存在することを確認することができた。

【0080】

また、内在化されたＲＥＰ－ドキソルビシンが腫瘍細胞内の特定小器官に存在することを確認するために、ＲＥＰ－ドキソルビシンを処理した腫瘍細胞にミトコンドリアのみに特異的に反応するミトトラッカー（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）を処理して蛍光顕微鏡で観察した。

【0081】

その結果、図１３のように、ＲＥＰ－ドキソルビシンが染色された赤色蛍光と膵臓癌細胞の細胞質を染色したミトトラッカー（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）の緑色蛍光、膵臓癌細胞核を染色した青色蛍光を確認し、五番目のイメージで赤色蛍光と緑色蛍光とが合わせられて黄色生蛍光と紫色蛍光とで表われることが確認されることによって、内在化されたＲＥＰ－ドキソルビシンは、ミトコンドリアと核内部に存在することを確認することができた。

【0082】

前記結果から、インテグリン収容体媒介メカニズムを通じてＲＥＰ－ドキソルビシンを捕集した小胞体が膵臓癌細胞の内部に移動した後、リソソームと融合してＲＥＰ－ドキソルビシンをリソソームに運び、リソソームの内部のタンパク質分解酵素は、ＲＥＰ－ドキソルビシンを小分子のペプチド－ドキソルビシンで加水分解してペプチド－ドキソルビシンを細胞質で排出し、該排出された小分子ペプチド－ドキソルビシン接合体が核とミトコンドリアとに浸透して抗ガン効果を表わすことが確認された。

【0083】

＜実施例７＞ヒト癌細胞に対するＲＥＰ－薬物接合体の細胞毒性の効果確認
Ａ５４９ヒト肺癌細胞、Ｈｅｐ Ｇ２ヒト肝癌細胞、ＨＴ－２９ヒト大腸癌細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞及びＰＡＮＣ－１ヒト膵臓癌細胞を用いて多様なタイプのヒト癌に対するＲＥＰ－ドキソルビシンの細胞毒性を確認した。

【0084】

癌細胞に対するＩＣ_５０値を確認するために、ＰＡＮＣ－１細胞を１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）及び５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した。

【0085】

細胞を３７℃、９５％相対湿度及び５％ ＣＯ_２条件の培養チャンバで培養した。ＰＡＮＣ－１細胞を９６ウェルプレート内の１％ ＦＢＳが含まれた培地にウェル当たり２×１０^４細胞を分注し、２４時間培養した。２４時間細胞を付着させた後、培養培地を新鮮なＤＭＥＭ培地（１００μＬ、ｎｏ ＦＢＳ）に取り替えた。

【0086】

ＲＥＰ－ドキソルビシンをドキソルビシンの濃度が０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、２．５、５及び１０μＭになるようにウェルに添加するか、パクリタキセルの濃度が０．１、０．２５、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、５０及び１００ｎｍになるようにＲＥＰ－パクリタキセルをウェルに添加した。

【0087】

４８時間培養した後、培養培地を除去し、細胞を冷たいＤＭＥＭ培地１００μＬで２回洗浄した。各ウェルにＣＣＫ－８［２－（２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２，４－ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ］１０μＬを添加し、３７℃、９５％相対湿度及び５％ ＣＯ_２条件下で１時間培養した。

【0088】

培養後、４５０ｎｍでｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて吸光度（ＯＤ）を測定した。細胞生存曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１を利用したｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｆｏｕｒ ＰＬ－Ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎに適した。

【0089】

その結果、表１及び表２のように、各癌細胞に対するＲＥＰ－ドキソルビシン接合体（μＭ）とＲＥＰ－パクリタキセル接合体（ｎＭ）とのＩＣ_５０値を確認することができた。

【0090】

【表1】

【0091】

【表2】

【0092】

＜実施例８＞ドキソルビシン、ＲＥＰ及びドキソルビシン混合物及びＲＥＰ－ドキソルビシン接合体の細胞毒性の確認
ドキソルビシン、ＲＥＰ及びドキソルビシン混合物及びＲＥＰ－ドキソルビシン接合体の細胞毒性を比較するために、実施例７のような方法でドキソルビシン、ＲＥＰ及びドキソルビシン混合物及びＲＥＰ－ドキソルビシン接合体をＰＡＮＣ－１細胞で処理してＩＣ_５０値を確認した。

【0093】

その結果、図１４のように、ドキソルビシンと比較して、ＲＥＰ及びドキソルビシン混合物の抗ガン効果が４倍増加した一方、ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体を２０倍以上増加した抗ガン活性を示すことを確認することができた。

【0094】

また、ドキソルビシン敏感性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びドキソルビシン抵抗性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞でドキソルビシン、ＲＥＰ及びドキソルビシン混合物及びＲＥＰ－ドキソルビシン接合体のＩＣ_５０（μＭ）値とドキソルビシンの薬物抵抗性指数とを確認した。

【0095】

その結果、表３のように、ＲＥＰ－ドキソルビシン接合体が処理されたドキソルビシン抵抗性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で薬物抵抗性の克服効果が表われることが確認された。

【0096】

【表3】

【0097】

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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