7390466 ウイルスクリアランス性能の評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-22

(45)【発行日】2023-12-01

(54)【発明の名称】ウイルスクリアランス性能の評価方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/70 20060101AFI20231124BHJP

   C12Q 1/44 20060101ALI20231124BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20231124BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20231124BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20231124BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20231124BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20231124BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20231124BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20231124BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/70

C12Q1/44

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6851 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/02

G01N33/50 P

G01N33/569 G

C12N15/09 Z

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022503376

(86)(22)【出願日】2021-02-26

(86)【国際出願番号】 JP2021007566

(87)【国際公開番号】W WO2021172573

(87)【国際公開日】2021-09-02

【審査請求日】2022-06-08

(31)【優先権主張番号】P 2020033114

(32)【優先日】2020-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】507365204

【氏名又は名称】旭化成メディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】粥川 太貴

(72)【発明者】

【氏名】柳田 恒一郎

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１６６９６５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５２９９０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５２３１７５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－ １／７０

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能を評価する方法であって、
（ａ）ウイルスキャプシド含有液を精製対象溶液に添加する工程、
（ｂ）前記ウイルスキャプシド含有液を添加された精製対象溶液をウイルス除去媒体に接触させ、精製された溶液を回収する工程、及び
（ｃ）前記精製される前の精製対象溶液中の全ウイルスキャプシド数及び前記精製された溶液中の全ウイルスキャプシド数を定量する工程
を含み、
前記精製対象溶液に添加される前記ウイルスキャプシド含有液において、中空ウイルス粒子が除去されており、
前記（ｃ）工程において、前記精製される前の精製対象溶液中のウイルスが有する核酸及び前記精製された溶液中のウイルスが有する核酸を定量する、
方法。

【請求項2】

前記（ｂ）工程において、前記ウイルスキャプシド含有液を添加された前記精製対象溶液を前記ウイルス除去媒体に通過させ、精製された前記溶液を回収する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記中空ウイルス粒子が遠心分離により除去される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記中空ウイルス粒子が密度勾配超遠心分離により除去される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記中空ウイルス粒子がイオジキサノールを用いた密度勾配超遠心分離により除去される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記核酸を、定量ＰＣＲ法又は蛍光フローサイトメトリー法で定量する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記核酸を、定量ＰＣＲ法で定量する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ウイルス除去媒体が、膜又はビーズの形態を有する媒体である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記ウイルス除去媒体がウイルス除去膜である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記ウイルスが有する核酸を定量する工程の前に、前記溶液中の遊離核酸を除去する工程をさらに含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ヌクレアーゼにより前記遊離核酸を除去する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ヌクレアーゼがＤＮａｓｅＩ又はベンゾナーゼである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ウイルスがＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅに属するウイルスである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記ウイルスキャプシド含有液が、天然由来ウイルスキャプシドを含むウイルスキャプシド含有液である請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能の評価方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生物物質含有製剤には、血液から精製される血漿分画製剤や、バイオテクノロジーによって生産される生物学的製剤がある。これらの生物物質含有製剤には、ウイルス混入のリスクがある。一般的に生物物質含有製剤は、ウイルスに対する安全性が保障されている必要がある。そのため、生物物質含有製剤の製造においては、生物物質含有製剤に含まれる又は含まれる可能性のあるウイルスを十分に除去又は不活化する工程、すなわちウイルス除去工程をおく必要がある（例えば、非特許文献１参照。）。ウイルス除去工程のウイルス除去又は不活化能力は、生物物質含有製剤の本製造に至る前にスケールダウンした系において評価・検討される。そのような評価・検討を、ウイルスクリアランス試験という。

【0003】

生物物質含有製剤の製造工程の中でもロバストなウイルス除去工程といわれるのは、低ｐＨ処理又はウイルス除去媒体による処理工程である（例えば、非特許文献２参照。）。ウイルス除去膜等のウイルス除去媒体による処理工程は、エンベロープの有無に関わらず全てのウイルスに対して実施することができる点で優れている。

【0004】

通常、生物物質含有製剤の製造工程におけるウイルスクリアランス試験は、任意の製造工程の前後におけるウイルス濃度を測定し、例えばその対数減少率（ＬＲＶ）を計算することでウイルスクリアランス能力を評価する（例えば、非特許文献１参照。）。このとき、ウイルス除去工程前の生物物質含有溶液に対してウイルス含有液を添加（ウイルススパイク）し、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に接触させる前及び後のウイルス濃度を測定することにより、ウイルス除去工程のウイルスクリアランス能力を評価する。

【0005】

ウイルスクリアランス能力を評価する際に使用するウイルスの種類に関しては、ＩＣＨ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ：日米欧医薬品規制調和国際会議）のｑ５ａにガイドラインが記載されており、有用な非特異的モデルウイルスの例として「動物パルボウイルス」が挙げられている（例えば、非特許文献１参照。）。その中でも、ＩＣＨ－ｑ５ａを引用した多くのウイルスクリアランス試験において、生物物質含有製剤のウイルスクリアランス試験にはマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）及び豚パルボウイルス（ＰＰＶ）が特に高頻度で使用されている。これらのウイルス濃度を測定するための方法としては、主にエンドポイント方式アッセイ法や局所病巣算定方式アッセイ法を含む感染価測定法、又は定量ＰＣＲ （Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｑＰＣＲ）法が用いられる（例えば、非特許文献２、３参照。）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】国際公開第２０１４／０８０６７６Ａ１号

【文献】米国特許出願公開第２０１２／００８８２２８号明細書

【文献】特許第４０２４０４１号公報

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｖｉｒｕｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌｉｎｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｏｒｉｇｉｎ Ｑ５Ａ（Ｒ１）

【文献】Ｎｏｔｅ Ｆｏｒ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｏｎ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ

【文献】血漿分画製剤のウイルスに対する安全性確保に関するガイドライン（平成１１年８月３０日付医薬発第１０４７号医薬安全局長通知）

【文献】Ｒａｐｈａｅｌ Ｗｏｌｆｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２０１６）

【文献】Ｂｅａｔｒｉｚ Ｍａｒｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ （２００４）

【文献】ウイルス実験学各論、丸善出版、国立衛生研究所学友会編 ｐｐ２２－２３

【文献】Ｖ． Ｈｕｔｏｒｎｏｊｓ ａｔ． ａｌ （２０１２） Ｅｎｖ， Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． １０： ｐｐ．１１７－１２３

【文献】Ａｎｔｈｏｎｙ Ｍ． Ｄ’Ａｂｒａｍｏ Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ

【文献】Ｊｏｓｈｕａ Ｃ Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１５

【文献】Ｐａｖｅｌ Ｐｌｅｖｋａ ｅｔ ａｌ．， ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ （２０１１）

【文献】ＰＥＴＥＲ ＴＡＴＴＥＲＳＡＬＬ ｅｔ ａｌ．， ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ （１９７６）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、溶液中のウイルスを除去する工程におけるウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能をより正確に評価可能な方法を提供することを課題の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らの知見によれば、ウイルススパイクに使用されるウイルス含有液は、２種類のウイルス、すなわち核酸を有し感染性を有するウイルス又は核酸を有するが感染性を有しないウイルスを含有する場合がある。さらに、ウイルス含有液は核酸及び感染性のどちらも有しない中空ウイルス粒子を含有する場合がある（例えば、非特許文献４、５参照）。中空ウイルス粒子は、中空キャプシド（ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄ）あるいはウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）ともいう。なお、「感染性を有しないウイルス」又は「非感染性ウイルス」とは、細胞に侵入する能力及び細胞内で増幅する能力を有してもよいが、侵入後の宿主細胞に対して細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ）及び細胞死を伴うウイルス放出を引き起こさず、感染価測定法によって検出されないウイルスを指す。感染性を有するウイルス、感染性を有しないウイルス、及び中空ウイルス粒子は、いずれも、ウイルスキャプシドである。これらウイルス及び／又は中空ウイルス粒子を含有する液を、本開示ではウイルスキャプシド含有液と呼ぶ。

【0010】

感染価測定法では、感染性を有するウイルスは検出できるが、感染性を有しないウイルス及び中空ウイルス粒子を検出することはできない。また、定量ＰＣＲ法では、核酸を有し感染性を有するウイルス及び核酸を有するが感染性を有しないウイルスを検出できるが、核酸を有しない中空ウイルス粒子を検出することができない。本発明者らは、ウイルスキャプシド含有液には従来のウイルスクリアランス性能評価方法では定量できないウイルス又は中空ウイルス粒子が存在し、これらが存在する場合にはウイルスクリアランス性能評価に影響を与えること、すなわち、ウイルス除去媒体のウイルス除去・不活化能力が過小評価される、又は正しく評価されないという重大な問題が生ずることを初めて見出した。

【0011】

例えば、中空ウイルス粒子を含有するウイルスキャプシド含有液を使用した場合、定量ＰＣＲ法では検出できない中空ウイルス粒子がウイルス除去媒体の破過を早め、本来測定すべき核酸を有するウイルスが、核酸を有するウイルスのみを負荷した場合に比して早期にウイルス除去媒体から漏れ出てしまい、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス能が過小評価されてしまうという問題を本発明者らは見出した。本発明者らは、鋭意検討を行った結果、中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液を使用することにより、より正確にウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能を評価できる場合があることを見出した。

【0012】

さらに感染価測定法では、核酸を有するが感染性を有しないウイルス及び／又は中空ウイルス粒子を含むウイルスキャプシド含有液を使用した場合に、核酸を有するが感染性を有しないウイルス及び／又は中空ウイルス粒子がウイルス除去媒体の破過を早め、本来測定すべき感染性を有するウイルスが早期にウイルス除去媒体から漏れ出してしまい、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス能が過小評価されてしまうという問題を本発明者らは見出した。本発明者らは、鋭意検討を行った結果、使用するウイルスキャプシド含有液における、感染価に対する全ウイルスキャプシド粒子数の比率（全ウイルスキャプシド粒子数／感染価）を事前に求め、感染価測定法によるウイルスクリアランス評価の結果を、核酸を有するが感染性を有しないウイルス及び中空ウイルス粒子を含む全ウイルスキャプシドの粒子数に基づく評価の結果として算出しなおすことにより、より正確にウイルスクリアランス性能を評価できる場合があることを見出した。なお、本開示において、「全ウイルスキャプシド」とは、ウイルスキャプシド含有液に存在する全ての種類のウイルスキャプシドを指す。本開示において、「全ウイルスキャプシド粒子数」とは、ウイルスキャプシド含有液に存在する全ての種類のウイルスキャプシドの粒子数を指す。従来技術においては、ウイルスクリアランス評価で使用される全ての種類のウイルスキャプシドを定量していないために、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス能が過小評価されていたことを、本発明者らは見出した。

【0013】

このように本発明者らは、ウイルスクリアランス性能評価において、使用する定量方法に応じてウイルスキャプシド含有液を選択することが無かった従来に比し、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能評価する際に、ウイルスの定量方法の種類に応じて使用するウイルスキャプシド含有液を適宜選択、あるいは使用するウイルスキャプシド含有液に応じて定量方法を適宜選択し、ウイルス除去媒体で精製される前後の溶液中の全ウイルスキャプシドを検出することにより、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能をより正確に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0014】

すなわち、本発明としては以下のものが挙げられる。
［１］
ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能を評価する方法であって、
（ａ）ウイルスキャプシド含有液を精製対象溶液に添加する工程、
（ｂ）ウイルスキャプシド含有液を添加された精製対象溶液をウイルス除去媒体に接触させ、精製された溶液を回収する工程、及び
（ｃ）精製される前の精製対象溶液中の全ウイルスキャプシド数及び精製された溶液中の全ウイルスキャプシド数を定量する工程
を含む方法。

【0015】

［２］
（ｂ）工程において、ウイルスキャプシド含有液を添加された精製対象溶液をウイルス除去媒体に通過させ、精製された溶液を回収する、［１］に記載の方法。

【0016】

［３］
精製対象溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液において、中空ウイルス粒子が除去されており、
（ｃ）工程において、精製される前の精製対象溶液中のウイルスが有する核酸及び精製された溶液中のウイルスが有する核酸を定量する、［１］又は［２］に記載の方法。

【0017】

［４］
中空ウイルス粒子が遠心分離により除去される、［３］に記載の方法。

【0018】

［５］
中空ウイルス粒子が密度勾配超遠心分離により除去される、［３］又は［４］に記載の方法。

【0019】

［６］
中空ウイルス粒子がイオジキサノールを用いた密度勾配超遠心分離により除去される、［３］から［５］のいずれかに記載の方法。

【0020】

［７］
核酸を、定量ＰＣＲ法又は蛍光フローサイトメトリー法で定量する、［３］から［６］のいずれかに記載の方法。

【0021】

［８］
核酸を、定量ＰＣＲ法で定量する、［３］から［７］のいずれかに記載の方法。

【0022】

［９］
ウイルス除去媒体が、膜又はビーズの形態を有する媒体である、［１］から［８］のいずれかに記載の方法。

【0023】

［１０］
ウイルス除去媒体がウイルス除去膜である、［１］から［９］のいずれかに記載の方法。

【0024】

［１１］
ウイルスが有する核酸を定量する工程の前に、溶液中の遊離核酸を除去する工程をさらに含む、［３］から［８］のいずれかに記載の方法。

【0025】

［１２］
ヌクレアーゼにより遊離核酸を除去する、［１１］に記載の方法。

【0026】

［１３］
ヌクレアーゼがＤＮａｓｅＩ又はベンゾナーゼである、［１２］に記載の方法。

【0027】

［１４］
ウイルスがＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅに属するウイルスである、［１］から［１３］のいずれかに記載の方法。

【0028】

［１５］
ウイルスキャプシド含有液が、天然由来ウイルスキャプシドを含むウイルスキャプシド含有液である［１］から［１４］のいずれかに記載の方法。

【0029】

［１６］
ウイルスキャプシド含有液が、核酸を有するウイルス粒子、及び中空ウイルス粒子を含む、［１］から［１５］のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0030】

本発明によれば、溶液中のウイルスを除去する工程におけるウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能をより正確に評価可能な方法を提供可能である。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】濃縮ＭＶＭ培養液及びリコンビナントＭＶＭ－ＶＰ２スタンダードのブロッティング結果を示す。各レーンの上に表示した数値は、それぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける濃縮ＭＶＭ培養液のサンプルロード量（μＬ）、リコンビナントＶＰ２スタンダードのサンプルロード量（μＬ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、本発明を実施するための形態（以下、「実施形態」ということがある）について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施できる。また、以下に示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための方法等を例示するものであって、これらの例示に限定されるものではない。

【0033】

実施形態に係るウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能を評価する方法は、（ａ）ウイルスキャプシド含有液を精製対象溶液に添加する工程と、（ｂ）ウイルスキャプシド含有液を添加された精製対象溶液をウイルス除去媒体に接触させ、精製された溶液を回収する工程と、（ｃ）精製される前の精製対象溶液中の全ウイルスキャプシド数及び精製された溶液中の全ウイルスキャプシド数を定量する工程と、を含む。

【0034】

一つの実施形態において、ウイルスとしては、感染性ウイルス又は非感染性ウイルスが例示される。ウイルスは天然由来であることが好ましい。また、ウイルス感染性及び核酸（ウイルス核酸）のいずれも有さない中空ウイルス粒子が存在する。

【0035】

一つの実施形態において、中空ウイルス粒子は、感染性及び核酸を有さないウイルスキャプシドである。また、中空ウイルス粒子には、浮上密度に影響を与えない程度の、ごく小さな核酸フラグメントを内包するものも含まれる。中空ウイルス粒子は天然由来であることが好ましい。

【0036】

一つの実施形態において、ウイルスキャプシドはウイルス及び／又は中空ウイルス粒子を含む。ウイルスキャプシドは天然由来であることが好ましい。

【0037】

天然由来のウイルス及び天然由来の中空ウイルス粒子は、組み換え発現や化学合成に代表される合成的に生成されるウイルスとは区別される。天然由来のウイルス及び天然由来の中空ウイルス粒子としては、それぞれ、ウイルスを感染させた宿主細胞を培地で培養した結果得られるウイルス及び中空ウイルス粒子や、ウイルス核酸を培養細胞にトランスフェクションして培養することで得られるウイルス及び中空ウイルス粒子が例示される。

【0038】

一つの実施形態において、ウイルスキャプシド含有液は、ウイルス及び／又は中空ウイルス粒子を含む液であれば特に限定されないが、天然由来のウイルス及び／又は天然由来の中空ウイルス粒子を含む液が例示される。感染性ウイルス、非感染性ウイルス、及び中空ウイルス粒子の３種のウイルスキャプシドのうちの少なくとも一つを含む液がウイルスキャプシド含有液として例示される。ウイルスキャプシド含有液は、感染性ウイルス又は非感染性ウイルスを少なくとも含むことが好ましい。また、上記３種のウイルスキャプシドのうち中空ウイルス粒子のみを含む液もウイルスキャプシド含有液の一つとして例示される。ウイルスを感染させた宿主細胞を培地で培養した結果得られる、ウイルスの培養液も、ウイルスキャプシド含有液の一つとして例示される。ウイルスは、宿主細胞に感染した状態で存在していてもよいし、ウイルスキャプシド含有液（例えばウイルスの培養液）中に遊離した状態で存在していてもよい。ウイルスキャプシド含有液は、宿主細胞にウイルスを感染させて培養することにより得られた培養物の培養上清及び／又は感染した細胞の破砕物（以下、単に「感染細胞破砕物」ともいう。）であってもよい。「培養上清」としては、感染培養後の培地が例示される。「感染細胞破砕物」としては、感染培養後の細胞を凍結融解やホモジェナイズによって破砕した、いわゆるライゼートが例示される。また、複数のウイルスキャプシド含有液を混合した液もウイルスキャプシド含有液の一つとして例示される。

【0039】

一つの実施形態において、ウイルスキャプシド含有液は、上記のウイルスキャプシド含有液であれば特に限定されないが、溶液、懸濁液、又はゲル状液が例示され、溶液が好ましい態様として例示される。溶液の例として、ウイルスの培養液や、ウイルスの培養液を精製しウイルスキャプシド以外の含有物を除去した液が挙げられる。

【0040】

感染性ウイルス及び非感染性ウイルスは、核酸（ウイルス核酸）を有する。感染性ウイルス及び非感染性ウイルスを合わせて、「核酸を有するウイルス」、「ＦｕｌｌＣａｐｓｉｄウイルス」又は「ＦＣウイルス」と呼ぶことがある。一方、中空ウイルス粒子は、感染性及び核酸（ウイルス核酸）のいずれも有さないウイルスキャプシドである。中空ウイルス粒子を、「核酸を有さないウイルス」と呼ぶことがある。ウイルスキャプシド含有液中に含まれ得る上記３種のウイルスキャプシド、すなわち感染性ウイルス、非感染性ウイルス、及び中空ウイルス粒子を合わせて全ウイルスキャプシドと呼ぶ。ただし、ウイルスキャプシド含有液から中空ウイルス粒子を除去した場合は、ウイルスキャプシド含有液中に含まれ得る感染性ウイルス及び非感染性ウイルスを合わせて全ウイルスキャプシドと呼ぶ。

【0041】

一つの実施形態において、ウイルスは、生物物質に含まれる又は含まれる可能性のあるウイルスであれば特に限定されないが、マウス微小ウイルス（ＭｉｎｕｔｅＶｉｒｕｓｏｆＭｉｃｅ）、豚パルボウイルス（ＰｏｒｃｉｎｅＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、レオウイルス３型（ＲｅｏＶｉｒｕｓＴｙｐｅ３）、急性灰白髄炎ウイルス（ＰｏｌｉｏＶｉｒｕｓ）、豚ヘルペスウイルス（ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨｕｍａｎＨｅｒｐｅｓＶｉｒｕｓ１）、異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、及びウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢｏｖｉｎｅＶｉｒａｌＤｉａｒｒｈｅａＶｉｒｕｓ）が例示され、マウス微小ウイルス及び豚パルボウイルスが好ましい態様として例示され、マウス微小ウイルスがより好ましい態様として例示される。

【0042】

一つの実施形態において、ウイルスがパルボウイルスである場合、その平均粒径が２０ｎｍ以上４０ｎｍ以下のウイルスが例示される。具体的には、豚パルボウイルス（ＰＰＶ）又はマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）などが例示される。宿主細胞に任意のパルボウイルスを感染させて培養した「培養上清」及び／又は「感染細胞破砕物」を、本実施形態においては「ウイルス培養液」と呼ぶことがある。

【0043】

一つの実施形態において、ウイルスキャプシド含有液は例えば以下の通り製造することができる。ウイルスキャプシド含有液を生産するために、まず、ウイルスの宿主細胞を培養する。宿主細胞としては、ウイルスが感染し、増幅する細胞であればいずれも利用することができる。ウイルスがパルボウイルスである場合、パルボウイルスが感染して増幅する細胞であればいずれも利用することができる。ウイルスが豚パルボウイルスであれば、ＰＫ－１３細胞（ＡＴＣＣ）及びＰＫ－１５細胞（ＡＴＣＣ）などが利用できる。ウイルスがマウス微小ウイルスであれば、マウス線維芽細胞Ａ９、シミアンウイルス４０形質転換ヒト線維芽細胞（３２４Ｋ細胞、ＮＢ３２４Ｋ細胞など）、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などが利用できる。

【0044】

一つの実施形態において宿主細胞の培養方法は限定されない。培養フラスコを用いる方法、マイクロキャリアに固定して攪拌培養する方法、ローラーボトルを用いる方法、バイオリアクターを用いる方法などいずれの方法も利用できる。また、接着培養及び浮遊培養のいずれも利用できる。

【0045】

一つの実施形態において、培養フラスコは、市販の、例えばファルコン社製の組織培養用フラスコや、マルチウェルプレートが例示される。

【0046】

一つの実施形態において、マイクロキャリアは、市販の、例えばＧＥヘルスケア社製のＣｙｔｏｄｅｘ、Ｃｙｔｏｐｏｒｅが例示される。

【0047】

一つの実施形態において、ローラーボトルは、市販の、例えばＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製のＣＥＬＬＭＡＳＴＥＲ細胞培養ローラーボトルが例示される。

【0048】

いずれの培養方法においても、培養温度は、哺乳類動物細胞培養に汎用的に適用される３３℃以上３９℃以下が例示され、特に３７℃が好ましい。培地のｐＨは、哺乳類動物細胞培養に汎用的に適用される７以上８以下が好ましい。培地の濃度は、宿主細胞と等張圧となる（浸透圧が等しくなる）濃度が好ましい。

【0049】

一つの実施形態において、培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＣＤ培地、ＳＦＭ培地、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＭＦ培地、Ｖｉｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ 培地（ＳＦＭ４Ｍｅｇａ Ｖｉｒ培地、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｘｐｒｅｓｓ培地、及びＣＤＭ４Ａｖｉａｎ培地）等が例示される。これらの培地は、ギブコ社、サーモフィッシャー社、ＧＥヘルスケア社等から入手することができる。

【0050】

培養した非感染状態の宿主細胞にウイルスのシードを感染させる。シードウイルスは、ＡＴＣＣなどから購入したウイルスを、本明細書に記載する方法等で増やした後にクライオチューブ等に小分けし、－８０℃で凍結保存しておいたものを使用できる。購入可能なシードウイルスの例として、ウイルスがＰＰＶならばＶＲ－７４２（ＡＴＣＣ）、ＭＶＭならばＶＲ－１３４６（ＡＴＣＣ）が例示される。

【0051】

シードウイルス感染方法は、培養した（非感染状態の）宿主細胞の入った培養器材中に、所定の量のウイルス（培地中に懸濁した状態のもの）を添加すればよい。

【0052】

培養液中のパルボウイルス以外の不純物量をより少なくするために、培地は血清を含まない無血清培地であることが望ましい。ただし、ウイルスの効率的な増幅は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清を含む培地で培養することにより達成することができる。そのため、特許文献１に記載の方法などにより、ウイルス培養液を回収する２４時間以上前に、培養培地を、血清含有培地から無血清培地に交換しておくことで、血清由来の不純物を含まない培地中に細胞からウイルスを生産させて回収することができる。次工程の超遠心の前に、パルボウイルス培養液中に存在する細胞の破片などの大きな粒子径の夾雑物を除去するために、低速遠心と除菌膜濾過を行うこともできる。低速遠心は、ウイルスが沈殿しないが細胞の破片が沈殿する重力加速度を選択して実施することができる。例えば３，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離（例えば、特許文献１参照。）が行われるが、これらの条件に限定されない。また、除菌膜濾過は、孔径０．４５μｍ、０．２２μｍ又は０．１μｍの膜を使用することができる。これらの孔径を有する膜の例として、サーモフィッシャー社製ボトルトップフィルター０．４５μｍ、又はサーモフィッシャー社製ボトルトップフィルター０．２２μｍ等が挙げられる。

【0053】

試験に供するウイルスキャプシド含有液をより高濃度、及び高純度とするため、回収したウイルス培養液を濃縮、及び精製してもよい。濃縮方法としては、既知の方法が利用できる。例えば、ＣｓＣｌ₂を用いて塩析沈殿させる方法、ＰＥＧ沈殿法や、限外濾過膜を用いる方法、超遠心分離法など、多くの既知の方法が利用できる（例えば、特許文献１、２、及び非特許文献６参照。）。その中でも、溶媒交換が便利であること、ウイルスの回収率が高いことから、超遠心分離法又はＰＥＧ沈殿法による濃縮法が好ましい。

【0054】

例えば、超遠心分離法を利用する場合は、ウイルスが沈殿する遠心相対力（ｇ）と時間で超遠心を行い、ウイルスを沈殿させたのちに上清を除去し、沈殿画分を適切な溶媒に再懸濁する。ウイルスがパルボウイルスの場合、これらを沈殿させる超遠心条件は既知であり、それらを利用することができる（例えば、非特許文献７参照。）。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ社製 Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ超遠心分離機でＴｙｐｅ４５ Ｔｉローターを使用する場合には、２９４００ ｒｐｍで２時間超遠心を行うことで、パルボウイルスは沈殿する。再懸濁する溶媒は、汎用的に使われるＴＮＥ（トリス緩衝液＋ＮａＣｌ＋ＥＤＴＡ）緩衝液やＰＢＳ緩衝液などが利用できる。溶媒は、好ましくはＰＢＳ緩衝液である。

【0055】

ＰＥＧ沈殿法を利用する場合は、ウイルスが凝結する程度のポリエチレングリコールと塩を加えて遠心分離を行い、ウイルスを沈殿させたのちに上清を除去し、沈殿画分を適切な溶媒に再懸濁する。このとき、ウイルスの沈殿に一般的に利用される実験条件を活用することができる（例えば、特許文献１参照。）。例えば、ポリエチレングリコールとしてはＰＥＧ６０００を用いることができる。また、ウイルスがパルボウイルスである場合は、終濃度１０．０ｗ／ｖ％ＰＥＧ６０００、終濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを加えて４℃で２時間攪拌したのちに、１０．０００ｘｇで３０分間遠心分離を行うことで、パルボウイルスは沈殿する。再懸濁する溶媒は、汎用的に使われるＴＮＥ（トリス緩衝液＋ＮａＣｌ＋ＥＤＴＡ）緩衝液やＰＢＳ緩衝液などが利用できる。好ましくはＰＢＳ緩衝液である。

【0056】

好ましくは、精製対象溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液において、中空ウイルス粒子が除去されている。ウイルスキャプシド含有液から中空ウイルス粒子を除去することにより、ウイルスキャプシド含有液に含まれていた中空ウイルス粒子の量に影響されずに、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能を正確に評価することが可能である。中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液は、例えば以下の通り製造することができる。

【0057】

中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液の作成方法としては、ウイルス培養液から中空ウイルス粒子を分離・除去する方法が利用できる。中空ウイルス粒子の分離・除去方法としては密度勾配超遠心による方法、イオン交換クロマトグラフィーによる方法が利用できるが、好ましくは密度勾配超遠心による方法である。

【0058】

密度勾配超遠心法では、核酸を有するウイルスと、核酸を有しない中空ウイルス粒子との浮上密度差を利用して中空ウイルス粒子の分離を行う。この超遠心条件は特定の条件に限定されるものではないが、感染性ウイルス及び非感染性ウイルスと、中空ウイルス粒子と、を分離させる超遠心条件には幾つかの報告があり、それらを利用することができる（例えば、非特許文献４、８参照。）。

【0059】

例えば、ＵＣチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製１３．２ｍＬ、＃３４４０５９）中に形成した、ＰＢＳ－１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ₂－２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）を溶媒に用いたイオジキサノール（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ社製、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）水溶液の非連続密度勾配（５５％－２ｍＬ、４５％－２ｍＬ、４０％－２ｍＬ、３５％－２ｍＬ、２５％－１．５ｍＬ、１５％－１．５ｍＬ）の最上部に１ｍＬのウイルス培養液をロードし、超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製 Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）でＳＷ４１ローターを使用して３５０００ｒｐｍ、４℃で１８時間の超遠心を行うことにより、核酸を有するウイルスと、中空ウイルス粒子と、を分離することができる。超遠心後のサンプルから核酸を有するウイルスの浮上密度にあたる画分のみを回収することで、ウイルス培養液から中空ウイルス粒子が除去される。ウイルスがパルボウイルスの場合、中空ウイルス粒子の浮上密度は１．１ｇ／ｍＬ以上１．２ｇ／ｍＬ以下であり、核酸を有するウイルスの浮上密度は１．２ｇ／ｍＬ以上１．３ｇ／ｍＬ以下である。好ましくは、この超遠心分離を合計で２回繰り返し行い、中空ウイルス粒子の分離度を高めるとよい。

【0060】

超遠心分離によって得られた核酸を有するウイルスを含む画分は高濃度のイオジキサノール水溶液となるため、溶媒交換を行ってイオジキサノール濃度を減少させることが好ましい。溶媒交換の方法は、既知の溶媒交換法の中から選択して実施することができる。例えば、脱塩、ＵＦ膜濾過、又は透析が例示され、好ましくは脱塩である。より好ましくはＺｅｂａＳｐｉｎＤｅｓａｌｔｉｎｇＣｏｌｕｍｎｓ４０ＫＭＷＣＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を利用した脱塩である。

【0061】

ウイルスキャプシド含有液において中空ウイルス粒子が除去されたことは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を利用した観察によって確認することができる。ＴＥＭを利用した観察法としては、例えば１．０％酢酸ウラニルを用いたネガティブ染色観察法又は低温電子顕微鏡（ＣｒｙｏＥＭ）観察法が例示される。ネガティブ染色観察法では、核酸を有するウイルスは白い粒子、核酸を有さないウイルスキャプシドである中空ウイルス粒子は黒い粒子として観察され、ＣｒｙｏＥＭ法では、核酸を有するウイルスは黒い粒子、中空ウイルス粒子は白い粒子として観察されるので、これらの粒子を視覚的に識別することが可能である（例えば、非特許文献９参照。）。

【0062】

例えば、全ウイルスキャプシドにおける中空ウイルス粒子の含有率を測定する場合、測定対象のウイルスキャプシド含有液の一部を採取し、これをＴＥＭにより観察する。１視野における核酸を有するウイルス及び中空ウイルス粒子の数をカウントし、全ウイルスキャプシドの粒子数に対する中空ウイルス粒子数の割合を算出する。これを３視野分測定した結果の平均値を、測定対象ウイルスキャプシド含有液における中空ウイルス粒子の含有率とすることができる。一つの実施形態において、中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液は、特に限定されないが、全ウイルスキャプシドにおける中空ウイルス粒子の含有率が、上限として５０％以下、４４％以下、３８％以下、３０％以下、２０％以下、又１０％以下であることが例示され、３８％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましい態様として例示される。下限としては、全く中空ウイルス粒子を含有しない（０％）又は透過型電子顕微鏡観察測定方法における検出限界以下であることが好ましいが、０．５％以上、１％以上、２％以上、５％以上、又は１０％以上が例示される。中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液は、好ましくは、中空ウイルス粒子を実質的に含まない。ウイルスキャプシド含有液には、ウイルス以外の成分が混入することもあるが、そのようなウイルスキャプシド含有液を排除するものではない。別の態様としてウイルス以外の成分を実質的に含まないウイルスキャプシド含有液も例示される。

【0063】

一つの実施形態において、ウイルス除去媒体で濾過される精製対象溶液に含まれる生物物質は、それと共に溶液中に含まれるウイルスが除去対象となる物質であれば特に限定されないが、タンパク質が例示される。タンパク質としては、アルブミン、グロブリン、又はフィブリノゲンが挙げられる。また、タンパク質としては、別の態様として抗体が例示される。生物物質には、バイオ医薬品（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）又は血漿分画製剤も含まれる。生物物質は市販のものを入手することもできるし、従来公知の方法で製造することもできる。

【0064】

一つの実施形態において、精製対象溶液である生物物質含有溶液は、生物物質を含む溶液であれば特に限定されない。生物物質含有溶液の溶媒としては、水溶液、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、又はトリス緩衝液が例示され、水溶液が好ましい態様として例示される。

【0065】

一つの実施形態において、生物物質含有溶液のｐＨは、上限として１２以下、１０以下、９以下、８以下、又は５以下が例示される。下限として２以上、３以上、又は４以上が例示される。

【0066】

一つの実施形態において、生物物質含有溶液の生物物質濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、上限として２００ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下、又は１０ｍｇ／ｍＬ以下が例示される。下限としては０ｍｇ／ｍＬ超、５ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以上、又は２０ｍｇ／ｍＬ以上が例示される。

【0067】

一つの実施形態において、ウイルス除去媒体は、ウイルスを除去することができる媒体であればその形態は特に限定されないが、ビーズ、ゲル、スポンジ、又は粉末等の形態が例示され、別の態様としては繊維、又は膜（平膜又は中空糸膜。いわゆるウイルス除去膜）が例示される。ウイルス除去媒体の形状の別の態様としては、平膜又は中空糸膜が例示され、さらに別の態様としては平膜が例示され、さらに別の態様としては中空糸膜が例示される。さらに別の態様としては、膜又はビーズの形態が例示される。ウイルス除去媒体は多孔質成形体であってもよい。多孔質成形体が、微多孔膜、不織布、織布、モノリス、ゲル、又は粒子床であってもよい。

【0068】

一つの実施形態において、ウイルス除去媒体の素材としては、ウイルスを除去することができる素材であれば特に限定されないが、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、セルロース、セルロース誘導体又はそれらの混合物が挙げられる。それぞれ公知の方法で製造することができる。

【0069】

一つの実施形態において、ウイルス除去媒体としては、ウイルス除去膜が好ましい。ウイルス除去膜は、使用するウイルスのサイズに応じて適宜選択することができ、ウイルスを除去することができれば特に限定されないが、パルボウイルスに対するＬＲＶが４以上である膜が例示される。パルボウイルスに対するＬＲＶが４以上であるろ過膜とは、使用するろ過膜に対し、パルボウイルスＰＰＶ又はＭＶＭを含む溶液を５０Ｌ／ｍ²負荷した場合におけるＬＲＶが４以上となる膜である。パルボウイルスを含む溶液としては、１０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ溶液（ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４）にＬｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］で与えられるパルボウイルスＰＰＶ又はＭＶＭ濃度を６．５としたものが用いられる。また、ウイルス除去膜の平均孔径が使用するウイルスの大きさ前後以下であれば特に限定されない。例えばパルボウイルスを使用した場合、ウイルス除去膜の平均孔径としては５ｎｍ以上２４ｎｍ以下の範囲が例示され、１４ｎｍ以上２２ｎｍ以下の範囲が好ましく、１８ｎｍ以上２０ｎｍ以下の範囲がより好ましい例として挙げられる。具体的には、プラノバ（旭化成メディカル社製）、ＶｉｒａｓｏｌｖｅＰｒｏ（Ｍｅｒｃｋ社製）、ＰｅｇａｓｕｓＰｒｉｍｅ、ＰｅｇａｓｕｓＳＶ４（ＰＡＬＬ社製）、及びＶｉｒｏｓａｒｔＣＰＶ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ社製）が例示される。

【0070】

一つの実施形態において、ウイルス除去媒体がウイルス除去膜である場合、ウイルス除去膜は実質的にウイルスを除去できるものであれば特に限定されないが、一例として約１５ｎｍ以上約７５ｎｍ以下の公称孔サイズを有するウイルス除去膜が例示される。例えば、公称孔サイズ２０ｎｍの膜では、例えばパルボウイルス（直径１８ｎｍ以上２６ｎｍ以下）を除去することが可能であり、一方、１６０ｋＤ（約８ｎｍ）といった大きさであるタンパク質、例えばモノクローナル抗体の通過を可能にする（例えば、特許文献３参照。）。例えば公称孔サイズ３５ｎｍ以上の膜を用いて、レトロウイルス（直径８０ｎｍ以上１００ｎｍ以下）を除去し得る。

【0071】

一つの実施形態において、ウイルス除去媒体がウイルス除去膜である場合、１００ｋＤ以上１０００ｋＤ以下の分画分子量を有するウイルス除去膜が例示される。これに関連して、膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、ある物質を膜に通過させた際に、当該物質の９０％が膜を通過できる物質の分子量（ｎｏｍｉｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）を意味する。分画分子量として、公称分画分子量を用いることもできる。

【0072】

一つの実施形態において、精製された生物物質含有溶液は、ウイルス除去媒体に接触させる前の生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に接触させ、回収された溶液であれば特に限定されない。「精製された」とは、「ウイルス除去媒体に接触、回収された」ものであれば足りる。精製された生物物質含有溶液の各条件は、前記の生物物質含有溶液の条件を適宜適用すればよい。

【0073】

一つの実施形態において、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能評価する際に、ウイルスの定量方法の種類に応じて使用するウイルスキャプシド含有液を適宜選択する、あるいは使用するウイルスの種類に応じて定量方法を適宜選択することで、当該ウイルス中のウイルスキャプシドを全て定量することが可能となる。

【0074】

例えば、ウイルスを検出するための定量方法として定量ＰＣＲ法を採用する場合、中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液を選択する。「核酸を有するウイルス」は、定量ＰＣＲ法によりその粒子個数を定量可能であるが、中空ウイルス粒子は、定量ＰＣＲ法によりその粒子個数を定量できないためである。通常、ウイルスは１粒子につき１分子の核酸をキャプシドに内包するため、「核酸を有するウイルス」に内包された核酸の分子数はウイルスの粒子数と等しくなる。このとき、ウイルスキャプシドに内包された核酸の分子数（コピー数）を表す単位としてＣｏｐｉｅｓ／ｍＬを使用することができる。

【0075】

また、ウイルスの定量方法として感染価測定法を採用する場合、精製対象溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液における感染価に対する全ウイルスキャプシドの粒子数の比を予め測定しておき、精製前後の精製対象溶液で測定した感染価から、上記の比（全ウイルスキャプシド粒子数／感染価）に照らして、精製前後の精製対象溶液における全ウイルスキャプシド粒子数を算出することができる。この場合、ウイルスキャプシド含有液から中空ウイルス粒子を除去しなくともよい。

【0076】

感染価とは、感染性を有するウイルスの濃度を表記する単位である。感染価測定法には、最小感染単位を決定するエンドポイント方式と、ウイルスによって形成される局所病巣算定方式がある。エンドポイント方式としては、ウイルスを段階希釈して一定数以上の培養細胞に接種し、一定期間培養して、感染の陽性／陰性を判定することで、５０％感染陽性となる希釈倍率を求める、５０％感染終末点（ＴＣＩＤ₅₀： Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ５０）法が一般的である。局所病巣算定方式としては、宿主細胞の単層培養上にウイルスを接種し、ウイルス吸着を行わせたあと、寒天を含む培地を重層して固め、接種したウイルスの数だけ形成されるプラークを測定する、プラーク法が一般的である。感染価の単位は、ＴＣＩＤ₅₀法を利用する場合はＴＣＩＤ₅₀、プラーク法を利用する場合はｐｆｕを使用することができる。ｐｆｕはｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（プラーク形成単位）の略である。また、ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ、及びｐｆｕ／ｍＬという単位によって、１ｍＬあたりの感染価が表される。

【0077】

ウイルスクリアランス能力を評価する方法は特定の方法に限定されないが、対数除去率（ＬＲＶ）計算法又はウイルス捕捉容量測定法を用いることができる。

【0078】

ＬＲＶ計算法では、ウイルス除去媒体による精製の前後でウイルス濃度を比較し、その対数除去率を計算する。ＬＲＶは以下の通り算出することができる。
ＬＲＶ＝濾過前のウイルス濃度の対数値－濾過後のウイルス濃度の対数値
濾過前のウイルス濃度の対数値は、ｌｏｇ₁₀［濾過前のウイルス粒子数／ｍＬ］で与えられる。濾過後のウイルス濃度の対数値は、ｌｏｇ₁₀［濾過後のウイルス粒子数／ｍＬ］で与えられる。

【0079】

ウイルス捕捉容量測定法では、ウイルス除去媒体と接触あるいは媒体を通過した溶液を複数のフラクションとして分取し、各フラクションのウイルス核酸濃度を定量する。このとき、ウイルス除去媒体と接触あるいは通過後にはじめてウイルス核酸が検出されたフラクションを選出し、該フラクションを分取するまでにウイルス除去媒体に負荷した総ウイルス量を該ウイルス除去媒体のウイルス捕捉容量とする。

【0080】

（ａ）ウイルスキャプシド含有液を精製対象溶液に添加する工程について
一つの実施形態において、添加（スパイク）するウイルス量については、ウイルスキャプシド含有液が添加された生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に接触させた際に、添加するウイルスキャプシド含有液又はウイルスキャプシド含有液に含まれる不純物によって、ウイルス除去媒体に目詰まり等の異常を起こさない量であれば、添加するウイルス量は特に限定されない。

【0081】

添加するウイルスキャプシド含有液の量、すなわちウイルススパイク率は以下の通り算出することができる。
ウイルススパイク率（％）＝（添加するウイルスキャプシド含有液の体積／ウイルスキャプシド含有液を添加する生物物質含有溶液の体積）×１００

【0082】

ウイルススパイク率は、ウイルスキャプシド含有液添加後にウイルス除去媒体の目詰まりが生じないものであれば特に限定されないが、例えば、生物物質含有溶液へのウイルススパイク率の上限としては１０％以下が例示され、下限としては０％超が例示される。ウイルス以外の成分によるウイルス除去媒体の目詰まりを防止する観点からは、ウイルススパイク率は１．０％以下であることが好ましい。

【0083】

生物物質含有溶液が商業生産を目的としたものである場合は、商業生産における製造条件を適切な割合でスケールダウンした条件で製造された生物物質含有溶液であることが好ましい。

【0084】

ウイルスキャプシド含有液を生物物質含有溶液に添加する際の生物物質含有溶液の温度としては、生物物質含有溶液に含まれる生物物質が安定して存在する温度であれば特に限定されないが、例えば、上限として５０℃以下、３７℃以下、２５℃以下が例示される。下限としては、０℃超、４℃以上、８℃以上が例示される。生物物質含有溶液が商業生産を目的としたものである場合は、商業生産における製造温度が好ましい。

【0085】

（ｂ）生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に接触させ、精製された生物物質含有溶液を回収する工程について
一つの実施形態において、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に接触させることとしては、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に接触させることができれば特に限定されないが、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に通過させること、又は生物物質含有溶液中にウイルス除去媒体を浸漬することなどがあげられる。目的タンパク質精製の制御を比較的容易に行う観点からは、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に通過させることが好ましい。

【0086】

一つの実施形態において、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に通過させることとしては、シリンジ又はポンプなどにより生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に通過させることが例示される。生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に通過させる方法としては、ウイルス除去媒体中のある部分に向けて流した生物物質含有溶液がウイルス除去媒体を通過し、ウイルス除去媒体の別の部分から生物物質含有溶液が回収できればよい。また、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に通過させる前後において、生物物質含有溶液とは別に緩衝液をウイルス除去媒体に通過させてもよい。生物物質含有溶液回収の際、ウイルス除去媒体に通過させる生物物質含有溶液をすべて回収してもよく（プール回収）、一定体積ごとにフラクションを取得してもよい（フラクション分取）。フラクション分取の場合、精製生物物質を含有するフラクションを収集して一つにすることにより、精製生物物質を回収することができる。

【0087】

また、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に通過させる流速としては特に限定されないが、ウイルス除去媒体がビーズの形態を有する場合には、下限値としてウイルス除去媒体１ｍＬに対して０．１ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、別の態様として０．５ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、別の態様として１．０ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示され、さらに別の態様としては５ｍＬ／ｍｉｎ以上が例示される。ウイルス除去媒体が膜の形態を有する媒体である場合には、下限として０Ｌ／ｍ²／ｈｏｕｒ超が例示され、別の態様として１０Ｌ／ｍ²／ｈｏｕｒが例示され、さらに別の態様としては４０Ｌ／ｍ²／ｈｏｕｒが例示される。

【0088】

一つの実施形態において、生物物質含有溶液をウイルス除去媒体に浸漬することとしては、生物物質含有溶液中にウイルス除去媒体を投入することが例示される。この際、ウイルス除去媒体が投入された生物物質含有溶液に対し、シェーカー等による振盪や攪拌子などによる攪拌を行ってもよいし、溶液を静置してもよい。浸漬後、ウイルス除去媒体を生物物質含有溶液から除去することにより精製タンパク質を回収することができる。ウイルス除去媒体の除去方法としては、遠心分離、ろ過などが例示される。

【0089】

一つの実施形態において精製された生物物質含有溶液を回収することとしては、精製された生物物質を取得することができれば特に限定されないが、精製された生物物質が溶解したままの溶液の状態で回収すればよい。例えば、プール回収又はフラクション分取等の方法から適宜選択して実施することができる。

【0090】

一つの実施形態において、ウイルス除去媒体は前記のウイルス除去媒体を使用することができる。

【0091】

（ｃ）精製される前の生物物質含有溶液中の全ウイルスキャプシド及び精製された生物物質含有溶液中の全ウイルスキャプシドを定量する工程について
一つの実施形態において、より正確にウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能を評価するためには、生物物質含有溶液中に存在する全ウイルスキャプシドを測定可能なウイルス定量方法を選択するか、又はウイルスクリアランス性能評価において使用するウイルスの種類に応じて定量方法を適宜選択すればよい。ウイルス定量方法としては、定量ＰＣＲ法、蛍光フローサイトメトリー法、ＴＣＩＤ₅₀法、又はプラーク法が例示される。

【0092】

例えば、ウイルスの定量方法として定量ＰＣＲ法のようなウイルス核酸を検出する方法を採用する場合、中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液を選択することができる。また、ウイルスの定量方法として感染価測定法のようなウイルスの感染価を測定する方法を採用する場合、生物物質含有溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液中の感染価に対する全ウイルスキャプシド粒子数の比（全ウイルスキャプシド粒子数／感染価）を予め測定しておき、生物物質含有溶液で測定した感染価から上記の比（全ウイルスキャプシド粒子数／感染価）に照らして、生物物質含有溶液に含まれるウイルス粒子数を算出することができる。

【0093】

（ｃ１）精製される前の生物物質含有溶液中のウイルスが有する核酸及び精製された生物物質含有溶液中のウイルスが有する核酸を定量する工程について
この場合、前記（ａ）工程で添加するウイルスキャプシド含有液として、中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液（例えばＦＣウイルスキャプシド含有液）を使用すればよい。

【0094】

核酸を定量する方法としては、既知の方法を使用すればよいが、定量ＰＣＲ法又は蛍光フローサイトメトリー法が例示される。より好ましくは定量ＰＣＲ法であり、さらに好ましくは定量リアルタイムＰＣＲ法である。定量ＰＣＲ法においては、例えば製品ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用することができる。蛍光フローサイトメトリー法においては、例えば製品Ｇａｌｌｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用することができる。

【0095】

定量ＰＣＲ法を用いる場合にウイルスから核酸を抽出する方法としては、既知の方法を使用すればよい、各種核酸抽出キットを使用する方法や、フェノールクロロホルム抽出法などが例示される。好ましくは核酸抽出キットを使用する方法が例示され、より好ましくはハイピュアウイルス核酸抽出キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用する方法が例示される。

【0096】

核酸抽出に供するサンプル量は、特に限定されない。核酸抽出に供したサンプル量と、実際に検出された核酸の分子数を利用して、核酸抽出に供したサンプルに含まれる核酸の濃度を計算することができる。

【0097】

また、核酸抽出に先立って、回収した生物物質含有溶液に含まれる遊離核酸を予め除去しておくことが好ましい。それにより、ウイルス除去媒体のウイルスクリランス性能をより正確に評価することができる。遊離核酸を予めの除去する方法はとしては、ヌクレアーゼを用いて遊離核酸を分解する方法を使用することができる。ヌクレアーゼの種類は特に限定されず、生物物質含有溶液の性質に適したものを選択して使用することができる。例えば、ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）又はベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）などのヌクレアーゼが利用できる。

【0098】

定量ＰＣＲ法による核酸定量法としては、濃度既知核酸をスタンダードに用いた絶対定量法が使用できる。このとき、濃度既知核酸としては、対象サンプルの測定に使用するプライマー、プローブを用いてＰＣＲ法により増幅できる核酸が使用できる。好ましくは対象サンプルと塩基配列が完全一致する核酸であり、より好ましくは対象サンプルと塩基配列が部分的に一致する核酸である。

【0099】

中空ウイルス粒子を除去したウイルスキャプシド含有液をスパイクした生物物質含有溶液に含まれるウイルス核酸及び精製された生物物質含有溶液に含まれるウイルス核酸を定量することで、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能を評価することができる。核酸を定量する方法としては、前記の通り定量ＰＣＲ法、又は蛍光フローサイトメトリー法を使用することができ、より好ましくは定量ＰＣＲ法、さらに好ましくは定量リアルタイムＰＣＲ法を使用することができる。核酸を有しない中空ウイルス粒子を除去することにより、核酸を定量する方法で検出されない中空ウイルス粒子が、ウイルス除去媒体のウイルスクリアランス性能評価に影響を与えることを抑制可能である。

【0100】

（ｃ２）精製される前の生物物質含有溶液中のウイルスの感染価及び精製された生物物質含有溶液中のウイルスの感染価を定量し、生物物質含有溶液に添加するウイルスキャプシド含有液における感染価に対する全ウイルスキャプシド粒子数の比率Ｔ（全ウイルスキャプシド粒子数／感染価）から、精製される前の生物物質含有溶液中の全ウイルスキャプシド粒子数及び精製された生物物質含有溶液中の全ウイルスキャプシド粒子数を算出する工程について
生物物質含有溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液における感染価に対する全ウイルスキャプシド粒子数の比率Ｔ（＝全ウイルスキャプシド粒子数／感染価）は、例えば、感染価を定量する前か後に算出する。（ｃ２）工程の場合、（ａ）工程で生物物質含有溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液は、感染性ウイルスに加えて、非感染性ウイルス及び／又は中空ウイルス粒子を含んでいてもよい。したがって、ウイルスキャプシド含有液から中空ウイルス粒子を除去しなくともよい。

【0101】

「感染価」の測定方法としては、既知の感染価測定方法をいずれも選択することができる。たとえば、ＴＣＩＤ₅₀法や、プラーク法を使用することができる。精製される前の生物物質含有溶液中のウイルスの感染価の測定方法、精製された生物物質含有溶液中のウイルスの感染価の測定方法、及び生物物質含有溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液におけるウイルスの感染価の測定方法は、同じであることが好ましい。

【0102】

比率Ｔは、前記（ａ）工程で生物物質含有溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液における、「全ウイルスキャプシド粒子数」を「感染価」で除したものとして定義される。すなわち、生物物質含有溶液に添加されるウイルスキャプシド含有液における感染価あたりの全ウイルスキャプシド粒子数を意味する。つまり、比率Ｔを用いることにより、生物物質含有溶液におけるウイルスの感染価から、生物物質含有溶液における全ウイルスキャプシド粒子数を算出することができる。

【0103】

比率Ｔは、（ａ）工程で生物物質含有溶液にウイルスキャプシド含有液を添加する事前あるいは事後どちらのタイミングで算出してもよい。ただし、（ａ）工程の実施によって、（ａ）工程で添加したウイルスキャプシド含有液と同一のウイルスキャプシド含有液の入手が不可能になる（例えばウイルスキャプシド含有液を使い切る、等）場合は、（ａ）工程の事前に比率Ｔをあらかじめ算出する必要がある。

【0104】

比率Ｔの定義における「全ウイルスキャプシド粒子数」の測定方法は、粒子として存在するウイルスキャプシドの濃度（個／ｍＬ）を測定可能なものであればいずれの方法も選択することができる。例えば、ウイルスキャプシド粒子のキャプシドタンパク質重量を測定して粒子数を算出する方法や、透過型電子顕微鏡による粒子濃度計測等を使用することができる。ウイルスキャプシド粒子のキャプシドタンパク質重量を測定する方法としては、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ（ＥｚｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｎｏＳｏｌｖａｎｔＡｓｓａｙ）法が例示される。

【0105】

一般的に、１つのウイルスキャプシド粒子を形成するキャプシドタンパク質の重量は計算により求めることができる。例えば、使用するウイルスがＭＶＭ（ＭｉｎｕｔｅＶｉｒｕｓＯｆＭｉｃｅ）の場合、ウイルス一粒子あたり、キャプシドタンパク質であるＶＰ２とＶＰ３タンパク質が合計で５０分子含まれることが知られている（例えば、非特許文献１０、１１参照。）。ＶＰ２の分子量は約６４３００ｇ／ｍｏｌ、ＶＰ３の分子量は６１４００ｇ／ｍｏｌであり（例えば、非特許文献１１参照。）、ＭＶＭ粒子におけるこれらの分子の含有比率は一般的にＶＰ２の方が十分大きいことから、これらのタンパク質の代表分子量としてＶＰ２の分子量６４３００ｇ／ｍｏｌを使用することができる。アボガドロ定数を６．０Ｅ２３／ｍｏｌとすると、ＭＶＭ一粒子当たりのＶＰ２及びＶＰ３含有量の合計は、（６４３００ｇ／ｍｏｌ×５０）／６．０Ｅ２３／ｍｏｌ＝５．４Ｅ－１８ｇと算出することができる。すなわち、（ａ）工程では、添加するウイルスキャプシド含有液に含まれるＶＰ２及びＶＰ３重量の合計を定量し、その値を５．４Ｅ－１８で除することによって、ＭＶＭ粒子の数及び濃度を算出することができる。

【0106】

なお、キャプシドタンパク質の重量を定量する以前に、ウイルスキャプシド含有液に含まれるキャプシドタンパク質のうち、粒子構造を形成しないものをあらかじめ除去しておくことが好ましい。粒子構造を形成しないキャプシドタンパク質はウイルスキャプシド粒子と比較して粒径が小さいため、ウイルスキャプシド粒子を維持し、キャプシドタンパク質を排除する分離方法によって除去することができる。この方法としては透析、脱塩、濾過などの方法が例示され、好ましくは透析である。より好ましくはＦｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２，ＣＥ，１ｍＬ，１０００ＫＤ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ社）による透析である。

【0107】

｛全ウイルスキャプシド粒子数（個）／感染価（ＴＣＩＤ₅₀あるいはＰｆｕ）｝で与えられる比率Ｔを算出するには、１ｍＬ等の単位体積あたりの「全ウイルスキャプシド粒子数」の実数値を、上記で選択した１ｍＬ等の単位体積あたりの「感染価」の実数値で除すればよい。

【0108】

次に、精製される前の生物物質含有溶液中のウイルスの感染価及び精製された生物物質含有溶液中のウイルスの感染価を定量する。このとき、ウイルス感染価を定量する方法としては、比率Ｔを算出するために使用する方法と同一の方法を選択することができる。

【0109】

さらに、精製される前の生物物質含有溶液中のウイルスの感染価及び精製された生物物質含有溶液中のウイルスの感染価に比率Ｔを掛けることで、精製される前の生物物質含有溶液中のウイルス感染価及び精製された生物物質含有溶液中のウイルス感染価のそれぞれを、全ウイルスキャプシド粒子数に変換することができる。

【実施例】

【0110】

以下実施例及び比較例を示して、本発明をより詳細に説明する。なお、以下に示す実施例は代表例であり、本発明が以下に示す実施例に限定されるものではない。

【0111】

１．濃縮ウイルス液の製造（１）
マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）の宿主細胞としてシアミンウイルス４０形質転換ヒト繊維芽細胞を用い、５％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ₂環境下にて、７５ｃｍ²底面積、容量１５ｍＬの組織培養用フラスコ（以下、単に「フラスコ」と呼ぶ。）を用いて継代培養した。フラスコからシアミンウイルス４０形質転換ヒト繊維芽細胞をはがして、新しいフラスコに１．５×１０＾６ｃｅｌｌｓ／１５ｍＬ／ｆｌａｓｋの密度で２．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に植え付けて、細胞にＭＶＭをＭＯＩ＝０．０１で感染させた。４日後に血清を含まない培地に培地交換し、さらに３日間細胞を培養した。感染から３日後にＭＶＭを含む培養上清を回収した。３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後に上清画分を回収し、この上清を０．４５μｍフィルター（ナルゲン社製）で濾過することによりウイルス培養液を得た。この作業をフラスコ７２個分実施し、合計７２０ｍＬのウイルス培養液を得た。

【0112】

このウイルス培養液をＴｙｐｅ４５ Ｔｉローターをセットした超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）で２９４００ｒｐｍ、２時間超遠心し、マウス微小ウイルスを沈殿させた。上清を除去した後、マウス微小ウイルスを含むペレットに３０ｍＬのＴＥ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０ ／ １ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）を添加して再懸濁し、濃縮されたＭＶＭを含むＴＥ緩衝液３０ｍＬを得た。この操作をもう一度繰り返し行い、濃縮されたＭＶＭを含むＴＥ緩衝液合計６０ｍLを得た。

【0113】

次に、濃縮されたＭＶＭを含むＴＥ緩衝液にそれぞれ終濃度１０ｗ／ｖ％、及び終濃度５００ｍｍｏｌ／Ｌ となるようＰＥＧ６０００及びＮａＣｌを加えて懸濁し、４℃で一晩静置した。この溶液を、ＳＷ２８ローターをセットした超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）で７８００ｒｐｍ、３０分間遠心し、マウス微小ウイルスを沈殿させた。上清を除去した後、マウス微小ウイルスを含むペレットに１．２ｍＬのＰＢＳ＋ＫＭ（１ｘＰＢＳ ／ ２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ ／ １ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ₂）を添加して再懸濁し、濃縮されたＭＶＭを含む溶液（以下、「ＭＶＭ－ＰＥＧ」と呼ぶ）を得た。

【0114】

２．ＦＣウイルスキャプシド含有液の製造
ＭＶＭ－ＰＥＧをイオジキサノール密度勾配超遠心によって精製した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社ＵＣチューブ（１３．２ｍＬ，３４４０５９）に底面から５５％ ２ｍＬ、４５％ ２ｍＬ、４０％ ２ｍＬ、３５％ ２ｍＬ、２５％ ２ｍＬ、１５％ １ｍＬの順にイオジキサノール／ＰＢＳ＋ＫＭを積層し、最上部に１ｍＬのＭＶＭ－ＰＥＧを積層した。このサンプルを、ＳＷ４１ローターをセットした超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）で３５０００ｒｐｍ、１８℃で１８時間超遠心した。その後に、チューブ上部から１ｍＬずつ１２個の画分を回収した。回収した全１２画分の密度、ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ、ＭＶＭ核酸コピー数、及び鶏赤血球凝集反応（ＨＡ）活性を測定した。ＭＶＭ核酸コピー数の測定では、ヌクレアーゼ処理によりサンプルに含まれる遊離核酸を除去したのち、キャプシドを破壊して得られたＭＶＭ核酸の分子数を定量リアルタイムＰＣＲ法によって測定した。ウイルス核酸の分子数は濃度既知核酸をスタンダードとして定量した。ＭＶＭスタンダードには、ＡＴＣＣ社ＶＲ１３４６株の反復配列を除く４７７５塩基をｐＴ７Ｂｌｕｅ－２ Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製，品番６９０８０）にクローニングした後に、プラスミドを制限酵素ＳａｌＩ－ＨＦ及びＥｃｏＮＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ社製、品番Ｒ３１３８Ｓ及びＲ０５２１Ｓ）によって切断した直鎖２本鎖ＤＮＡを使用した。鶏赤血球凝集反応活性とは、赤血球凝集素を持つ検体を検出する方法である。ウイルス液を２倍段階希釈して、ＰＢＳで０．１３％に希釈したニワトリ保存血（日本バイオテスト）に接種し、２５℃で２時間静置した。赤血球凝集が陽性となる限界希釈倍率を判定することで、サンプルに存在する赤血球凝集素、すなわちウイルスキャプシドの粒子数を測定した。

【0115】

ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ、ＭＶＭ核酸コピー数、及びＨＡ活性すべての指標でピークとなったフラクション１０をＦＣウイルスキャプシド含有液として回収し、ＨＡ活性のみが現れたフラクション５及び６を中空ウイルス粒子含有液として回収した。

【0116】

続いて、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ ４０Ｋ ＭＷＣＯ １０ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してフラクション５及び６又は１０の溶媒をそれぞれイオジキサノール／ＰＢＳ＋ＫＭからＰＢＳ＋ＫＭへ交換し、ＭＶＭ ＥＣウイルスキャプシド含有液（ＭＶＭ ＥＣ）４．６ｍＬ及びＭＶＭ ＦＣウイルスキャプシド含有液（ＭＶＭ ＦＣ）２．１ｍＬを取得した。

【0117】

前記ＭＶＭ ＦＣ及びＭＶＭ ＥＣについて、それぞれの１ｍＬあたりのウイルス核酸分子数の対数値（Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］）、及び鶏赤血球凝集反応が陽性となった限界希釈倍率を表１に示す。また、低温電子顕微鏡観察の結果、ＭＶＭ ＦＣに含まれる中空ウイルス粒子の比率は１．０％未満、ＭＶＭ ＥＣに含まれる核酸を有するウイルスの比率は０．５％未満であった。

【表1】

【0118】

３．中空ウイルス粒子を含むウイルスキャプシド含有液の作成
前記ＭＶＭ ＦＣ及びＭＶＭ ＥＣを混合することで、任意の比率で中空ウイルス粒子を含むウイルスキャプシド含有液（「ＦＥ混合液」と呼ぶ）を作製した。ＭＶＭ ＦＣとＭＶＭ ＥＣの混合比率は、ＨＡ陽性の限界希釈倍率を基準に計算した、それぞれのウイルスキャプシド含有液に含まれる全ウイルスキャプシドの濃度をもとに決定した。例えば、ＭＶＭ ＦＣは中空粒子を含まないウイルスキャプシド含有液であるから、これに含まれる全ウイルス粒子の濃度はLog₁₀[Copies/mL]と等しい。このとき、ＭＶＭ ＦＣに含まれる全ウイルス粒子の濃度は、１２．２７Log₁₀[Particles/mL]となる。ここで、ＨＡ陽性の限界希釈倍率はウイルスキャプシド含有液に含まれる全ウイルスキャプシドの濃度に比例するため、ＭＶＭ ＥＣに含まれる全ウイルスキャプシド濃度は、ＭＶＭ ＦＣとＭＶＭ ＥＣのＨＡ陽性の限界希釈倍率の比較から、１２．２７Log₁₀[Particles/mL]と計算することができる。

【0119】

ＦＥ混合液と、その作成のために混合したＭＶＭ ＦＣ及びＭＶＭ ＥＣの比率、及び１ｍＬあたりのウイルス核酸分子数の対数値（Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］）を表２に示す。

【表2】

【0120】

４．濃縮ウイルス液の製造（２）
１．濃縮ウイルス液の製造（１）と同様にして、ウイルス培養液を得た。このウイルス培養液をＴｙｐｅ４５ Ｔｉローターをセットした超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）で２９４００ｒｐｍ、２時間超遠心し、マウス微小ウイルスを沈殿させた。上清を除去した後、マウス微小ウイルスを含むペレットに６ｍＬのＴＮＥ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０ ／ １００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ／ １ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）を添加して再懸濁し、濃縮されたＭＶＭを含むＴＮＥ緩衝液（以下、「濃縮ＭＶＭ培養液（１）」と呼ぶ）６ｍＬを得た。この操作を２回繰り返して行い、さらに２つの濃縮ＭＶＭ培養液（濃縮ＭＶＭ培養液（２）、濃縮ＭＶＭ培養液（３））を得た。

【0121】

５．濃縮ウイルス培養液の比率Ｔの算出
濃縮ＭＶＭ培養液（濃縮ＭＶＭ培養液（１））５μＬと、３．５ｎｇ／μＬリコンビナントＭＶＭ－ＶＰ２スタンダード（Ａｌｐｈａｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製 ＭＶＭＶＰ２１－Ｃ；Ｎ末端にＨｉｓ６タグを付加したＭＶＭ―ＶＰ２）の希釈系列５μＬと、に４Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ サンプルバッファー（ＢｉｏＲａｄ）を１．７μＬ加え、９５℃で５分間インキュベートした。これらのサンプルを、１０％ミニプロティアンＴＧＸプレキャストゲル（ＢｉｏＲａｄ）を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。分離後の１０％ミニプロティアンＴＧＸプレキャストゲルを回収し、トランスブロットＴｕｒｂｏブロッティングシステム（ＢｉｏＲａｄ）及びトランスブロットＴｕｒｂｏＲＴＡニトロセルローストランスファーキット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して２５Ｖ定電圧、３０分の条件でタンパク質をメンブレンに転写した。転写終了後メンブレンを回収し、５％スキムミルク／ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ，ＴＡＫＡＲＡ）に浸漬して室温で１時間振盪した。このメンブレンをＰＢＳＴで３回洗浄し、５０００倍希釈抗ＭＶＭ－ＶＰ２抗体（Ａｌｐｈａｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製 ＭＶＭＶＰ２１－Ｓ）／ＰＢＳＴに浸漬して４℃で一晩反応させた後、メンブレンをＰＢＳＴで３回洗浄し、さらに５０００倍希釈ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）／ＰＢＳＴに浸漬して室温で１時間反応した。メンブレンをＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＷＥＳＴ Ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳＰｕｌｓ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、図１に示すように、ＭＶＭ－ＶＰ２及びＶＰ３のシグナルを検出した。

【0122】

濃縮ＭＶＭ培養液及びＭＶＭ－ＶＰ２スタンダードサンプルから検出されたＭＶＭ－ＶＰ２及びＭＶＭ－ＶＰ３シグナルは、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して定量した。まず、濃度既知のリコンビナントＶＰ２スタンダードのシグナルを定量して、シグナル値に対するＶＰ２量（ｎｇ）の検量線を作成した。次に、濃縮ＭＶＭ培養液のシグナルを定量し、リコンビナントＶＰ２スタンダードのシグナルから作成した検量線に照らして濃縮ＭＶＭ培養液に含まれるＭＶＭ－ＶＰ２及びＶＰ３の質量を求めた。ＭＶＭ１粒子あたり６４．３ｋＤａのＭＶＭ－ＶＰ２及びＶＰ３が合計で５０分子含まれるとして、濃縮ＭＶＭ培養液中のＭＶＭ－ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質量の合計から、濃縮ＭＶＭ培養液中のＭＶＭ濃度（濃縮ＭＶＭ培養液単位体積あたりのＭＶＭ粒子数の対数値：Ｌｏｇ₁₀［Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ］）を算出した。算出した結果を表３に示す。

【0123】

さらに別の２つの濃縮ＭＶＭ培養液（濃縮ＭＶＭ培養液（２）、濃縮ＭＶＭ培養液（３））についても、上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥからＭＶＭ濃度を算出した。算出した結果を表３に示す。

【表3】

【0124】

また、濃縮ＭＶＭ培養液の１ｍＬあたりの感染価（Ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］）を別途測定し、濃縮ＭＶＭ培養液の感染価に対するウイルス粒子数の比率Ｔの常用対数、すなわちＬｏｇ₁₀［（Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）／（ＴＣＩＤ₅₀）］を算出した。算出した結果を表４に示す。

【表4】

【0125】

［実施例１］
ＦＥ混合液（１）１ｍＬを「２．ＦＣウイルスキャプシド含有液の製造」に記載の方法で超遠心精製し、中空ウイルスを含まないウイルスキャプシド含有液（以下、「ＦＥ混合液（１）－Ｅ」と呼ぶ）を得た。同様にして、ＦＥ混合液（２）１ｍＬ及びＦＥ混合液（３）１ｍＬから、中空ウイルスを含まないウイルスキャプシド含有液（以下、「ＦＥ混合液（２）－Ｅ」、及び「ＦＥ混合液（３）－Ｅ」と呼ぶ）を得た。ＦＥ混合液（１）－Ｅ、ＦＥ混合液（２）－Ｅに含まれる中空ウイルス粒子の比率は、低温電子顕微鏡観察の結果、どちらも１．０％未満であった。

【0126】

ＦＥ混合液（１）－Ｅを終濃度１０ｍｇ／ｍＬのヒトグロブリン及び０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む生物物質含有溶液（ｐＨ ４．５）に添加し（合計１００ｍＬ）、この溶液をＰｌａｎｏｖａ２０Ｎ（旭化成メディカル社製、膜面積０．００１ｍ２）で濾過した。ＦＥ混合液（１）－Ｅを添加した生物物質含有溶液１ｍＬあたりのＭＶＭ核酸コピー数は８．８７Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］であった。濾過条件は、７８．４ｋＰａ、２５℃とした。

【0127】

Ｌｏｇ１０［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍ２］で与えられる膜面積あたりのウイルス負荷量が約０．２間隔となるようにフラクションサイズを決定し、ウイルス除去膜通過後の濾液を計１２フラクション回収した。ウイルス除去膜通過前の液、及びフラクション回収したウイルス除去膜濾過液から各２３０μＬを分取し、２５μＬの１０ｘ反応バッファー（５００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ₂、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ₂）及び終濃度４０Ｕｎｉｔ／μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を加えて室温で１時間静置した。この反応後に終濃度１０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを加えて室温で１０分静置した。このサンプルからＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して核酸を抽出した。抽出した核酸の濃度を定量リアルタイムＰＣＲで測定し、ウイルス除去膜通過前の液及びウイルス除去膜濾過液フラクション中のウイルス核酸、すなわちウイルス粒子数を定量した。

【0128】

濾過液フラクションの中で初めてウイルスが検出され、且つ以降継続的にウイルス核酸が検出されるようになるフラクションを選択した。ウイルス除去膜通過前液のウイルス核酸濃度に該フラクションを回収するまでの総濾過体積をかけて、ウイルス漏れが起こらない限界ウイルス負荷量を計算した。この限界ウイルス負荷量を、ウイルス除去膜によるウイルス粒子保持容量（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｃａｐａｃｉｔｙ）とした。ウイルス粒子保持容量は、ウイルス除去膜が除去可能なウイルス粒子数の限界値を示すため、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能のひとつとして利用することができる。

【0129】

【表5】

【0130】

濾過結果を表５に示す。表５中、ウイルス除去膜通過前液の１ｍＬあたりのウイルス核酸コピー数（８．８７＝Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］の真数）に、総濾過量［Ｂ］列をかけ、さらに膜面積０．００１ｍ²で除することで、フラクションを分取した際の単位面積当たりの総ウイルス負荷量［Ｃ］列を計算した。これらのフラクションに対して定量リアルタイムＰＣＲによるウイルス検出を行った（［Ｄ］列）。濾過液フラクションの中で初めて、且つ以降継続的にウイルス核酸が検出されるようになる直前のフラクション５を選択し、フラクション５を採取した際のＬｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍ²］で与えられる単位膜面積当たりの総ウイルス負荷量１２．９４をウイルス除去膜によるウイルス粒子保持容量とした。

【0131】

さらに、ＦＥ混合液（２）－Ｅ及びＦＥ混合液（３）－Ｅについても、ＦＥ混合液（１）－Ｅと同様の濾過を行い、ウイルス除去膜のウイルス粒子保持容量を求めた。ＦＥ混合液（２）－Ｅを添加した生物物質含有溶液１ｍＬあたりのＭＶＭ核酸コピー数は８．６８Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］、ＦＥ混合液（３）－Ｅを添加した生物物質含有溶液１ｍＬあたりのＭＶＭ核酸コピー数は７．９１Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］であった。濾過液フラクションの中で初めて、且つ以降継続的にウイルス核酸が検出されるようになる直前のフラクションは、ＦＥ混合液（２）－Ｅの場合はフラクション６、ＦＥ混合液（３）－Ｅの場合はフラクション１０であった。また、当該フラクションまでの総濾過量は、ＦＥ混合液（２）－Ｅの場合は１７．３６ｍＬ、ＦＥ混合液（３）－Ｅの場合は１０５．７３ｍＬであった。それぞれの混合液を用いた場合のウイルス除去膜のウイルス粒子保持容量の結果を表６に示す。

【表6】

【0132】

以上より、中空粒子を除去し、かつ定量ＰＣＲ測定を採用することにより、除去前の中空粒子の含有率が異なるウイルスキャプシド含有液（ＦＥ混合液（１）～（３））であっても、ウイルス除去膜のウイルス粒子保持容量を正確に測定できることが分かる。ここで、濾過液フラクションの中で初めて、且つ以降継続的にウイルス核酸が検出されるようになるフラクションと、その直前のフラクションまでの単位膜面積当たりの総ウイルス負荷量（Ｌｏｇ［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍ²］）は、
ＦＥ混合液（１）－Ｅではそれぞれ１２．９４、１３．１１、
ＦＥ混合液（２）－Ｅではそれぞれ１２．９２、１３．１０、
ＦＥ混合液（３）－Ｅではそれぞれ１２．９４、１３．１３であり、
Ｌｏｇ［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍ²］で与えられる単位膜面積当たりの総ウイルス負荷量は、１フラクションあたり０．１７から０．１９ずつ増加している。このため、濾過液フラクションの中で初めて、且つ以降継続的にウイルス核酸が検出されるようになる直前のフラクションを分取してから０．１９の範囲内では、どの総ウイルス負荷量においてウイルス漏れが開始したかを区別できない。つまり、本実施例においては、Ｌｏｇ［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍ²］で与えられるウイルス粒子保持容量として０．１９未満の差は許容される。

【0133】

これに対し、本実施例におけるＬｏｇ［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍ²］で与えられるＭＶＭ ＦＣウイルスキャプシド含有液のウイルス粒子保持容量の最大値は１２．９４、最小値は１２．９２であるから、その差は０．０２である。これは０．１９よりも小さいため、本実施例におけるＦＥ混合液（１）－Ｅ、ＦＥ混合液（２）－Ｅ、及びＦＥ混合液（３）－Ｅのウイルス粒子保持容量の差は、誤差として許容される。すなわち、いかなる濃度で中空粒子を含むウイルスキャプシド含有液であっても、本方法により、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を正確に評価できることが分かる。

【0134】

［実施例２］
ＦＣウイルス及び中空ウイルス粒子を含む濃縮ＭＶＭ培養液（１）を、Ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］で与えられる１ｍＬあたりの感染価が４．２０８となるように終濃度１０ｍｇ／ｍＬのヒトグロブリン及び０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む生物物質含有溶液（ｐＨ４．５）に添加し（合計２５０ｍＬ）、ウイルス除去膜（特許第６２２０４４７号に記載の方法に準じて製造したセルロース膜。平均透水孔径２０ｎｍ、膜面積０．００１ｍ²）でウイルスキャプシド含有液を添加された生物物質含有溶液を濾過した。濾過条件は、７８．４ｋＰａ、２５℃とした。

【0135】

Ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍ²］で与えられる膜面積あたりのウイルス負荷量が０．２間隔となるようにフラクションサイズを決定し、ウイルス除去膜通過後の濾液を計１２フラクション回収した。ウイルス除去膜通過前の液、及びフラクション回収したウイルス除去膜濾過液の１ｍＬあたりの感染価（Ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］）を測定した。

【0136】

濾過液フラクションの中で初めて、且つ以降継続的にウイルス感染性が検出されるようになる直前のフラクションを選択した。ウイルス除去膜通過前液の１ｍＬあたりのＭＶＭ感染価に該フラクションを回収するまでの総濾過体積をかけて、ウイルス漏れが起こらない限界ウイルス負荷量を計算した。この限界ウイルス負荷量を、ウイルス除去膜によるウイルス感染価保持容量（Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｃａｐａｃｉｔｙ）とした。

【0137】

濃縮ＭＶＭ培養液（１）の濾過結果を表７に示す。表７中、ウイルス除去膜通過前液の１ｍＬあたりのウイルス感染価（４．２０８＝Ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］の真数）に、総濾過量［Ｂ］列をかけ、さらに、膜面積０．００１ｍ²で除することで、該フラクションを分取した際の単位面積当たりの総ウイルス負荷量［Ｄ］列を計算した。これらのフラクションに対してＴＣＩＤ₅₀法によるウイルス検出を行った（［Ｅ］列）。濾過液フラクションの中で初めて、且つ以降継続的にウイルス感染性が検出されるようになる直前のフラクション６を選択し、フラクション６を採取した際のＬｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍ²］で与えられる単位膜面積当たりの総ウイルス負荷量８．６１をウイルス除去膜によるウイルス感染価保持容量とした。

【表7】

【0138】

次に、ウイルス除去膜によるウイルス感染価保持容量をウイルス粒子保持容量に変換した。ウイルス粒子保持容量とはウイルス除去膜が除去可能なウイルス「個数」の限界値を示すものであるから、Ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍ²］で与えられるウイルス感染価保持容量に、感染価に対する全ウイルスキャプシド粒子数の比率Ｔの対数値を加えることで、ウイルス感染価保持容量をウイルス粒子保持容量に変換することができる。Ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍ²］で与えられるウイルス感染価保持容量８．６１に、先に求めたＭＶＭ濃縮培養液の感染価に対する全ウイルスキャプシド粒子数の比率Ｔの対数値である２．５５を加えて得られる１１．１６を、Ｌｏｇ₁₀［Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍ²］で与えられるウイルス粒子保持容量とした。

【0139】

さらに、表４に示した濃縮ＭＶＭ培養液（２）及び濃縮ＭＶＭ培養液（３）についても、濃縮ＭＶＭ培養液（１）と同様の濾過を行い、ウイルス除去膜のウイルス粒子保持容量を求めた。濾過液フラクションの中で初めて、且つ以降継続的にウイルス感染性が検出されるようになる直前のフラクションは、濃縮ＭＶＭ培養液（２）の場合はフラクション８、濃縮ＭＶＭ培養液（３）の場合はフラクション８であった。また、当該フラクションまでの総濾過量は、濃縮ＭＶＭ培養液（２）の場合は３８．９９ｍＬ、濃縮ＭＶＭ培養液（３）の場合は３９．５５ｍＬであった。それぞれの液を用いた場合のウイルス除去膜のウイルス粒子保持容量の結果を表８に示す。

【表8】

【0140】

本実施例では、ＴＣＩＤ₅₀法によってウイルス感染性の検出を行い、その後比率Ｔを使用してウイルス感染価保持容量をウイルス粒子保持容量へ変換した。この場合、濃縮ＭＶＭ培養液（１）～（３）におけるウイルス粒子保持容量の誤差はＴＣＩＤ₅₀法の誤差によってもたらされる。ＴＣＩＤ₅₀法では一般的にＬｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］で与えられる測定値に±０．２５の実験誤差が生じる。したがって、異なる２つの測定値を比較する場合、０．５以内の差は実験誤差として許容される。表８に示す通り、本実施例におけるウイルス粒子保持容量の最大値は１１．２７、最小値は１０．８６であり、その差は０．４１であった。この差は誤差として許容される０．５よりも小さいため、本実施例におけるＭＶＭ濃縮培養液（１）～（３）のウイルス粒子保持容量は、誤差なく正確に測定できていると判断できる。

【0141】

以上より、本方法によれば、作成ロット毎に感染価に対する全ウイルスキャプシド粒子数が様々に異なるウイルスキャプシド含有液を用いた濾過でも、ウイルス除去膜のウイルス粒子保持容量を、粒子数に基づく値として正確に測定できることが分かる。

【0142】

また、以上より、ヒトグロブリン含有溶液にウイルスを添加し、感染価を検出できるＴＣＩＤ₅₀法を採用してウイルス除去膜のウイルスクリアランス評価を行った場合であっても、定量した感染価を、使用したウイルスキャプシド含有液の比率Ｔにてウイルス濃度に変換することで、作成ロットが異なるウイルスキャプシド含有液（ＭＶＭ（１）～（３））であっても、ウイルス除去膜のウイルス粒子保持容量を誤差なく正確に測定できることが分かる。すなわち、本方法により、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を正確に評価することができることが分かる。

【0143】

［比較例１］
表２に記載のＦＥ混合液（１）を、終濃度１０ｍｇ／ｍＬのヒトグロブリン及び０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む生物物質含有溶液（ｐＨ ４．５）に添加し（合計２００ｍＬ）、この溶液をＰｌａｎｏｖａ２０Ｎ（旭化成メディカル社製、膜面積０．００１ｍ²）で濾過した。ＦＥ混合液（１）を添加した生物物質含有溶液１ｍＬあたりのＭＶＭ核酸コピー数は７．７６Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］であった。濾過条件は、７８．４ｋＰａ、２５℃とした。ＦＥ混合液（１）を用いた以外は実施例１に記載の方法と同様の方法でフラクション採取及びウイルス核酸の定量を実施した。濾過の結果を表９に示す。

【表9】

【0144】

この結果から、ウイルス粒子保持容量は１２．５８Log[Copies/m²]であった。この値は、ＦＥ混合液（１）－Ｅを用いて測定したＰｌａｎｏｖａ２０Ｎのウイルス粒子保持容量（１２．９４）と比較して０．３６小さい。また、中空ウイルス粒子を含まないウイルスキャプシド含有液を用いて測定したＰｌａｎｏｖａ２０Ｎのウイルス粒子保持容量の平均値（１２．９３）と比較して０．３５小さい。この結果は、中空粒子を含むウイルスキャプシド含有液を用いた性能評価では、ウイルスフィルターのウイルス除去性能が過小評価されることを示している。

【0145】

［比較例２］
表２に記載のＦＥ混合液（２）を、終濃度１０ｍｇ／ｍＬのヒトグロブリン及び０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む生物物質含有溶液（ｐＨ ４．５）に添加し（合計１００ｍＬ）、この溶液をＰｌａｎｏｖａ２０Ｎ（旭化成メディカル社製、膜面積０．００１ｍ²）で濾過した。ＦＥ混合液（２）を添加した生物物質含有溶液１ｍＬあたりのＭＶＭ核酸コピー数は７．８５Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］であった。濾過条件は、７８．４ｋＰａ、２５℃とした。ＦＥ混合液（２）を用いた以外は実施例１に記載の方法と同様の方法でフラクション採取及びウイルス核酸の定量を実施した。濾過の結果を表１０に示す。

【表10】

【0146】

この結果から、ウイルス粒子保持容量は１２．４６Log[Copies/m²]であった。この値は、ＦＥ混合液（２）－Ｅを用いて測定したＰｌａｎｏｖａ２０Ｎのウイルス粒子保持容量（１２．９２）と比較して０．４６小さい。また、中空ウイルス粒子を含まないウイルスキャプシド含有液を用いて測定したＰｌａｎｏｖａ２０Ｎのウイルス粒子保持容量の平均値（１２．９３）と比較して０．４７小さい。この結果は、中空粒子を含むウイルスキャプシド含有液を用いた性能評価では、ウイルスフィルターのウイルス除去性能が過小評価されることを示している。

【0147】

［比較例３］
表２に記載のＦＥ混合液（３）を、終濃度１０ｍｇ／ｍＬのヒトグロブリン及び０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む生物物質含有溶液（ｐＨ ４．５）に添加し（合計１００ｍＬ）、この溶液をＰｌａｎｏｖａ２０Ｎ（旭化成メディカル社製、膜面積０．００１ｍ²）で濾過した。ＦＥ混合液（２）を添加した生物物質含有溶液１ｍＬあたりのＭＶＭ核酸コピー数は７．８９Ｌｏｇ₁₀［Ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ］であった。濾過条件は、７８．４ｋＰａ、２５℃とした。ＦＥ混合液（３）を用いた以外は実施例１に記載の方法と同様の方法でフラクション採取及びウイルス核酸の定量を実施した。濾過の結果を表１１に示す。

【表11】

【0148】

この結果から、ウイルス粒子保持容量は１１．７１Log[Copies/m²]であった。この値は、ＦＥ混合液（３）－Ｅを用いて測定したＰｌａｎｏｖａ２０Ｎのウイルス粒子保持容量（１２．９４）と比較して１．２３小さい。中空ウイルス粒子を含まないウイルスキャプシド含有液を用いて測定したＰｌａｎｏｖａ２０Ｎのウイルス粒子保持容量の平均値（１２．９３）と比較して１．２２小さい。この結果は、中空粒子を含むウイルスキャプシド含有液を用いた性能評価では、ウイルスフィルターのウイルス除去性能が過小評価されることを示している。

【図1】