特許 7404320 線維症の治療において使用するためのエンドスタチン断片およびバリアント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-15

(45)【発行日】2023-12-25

(54)【発明の名称】線維症の治療において使用するためのエンドスタチン断片およびバリアント

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20231218BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20231218BHJP

   A61K 38/17 20060101ALN20231218BHJP

   A61P 11/00 20060101ALN20231218BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K14/47 ZNA

C12N15/62 Z

A61K38/17

A61P11/00

【請求項の数】 4

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021158128

(22)【出願日】2021-09-28

(62)【分割の表示】P 2018515195の分割

【原出願日】2016-06-03

(65)【公開番号】P2022002527

(43)【公開日】2022-01-11

【審査請求日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】62/171,889

(32)【優先日】2015-06-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/257,607

(32)【優先日】2015-11-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】517423774

【氏名又は名称】アイバイオ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＢＩＯ， ＩＮＣ．

(73)【特許権者】

【識別番号】517423785

【氏名又は名称】ノビシ・バイオテック・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＩＣＩ ＢＩＯＴＥＣＨ ＬＬＣ

(73)【特許権者】

【識別番号】517423796

【氏名又は名称】エム・ユー・エス・シィ・ファウンデーション・フォー・リサーチ・ディベロップメント

【氏名又は名称原語表記】ＭＵＳＣ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＦＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フェガリ－ボストウィック，キャロル

(72)【発明者】

【氏名】ライアン，テレンス・イー

(72)【発明者】

【氏名】パジェット，ハル・エス

(72)【発明者】

【氏名】マギー，マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ホルツ，アール・バリー

【審査官】小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】特表２００２－５１７１８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１１／０５０３１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特許第６９５２６８５（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】ZHOU, H. et al.，Contributions of disulfide bonds in a nested pattern to the structure, stability, and biological functions of endostatin，J. Biol. Chem.，2005年，Vol. 280(12)，pp. 11303-11312

【文献】山口由衣 ほか，線維化疾患におけるエンドスタチンの役割と機能，日本臨床免疫学会会誌，2013年，Vol. 36(6)，pp. 452-458

【文献】Yamaguchi Y. et al.，A Peptide Derived from Endostatin Ameliorates Organ Fibrosis，Sci Transl Med，2012年，Vol. 4:136ra71

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

Ａ６１Ｋ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｋ３８／００－３９／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

線維症の対象を治療するための医薬品を製造するための単離されたポリペプチドの使用であって、ここにおいて単離されたポリペプチドは、
ａ）配列番号１６を含み、
ｂ）それを必要とする対象に投与された場合に抗線維化活性を有する、
単離されたポリペプチドであって、単離されたポリペプチドが緩衝液中で可溶性であり、１．２ＭＤａの分子量を有する多量体を形成し、
ここにおいて線維症が肺線維症である、使用。

【請求項2】

単離されたポリペプチドが、分泌型配列、ペプチドタグ、ＫＤＥＬポリペプチド、配列番号１６のＣ末端にＡｌａ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ配列、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、または配列番号１７のアミノ酸２７～４３をさらに含む、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

コルチコステロイド、免疫抑制剤、アセチルシステイン、Ｄ－ペニシラミン、コルヒチン、レラキシン、ステロイド、シクロスポリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノレート、グリタゾン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、およびフルベストラントからなる群から選択される別の治療剤が、前記線維症の対象にさらに投与されるものである、請求項１に記載の使用。

【請求項4】

前記別の治療剤が経口投与または静脈内投与により投与されるものである、請求項３に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月５日出願の米国仮出願第６２／１７１，８８９号および２０１５年１１月１９日出願の米国仮出願第６２／２５７，６０７号の優先権の利益を主張するものである。

【0002】

技術分野
本文献は、線維症を治療するための材料および方法、特に、線維症を治療するための、エンドスタチンの断片およびバリアントを含有するポリペプチドの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

背景技術
エンドスタチンは、コラーゲン１８のＣ末端に対応する１８３アミノ酸のタンパク質分解切断断片であり、抗腫瘍活性を有し、毒性の副作用は伴わない（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ、８８：２７７－２８５（非特許文献１）；Ｋｉｓｋｅｒら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６１：７６６９－７６７４（非特許文献２）；Ｄｈａｎａｂａｌら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５９：１８９－１９７（非特許文献３）；Ｙｏｏｎら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５９：６２５１－６２５６（非特許文献４）；ＦｏｌｋｍａｎおよびＫａｌｌｕｒｉ、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第６版、１６１～１９４頁、Ｈａｍｉｌｔｏｎ：Ｂ．Ｃ．Ｄｅｃｋｅｒ Ｉｎｃ．（非特許文献５））。このタンパク質に関しては、内皮細胞の増殖、遊走、および管形成の阻害などの、いくつもの抗血管新生活性が報告されている。この活性は、エンドスタチンのＮ末端領域に局在している。エンドスタチンはまた、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）によって誘導される血管透過性を抑制する（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００３）Ｆａｓｅｂ
Ｊ、１７：８９６－８９８（非特許文献６））。エンドスタチンは、α５β１インテグリンとの結合を介して接着斑キナーゼのリン酸化を阻害することによって内皮細胞の遊走を阻害する（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６２：５５８０－５５８９（非特許文献７））。細胞表面グリピカンが低親和性エンドスタチン受容体であることも示されている（Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉら（２００１）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、７：８１１－８２２（非特許文献８））。エンドスタチンは、ｃ－ｍｙｃ活性の下方制御（ＳｈｉｃｈｉｒｉおよびＨｉｒａｔａ（２００１）Ｆａｓｅｂ Ｊ、１５：１０４４－１０５３（非特許文献９））、サイクリン－Ｄ１活性の下方制御（Ｈａｎａｉら（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７．１６４６４－１６４６９（非特許文献１０））およびＲｈｏＡ活性の下方制御（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８：３７８９５－３７９０１（非特許文献１１））、ＶＥＧＦシグナル伝達の遮断（Ｈａｊｉｔｏｕら（２００２）Ｆａｓｅｂ Ｊ、１６：１８０２－１８０４（非特許文献１２）；Ｋｉｍら（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７：２７８７２－２７８７９（非特許文献１３））、ならびにｗｎｔ－シグナル伝達経路の阻害（Ｈａｎａｉら（２００２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１５８：５２９－５３９（非特許文献１４））などの、いくつかのシグナル伝達経路に関係づけられている。さらに、エンドスタチンは、メタロプロテイナーゼに結合し、それを不活化すること（Ｋｉｍら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ、６０：５４１０－５４１３（非特許文献１５）；Ｎｙｂｅｒｇら（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８：２２４０４－２２４１１（非特許文献１６）；Ｌｅｅら（２００２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５１９：１４７－１５２（非特許文献１７））、および血管新生を抑制する一連の遺伝子を調節すること（Ａｂｄｏｌｌａｈｉら（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、１３：６４９－６６３（非特許文献１８））が示されている。

【0004】

マウスエンドスタチンおよびヒトエンドスタチンの両方の結晶構造が解明されており（Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒら（１９９８）Ｅｍｂｏ Ｊ、１７：１６５６－１６６４（非特許文献１９）；Ｄｉｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５：１０４４３－１０４４８（非特許文献２０））、結晶化に必要な高濃度において非共有結合により保持された二量体が示されている（Ｄｉｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５：１０４４３－１０４４８（非特許文献２０））。２つのジスルフィド結合が存在することにより、高度にフォールディングされた構造がもたらされる。エンドスタチンは、分子のＮ末端の３つのヒスチジン（ヒスチジン１、３、および１１）ならびにアスパラギン酸７６を介して、単量体当たり１つの亜鉛原子に結合する。エンドスタチンのヘパリン結合性は、分子の三次元球状表面にわたって密集した連続していないアルギニンによって媒介される（Ｓａｓａｋｉら（１９９９）Ｅｍｂｏ
Ｊ、１８：６２４０－６２４８（非特許文献２１））。

【0005】

臓器線維芽細胞によるフィブロネクチン（ＦＮ）およびＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌα１）などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の過剰な沈着は、線維症と定義される。臓器線維症は、末期臓器不全症をもたらす多くの疾患の最終的な共通経路である。しかし、臓器線維症に対する有効な療法は依然として得られていない（例えば、Ｂｊｏｒａｋｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ ２０００；１５７：１９９－２０３（非特許文献２２）を参照されたい）。急性炎症および慢性炎症、血管新生、常在細胞の活性化、およびＥＣＭリモデリングを含めた制御できない創傷治癒応答が線維症の病理発生に関与すると考えられている（Ｗｙｎｎ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７；１１７：５２４－２９（非特許文献２３）；Ｋａｌｌｕｒｉら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２０００；９：４１３－８（非特許文献２４）。ＴＧＦ－βは、線維化臓器において増加するプロトタイプ線維化サイトカインであり、ＥＣＭ分子の合成を刺激すること、線維芽細胞を活性化してα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）を発現する筋線維芽細胞にすること、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を下方制御することによって線維症の発生に寄与する（例えば、Ｂｒａｎｔｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ １９９９；１：１３４９－６５（非特許文献２５）を参照されたい）。期待が大きいにもかかわらず、初期全身性硬化症（ＳＳｃ）の患者におけるモノクローナル抗ＴＧＦ－β抗体の臨床試験ではいかなる有効性も示すことができなかった（Ｖａｒｇａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２００９；５：２００－６（非特許文献２６））。したがって、線維症の他の治療が依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ、８８：２７７－２８５

【文献】Ｋｉｓｋｅｒら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６１：７６６９－７６７４

【文献】Ｄｈａｎａｂａｌら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５９：１８９－１９７

【文献】Ｙｏｏｎら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５９：６２５１－６２５６

【文献】ＦｏｌｋｍａｎおよびＫａｌｌｕｒｉ、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第６版、１６１～１９４頁、Ｈａｍｉｌｔｏｎ：Ｂ．Ｃ．Ｄｅｃｋｅｒ Ｉｎｃ．

【文献】Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００３）Ｆａｓｅｂ Ｊ、１７：８９６－８９８

【文献】Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６２：５５８０－５５８９

【文献】Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉら（２００１）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、７：８１１－８２２

【文献】ＳｈｉｃｈｉｒｉおよびＨｉｒａｔａ（２００１）Ｆａｓｅｂ Ｊ、１５：１０４４－１０５３

【文献】Ｈａｎａｉら（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７．１６４６４－１６４６９

【文献】Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８：３７８９５－３７９０１

【文献】Ｈａｊｉｔｏｕら（２００２）Ｆａｓｅｂ Ｊ、１６：１８０２－１８０４

【文献】Ｋｉｍら（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７：２７８７２－２７８７９

【文献】Ｈａｎａｉら（２００２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１５８：５２９－５３９

【文献】Ｋｉｍら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６０：５４１０－５４１３

【文献】Ｎｙｂｅｒｇら（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８：２２４０４－２２４１１

【文献】Ｌｅｅら（２００２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５１９：１４７－１５２

【文献】Ａｂｄｏｌｌａｈｉら（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、１３：６４９－６６３

【文献】Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒら（１９９８）Ｅｍｂｏ Ｊ、１７：１６５６－１６６４

【文献】Ｄｉｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５：１０４４３－１０４４８

【文献】Ｓａｓａｋｉら（１９９９）Ｅｍｂｏ Ｊ、１８：６２４０－６２４８

【文献】Ｂｊｏｒａｋｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ ２０００；１５７：１９９－２０３

【文献】Ｗｙｎｎ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７；１１７：５２４－２９

【文献】Ｋａｌｌｕｒｉら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２０００；９：４１３－８

【文献】Ｂｒａｎｔｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ １９９９；１：１３４９－６５

【文献】Ｖａｒｇａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２００９；５：２００－６

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

概要
本文献は、少なくとも一部において、抗線維症活性を有するＣ末端エンドスタチン断片およびそのバリアントの開発、ならびにそのような断片およびバリアントを植物において産生させるための方法、およびそれを必要とする対象において線維症を治療するための断片およびバリアントの使用の方法の開発に基づく。

【0008】

本文献はまた、少なくとも一部において、Ｉｇ－Ｆｃポリペプチドと連結したエンドスタチンのＥ３領域（例えば配列番号２および配列番号１３のアミノ酸１３３～１８０）を
含有する、エンドスタチンに基づくポリペプチドが、典型的なペプチド－Ｆｃ融合タンパク質とは異なり、高分子量（ＨＭＷ）多量体を形成し得るという発見にも基づく。ＨＭＷ形態は、精製（例えば、限外濾過または接線流濾過（ＴＦＦ）によるもの）に利点をもたらす可能性があり、線維症の治療にも使用することができる。

【0009】

一態様では、本文献は、配列番号１４を含み、それを必要とする対象に投与された場合に抗線維症活性を有する、単離されたポリペプチドを特徴とする。単離されたポリペプチドは、分泌型配列、ペプチドタグ（例えば、６Ｈｉｓタグ、ＫＤＥＬポリペプチドを含有するタグ、もしくはその両方）、配列番号１４のＣ末端におけるＡｌａ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ配列、および／または、ＩｇＧ Ｆｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインなどのＩｇＧ１ Ｆｃドメイン）、配列番号１７のアミノ酸２７～４３をさらに含み得る。ポリペプチドは、配列番号１６または配列番号１７を含み得る。ポリペプチドは、高分子量多量体であり得る。

【0010】

別の態様では、本文献は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１３３～１８０、ならびに分泌型配列、ペプチドタグ、ＫＤＥＬ配列、配列番号２のアミノ酸１３３～１８０のＣ末端におけるＡｌａ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ配列、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、および／または配列番号１７のアミノ酸２７～４３のうちの１つまたは複数を含み、（ｂ）それを必要とする対象に投与された場合に抗線維症活性を有する、単離されたポリペプチドを特徴とする。ポリペプチドは、配列番号１５を含み得る。

【0011】

別の態様では、本文献は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸１３３～１８０、ならびに分泌型配列、ペプチドタグ、ＫＤＥＬ配列、配列番号２のアミノ酸１３３～１８０のＣ末端におけるＡｌａ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ配列、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、および／または配列番号１７のアミノ酸２７～４３のうちの１つまたは複数を含み、（ｂ）それを必要とする対象に投与された場合に抗線維症活性を有する、単離されたポリペプチドを特徴とする。

【0012】

別の態様では、本文献は、異種プロモーターと作動可能に連結した、本明細書に開示されているポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。本文献はまた、単離されたポリヌクレオチドを含有する発現ベクターも特徴とする。発現ベクターは、ｌａｕｎｃｈベクター（例えば、ウイルスｌａｕｎｃｈベクター）であり得る。さらに、本文献は、発現ベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞を特徴とする。

【0013】

別の態様では、本文献は、配列番号１４を含み、それを必要とする対象に投与された場合に抗線維症活性を有する、高分子量多量体を特徴とする。

【0014】

さらに別の態様では、本文献は、（ａ）本明細書に記載のポリペプチドおよび／または多量体、ならびに（ｂ）医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を特徴とする。

【0015】

本文献はまた、本明細書に開示されている抗線維症活性を有するポリペプチドを作出するための方法も特徴とする。方法は、（ａ）植物に、請求項１、請求項１２、請求項１３、または請求項１５に記載の抗線維化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物ウイルスベクターを導入するステップ、および（ｂ）植物を、少なくとも一部の植物細胞においてポリヌクレオチドが発現されるのに十分な条件下でそれに十分な時間にわたって維持するステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、（ａ）植物に、（ｉ）第１の植物ウイルスに由来する機能的コートタンパク質をコードする構成成分を含む担体ベクター、ならびに（ｉｉ）抗線維化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの第２の植物ウイルスに由来する構成成分を含むが、機能的コートタンパク質遺伝子を欠く産生体ベクター、または（ｉ）第１の植物ウ
イルスに由来する機能的移動タンパク質をコードする構成成分を含む担体ベクター、ならびに（ｉｉ）抗線維化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの第２の植物ウイルスに由来する構成成分を含むが、機能的移動タンパク質遺伝子を欠く産生体ベクター、または（ｉ）第１の植物ウイルスに由来する機能的コートタンパク質をコードする構成成分を含む担体ベクター、ならびに（ｉｉ）抗線維化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの第２の植物ウイルスに由来する構成成分を含むが、第２の植物ウイルスにおいて通常見いだされる１つまたは複数の機能的複製タンパク質遺伝子を欠く産生体ベクターを導入するステップ、（ｂ）植物を、担体ベクターが産生体ベクターを補完し、したがって、産生体ベクターが植物全体にわたって移動することを可能にするのに十分な条件下でそれに十分な時間にわたって維持するステップ、ならびに（ｃ）植物を、少なくとも一部の植物細胞においてポリヌクレオチドが発現されるのに十分な条件下でそれに十分な時間にわたって維持するステップを含み得る。

【0016】

導入するステップは、真空浸潤を含み得る。方法は、抗線維症活性を有するポリペプチドを含む植物を採取するステップ、植物から抗線維症活性を有するポリペプチドを抽出するステップ、および／または、抗線維症活性を有するポリペプチドを精製するステップをさらに含み得る。

【0017】

別の態様では、本文献は、線維症の対象を治療する方法を特徴とする。方法は、線維症の対象を選択するステップ、および治療有効量の本明細書に記載のポリペプチドを対象に投与するステップを含み、それにより線維症の対象を治療し得る。対象は、肺線維症を有する対象であり得る。方法は、治療有効量の別の治療剤（例えば、コルチコステロイド、免疫抑制剤、アセチルシステイン、Ｄ－ペニシラミン、コルヒチン、レラキシン、ステロイド、シクロスポリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノレート、グリタゾン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、およびフルベストラントからなる群から選択される治療剤）を対象に投与するステップをさらに含み得る。コルチコステロイドは、プレドニゾンであり得る。免疫抑制剤は、メトトレキサートまたはシクロスポリンであり得る。投与するステップは、経口投与または静脈内投与を含み得る。

【0018】

さらに別の態様では、本文献は、医薬的に許容される担体および本明細書に記載のポリペプチドを含有する組成物であって、対象への経口投与または静脈内投与用に製剤化されている組成物を特徴とする。ポリペプチドは、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７を含み得る。

【0019】

特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料が下に記載されている。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書に支配される。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。

【0020】

本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、付属図および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1A】ＴＧＦ－β刺激と組み合わせた、組換えエンドスタチン（ｒＥ）で処理した線維芽細胞およびエンドスタチン由来ペプチドで処理した線維芽細胞におけるＥＣＭ産生の図である。図１Ａ：ビヒクル（Ｖ）、ｒＥを単独で用いて、または事前のＴＧＦ－β刺激と共にビヒクル（Ｖ）、ｒＥを用いて処理したヒト正常肺線維芽細胞（ＮＬ）におけるＦＮ発現およびＣｏｌ１α１発現。ウエスタンブロットを用いてタンパク質を検出した。グリセルアルデヒドｅ－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を溶解物についてのローディング対照として使用した。

【図1B】ＴＧＦ－β刺激と組み合わせた、組換えエンドスタチン（ｒＥ）で処理した線維芽細胞およびエンドスタチン由来ペプチドで処理した線維芽細胞におけるＥＣＭ産生の図である。図１Ｂ：健康な対照、ＳＳｃの患者、およびＩＰＦの患者からの初代肺線維芽細胞における、ＴＧＦ刺激後にエンドスタチンポリペプチドで処置した肺線維芽細胞のＦＮ発現およびＣｏｌ１α１発現。

【図1C】ＴＧＦ－β刺激と組み合わせた、組換えエンドスタチン（ｒＥ）で処理した線維芽細胞およびエンドスタチン由来ペプチドで処理した線維芽細胞におけるＥＣＭ産生の図である。図１Ｃ：健康な対照（ＮＬ）４名、ＳＳｃの患者３名、およびＩＰＦの患者３名からの線維芽細胞を使用して得られた、肺線維芽細胞におけるＦＮ発現およびＣｏｌ１α１発現のグラフによる要約。バンドの強度をＧＡＰＤＨの強度に対して正規化し、ビヒクル（Ｖ）に対する比として表した。対応のあるｔ検定を統計解析に使用した。^＊Ｐ＜０．０４、^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図1D】ＴＧＦ－β刺激と組み合わせた、組換えエンドスタチン（ｒＥ）で処理した線維芽細胞およびエンドスタチン由来ペプチドで処理した線維芽細胞におけるＥＣＭ産生の図である。図１Ｄ：斑状強皮症の患者およびＳＳｃの患者から得たヒト皮膚線維芽細胞におけるＦＮレベルおよびＣｏｌ１α１レベルの代表的な結果。

【図1E】ＴＧＦ－β刺激と組み合わせた、組換えエンドスタチン（ｒＥ）で処理した線維芽細胞およびエンドスタチン由来ペプチドで処理した線維芽細胞におけるＥＣＭ産生の図である。図１Ｅ：Ｖ、５μｇ／ｍｌのｒＥ、またはエンドスタチンポリペプチドを単独で用いて処置した、ＩＰＦの患者から得た線維化線維芽細胞におけるＦＮ発現およびＣｏｌ１α１発現の代表的な結果（左側）。ＩＰＦ線維芽細胞を、種々の濃度（５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌ）のＥ４を用いて処理した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｖ）を、２０μｇ／ｍｌのＥ４に対応するレーンにおけるものと同等の体積で添加した（右側）。

【図1F】ＴＧＦ－β刺激と組み合わせた、組換えエンドスタチン（ｒＥ）で処理した線維芽細胞およびエンドスタチン由来ペプチドで処理した線維芽細胞におけるＥＣＭ産生の図である。図１Ｆ：ＴＧＦ－β刺激後にエンドスタチンポリペプチドを用いて処理した正常肺線維芽細胞におけるα－ＳＭＡレベル。

【図2A】ｅｘ ｖｉｖｏヒト皮膚線維症器官培養モデルの図である。図２Ａ：組換えＴＧＦ－βまたは１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ビヒクル）をヒト皮膚外植片に１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌの濃度で皮内注射した。注入の１週間後に皮膚を採取した。代表的なＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン染色）画像が上の行に示されており、マッソン・トリクローム染色切片の画像が下の行に示されている。倍率、２０×。

【図2B】ｅｘ ｖｉｖｏヒト皮膚線維症器官培養モデルの図である。図２Ｂ：組換えエンドスタチン（ｒＥ）をヒト皮膚に１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度で注射した。１×ＰＢＳをビヒクル対照（Ｖ）として使用した。代表的なＨ＆Ｅ画像が示されている。倍率、２０×。

【図2C】ｅｘ ｖｉｖｏヒト皮膚線維症器官培養モデルの図である。図２Ｃ：エンドスタチンポリペプチド（Ｅ－１、Ｅ－２、Ｅ－３、およびＥ－４；全て１０μｇ／ｍｌ）をヒト皮膚に皮内注射した。ＤＭＳＯをビヒクル対照（Ｖ）として使用した。代表的なＨ＆Ｅ画像が示されている。倍率、２０×。

【図3A】ヒト皮膚におけるＴＧＦ－βによって誘導される線維症および皮膚の厚さに対する組換えエンドスタチンの影響を示す図である。図３Ａ：ビヒクル、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βを単独で、またはｒＥ（１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌ）とＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の組合せを注射したヒト皮膚の代表的なＨ＆Ｅ画像。注入の１週間後に組織を採取した。倍率、２０×。

【図3B】ヒト皮膚におけるＴＧＦ－βによって誘導される線維症および皮膚の厚さに対する組換えエンドスタチンの影響を示す図である。図３Ｂ：皮膚の厚さのグラフ表示。データは、４つの異なるドナー由来のヒト皮膚外植片を使用した４つの独立した３連での実験を表す。マン・ホイットニーのＵ検定を統計解析に使用した。^＊Ｐ＜０．０４。

【図4A】ヒト皮膚におけるＴＧＦ－βによって誘導される線維症および皮膚の厚さに対するエンドスタチンポリペプチドの影響を示す図である。図４Ａ：ビヒクル、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βを単独で、またはＥ－１、Ｅ－２、Ｅ－３、もしくはＥ－４（１０μｇ／ｍｌ）とＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の組合せを注射したヒト皮膚の代表的なＨ＆Ｅ画像。倍率、２０×。

【図4B】ヒト皮膚におけるＴＧＦ－βによって誘導される線維症および皮膚の厚さに対するエンドスタチンポリペプチドの影響を示す図である。図４Ｂ：図４Ａに示されている皮膚の厚さのデータのグラフ表示。データは、２つのドナー由来のヒト皮膚外植片を使用した２つの独立した実験を表し、各実験は３連で行った。マン・ホイットニーのＵ検定を統計解析に使用した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０２。

【図5A】ＴＧＦ－βによって誘導される線維症におけるＥ－１およびＥ－４の用量反応を示す図である。図５Ａ：Ｅ－１（上の行）またはＥ－４（下の行）を１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で注射したヒト皮膚の代表的なＨ＆Ｅ画像。倍率、２０×。

【図5B】ＴＧＦ－βによって誘導される線維症におけるＥ－１およびＥ－４の用量反応を示す図である。図５Ｂ：図５Ａに示されている皮膚の厚さのデータのグラフ解析。ＤＭＳＯをビヒクル対照として使用した。実験を２連で行い、各切片から６視野で皮膚の厚さを測定した。マン・ホイットニーのＵ検定を統計解析に使用した。^＊Ｐ＜０．０２、^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図6A】マウス皮膚におけるｉｎ ｖｉｖｏでの線維症の発生に対するエンドスタチンポリペプチドの影響を示す図である。図６Ａ：マウスに、ビヒクル、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βを単独で、またはＥ－１、Ｅ－２、Ｅ－３、およびＥ－４（１０μｇ／ｍｌ）とＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の組合せを皮内注射した。注入の１週間後に皮膚を採取した。切片をＨ＆Ｅで染色した。倍率、２０×。

【図6B】マウス皮膚におけるｉｎ ｖｉｖｏでの線維症の発生に対するエンドスタチンポリペプチドの影響を示す図である。図６Ｂ：図６Ａに示されている皮膚の厚さのデータのグラフによる要約。データは、それぞれ２連で行った４つの独立した実験を表す。マン・ホイットニーのＵ検定を統計解析に使用した。^＊Ｐ＜０．０４、^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図7A】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）における尿細管形成を阻害するエンドスタチンポリペプチドの能力。図７Ａ：ビヒクル、ｒＥ（５０ｎＭ）、またはＥ４（５０ｎＭ）を用いて処理したＨＵＶＥＣのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）培養物の代表的な画像。等価量のＤＭＳＯをビヒクルとして使用した。倍率４０×。

【図7B】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）における尿細管形成を阻害するエンドスタチンポリペプチドの能力。図７Ｂ：図７Ａに示されているコード形成の画像数量化。示されているデータは、３つの独立した実験の結果の要約である。^＊Ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後、ボンフェローニ検定。

【図8A】ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ブレオマイシンによって誘導される皮膚線維症に対するエンドスタチンＥ－４の影響を示す図である。図８Ａ：マウスに、１×ＰＢＳをビヒクル（Ｖ）として、またはブレオマイシン（Ｂｌｅｏ；２０μｇ／マウス）を毎日皮下注射した。１日目にＥ－４（１０μｇ／ｍｌ）をブレオマイシンと混合し、その後Ｅ４の注射は伴わずに毎日のブレオマイシン投与を継続した（Ｂｌｅｏ＋Ｅ－４）。１０日後に皮膚を採取した。切片をＨ＆Ｅで染色した。倍率、１００×。

【図8B】ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ブレオマイシンによって誘導される皮膚線維症に対するエンドスタチンＥ－４の影響を示す図である。図８Ｂ：図８Ａに示されている皮膚の厚さのデータのグラフによる要約。データは、３つの独立した実験を表す。マン・ホイットニーのＵ検定を統計解析に使用した。^＊Ｐ＜０．００１、^＊＊Ｐ＜０．００００１。Ｅ４の単回投与であっても、Ｅ４投与により、ブレオマイシンによって誘導される皮膚線維症の有意な減弱が引き起こされた。

【図9】Ｅ４により、ＴＧＦ－βの３日後の投与であっても、ＴＧＦβによって誘導される皮膚線維症が逆転することを示す図である。マウス皮膚を、１日目にＴＧＦ－βを用いて処理し、Ｅ－４ＬまたはＥ－１Ｌ（これは線維化トリガーの投与とペプチドの投与の間の３日間のラグの後に投与されたＥ－４およびＥ－１である）。Ｅ－１またはＥ－４を３日目に腹腔内（ＩＰ）投与し、７日目に採取した。７日目に、Ｅ４により、ＴＧＦ－βによって誘導される皮膚線維症の有意な低減が引き起こされた。したがって、Ｅ４は、ＴＧＦ－βによって誘発される皮膚線維症を予防し（図４－６）、また、逆転させる（図９）。

【図10A】Ｅ４により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてブレオマイシンによって誘導される肺線維症が減弱することを示す図である。図１０Ａ：ブレオマイシン６０μｇを、ビヒクルとしてＤＭＳＯ（Ｂｌｅｏ）と、またはＥ－４（Ｂｌｅｏ＋Ｅ－４；１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせて気管内投与した。一部のマウスでは、ブレオマイシンによる処置の３日後にＥ－４（１０μｇ／ｍｌ）を気管内（ＩＴ）投与した（Ｂｌｅｏ＋Ｅ－４Ｌ）。ＰＢＳをブレオマイシン（Ｖ）のビヒクルとして使用した。処置の１０日後に肺を採取した。Ｈ＆Ｅ（左側のパネル）およびマッソン・トリクローム（右側のパネル）を用いて染色した代表的な画像は、３つの独立した実験を表す。倍率、１００×。ブレオマイシンと同時にまたはブレオマイシンの３日後に投与したＥ４により、線維症およびマッソン・トリクローム染色の顕著な低減が引き起こされた。

【図10B】Ｅ４により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてブレオマイシンによって誘導される肺線維症が減弱することを示す図である。図１０Ｂ：Ｖ、Ｂｌｅｏ、Ｂｌｅｏ＋Ｅ－４、およびＢｌｅｏ＋Ｅ－４Ｌを用いて処置したマウス肺から得た酸可溶性コラーゲンの数量化。３つの独立した実験からのコラーゲンのレベルがμｇ／ｍｇ（肺）として示されている。対応のないｔ検定を統計解析に使用した。^＊Ｐ＜０．０５。ブレオマイシンの３日後にもたらしたＥ４ポリペプチドにより、マウス肺におけるコラーゲンレベルが有意に低下した。

【図10C】Ｅ４により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてブレオマイシンによって誘導される肺線維症が減弱することを示す図である。図１０Ｃ：低倍率（２×）の、図９に示されているマウス肺（ＢＬＭ＋Ｅ４／Ｅ４Ｌ ＩＴ １０日目）。Ｂｌｅｏ＋Ｅ４Ｌについては、まずＢｌｅｏを投与し、その後、Ｂｌｅｏ投与とＥ４投与の間に３日間のラグを設けた）。

【図11】Ｅ４により、腹腔内投与（ＩＰ）か気管内投与（ＩＴ）かにかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてブレオマイシンによって誘導される肺線維症が減弱することを示す図である。１日目にブレオマイシンをＩＴ投与し、３日目にＥ４をＩＰ投与またはＩＴ投与した。２１日目に肺を採取した。２１日目に、Ｅ４により、ＩＰ投与かＩＴ投与かにかかわらず、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症の有意な減弱が引き起こされた。したがって、Ｅ４は、投与経路に関係なく、線維症の低減に有効である。ビヒクル単独（Ｖ）、ブレオマイシン単独（Ｂｌｅｏ）、ブレオマイシンおよびＥ４のＩＰ投与、ならびにブレオマイシンおよびＥ４のＩＴ投与について結果が示されている。

【図12】Ｅ４により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のレベルが低下し、したがって、コラーゲンの架橋結合が低減し、コラーゲンの安定性が低下してタンパク質分解をより受けやすくなることにより、線維症が低減することを示す図である。Ｅ４を伴ってまたは伴わずにＢＬＭを用いて処置したマウスの肺切片を免疫組織化学的検査に使用して、ＬＯＸを検出した。示されている切片は、対照ＩｇＧ、リン酸緩衝生理食塩水、ブレオマイシンおよびブレオマイシンとその後にＥ４を用いた処置である。

【図13】Ｅ４により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、初代ヒト肺線維芽細胞におけるＴＧＦ－βによって誘導されるＬＯＸ産生が遮断されることによって線維症が低減することを示す図である。第４継代の正常肺線維芽細胞を、ビヒクル、Ｅ４、ＴＧＦ－β、またはＴＧＦ－βとその３０分後にＥ４を用いて処理した。４８時間後に、線維芽細胞によって馴化させた培地を、ウエスタンブロット分析を使用して分析した。レーン１：ビヒクル（ＤＭＳＯ）；レーン２：Ｅ－４；レーン３：ＴＧＦ－β；レーン４：ＴＧＦ－β、その後にＥ４。ＬＯＸ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって調査したところ、同様の結果が得られた。

【図14A】Ｅ４により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、初代ヒト肺線維芽細胞におけるＭＭＰ－２活性が誘導され、したがって、コラーゲンおよび他の基質タンパク質の分解の増加がもたらされることによって線維症が低減することを示す図である。初代ヒト肺線維芽細胞を、Ｅ－４、その後にＴＧＦ－βを用いて処理した場合（レーン４）のＭＭＰ－２活性の上昇を示すゼラチンザイモ電気泳動ゲルのデジタル画像。レーン１：ビヒクル（ＤＭＳＯ）；レーン２：Ｅ－４；レーン３：ＴＧＦ－β；レーン４：ＴＧＦ－β、その後にＥ４。

【図14B】ＴＧＦ－βおよびＥ－４を用いて処理した細胞では総ＭＭＰ－２レベルおよび活性ＭＭＰ－２レベルの両方が上昇することを示すデジタル画像である。これにより、Ｅ－４により、ＭＭＰ－２プロ酵素のレベルが上昇するが、活性マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ－２、メタロプロテアーゼ－２とも称される）のレベルも上昇することが示唆される。

【図15】Ｅ４により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、初代ヒト肺線維芽細胞における、ＴＧＦβの阻害剤であるＩＤ１の発現が誘導されることによって線維症が低減することを示すグラフである。リアルタイムＰＣＲ分析を実施して、示されている条件下でのＩＤ１ ｍＲＮＡレベルを決定した。

【図16】Ｅ－４により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、初代ヒト肺線維芽細胞におけるマスター転写因子Ｅｇｒ－１のレベルが低下することによって線維症が低減することを示す図である。Ｅｇｒ－１レベルの低下は、コラーゲン、ＳＭＡ、およびフィブロネクチンの低下と対応する。レーン１：ビヒクル（ＤＭＳＯ）；レーン２：Ｅ４；レーン３：ＴＧＦβ、レーン４：ＴＧＦβ、その６０分後にＥ４。２４時間後に試料を採取した。

【図17A】ヒト皮膚における、ＴＧＦ－βによって誘発される確立された線維症に対するエンドスタチンペプチドの影響を示す図である。図１７Ａ：１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βを投与した２日後に、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、Ｅ－１、またはＥ－４（１０ｍｇ／ｍｌ）をヒト皮膚にさらに注射した（それぞれＶ、Ｅ－１ＬおよびＥ－４Ｌ）。ヒト皮膚の代表的なＨ＆Ｅ画像を示した。倍率、２０×。

【図17B】ヒト皮膚における、ＴＧＦ－βによって誘発される確立された線維症に対するエンドスタチンペプチドの影響を示す図である。図１７Ｂ：Ａに示されている皮膚の厚さのデータのグラフ表示。データは、２つのドナー由来のヒト皮膚外植片を使用した２つの独立した実験を表し、各実験を２連で行った。マン・ホイットニーのＵ検定を統計解析に使用した。^＊Ｐ＜０．０１。

【図18】示差的な溶解性に基づく、タグ付けされていないＥ３の精製スキームを示す図である。

【図19】植物において産生されたＥ３バリアントを示す図である。

【図20】経口Ｐｌａｎｔ－Ｍａｄｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＰＭＰ）Ｅ３バリアントにより、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症が予防されることを示す図である。

【図21】Ｅ３－Ｆｃの静脈内投薬が経口投与と同等であることを示すグラフである。

【図22】静脈内Ｅ３－Ｆｃには、肺線維症を逆転させる潜在性があることを示すグラフである。

【図23】ヒトＩｇＧ ＦｃとＥ３の融合物の発現の概略図（左側のパネル）およびウエスタンブロット（右側のパネル）である。

【図24】ヒトＩｇＧ ＦｃとＥ３の融合物の精製を示す図である。

【図25】ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２、およびＩｇＭ ＦｃとＥ３の融合物が不溶性であるまたは発現が乏しいことを示す図である。

【図26】Ｅ３－Ｆｃ（配列番号１６）、Ｅ３（配列番号２０）、およびＥ４（配列番号２１）のアミノ酸配列を示す図である。

【図27】ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３原薬製造プロセスのブロック図である。

【図28】ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の発現のためのｐＧＲ－Ｄ４ベクターの概略図である。

【図29】プロテインＡおよびＴＦＦによって精製されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示す図である。

【図30】ＴＦＦによって精製されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のサイズ排除クロマトグラムである。

【図31】ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラムである。

【図32】ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３ ＣＥＸ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像である。

【図33】ＣＥＸ画分１Ａ４（上）および１Ｂ２（下）のサイズ排除クロマトグラムである。

【図34】２２０ｎｍにおける非還元ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）クロマトグラムである。

【図35】還元ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）スペクトルを示すグラフである。

【図36】還元（Ｒ）条件および非還元（ＮＲ）条件下でのｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像である。

【図37】図３８との相関についてトリプシンペプチド断片が強調表示されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３配列を示す図である。

【図38】ゲル内トリプシン消化されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３バンド１（還元）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。

【図39】ブレオマイシンモデルにおける経口投与およびＩＶ投与の概略図である。

【図40】ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の経口投与およびＩＶ投与で処置したマウス肺のヘマトキシリン・エオシン染色を示す図である。

【図41】経口およびＩＶによるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を用いて処置したブレオマイシンモデルにおけるマウス肺のヒドロキシプロリンアッセイを示すグラフである。

【図42】経口およびＩＶによるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を用いて処置したブレオマイシンモデルの反復実験におけるマウス肺のヒドロキシプロリンアッセイを示すグラフである。

【図43】ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の浸透圧ポンプによる皮下（ｓ．ｃ．）投与で処置したマウス皮膚のヘマトキシリン・エオシン染色を示す図である。

【図44】ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の浸透圧ポンプによるｓ．ｃ．投与で処置したマウスの皮膚の厚さを示すグラフである。

【図45】ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を用いて処置したＴＧＦ－βモデルにおけるヒト皮膚のヒドロキシプロリンアッセイを示すグラフである。

【図46】Ｅ４エンドスタチンペプチドの作用機構の概略図である。

【図47】Ｅ３ Ｆｃ融合物Ｅ３－Ｆｃ（ＥＮＤ－２５）、Ｅ３－リンカー－Ｆｃ（ＥＮＤ－２６）、およびＣ６７Ａ Ｅ３－Ｆｃ（ＥＮＤ－５５）溶解物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを総タンパク質量について画像処理した図（左側のパネル）、およびウエスタンブロットによって抗Ｆｃ抗体を用いてウエスタンブロットした図（右側のパネル）である。

【図48】ＥＮＤ－５５シミュレート胃液（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｆｌｕｉｄ）（ペプシン）消化を示す図である。総タンパク質量のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（左側のパネル）、およびニワトリ抗Ｅ３抗体（中央のパネル）または抗ヒトＦｃ抗体（右側のパネル）のいずれかを用いたウエスタンブロット。

【発明を実施するための形態】

【0022】

配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、アミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル［８１２３－８４１０２－０３ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ， Ａｐｒ．４， ２０１２， １２．５ ｋｉｌｏｂｙｔｅｓ］として提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において：
配列番号１は、ヒトエンドスタチンをコードする例示的な核酸配列である。

【0023】

配列番号２は、ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列である。
配列番号３は、マウスエンドスタチンをコードする例示的な核酸配列である。

【0024】

配列番号４は、マウスエンドスタチンのアミノ酸配列である。
配列番号５は、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１タンパク質をコードする例示的な核酸配列である。

【0025】

配列番号６は、ヒトＩｇＧ１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７は、リンカーをコードする例示的な核酸配列である。

【0026】

配列番号８は、リンカーのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ラットエンドスタチンポリペプチドの一部である。

【0027】

配列番号１０は、ウシエンドスタチンポリペプチドの一部である。
配列番号１１は、ヒトＸＶ型コラーゲンポリペプチドの一部である。

【0028】

配列番号１２は、エンドスタチンをコードする例示的な核酸配列である。
配列番号１３は、配列番号２と３カ所のアミノ酸置換によって異なる例示的なエンドスタチンポリペプチドのアミノ酸配列である。

【0029】

配列番号１４（ＳＹＣＥＴＷＲＴＥＡＰＳＡＴＧＱＡＳＳＬＬＧＧＲＬＬＧＱＳＡＡＳＣＨＨＡＹ ＩＶＬＡＩＥＮＳＦＭＴ）は、下線が引かれている位置にＣ→Ａ突然変異を有するヒトエンドスタチンの一部である。

【0030】

配列番号１５は、分泌型配列、ヒトエンドスタチンの一部、およびペプチドタグを含む例示的なアミノ酸配列である。

【0031】

配列番号１６は、分泌型配列、Ｃ６７Ａ突然変異を有するヒトエンドスタチンの一部、およびＩｇＧ Ｆｃドメインを含む例示的なアミノ酸配列である。

【0032】

配列番号１７は、分泌型配列、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの一部、Ｃ６７Ａ突然変異を有するヒトエンドスタチンの一部、およびペプチドタグを含む例示的なアミノ酸配列である。

【0033】

配列番号１８（ＱＫＳＶＷＨＧＳＤＰＮＧＲＲＬＴＥ）は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの１７アミノ酸部分である。

【0034】

配列番号１９は、４アミノ酸小胞体標的化配列である。
配列番号２０は、ヒトエンドスタチンのＥ３部分のアミノ酸配列である。

【0035】

配列番号２１は、ヒトエンドスタチンのＥ４部分のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、Ｅ３＿Ｃ６７Ａ－Ｆｃ＿ＩｇＧ２融合物のアミノ酸配列である。

【0036】

配列番号２３は、Ｅ３＿Ｃ６７Ａ－Ｆｃ＿ＩｇＧ３融合物のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、Ｅ３＿Ｃ６７Ａ－Ｆｃ＿ＩｇＧ４融合物のアミノ酸配列である。

【0037】

配列番号２５は、Ｅ３＿Ｃ６７Ａ－Ｆｃ＿ＩｇＡ１融合物のアミノ酸配列である。
配列番号２６は、Ｅ３＿Ｃ６７Ａ－Ｆｃ＿ＩｇＡ２融合物のアミノ酸配列である。

【0038】

配列番号２７は、Ｅ３＿Ｃ６７Ａ－Ｆｃ＿ＩｇＭ融合物のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、Ｊ鎖＿ＰＶＸ＿ｓｇｐ３６のアミノ酸配列である。

【0039】

配列番号２９は、ＩｇＧ１＿Ｆｃ－Ｅ３＿Ｃ６７Ａ Ｃ末端融合物のアミノ酸配列である。

【0040】

詳細な説明
Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドが本明細書に提示される。一部の実施形態では、これらのポリペプチドは、（１）配列番号１３もしくは配列番号２のアミノ酸１３３～１８０として記載されているアミノ酸配列の少なくとも４０個の連続したアミノ酸；（２）最大で５カ所のアミノ酸置換を伴う、配列番号１３もしくは配列番号２のアミノ酸１３３～１８０として記載されているアミノ酸配列の少なくとも４０個の連続したアミノ酸；（３）配列番号１３もしくは配列番号２のアミノ酸１３３～１８０として記載されているアミノ酸配列；（４）最大で５カ所のアミノ酸置換を伴う、配列番号１３もしくは配列番号２のアミノ酸１３３～１８０として記載されているアミノ酸配列；または（５）配列番号１４として記載されているアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、ポリペプチドは、抗線維症活性を有し、ポリペプチドは、配列番号１３もしくは配列番号２のアミノ酸１～９２を含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｃ末端においてアミド化されている。これらのポリペプチドを作出する方法も提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドを植物において産生させることができる。さらに、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞、ならびにポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法が提供される。方法は、対象における線維症の治療を含み得る。例えば、肺および皮膚の線維化状態、ならびに他の臓器の線維化状態（例えば、肝硬変、角膜線維症、および腎線維症）を治療するための方法が提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている抗線維症Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドにより、線維症を選択的に阻害することができる。一部の例では、血管新生の阻害を伴わずに線維症が阻害される。したがって、所望の治療転帰を実現するために、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドを使用して、血管新生に干渉せずに望ましくない線維症をより特異的かつ選択的に標的とすることができる。

【0041】

用語
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）において見いだすことができる。

【0042】

本開示の種々の実施形態についての精査を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される：
動物：例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生きている多細胞の脊椎動物生物体。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を包含する。同様に、「対象」という用語は、ヒトおよび動物対象の両方を包含する。

【0043】

アミド化またはアミド誘導体：ポリペプチドの生物活性を増強することができるアミドを形成する翻訳後修飾。アミド化では、Ｃ末端アミノ酸（ポリペプチド－ＣＯＯＨ）が修飾されてアミド（ポリペプチド－ＣＯＮＨ_２）が形成される。アミドは、翻訳後Ｃ末端アミド化によって形成することができる。修飾されるアミノ酸の後ろは、アミド基をもたらすグリシンであり得る。前駆プロタンパク質に由来するポリペプチドの翻訳後アミド化のプロセスはよく特徴付けられており、３つの酵素的ステップを伴う（Ｃｕｔｔｉｔｔａ、Ｔｈｅ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ、２３６：８７－９３、１９９３）。ステップ１は、タンパク質のカルボキシ末端付近の塩基性アミノ酸の対の末端タンパク質分解による切断を伴う。ステップ２は、塩基性残基のカルボキシペプチダーゼ媒介性除去を伴う。ステップ３は、アミド化反応であり、隣接するカルボキシ末端のアミノ酸のアミドを形成する末端グリシンの酸化を伴う。グリシンは、隣接するアミノ酸へのアミドドナーとして機能することが分かっている唯一のアミノ酸である。ポリペプチドの遊離酸の形態とアミド化された形態を構造的に区別することは難しいが、アミドは、ポリペプチドの遊離酸の形態の１００～１０００倍の生物活性を有する（Ｃｕｔｔｉｔｔａ、Ｔｈｅ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ、２３６：８７－９３、１９９３）。Ｃ末端アミド化は、多くのポリペプチドの生物活性に必須である。

【0044】

ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）：内部の非コードセグメント（イントロン）および転写を決定する調節配列を欠くＤＮＡの一片。ｃＤＮＡは、実験室において、細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡからの逆転写によって合成される。

【0045】

コラーゲン：哺乳動物において細長い原線維の形態で見いだされるタンパク質であり、大部分が腱、靭帯および皮膚などの線維組織において見いだされ、角膜、軟骨、骨、血管、消化管、および椎間板においても豊富である。トロポコラーゲンまたは「コラーゲン分子」は、原線維などのより大きなコラーゲン凝集体のサブユニットである。これは長さおよそ３００ｎｍ、直径１．５ｎｍであり、それぞれが左巻きへリックスのコンフォメーションを有する３つのポリペプチド鎖（アルファ鎖と称される）で構成される。Ｉ型コラーゲンでは、各三重らせんが会合してコラーゲンミクロフィブリルと称される右巻きスーパースーパーコイルになる。エンドスタチンはコラーゲンの最初の１８３アミノ酸である。

【0046】

保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドの活性、例えばポリペプチドの線維症を阻害する能力などに実質的に影響を及ぼさないまたはそれを低下させない置換である。保存的置換の具体的な非限定的な例としては、以下が挙げられる：

【0047】

【表1】

【0048】

保存的変化という用語は、置換ポリペプチドに対して生じる抗体が非置換ポリペプチドに対しても免疫反応するのであれば、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも包含する。非保存的置換は、タンパク質の線維症を阻害する能力などの活性を低下させる置換である。

【0049】

から本質的になる／からなる：ポリペプチドに関しては、特定のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドは、いかなる追加的なアミノ酸残基も含まない。しかし、ポリペプチドは、ポリペプチドの基本的特性および新規特性に実質的に影響を及ぼさない、標識（例えば、蛍光標識、放射性標識、もしくは固体粒子標識）、糖または脂質などの追加的な非ペプチド構成成分を含んでよい。特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、いかなる追加的なアミノ酸残基も含まず、核酸、脂質、糖などの追加的な生物学的構成成分も含まず、標識も含まない。特定のアミノ酸配列からなるまたはそれから本質的になるポリペプチドは、グリコシル化されていてよいまたはアミド修飾を有してよい。ポリヌクレオチドに関しては、指定の核酸配列から本質的になるポリヌクレオチドは、いかなる追加的な核酸残基も含まない。しかし、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの基本的特性および新規特性（１つまたは複数）に実質的に影響を及ぼさない、標識（例えば、蛍光標識、放射性標識、または固体粒子標識）またはポリペプチドなどの追加的な非核酸構成成分を含んでよい。指定の核酸配列からなるポリヌクレオチドは、いかなる追加的な核酸残基も
含まず、追加的な生物学的構成成分または標識も含まない。

【0050】

縮重バリアント：遺伝暗号の結果として縮重した配列を含むＣ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。天然アミノ酸には２０種があり、その大部分が１つ超のコドンによって指定される。したがって、縮重ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列によりコードされるＣ末端エンドスタチンポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない限りは、全てが本開示に含まれる。

【0051】

発現制御配列：作動可能に連結した異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、核酸配列の転写、および必要に応じて翻訳が制御および調節される場合、その核酸配列と作動可能に連結している。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、その遺伝子の、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にする正確なリーディングフレームの維持、および終止コドンを含み得る。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現に影響を及ぼし得る構成成分を含むものとし、その存在が有利である追加的な構成成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。発現制御配列は、プロモーターを含み得る。

【0052】

プロモーターは、転写を導くために十分な最小の配列である。プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的に制御可能なものにする、または外部のシグナルまたは薬剤による誘導性のものにするために十分なプロモーターエレメントも含まれる。そのようなエレメントは、遺伝子の５’領域または３’領域に位置し得る。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターのどちらも含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６－５４４、１９８７を参照されたい）。例えば、細菌系においてクローニングする場合、例えば、バクテリオファージラムダのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ－ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用することができる。一部の実施形態では、哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターなど）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルス長い末端反復；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターなど）を使用することができる。組換えＤＮＡまたは合成技法によって作製されたプロモーターを使用して核酸配列の転写をもたらすこともできる。

【0053】

エンドスタチン：ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端に対応する１８３アミノ酸タンパク質分解切断断片。エンドスタチンのＣ末端ポリペプチドは、Ｃ末端領域からの連続したアミノ酸、アミノ酸９３からアミノ酸１８３までを含む。例示的なヒトエンドスタチンポリペプチドは、配列番号２および配列番号１３に記載されている。

【0054】

線維症：修復または反応プロセスとしての、臓器または組織の正常な構成物としての線維組織の形成とは対照的な、臓器または組織における過剰な線維状結合組織の形成または発生。皮膚および肺は、線維症にかかりやすい。例示的な線維化状態は、強皮症、特発性肺線維症、斑状強皮症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の結果としての線維症、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、および上皮下線維症、心内膜心筋線維症、子宮線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、外科手術後の瘢痕、喘息、硬変症／肝線維症、異常な創傷治癒、糸球体腎炎、および多巣性線維化硬化症である。

【0055】

異種：別々の遺伝源または種に由来すること。エンドスタチンに対して異種であるポリペプチドは、エンドスタチンをコードしない核酸を起源とする。特定の非限定的な例では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドおよび異種アミノ酸配列を含有するポリペプチドは、Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ１など）、β－ガラクトシダーゼ、マルトース結合性タンパク質
、およびアルブミン、Ｂ型肝炎表面抗原、または免疫グロブリンアミノ酸配列を含む。一般に、エンドスタチンなどの目的のタンパク質に特異的に結合する抗体は、異種タンパク質には特異的に結合しない。

【0056】

宿主細胞：ベクターを繁殖させ、そのＤＮＡを発現させることができる細胞。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得る。この用語は、対象とする宿主細胞の任意の後代も包含する。複製の間に突然変異が起こり得るので、全ての後代が親細胞と同一ではない可能性があることが理解される。しかし、「宿主細胞」という用語が使用される場合、そのような後代が含まれる。

【0057】

特発性肺線維症：肺を支える骨組（間質）の線維症を特徴とする慢性の進行型肺疾患である、原因不明の線維化肺胞炎（ＣＦＡ）としても公知の状態。定義によれば、この用語は、肺線維症の原因が不明（「特発性」）である場合にのみ使用される。ＩＰＦの患者由来の肺組織が病理医により顕微鏡の下で検査されると、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）として公知の特有の一連の組織学的／病理的特徴が示される。ＵＩＰは、肺を支える骨組（間質）を伴う両肺の進行性の瘢痕化を特徴とする。

【0058】

疾患の阻害または治療：線維症などの疾患の阻害とは、疾患の完全な発生を阻害することを指す。いくつかの例では、疾患の阻害とは、瘢痕組織の形成または可動域の増大または疼痛の減少などの、線維症の症状の緩和を指す。「治療」とは、線維症などの疾患に関連する疾患または病的状態の徴候または症状を好転させる治療介入を指す。

【0059】

単離された：「単離された」生物学的構成成分（例えば、核酸またはタンパク質または細胞小臓器など）は、その構成成分が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的構成成分、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞小臓器から実質的に分離または精製されたものである。「単離された」核酸およびタンパク質とは、標準の精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含する。

【0060】

ケロイドまたはケロチド瘢痕：瘢痕の一種であり、その成熟度に応じて、主にＩＩＩ型コラーゲン（初期）またはＩ型コラーゲン（後期）のいずれかで構成される。これは、治癒した皮膚傷害の部位において肉芽組織（３型コラーゲン）が過成長し、その後、１型コラーゲンでゆっくりと置き換えられた結果である。ケロイドは、堅くゴムのような病変または光沢のある線維状の小結節であり、淡紅色から肌色までまたは赤色から暗褐色まで変動し得る。ケロイド瘢痕は良性、非伝染性であり、通常は重度のそう痒、鋭痛、および肌のきめの変化を伴う。重症の場合には、皮膚の動きに影響を及ぼし得る。ケロイドは、元の創傷の境界を越えて成長することはない隆起した瘢痕である肥厚性瘢痕とは異なる。

【0061】

標識：別の分子の検出を容易にするために、その分子に直接または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物。標識の具体的な非限定的な例としては、蛍光タグ、酵素的連結、および放射性同位元素が挙げられる。

【0062】

リンカー配列：リンカー配列は、２つのポリペプチドドメインを共有結合により連結するアミノ酸配列である。リンカー配列は、連結するポリペプチドドメインに回転性の自由をもたらすため、および、それにより、適切なドメインフォールディングおよびＭＨＣへの提示を促進するために、本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチド間に含めることができる。例として、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドを２つ含有する組換えポリペプチドにおいて、２つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドの間にリンカー配列をもたらすことができ、例えば、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチド－リンカー－Ｃ
末端エンドスタチンポリペプチドを含有するポリペプチドなどである。一般に、長さが２アミノ酸から２５アミノ酸の間であるリンカー配列が当技術分野で周知であり、それらとして、これだけに限定されないが、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４－３９７、１９８９に記載されているグリシン（４）－セリンスペーサー（×３）が挙げられる。

【0063】

リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）：リシルオキシダーゼは、コラーゲンおよびエラスチン前駆体におけるリシン残基からのアルデヒドの形成を触媒する細胞外銅酵素である。これらのアルデヒドは、高度に反応性であり、他のリシルオキシダーゼ由来アルデヒド残基と、または修飾されていないリシン残基と自然に化学反応する。これにより、コラーゲン原線維の安定化のため、ならびに成熟エラスチンの完全性および弾性のために必須である架橋結合したコラーゲンおよびエラスチンがもたらされる。

【0064】

哺乳動物：この用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を包含する。同様に、「対象」という用語は、ヒトおよび動物対象の両方を包含する。

【0065】

マトリックスメタロプロテイナーゼ－２：ゼラチナーゼＡとしても公知の、７２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼ。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質は、胚発生、生殖、および組織リモデリングなどの正常な生理的プロセスにおいて、ならびに関節炎および転移などの疾患過程において、細胞外マトリックスの分解に関与する。大多数のＭＭＰは、細胞外プロテイナーゼによって切断されると活性化される不活性プロタンパク質として分泌される。ＭＭＰ－２は、基底膜の主要な構造的構成成分であるＩＶ型コラーゲンを分解する。ＭＭＰ－２はまた、ネイティブおよび変性したＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンなどの追加的な基質も分解する（ｃｌｉｐ．ｕｂｃ．ｃａ／ａｒｃｈｉｖｅ／ｍｍｐ＿ｔｉｍｐ＿ｆｏｌｄｅｒ／ｍｍｐ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．ｓｈｔｍ ｗｅｂｓｉｔｅを参照されたい）。

【0066】

オリゴヌクレオチド：約１００ヌクレオチド塩基までの長さの直鎖状ポリヌクレオチド配列。

【0067】

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：いかなる内部終結コドンも伴わない、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は通常、ポリペプチドに翻訳可能である。

【0068】

作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係して配置されている場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがＣ末端エンドスタチンポリペプチドをコードする配列などのコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列と作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続したものであり、２つのタンパク質コード領域を接合する必要があれば、同じリーディングフレーム内にある。

【0069】

ペプチド修飾：Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドの合成実施形態を含む。さらに、これらのタンパク質の類似体（非ペプチド有機分子）、誘導体（開示されているポリペプチド配列から出発して得られる、化学的に官能性をもたせたポリペプチド分子）およびバリアント（ホモログ）を本明細書に記載の方法において利用することができる。本開示の各ポリペプチドは、天然に存在するおよび他のＬ－アミノ酸および／またはＤ－アミノ酸のいずれかであり得るアミノ酸の配列で構成される。

【0070】

ペプチドは、修飾されていないポリペプチドと基本的に同じ活性を有し、場合によって他の望ましい特性を有する誘導体を作製するために、種々の化学的技法によって修飾する
ことができる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシル末端であるか側鎖であるかにかかわらず、医薬的に許容される陽イオンの塩の形態でもたらすこともでき、エステル化してＣ_１～Ｃ_１６エステルを形成することもでき、式ＮＲ_１Ｒ_２（Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立にＨまたはＣ_１～Ｃ_１６アルキルである）のアミドに変換することもでき、組み合わせて５員環または６員環などの複素環式環を形成することもできる。ポリペプチドのアミノ基は、アミノ末端であるか側鎖であるかにかかわらず、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸および他の有機塩などの医薬的に許容される酸付加塩の形態にすることもでき、修飾してＣ_１～Ｃ１_６アルキルまたはジアルキルアミノにすることもでき、アミドにさらに変換することもできる。

【0071】

ポリペプチド側鎖のヒドロキシル基は、よく理解されている技法を使用してＣ_１～Ｃ_１６アルコキシまたはＣ_１～Ｃ_１６エステルに変換することができる。ポリペプチド側鎖のフェニル環およびフェノール環は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素などの１つまたは複数のハロゲン原子で、またはＣ_１～Ｃ_１６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_１６アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、またはそのようなカルボン酸のアミドで置換することができる。ポリペプチド側鎖のメチレン基は、伸長させて相同なＣ_２～Ｃ_４アルキレンにすることができる。チオールは、アセトアミド基などの、いくつものよく理解されている保護基のいずれか１つを用いて保護することができる。安定性の増強をもたらす構造に対してコンフォメーションの制約を選択し、もたらすために、本発明のポリペプチドに環状構造を導入するための方法も当業者には理解されよう。

【0072】

ペプチド模倣物および有機模倣物（ｏｒｇａｎｏｍｉｍｅｔｉｃ）の化学的構成物の三次元配置が、ポリペプチドの主鎖および構成成分アミノ酸の側鎖の三次元配置を模倣するようなペプチド模倣物および有機模倣物実施形態が構想され、その結果、測定可能なまたは増強された、線維症を治療する能力を有するＣ末端エンドスタチンポリペプチドのそのようなペプチド模倣物および有機模倣物がもたらされる。コンピュータモデリング適用に関して、ファーマコフォアは、生物活性の構造的な要件のための理想的な三次元の定義である。ペプチド模倣物および有機模倣物は、各ファーマコフォアが現行のコンピュータモデリングソフトウェア（コンピュータ支援薬物設計またはＣＡＤＤを使用するもの）にフィットするようにデザインすることができる。ＣＡＤＤにおいて使用される技法の説明については、Ｗａｌｔｅｒｓ、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ
ｏｆ Ｄｒｕｇｓ」、Ｋｌｅｇｅｒｍａｎ ＆ Ｇｒｏｖｅｓ編、１９９３、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌｌ．、１６５～１７４頁およびＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｍｕｎｓｏｎ（編）１９９５、Ｃｈ．１０２を参照されたい。そのような技法を使用して調製された模倣物も含まれる。

【0073】

医薬的に許容される担体：使用される医薬的に許容される担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１５版（１９７５）には、本明細書において開示されている融合タンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。

【0074】

一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に左右される。例えば、非経口用製剤は、通常、ビヒクルとして、例えば水、生理的食塩水、平衡させた塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの医薬的かつ生理的に許容される流体を含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、ピル、錠剤、またはカプセル剤の形態など）に関しては、従来の無毒性固体担体として、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝
剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの無毒性補助物質を含有し得る。

【0075】

「治療有効量」とは、治療される対象において所望の効果を実現するための組成物の分量である。例えば、治療有効量は、免疫応答を誘導する、線維症を阻害する、瘢痕体積を低下させる、または線維化状態の外的症状を測定可能な程度に変化させるために必要な量であり得る。対象に投与する場合、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効果が実現されることが示されている標的組織中濃度（例えば、皮膚細胞または肺組織における）が実現される投薬量を使用する。

【0076】

ポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドまたは核酸配列という用語は、少なくとも１０塩基の長さのポリマーの形態のヌクレオチドを指す。組換えポリヌクレオチドは、それが由来する生物体の天然に存在するゲノム中ではすぐ隣にあるコード配列（一方は５’末端、一方は３’末端）の両方のすぐ隣にはないポリヌクレオチドを含む。したがって、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ；自律複製性プラスミドもしくはウイルスに組み込まれた組換えＤＮＡ；または原核生物もしくは真核生物ゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、または他の配列とは独立した別の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在するものを包含する。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または、いずれかのヌクレオチドの修飾された形態であり得る。この用語は、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。

【0077】

ペプチドまたはポリペプチド：長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）を問わず、任意のアミノ酸の鎖。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドである。ポリペプチドは、５アミノ酸から６０アミノ酸の間の長さであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約１０アミノ酸から約５５アミノ酸までの長さである。さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、約２０アミノ酸から約５０アミノ酸までの長さである。さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、約５０アミノ酸の長さである。ポリペプチドに関しては、「約」という単語は、整数の量を示す。したがって、一例では、「約」５０アミノ酸の長さのポリペプチドは、４９アミノ酸から５１アミノ酸までの長さである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、多量体の形態であり得る。例えば、ポリペプチドは、本明細書に記載のエンドスタチン断片および／または融合物を複数含む高分子量多量体であり得る。高分子量多量体は、例えば、５００ｋＤａ超（例えば、５００～７５０ｋＤａ、７５０ｋＤａ～１メガダルトン（ＭＤａ）、１～１．５ＭＤａ、１．５～２ＭＤａ、２～２．５ＭＤａ、または２．５～３ＭＤａ）の分子量を有し得る。

【0078】

翻訳後修飾：新しく形成されたタンパク質の修飾；これは、ある特定のアミノ酸に対する、アミノ酸の欠失、ある特定のアミノ酸の化学修飾（例えば、アミド化、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、ピログルタミン酸の形成、メチオニン上のサルファ基の酸化／還元、または同様の小分子の添加）を含み得る。

【0079】

プローブおよびプライマー：プローブとは、検出可能な標識またはレポーター分子に付着した単離された核酸を含む。プライマーとは、約１５ヌクレオチド以上の長さの短い核酸、好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニーリングして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野で公知の他の核酸の増幅方法によって核酸配列を増幅するために使用することができる。特定のプローブまたはプライマーの特異性はその長さに伴って増大することが当業者には理解されよう。したがって、例えば、２０個の連続したヌクレオチドを含有するプ
ライマーは、標的に、１５ヌクレオチドのみの対応するプライマーよりも高い特異性でアニーリングする。したがって、より高い特異性を得るために、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約５０個以上の連続したヌクレオチドを含有するプローブおよびプライマーを選択することができる。

【0080】

精製された：本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドは、当技術分野で公知の手段のいずれかによって精製すること（および／または合成すること）ができる（例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ編、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０；およびＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２を参照されたい）。実質的な精製とは、他のタンパク質または細胞構成成分からの精製を示す。実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％純粋である。したがって、特定の非限定的な一例では、実質的に精製されたタンパク質は、他のタンパク質または細胞構成成分を９０％含まない。

【0081】

したがって、精製されたという用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的な用語として意図されている。例えば、精製された核酸とは、核酸が、細胞内のその天然の環境にある核酸よりも富化されているものである。追加的な実施形態では、核酸調製物または細胞調製物は、核酸または細胞が、それぞれ調製物の総核酸含有量または総細胞含有量の少なくとも約６０％（例えば、これだけに限定されないが、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％など）になるように精製される。

【0082】

組換え：組換え核酸とは、天然に存在しない配列を有する、または、そうでなければ分離されている２つの配列のセグメントの人工的な組合せによって作出された配列を有する核酸である。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成によって、または、より一般には、単離された核酸のセグメントの人工的操作によって、例えば、遺伝子工学の技法によって実現される。

【0083】

強皮症：線維症（または硬化）、血管の変質、および自己抗体を特徴とする慢性自己免疫疾患。２つの主要な形態があり、１つは、全身性のものであり、手、腕および顔に主に影響を及ぼす限局性の皮膚強皮症を含むが、肺高血圧症の頻度が高い。びまん性皮膚強皮症（または全身性硬化症）は、急速に進行し、皮膚および１つまたは複数の内臓、頻繁には腎臓、食道、心臓および肺の大きな領域に影響を及ぼす。全身性強皮症はそのどちらの形態でも致死的であり得る。強皮症の他の形態は、２つの亜型：斑状強皮症および線状強皮症を有する局在性のものである。本開示のエンドスタチンペプチドは、あらゆる形態の強皮症を治療するために使用することができる。

【0084】

選択的にハイブリダイズする：関連しないヌクレオチド配列が排除される中程度または高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション。

【0085】

核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを実現するために使用される条件は、ハイブリダイズさせる核酸の性質に応じて変動する。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、ＧＣ対ＡＴ含量）、および核酸型（例えば、ＲＮＡであるかＤＮＡであるか）がハイブリダイゼーション条件の選択において考慮され得る。追加的な考察は、核酸の一方が、例えばフィルター上に固定化されているかどうかである。

【0086】

漸進的に高くなるストリンジェンシー条件の具体的な例は以下の通りである：２×ＳＳ
Ｃ／０．１％ＳＤＳ、ほぼ室温（ハイブリダイゼーション条件）；０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、ほぼ室温（低ストリンジェンシー条件）；０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、約４２℃（中程度のストリンジェンシー条件）；および０．１×ＳＳＣ、約６８℃（高ストリンジェンシー条件）。当業者は、これらの条件の変動を容易に決定することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１～３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）。洗浄は、これらの条件のうちの１つのみ、例えば高ストリンジェンシー条件を使用して行うこともでき、条件のそれぞれを、例えば、それぞれ１０～１５分にわたって、上に列挙されている順序で、列挙されている任意のまたは全てのステップを反復して、使用することもできる。しかし、上記の通り、最適な条件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変動し、経験的に決定することができる。

【0087】

配列同一性：アミノ酸配列間の類似性は、他の点では配列同一性と称される配列間の類似性に関して表される。配列同一性は、百分率同一性（または類似性または相同性）に関して測定される頻度が高く、百分率が高いほど、２つの配列の類似性が高い。Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドのホモログまたはバリアントは、標準の方法を使用してアラインメントした際に、比較的高い程度の配列同一性を有する。

【0088】

比較のために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ ７３：２３７、１９８８；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１、１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１、１９８８；およびＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４、１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９、１９９４には、配列アラインメント方法および相同性算出の詳細な考察が示されている。

【0089】

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、１９９０）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を含めたいくつかの供給源から、および、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連した使用に関して、インターネット上で入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性をどのように決定するかについての記載は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。

【0090】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドのホモログおよびバリアントは、一般には、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ２．０、初期パラメーターに設定したギャップ挿入ｂｌａｓｔｐを使用して、エンドスタチンのアミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数して、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％の配列同一性を有することを特徴とする。約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のためには、ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ機能を使用し、初期パラメーター（ギャップ存在コスト（ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ）１１、および１残基当たりのギャップコスト（ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ
ｃｏｓｔ）１）に設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用する。短いペプチド（およそ３０アミノ酸未満）をアラインメントする場合、アラインメントは、ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ機能を使用し、初期パラメーター（オープンギャップ（ｏｐｅｎ ｇａｐ）９、エクステンションギャップ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ）１のペナルティ
）に設定したＰＡＭ３０行列を使用して実施されるべきである。参照配列に対してさらに高い類似性を有するタンパク質では、この方法によって評価した場合、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性など、百分率同一性の上昇が示される。配列全体未満を配列同一性について比較する場合、ホモログおよびバリアントは、一般には、１０～２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれらの類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。そのような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。これらの配列同一性の範囲は単に手引きとして提示されていることが当業者には理解されよう。全面的に、提示されている範囲外の強力に意味のあるホモログが得られ得る可能性がある。

【0091】

治療有効量：治療される対象において所望の効果を実現するために十分な、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドなどの化合物の分量。例えば、治療有効量は、対象における皮膚線維症または肺線維症などの線維症を治療するまたは好転させるために必要な量であり得る。一部の実施形態では、治療有効量は、対象をある期間にわたって測定可能な量で治療するため、または対象における疾患の進行を測定可能な程度に阻害するために必要な量である。他の実施形態では、治療有効量は、疾患を予防的に阻害するために必要な量である。

【0092】

有効量のＣ末端エンドスタチンポリペプチドは、単回投薬で、または、複数回投薬で、例えば治療の経過中毎日、投与することができる。しかし、有効量は、適用される化合物、治療される対象、苦痛の重症度および型、ならびに化合物の投与様式に左右される。

【0093】

形質導入された：形質導入された細胞とは、分子生物学技法によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で使用される場合、形質導入という用語は、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速による裸のＤＮＡの導入を含めた、核酸分子をそのような細胞に導入することができる全ての技法を包含する。

【0094】

ベクター：宿主細胞に導入されると、それにより、形質転換された宿主細胞を生じさせる核酸分子。ベクターは、複製開始点などの、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１種または複数種の選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターとしては、グラム陰性菌細胞およびグラム陽性菌細胞における発現のためのプラスミドを含むプラスミドベクターが挙げられる。例示的なベクターとして、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおける発現のためのベクターが挙げられる。ベクターとして、例えば、これだけに限定されないが、レトロウイルスベクター、オルソポックスベクター、アビポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、スイポックスベクター、アデノウイルスのベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスおよびポリオウイルスベクターなどのウイルスベクターも挙げられる。ベクターとして、酵母細胞および昆虫細胞における発現のためのベクターも挙げられる。

【0095】

特に説明がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明らかでない限り、複数の指示対象を包含する。同様に、「または（ｏｒ）」という単語は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、「および（ａｎｄ）」を含
むものとする。核酸またはペプチドに関してもたらされる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は、概算値であり、説明のために提示されるものであることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料が下に記載されている。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、用語の説明を含めた本明細書により支配される。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。

【0096】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチド
Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドおよびそのバリアントが本明細書に開示されている。ポリペプチドは、これだけに限定することなく、強皮症などの線維化状態において存在する線維症を阻害し得る。ポリペプチドは、Ｃ末端エンドスタチンタンパク質のアミノ酸配列を含有するが、全長エンドスタチンは含まない。エンドスタチンタンパク質は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ科の動物、ネコ科の動物、ウマ科の動物、ウシ科の動物、ヒツジのような動物、ヒツジ、または齧歯類（例えば、マウスまたはラット）に由来するものなどの哺乳動物タンパク質であり得る。ヒトエンドスタチン（配列番号２として記載されているアミノ酸配列）をコードする例示的なヌクレオチド配列は、
ATGCACAGCC ACCGCGACTT CCAGCCGGTG CTCCACCTGG TTGCGCTCAA CAGCCCCCTG
TCAGGCGGCA TGCGGGGCAT CCGCGGGGCC GACTTCCAGT GCTTCCAGCA GGCGCGGGCC
GTGGGGCTGG CGGGCACCTT CCGCGCCTTC CTGTCCTCGC GCCTGCAGGA CCTGTACAGC
ATCGTGCGCC GTGCCGACCG CGCAGCCGTG CCCATCGTCA ACCTCAAGGA CGAGCTGCTG
TTTCCCAGCT GGGAGGCTCT GTTCTCAGGC TCTGAGGGTC CGCTGAAGCC CGGGGCACGC
ATCTTCTCCT TTAACGGCAA GGACGTCCTG ACCCACCCCA CCTGGCCCCA GAAGAGCGTG
TGGCATGGCT CGGACCCCAA CGGGCGCAGG CTGACCGAGA GCTACTGTGA GACGTGGCGG
ACGGAGGCTC CCTCGGCCAC GGGCCAGGCC TACTCGCTGC TGGGGGGCAG GCTCCTGGGG
CAGAGTGCCG CGAGCTGCCA TCACGCCTAC ATCGTGCTAT GCATTGAGAA CAGCTTCATG
ACTGCCTCCA AGTAG（配列番号１）である。

【0097】

全て参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ０３０５８２．３；ＮＭ１３０４４４．２；ＮＭ１３０４４５．２も参照されたい。

【0098】

ヒトエンドスタチン（配列番号１３として記載されているアミノ酸配列）をコードする別の例示的なヌクレオチド配列は、
CACAGCCACCGC GACTTCCAGC CGGTGCTCCACCTGGTTGCG CTCAACAGCC CCCTGTCAGG
CGGCATGCGG GGCATCCGCG GGGCCGACTTCCAGTGCTTC CAGCAGGCGC GGGCCGTGGG
GCTGGCGGGC ACCTTCCGCG CCTTCCTGTCCTCGCGCCTG CAGGACCTGT ACAGCATCGT
GCGCCGTGCC GACCGCGCAG CCGTGCCCATCGTCAACCTC AAGGACGAGC TGCTGTTTCC
CAGCTGGGAG GCTCTGTTCT CAGGCTCTGAGGGTCCGCTG AAGCCCGGGG CACGCATCTT
CTCCTTTGAC GGCAAGGACG TCCTGAGGCACCCCACCTGG CCCCAGAAGA GCGTGTGGCA
TGGCTCGGAC CCCAACGGGC GCAGGCTGACCGAGAGCTAC TGTGAGACGT GGCGGACGGA
GGCTCCCTCG GCCACGGGCC AGGCCTCCTCGCTGCTGGGG GGCAGGCTCC TGGGGCAGAG
TGCCGCGAGC TGCCATCACG CCTACATCGTGCTCTGCATT GAGAACAGCT TCATGACTGC
CTCCAAGTAG（配列番号１２）である。

【0099】

配列番号１によりコードされる、例示的なヒトエンドスタチンポリペプチド配列は、
HSHRDFQPVL HLVALNSPLS GGMRGIRGAD FQCFQQARAV GLAGTFRAFL SSRLQDLYSI
VRRADRAAVP IVNLKDELLF PSWEALFSGS EGPLKPGARI FSFNGKDVLTHPTWPQKSVW
HGSDPNGRRL TESYCETWRT EAPSATGQAY SLLGGRLLGQ SAASCHHAYI VLCIENSFMTASK（配列番号２
）である。

【0100】

このタンパク質は、１８３アミノ酸の長さであり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＦ０１３１０と、ＡＡＦ０１３１０の開始メチオニンを欠く以外は同一である）。

【0101】

配列番号１２によりコードされる例示的なヒトエンドスタチンポリペプチド配列は、
HSHRDFQPVL HLVALHSPLS GGMRGIRGAD FQCFQQARAV GLAGTFRAFL SSRLQDLYSI
VRRADRAAVP IVNLKDELLF PSWEALFSGS EGPLKPGARI FSFDGKDVLRHPTWPQKSVW
HGSDPNGRRL TESYCETWRT EAPSATGQAS SLLGGRLLGQ SAASCHHAYI VLCIENSFMTASK（配列番号１３）である。

【0102】

参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＣＡＢ９０４８２も参照されたい。

【0103】

配列番号２は、配列番号１３と、上記の配列番号２および１３において下線によって示されている３カ所のアミノ酸置換を除いて、同一である。

【0104】

マウスエンドスタチンをコードする例示的なヌクレオチド配列は、
CATACTCATC AGGACTTTCA GCCAGTGCTC CACCTGGTGG CACTGAACAC CCCCCTGTCT
GGAGGCATGC GTGGTATCCG TGGAGCAGAT TTCCAGTGCT TCCAGCAAGC CCGAGCCGTG
GGGCTGTCGG GCACCTTCCG GGCTTTCCTG TCCTCTAGGC TGCAGGATCT CTATAGCATC
GTGCGCCGTG CTGACCGGGG GTCTGTGCCC ATCGTCAACC TGAAGGACGA GGTGCTATCT
CCCAGCTGGG ACTCCCTGTT TTCTGGCTCC CAGGGTCAAC TGCAACCCGG GGCCCGCATC
TTTTCTTTTG ACGGCAGAGA TGTCCTGAGA CACCCAGCCT GGCCGCAGAA GAGCGTATGG
CACGGCTCGG ACCCCAGTGG GCGGAGGCTG ATGGAGAGTT ACTGTGAGAC ATGGCGAACT
GAAACTACTG GGGCTACAGG TCAGGCCTCC TCCCTGCTGT CAGGCAGGCT CCTGGAACAG
AAAGCTGCGA GCTGCCACAA CAGCTACATC GTCCTGTGCA TTGAGAATAG CTTCATGACC
TCTTTCTCCA AA（配列番号３）である。

【0105】

配列番号３によりコードされる例示的なマウスエンドスタチンポリペプチド配列は、
HTHQDFQPVL HLVALNTPLS GGMRGIRGAD FQCFQQARAV GLSGTFRAFL SSRLQDLYSI
VRRADRGSVP IVNLKDEVLS PSWDSLFSGS QGQLQPGARI FSFDGRDVLR HPAWPQKSVW
HGSDPSGRRL MESYCETWRT ETTGATGQAS SLLSGRLLEQ KAASCHNSYI VLCIENSFMT
SFSK（配列番号４）である。

【0106】

このタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＦ６９００９と同一である。他の種に由来するエンドスタチンヌクレオチドおよびアミノ酸配列も公的に入手可能である。

【0107】

一部の実施形態では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、エンドスタチンタンパク質のＣ末端領域の約１０個～約６０個の連続したアミノ酸を含有するが、全長エンドスタチンタンパク質、またはエンドスタチンタンパク質のＮ末端領域は含まない。ペプチドは、エンドスタチンタンパク質のＣ末端領域の約１０個から約５５個までの連続したアミノ酸または約２０個から約５４個までの連続したアミノ酸、例えば、エンドスタチンタンパク質（例えば、配列番号２など）のＣ末端領域の約５３個の連続したアミノ酸などを含み得る。例えば、ペプチドは、エンドスタチンタンパク質のＣ末端領域の約４０個、約４５個、約個、４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約５１個、約５２または約５３個の連続したアミノ酸、例えば、配列番号２、配列番号１３、または配列番号４などのエンドスタチン配列のアミノ酸９３～１８３などを含み得る。アミノ酸配列または核酸配列に関しては、「約」とは、１残基（指定の数よりも１つ多いまたは１つ少ない）範
囲内を意味する。

【0108】

エンドスタチンペプチドは、エンドスタチンタンパク質のＣ末端領域の４０個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、４０～４５個、４５～５０個、または５０～５５個の連続したアミノ酸を含み得る。一部の例では、ペプチドは、これだけに限定することなく、配列番号２、配列番号４、または配列番号１３などのエンドスタチンポリペプチドのＣ末端領域の４０個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個の連続したアミノ酸からなる。一部の実施形態では、ペプチドは、エンドスタチンのアミノ酸１３３～１８０の少なくとも３０アミノ酸、または抗線維症活性を有するそのバリアントを含むまたはそれからなる。

【0109】

エンドスタチンペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号１３などのエンドスタチンタンパク質の約アミノ酸１２０、１２５、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５～約アミノ酸１７５、１８０、１８１、１８２または１８３を含み得る、それからなり得る、またはそれから本質的になり得る。一部の例では、ペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号１３のアミノ酸１２０～１８３、１２５～１８３、１３０～１８３、１３１～１８３、１３２～１８３、１３４～１８３、１３５～１８３、１２０～１８０、１２５～１８０、１３０～１８０、１３１～１８０、１３２～１８０、１３３～１８０、１３４～１８０、または１３５～１８０を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。特定の例では、ペプチドは、配列番号２のアミノ酸１３３～１８０、配列番号４のアミノ酸１３３～１８０、配列番号１３のアミノ酸１３３～１８０を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。これに関連して、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、ペプチドが、追加的なアミノ酸残基は含まないが、標識などの追加的な構成成分は含み得ることを意味する。

【0110】

本明細書に開示されている他のエンドスタチンペプチドバリアントは、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドに対して少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を含み得る、それからなり得る、またはそれから本質的になり得る。Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、全長エンドスタチンタンパク質またはエンドスタチンタンパク質のＮ末端領域（例えば、配列番号２などのアミノ酸１～９２）を含まない。

【0111】

一部の非限定的な例では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、保存的アミノ酸置換などの置換を含み得、天然に存在するＣ末端エンドスタチンポリペプチド（配列番号２、４、または１３参照）において、最大で約１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所の置換で、抗線維症活性が保持されることが予測される。Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、最大で１カ所、最大で２カ所、最大で３カ所または最大で４カ所の、保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を含み得る。

【0112】

上記の配列と類似したポリペプチドは、置換、欠失または付加を含有し得る。差異は、例えば、ポリペプチドの、異なる種の間で有意に保存されていない領域におけるものであり得る。そのような領域は、種々の動物種に由来するエンドスタチンタンパク質のアミノ酸配列をアラインメントすることによって同定することができる。したがって、エンドスタチンペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号１３のアミノ酸１３３～１８０として記載されているアミノ酸のうちの少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも５０個、少なくとも５１個、少なくとも５２個、または全てを含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。あるいは、エンドスタチンペプチドは、これらの配列のうちの１つにおける最大で１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸置換を含み得、もたらされる
ペプチドは抗線維症活性を有する。ペプチドは、４０アミノ酸、４５アミノ酸、４６アミノ酸、４７アミノ酸、４８アミノ酸、４９アミノ酸、５０アミノ酸、５１アミノ酸、５２アミノ酸、５３アミノ酸、４０～４５アミノ酸、４５～５０アミノ酸、または５０～５５アミノ酸の長さであり得る。ペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号１３などのエンドスタチンの配列全体またはＮ末端領域を含まない。追加的な実施形態では、ペプチドは、最大で４０アミノ酸、４５アミノ酸、４６アミノ酸、４７アミノ酸、４８アミノ酸、４９アミノ酸、５０アミノ酸、５１アミノ酸、５２アミノ酸、または５３アミノ酸の長さ、例えば、４０アミノ酸、４５アミノ酸、４６アミノ酸、４７アミノ酸、４８アミノ酸、４９アミノ酸、５０アミノ酸、５１アミノ酸、５２アミノ酸、または５３アミノ酸の長さのペプチドなどである。

【0113】

一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、Ｃ末端アミドを含むように修飾される。本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドのいずれも、Ｃ末端アミドを含み得る。

【0114】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、エンドスタチンのアミノ酸１３３～１８０に３つのシステイン残基を含む。理論に束縛されることなく、３つのシステイン残基のうちの２つが、ペプチドの三次構造に重要な分子内ジスルフィド架橋の形成に関与すると考えられる。第３のシステイン残基は分子間相互作用に関与する可能性がある。一部の実施形態では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、システイン修飾を含み得る。システイン修飾は、任意のアミノ酸で置換することができる。一部の実施形態では、システイン修飾は、システインからアラニンへの置換であり得る。理論に束縛されることなく、システインのアラニンでの置換（例えば、Ｃ６７Ａ）により、本明細書に記載のＣ末端エンドスタチンポリペプチドの溶解性が増強され得ると考えられる。システインからアラニンへの置換を有する例示的なＣ末端エンドスタチンポリペプチドは配列番号１４に記載されている。

【0115】

以下は、ヒト（アミノ酸１３３～１８０）、マウス、ラット、およびウシのＸＶＩＩＩ型コラーゲンエンドスタチンのアミノ酸配列、およびヒトＸＶ型コラーゲンのアラインメントである：配列番号：

【0116】

【表2】

【0117】

アミノ酸１３３～１４１、１４５～１５３、１５５～１５８、１６２～１６６、および１６９～１８０は、エンドスタチン配列の間で保存されている（上記の２列目）。完全なヒトエンドスタチン配列については、配列番号２を参照されたい；完全なマウスエンドスタチン配列については、配列番号４を参照されたい；完全なラットエンドスタチン配列については、配列番号９を参照されたい；完全なウシエンドスタチン配列については、配列番号１０を参照されたい。完全なヒトＸＶ型コラーゲンは配列番号１１として提示されている。

【0118】

一部の実施形態では、上記のアラインメントの２列目のアミノ酸は、配列番号２、配列番号４、または配列番号１３の、ポリペプチドの抗線維症活性を保存するために保存され
得る領域を示す。さらなる実施形態では、ポリペプチドの抗線維症活性を保存するために、下線が引かれているアミノ酸が保持されるべきである。したがって、一部の実施形態では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号１３のアミノ酸１３３～１４１、１４５～１５３、１５５～１５８、１６２～１６６および１６９～１８０を含む。一部の実施形態では、１４５位のＡが保存される。

【0119】

本明細書においてＥ４と称されるポリペプチドは、Ｃ末端アミドを伴うヒトエンドスタチンのアミノ酸１３３～１８０である（配列番号２のアミノ酸１３３～１８０を参照されたい）。一部の実施形態では、抗線維症活性を保持するためにペプチド内に保持することができる領域は、保存されているＥ４の最初の７アミノ酸内の潜在的なリン酸化部位：ＳＹＣＥおよびＴＷＲ（それぞれＥ４のアミノ酸１～４および５～７、配列番号２または配列番号１３のアミノ酸１３３～１３６および１３７～１３９も参照されたい）の一方または両方を含む。一部の実施形態では、抗線維症活性を保持するためにペプチド内に保持することができる領域は、潜在的なミリストイル化部位：ＧＱａｙＳＬおよびＧＱｓａＡＳ（それぞれＥ４のアミノ酸１５～２０および２７～３２、配列番号２または配列番号１３のアミノ酸１４７～１５２およびアミノ酸１５９～１６４）の一方または両方を含む。したがって、一部の実施形態では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号１３のアミノ酸１３３～１８０における０カ所、または最大で１カ所、最大で２カ所、最大で３カ所、最大で４カ所、または最大で５カ所の置換であって、配列番号２、配列番号４、または配列番号１３のアミノ酸１３３～１４１、１４５～１５３、１５５～１５８、１６２～１６６、および１６９～１８０内のものではない置換を含み、Ｃ末端アミドを含む。

【0120】

他の実施形態では、ヒト配列とマウス配列の間で異なるアミノ酸を、抗線維症活性に影響を及ぼすことなく置換することができる。他の実施形態では、ヒト配列における上記の太字およびイタリック体で示されているアミノ酸は、抗線維症活性を保護しながら置換することができるアミノ酸である。例えば、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドにおいて、アミノ酸配列のアミノ酸１４２～１４４、１５４、１５９～１６１、および１８１～１８３を変更することができる。これらのアミノ酸は、例えば、上記（配列番号９～１０）の別の種において見いだされるアミノ酸で置換することができる。例えば、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、配列番号２または配列番号１３のアミノ酸１３３～１８０を含んでよく、ここで、アミノ酸１４２～１４４、１５４、およびアミノ酸１５９～１６１が置換されている。このポリペプチドはＣ末端アミドを含んでよい。

【0121】

これらまたは他の位置において置換すること、挿入することまたは欠失させることができる他のアミノ酸は、突然変異誘発試験とバイオアッセイの組合せによって同定することができる。上記のアラインメントは単にガイドラインとして提示されている。

【0122】

下記の融合ポリペプチドを含めた、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドを含有するポリペプチド（例えば、Ｅ３）の多量体も本発明に包含される。一部の実施形態では、多量体は、それぞれがＣ末端エンドスタチン断片を含む二量体、三量体、または四量体であり得る。

【0123】

エンドスタチンポリペプチドを検出、精製、安定化、または可溶化するために使用することができるペプチドなどの異種ペプチドと融合したＣ末端エンドスタチンポリペプチドも本発明に包含される。これらのポリペプチドは、全長エンドスタチンタンパク質またはエンドスタチンタンパク質のＮ末端領域を含まない。一部の実施形態では、Ｃ末端ポリペプチドのＮ末端に免疫グロブリン（Ｉｇ）定常重鎖または軽鎖ドメインまたはその一部を連結することができる。例えば、これだけに限定することなく、配列番号２、配列番号４、配列番号１３（例えば、Ｅ４）、または配列番号１４のアミノ酸１３３～１８０などの
ポリペプチドを重鎖のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインに連結することができる。定常領域が軽鎖に由来するものである場合、カッパ軽鎖に由来するものであってもラムダ軽鎖に由来するものであってもよい。定常領域が重鎖に由来するものである場合、以下の抗体のクラス：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＭの任意の１つの抗体に由来するものであってよい。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であってよい。定常ドメインは、Ｆｃ断片であってよい。定常ドメインは、ヒト抗体などの哺乳動物の抗体に由来するものであってよい。可溶性受容体－ＩｇＧ融合タンパク質は、一般的な免疫学的試薬であり、それらを構築するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３８号、同第５，７２６，０４４号；同第５，７０７，６３２号；同第７５０，３７５号、同第５，９２５，３５１号、同第６，４０６，６９７号およびＢｅｒｇｅｒｓら Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ ２８４：８０８－１２を参照されたい）。一例では、免疫グロブリンは、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部分であり、ヒンジ領域において２つの重鎖間の二量体化が起こる。Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを融合ポリペプチドの一部として含めることにより、Ｆｃ領域を含むポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ循環半減期、および当該ポリペプチドを含むオリゴマーまたは二量体のｉｎ ｖｉｖｏ循環半減期が増大することが理解される。

【0124】

ヒンジ領域、ならびにドメインＣＨ２およびＣＨ３を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ部分は、ヌクレオチド配列：
GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA（配列番号５）を有し、これは
、アミノ酸配列：
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys（配列番号６）を有するポリペプチ
ドをコードする。

【0125】

定常Ｉｇドメインは、１つまたは複数のエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体への結合および補体活性化を低下させるまたは排除する１つまたは複数の突然変異も含有し得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０、２３９～６
５頁（１９９２）；ＤｕｎｃａｎおよびＷｉｎｔｅｒ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：７３８－７４０；およびＸｕら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３４６９－３４７４）を参照されたい。例えば、ヒトＩｇＧ１のＬｅｕ２３５およびＰｒｏ３３１に対応するアミノ酸の、それぞれＧｌｕおよびＳｅｒへの突然変異がもたらされ、そのような構築物は、米国特許第６，６５６，７２８号にさらに記載されている。

【0126】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、例えばＣ末端エンドスタチンポリペプチドと異種ポリペプチドの間など、トロンビン切断部位を有するリンカー配列と連結することもできる。そのような部位をコードする例示的なヌクレオチド配列は、アミノ酸配列：Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ（配列番号８）を有するポリペプチドをコードする以下のヌクレオチド配列：５’ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＴＡ ＧＴＧ
ＣＣＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＧＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＴＧ ＣＡＧ３’（配列番号７）を有する。Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドはまた、シグナル配列と融合することもできる。例えば、組換えによって調製する場合、ペプチドをコードする核酸の５’末端にシグナル配列を連結し、その結果、ペプチドを細胞から分泌させることができる。

【0127】

ペプチドは、例えば、調製物中のペプチドの少なくとも約９０％が所望のペプチドである場合など、実質的に純粋な調製物として使用することができる。少なくとも約５０％、６０％、７０％、または８０％の所望のペプチドを含む組成物も使用することができる。ペプチドは、変性したものであっても変性していないものであってもよく、その結果として、凝集したものであっても凝集していないものであってもよい。

【0128】

本発明に包含される他のＣ末端エンドスタチンポリペプチドは、修飾されたアミノ酸を含むものである。例示的なペプチドは、それが由来するペプチドの少なくとも１つの生物学的機能が保持される、グリコシル化、ペグ化、リン酸化または任意の同様のプロセスによって修飾されたものであってよい誘導体ペプチドである。ペプチドは、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸も含んでよい。例えば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を置換または付加としてペプチドに導入することができる。非古典的なアミノ酸としては、これだけに限定されないが、一般に、一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４－ジアミノ酪酸、アルファ－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、ガンマ－Ａｂｕ、イプシロン－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ベータアラニン、フルオロ－アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばベータ－メチルアミノ酸、Ｃアルファ－メチルアミノ酸、Ｎアルファ－メチルアミノ酸など、およびアミノ酸類似体が挙げられる。一部の実施形態では、セレノメチオニンによる置換が有用であり得る（例えば、Ｘ線回析分析のために）。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）であってもＬ（左旋性）であってもよい。他の特定の実施形態では、配列内の１つまたは複数のアミノ酸を、１つまたは複数のアミノ酸とペプチド結合を形成することが可能な（したがって、「枝」を形成することが可能な）遊離の側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸類似体で置換することによってなどで、本明細書において列挙されているペプチドの分枝型がもたらされる。環式のペプチドも意図されている。

【0129】

例えばベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、ペグ化、公知の保護／ブロック基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子または他の細胞性リガンドなどとの連結によってなどで、合成中または合成後に示差的に修飾されるペプチド誘導体も包含される。特
定の実施形態では、ペプチドのＮ末端をアセチル化し、かつ／またはＣ末端をアミド化する。

【0130】

一例では、ペプチドは、カルボキシ末端アミドを含む。この型のＣ末端エンドスタチンポリペプチドの特定の非限定的な一例は、Ｅ４であり（例えば、配列番号１３のアミノ酸１３３～１８０を参照されたい）、これは、下の実施例の節に詳細に記載されている。このペプチド、または本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドのいずれも、Ｃ末端をアミド化することができる。

【0131】

化学修飾されたペプチドおよびペプチド模倣薬などのＣ末端エンドスタチンポリペプチドの誘導体も提供される。ペプチド模倣薬は、ペプチドおよびタンパク質に基づくまたはそれに由来する化合物である。ペプチド模倣薬は、非天然アミノ酸、コンフォメーション抑止、等配電子交換などを使用して公知のペプチド配列を構造的に修飾することによって得ることができる。対象ペプチド模倣薬は、ペプチドと非ペプチド合成構造の間の構造的空間の連続体を構成し、したがって、ペプチド模倣薬は、ファーマコフォアの描写において、およびペプチドを親ペプチドの活性を有する非ペプチド化合物に翻訳することの補助において有用であり得る。

【0132】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドのミモトープが本開示に含まれる。そのようなペプチド模倣薬は、非加水分解性（例えば、プロテアーゼまたは対応するペプチドを分解する他の生理的条件に対する安定性の増大）、細胞分化を刺激する特異性および／または効力の増大などの特質を有し得る。例として、ペプチド類似体は、例えば、ベンゾジアゼピン系薬（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８を参照されたい）、置換ガンマラクタム環（Ｇａｒｖｅｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、１２３頁）、Ｃ－７模倣物（Ｈｕｆｆｍａｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、１０５頁）、ケト－メチレン偽ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎら（１９８６）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ
２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅおよびＦｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｉｌｌ．、１９８５）、β－ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉら（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；およびＳａｔｏら（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、β－アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２６：４１９；およびＤａｎｎら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）、ジアミノケトン（Ｎａｔａｒａｊ ａｎら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２４：１４１）、ならびにメチレンアミノ修飾（Ｒｏａｒｋら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、１３４頁）を使用して生成することができる。また、一般に、Ｓｅｓｓｉｏｎ ＩＩＩ：Ａｎａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８を参照されたい。

【0133】

ペプチド模倣薬を生成するために行うことができる種々の側鎖の置き換えに加えて、本
開示では、コンフォメーションが抑止されたペプチド二次構造の模倣物の使用が具体的に意図されている。ペプチドのアミド結合に対する多数の代替が開発されてきた。アミド結合に対する頻繁に活用される代替としては、以下の群（ｉ）トランス－オレフィン、（ｉｉ）フルオロアルケン、（ｉｉｉ）メチレンアミノ、（ｉｖ）ホスホンアミド、および（ｖ）スルホンアミドが挙げられる。さらに、ペプチドの骨格のより実質的な修飾に基づくペプチド模倣薬を使用することができる。このカテゴリーに入るペプチド模倣薬としては、（ｉ）レトロインベルソ類似体、および（ｉｉ）Ｎ－アルキルグリシン類似体（いわゆるペプトイド）が挙げられる。さらに、コンビナトリアルケミストリーの方法を使用して、ペプチド模倣薬を作製することができる。例えば、いわゆる「ペプチドモーフィング」戦略の一部の実施形態では、広範囲のペプチド結合置換を含むペプチド類似体のライブラリーのランダムな生成に焦点が当てられる。例示的な実施形態では、ペプチド模倣物は、ペプチドのレトロインベルソ類似体として得ることができる。そのようなレトロインベルソ類似体は、Ｓｉｓｔｏら、米国特許第４，５２２，７５２号に記載されているものなどの、当技術分野で公知の方法に従って作出することができる。レトロインベルソ類似体は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／０１７２０号に記載されている通り生成することができる。一部通常のペプチド連結を含むものなどの混合ペプチドを生成することができる。一般的な指針として、一般には、タンパク質分解を最も受けやすい部位を変更し、より受けにくいアミド結合を模倣切り換えの選択肢とする。最終生成物、またはその中間体は、ＨＰＬＣによって精製することができる。

【0134】

一部の実施形態では、ペプチドは、Ｄ立体異性体である少なくとも１つのアミノ酸またはあらゆるアミノ酸を含んでよい。他のペプチドは、少なくとも１つの逆転したアミノ酸を含んでよく、逆転したアミノ酸は、Ｄ立体異性体であってよい。ペプチドのあらゆるアミノ酸が逆転したものであってよく、かつ／またはあらゆるアミノ酸がＤ立体異性体であってよい。別の例示的な実施形態では、ペプチド模倣物は、ペプチドのレトロエナンチオ類似体として得ることができる。このようなレトロエナンチオ類似体は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０１７２０号に記載されている通り、市販のＤ－アミノ酸（またはその類似体）および標準の固相または液相ペプチド合成技法を用いて合成することができる。最終生成物をＨＰＬＣによって精製して、純粋なレトロエナンチオ類似体を得ることができる。さらに別の例示的な実施形態では、対象ペプチドに対するトランス－オレフィン誘導体を作出することができる。トランス－オレフィン類似体は、Ｓｈｕｅら（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８：３２２５の方法に従って、および、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０１７２０に記載されている通り合成することができる。上記の方法によって合成された偽ジペプチドを他の偽ジペプチドとカップリングして、アミド官能性の代わりにいくつかのオレフィン系官能性を有するペプチド類似体を作出することがさらに可能である。さらに別のクラスのペプチド模倣物誘導体として、ホスホン酸誘導体が挙げられる。そのようなホスホン酸誘導体の合成は、公知の合成スキームから適応させることができる（例えば、Ｌｏｏｔｓら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｅｓｃｏｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｅｉｄｅｎ、１９８８、１１８頁））；Ｐｅｔｒｉｌｌｏら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｉｌｌ．、１９８５）を参照されたい。

【0135】

多くの他のペプチド模倣構造が当技術分野で公知であり、対象ペプチド模倣薬への使用に容易に適応させることができる。例えば、ペプチド模倣物に１－アザビシクロ［４．３．０］ノナン代替物（Ｋｉｍら（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：２８４７を参照されたい）、またはＮ－アシルピペラズ酸（Ｘｉら（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：８０を参照されたい）、または制約されたアミノ酸類似体として２置換ピペラジン部分（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．、Ｃｈｅｍ．３９：１３
４５－１３４８を参照されたい）を組み入れることができる。さらに他の実施形態では、ある特定のアミノ酸残基を単環式または二環式芳香族または複素芳香族核、または二芳香族、芳香族－複素芳香族、または二複素芳香族核などのアリールおよびビアリール部分で置き換えることができる。対象ペプチド模倣薬は、例えば、コンビナトリアル合成技法とハイスループットなスクリーニングの組合せによってなどで最適化することができる。さらに、ミモトープの他の例としては、これだけに限定されないが、タンパク質に基づく化合物、炭水化物に基づく化合物、脂質に基づく化合物、核酸に基づく化合物、天然の有機化合物、合成により得られる有機化合物、抗イディオタイプ抗体および／または触媒抗体、またはその断片が挙げられる。ミモトープは、例えば、天然化合物および合成化合物のライブラリーを、線維症を阻害することが可能な化合物についてスクリーニングすることによって得ることができる。ミモトープは、例えば、天然化合物および合成化合物のライブラリー、特に、化学的またはコンビナトリアルライブラリー（例えば、配列またはサイズが異なるが同じ構成要素を有する化合物のライブラリー）から得ることもできる。ミモトープは、例えば、合理的薬物設計によって得ることもできる。合理的薬物設計の手順では、本発明の化合物の三次元構造を、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）またはＸ線結晶構造解析によって解析することができる。次いで、三次元構造を使用して、潜在的なミモトープの構造を、例えばコンピュータモデリングによって予測することができる。次いで、予測されたミモトープ構造を、例えば、化学合成、組換えＤＮＡ技術によって、または天然の供給源（例えば、植物、動物、細菌および真菌）からミモトープを単離することによって作製することができる。

【0136】

開示されている方法において使用されるＣ末端エンドスタチンポリペプチドは全て抗線維化活性を有する。例えば、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドにより、線維症を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または本明細書に記載されているアッセイにおけるものなどの対照と比較して２倍、５倍、１０倍、３０倍もしくは１００倍、低減または阻害することができる。

【0137】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチド（アミド化された形態のペプチドを含む）は、当技術分野で周知の自動固相手順によって容易に合成することができる。固相合成のための技法および手順は、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ、ＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓより出版、１９８９に記載されている。あるいは、これらのペプチドは、例えば、Ｌｉｕら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：９３３－９３６、１９９６；Ｂａｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１－１８８７、１９９５；Ｔａｍら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５：２０９－２１６、１９９５；ＳｃｈｎｏｌｚｅｒおよびＫｅｎｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：２２１－２２５、１９９２；ＬｉｕおよびＴａｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４１４９－４１５３、１９９４；ＬｉｕおよびＴａｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６５８４－６５８８、１９９４；およびＹａｍａｓｈｉｒｏおよびＬｉ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３１：３２２－３３４、１９８８）に記載されている通り、セグメント縮合によって調製することができる。本開示のペプチドの合成に有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７－７０９２、１９８５に記載されている。本開示のペプチドは、合成ペプチドの商業的供給者から容易に購入することもできる。そのような供給者としては、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、Ｋｙ．）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）、Ａｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＣｅｌｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）が挙げられる。

【0138】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび宿主細胞
本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。これらのポリヌクレオチドとしては、目的のペプチドをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が挙げられる。コード配列のサイレント突然変異は、１つ超のコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る遺伝暗号の縮重（すなわち、重複性）に起因する。したがって、例えば、ロイシンは、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコードされる可能性があり、セリンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコードされる可能性があり、アスパラギンは、ＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされる可能性があり、アスパラギン酸は、ＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされる可能性があり、システインは、ＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされる可能性があり、アラニンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコードされる可能性があり、グルタミンは、ＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされる可能性があり、チロシンは、ＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされる可能性があり、イソロイシンは、ＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡによってコードされる可能性がある。標準の遺伝暗号を示す表は、種々の供給源において見いだすことができる（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．５ Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏ．、ＮＹ）を参照されたい。

【0139】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製系（３ＳＲ）およびＱβレプリカーゼ増幅系（ＱＢ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法によってクローニングまたは増幅することができる。例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分子のＤＮＡ配列に基づくプライマーを使用して、ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。多種多様なクローニングおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法体系は当業者に周知である。ＰＣＲ方法は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３、１９８７；およびＥｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９）に記載されている。ポリヌクレオチドはまた、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを、所望のポリヌクレオチドの配列から選択されるプローブを用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングすることによって単離することもできる。

【0140】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、自律複製性プラスミドもしくはウイルス内のベクターに組み込まれた、または原核生物もしくは真核生物ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた、または他の配列とは独立して別の分子（例えば、ｃＤＮＡなど）として存在する組換えＤＮＡを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾された形態であってよい。この用語は、一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡを包含する。

【0141】

一部の実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓなどの酵母における発現のためにベクターを使用する。構成的プロモーターである原形質膜Ｈ^＋－ＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ１）、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ－１（ＡＤＨ１）、および多面発現性薬物耐性ポンプ（ＰＤＲ５）などのいくつかのプロモーターが、酵母発現系において使用されることが公知である。さらに、ＧＡＬ１－１０（ガラクトースによって誘導される）、ＰＨＯ５（低細胞外無機リン酸によって誘導される）、およびタンデム熱ショックＨＳＥエレメント（３７℃までの温度上昇によって誘導される）などの多くの誘導性プロモーターが使用される。力価測定可能な誘導因子に応答して変動する発現を導くプロモーターとしては、メチオニン応答性ＭＥＴ３およびＭＥＴ２５プロモーターならびに銅依存性ＣＵＰ１プロモーターが挙げられる。これら
のプロモーターはいずれも、多コピー（２μ）または単一コピー（ＣＥＮ）プラスミドにクローニングして、発現レベルの調節においてさらなるレベルをもたらすことができる。プラスミドは、酵母における選択のための栄養マーカー（例えば、ＵＲＡ３、ＡＤＥ３、ＨＩＳ１、およびその他など）ならびに細菌における繁殖のための抗生物質耐性（ＡＭＰ）を含んでよい。Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおける発現のためのプラスミド、例えばｐＫＬＡＣ１などが公知である。したがって、一例では、細菌における増幅後、プラスミドを、細菌形質転換と同様の方法により、対応する酵母栄養要求株に導入することができる。ポリヌクレオチドはまた、昆虫細胞における発現用にデザインすることもできる。

【0142】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、種々の酵母株において発現させることができる。例えば、７種の多面的薬物耐性輸送体、ＹＯＲ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ５、ＹＣＦ１、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、およびＰＤＲ１５を、それらの活性化転写因子であるＰＤＲ１およびＰＤＲ３と共に、酵母宿主細胞において同時に欠失させ、それにより、得られる株を薬物に対して感受性にする。原形質膜の脂質組成が変化した酵母株、例えば、エルゴステロール生合成に欠陥のあるｅｒｇ６突然変異体なども利用することができる。タンパク質分解に対する感受性が高いタンパク質は、他の液胞型ヒドロラーゼの活性化を制御する主要液胞型エンドペプチダーゼ（ｍａｓｔｅｒ ｖａｃｕｏｌａｒ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ｐｅｐ４を欠く酵母において発現させることができる。対応するヌル突然変異体が生存不能である場合、遺伝子の温度感受性（ｔｓ）対立遺伝子を有する株における異種発現を使用することができる。

【0143】

本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするウイルスベクターを調製することもできる。ポリオーマ、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：１５３３１５３６）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ、１９９２、Ｃｕｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：３９－６；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、１９８８、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６－６２９；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：４４０７－４４１２；Ｑｕａｎｔｉｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２５８１－２５８４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６８：１４３－１５５；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：２２３３－２２３９；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ－Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１：２４１－２５６）、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４：４９５－４９９）、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９１－１２３；Ｏｎら、１９９０、Ｇｅｎｅ、８９：２７９－２８２）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含めたヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：６７－９０；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２９５２２９６５；Ｆｉｎｋら、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１１－１９；Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１：３３７－３７１；Ｆｒｅｓｓｅら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：２１８９－２１９９）、シンドビスウイルス（Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒら、１９９５、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１１６１－１１６７；米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号）、アルファウイルス（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８－２２；Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３７１－１１３７７）ならびにトリ起源のレトロウイルス（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：７４９－７５４；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：３３９１－３３９７）マウス起源のレトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：１－２４；Ｍｉｌｌｅｒら、１９
８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：４３１－４３７；Ｓｏｒｇｅら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：１７３０－１７３７；Ｍａｎｎら、１９８５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５４：４０１－４０７）、およびヒト起源のレトロウイルス（Ｐａｇｅら、１９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４：５３７０－５２７６；Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２７３１－２７３９）を含めたいくつものウイルスベクターが構築されている。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多核体病ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターも当技術分野で公知であり、商業的な供給源（例えば、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）などから入手することができる。

【0144】

したがって、一部の実施形態では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをウイルスベクターに含める。適切なベクターとしては、レトロウイルスベクター、オルソポックスベクター、アビポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、スイポックスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターが挙げられる。具体的な例示的ベクターは、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよび高度に減弱したワクシニアウイルス（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、アデノウイルス、バキュロウイルスなどである。

【0145】

使用されるポックスウイルスとしては、オルソポックスウイルス、スイポックスウイルス、アビポックスウイルス、およびカプリポックスウイルスが挙げられる。オルソポックスとしては、ワクシニア、エクトロメリア、およびアライグマポックスが挙げられる。使用されるオルソポックスの１つの例は、ワクシニアである。アビポックスとしては、鶏痘、カナリアポックスおよび鳩痘が挙げられる。カプリポックスとしては、山羊痘および羊痘が挙げられる。一例では、スイポックスは、豚痘である。発現用のポックスウイルスベクターの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１６５，４６０号に記載されている。使用することができる他のウイルスベクターとしては、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスなどの他のＤＮＡウイルス、ならびにレトロウイルスおよびポリオなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。

【0146】

適切なベクターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９９８，２５２号において開示されている。一例では、組換えワクシニアウイルスなどの組換えポックスウイルスを、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードする、天然では隣接ワクシニア調節ＤＮＡ配列と連続していないＤＮＡ配列と隣接したワクシニア調節配列またはそれと機能的に等価のＤＮＡ配列を含有するキメラ遺伝子を挿入することによって合成的に改変する。そのようなキメラ遺伝子を含有する組換えウイルスは、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドを発現させるのに有効である。一例では、ワクチンウイルスベクターは、（Ａ）（ｉ）Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列および（ｉｉ）Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に近接し、それに対して転写制御を及ぼすものであり、前記セグメントに隣接するポックスウイルスプロモーターで構成されるセグメント、（Ｂ）ポックスウイルスゲノムの必須でない領域に由来するＤＮＡを含む。ウイルスベクターは、選択マーカーをコードし得る。一例では、ポックスウイルスは、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子を含む（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９９８，２５２号を参照されたい）。

【0147】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポックスウイルスベクターは、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結した少なくとも１つ
の発現制御エレメントを含む。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御および調節するためにポックスウイルスベクターに挿入される。これらのベクターにおいて使用される発現制御エレメントの例としては、これだけに限定されないが、ｌａｃ系、ファージラムダのオペレーター領域およびプロモーター領域、酵母プロモーターおよびポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスまたはＳＶ４０が挙げられる。追加的な作動可能なエレメントとしては、これだけに限定されないが、宿主系におけるＣ末端エンドスタチンポリペプチドをコードする核酸配列の適切な転写およびその後の翻訳に必要なリーダー配列、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよび任意の他の配列が挙げられる。発現ベクターは、核酸配列を含有する発現ベクターの宿主系への移入およびその後の複製に必要な追加的なエレメントを含有し得る。そのようなエレメントの例としては、これだけに限定されないが、複製開始点および選択マーカーが挙げられる。そのようなベクターは従来の方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）を使用して容易に構築され、また、市販されていることも当業者には理解されよう。

【0148】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡウイルスを調製するための基本的な技法は、当技術分野で公知である。そのような技法は、例えば、ドナープラスミド内のＤＮＡ配列に隣接するウイルスＤＮＡ配列と親ウイルス内に存在する相同な配列の間の相同組換えを伴う（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：７４１５－７４１９）。特に、ポックスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを遺伝子の送達に使用することができる。ベクターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０９３，２５８号に記載されている鶏痘ウイルスの合成組換え体を創出するための方法と類似したステップなどの当技術分野で公知のステップによって構築することができる。他の技法は、親ウイルスベクター内に天然に存在するまたは人工的に挿入された独特の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して異種ＤＮＡを挿入することを含む。

【0149】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞にＤＮＡを移入することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることができる。細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。この用語は、対象とする宿主細胞の任意の後代も包含する。複製の間に突然変異が起こり得るので、全ての後代が親細胞と同一ではない可能性があることが理解される。安定に移入する、つまり、外来ＤＮＡを宿主内で連続的に維持する方法は、当技術分野で公知である。

【0150】

上記の通り、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結することができる。コード配列に作動可能に連結される発現制御配列は、発現制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が実現されるようにライゲーションされる。発現制御配列としては、これだけに限定されないが、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、その遺伝子の、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にする正確な読み枠の維持、および終止コドンが挙げられる。

【0151】

宿主細胞としては、微生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞および哺乳動物宿主細胞を挙げることができる。

【0152】

真核生物配列またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を原核生物において発現させる方法は当技術分野で周知である。適切な宿主細胞の非限定的な例としては、細菌、古細菌、昆虫、真菌（例えば、酵母）、植物、および動物細胞（例えば、ヒトなどの哺乳動物細胞
）が挙げられる。使用される例示的な細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、および不死化哺乳動物骨髄系細胞株およびリンパ系細胞株が挙げられる。哺乳動物細胞を培養物中で繁殖させるための技法は周知である（ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ（編）、１９７９、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ ５８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。一般に使用される哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株があるが、より高い発現、望ましいグリコシル化パターン、または他の特徴がもたらされるようにデザインされた細胞などの細胞株を使用することができる。上記の通り、ポリエチレングリコール形質転換、プロトプラスト形質転換および遺伝子銃などの、酵母細胞を形質転換するための技法も当技術分野で公知である（ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３５０：８７－９６、２００２を参照されたい）。

【0153】

組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技法によって行うことができる。宿主が、例えば、これだけに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことが可能なコンピテント細胞は、当技術分野で周知の手順を使用して指数関数的成長相後に採取し、その後、ＣａＣｌ_２方法によって処理した細胞から調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ_２またはＲｂＣｌを使用することができる。形質転換は、所望であれば、宿主細胞のプロトプラストを形成した後に、またはエレクトロポレーションによって実施することもできる。

【0154】

宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、リポソームに入れたプラスミドの微量注射、エレクトロポレーション、挿入などの従来の機械的手順、またはウイルスベクターのなどのＤＮＡのトランスフェクション方法を使用することができる。真核細胞は、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子を用いて同時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用して真核細胞を一過性に感染させるまたは形質転換し、タンパク質を発現させることである（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ編、１９８２）を参照されたい。

【0155】

エンドスタチン断片およびバリアントは、植物において産生させることもできる。例えば、ポリペプチドを、例えば、米国特許第７，４９１，５０９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている通り、ＩＢＩＯＬＡＵＮＣＨ（商標）遺伝子発現プラットフォーム（ｉＢｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用して植物において発現させることができる。ＩＢＩＯＬＡＵＮＣＨ（商標）プラットフォームを使用して、非トランスジェニック植物体において高レベルの標的タンパク質を産生させることができる。このプラットフォームには、動物細胞または微生物を利用する利用する方法と比較して、また、トランスジェニック植物を必要とする系と比較して、利点があり得る。

【0156】

この系を使用するために、所望の遺伝子をＩＢＩＯＬＡＵＮＣＨ（商標）ベクターにクローニングし、これを、植物の葉に導入する（例えば、自動真空浸潤によって）。次の４～７日間にわたってベクターを幹および葉の細胞に拡散させ、そこで所望のタンパク質を非常に高レベルで発現させる。次いで、緑色植物性材料を採取し、タンパク質産物を精製する。同じ設備で新しい植物作物を用いて異なるタンパク質についてＩＢＩＯＬＡＵＮＣＨ（商標）遺伝子発現プロセス全体を繰り返すことができ、これにより、この技術がタン
パク質薬物およびワクチンを作製するための最も柔軟かつ高速なやり方になっている。

【0157】

植物における発現ベクター系は、１つまたは複数のウイルスベクター構成成分を含み得る。種々の植物種に感染し、ポリヌクレオチドの発現に使用することができる多種多様なウイルスが公知である。植物に感染するウイルスの科としては、限定することなく、Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ（ｄｓＤＮＡ）、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ（ｓｓＤＮＡ）、ＲｅｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ（ｄｓＲＮＡ）、およびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＣｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ（ｓｓＲＮＡ）が挙げられる。さらなる情報は、例えば、１９９５その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる「Ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｓｉｘｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ」（Ｍｕｒｐｈｙら編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（Ｇｒｉｅｒｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｉｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、１２６～１４６頁、１９８４；Ｇｌｕｚｍａｎら、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ、１７２～１８９頁、１９８８；およびＭａｔｈｅｗ、Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｏｎｌｉｎｅも参照されたい）において見いだすことができる。

【0158】

局所（葉内）感染または全身感染のいずれかを首尾よく確立するために、ウイルスは、複製可能でなければならない。多くのウイルスは、複製プロセスに関与する１種または複数種のタンパク質（本明細書では、複製タンパク質またはレプリカーゼタンパク質と称される）をコードする遺伝子を含有する。例えば、多くのＲＮＡ植物ウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼをコードする。ヘリカーゼまたはメチルトランスフェラーゼタンパク質（１つまたは複数）などの追加的なタンパク質も必要になり得る。ウイルスゲノムは、複製タンパク質をコードする機能的遺伝子に加えて、同様に複製のために必要であるまたは複製を容易にする種々の配列構成成分を含有し得る。

【0159】

植物に感染する任意のウイルスを使用して、本明細書に記載の方法に従ってウイルスベクターまたはベクター系を調製することができる。ｓｓＲＮＡウイルス、特に（＋）鎖ゲノムを有するものが特に有用であり得る。そのようなウイルス内に存在する遺伝子材料を操作するための技法および試薬としては、当技術分野で周知のものが挙げられる。一般には、例えば、ウイルスゲノムのＤＮＡコピーを調製し、微生物ベクター（例えば、細菌ベクター）にクローニングする。ジェミニウイルスを含めたある特定のｓｓＤＮＡウイルスが特に有用である。一般に、ベクターおよびウイルスゲノムはＲＮＡまたはＤＮＡの形態で存在し得ることが理解されよう。さらに、ＤＮＡベクター内に存在するＲＮＡウイルスのゲノムまたはその一部などの特徴を参照する場合、特徴はＲＮＡ形態のＤＮＡコピーとして存在することが理解されるべきである。

【0160】

いくつもの異なる型のウイルスを使用することができる。適切なウイルスとしては、例えば、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅのメンバー（例えば、ブロモウイルス、アルファモウイルス、イラルウイルス）およびＴｏｂａｍｏｖｉｒｉｄａｅのメンバーが挙げられる。有用なウイルス種としては、例えば、アルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）、リンゴクロロティックリーフスポットウイルス、リンゴステムグルービングウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス、オオムギ黄化萎縮ウイルス、ビート萎黄ウイルス、ソラマメモットルウイルス、ソラマメウイルトウイルス、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）、カーネーション潜在ウイルス、カーネーションモザイクウイルス、カーネーションリングスポットウイルス、ニンジンモットルウイルス、キャッサバ潜在ウイルス（ＣＬＶ）、ササゲクロ
ロティックモットルウイルス、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、キュウリ緑斑モザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、レタス伝染性黄斑ウイルス、トウモロコシクロロティックモットルウイルス、トウモロコシラヤドフィノウイルス、トウモロコシ縞葉枯病ウイルス（ＭＳＶ）、パースニップ黄斑ウイルス、エンドウひだ葉モザイクウイルス、ジャガイモＸウイルス、ジャガイモウイルスＹ、ラズベリー黄化ウイルス、イネ壊死ウイルス（ＲＮＶ）、イネ縞葉枯ウイルス、イネツングロ球状ウイルス、ドクムギモザイクウイルス、土壌感染性ムギ類萎縮ウイルス、インゲンマメ南部モザイクウイルス、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコ壊死ウイルス、タバコ茎壊疽ウイルス、タバコリングスポットウイルス、トマトブッシースタントウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）、およびカブ黄斑モザイクウイルス（ＴＹＭＶ）が挙げられる。

【0161】

これらの植物ウイルスのエレメントを公知の技法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９；Ｃｌｏｖｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５；Ｄａｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７２：２８５－２９２、１９８９；Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１、１９８７；Ｆｒｅｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：１２９４－１２９７、１９８６；Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２６９：７３－７６、１９９０；ＹｕｓｉｂｏｖおよびＬｏｅｓｃｈ－Ｆｒｉｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０８（１）：４０５－７、１９９５；およびＳｐｉｔｓｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６（５）：２５４９－５３、１９９９を参照されたい）に従って遺伝子操作して、本明細書で提示されるエンドスタチンポリペプチドを含めた目的のポリペプチドの植物による産生に使用するためのウイルスベクターを生成する。少なくとも２種のベクターを使用し、その一方または両方が全身感染することができないものであるが、一緒になって、ベクターの少なくとも一方の全身感染を支持するために必要な全ての機能がもたらされ、植物体全体での目的のポリヌクレオチドの発現が可能になる。したがって、ウイルス構成成分はトランスで互いに補完しあって全身感染能をもたらすことができる。

【0162】

具体的には、産生体ベクターを調製する。このベクターは、関連する植物宿主における発現を導く調節配列の制御下で目的のポリヌクレオチド（例えば、エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドをウイルスプロモーター、例えばＣＰプロモーターの制御下に配置する。例えば、天然ウイルスＣＰ遺伝子を目的のポリヌクレオチドで置き換えることが望ましい場合がある。産生体ベクターは、全身移動に必要な１つまたは複数の構成成分を欠く。例えば、産生体ベクターは、機能的ＣＰ（例えば、ＣＰ遺伝子）の発現に十分な配列を含有しなくてもよいが、細胞間移動タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。産生体ベクターは、シスで存在する場合にウイルスの拡散を容易にするためにシスで必要になり得る１種または複数種の配列エレメント（例えば、集合開始点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ））を含有し得る。例えば、産生体ベクターは、産生ウイルスと同じ型のウイルスまたは別のウイルスのいずれかに由来する、ＣＰの活性に必要であるまたはそれを容易にする集合開始点を含有し得る。そのような配列エレメントは、ＣＰの認識部位を含み得る。他の実施形態では、産生体ベクターは、機能的ＭＰおよび／またはレプリカーゼタンパク質の発現に十分な配列を欠き得る。これらの実施形態では、産生体ベクターは、機能的ＣＰの発現に十分な配列を欠いてもよく欠いていなくてもよい。

【0163】

担体ベクターも調製する。このベクターは、産生体ベクターを補完し、その結果、産生体ベクターには欠けている、全身感染に必要な構成成分をもたらすものである。例えば、ある特定の担体ベクターは、機能的コートタンパク質をコードする構成成分を含む。これらの担体ベクターは、機能的コートタンパク質をコードする構成成分を欠く産生体ベクタ
ーを補完するのに適している。担体ベクターは、植物への全身感染を成功させるのに必要な少なくとも１つのウイルス構成成分（例えば、レプリカーゼまたは移動タンパク質をコードする遺伝子）が産生体ベクターには存在するのであれば、そのような構成成分を欠いてよい。担体ベクターは、目的のポリヌクレオチド（産生体ベクター内の目的のポリヌクレオチドと同じものであっても異なるものであってもよい）を含み得る。そのような場合では、組換え担体ベクターが非標的植物に拡散するのを最小限にするために、例えば、１つまたは複数の必要なシス作用性配列を欠くことが原因で全身感染に欠陥のある担体ベクターを使用することが望ましい。

【0164】

担体ベクターは、細胞間移動構成成分（例えば、細胞間移動タンパク質をコードする遺伝子または細胞間移動に必要な非コード構成成分）を含み得（しかし必要ではない）、かつ／または１つまたは複数のレプリカーゼタンパク質をコードする構成成分を欠き得る。担体ベクターが細胞間移動構成成分（例えば、機能的ＭＰをコードする部分）を含まない実施形態では、そのような構成成分を産生体ベクターに含めるべきである。

【0165】

完全なベクターセットは、全身ウイルス感染および目的のポリヌクレオチドの発現を成功させるのに必要な全ての構成成分を含む。「構成成分」という用語は、タンパク質コード配列およびシス作用性配列（例えば、プロモーター、集合開始点、ｍＲＮＡの非翻訳領域に対応する部分）などの非コード配列のどちらも含むものとする。異なるベクター、またはベクターエレメントは、異なる植物ウイルスに由来するものであってよい。実際、異なるウイルス特性（例えば、宿主域、プロモーター活性レベル、ビリオンの寸法など）を活用するために、異なるウイルスのエレメントからベクターを調製することが望ましい場合がある。

【0166】

一部の実施形態では、目的のポリヌクレオチド、レプリカーゼ遺伝子、および移動タンパク質遺伝子を含むが、機能的コートタンパク質をコードする構成成分を欠く産生体ベクターがもたらされ、コートタンパク質遺伝子を発現する担体ベクターがもたらされる。例えば、産生体ベクターは、ＴＭＶ ＣＰプロモーターの制御下でＴＭＶ ＣＰコード配列が目的のポリヌクレオチドで置き換えられた、ＴＭＶに基づくベクターを含み得る。この産生体ベクターは、全身的に移動することができない。野生型ＡｌＭＶベクターが担体ベクターとしての機能を果し得る。ＡｌＭＶベクターは、機能的コートタンパク質をコードする構成成分を含有する。産生体ベクターおよび担体ベクターの両方を同時感染させることにより、ＡｌＭＶベクターＣＰコード配列からＣＰが産生されてＴＭＶに基づくベクターが補完され、その結果、ＴＭＶに基づくベクターの全身移動、および最初に感染させたところではない葉におけるポリヌクレオチドの発現がもたらされる。あるいは、機能的ＣＰコード配列および作動可能に連結したプロモーターが存在するのであれば、ＡｌＭＶ ＣＰの発現に必要なもの以外の１つまたは複数のウイルス構成成分が除去されたＡｌＭＶに基づくベクター（例えば、機能的ＭＰまたは複製タンパク質をコードする構成成分を欠く、ＡｌＭＶに基づくベクター）を使用することができる。ＣＰは、ＡｌＭＶに由来するものであっても別のウイルスに由来するものであってもよい。

【0167】

一部の実施形態では、ＣＰにより、担体ベクターの全身移動が可能になり、他の実施形態では、担体ベクターの全身移動を可能にするものではないが、産生体ベクターの全身移動を可能にするＣＰが選択される。担体ベクターがＡｌＭＶ ＣＰの発現に必要なもの以外のウイルス構成成分のうちの１つまたは複数を欠くこれらの実施形態では、産生体ベクターにより担体ベクターを補完することができる。例えば、産生体ベクターにより、それぞれ担体ベクター（および、一部の場合では産生体ベクターも）の細胞間移動または複製を可能にする機能的ＭＰまたはレプリカーゼタンパク質コード配列などの構成成分を供給することができる。産生体または担体のいずれかが複製タンパク質をコードする構成成分（例えば、機能的ＲＮＡポリメラーゼをコードする構成成分）を欠き、他のベクター（そ
れぞれ担体または産生体）により、欠けている構成成分が供給される場合、多くの場合、複製機能の有効なトランス補完を実現するために、機能的複製構成成分を供給するベクターに由来するプロモーター（例えば、ゲノムプロモーター）を、機能的複製タンパク質をコードする構成成分を欠くベクターに挿入することが望ましいことが理解されよう。

【0168】

有用なウイルスベクター系の別の例は、目的のポリヌクレオチドがＡｌＭＶベクターに挿入され、ネイティブなＡｌＭＶ ＣＰをコードする構成成分が置き換えられた産生体ベクターを含む。目的のポリヌクレオチドはＡｌＭＶ ＣＰプロモーターの制御下に配置される。この産生体ベクターは、ＣＰを欠くので、全身感染することができないが、複製することができ、感染した葉の細胞間を移動することができる。この系は、ＡｌＭＶ ＣＰ
３’ＵＴＲを有するまたは有さない、ＡｌＭＶ ＣＰをコードする部分がＣＭＶベクターに挿入され、天然に存在するＣＭＶのゲノムにおいて見いだされるＣＭＶ ＣＰをコードする構成成分が置き換えられた、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）に基づく担体ベクターも包含する。ＡｌＭＶ ＣＰをコードする構成成分は、ＣＭＶ ＣＰプロモーターの制御下に配置される。このベクターは、ＡｌＭＶ ＣＰを発現する。産生体ベクターと担体ベクターの同時感染により、ＣＰを担体ベクターから発現させて、産生体ベクターが機能的ＣＰをコードする構成成分を欠くことをトランス補完することが可能になり、それにより、産生体ベクターの全身移動が可能になる。ＡｌＭＶ ＣＰにより、担体ベクターの全身移動も可能になる。

【0169】

一部の実施形態では、担体ベクターに由来するコード配列または非コード配列の一部を産生体ベクターに挿入することが望ましい場合があり、逆もまた同じである。例えば、ある特定の配列により、複製を増強するまたは細胞間または長距離の移動を容易にすることができる。特に、ある特定の配列は、ウイルス転写物とＣＰ（例えば、集合開始点）の複合体の形成の認識部位としての機能を果たし得る。そのような場合では、第２のウイルスベクターからトランスにもたらされたＣＰを使用して第１のウイルスベクターの全身移動を実現する場合、ＣＰの活性を容易にする第２のウイルスベクターを第１のウイルスベクターに挿入することが望ましい場合がある。そのような配列としては、例えば、ウイルス転写物３’ＵＴＲの一部または全部を挙げることができる。一部の場合では、ＡｌＭＶのＲＮＡ３ ３’ＵＴＲの一部または全部を、異なるウイルスベクター、例えば、ＴＭＶに基づくベクターに挿入する。この構成成分をＴＭＶに基づくベクターに含めることにより、ＡｌＭＶ ＣＰの、機能的ＴＭＶ ＣＰをコードする部分を欠くＴＭＶに基づくベクターをトランス補完する能力が助長される。この一般的な原理を、トランス補完ベクター、例えば、トランス補完産生体ベクターおよび担体ベクター系を含む任意のウイルスベクター系に適用できることが理解されよう。

【0170】

当業者には理解される通り、ベクターセットが、全身ウイルス感染することができない（例えば、１種または複数種の機能的複製タンパク質、移動タンパク質、またはコートタンパク質をコードする構成成分を欠く）産生体ベクターと、産生体ベクターでは欠如している機能（１つまたは複数）をもたらす担体ベクターとを含む限りは、そのセットは、本明細書に記載の方法に従って使用するのに適する。一部の実施形態では、個々のベクターのいずれも全身ウイルス感染することができないが、セットとしては、ベクターの一方または両方がそのような感染および目的のポリヌクレオチドの発現にコンピテントになる。そのような系により、いくつもの利点がもたらされ得る。例えば、産生体ベクターが担体ベクターの不在下で植物に感染する場合、全身感染はもたらされないことが理解されよう。これにより、目的のポリヌクレオチドが、標的植物と同じ種であってさえ、意図されたものではない（非標的）植物において発現するリスクが減少する。特に、担体ベクターが複製または細胞間移動にコンピテントでない場合（複製または細胞間移動に必要な構成成分を欠くことが原因で）、または担体ベクターが全身感染にインコンピテントである場合（例えば、長距離の移動に必要である集合開始点などのシス作用性配列を欠くことが原因
で）、産生体ベクターと担体ベクターの両方が意図されたものではない植物宿主に同時感染する可能性が著しく減少する。

【0171】

一般に、ウイルスの機能を保存するため、および単に遺伝子操作のしやすさでも、ベクターは、既存の植物ウイルスゲノムを変化させることによって（例えば、特定の遺伝子を除去することによって、および／または特定の配列を破壊もしくは置換してそれらを不活化するもしくは置き換えることによって）調製される。そのような状況では、ベクターは、天然ウイルスゲノムに対して非常に高い配列同一性を示す。当然、例えば、個々の所望の遺伝子エレメントを別々に単離し、それらを、場合によって追加的なエレメントを含めて連結し合わせることにより、完全に新規のベクターを調製することもできる。また、特定のベクターが、所与の遺伝子、タンパク質、または活性を欠く（例えば、産生体ベクターがコートタンパク質遺伝子を欠く）と言う場合には、ベクターが関連するコード配列を有してもよいが、それにもかかわらずそのようなタンパク質または活性のいずれも感染の条件下でベクターにより発現されなければ十分であることに留意するべきである。しかし、一般に、関連するコード配列をベクターから除去することが望ましい。

【0172】

類似して、ベクターが特定のタンパク質または活性を断定的に発現すると言う場合、関連する遺伝子が天然に見いだされる対応する遺伝子と同一である必要はない。例えば、時にはコートタンパク質に小さな欠失が許容され得ることが見いだされている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／４６３５０を参照されたい）。タンパク質が機能的である限りは、それを本明細書に記載の方法に従って使用することができる。しかし、一般に、天然のタンパク質に対して非常に高い配列同一性があることが最も有用であるとみなされる。例えば、大きな欠失（例えば、約２５アミノ酸超）は、一般に、回避されるべきである。一般には、ウイルスタンパク質は、対応する天然ウイルスタンパク質に対して少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を示す。より詳細には、ウイルスタンパク質は、一般には、関連する天然ウイルスタンパク質の重大な機能性部分（一般には、少なくともいくつかのアミノ酸、多くの場合、少なくとも１０アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、４０アミノ酸、５０アミノ酸または以上）に対して１００％の同一性を有するべきである。

【0173】

多くのタンパク質の場合に、機能活性、および／または、安定性などのタンパク質の種々の他の性質などに有意に影響を及ぼさない、いくつものアミノ酸の変化をなすことができることに留意する。特に、多くのタンパク質で、活性の有意な低下を伴わない保存的アミノ酸の変化－アミノ酸の、同様の性質を有する異なるアミノ酸での置換が許容される。保存的アミノ酸置換は、当技術分野で周知であり、アミノ酸配列を変更しながら、所与のポリペプチドと類似したまたは実質的に類似した性質を有するポリペプチドを得るための１つの手法である。一般に、アミノ酸は、（１）電荷（正、負、または非荷電）；（２）体積および極性；（３）グランサムの物理化学的距離；ならびにこれらの組合せに応じた群に分類され、分けられている。例えば、Ｚｈａｎｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、５０：５６－６８、２０００；Ｇｒａｎｔｈａｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、８５：８６２－８６４、１９７４；Ｄａｇａｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．、１９（７）、１０２２－１０２５、２００２；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｓｔｒｙｅｒら、Ｗ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、１９９５；および米国特許第６，０１５，６９２号を参照されたい。例えば、アミノ酸は、体積および極性に基づいて以下のカテゴリーに分けることができる：特別（Ｃ）；中性であり、小さい（Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ）；極性であり、比較的小さい（Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ）、極性であり、比較的大きい（Ｒ、Ｈ、Ｋ）、非極性であり、比較的小さい（Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ）、および非極性であり、比較的大きい（Ｆ、Ｗ、Ｙ）。保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を同じ群のアミノ酸で置き換える置換と定義することができる。したがって、所与のウイルスタンパク質において１つまたは複数の保存的アミ
ノ酸置換を行うことにより、種々の機能的に等価のタンパク質を得ることができる。

【0174】

ウイルスに感染しやすい任意の植物を本明細書に記載の方法に従って利用することができる。一般に、多くの場合、定義済みの条件下、例えば、温室および／または水性系における成長に適した植物を利用することが望ましい。発現したポリヌクレオチドが望ましくなく経口摂取される可能性があるという懸念を伴わずに成長させることができるように、一般にはヒトまたは家畜動物により消費されず、かつ／または一般にはヒト食物鎖の一部ではない植物を選択することも望ましい。しかし、他の実施形態では、食用植物を使用することが望ましい。

【0175】

多くの場合、ある特定の望ましい植物特性は、発現させる特定のポリヌクレオチドによって決定される。いくつか例を挙げると、ポリヌクレオチドが、高収率で産生させるタンパク質をコードする場合（多くの場合、例えば、治療用タンパク質を発現させる場合）、多くの場合、比較的高いバイオマスを有する植物（例えば、ウイルスに高度に感染しやすく、成長期間が短く、また、ヒト食物鎖の中に入っていない、さらなる利点を有するタバコ）を選択することが望ましい。ポリヌクレオチドが、完全な活性に特定の翻訳後修飾が必要である（またはそれによって阻害される）タンパク質をコードする場合、ある特定の植物種に、関連する修飾（例えば、特定のグリコシル化）を実現することができること（またはできないこと）により、選択が導かれ得る。

【0176】

一部の実施形態では、作物植物、または作物関連植物を利用する。一部の実施形態では、食用植物を利用する。

【0177】

本明細書に記載の方法に従って使用するのに適した植物としては、限定することなく、被子植物、コケ植物（例えば、Ｈｅｐａｔｉｃａｅ、Ｍｕｓｃｉなど）、シダ植物（例えば、シダ類、トクサ類、ヒカゲノカズラ類）、裸子植物（例えば、針葉樹、ｃｙｃａｓ、Ｇｉｎｋｏ、Ｇｎｅｔａｌｅｓ）、および藻類（例えば、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｍｙｘｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ、およびＥｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。一部の実施形態では、Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ科（Ｆａｂａｃｅａｅ科のメンバー；例えば、エンドウマメ、アルファルファ、ダイズ）；Ｇｒａｍｉｎｅａｅ科（Ｐｏａｃｅａｅ科のメンバー；例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ）；Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ科、特にＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属のメンバー（例えば、トマト）、Ｓｏｌａｎｕｍ属のメンバー（例えば、ジャガイモ、ナス）、Ｃａｐｓｉｕｍ属のメンバー（例えば、コショウ）、またはＮｉｃｏｔｉａｎａ属のメンバー（例えば、タバコ）；Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ科、特にＤａｕｃｕｓ属のメンバー（例えば、ニンジン）、Ａｐｉｕｍ属のメンバー（例えば、セロリ）、またはＲｕｔａｃｅａｅ属のメンバー（例えば、オレンジ）；Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ科のメンバー、特にＬａｃｔｕｃａ属のメンバー（例えば、レタス）；およびＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）科、特にＢｒａｓｓｉｃａまたはＳｉｎａｐｉｓ属のメンバーが特に有用であり得る。例えば、有用なＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ科のメンバーとしては、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｎｉｇｒａ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａｅ、Ｂ．ｔｏｕｒｎｉｆｏｒｔｉｉ、Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ、およびＲａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓが挙げられる。

【0178】

例えば、成熟植物、実生、芽、および種子を含めた任意の発生段階にある植物において、発現系を使用してポリヌクレオチドを感染させることおよび／または発現させることができる。発現系を使用して植物の任意の一部分（例えば、根、葉、幹など）を感染させることができる。一部の実施形態では、発現系を使用して芽を感染させる。一般に、植物は、正常な発芽温度を実現するのに必要なものを超える、光または熱の形態での外部の栄養
分またはエネルギーを必要としない実生であれば、芽であるとみなされる。多くの場合、２週齢未満、および一般には１０日齢未満の実生が芽とみなされる。

【0179】

一般に、ウイルスベクターは、公知の技法に従って植物に送達することができる。例えば、ベクター自体を植物に直接適用することができる（例えば、擦傷接種（ａｂｒａｓｉｖｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）、機械化噴霧接種、真空浸潤、粒子衝撃、またはエレクトロポレーションによって）。あるいは、ビリオンを調製し（例えば、すでに感染した植物から）、公知の技法に従って他の植物に適用することができる。

【0180】

上記の通り、一部の実施形態では、ウイルスベクターを芽に適用する（例えば、浸潤または機械的接種［噴霧］によって）。

【0181】

ウイルスゲノムを植物に直接適用することによって感染を実現させる場合、任意の利用可能な技法を使用してゲノムを調製することができる。例えば、本明細書に記載の方法に従って有用に使用される多くのウイルスは、ｓｓＲＮＡゲノムを有する。ｓｓＲＮＡは、ゲノムのＤＮＡコピーの転写によって、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかにおけるＲＮＡコピーの複製によって調製することができる。使いやすいｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写系（例えば、ＳＰ６、Ｔ７、網状赤血球溶解物など）の容易な利用可能性、および同じくＲＮＡベクターのＤＮＡコピーを維持することの利便性を考慮すると、ｓｓＲＮＡベクターは、多くの場合、特にＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製されることが予想される。

【0182】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチド発現産物を、それらを発現する植物組織から単離することが望ましい。そのような単離された産物を、それらの意図された使用（例えば、医薬品または診断剤として、試薬としてなど）のために製剤化することが望ましい場合もある。他の実施形態では、産物を、それらを発現する植物組織の一部または全部と共に製剤化することが望ましい。

【0183】

発現産物を、それを発現する植物組織の一部または全部から単離するために、任意の利用可能な精製技法を使用することができる。当業者は、広範囲の分画および分離手順に詳しい（例えば、Ｓｃｏｐｅｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｊａｎｓｏｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ、ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、１９９８；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１９９３；およびＲｏｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。多くの場合、産物を約５０％、好ましくは約６０％超、約７０％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、または約９９％超純粋なものにすることが望ましい。

【0184】

産物を植物性材料と共に製剤化するためには、多くの場合、関連するレシピエント（例えば、ヒトまたは他の動物）に対して毒性ではない植物が利用されていることが望ましい。関連する植物組織（例えば、葉）を単に採取し、発現産物の活性の維持を考慮した上で、当技術分野で公知の技法に従って処理することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、食用植物（特に植物の食用部分）において発現させることができ、その結果、その材料をその後食することができる。例えば、ポリヌクレオチドが、経口送達後に活性になる（適正に製剤化されている場合）栄養的に関連するタンパク質または治療用タンパク質をコードする場合、食用植物部分でタンパク質を産生させること、および、発現
したポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが発現された植物性材料の一部または全部と共に経口送達するために製剤化することが有用であり得る。

【0185】

ポリヌクレオチドが治療剤をコードするまたは産生するものである場合、公知の技法に従って製剤化することができる。例えば、有効量の医薬的に活性な産物を、１種または複数種の有機または無機の液体または固体の医薬的に適切な担体材料と共に製剤化することができる。医薬的に活性な産物は、タンパク質の生物活性が破壊されない限りは、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、溶液、カプセル剤、クリーム剤、軟膏剤、エアロゾル、分包散剤、溶液、溶媒、希釈剤、表面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、および固体結合などの剤形で使用することができる。

【0186】

医薬的に許容される担体としての機能を果し得る材料としては、これだけに限定されないが、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末化トラガント；モルト；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性の生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒性適合する滑沢剤、ならびに着色料、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、および香料、防腐剤が挙げられ、また、配合者の判断に従って、抗酸化剤も組成物中に存在してよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１９７５も参照されたい）。例えば、ポリヌクレオチド発現産物は、従来の混合造粒糖剤形成、溶解、凍結乾燥、または同様のプロセスにより、医薬組成物としてもたらすことができる。

【0187】

一部の実施形態では、皮下注射または筋肉内注射された医薬的に活性な産物（例えば、タンパク質）の吸収を遅らせることによって医薬調製物の効果を延長することが有用であり得る。これは、難水溶性の結晶性材料または非結晶性材料の液体懸濁液を使用することによって実現することができる。そのとき、産物の吸収速度はその溶解速度に左右され、それが今度はサイズおよび形態に左右され得る。あるいは、非経口的に投与された産物の遅延吸収は、産物を油状ビヒクル中に溶解または懸濁させることによって実現される。注射可能なデポ剤の形態は、ポリ乳酸－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中にタンパク質の微小封入マトリックス（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ）を形成することによって作製される。産物とポリマーの比および使用する特定のポリマーの性質に応じて放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられる。デポ剤注射製剤は、産物を体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルション中に閉じ込めることによって調製することができる。

【0188】

腸溶性投与される、医薬的に活性な産物の調製物は、固体、半固体、懸濁液またはエマルションの形態で導入することができ、また、水、懸濁化剤、および乳化剤などの任意の医薬的に許容される担体と配合することができる。発現産物は、特に、対象における疾患の発生を予防するためまたはすでに確立された疾患を好転もしくは遅延させるために予防措置として投与する場合には、ポンプによってまたは持続放出の形態で投与することもできる。

【0189】

医薬的に活性な産物は、場合によって植物組織と共に、医薬組成物として経口投与するのに特によく適し得る。採取された植物性材料を所望の治療用産物の性質およびその所望の形態に応じて種々のやり方（例えば、風乾、フリーズドライ、抽出など）のいずれかで処理することができる。好ましい実施形態では、上記のそのような組成物は、単独で経口摂取されるまたは食物もしくは飼料もしくは飲料と共に経口摂取される。経口投与用の組成物は、感染植物；感染植物の抽出物、および、乾燥粉末、食糧、水性または非水性溶媒、懸濁液、またはエマルションとして提供される、感染植物から精製されたタンパク質を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注射可能な有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水を含めた水、水－アルコール溶液、エマルションまたは懸濁液、および塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖溶液、デキストロースプラス塩化ナトリウム溶液、ラクトースまたは不揮発性油を含有するリンゲル液を含めた緩衝医療用非経口ビヒクルが挙げられる。乾燥粉末の例としては、乾燥させた、例えば、フリーズドライ、風乾、または噴霧乾燥した任意の感染植物バイオマスが挙げられる。例えば、植物を、市販の空気乾燥機に約１２０華氏温度で入れてバイオマスの水分含量が５重量％未満になるまで置くことによって風乾することができる。乾燥させた植物は、さらに処理するためにバルク固体として保管することもでき、粉砕して所望のメッシュサイズの粉末にすることによってさらに処理することもできる。あるいは、風乾に感受性である産物に対してはフリーズドライを使用することができる。産物を真空乾燥機に入れ、真空下でバイオマスの水分含量が約５重量％未満になるまで乾燥凍結させることによってフリーズドライすることができる。乾燥させた材料は、さらに処理することができる。

【0190】

感染植物は、１つまたは複数の薬草調製物として、またはそれと共に投与することができる。有用な薬草調製物としては液体薬草調製物および固体薬草調製物が挙げられる。薬草調製物の一部の例としては、チンキ、抽出物（例えば、水性抽出物、アルコール抽出物）、浸出液、乾燥調製物（例えば、風乾、噴霧乾燥、凍結、またはフリーズドライしたもの）、粉末（例えば、凍結乾燥粉末）、および液体が挙げられる。薬草調製物は、例えば、カプセル剤、錠剤、坐薬、液剤など、任意の標準の送達ビヒクルに入れた状態で提供することができる。適用することができる薬草調製物の種々の製剤および送達のモダリティは当業者には理解されよう。

【0191】

所望の医薬的に活性な産物を抽出によって得るための特に有用な方法も当業者には理解されよう。感染植物を抽出して、残留するバイオマスから所望の産物を取り出し、それにより、産物の濃度および純度を増大させることができる。植物を緩衝溶液中で抽出することもできる。

【0192】

例えば、新しく採取した植物を、ある量の、例えばリン酸緩衝液を用いて緩衝させた氷冷水中に１：１の重量比で入れることができる。必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。植物を、緩衝溶液中に懸濁させながら活発に混合することまたは粉砕することによって破壊し、抽出されたバイオマスを濾過または遠心分離によって除去することができる。溶液中に保持される導入遺伝子産物を、追加的なステップによってさらに精製することもでき、フリーズドライまたは沈殿によって乾燥粉末に変換することもできる。抽出は、圧搾によって行うこともできる。生植物を圧搾器で圧搾することによってまたは密接な間隔のローラーを通過させて押しつぶすことによって抽出することもできる。押しつぶされた植物から搾り出された流体を収集し、当技術分野で周知の方法に従って処理する。圧搾による抽出により、産物をより濃縮された形態で放出させることが可能になる。しかし、産物の全体的な収率は、産物を溶液中で抽出する場合よりも低い可能性がある。

【0193】

感染植物、抽出物、粉末、乾燥調製物および精製タンパク質産物などは、上記の１つま
たは複数の賦形剤を伴うまたは伴わない、カプセル封入された形態であってもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、制御放出コーティングおよび製剤の技術分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。そのような固体剤形では、活性な産物をショ糖、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１種の不活性な希釈剤と混和することができる。そのような剤形は、通常の慣例の通り、不活性な希釈剤以外の追加的な物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶セルロースなどの錠剤化滑沢剤および他の錠剤化補助剤も含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合では、剤形は、緩衝剤も含み得る。剤形は、場合によって乳白剤を含有し得、また、腸管のある特定の一部分に、場合によって遅延様式で、活性成分（１つまたは複数）のみが放出されるまたは優先的に放出される組成のものであり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。

【0194】

一部の実施形態では、医薬的に活性な産物を発現する感染植物、または感染植物のバイオマスを医薬食品として経口投与する。そのような食用組成物は、固体形態の場合には未加工で食べることによって、または液体の形態の場合には飲むことによって消費される。一部の実施形態では、トランスジェニック植物材料は、事前処理ステップを伴わずに、または最低限の調理調製後に直接摂取される。例えば、医薬的に活性なタンパク質を、直接食べることができる芽（例えば、アルファルファ芽、リョクトウ芽、またはホウレンソウまたはレタス葉芽）において発現させる。一部の実施形態では、植物バイオマスを処理し、処理ステップ後に回収された材料を摂取する。

【0195】

治療方法および医薬組成物
本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチド、またはＣ末端エンドスタチンポリペプチドをコードする核酸は、線維症を治療するために使用することができる。いくつかの例では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードする核酸は、例えば対象における線維症を低減させるために使用される。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、線維症を低減させるために、治療有効量の本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を対象に投与するステップを含む。一部の例では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１３３～１８０、配列番号４、配列番号１３、または配列番号１４を含む、またはそれからなる。しかし、本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドのいずれも、線維症を低減させるために使用することもできる。一部の実施形態では、ペプチドを単位用量として投与することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドを多量体として投与する。

【0196】

適切な対象としては、皮膚または肺の線維症を有する対象が挙げられるが、任意の組織の線維症を、本明細書に開示されている方法を使用して治療することができる。一例では、対象は強皮症を有する。他の例では、対象は、特発性肺線維症、斑状強皮症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の結果としての線維症、ケロイドまたは肥厚性瘢痕、上皮下線維症、心内膜心筋線維症、子宮線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、外科手術後の瘢痕、喘息、硬変症／肝線維症、異常な創傷治癒、糸球体腎炎、および多巣性線維化硬化症を有する。

【0197】

さらなる例では、方法を使用して、限局性皮膚強皮症またはびまん性皮膚強皮症（または全身性硬化症）などの全身型の強皮症を治療する。方法を使用して、斑状強皮症および線状強皮症を含めた局在型の強皮症を治療することができる。

【0198】

方法は、治療を必要とする対象、例えば、強皮症、特発性肺線維症、斑状強皮症、ケロ
イド瘢痕、肥厚性瘢痕、または上皮下線維症などの線維化疾患を有する対象などを選択するステップを含み得る。例示的な適用では、組成物を、強皮症、特発性肺線維症、斑状強皮症、ケロイド瘢痕、肥厚性瘢痕、もしくは上皮下線維症などの線維化疾患、または上に列挙されている障害にいずれかを有する対象に、線維症を低減させるために十分な量で投与する。この使用に関する有効量は、疾患の重症度、患者の健康の一般状態、および患者の免疫系の頑強性に左右される。一例では、化合物の治療有効量は、症状（１つもしくは複数）の主観的な軽減または臨床医もしくは他の必要条件を満たした観察者により認められた客観的に同定可能な改善をもたらす量である。

【0199】

皮膚の厚さを減少させるための方法が本発明で提供される。方法は、治療有効量のＣ末端エンドスタチンポリペプチドを投与するステップを含み、それにより、皮膚の厚さを減少させる。別の実施形態では、肺線維症を低減させるための方法が提供される。方法は、治療有効量のＣ末端エンドスタチンポリペプチドを投与するステップを含み、それにより、皮膚の厚さを減少させる。本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドのいずれも、これらの方法において使用することができる。一部の実施形態では、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１３３～１８０、配列番号４、配列番号１３、または配列番号１４を含む、またはそれからなる。

【0200】

形質転換増殖因子（ＴＧＦ）－βによって誘導されるＬＯＸなどのリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を減少させるための方法が本発明で提供される。方法は、細胞を有効量のＣ末端エンドスタチンポリペプチドに接触させるステップを含み、それにより、ＬＯＸを減少させる。方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。一部の実施形態では、方法は、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドと接触させた細胞によって産生されるＬＯＸの量を対照と比較するステップを含む。対照は、標準の値、または、担体と接触させた細胞などの、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドと接触させていない細胞によって産生されるＬＯＸの量であってよい。

【0201】

マトリックスメタロプロテイナーゼ－２（ＭＭＰ－２）を増加させるための方法が本発明で提供される。方法は、細胞を有効量のＣ末端エンドスタチンポリペプチドに接触させることを含み、それにより、ＭＭＰ－２産生を増加させる。方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。一部の実施形態では、方法は、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドと接触させた細胞によって産生されるＭＭＰ－２の量を対照と比較するステップを含む。対照は、標準の値、または、担体と接触させた細胞などの、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドと接触させていない細胞によって産生されるＭＭＰ－２の量であってよい。

【0202】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、当業者に公知の任意の手段（Ｂａｎｇａ、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｐａ．、１９９５を参照されたい）により、局所的にまたは全身的に、例えば、皮内注射、くも膜下腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射または静脈内注射によって投与することができるが、さらに経口投与、経鼻投与、経皮投与または肛門の投与が意図されている。一部の実施形態では、投与は、皮下注射、皮内注射、または筋肉内注射によるものである。別の実施形態では、投与は、腹腔内投与またはくも膜下腔内投与によるものである。応答を刺激するためにペプチドまたはタンパク質が利用可能な時間を延長するために、ペプチドまたはタンパク質を、埋め込み物、油性注射、または粒子系として提供することができる。粒子系は、微小粒子、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、ナノカプセル、または同様の粒子であってよい（例えば、Ｂａｎｇａ、上記を参照されたい）。

【0203】

皮膚の治療に関しては、治療有効量の少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を、例えば軟膏剤の形態などで、皮膚の患部に局所的に投与することができる。一部の実施形態では、軟膏剤は、皮膚への容易な適用に適した硬度を有する完全に均一な半固体の外用剤である。そのような軟膏剤は、脂肪、脂肪油、ラノリン、ＶＡＳＥＬＩＮＥ（登録商標）、パラフィン、ワックス、硬軟膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール、高級アルコール、グリセロール、水または乳化剤および懸濁化剤を有し得る。これらの成分を基剤として使用して、囮化合物を一様に混合することができる。基剤に応じて、混合物は、油性軟膏剤、乳化軟膏剤、または水溶性軟膏剤の形態であり得る。油性軟膏剤には、植物油および動物油および脂肪、ワックス、ＶＡＳＥＬＩＮＥ（登録商標）および流動パラフィンなどの基剤が使用される。乳化軟膏剤は、油性物質および水で構成され、乳化剤を用いて乳化されたものである。乳化軟膏剤は、水中油の形態（Ｏ／Ｗ）または油中水の形態（Ｗ／Ｏ）のいずれかをとり得る。水中油の形態（Ｏ／Ｗ）は、親水性軟膏剤であり得る。油中水の形態（Ｗ／Ｏ）は、水相を最初に欠き、親水性ＶＡＳＥＬＩＮＥ（登録商標）および精製ラノリンを含み得る、または、水吸収軟膏剤（水相を含む）および水和ラノリンを含有し得る。水溶性軟膏剤は、完全に水溶性のＭａｃｒｏｇｏｌ基剤を主要な成分として含有し得る。

【0204】

医薬的に許容される担体としては、ＶＡＳＥＬＩＮＥ（登録商標）などのペトロラタムが挙げられ、ここで、ペトロラタムは、５％ステアリルアルコールを含有するか、ペトロラタム単独であるか、または流動パラフィンを含有するペトロラタムである。そのような担体により、医薬組成物を、錠剤、ピル、糖衣剤、カプセル剤、液体調製物、ゲル剤、軟膏剤、シロップ剤、スラリー剤、および懸濁液などの、消費に適した形態で処方することが可能になる。患部または目的の組織内の細胞に局所的に投与する場合、少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを、合成または天然の親水性ポリマーを担体として含有する組成物として投与することができる。そのようなポリマーの例としては、ヒドロキシプロピルセルロースおよびポリエチレングリコールが挙げられる。１つまたは複数のＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適切な溶媒中で親水性ポリマーと混合することができる。次いで、溶媒を風乾などの方法によって除去し、次いで、残りを所望の形態（例えば、シート）に形づくり、標的部位に適用する。そのような親水性ポリマーを含有する製剤は、水分含量が低いので長持ちする。使用時に、水を吸収させ、同じく長持ちするゲルにする。シートの場合では、多価アルコールを、セルロース、デンプンおよびその誘導体、または合成ポリマー化合物などの、上記のものと同様の親水性ポリマーと混合することによって硬度を調整することができる。したがって形成された親水性シートを使用することができる。治療有効量の１つまたは複数のＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを絆創膏および包帯に組み入れることもできる。

【0205】

吸入による投与に関しては、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な噴射剤を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧剤提示の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合では、定量を送達するための弁をもたらすことによって投薬単位を決定することができる。吸入器または吹き入れ器に使用するためのカプセルおよびカートリッジを、化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な散剤塩基を含有させて製剤化することができる。

【0206】

一部の実施形態では、例えば、これだけに限定されないが、Ｅ４などのＣ末端エンドスタチンポリペプチドを吸入によって投与することができる。例えば、Ｃ末端エンドスタチ
ンポリペプチドを、例えばネブライザーまたは定量噴霧式吸入器を使用して、エアロゾル化した形態で投与することができる。使用される技術としては、マイクロポンプネブライザー（例えば、ＡＥＲＯＧＥＮ ＧＯ（登録商標）システムなど）、大きな細かい粒子画分が生じるようにデザインされたジェットネブライザー（例えば、ＰＡＲＩ ＬＣ ＳＴＡＲ（登録商標）など）、微粒化の間に発生するせん断が少ないジェットネブライザー（例えば、ＨＵＤＳＯＮ ＭＩＣＲＯＭＩＳＴ（登録商標）など）、および超音波ネブライザー（例えば、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ ＵＬＴＲＡ－ＮＥＢ（登録商標）など）が挙げられる。

【0207】

エンドスタチンポリペプチドを生理食塩水などの担体に溶解させ、上記のデバイスを使用して微粒化することができる。付随するエアロゾルを、一連の空気力学的段階を使用してエアロゾルを液滴サイズに基づいて別々の画分に分離および収集するＮＥＸＴ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＩＭＰＡＣＴＯＲ（登録商標）（ＮＧＩ）（ＭＳＰ Ｃｏｒｐ．、Ｓｈｏｒｅｖｉｅｗ、Ｍｉｎｎ．）を使用して収集することができる。液滴サイズは肺内の沈着位置の主要な決定因子であるので、このデバイスにより、小気道および肺胞に沈着する液体エアロゾルの部分を特異的に単離することが可能になる。

【0208】

エアロゾル粒子サイズは、多くの場合、粒子サイズ、形状、および密度に基づくパラメーターである空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）を単位として表される。球状粒子に関しては、ＭＭＡＤはＭＭＤ（ｐ^１／２）と同等であり、ここで、ＭＭＤは質量中央径であり、ｒは容積密度である。非球状粒子に関しては、ＭＭＡＤはＭＭＤ（ｐ／ｘ）^１／２と同等であり、ここで、Ｘは形状係数である。したがって、単位密度よりも大きな粒子の実際の直径はそれらのＭＭＡＤよりも小さくなる。

【0209】

気道内の粒子沈着の部位は、粒子サイズに基づいて区分される。一例では、約１～約５００ミクロンの粒子を利用し、例えば、約２５～約２５０ミクロン、または約１０～約２５ミクロンを利用する。他の実施形態では、約１～５０ミクロンの粒子を利用する。肺に投与するための定量噴霧式吸入器における使用に関しては、約１０ミクロン未満の粒子、例えば約２～約８ミクロンなど、例えば約１～約５ミクロンなどの粒子、例えば２～３ミクロン粒子などを利用することができる。

【0210】

治療有効量のＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体に入れた状態で投与することができる。医薬的に許容される担体（例えば、生理的または薬学的に許容される担体）は当技術分野で周知であり、それらとして、これだけに限定されないが、生理的ｐＨ（例えば、約７．０から約８．０までのｐＨ、または約７．４のｐＨ）の緩衝溶液が挙げられる。生理的に適合する緩衝溶液の具体的な非限定的な一例は、リン酸緩衝生理食塩水である。他の薬理学的に許容される担体としては、局部的に適用されること（例えば、治癒を促進するための手術創への適用）が意図されている医薬製剤に特に適する浸透剤が挙げられる。

【0211】

本明細書に開示されている薬理学的組成物により、線維症を低減するための、少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかにおける使用が容易になる。そのような組成物は、任意の適切な対象への活性成分の送達に適するものであってよく、それ自体公知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、乳化、カプセル封入、閉じ込めまたは凍結乾燥プロセスによって製造することができる。薬理学的組成物は、１種または複数種の薬理学的に（例えば、生理的または医薬に）許容される担体、ならびに医薬的に使用することができる、活性化合物の調製物への加工を容易にする任意選択の助剤を使用して、従来の様式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に左右される。したがって、注射用には、活性成分を水溶液に製剤化することができる。経粘膜投与
用には、関門を透過させるのに適した浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知である。

【0212】

経口投与用には、治療有効量の少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を、錠剤、ピル、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに組み入れるのに適した担体と組み合わせることができる。

【0213】

タンパク質薬は、消化管において、トリプシン、キモトリプシン、および刷子縁ペプチダーゼなどの酵素の作用によるプロテアーゼ媒介性分解を受け、したがって、大きなタンパク質分子の経口投与では、多くの場合、意図された治療効果がもたらされない（ＳｏｌｔｅｒｏおよびＥｋｗｒｕｉｂｅ、２００１ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１０６－１１０）。驚いたことに、本明細書に記載のＣ末端エンドスタチンポリペプチドは、経口経路によって投与された場合であっても、その活性および治療効果を維持することができる。理論に束縛されることなく、本明細書に記載のＣ末端エンドスタチンポリペプチドは、プロテアーゼ活性から免れ、小腸に吸着し、循環中に進入して治療的利益をもたらすことを可能にするさらなる性質を含むと考えられる。

【0214】

一部の実施形態では、非経口投与に関して、治療有効量の少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を注射によって、例えばボーラス注射または持続注入によって投与することができる。そのような組成物は、懸濁液、溶液または油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中のエマルションなどの形態をとってよく、また、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化用薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含有してよい。他の薬理学的賦形剤は、当技術分野で公知である。

【0215】

場合によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与用であるかｉｎ ｖｉｖｏ投与用であるかにかかわらず、少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを、異種タンパク質、炭化水素または脂質中に含有させることまたはそれとコンジュゲートすることができる。同時投与は、少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを、タンパク質、炭化水素、または脂質の前に、それと実質的に同時に、またはその後に投与するようなものであってよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドをタンパク質、炭化水素、または脂質と実質的に同時に投与する。

【0216】

他の送達系としては、持効放出、遅延放出または持続放出の送達系が挙げられる。そのような系により、上記の本発明の組成物の反復投与を回避することができ、それにより、対象および医師にとっての利便性が増す。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。それらとして、ポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリシュウ酸、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ酸無水物などのポリマーに基づく系が挙げられる。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系としては、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロールならびに脂肪酸またはモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質などの非ポリマー系；ハイドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドに基づく系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用した圧縮錠剤；部分的に融合した埋め込み物なども挙げられる。特定の例として、これだけに限定されないが、（ａ）少なくとも１つのＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドが、米国特許第４，４５２，７７５号；同第４，６６７，０１４号；同第４，７４８，０３４号；同第５，２３９，６６０号；および同第６，２１８，３７１号に記載さ
れているものなどのマトリックス中に入った形態で含有される浸食系、ならびに（ｂ）活性構成成分が米国特許第３，８３２，２５３号および同第３，８５４，４８０号に記載されているものなどのポリマーから制御された速度で浸透する拡散系が挙げられる。さらに、ポンプに基づくハードウェア送達系を使用することができ、その一部は埋め込みに適している。

【0217】

強皮症などの慢性の状態を治療するためには長期間持続放出の埋め込み物の使用が特に適切であり得る。長期間放出とは、本明細書で使用される場合、埋め込み物を構築し、治療レベルの活性成分が少なくとも３０日間、好ましくは６０日間にわたって送達されるように配置することを意味する。長期間持続放出の埋め込み物は、当業者に周知であり、それらとして、上記の放出系のいくつかが挙げられる。これらの系は、オリゴデオキシヌクレオチドとの使用に関して記載されている（米国特許第６，２１８，３７１号を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に関しては、核酸およびペプチドは、分解（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどによるもの）に対して比較的抵抗性であることが好ましい。したがって、Ｃ末端アミドを含めることなどの修飾を使用することができる。

【0218】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドの治療有効量は、利用されるＣ末端エンドスタチンポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド、治療される対象、苦痛の重症度および型、ならびに投与様式に左右される。例えば、ペプチドをコードするポリヌクレオチドの治療有効量は、体重１キログラム（ｋｇ）当たり約０．０１μｇから体重１ｋｇ当たり約１ｇまで、例えば、体重１ｋｇ当たり約１μｇ～約５ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり約５μｇ～約１ｍｇなど、変動し得る。正確な用量は、当業者により、特定の化合物の効力、対象の年齢、重量、性別および生理的状態に基づいて容易に決定される。

【0219】

核酸の投与に関しては、核酸の投与の１つの手法は、例えば哺乳動物発現プラスミドを用いてなど、プラスミドＤＮＡを用いて直接処理するものである。上記の通り、分子の発現を増大させるために、Ｎ末端エンドスタチンペプチドをコードするヌクレオチド配列をプロモーターの制御下に置くことができる。

【0220】

ｉｎ ｖｉｖｏにおける投与のためにウイルスベクターを利用する場合、レシピエントに、哺乳動物１ｍｇ当たり約１０^５～約１０^１０プラーク形成単位の範囲の、組成物中の各組換えウイルスの投薬量もたらすことが望ましいが、より低い用量またはより高い用量を投与することができる。組換えウイルスベクターの組成物は、哺乳動物に、癌のいかなる証拠よりも前に、または、癌を患っている哺乳動物における疾患の退縮を媒介するために、導入することができる。組成物を哺乳動物に投与するための方法の例としては、これだけに限定されないが、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで組換えウイルスに曝露させること、または組成物を患部組織に注射すること、またはウイルスを静脈内投与、皮下投与、皮内投与もしくは筋肉内投与することが挙げられる。あるいは、組換えウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターの組合せを、医薬的に許容される担体に入れた状態で、癌性病変に直接注射することによって局所的に投与することができる。一般に、投与される１つまたは複数のＣ末端エンドスタチンポリペプチドの核酸配列を有する組換えウイルスベクターの分量は、ウイルス粒子の力価に基づく。投与される免疫原の例示的な範囲は、ヒトなどの哺乳動物当たりウイルス粒子１０^５～１０^１０個である。

【0221】

具体的な非限定的な一例では、静脈内投与用の医薬組成物は、１日当たり患者当たり約０．１μｇ～１０ｍｇのＣ末端エンドスタチンポリペプチドを含む。特に、薬剤を離れた部位に投与し、体腔中または臓器の内腔中などの循環系またはリンパ液系には投与しない場合、１日当たり患者当たり０．１ｍｇから約１００ｍｇまでの投薬量を使用することが
できる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者には公知または明らかであり、また、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９５などの刊行物においてより詳細に記載されている。

【0222】

対象により必要性および耐容性が示される投薬量および頻度に応じて組成物の単回投与または複数回投与を行う。一部の実施形態では、投薬量を、ボーラスとして１回投与するが、別の実施形態では、治療結果が実現されるまで定期的に適用することができる。一般に、用量は、対象に対して許容されない毒性を生じさせることなく疾患の症状または徴候を治療するまたは好転させるために十分なものである。全身投与または局所投与を利用することができる。

【0223】

別の方法では、追加的な薬剤を投与する。一例では、この投与は逐次的なものである。他の例では、追加的な薬剤をＣ末端エンドスタチンポリペプチドと同時に投与する。

【0224】

強皮症の治療に関しては、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドと共に使用することができる追加的な薬剤の例としては、ニフェジピン、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、またはニカルジピンが挙げられる。治験薬ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）も強皮症の治療に使用される。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）または他のチロシンキナーゼ阻害剤を本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドと共に使用することができる。肺が関与する強皮症の患者には、酸素療法が有益であり、本明細書に開示されているＣ末端エンドスタチンポリペプチドをこの療法と共に投与することができる。

【0225】

皮膚の線維症および強皮症の治療に関しては、使用される追加的な薬剤は、Ｄ－ペニシラミン、コルヒチン、レラキシン、ステロイド、およびシクロスポリンである。Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドも免疫抑制剤と組み合わせて使用することができる。さらに、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをメトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノレート、グリタゾン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、またはフルベストラント（ＩＣＩ－１８２，７８０）と共に使用することができる。

【0226】

以下の実施例において本発明がさらに説明され、これにより特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲は限定されない。

【実施例】

【0227】

臓器線維芽細胞によるフィブロネクチン（ＦＮ）およびＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の過剰な沈着は、線維症と定義される。臓器線維症は、末期臓器不全症をもたらす多くの疾患の最終的な共通経路である。しかし、臓器線維症に対する有効な療法は依然として得られていない（例えば、Ｂｊｏｒａｋｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．、２０００；１５７：１９９－２０；ＶａｒｇａおよびＡｂｒａｈａｍ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７；１１７：５５７－６７；Ｗｙｎｎ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７；１１７：５２４－２９を参照されたい）。急性炎症および慢性炎症、血管新生、常在細胞の活性化、およびＥＣＭリモデリングを含めた制御できない創傷治癒応答が線維症の病理発生に関与すると考えられている（Ｗｙｎｎ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７；１１７：５２４－２９；ＫａｌｌｕｒｉおよびＳｕｋｈａｔｍｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ ２０００；９：４１３－８）。ＴＧＦ－βは、線維化臓器において増加するプロトタイプ線維化サイトカインであり、ＥＣＭ分子の合成を刺激すること、線維芽細胞を活性化してα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）を発現する筋線維芽細胞にすること、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を下方制御することによって線維症の発生に寄与する（Ｂｒａｎｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ
１９９９；１：１３４９－６５；ＶａｒｇａおよびＰａｓｃｈｅ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２００９；５：２００－６）。期待が大きいにもかかわらず、初期ＳＳｃの患者におけるモノクローナル抗ＴＧＦ－β抗体の臨床試験ではいかなる有効性も示すことができなかった（ＶａｒｇａおよびＰａｓｃｈｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２００９；５：２００－６）。

【0228】

エンドスタチンは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのカルボキシ末端の２０ｋＤａの内部断片である。エンドスタチンは、強力な抗血管新生活性を有する培養したマウス血管内皮腫細胞株の上清中で最初に同定された（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ １９９７；８８：２７７－８５）。エンドスタチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて内皮の増殖および管形成を阻害し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍成長を阻害する（Ｄｈａｎａｂａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９９；２５８：３４５－５２）。臨床試験を含め、エンドスタチンの抗腫瘍性を評価するための試験が行われてきた（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００６；３１２：５９４－６０７）。エンドスタチンのＮＨ_２末端ドメインは血管新生の阻害に関与する機能的ドメインとして報告されている（Ｔｊｉｎ Ｔｈａｎ Ｓｊｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：３６５６－６３）。この効果の正確な分子機構は不明のままであるが、エンドスタチン受容体としてインテグリン、グリピカン、ｆｌｋ－１、およびヌクレオリンが報告されている（Ｓｕｄｈａｋａｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００３；１００：４７６６－７１；Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２００１；７：８１１－２２）。最近の試験から、肺線維症のＩＰＦ患者およびＳＳｃ患者から得た血清および／またはＢＡＬＦにおいてエンドスタチンが増加していることが示された（例えば、Ｓｕｍｉ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ａｎａｌ ２００５；１９：１４６－９）。

【0229】

本明細書で考察されている試験では、エンドスタチンの線維症に対する効果を評価した。エンドスタチンおよびエンドスタチン由来ペプチドの線維症に対する効果を、初代ヒト線維芽細胞を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒト皮膚を使用してｅｘ ｖｉｖｏ、およびＴＧＦ－βを用いて処置したマウス皮膚を使用してｉｎ ｖｉｖｏで評価した。驚いたことに、所見から、エンドスタチンのカルボキシ末端ペプチドが、抗線維化活性を有し、線維化障害に対する新規療法をもたらすものであることが実証される。

【0230】

＜実施例１＞
材料および方法
試薬および抗体。全長組換えヒトエンドスタチン（ｒＥ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。組換えヒトＴＧＦ－βをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。マウスモノクローナル抗ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）抗体、ヤギポリクローナル抗ヒトＩ型コラーゲンαＩ鎖（Ｃｏｌ１α１）抗体、およびマウスモノクローナル抗ヒトＧＡＰＤＨ抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆ．）から購入した。マウスモノクローナル抗ヒトα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）抗体をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0231】

ヒトエンドスタチンペプチドの合成。ペプチドを、Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｔｈｅｗｓ、ＮＣ）において、ＦＭＯＣ合成プロトコールを使用して固相により合成した。簡単に述べると、活性化させたアミノ酸を固体支持体（Ｗａｎｇ ＲｅｓｉｎおよびＰＥＧ－ＰＳ）にカルボキシ末端から開始してアミノ末端まで段階的に付加することによって合成を実施した。アミノ酸の活性化をＤＩＰＥＡ／ＨＯＢＴ／ＴＢＴＵ化学によって実施した。合成の最後に、試薬Ｒ（９０％ＴＦＡ、５％チオアニソール、３％エタンジチオール、および２％アニソール）を用いてペプチドを樹脂から切断し、多数のエーテル抽出に供した。粗製ペ
プチドを分析し、特徴付け、ゲル濾過（Ｇ－２５カラム）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ、４８６および６００Ｅ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって精製した。正確な質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（Ｔｈｅ Ｖｏｙａｇｅｒ－ＤＥ ＳＴＲ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）によって確認した。ペプチドの配列は表１に示されており、これは、アミノ酸１～４５（Ｅ１）；７１～１１５（Ｅ２）；１３３～１８０（Ｅ３）、１３３～１８０Ａ（Ｅ４）に対応し、Ｅ３とはカルボキシ末端アミドの存在により異なる。全てのペプチドの純度が＞９８％であった。全てのペプチドをＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、１×ＰＢＳ中１～２０μｇ／ｍｌまで希釈した。

【0232】

初代線維芽細胞培養、ヒト初代肺線維芽細胞および皮膚線維芽細胞を培養した。正常な臓器ドナー、ＳＳｃの患者またはＩＰＦの患者の肺外植片、およびＳＳｃ患者、斑状強皮症患者および健康なドナーの臨床的に関与する皮膚を初代線維芽細胞培養に使用した。肺末梢部および皮膚をおよそ２ｃｍの小片に細かく切り、線維芽細胞を、以前に記載されている通り（Ｆｅｇｈａｌｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ １９９９；４２：１４５１－７）、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、および抗真菌剤を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、Ｖａ．）で培養した。全ての細胞を３～６回継代して使用した。

【0233】

ウエスタンブロット分析。培養した線維芽細胞から細胞溶解物を以前に記載されている通り（Ｐｉｌｅｗｓｋｉら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００５；１６６：３９９－４０７）得た。簡単に述べると、初代線維芽細胞２．０×１０^５個を３５ｍｍのウェル中、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＴＧＦ－βまたはビヒクル対照としてＰＢＳを補充した０．５％ＦＢＳ含有培地で２４時間培養し、その後、５μｇ／ｍｌのヒトｒＥ、エンドスタチンペプチド（Ｅ１～Ｅ４）、またはＤＭＳＯ（ビヒクル）を添加して４８時間置いた。一部の実験では、ＴＧＦ－β刺激を伴わずにエンドスタチンペプチドを使用した。細胞溶解物をウエスタンブロットによって分析した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗体および化学発光（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）と共にインキュベートした後、シグナルを検出した。予測された分子サイズを有する個々のバンドの強度を、インターネット（／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）上で利用可能なｉｍａｇｅ／Ｊ（登録商標）ソフトウェアを使用して半定量的に解析し、個々のＧＡＰＤＨ強度に対して正規化した。

【0234】

ｅｘ ｖｉｖｏにおけるヒト皮膚アッセイ。ヒト腹部皮膚を矯正形成手術から得た。以前に記載されている通り（Ｙａｓｕｏｋａら、Ｔｈｅ ｏｐｅｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｊ ２００８；２：１７－２２）、皮下脂肪組織を均一に除去し、皮膚組織を１．５ｃｍ×１．５ｃｍの切片に切った。以下を１×ＰＢＳ中総体積１００μｌで皮内注射した：ｒＥ単独（１－１０μｇ／ｍｌ）、エンドスタチンペプチド単独（１０μｇ／ｍｌ）、ｒＥまたはエンドスタチンペプチド（１－２０μｇ／ｍｌ）とＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の組合せ、およびＴＧＦ－β単独（１０ｎｇ／ｍｌ）。一部の実験では、ヒト皮膚に、まずＴＧＦ－βを注射して４８時間置き、その後、組換えエンドスタチン（ｒＥ）をＴＧＦ－βと同じ注射部位に投与した。図の説明文に示されている通り、独立した実験を２連または３連で行った。完全な表皮層および皮膚層を含有する外植片を、気相液相界面で表皮層およびケラチン層を上にして空気に曝露させて培養した。培養培地を２日に１回交換した。１週間または２週間後、注射部位付近を中心として直径８ｍｍの領域に対応する皮膚組織を使い捨ての８ｍｍ ＡＣＵＰＵＮＣＨ（登録商標）（Ａｃｕｄｅｒｍ，Ｉｎｃ．、Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦＬ）を使用して採取した。皮膚組織を１０％ホルマリン中に固定した後、パラフィンに包埋した。

【0235】

ｉｎ ｖｉｖｏマウス実験。ＣＢ５７ＢＬ６／Ｊ雄マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。ヒトｒＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはエンドスタチンペプチド（１０μｇ／ｍｌ）とＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の組合せ、またはＴＧＦ－β単独を１×ＰＢＳ中総体積１００μｌとしてマウスの背中に皮内注射した。マウスの２つの異なる皮膚部位に注射し、注入の１週間後に屠殺した。注射部位の周囲の皮膚を採取し、１０％ホルマリン中に固定した後、パラフィンに包埋した。

【0236】

皮膚の厚さの測定。パラフィン包埋したヒト皮膚組織およびマウス皮膚組織の６μｍの切片をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。一部の実験では、切片を、コラーゲンを同定するマッソン・トリクロームで染色した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８００顕微鏡で画像を取得した。真皮の厚さを各切片の６つのランダムな視野でｉｍａｇｅ／Ｊ（登録商標）ソフトウェアを使用して測定した。データを任意単位で示す。

【0237】

尿細管形成アッセイ。エンドスタチンペプチドの血管新生を阻害する能力を、尿細管形成アッセイにおいてＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）培養物を使用して調査した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＥＢＭ－２ ＭＶ ＳＩＮＧＬＥＱＵＯＴＳ（登録商標）を補充した内皮細胞基本培地－２（ＥＢＭ－２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で維持した。ＨＵＶＥＣ（５×１０^４個）を、２連で、２４ウェルのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において、単独で、またはＥＢＭ－２中ｒＥもしくはＥ４ペプチド（５０ｎＭ）の存在下、３７℃で培養した。ＤＭＳＯをビヒクル対照として使用した。２４時間後に、倒立顕微鏡を使用して画像を捕捉した。コード形成の程度を、ウェル当たり６つのランダムな視野において管が占める面積を測定することによって数量化した。３つの独立した実験を実施した。

【0238】

統計解析。全ての連続変数を、平均±標準偏差として表した。２群間の比較は、必要に応じて対応のあるｔ検定またはマン・ホイットニーのＵ検定を使用して統計的有意性について検定した。３群間の比較は、ＡＮＯＶＡ、その後、ボンフェローニの検定を使用して実施した。

【0239】

＜実施例２＞
ヒトエンドスタチンにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＴＧＦ－βで処理したヒト初代肺線維芽細胞および皮膚線維芽細胞におけるＦＮ産生およびＣｏｌ１α１産生が阻害される
エンドスタチンにより線維芽細胞におけるＥＣＭ構成成分の産生が調節されるかどうかを評価するために、正常なヒト肺線維芽細胞においてＦＮ発現およびＣｏｌ１α１発現をウエスタンブロット分析によって調査した。細胞を、２４時間にわたるヒトＴＧＦ－βを用いた予備刺激を伴って、または伴わずに、５μｇ／ｍｌのｒＥを用いて４８時間にわたって処理した。図１Ａに示されている通り、ｒＥにより、ＴＧＦ－βで前処理した線維芽細胞におけるＦＮレベルおよびＣｏｌ１α１レベルが劇的に低下した。阻害効果を媒介するエンドスタチンの機能的ドメインを定義するために、エンドスタチンの異なる領域に対応する４つの異なるペプチドを合成した（表１）。

【0240】

【表3】

【0241】

図１Ｂおよび１Ｃに示されている通り、エンドスタチン（Ｅ４）のカルボキシ末端に由来する断片により、ＴＧＦ－βで処理した細胞におけるＦＮ産生およびＣｏｌ１α１産生が、ＴＧＦ－β単独で処理した正常肺線維芽細胞と比較して有意に抑制された（どちらの比較においてもＰ＝０．０３）。他方では、エンドスタチンのアミノ末端領域に位置するＥ１ペプチドは効果を有さなかった。健康な線維芽細胞に加えて、臨床的な肺線維症を有するＳＳｃ患者およびＩＰＦ患者から得た肺線維芽細胞を並行アッセイにおいて使用し、結果は同様であった（図１Ｂおよび１Ｃ）。肺線維芽細胞におけるｒＥおよびＥ４の抗線維化効果が実証されたので、皮膚がＳＳｃにおける線維症の影響を受ける主要臓器であることから、皮膚線維芽細胞に対するこれらのペプチドの効果を調査した。健康な対照、全身性硬化症（ＳＳｃ）の患者または局在型強皮症（斑状強皮症）の皮膚から得た初代線維芽細胞をｒＥまたはＥ４で処理した。肺線維芽細胞と同様に、ｒＥおよびＥ４により、皮膚線維芽細胞におけるＴＧＦ－βによって誘導されるＥＣＭ産生が減少した。代表的な結果を図１Ｄに示す。

【0242】

＜実施例３＞
エンドスタチンペプチドにより、ＳＳｃの患者およびＩＰＦの患者に由来する初代肺線維芽細胞の線維化表現型が逆転する
線維化組織ではＴＧＦ－βが上方制御されることが示されているので、線維化の肺線維芽細胞におけるマトリックス産生が、ＴＧＦ－β刺激の不在下でエンドスタチンペプチドを用いた処理によって変化するかどうかを調査した。図１Ｅの左側のパネルに示されている通り、Ｅ４で処理した線維芽細胞ではＦＮレベルおよびＣｏｌ１α１レベルの両方が低下した。さらに、同じ線維芽細胞を、種々の濃度のＥ４を用いて処理して、最適な抗線維化用量を同定した。Ｅ４では、Ｃｏｌ１α１レベルがビヒクル対照と比較して用量依存的に低下したが（図１Ｅ、右側のパネル）、ＦＮレベルに対する効果は大きくなかった。ＥＣＭの減少は、ＴＧＦ－β刺激後に観察されたものよりも大きくなかった。総合すると、結果から、Ｅ４により、線維化の環境からの線維芽細胞におけるＥＣＭ構成成分のベースラインの産生を減少させ、したがって、線維化表現型を逆転させることができることが示される。

【0243】

α－ＳＭＡを発現する活性化線維芽細胞である筋線維芽細胞は、ＴＧＦ－β刺激によって誘導され、線維症において中心的な役割を果たす。したがって、エンドスタチンペプチドの、正常肺線維芽細胞におけるα－ＳＭＡ発現に対する効果を調査した。図１Ｆに示されている通り、ＴＧＦ－β刺激により、α－ＳＭＡ発現が著しく増加した。興味深いことに、Ｅ４、およびより少ない程度にＥ３により、ＴＧＦ－βによって誘導されるα－ＳＭＡレベルが低下し、これにより、エンドスタチンのカルボキシ末端領域により、線維芽細胞の活性化およびそれらの筋線維芽細胞表現型への転移を予防することができることが示唆される。

【0244】

＜実施例４＞
ヒト皮膚において、エンドスタチンにより、皮膚の厚さが減少し、ＴＧＦ－βによって誘導される線維症が予防される
培養したヒト皮膚外植片を、線維形成因子の作用を評価するため、線維症の進行を停止させ、潜在的に逆転させるための阻害剤／療法の有効性を評価するための臓器モデルとして使用することができる（Ｙａｓｕｏｋａ、Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｊ
２００８；２：１７－２２）。線維症に対する潜在的な治療剤としてのエンドスタチンの有効性を評価するために、このｅｘ ｖｉｖｏヒト皮膚モデルを使用した。ＴＧＦ－βは線維症において中心的な役割を果たす周知の線維化促進因子であるので、ヒト組換えＴＧＦ－βをまず皮内注射して線維症のレベルを評価した。図２Ａに示されている通り、ＴＧＦ－β注射により、注入の１週間後、皮膚の厚さが用量依存的に劇的に増大した。ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の線維化作用は２週間で消失した。ｒＥ（１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌ）またはエンドスタチンペプチド（１０μｇ／ｍｌ）のベースラインの効果も個別に調査した。ｒＥおよびＥ１～４により皮膚の厚さは有意には変化しなかったが、ｒＥ、Ｅ３、およびＥ４では、ヒト皮膚の厚さが減少する傾向が示された（図２Ｂおよび２Ｃ）。ｒＥにより、ＴＧＦ－βで処理したヒト皮膚における線維症を阻害することができるかどうかを決定した。ＴＧＦ－βおよびｒＥを同時に注射した。投与の１週間後、ｒＥとＴＧＦ－βの組合せにより、皮膚の厚さが用量依存的に有意に減少した（図３）。線維症の逆転に対するｒＥの効果を評価するために、ＴＧＦ－β投与の２日後にペプチドを注射した。同時処置と同様に、遅れてのｒＥによっても、ＧＦ－βによって誘導される皮膚線維症が有意に好転した。所見から、ヒトエンドスタチンにより、ヒト皮膚において、線維症の発生および進行を予防することができ、またＴＧＦ－βによって誘導される線維症を逆転することもできることが示される。

【0245】

＜実施例５＞
エンドスタチンペプチドにより、ヒト皮膚におけるＴＧＦ－βによって誘導される線維症がｅｘ ｖｉｖｏで低減し、既存の線維症が逆転する
エンドスタチンのどの部分が、ヒト皮膚外植片におけるＴＧＦ－βによって誘導される線維症の阻害に関与するかを決定するために、エンドスタチンペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βの存在下で投与した。代表的な画像を図４Ａに示す。Ｅ３およびＥ４により、皮膚の厚さによって測定される線維症の発生が、ＴＧＦ－β単独と比較して有意に消失した（それぞれＰ＝０．０４、０．０１；図４）。種々の濃度のＥ１またはＥ４をＴＧＦ－βと組み合わせて注射した皮膚外植片の皮膚の厚さを調査した。図５に示されている通り、Ｅ１とは異なり、５～２０μｇ／ｍｌの濃度のＥ４ではＴＧＦ－βによって誘導される皮膚線維症が明白に好転し、それにより、エンドスタチンのＣ末端により線維症を抑制することができることが示される（図１７を参照されたい）。

【0246】

＜実施例６＞
エンドスタチンペプチドにより、マウス皮膚におけるＴＧＦ－βによって誘導される線維症がｉｎ ｖｉｖｏで低減する
エンドスタチンペプチドの抗線維化効果をｉｎ ｖｉｖｏでさらに評価した。ｒＥとＴ
ＧＦ－βの組合せおよびエンドスタチンペプチドとＴＧＦ－βの組合せをマウスの皮膚に注射した。注入の１週間後、マウスは健康に見え、窮迫の徴候は示されなかった。図６に示されている通り、マウス皮膚において、ヒトＴＧＦ－βにより、皮膚の厚さが強力に増大した（Ｐ＝０．００４）。ヒトエンドスタチンペプチドのカルボキシ末端に由来するペプチドＥ３およびＥ４により、ＴＧＦ－βによって誘導される皮膚線維症が予防された（それぞれＰ＝０．０１、０．００７）。さらに、Ｅ２により、皮膚の厚さが有意に減少した（Ｐ＝０．０３）。エンドスタチンのアミノ末端に対応するペプチドであるＥ１では、ＴＧＦ－βによって誘導される皮膚線維症は変化しなかった。これらの結果から、我々のヒト皮膚モデルから得られた結果が確認され、また、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏにおける、ＴＧＦ－βによって誘導される線維症の予防におけるエンドスタチンのＣ末端ドメイン重要性が強調される。

【0247】

＜実施例７＞
エンドスタチンのＣ末端ペプチドの抗血管新生活性は大きくない
エンドスタチンの抗血管新生効果は、アミノ末端ドメインに帰するものとされていた（Ｔｊｉｎ Ｔｈａｍ Ｓｊｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：３６５６－６３）。エンドスタチンのカルボキシ末端領域の抗血管新生能を評価するために、Ｅ４のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける尿細管形成に対する効果をマトリゲルを使用して調査した。図７に示されている通り、ｒＥの、ＨＵＶＥＣによる管状構造形成を阻害する能力は有意であり、それにより、以前の報告が確認された。他方では、Ｅ４の血管新生を抑制する能力は大きくなく、それにより、エンドスタチンのＥ４に対応する領域はエンドスタチンの抗血管新生活性に有意に寄与しないことが示唆される。

【0248】

したがって、エンドスタチンのカルボキシ末端領域に対応するペプチドであるＥ４により、ＴＧＦ－βによって誘導される線維症が好転し、さらには逆転する。Ｅ４により、初代肺線維芽細胞および皮膚線維芽細胞におけるＴＧＦ－βによって誘導されるＥＣＭ産生が抑制され、α－ＳＭＡレベルが下方制御された。ｉｎ ｖｉｖｏ分析およびｅｘ ｖｉｖｏ分析から、Ｅ４により、ＴＧＦ－βによって誘発される皮膚の厚さの増加が妨害されることが明らかになった。さらに、Ｅ４の抗血管新生能はｒＥと比較して低かった。総合すると、所見から、エンドスタチンの、抗線維化能および抗血管新生能に関与するドメインが別個であることが示唆される。他のエンドスタチンペプチド（例えば、Ｅ２およびＥ３）も抗線維化活性を有することが示されている。

【0249】

エンドスタチンの抗血管新生活性には、抗腫瘍療法の開発を対象とする多数の調査の焦点が当てられてきた。最近、特発性肺線維症（ＩＰＦ）および全身性硬化症（ＳＳｃ）などの線維化障害におけるエンドスタチンの血清中レベルおよびＢＡＬＦ中レベルの上昇が報告された。重症呼吸器機能障害を有するＩＰＦ患者、ならびに肺線維症、重症皮膚線維症、および皮膚瘢痕を有するＳＳｃ患者では、それらの臨床症状を有さない患者と比較して、エンドスタチンレベルが比較的上昇していた（Ｓｕｍｉ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ａｎａｌ ２００５；１９：１４６－９；Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｔｈｏｒａｘ ２００９；６４：１５６－６１）。さらに、ＳＳｃ患者の培養した皮膚線維芽細胞（Ｔａｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００５；５２：８６５－７６）およびＩＰＦの患者の肺抽出物全体（Ｙａｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００７；１７５：４５－５４）ではＸＶＩＩＩ型コラーゲン発現が増加していた。この点について、エンドスタチンはＭＭＰおよびカテプシンＬを含めたいくつかのプロテアーゼによって切断されたＸＶＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解産物であるので（Ｗｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９；５９：６０５２－６；Ｆｅｌｂｏｒ、ＥＭＢＯ Ｊ ２０００；１９：１１８７－９４）、また、ＭＭＰもＳＳｃおよびＩＰＦにおいて上方制御されるので（Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｔｈｏｒａｘ ２００９；６４：１５６－６１、Ｔｏｕｂｉら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００２；２０：２２１－４）、これ
らの患者において切断されたエンドスタチンレベルが上昇するという所見は妥当であると思われる。しかし、エンドスタチンが線維症の病理発生にどのように関与し得るかは不明である。

【0250】

理論に束縛されることなく、線維化組織におけるエンドスタチンの増加は、不首尾ではあるが、線維症の進行の停止を対象とする負のフィードバック調節ループを構成し得る。エンドスタチンは異常な「血管新生性」内皮癌細胞においてその「血管新生」能を制御／阻害する可能性がある産物として最初に同定されたので（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ
１９９７；８８：２７７－８５）、線維症におけるエンドスタチンが同様の調節機能を果たすことは妥当であると思われる。

【0251】

創傷治癒モデルを使用した、組換えエンドスタチンで処置したマウス皮膚では、結合組織は減少するが血管密度は正常であることが報告されている（Ｂｌｏｃｈら、ＦＡＳＥＢ
Ｊ ２０００；１４：２３７３－６）。さらに、エンドスタチンのＮ末端領域に由来するペプチドにより、マウスモデルにおける腹膜硬化症の進行が予防された（Ｔａｎａｂｅら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００７；７１：２２７－３８）；調査されたペプチドは、アミノ酸１～２７を包含するエンドスタチンのＮ末端に対応するものであった。

【0252】

対照的に、本明細書では、エンドスタチンのＮ末端ではなく、Ｃ末端領域が、エンドスタチンの抗線維化効果に関与することが示されている。実際、Ｎ末端エンドスタチンのドメインに対応するペプチドは、アッセイのいくつかでは線維化表現型に寄与した。エンドスタチンの抗血管新生能に関与する特定のアミノ酸配列を定義することを対象とする試験（Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｔｈｏｒａｘ ２００９；６４：１５６－６１；Ｃａｔｔａｎｅｏら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００３；２８３：２３０－６；Ｘｕら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ ２００８；９：２７５－８３）により、エンドスタチンの全体的な血管新生抑制活性がＮ末端ドメインの２７アミノ酸ペプチドに位置することが示されている（Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｔｈｏｒａｘ ２００９；６４：１５６－６１）。したがって、エンドスタチンの、その抗線維化活性を媒介する機能的ドメインは、その抗血管新生能に関与する機能的ドメインとは異なり、これは、血管新生の阻害の機構と線維症の阻害の機構が異なることを意味する。したがって、本明細書に開示されている抗線維化Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドは、血管新生を阻害せずに、線維症を選択的に阻害することができるものである。Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドを使用して、所望の治療転帰に影響を及ぼし得る血管新生への干渉を伴わずに望ましくない線維症をより特異的かつ選択的に標的とすることができる。

【0253】

Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドにより、ＴＧＦ－βで処理した線維芽細胞におけるα－ＳＭＡ発現も減少する。さらに、正常な線維芽細胞に対するＥ４のマトリックス減少効果は、線維化線維芽細胞におけるものよりも大きくなかった。これにより、線維症におけるエンドスタチンＣ末端ペプチドの治療効果が、一部において、ＴＧＦ－βおよび他の線維症促進性増殖因子による線維芽細胞活性化の妨害に起因する可能性があることが示唆される。

【0254】

２００５年に、Ｈｉｓタグ付きタンパク質として追加的な９アミノ酸配列を含有する、Ｅ．ｃｏｌｉから精製された組換えヒトエンドスタチンであるＥＮＤＳＴＡＲ（登録商標）が、中国において非小細胞肺癌の治療に関して承認された（Ｓｕｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００５（ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）；２３：７１３８）。その効果にもかかわらず、治療には、高用量を必要とすること、タンパク質の半減期が短いこと、安定性が乏しいこと、および容易に不活化することを含めた、いくつかの不都合があった（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９；１７：３３６－７；Ｈｕら、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉ
ｎ ２００８；２９：１３５７－６９を参照されたい）。本明細書に開示されている低分子合成ペプチドでは、これらの障害を克服することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏにおいて、Ｅ４により、ｒＥと比較して、さらにはＥ３と比較しても、線維症が有意に阻害された。さらに、Ｅ４の抗血管新生活性は、ｒＥと比較して最小のものであり、これにより、エンドスタチンの抗血管新生活性がそのＮ末端ドメインに存在することが確認される。Ｅ３とＥ４の唯一の差異は、Ｅ４のＣ末端にアミド結合が存在することである。理論に束縛されることなく、このアミドにより、ペプチドがカルボキシペプチダーゼまたは他の分解性分子によるカルボキシ分解に対してより抵抗性になり、したがって、ペプチドが安定化し、おそらくその生物活性が維持される（Ｙａｎｇら Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００７；１７５：４５－５４）。

【0255】

残念ながら、臓器線維症に対する有効な療法は存在しない。アミド結合の形成を伴うアミノ酸配列１３３－１８０に対応するエンドスタチンのＣ末端ドメインにより、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで、ヒト皮膚において、初代皮膚線維芽細胞および肺線維芽細胞によるＥＣＭ産生が抑制され、ＴＧＦ－βによって誘導される皮膚線維症が好転した。本明細書で提示されている所見から、Ｅ４を、ＩＰＦ、ＳＳｃ、斑状強皮症、ならびに移植片対宿主病、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、ならびに喘息における上皮下線維症などの他の臓器線維症を含めた線維化障害の治療に使用することができることが実証される。

【0256】

＜実施例８＞
Ｅ４の有効性の確認
ヒトエンドスタチンのカルボキシ末端であるペプチド、Ｅ４により、多数の線維形成因子によって誘発される線維症を減弱させることができる。Ｅ４の抗線維化効果は、線維形成トリガーと同時に投与されるかその後に投与されるかにかかわらず検出することができる。線維症の前臨床モデル４種：ａ）ｉｎ ｖｉｖｏ、マウス皮膚における、ブレオマイシンによって誘導される皮膚線維症、ｂ）マウス皮膚における、ＴＧＦ－βによって誘導される皮膚線維症、およびｃ）ブレオマイシンによって誘導される肺線維症においてＥ４の有効性を確認した。Ｅ４ペプチドまたは対照ペプチド（Ｅ１；エンドスタチンのアミノ末端領域）をＴＧＦ－βもしくはブレオマイシンと同時に、またはＴＧＦ－βもしくはブレオマイシンの３～４日後に投与した。マウスを皮膚線維症のＴＧＦ－βによる開始の１週間後および２週間後、ならびにブレオマイシンにより誘導された肺線維症の２週間後および３週間後に屠殺した。Ｅ４ペプチドの２つの異なる投与形式についても試験した。腹腔内投与および気管内投与が有効であることが確認された。投与したＥ４の量は、１０μｇ／ｍｌであり、皮膚およびＩＰ注射については総体積１００μｌであり、ＩＴ投与については５０μｌであった。

【0257】

これらの試験について、線維症を、Ｈ＆Ｅ皮膚切片（皮膚）での皮膚の厚さの測定、マッソン・トリクローム染色によるコラーゲンレベルの評価（皮膚および肺）、ならびにＳｉｒｃｏｌアッセイによるコラーゲンレベルの測定（肺）によって評価した。さらに、Ｅ４がその抗線維化効果を発揮する機構を確認するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の産生、マトリックス安定化を促進する酵素のレベル、したがって、ＥＣＭ構成成分を分解する酵素の蓄積およびレベル、ならびに線維化促進トリガーの下流の転写因子のレベルを評価した。対応のないｔ検定および三元配置ＡＮＯＶＡ（ＩＤ１データについて）を使用して結果を評価した。

【0258】

結果
Ｅ４により、Ｅ４の単回投与であっても、ブレオマイシンによって誘導される皮膚線維症の有意な減弱が引き起こされた（図８）。Ｅ４により、７日目に、ＴＧＦ－βによって誘導される皮膚線維症の有意な低減が引き起こされた。したがって、Ｅ４により、ＴＧＦ
－βによって誘発される皮膚線維症が予防され（図８）、また、それが逆転する（図９）。

【0259】

ブレオマイシンと同時にまたはブレオマイシンの３日後に投与されたＥ４により、線維症およびマッソン・トリクローム染色の顕著な低減が引き起こされた（図９および図１０）。ブレオマイシンの３日後にもたらされたＥ４ペプチドにより、マウス肺におけるコラーゲンレベルが有意に低下した（図１０Ｂを参照されたい）。

【0260】

Ｅ４により、投与形式にかかわらず、ＴＧＦ－βおよびブレオマイシンによって誘導される皮膚線維症（図８）および肺線維症（図１０）の両方の統計的に有意な低減が引き起こされた。Ｅ４の腹腔内投与および気管内投与のどちらも、皮膚線維症および肺線維症を遮断するのに有効であった。例えば、Ｅ４により、腹腔内投与であったか気管内投与であったかにかかわらず、２１日目に、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症の有意な減弱が引き起こされた（図１１）。したがって、Ｅ４は、投与形式に関係なく、線維症を低減させるのに有効である。

【0261】

結果から、Ｅ４の抗線維化効果が多数の経路を介して発揮されることも証明される。Ｅ４により、コラーゲン、エラスチン、および他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子の架橋結合に関与する酵素であるリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のレベルが低下し、したがって、ＥＣＭが安定化する。Ｅ４により、コラーゲンの安定性が低下し、タンパク質分解をより受けやすくなり得る。図１２は、Ｅ４を用いたまたは用いなかった、ブレオマイシンを用いて処理したマウスの肺切片を示す。

【0262】

Ｅ４に媒介されるＬＯＸの低下はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても検出された。第４継代の正常肺線維芽細胞を、ビヒクル、Ｅ４、ＴＧＦ－β、またはＴＧＦ－βを用いて処理し、続いて、３０分後にＥ４によって処理した（図１３）。４８時間後に、線維芽細胞によって馴化させた培地を、ウエスタンブロット分析を使用して分析した。Ｅ４を用いた処理により、ＬＯＸのレベルが有意に低下した。ＬＯＸ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって調査したところ、同様の結果が得られた。

【0263】

Ｅ４により、フィブロネクチンならびにネイティブなコラーゲンおよび変性コラーゲンを含めたいくつかのＥＣＭ分子を分解する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ－２）の誘導および活性化によるＥＣＭ構成成分の分解も促進される（図１４）。さらに、Ｅ４により、ＴＧＦ－βの作用を阻害する転写因子である分化（ＩＤ）－１の阻害剤のレベルが上昇する（図１５）。ウエスタンブロット分析において、Ｅ４により、処理し、２４時間後に採取した初代ヒト肺線維芽細胞におけるマスタースイッチ転写因子（ｍａｓｔｅｒ ｓｗｉｔｃｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であるＥｇｒ－１（図１６を参照されたい）のレベルが低下することが決定された。Ｅｇｒ－１レベルの低下は、コラーゲン、ＳＭＡおよびフィブロネクチンの低下と対応する。Ｅｇｒ－１は、いくつかの線維化剤（ＴＧＦ－βおよびブレオマイシンを含む）の作用を媒介することが公知である。

【0264】

したがって、Ｅ４は有意な抗線維化効果を発揮した。このペプチドにより、これらの線維化トリガーと同時に投与されるか線維症の開始から数日後に投与されるかにかかわらず、ＴＧＦ－βおよびブレオマイシンの線維形成作用が有意に減弱し、これにより、Ｅ４、および他のＣ末端エンドスタチンポリペプチドが確立された線維症を逆転させるのにも有効であることが示唆される。Ｅ４の抗線維化効果は、ブレオマイシンによって肺線維症を誘導し、ＴＧＦ－βによって皮膚線維症を誘導したマウスに気管内投与したか腹腔内投与したかにかかわらず認められた。さらに、Ｅ４の抗線維化効果は、ＬＯＸの減少を通じたＥＣＭの不安定化、したがって、ＥＣＭ架橋結合の減少、ＭＭＰ－２の活性化によるＥＣ
Ｍ分解の誘導、Ｅｇｒ－１レベルの抑制、および転写因子ＩＤ－１の増加を含む多数の経路を介して発揮された。

【0265】

したがって、いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび４種のｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏにおける線維症の前臨床モデルにより、Ｅ４によって例示されるＣ末端エンドスタチンポリペプチドが、２つの臓器、肺および皮膚における線維症を遮断し、逆転させることができる有効な抗線維化ペプチドであることが示唆される。これらの抗線維化効果ならびにエンドスタチンに特有の抗血管新生効果の欠如により、Ｅ４は、臓器線維症に対する治療用ペプチドとして魅力的なものになっている。

【0266】

＜実施例９＞
植物における経口的に活性な抗線維化タンパク質の産生
表２に示されているＥ３－６Ｈｉｓ－ＫＤＥＬ、Ｅ３－Ｆｃ（Ｃ６７Ａ）、および増大させたＥ３－６Ｈｉｓ－ＫＤＥＬペプチドの発現、精製、および経口送達を評価するために試験を行った。

【0267】

方法
ペプチドを、ＩＢＩＯＬＡＵＮＣＨ（商標）遺伝子発現プラットフォームを使用して植物において発現させた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ブレオマイシンを気管内に与え、併せてＥＮＤ－５５（本明細書ではＥ３－Ｆｃ（Ｃ６７Ａ）およびＣＦＢ０３とも称される）を静脈内（ＩＶ）投与したか、または、ブレオマイシンの８日後にＥＮＤ－５５をＩＶ投与した。１２日目にマウスを屠殺し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびヒドロキシプロリンアッセイの両方のために肺試料を取得した。

【0268】

結果
Ｅ３ペプチドを、ＩＢＩＯＬＡＵＮＣＨ（商標）プラットフォームを使用して植物において発現させた。タグ付けされていないＥ３ペプチドを示差的な溶解性に基づいて精製した。図１８を参照されたい。Ｅ３バリアントペプチド（Ｅ３－６Ｈｉｓ－ＫＤＥＬ、増大させたＥ３－６Ｈｉｓ－ＫＤＥＬ（Ｃ６７Ａ）、およびＥ３－Ｆｃ（Ｃ６７Ａ））のそれぞれが首尾よく産生され、精製された。図１９を参照されたい。

【0269】

マウスにおいて、ブレオマイシンを使用して肺線維症を誘導した。動物を、Ｅ３バリアントまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を経口的に用いて処置した。肺組織像を検査し、経口送達されたＥ３バリアント（Ｅ３－６Ｈｉｓ－ＫＤＥＬおよび増大させたＥ３－６Ｈｉｓ－ＫＤＥＬ）により、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症が低減したことが示された。図２０を参照されたい。

【0270】

図２１および２２に示されている実験に関しては、またマウスにおいてブレオマイシンを使用して肺線維症を誘導した。対照にはＰＢＳを投与し、実験試料にはＥＮＤ５５（Ｅ３－Ｆｃ（Ｃ６７Ａ）とも称される）も経口投与または静脈内投与した。肺におけるヒドロキシプロリン含有量を測定した。

【0271】

ブレオマイシンのみを用いて処置したマウスと比較して、ＥＮＤ－５５を１００μｇまたは２００μｇで用いた処置したマウスでは、ヒドロキシプロリンアッセイを使用して評価された通り、肺線維症が低減した（図２１）。いずれの用量で静脈内投与されたＥＮＤ－５５も、５０μｇで経口投与されたＥＮＤ－５５と同様の有効性を有すると思われた。ブレオマイシン処置の８日後に投与されたＥＮＤ－５５（経口および静脈内の両方）によっても、これらの群のそれぞれで処置したマウスは３匹のみであったが、線維症が低減すると思われた。したがって、これらの試験から、ＥＮＤ５５の経口送達およびＩＶ送達により、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症が予防されること、および、ポリペプ
チドのＩＶ投薬が経口投与と同等であることが示された。図２１および２２を参照されたい。さらに、ＥＮＤ－５５により、同時に投与したか線維化トリガーの後に投与したかにかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症が好転した（ｄ８として示されている；図２１）。したがって、ＥＮＤ５５のＩＶ投与には、肺線維症を逆転させる潜在性がある。

【0272】

【表4】

【0273】

＜実施例１０＞
Ｅ３と融合したＩｇ分子
種々のＦｃドメインとＥ３の融合物を発現させた（Ｅ３－Ｆｃ（ＩｇＧ１）に加えて）。配列は以下の通りであった：
E3_C67A-Fc_IgG2:
MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSASYCETWRTEAPSATG QASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLAIENSFMTERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESN
GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２２）
E3_C67A-Fc_IgG3:
MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSASYCETWRTEAPSATG QASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLAIENSFMTELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK（配列番号２３）
E3_C67A-Fc_IgG4:
MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSASYCETWRTEAPSATG QASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLAIENSFMTESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号２４）
E3_C67A-Fc_IgA1:
MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSASYCETWRTEAPSATG QASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLAIENSFMTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY（配列番号２５）
E3_C67A-Fc_IgA2:
MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSASYCETWRTEAPSATG QASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLAIENSFMTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY（
配列番号２６）
E3_C67A-Fc_IgM:
MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSASYCETWRTEAPSATG QASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLAIENSFMTVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY（配列番号２７）
Ｊ－鎖＿ＰＶＸ＿ｓｇｐ３６：
MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSAQEDERIVLVDNKCK CARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD（配列番号２８）
ＩｇＧ１＿Ｆｃ－Ｅ３＿Ｃ６７Ａ（Ｃ末端融合物）：
MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSAEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLAIENSFMT（配列番号
２９）
図２３に示されている通り、Ｅ３とＩｇＧ２のＦｃ領域の融合物では不十分な発現が示され、精製には不十分であり、ＩｇＧ３との融合物は、可溶性であり、精製され、ＩｇＧ４との融合物は、可溶性であり、精製され、ＩｇＡ１との融合物（±Ｊ鎖）は不溶性であり、ＩｇＡ２との融合物（±Ｊ鎖）は不溶性であり、ＩｇＭとの融合物（±Ｊ鎖）では、不十分な発現が示され、精製には不十分であったが、Ｆｃ－Ｅ３は、可溶性であり、精製された。

【0274】

ＩｇＧ Ｆｃ発現のために、清澄化した植物溶解物をウエスタンブロット（ＧｅｎｗａｙニワトリＥ３抗体）にかけた。融合物は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のヒ
ンジ＋ＦｃドメインのＮ末端、またはＩｇＧ１のヒンジ＋ＦｃドメインのＣ末端のいずれかと連結したＥ３（Ｃ６７Ａ）を含むものであった。ＩｇＧ２融合物では低発現が示されたが、ＩｇＧ３融合物およびＩｇＧ４融合物では中程度の発現が示された。Ｅ３－ＩｇＧ１融合物は十分に発現した。非還元試料は全て大きな構造を形成すると思われたが、おそらく、ＥＮＤ－５５（ｉＢｉｏＣＦＢ０３）ＨＭＷ多量体ほどは大きくなかった（図２４）。

【0275】

ＩｇＡ／Ｍ発現のために、清澄化した植物溶解物を変性緩衝液（全部）または非変性緩衝液（可溶性）中で粉砕し、ウエスタンブロット（ＧｅｎｗａｙニワトリＥ３抗体）にかけた。融合物は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＭのヒンジ＋ＦｃドメインのＮ末端と連結したＥ３（Ｃ６７Ａ）を含有するものであった。ＩｇＡ１融合物およびＩｇＡ２融合物は通常の粉砕緩衝液には不溶性であった。ＩｇＭ融合物の発現は非常に低かった。Ｊ鎖の同時発現には明白な影響はなかった。図２５を参照されたい。

【0276】

＜実施例１１＞
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３：高分子量多量体
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３（本明細書ではＥＮＤ５５またはＥ３－Ｆｃ（Ｃ６７Ａ）とも称される）は、図２６に示されている通り、３０６アミノ酸長の融合タンパク質の多数のサブユニットで構成される高分子量多量体であり、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端に由来する４８アミノ酸の断片（Ｅ３の配列）を有し、分泌リーダーペプチド［太字；２６アミノ酸；分子の小胞体（ＥＲ）への分泌中にＥＲ局在シグナルペプチダーゼによって切断される］が付加されており、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（イタリック体；２３２）と融合したものである。この融合タンパク質は、６７位におけるシステインからアラニンへの突然変異（下線が引かれているおよび太字）および１つのグリコシル化部位（イタリック体および下線が引かれている）も含有する。グリコシル化されていないＥ３－Ｆｃの予測される分子量は、３１，１５３Ｄａである。

【0277】

化学、製造および制御
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３は、３１ｋＤａから３３ｋＤａの間の２つの主要なグリコフォームを有する単量体が繰り返されるおよそ１．２メガダルトン（ＭＤａ）の多量体タンパク質である。多量体は可溶性であり、４℃、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で保管した場合、安定である。

【0278】

製造の方法
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３原薬を、Ｃａｌｉｂｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＬＬＣ（８８００ ＨＳＣ Ｐｋｗｙ、Ｂｒｙａｎ、ＴＸ ７７８０７）において、上流の産生の農業規模化、その後の従来の下流の精製および配合プロセスを可能にする、一過性の植物に基づく発現系を利用するＩＢＩＯＬＡＵＮＣＨ（商標）プラットフォームを使用して製造した。製造プロセスの概要を図２７に示す。

【0279】

原薬製造プロセスの要約
マスターセルバンク（ＭＣＢ）およびワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の生成
コドン最適化配列
エンドスタチンＥ３ペプチド（ヒトコラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）鎖プレプロタンパク質のアミノ酸１，４６６～１，５１３、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０８５０５９．０２）の遺伝子配列を、突然変異オリゴを用いた鎖重複伸長（Ｓｔｒａｎｄ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＳＯＥ）を使用してＥ３ペプチドの最後のシステインをアラニンに突然変異させることによって改変した。得られたＥ３ペプチド突然変異体Ｃ６７Ａ配列をＮｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａエクステンシン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ３４０７３．１）のシグナルペプチドと、およびヒト免疫グロブ
リンＧ１ Ｆｃ領域（アミノ酸２１６～４４７、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ２０４５４）と、ＳＯＥによって融合して、候補遺伝子ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を形成した（表３；図２６）。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３遺伝子を、植物における発現のために、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍコドン使用表を使用してコドン最適化し、ＩＢＩＯＬＡＵＮＣＨＴＭ（商標）タバコモザイクウイルスに基づくベクターｐＧＲ－Ｄ４に、制限部位ＰａｃＩとＸｈｏＩの間にクローニングしてベクターｐＳＭ０４２を生成した（図２８）。

【0280】

【表5】

【0281】

アグロバクテリウムベクター株ＧＶ３１０１へのクローニング
次いで、発現ベクターｐＳＭ０４２をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＧＶ３１０１にヘルパープラスミドｐＳＯＵＰと共にエレクトロポレーションによって動員した（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ０４８８７０．１）（Ｈｅｌｌｅｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０００；４２（６）：８１９－８３２）。ｐＳｏｕｐは、ｐＧｒｅｅｎに含有されるｐＳａ Ｏｒｉ配列に対して、それがアグロバクテリウムにおいて複製することが可能になるようにトランスで作用するＲｅｐＡをコードする。アグロバクテリウムクローンを、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレート上で５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、２５ｍｇ／Ｌのリファンピシンおよび１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンに対して選択した。カナマイシン耐性はｐＧＲ－Ｄ４発現ベクターによりもたらし、リファンピシン耐性はＧＶ３１０１アグロバクテリウム株によりもたらし、テトラサイクリン耐性はヘルパーベクターｐＳＯＵＰによりもたらした。２８℃で３日間インキュベートした後、各細菌培養物を振とうインキュベーター中、２８℃、２２５ｒｐｍで増幅するために、単一のコロニーを採集して、液体ＬＢ培地（上記の抗生物質を補充したもの）に接種した。各クローンをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって同定し、特異的な挿入断片を、ｐＧＲ－Ｄ４発現ベクターにおいて挿入断片の上流に結合する特異的なプライマーを使用した配列決定によって確認した。確認されたら、最初のアグロバクテリアＭＣＢおよびＷＣＢを生成し、２つの別々の冷凍装置中、－７０℃で保管した。

【0282】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３発現
ステップ１－トレーの組立て、播種トレー
公称サイズ４フィート×３フィートのアルミニウム植物生長トレーを使用した。２４０個のロックウールのプラグを含有するＳｔｙｒｏｆｏａｍプラグトレーに自動真空針播種機で播種した。４つのプラグトレー（９６０の植物体）をアルミニウム発芽トレーのそれぞれに置き、発芽室に運んだ。

【0283】

ステップ２－植物の発芽生長
植物を、光合成および最適な植物の生長が最適化されるように強度を調節したスペクト
ル的に適正な光によるＬＥＤ照明を備えた縦型ラック中、２７℃で３週間にわたって発芽させた。滴下潅水を使用して、水耕生長に必要な無機質の改変ホーグランド溶液を送達した。植物の生長を支持するために土壌または他の材料は使用しなかった。

【0284】

ステップ３－低密度トレーへの移植
３週間生長させた時点で、発芽した植物を含有するプラグを、葉の増大を可能にするために、トレー当たり３２０の植物体のみが配置された４フィート×４フィートの生長トレーに機械的に移植した。植物を２５℃でさらに２週間生長させた。この段階で各植物の葉バイオマスはおよそ８～１０グラムであった。

【0285】

ステップ４－アグロバクテリウムの成長
選択されたアグロバクテリウムクローンを、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、２５ｍｇ／Ｌのリファンピシンおよび１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを補充したＬＢ培地を含有する培養フラスコ中のワーキングセルバンクから、２８℃、２２５ｒｐｍで撹拌しながら成長させた。ＯＤ_{６００ｎｍ}が約１．５に達した培養物を収集し、２ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．６を含有する逆浸透精製水中５０倍に希釈した。

【0286】

ステップ５－植物へのベクターの真空アグロインフィルトレーション（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
アグロバクテリアを１時間にわたって誘導した後、５週齢の植物に、ゲージで２３インチＨｇのところに真空浸潤を行った。真空浸潤の前に、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物体を、私有の赤色／青色ＬＥＤ光の下、約２７℃、相対湿度約５０％で５週間にわたって水耕法で生長させた。アグロインフィルトレーション処理した植物を一定のＬＥＤ光の下、約２５℃、相対湿度約５０％でインキュベートした。

【0287】

ステップ６－浸潤後生長
浸潤後の室内水耕生長条件により、植物を調節光レジメンの下、２５℃で維持した。浸潤の６日後、抽出のために植物を採取場に自動的に運んだ。

【0288】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３－精製プロセス
ステップ７－植物採取－ホモジナイズおよび遠心清澄化
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３（Ｅ３－Ｆｃ）を発現するＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａバイオマスを、ワーリング強力実験グレードステンレス鋼ブレンダーを用い、水性酸性化（ｐＨ４．８－５．２）抽出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、６０ｍＭのアスコルビン酸、および１ｍＭのＰＭＳＦ）中で１分にわたって機械的にホモジナイズした。バイオマスを遠心分離によって部分的に清澄化し、その後、１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを６．２に調整した。

【0289】

ステップ８－深層濾過
抽出物を深層濾過（公称保持評価１．２／０．２μｍ）によってさらに清澄化した。

【0290】

ステップ９－限外濾過
清澄化された抽出物を、７５０ｋＤａ分画分子量（ＭＷＣＯ）孔径の線維１ｍｍを含有する中空繊維接線流濾過（ＴＦＦ）モジュールに適用した。抽出物を、せん断速度６，０００～８，０００ｓｅｃ^－１および膜間差圧５～７ｐｓｉで、７５０ｋＤａ ＭＷＣＯを通して濾過した。

【0291】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の精製をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって最初に評価した。図２９において見ることができるように、上記の手順によって精製されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３は、変性していない状態（加熱
処理およびβ－メルカプトエタノールを伴わない；レーン６）ではゲルに進入することができなかった。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の試料（レーン４）は、Ｅ３とアミノ酸組成が同じであるが一次配列がスクランブルされ、ＩｇＧ１－Ｆｃと融合したペプチドである、対照試薬（ＥＮＤ－８１）（レーン５）と同様に挙動した。これらの結果により、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３が、天然には植物において産生された際に高分子量アレイとして存在すること、この挙動は精製方法に起因するものではなく、実際には、同様の非極性Ｎ末端配列を有するＦｃ融合タンパク質に内因性のものであることが示唆される。一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ変性条件下（熱プラスβ－メルカプトエタノール）で電気泳動した場合、大多数の精製されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３（レーン３）は見かけの分子量が約３５ｋＤａおよび約３２ｋＤａである２つのバンドに分離された。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３（レーン１）およびＥＮＤ－８１対照試薬（レーン２）についても同様の結果が得られる。これらの結果は、二重のバンドパターンが、精製方法または融合タンパク質のＥ３関連部分の一次配列に起因するものではなく、Ｆｃ融合パートナーのグリコシル化パターンの差異に起因する可能性があることを示すものである。さらに、見かけの分子量がｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３二量体（約７０ｋＤａ）、三量体（約１１０ｋＤａ）、および四量体（＞１５０ｋＤａ）と一致するバンドも変性試料において観察され、これは精製方法に関係なく見られ、また、対照試薬においても観察された。これらの追加的なバンドから、高分子量アレイが、異常に安定であり、一般的な電気泳動変性条件に抵抗するものであり、また、疎水性ペプチドとヒトＦｃの融合物の追加的な特質であり得ることが示される。これらの挙動に起因して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥはｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を特徴付けるために好ましい方法ではない。

【0292】

ＴＦＦ保持液の純度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で評価し、非浸潤保持液と比較した（図３０）。ネイティブな非還元条件下では、ＳＥＣクロマトグラムから、保持時間６分（分子量１．２ＭＤａに対応することが推定）において単一のｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３ピークが明らかになり、これは、非浸潤バイオマスでは完全に存在しない。保持液は、主にｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３産物で構成され、残りには植物宿主細胞タンパク質が寄与する。産物はＰＢＳおよび生理食塩水に５０ｍｇ／ｍＬのレベルで可溶性である。

【0293】

ステップ１０－陽イオン交換クロマトグラフィー
次いで、ＴＦＦ保持液を、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーのために、濾過（公称保持評価１．２／０．２μｍ）、１Ｍの酢酸を用いてｐＨを５．３～５．７に調整すること、および超純水を添加することによって伝導率を４～６ｍＳ／ｃｍに調整することによって調製した。ＣＥＸクロマトグラフィーの間に、最大２５０ｍＭの塩化ナトリウムを用いて洗浄することによって残りの不純物を除去し（図３１のＣＥＸ洗浄；図３２のレーン３～５および９、図３３の上部）、５５０ｍＭの塩化ナトリウムを９５％以上の純度で用いてｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を溶出した（図３１のＣＥＸ溶出；図３２のレーン６および１０；図３３の底部）。

【0294】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用してＣＥＸ画分の含有量を評価した（図３２）。レーン２～７の試料を、２６６ｍＭのβ－メルカプトエタノールの存在下、７０℃で１０分間加熱した後、ローディングした。レーン９および１０の試料は、β－メルカプトエタノールを含有せず、電気泳動前の加熱も行わなかった。レーン３～５は、それぞれ１００ｍＭ、１５０ｍＭおよび２５０ｍＭのＮａＣｌを含有する洗浄画分１Ａ１、１Ａ４および１Ａ９に対応する（図２９）。レーン６は、溶出画分１Ｂ２（５５０ｍＭのＮａＣｌ）を示し、これは、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３産物を還元剤（例えば、熱およびβ－メルカプトエタノール）に曝露させた場合に観察可能な単量体種（約３５ｋＤａ）、二量体種（約７０ｋＤａ）、三量体種（約１１０ｋＤａ）および四量体種（約１５０ｋＤａ）を示すものである。溶出画分１Ｂ２をβ－メルカプトエタノールの不在下で、電気泳動前の加熱も行わずにローディ
ングした場合（レーン１０）、ＨＭＷ ｉＢｉｏ－ＣＦＢ－０３多量体は、ゲルの起点で可視化することができる。

【0295】

ステップ１１－ダイアフィルタレーション緩衝液の交換および滅菌濾過
次いで、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３ ＣＥＸ溶出プール材料を１２．５ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、緩衝液を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ ＴＦＦ（安定化されたセルロース）を膜間差圧２～４ｐｓｉで使用してＴＦＦによってリン酸緩衝生理食塩水と交換した。

【0296】

ステップ１２－バルク原薬の包装
バルク原薬を滅菌濾過し、バイオセーフティキャビネット内で、滅菌袋で包装した。バルク産物を最終的な充填のために選択された充填設備に移す。

【0297】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の特徴付け
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のＳＥ－ＨＰＬＣ分析
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３試料をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析して、ＨＭＷ多量体の純度を評価した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析はＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ ｘＬ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍのカラムでＵＶ検出を伴う１１００シリーズＨＰＬＣシステムを使用して実施した。ＳＥ－ＨＰＬＣの移動相は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（一塩基、一水和物）、リン酸ナトリウム（二塩基、無水物）および０．３Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０からなるものであった。試料分析の前に、タンパク質混合物標準物質を調製し、２０μＬをカラムに注射した。サイログロブリン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）、オボアルブミン（１ｍｇ／ｍＬ）、α－ラクトアルブミン（１ｍｇ／ｍＬ）およびアプロチニン（０．４ｍｇ／ｍＬ）からなるＳＥ－ＨＰＬＣタンパク質混合物標準物質を使用して、試料クロマトグラフィーピークの分子量を決定した。移動相緩衝液をブランク注射として使用した。試料分析の前に、カラムを、移動相を用いて平衡化した。試料をカラムにおいて毎分１．０ｍＬの流速で１５分の総実行時間にわたって分離した。

【0298】

ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ．０１．０４ ０２５）を用いてデータ解析を実施した。吸光度を２２０ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて記録した。各試料のＵＶシグナルを統合し、検出された各ピークの相対的なパーセント存在量を決定した。パーセント相対的な存在量が０．１％以上の全てのピークを数量化の考慮に入れた。

【0299】

非還元条件下でのｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のＳＥ－ＨＰＬＣ分析では６分の時点で主要なピークが示され、これは、図３４に示されている通り、タンパク質混合物標準物質からのサイログロブリン二量体のピーク（１．２ＭＤａ）に明白に重ね合わされ、これにより、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３が高次タンパク質構造として存在することが示される。１０．２分の時点でも別の小さなピークが観察され、これは、タンパク質混合物標準物質に重ね合わせるとおよそ５０ｋＤａのピークに対応する。１２．６分および１２．９分の時点の２つの小さなピークは２８０ｎｍでは検出されず、非タンパク質不純物であるとみなされた。保持時間６分および１０．２分におけるピークを別々に分画収集し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ
ＭＳを使用してそれらの同一性を決定するためにトリプシン消化に供した。

【0300】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３試料を、ＨＭＷ多量体の分子量を得るために非還元条件下および還元条件下でＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによって分析し、その後、配列確認のためにトリプシン消化した。還元分析に関しては、試料を０．５ＭのＢＭＥで処理し、７０℃で１０分間加熱した。シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（α－ＣＨＣＡ）（Ｓｉｇｍａ）およびシナピン酸マトリックスをトリプシンペプチドおよびそれぞれＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを使用した分子量決定のために使用した。シナピン酸マトリックス溶液を３０：７０アセ
トニトリル（ＡＣＮ）：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中１０ｍｇ／ｍＬに調製し、α－ＣＨＣＡマトリックスを１：１：１エタノール：ＡＣＮ：０．１％ＴＦＡ中１０ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、試料を０．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中に１：９の比で混合し、混合物１．５μＬを分析のためにＭＡＬＤＩプレート上にスポットした。

【0301】

試料を完全に風乾させた後に分析し、およそ２～３分にわたってマトリックスと共結晶化させた。次いで、プレートをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計にローディングした。ペプチド分析のための取得は手動で行い、計器のモードは「Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ」、「Ｄｅｌａｙｅｄ」、および「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」に設定し、加速電圧およびグリッドはそれぞれ２０ｋＶおよび６６～７４％に設定し、遅延時間は約１２５ｎｓｅｃとした。ショット／スペクトルを１５０に設定し、５００～４，０００Ｄａの質量範囲および４００Ｄａの低質量ゲーティングを用いた。較正およびデータファイルスペクトルを取得するためにα－ＣＨＣＡマトリックスを選択した。取得を開始する前、イオン供給源およびミラー圧は常にそれぞれ５．０×１０^－７ｔｏｒｒ未満および１．２×１０^－７ｔｏｒｒ未満にした。最初のレーザーパワーは較正のために１２５０に設定し、スペクトル取得中に必要に応じて調整した。２点質量較正曲線を、標準の試験混合物におけるＡＣＴＨ（２，０９３．０８６７Ｄａにおける１～１７断片）分離の質量ピークおよびブラジキニン（９０４．４６８１Ｄａにおける２～９断片）質量ピークを用いて作成し、標準操作手順（ＳＯＰ）に詳述されている通りタンパク質試料分析に適用した。試験混合物スペクトルを再度取得することによって較正ファイルを試験し、いずれかのペプチドのモノアイソトピック質量が＞±０．２Ｄａである場合にはファイルを棄却し、再度取得した。各ペプチドのモノアイソトピック質量を較正に使用した。

【0302】

同様に、分子量分析に関しては、計器モードを「Ｌｉｎｅａｒ」、「Ｄｅｌａｙｅｄ」および「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」に設定し、加速電圧を２５ｋＶとし、グリッドを６６～７４％に設定し、遅延時間を２００ｎｓｅｃとした。ショット／スペクトルを２００に設定し、４，５００～２００，０００Ｄａの質量範囲および４，０００Ｄａの低質量ゲーティングを用いた。較正およびデータファイルスペクトルを取得するためにシナピン酸マトリックスを選択した。最初のレーザーパワーは較正のために１８００に設定し、ペクトル取得中に必要に応じて調整した。１点較正曲線を、ミオグロビン（１１，６５２．５２Ｄａ）平均質量ピークを用いて作成した。

【0303】

還元条件下でのｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のＭＡＬＤＩスペクトルでは、ｍ／ｚ３１，１６６．９４［Ｍ＋Ｈ］^＋およびｍ／ｚ３３，０６８．８８［Ｍ＋Ｈ］^＋が示され、これは、それぞれグリコシル化されていない（Ｅ３－Ｆｃ Ｎｏｎ－ｇｌｙ）ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３およびグリコシル化された（Ｅ３－Ｆｃ Ｇｌｙ）ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を表す（図３５）。スペクトルは、安定な多量体の単量体サブユニットを示す。

【0304】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の還元バンドおよび非還元バンドのゲル内トリプシン消化を実施して、バンドの同一性を確認した（図３６）。還元条件については、分子量マーカーに従って、バンド１は約３５ｋＤａに対応し、バンド２は約７０ｋＤａに対応し、バンド３は約１００ｋＤａに対応する。次いで、各バンドからのトリプシンペプチドを使用してｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の配列カバレッジを得た。非還元条件については、バンド１は、決してウェルから離れないＨＭＷ多量体である。

【0305】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３還元バンド１のゲル内トリプシン消化により、Ｅ３およびＨＭＷ多量体のＦｃ領域に由来するいくつかのペプチドがもたらされた（図３７）。以下に示されているｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３配列では、Ｅ３ペプチドが黄色で強調表示されている。ＭＡＬＤＩスペクトルにおいて、同定されたペプチドの全ての配列が色分けされ、それらのそれぞれの質量が強調表示されている（図３８）。

【0306】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のさらなる特徴付け
さらなる分析を使用してｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を特徴付ける。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の均一性を評価し、また、分子量の推定値を導き出すことができる分子の直径を決定するために、ネガティブ染色電子顕微鏡を使用する。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のグリコシル化パターンの特徴付けも実施する。

【0307】

ＲＰ ＨＰＬＣカラムでの分離によって調製されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の正確な分子量を決定するために、ＨＰＬＣとインターフェース接続した四重極飛行時間（Ｑ－ＴＯＦ）を使用してさらなる質量分析分析を実施する。

【0308】

効力アッセイ
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の効力の提案された評価では、線維症に関与する２つのメディエーターである、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の活性およびマトリックスメタロプロテアーゼ－１（ＭＭＰ－１）のタンパク質含有量を評価するために、二峰性の手法をとる。ｕＰＡおよびＭＭＰ－１アッセイを使用して、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３バッチの効力を、以前の機構的試験におけるそれらの頑強性に基づいて推定する。

【0309】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の概念実証および特定の作用機構を決定するために、いくつもの実験を実施した。これらの試験および結果は、本明細書に詳細に記載されている。大多数の概念実証アッセイおよび作用機構実験は、Ｅ３ペプチドのアミド化した形態であるＥ４を用いて実施した。組換えｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を使用して以下に提案されている効力アッセイを実施し、条件づける。

【0310】

ｕＰＡ活性アッセイ
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子は、その受容体ｕＰＡＲと共に、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換をもたらすタンパク質分解カスケードを開始する（Ｃｈｏｏｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ．２００３；４１５：Ｓ４６－５８）。ｕＰＡは、細胞外のタンパク質分解において、下流の酵素を活性化し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と相互作用するプラスミノーゲン系におけるその役割を介して重要な機能を有する。さらに、臓器の選択では、ｕＰＡは、抗線維化因子である潜在的なＨＧＦの化学量論的活性化において重要である（Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５；２７０：６０３－６１１）。ｕＰＡは、細胞外環境においてまたはｕＰＡＲと結合している間にタンパク質分解により活性化される不活性タンパク質として産生される。ＩＰＦ患者ではｕＰＡのレベルが有意に低下し（Ｇｕｎｔｈｅｒら、ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓおよびＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２０００；８３：８５３－８６０）、また、肺線維症の患者の気管支肺胞洗浄液ではプラスミノーゲン活性化が損なわれることが報告されている。多数のグループにより、ｕＰＡには種々の臓器および動物モデルにおける抗線維化効果があることが実証されている。例えば、喘息のマウスモデルでは、吸入されたｕＰＡにより気道リモデリングが低減し（Ｋｕｒａｍｏｔｏら、Ａｍ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．－Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９；２９６：Ｌ３３７－３４６）、マウス肺におけるｕＰＡのトランスジェニック発現により、線維症からの保護がなされた（Ｓｉｓｓｏｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｙｈｅｒａｐｙ １９９９；１０：２３１５－２３２３；Ｓｉｓｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．－Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２；２８３：Ｌ１０２３－１０３２；Ｉｄｅｌｌ、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００３；１６８：１２６８－１２６９）。Ｈｓｕらにより、ＳＳｃの患者およびＩＰＦの患者の線維化肺組織ではｕＰＡのレベルが低下することが示されている（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２０１１；６３：７８３－７９４）。試験から、Ｅ４によりｕＰＡのレベルおよび活性が低下することも実証されている。

【0311】

初代ヒト線維芽細胞を、ヒト組換えＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクル対照としてＰＢＳと共に、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３（１０μｇ／ｍｌ）またはＤＭＳＯ（陰性対照）と共にインキュベートすることによってアッセイを実施する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓからのｕＰＡ活性アッセイ（Ｈｕｍａｎ ｕＰＡ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、カタログ番号ＨＵＰＡＫＴ）を使用して初代ヒト線維芽細胞におけるｕＰＡの活性を測定する。アッセイは、ヒトＰＡ－１と共有結合することができるｕＰＡを検出するＥＬＩＳＡである。アッセイの原理は、試料中の機能的に活性なｕＰＡが、アビジンをコーティングしたプレートに結合したビオチン化ヒトＰＡ－１と共有結合による複合体を形成するというものである。次いで、結合したｕＰＡを、西洋ワサビペルオキシダーゼ二次Ａｂと反応する抗ｕＰＡ一次抗体（Ａｂ）を用いて検出し、その後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて４５０ｎｍにおいて検出する。不活性のｕＰＡまたは複合体を形成しているｕＰＡは結合せず、検出されない。呈色の量は、試料中の活性なｕＰＡの濃度に正比例する。試料中の活性なｕＰＡの濃度は、ｕＰ検量線から決定される。

【0312】

ＭＭＰ－１タンパク質および活性アッセイ
ＭＭＰは、ＥＣＭおよび他のタンパク質を切断する亜鉛依存性プロテアーゼである（Ａｍａｌｉｎｅｉら、２００７）（Ｐａｒｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４；４：６１７－６２９）。ＭＭＰ－１は、プロトタイプ間質性コラゲナーゼ１であり、ヒト組織における線維化コラーゲンの分解に重要な酵素である（Ａｍａｌｉｎｅｉら、Ｒｏｍ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ Ｅｍｂｒｙｏｌ ２００７；４８：３２３－３３４）。ＭＭＰの活性が増大することにより線維症が消散し得るという証拠は、種々の癌を治療するために、広範に作用するメタロプロテアーゼ阻害剤を使用し、ＭＭＰ阻害剤で、患者に、どちらもＳＳｃにおいて生じる皮膚の肥厚および関節拘縮が発生した臨床試験の報告によってもたらされる（Ｐａｒｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４；４：６１７－６２９に概説されている）。ＭＭＰ－１の治療的潜在性を支持する科学的証拠が存在し、例えば、ＭＭＰ－１の一過性発現が肝線維症を減弱するのに十分であり（Ｉｉｍｕｒｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ
２００３；１２４：４４５－４５８；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＭＰ－１ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｈａｖｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｇｅｏｒｇｅ、Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）２０１２；１２２：８３－９２；Ｆｏｒｏｎｊｙ、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｓ．２００８；３１：７２５－７３５）；ヒトＭＭＰ－１の発現により心筋線維症が予防され（Ｆｏｒｏｎｊｙら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｓ．２００８；３１：７２５－７３５）、また、組換えＭＭＰ－１により筋肉線維症が消散する（Ｋａａｒら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ ２００８；４：１４１１－１４２０）。Ｙａｍａｇｕｃｈｉらは、Ｅ４により、コラーゲンの架橋結合および安定化に関与する酵素であるリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のレベルが低下することを以前報告している（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．、２０１２；４：１３６ｒａ１７１）。これらの所見から、Ｅ４により、ＬＯＸが減少し、したがって、ＭＭＰ－１およびＭＭＰ－３のレベルが上昇することによりＥＣＭの分解が容易になることによってＥＣＭが弱まることが示唆される。これにより、Ｅ４の、進行中の線維症をＭＭＰ媒介性マトリックス分解によって低減する能力も説明される。プラスミノーゲン系を介したＭＭＰ－１およびＭＭＰ－３の活性化は文献で十分に裏付けられている（Ｇｈａｒａｅｅ－Ｋｅｒｍａｎｉら、Ｅｘｐ．Ｏｐ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ２００８；１７：９０５－９１６に概説されている）。ＭＭＰ－１およびＭＭＰ－３はまた、ＨＧＦによっても誘導され得る（Ｊｉｎｎｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５；３３：３５４０－３５４９；Ｋａｎｅｍｕｒａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｓ．２００８；３８：９３０－９３９；Ｍｏｎｖｏｉｓｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００２；９７：１５７－１６２
；Ｄｕｎｓｍｏｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：２４５７６－２４５８２；Ｈｕｅｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４；６７：６４３－６５４）。

【0313】

他の試験から、Ｅ４により、ヒト初代線維芽細胞におけるＭＭＰ－１発現が誘導されることが明らかになった。データから、Ｅ４を用いて処理した線維芽細胞の上清においてＭＭＰ－１活性が上昇することも示される。ＭＭＰ－１レベルを、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３についての効力試験の一部として、初代線維芽細胞におけるＭＭＰ－１タンパク質レベルの定量的測定として市販のＥＬＩＳＡキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＲＡＢ０３６２－１ＫＴ）を使用してアッセイする。簡単に述べると、試料を、固定化されたＭＭＰ－１抗体でコーティングされた９６ウェルプレートにピペットで入れ、続いて洗浄した後、ビオチン化ヒトＭＭＰ－１抗体と共有結合による複合体を形成させる。結合したＭＭＰ－１を西洋ワサビペルオキシダーゼと反応させ、次いで、ＴＭＢ基質溶液を用いて検出する。不活性なＭＭＰ－１または複合体を形成しているＭＭＰ－１は結合せず、検出されない。呈色の量は、試料中のＭＭＰ－１の濃度に正比例し、色の全体的な強度を４５０ｎｍにおける吸光度によって決定する。

【0314】

初代線維芽細胞におけるＭＭＰ－１活性レベルを、市販の抗体アレイキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ カタログ番号ＡＡＨ－ＭＭＰ－１）を使用してもアッセイする。簡単に述べると、試料を、抗体でコーティングした膜を含有する８ウェルインキュベーショントレーにピペットで入れ、インキュベートする。続いて洗浄した後、試料をビオチン化抗体と共にインキュベートする。結合したＭＭＰ－１を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンと反応させ、その後、検出緩衝液を用いて検出する。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍＲイメージングシステム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて測定される通り、シグナル強度は試料中の活性なＭＭＰ－１の濃度に正比例する。

【0315】

安定性評価
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を、リアルタイムの実際の状態での安定性について、標識された保管の状態、凍結した状態、および加速された状態で、植物により産生されたポリペプチドの少なくとも３つのバッチ（ＤＳ）について、および投与のために製剤化されたポリペプチドの各ロット（ＤＰ）について評価する。ＤＳについての安定性試験の持続時間は、リアルタイムの実際の状態および凍結した状態については１２カ月であり、加速された状態については６カ月である。ＤＰについての安定性試験の持続時間は、リアルタイムの実際の状態および凍結した状態については３６カ月であり、加速された状態については６カ月である。ＤＳについては、全ての状態についての試験頻度を、放出時および３カ月毎とする。ＤＰについては、リアルタイムの実際の状態および凍結した状態についての試験頻度は、放出時および３カ月、６カ月、９カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月および３６カ月とし、加速された状態については放出時および３カ月毎とする。ＤＰの保管方向、直立、倒立および水平の位置について、安定性を評価する。

【0316】

非臨床
非臨床有効性試験の要約
エンドスタチンならびに化学的に合成されたペプチドであるＥ３およびＥ４を用いて実施した試験により、抗線維化効果の別の証拠がもたらされた。これらの化学的に合成されたペプチドは、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３で見られるような高分子量多量体を形成しない。ヒト皮膚ｅｘ ｖｉｖｏモデルにおいてＴＧＦ－βの皮内注射によって線維症が誘導された、またはＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＴＧＦ－βもしくはブレオマイシンの皮下（ｓ．ｃ．）投与によって線維症誘導された、ＳＳｃモデルにおいて、有効性が観察された。化学合成によって作製されたＥ３ペプチドおよびＥ４ペプチドを皮内投与またはｓ．ｃ．投与した場合、皮膚の厚さ、コラーゲン含有量、およびヒドロキシプロリン含有量の低減に
よって実証された通り、これらのモデルにおける線維症が減弱した。ブレオマイシンによって誘導されるＳＳｃマウスモデルでは、予防的投薬レジメンおよび介入的投薬レジメンのどちらでも線維症の低減が実現された。これらのペプチドは、ヒト肺線維芽細胞の初代培養物においてＴＧＦ－β処理によって誘導されるＩＰＦモデル、またはＣ５７ＢＬ／６マウスの肺にブレオマイシンを滴下注入することによって誘導されるＩＰＦモデルにおいても有効であった。ペプチドを、線維芽細胞培養物に投与した、または、マウスに、経口的に、静脈内にもしくは気管内にもたらした。

【0317】

エンドスタチンは、抗線維化薬として有用であり得る。エンドスタチンにより、機械的創傷によって誘導されるウサギ耳瘢痕モデルにおいて（Ｚｈｉｙｏｎｇら、Ｉｎｔ Ｊ Ｌｏｗ Ｅｘｔｒｅｍ Ｗｏｕｎｄｓ ２０１２；１１（４）：２７１－２７６；Ｒｅｎら、Ｊ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．Ｂ．２０１３；１４（３）：２２４－２３０）、ラットへの気管内（ｉ．ｔ．）ブレオマイシン投与によって誘導されるＩＰＦモデルにおいて（Ｗａｎら、Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ．２０１３；１４（１）：５６）、マウスへの四塩化炭素の投与によって誘導される肝線維症モデルにおいて（Ｃｈｅｎら、Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２０１４；２３９（８）：９９８－１００６）、およびラットへのストレプトゾトシン投与によって誘導される糖尿病／腎線維症モデルにおいて（Ｂａｉら、Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ．２０１４；９（４）：１－１２）、傷害パラメーターが逆転した。

【0318】

ペプチドＥ３およびＥ４を用いて以前に確立されたモデルに基づいて、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を様々な用量および投薬スケジュールで用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験を行う。組換えｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３も効力アッセイにおいて使用する。

【0319】

【表6】

【0320】

ｉｎ ｖｉｖｏマウスＳＳｃモデル
ブレオマイシンの気管内投与によって１２日の時間枠内に肺線維症を誘導することができる、マウスＳＳｃモデルが確立されている（図３９を参照されたい）。このモデルは、線維症の発生を減弱するためにエンドスタチンペプチドＥ３およびＥ４を使用する経験に基づいて構築されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の有効性を実証するために使用されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．、２０１２；４：１３６ｒａ１７１）。このモデルにおいて、ブレオマイシンを用いた処置の１０日後および２１日後にＳｉｒｃｏｌアッセイを用いて肺組織像およびコラーゲン含有量を測定した（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．、２０１２；４：１３６ｒａ１７１）。

【0321】

ヒドロキシプロリンは、コラーゲンに特有のアミノ酸であり、このタンパク質を数量化するために伝統的に使用されている。当該方法により、湿組織１ｍｇ当たりのヒドロキシプロリンの総量の定量的決定がもたらされる。当該技法により、ヒドロキシプロリンを測定するためのハイスループットかつ正確な方法がもたらされ、それにより、コラーゲンを
様々な形式で数量化することが可能になる。一部の例では、線維化組織の割合および分布を評価するために、ヒドロキシプロリン含有量アッセイを、トリクローム染色技法（または適切な代替）を使用する独立した線維症の組織学的決定によって補完するべきである。

【0322】

組織線維症／コラーゲン沈着を評価するために、ヒドロキシプロリン数量化アッセイを実施した。肺試料を取り出し、６ＮのＨＣｌ １ｍＬ中、１１０℃で一晩、消化した。６ＮのＮａＯＨを用いて中和した後、ｐＨを６．０～９．０の範囲内に調整し、試料をクロラミンＴ溶液（１．４％クロラミンＴ、１０％イソプロパノール、０．５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０）１ｍＬと混合し、室温で２０分置いた。クロラミンＴ溶液を用いた処理後、試料を、エーリッヒ溶液（１４．９％ｐジメチルアミノベンズアルデヒド、７０％イソプロパノール、２０％過塩素酸；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｍＬと混合し、６５℃で１５分インキュベートした。一定分量を９６ウェルプレートに移し、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。コラーゲン含有量を、ヒドロキシプロリン１μｇが６．９４μｇに対応する換算係数を使用して、シス－４ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて作成した検量線と比較することによって算出した。このアッセイは、下記のｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を使用する試験において使用されており、また、このマウスモデルにおける非臨床試験において使用される。

【0323】

ブレオマイシンマウスモデルにおけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の静脈内投与および経口投与
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ブレオマイシンｉ．ｔ．を、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の静脈内（ＩＶ）投与と併せてもたらした、または、ブレオマイシンの８日後にｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３をＩＶ投与した。マウスを１２日目に屠殺し、Ｈ＆Ｅ染色（図４０）およびヒドロキシプロリンアッセイ（図４１）の両方のために肺試料を取得した。実験計画図を図３９において見ることができる。ブレオマイシンのみを用いて処置したマウスと比較して、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３、ＩＶ、マウス当たり１００μｇまたは２００μｇで繰り返し処置したマウスでは、ヒドロキシプロリンアッセイを使用して評価された通り、肺線維症が低減した。いずれの用量で静脈内投与されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３も、５０μｇで経口投与されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３と同様の有効性を有すると思われた。ブレオマイシン処置の８日後に投与されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３（経口的および静脈内のどちらも）でも線維症が低減すると思われた。しかし、これらの群のそれぞれで処置されたマウスは３匹のみであった。したがって、これらの実験を、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３をマウス当たり２００μｇでＩＶ投与すること（ｎ＝９）またはマウス当たり５０μｇで経口投与すること（ｎ＝９）を用いて繰り返した（図４２）。マウス当たり１００μｇのｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を用いてＩＶ処置したマウスでは、ブレオマイシンのみを用いて処置したマウスと比較して肺線維症が低減した。ＩＶまたは経口経路のいずれによる投与でも有効性は同様であると思われた。

【0324】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３により、同時投与か線維化トリガー後の投与か（ｄ８と表される）にかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症が好転した。１×ＰＢＳをビヒクルとして使用した。平均コラーゲン値は、肺当たりのマイクログラム数として示される。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を経口投与（経口）または静脈内投与（ＩＶ）した。図４１のエラーバーは、平均の標準偏差を表す。Ｐ値を、クラスカル・ワリス検定、その後、マン・ホイットニーのＵ検定を使用して算出した。

【0325】

マウス皮膚ＳＳｃモデルにおけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の浸透圧ポンプ投与
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３３ｍＵのブレオマイシンを７日間、ブレオマイシンを皮下送達するためにマウスの背中に外科的に埋め込んだミニ浸透圧ポンプを使用してもたらした。７日目に、ポンプを取り出し、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３４６０μｇを含有するポンプと交換し、さらに７日間にわたってｓ．ｃ．投与した。３５日目にマウスを屠殺し、ポンプ
部位と逆側の背中から皮膚を切り取り、ホルマリン固定し、パラフィンに包埋した。皮膚切片をＨ＆Ｅで染色し（図４３）、皮膚の厚さ（図４４）を測定した。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を用いて処置したマウスでは、ヒドロキシプロリンアッセイを使用して評価された通り、皮膚の厚さが減少した。

【0326】

ｅｘ ｖｉｖｏヒト皮膚ＳＳｃモデル
ＴＧＦ－βの注射によって誘導されるヒト皮膚ＳＳｃモデルにおいてｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の有効性を評価した。ＴＧＦ－βにより、ＳＳｃの皮膚特性の病理学的変化が誘導される。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３をＴＧＦ－βと同時に投与した場合、ヒト皮膚におけるＴＧＦ－βによって誘導された線維症が減弱した。ＴＧＦ－β１０ｎｇと同時に投与した場合、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の１００μｇの単回皮内投薬により、投薬の１週間後にヒドロキシプロリンアッセイによって評価したところ、コラーゲンの増加が予防された（図４５）。

【0327】

ヒト皮膚を腹部外科手術から得、不要な部分を切り取り、脂肪を取り除き、約１×１インチの小片に切断した。小片を気相液相界面において器官培養物中で維持した。小片にビヒクル（Ｖ）、ＴＧＦ－β（Ｔ）またはＴＧＦ－β＋ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３（Ｔ＋ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３）を１００μｌの体積で注射した。用量：ビヒクル＝１×ＰＢＳ１００μｌ；Ｔ＝ＴＧＦ－β１０ｎｇ；Ｔ＋ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３＝ＴＧＦ－β１０ｎｇ＋ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３ １００μｇ。１週間（７日）後、皮膚の３ｍｍの穿孔を得、皮膚穿孔におけるヒドロキシプロリンを測定した。データは、ｎ＝３／群を表す。^＊は、ｐ＜０．０５を示す。

【0328】

ｉＢＩＯ－ＣＦＢ０３を支持するＥ４データの正当化
前臨床的線維症モデルにおけるＣ末端エンドスタチンペプチドの有効性および作用機構の評価を、化学的に合成されたＥ３、および密接に関連するペプチドであるＥ４を使用して実施した。Ｅ４は、Ｅ３とは、Ｅ３ペプチドを安定化するためにＣ末端アミドが付加されていることにより異なる。組換えｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を使用した有効性および機構的試験を行って、化学的に合成されたＥ３およびＥ４を用いて以前に実証された抗線維化活性を確認する。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３により、Ｅ３／Ｅ４の溶解性、安定性および精製が改善され、また、別の前臨床試験において有望な結果が示されている。

【0329】

Ｅ４ペプチドを用いた作用機構試験
Ｅ４が抗線維化活性を発揮する機構を同定するために、いくつかの実験を実施した。種々の線維化トリガーを用いて刺激した初代ヒト肺線維芽細胞またはマウス肺組織から抽出されたＲＮＡに対して、エンドスタチンペプチドによる影響を受ける遺伝子を同定するために、Ｅ４による処理の不在下および存在下で、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に基づくアレイを実施した。

【0330】

アレイにより、以前に線維症に関係づけられたいくつかの遺伝子がＥ４による処理の影響を受けることが同定された。これらの遺伝子には、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）－３、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）－１およびＭＭＰ－３、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ）－１、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれ、表５に示されている通り、Ｅ４の存在下でレベルが低下または上昇した。

【0331】

【表7】

【0332】

作用機構の概要およびモデル
要約すると、エンドスタチンに由来するペプチドであるＥ４は、２種の異なる線維化トリガー、ブレオマイシンおよびＴＧＦ－βの適用後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗線維化効果を発揮する（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．、２０１２；４：１３６ｒａ１７１）。Ｅ４により、線維化促進因子ＣＴＧＦおよびＩＧＦＢＰ－３のレベルが低下し、また、ＭＭＰ－１およびＭＭＰ－３のレベルおよび活性の上昇が誘導される。さらに、Ｅ４により、プラスミノーゲン系が活性化し、ｕＰＡのレベルおよび活性が上昇し、ｕＰＡ阻害剤であるＰＡＩ－１のレ
ベルが低下し、また、プロＨＧＦのその活性な鎖への変換が誘導される。Ｅ４は、ＰＡＩ－１の下方調節およびｕＰＡ活性の上昇によって抗線維化効果を発揮し、それにより、ＨＧＦ活性化、線維化中間体であるＣＴＧＦおよびＩＧＦＢＰ－３の減少、ならびに活性なＭＭＰ－１およびＭＭＰ－３産生の誘導によるＥＣＭ分解の増加が導かれる。標的特異性は、図４６に示されている概略図に要約されている。

【0333】

ＰＫおよび毒性学的試験
薬物動態試験
血清および皮膚を含めた生物検体中のｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を検出する方法（１つまたは複数）を確立する。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の薬物動態学および代謝を動物において評価する。最初の探索的試験をマウスにおいて行って、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の血清中濃度を決定し、効果的なＩＶ用量と循環薬物レベルの関係の確立を開始する。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３吸収の潜在的な種差を調査するため、および急性および慢性毒性学的試験について提案された２つの種におけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の血清中濃度を決定するために、ラットおよびウサギにおける探索的ＰＫ試験も行う。ラットおよびウサギにおけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のより包括的なＰＫ／ＡＤＭＥ評価を行って、ＰＫプロファイルおよび用量直線性を特徴付ける。ＰＫ／ＡＤＭＥ評価の一部は、提案された毒性学的試験の毒物動態学部分において行う。

【0334】

エンドスタチンＰＫの評価に使用した（Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３；２１（２）：２２３－２３１）市販のポリクローナル酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）９６ウェルプレートアッセイ（Ａｃｃｕｃｙｔｅ，Ｃｙｔｉｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐａｒｋ、ＭＤ）を、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を検出するその能力について試験する。Ｔｈｏｍａｓらにより公開された方法に加えて、免疫グロブリンＹ（ＩｇＹ）抗体を免疫学的試験に使用することの実現性を調査する。ＩｇＹ抗体は、哺乳動物抗原に対して、抗体／抗原複合体がどちらも哺乳動物供給源に由来する系よりも低い交差反応性およびバックグラウンドを生じる。さらに、組織または生体液におけるＰＫ解析および他の数量化の必要性のためのサンドイッチＥＬＩＳＡを構築する目的でｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３に対するマウスモノクローナル抗体を発生させる。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３に特異的な免疫試薬を生成するための追加的な技術として、工学的に操作して結合および検出試薬を生成することができる単鎖可変結合性断片（ｓｃＦｖ）または組換えモノクローナルＩｇＹ抗体を生成するための出発材料としてポリクローナルＩｇＹ抗ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３抗体を生成するために、ニワトリ脾臓細胞を使用する。

【0335】

組織および生体液におけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を検出するための高感度かつ高特異度のサンドイッチＥＬＩＳＡが不可能である場合には、選択的に検出するために、特異的なペプチド断片に対して高レベルの感度をもたらす多重反応モニタリングを使用して、エンドスタチン関連ペプチドのＭＳ／ＭＳに基づくアッセイを展開する。理想的には、そのようなアッセイは、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を天然のレベルのエンドスタチンまたはその前駆コラーゲン分子と区別するために、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３に独特のペプチド断片に焦点を合わせる。この手法の成功は、複雑な生体試料中のそのような断片を検出できることにも依存し、また、試料を「脱複雑化」して検出および再現性を最大にするための特定の組織／生体液調製および分離プロトコールを必要とする。

【0336】

一部の場合では、生物分析評価のために、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を特徴付けるための方法が採用される。これらの方法としては、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、イムノアッセイ、およびＬＣ／ＭＳ－ＭＳが挙げられる。

【0337】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３についての適切な生物分析方法の確立後、マウスにおいて、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のＩＶ投与を評価するため、ならびに概念実証マウス試験から同定され
た効果的な用量レベルと血清および標的組織中の薬物のレベルの間の可能性のある関係の確立を開始するための最初の予備試験を行う。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３が急性および慢性毒性学的試験に使用した２つの種において効果的であることを確立するために、ラットおよびウサギにおける予備ＰＫ試験も使用する。さらに、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３吸収およびＰＫプロファイルの潜在的な種差を同定する。

【0338】

探索的試験後、ＰＫプロファイルおよび用量直線性を特徴付けるため、および第１相試験における用量選択を支持するために、ラットおよびウサギにおけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のより包括的なＰＫ／ＡＤＭＥ評価を行う。これらの試験のデザインは、投薬前、投薬直後、および最大で投薬の１２０時間後の血液収集を含む。動物の群を、試料採取の間に、種および試料採取の頻度に応じて交互交替的にするまたは終末収集を予定する（ラットのみ）。終末収集を予定したラットからは皮膚も収集する。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の血清中レベルおよび皮膚中レベルを評価する。

【0339】

毒性学的試験の毒物動態学部分でさらなるＰＫ／ＡＤＭＥ評価を行い、単回および複数回（毎日／週に１回）用量投与後にｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のＰＫを評価する。

【0340】

単回投薬毒性学
ＧＬＰ動物毒性学的試験のための用量選択を容易にするため、および第１相試験での健康な志願者における試験の開始を支持するために、スプラーグドーリーラットおよびニュージーランドホワイトウサギにおける非ＧＬＰ単回投薬毒性学的試験を行う。

【0341】

非ＧＬＰ急性ラット毒性学的試験
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の毒性を、雄および雌成体スプラーグドーリーラットにおいて、単回静脈内投与後に評価する。３つの用量レベルで静脈内投与したｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を評価し、対照としてビヒクルの単回静脈内投与をもたらしたラットの１つの群と比較する。潜在的な毒性および試験群間の統計学的差異の適切な決定をもたらすために、この型の試験の標準作業方法に基づいて、群当たりおよび性別当たり３匹のラットを使用する。

【0342】

評価は、死亡率、罹患率、臨床的知見、および体重変化の評価を含む。血液試料を、血液学的検査、臨床化学的検査、および凝固パラメーター評価のために収集する。臓器を秤量し、あらゆる肉眼での病理学的変化について検査する。肉眼での剖検所見が未決定の臓器に対して病理組織検査を実施する。

【0343】

皮膚検体および血清におけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の決定を使用して全身および標的臓器の曝露を評価する。皮膚検体および血清におけるＭＭＰ－１およびｕＰＡレベルをこれらのＳＳｃバイオマーカーのベースライン評価のために決定する。

【0344】

ラットは、毒性を評価するためのモデル種のうちの１つであり、この目的に関して全ての規制当局の毒性試験ガイドラインにより推奨される種のうちの１つであるので、これらの試験に使用する。

【0345】

非ＧＬＰ急性ウサギ毒性学的試験
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の毒性をニュージーランドホワイト雄および雌成体ウサギにおいても、単回静脈内投与後に評価する。３つの用量レベルで静脈内投与したｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を評価し、対照としてビヒクルの単回静脈内投与をもたらしたウサギの１つの群と比較する。潜在的な毒性および試験群間の統計学的差異の適切な決定をもたらすために、この型の試験の標準作業方法に基づいて、群当たりおよび性別当たり２匹のウサギを使用する。

【0346】

評価は、死亡率、罹患率、臨床的知見、および体重変化の評価を含む。血液試料を、血液学的検査、臨床化学的検査、および凝固パラメーター評価のために収集する。臓器を秤量し、あらゆる肉眼での病理学的変化について検査する。肉眼での剖検所見が未決定の臓器に対して病理組織検査を実施する。

【0347】

皮膚検体および血清におけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の決定を使用して全身および標的臓器の曝露を評価する。皮膚検体および血清におけるＭＭＰ－１およびｕＰＡレベルをこれらのＳＳｃバイオマーカーのベースライン評価のために決定する。

【0348】

ウサギは、毒性を評価するための別のモデル種であり、この目的に関して全ての規制当局の毒性試験ガイドラインにより推奨される種のうちの１つであるので、これらの試験に使用する。

【0349】

反復投薬毒性学的試験
第１相試験での健康な志願者における試験の開始を支持するために、スプラーグドーリーラットおよびニュージーランドホワイトウサギにおいて２８日間反復投薬ＧＬＰ毒性学的試験を行う。

【0350】

２８日間反復投薬ＧＬＰラット毒性学的試験
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の毒性を、雄および雌成体スプラーグドーリーラットにおいて、連続して２８日間、２日に１回（３回／週）の静脈内投与を評価する。３つの用量レベルで静脈内投与したｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を評価し、対照としてビヒクルの単回静脈内投与をもたらしたラットの１つの群と比較する。用量選択は、ＰＫラット試験からの所見、ならびに予備および単回投薬ラット毒性学的試験において同定された最大の耐容性が示される／実行可能かつＮＯＡＥＬ用量に基づく。

【0351】

主要な試験部分に加えて、２８日間回復期間および毒物動態学分析には動物のサテライト群を含める。

【0352】

試験デザインを表６に要約する。

【0353】

【表8】

【0354】

群当たりおよび性別当たりのラットの数は、潜在的な毒性および試験群間の統計学的差異の適切な決定をもたらすために、この型の試験の標準作業方法に基づく。

【0355】

評価は、死亡率、罹患率、臨床的知見、および体重変化の評価を含む。血液試料を、血液学的検査、臨床化学的検査、および凝固パラメーター評価のために収集する。臓器を秤量し、あらゆる肉眼での病理学的変化について検査する。肉眼での剖検所見が未決定の臓器に対して病理組織検査を実施する。

【0356】

皮膚検体および血清におけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３レベルの決定を使用して全身および標的臓器の曝露を評価する。皮膚検体および血清におけるＭＭＰ－１およびｕＰＡレベルをこれらのＳＳｃバイオマーカーのベースライン評価のために決定する。

【0357】

ラットは、毒性を評価するためのモデル種のうちの１つであり、この目的に関して全ての規制当局の毒性試験ガイドラインにより推奨される種のうちの１つであるので、これらの試験に使用する。

【0358】

２８日間反復投薬ＧＬＰウサギ毒性学的試験
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の毒性を、ニュージーランドホワイト雄および雌成体ウサギにおいて、連続して２８日間、１日１回の静脈内投与した後に評価する。３つの用量レベルで静脈内投与したｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３を評価し、対照としてビヒクルの単回静脈内投与をもたらしたウサギの１つの群と比較する。用量選択は、ＰＫウサギ試験からの所見、ならびに予備および単回投薬ウサギ毒性学的試験において同定された最大の耐容性が示される／実行可能かつＮＯＡＥＬ用量に基づく。

【0359】

主要な試験部分に加えて、２８日間回復期間および毒物動態学の分析には動物のサテライト群を含める。

【0360】

試験デザインを表７に要約する。

【0361】

【表9】

【0362】

群当たりおよび性別当たりのウサギの数は、潜在的な毒性および試験群間の統計学的差異の適切な決定をもたらすために、この型の試験の標準作業方法に基づく。

【0363】

評価は、死亡率、罹患率、臨床的知見、および体重変化の評価を含む。血液試料を、血液学的検査、臨床化学的検査、および凝固パラメーター評価のために収集する。臓器を秤量し、あらゆる肉眼での病理学的変化について検査する。肉眼での剖検所見が未決定の臓器に対して病理組織検査を実施する。

【0364】

皮膚検体および血清におけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の決定を使用して全身および標的臓器の曝露を評価する。皮膚検体および血清におけるＭＭＰ－１およびｕＰＡレベルをこれらのＳＳｃバイオマーカーのベースライン評価のために決定する。

【0365】

ウサギは、毒性を評価するためのモデル種であり、この目的に関して全ての規制当局の毒性試験ガイドラインにより推奨される種のうちの１つであるので、これらの試験に使用する。

【0366】

非臨床開発計画
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の非臨床開発は、構造的に関連するエンドスタチンペプチドを用いて実証された、以前に実証された抗線維化活性を確認するために、線維症モデルにおいて有効性を評価することを含む。ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の抗線維化活性をさらに特徴付けるために、その作用機構を探索する試験も使用する。さらに、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の薬物動態を評価する。

【0367】

ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の免疫原性をラットおよびウサギにおいて抗薬物抗体に対して評価する。最初のスクリーニングアッセイを行い、スクリーニングアッセイで陽性と試験された試料を、確証的アッセイを使用して再試験する。あらゆる中和抗体活性を測定するために中和アッセイも実施する。

【0368】

潜在的なｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の毒性をラットおよびウサギにおいて評価する。最初の予備試験を使用して、急性のｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の単回投薬後の動物の耐容性および化合物利用可能性に基づいて、最大の耐容性が示される用量を実現する、または他の点では、最大の実行可能な用量を確立する能力を探究する。ＧＬＰコンプライアンスの下で２８日間の反復投薬投与（２日に１回；３回／週）後の潜在的なｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の毒性を探究するために、ラットおよびウサギにおける反復投薬試験も行う。単回投薬および２８日間ＧＬＰ反復投薬試験の未決定の転帰について、慢性使用を支持するために、６カ月間反復投薬ＧＬＰ試験で齧歯類および非齧歯類種の両方における慢性毒性学的試験を行う。

【0369】

臨床
進行固形腫瘍を有する患者における組換えヒトエンドスタチンの第１相ＰＫ試験およびＰＤ試験において、最大３００ｍｇ／ｍ^２の用量の１時間にわたる静脈内注入で毎日もたらしたところ、エンドスタチンが、有意な薬物関連毒性を基本的に有さず、耐容性がよいことが実証された（Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３；２１（２）：２２３－２３１）。

【0370】

オープンラベル、２セグメント第１相試験を正常な健康な志願者（ＮＨＶ）およびＳＳｃ患者において行って、静脈内投与されたｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の安全性、免疫原性、および薬物動態学を評価する。セグメントＡは、単回投薬、用量漸増デザインである。このセグメントの完了後、データ安全性監視委員会（ＤＳＭＢ）により、ＰＫおよび安全性データの精査が行われて、最大耐量（ＭＴＤ）が決定される。ＳＳｃ患者は、第１のセグメントからのＭＴＤでの反復投薬曝露に関する試験のセグメントＢに登録される。セグメントＢでは、第１の投薬と第２の投薬の間の待ち期間（１週間）および／または投薬スケジュール（投薬２の後の他の日）を必要に応じて調整した。

【0371】

試験のセグメントＡにおける評価のための最大用量５ｍｇを、マウス－ブレオマイシンモデルにおける概念実証試験からの結果に基づいて、可能な治療用量として選択した。これらの試験では、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ－３の有意な効果が認められる最小用量は動物当たり２０μｇであった。これを、ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｙにおいて提供される換算係数を使用してヒト相当用量（ＨＥＤ）のスケールにする：Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ
ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ（２００５年７月）には、
［マウス２０ｇ当たり２０μｇ］^＊０．０８１^＊６０ｋｇのヒト＝用量当たり４．８ｍｇ
と示されている。

【0372】

この第１相臨床試験についての最大ヒト用量を１０倍超過する安全係数がもたらされるように毒性学的試験をデザインする。

【0373】

免疫原性試料採取
ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３は治療用タンパク質であるので、臨床研究に登録された志願者を抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生率についてモニタリングする。ＡＤＡスクリーニングのための血清試料は、第１の投薬の前、最終的な投薬の前（セグメントＢ参加者のみ）、最終的な投薬の１４日後、および２８日後に収集する。

【0374】

薬物動態学試料採取
試験のセグメントＡでは、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の薬物動態（Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０∞、血清中濃度、消失定数、クリアランス）を評価するための血清試料を以下の時点で収集する：
・０分（投薬前ベースライン）
・５分間
・１５分間
・３０分間
・１時間
・２時間
・６時間
・１２時間
試験のセグメントＢでは、用量１ ＰＫ血清試料を参加ＳＳｃ患者から上記と同じ試料採取計画に従って収集する。その後の試験用量のために、セグメントＡにおいて観察されたＴｍａｘに最も近い時点で単一の血清ＰＫ試料を収集する。

【0375】

薬理的活性
セグメントＢに登録されたＳＳｃ患者を、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の可能性のある薬理活性について、段階的な皮膚生検によって評価する。皮膚生検をベースライン、４週目および１２週目に実施する。ベースライン時点では、各群（ａｒｍ）から１つ、２つの生検材料を取得する。４週目の生検材料は一方の群（ａｒｍ）から取得し、１２週目の生検材料は他方の群（ａｒｍ）から取得する。個々の群（ａｒｍ）から２つの皮膚生検材料を８の字パターンで取得する。一方は、皮膚の厚さまたはコラーゲン組織化の任意の変化を評価するための適切な染色（例えば、Ｈ＆Ｅ、マッソン・トリクローム、Ｖｅｒｈｏｅｆｆ－Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ）を用いた組織学的検査のために使用し、他方は、ヒドロキシプロリンアッセイのために使用する。

【0376】

臨床開発計画
びまん性ＳＳｃ患者における、静脈内投与によるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の安全性、ＰＫおよび予備的有効性評価するために、オープンラベル第２ａ相試験を行う。この試験は、用量効果と用量耐容性の関係を評価するため、ならびに適切な投薬レジメンを決定するためにデザインされた反復投薬オープンラベル試験である。この第２ａ相試験のために選択される用量レベルは、同じ投与経路で実施された第１相試験および非臨床的毒性学的試験からのデータに基づいて選択する。第２ａ相試験の後に、安全性および有効性を評価するために、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の静脈内投与を使用して３～６カ月間行う第２ｂ相試験を行い、その後、びまん性ＳＳｃ患者におけるｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３のプラセボ対照第３相試験を行う。臨床開発計画（ＣＤＰ）の要約を表８に示す。

【0377】

【表10】

【0378】

経口投与経路の開発
予備的データから、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の経口投薬が、静脈内経路による投与と少なくとも同程度に効果的であることが示唆される。これらのデータおよび慢性使用される可能性が高いことに関する経口投与経路のベネフィットに基づいて、ｉＢｉｏ－ＣＦＢ０３の経口用製剤を開発した。経口用製剤がこのプログラムに有益であることが決定されれば、経口用製剤を臨床試験に導入する前に、表９に概説されている試験を実施する。

【0379】

【表11】

【0380】

＜実施例１２＞
経口送達Ｆｃ融合タンパク質
Ｅ３－Ｆｃ（ＥＮＤ－２５）、Ｅ３－リンカー－Ｆｃ（ＥＮＤ－２６）、およびＣ６７Ａ Ｅ３－Ｆｃ（ＥＮＤ－５５）溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけ、総タンパク質量について画像処理し（図４７、左側のパネル）、抗Ｆｃ抗体を用いてウエスタンブロットによってプローブした（図４７、右側のパネル）。

【0381】

等量の、Ｎｏｖｉｃｉ（ＰＥＧによる精製）またはＣａｌｉｂｅｒ（プロテインＡによる精製）からの精製ＥＮＤ－５５をシミュレート胃液（ＳＧＦ）中で０秒間、５秒間、３０秒間、４５秒間、６０秒間、または３００秒間消化した。反応を、１６０ｍＭの炭酸ナトリウムを用いて停止させた。次いで、試料を４～２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけ、無染色ゲル画像処理機で総タンパク質量について画像処理した（図４８、左側のパネル）。次いで、ゲルをニトロセルロースに移し、ニワトリ抗Ｅ３抗体（図４８、中央のパネル）または抗ヒトＦｃ抗体（図４８、右側のパネル）のいずれかを用いてウエスタンブロットのためにプローブした。Ｅ３プラスＦｃの推定ヒンジ領域はＦｃ分子から遊離すると思われるが、３００秒の時点ではほとんど分解される。Ｃａｌｉｂｅｒ試料とＮｏｖｉｃｉ試料の差異は、Ｃａｌｉｂｅｒ材料では初期時点でより顕著であり、Ｃａｌｉｂｅｒ試料では低グリコシル化Ｅ３－Ｆｃである、約１４ｋＤのバンドであると思われる。約１０ｋＤのＥ３陽性バンドは、Ｃａｌｉｂｅｒ試料のほうがわずかに弱い。全ての画像を、互いと尺度を合わせ、アラインメントした。

【0382】

他の実施形態
本発明はその詳細な説明と併せて記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲に入る。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【配列表】

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