特許 7406846 快速的且つ鮮やかなデジタルパソロジー方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-20

(45)【発行日】2023-12-28

(54)【発明の名称】快速的且つ鮮やかなデジタルパソロジー方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20231221BHJP

【ＦＩ】

G01N33/48 P

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2022163260

(22)【出願日】2022-10-11

【審査請求日】2022-10-11

(73)【特許権者】

【識別番号】506292158

【氏名又は名称】国立台湾大学

【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １， Ｒｏｏｓｅｖｅｌｔ Ｒｄ． Ｓｅｃ．４， Ｄａ‘ａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100143720

【弁理士】

【氏名又は名称】米田 耕一郎

(72)【発明者】

【氏名】孫▲啓▼光

(72)【発明者】

【氏名】バスカー ジョティ ボラー

(72)【発明者】

【氏名】曾耀▲チェン▼

【審査官】下村 一石

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２８６０４４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１４－００２１６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０２１－０３９１１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】LUO, Teng et al.，Enhanced Visualization of Hematoxylin and Eosin Stained Pathological Characteristics by Phasor Approach，Analytical Chemistry，米国，American Chemical Society，2017年08月01日，Vol.89, No.17，pp.9224-9231

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヘマチン(H)やエオシン(E)或いは、ヘマチンとエオシン(HE)の染料によって着色され、切除された未定の、物理的に薄片化されていない生体試料に対して、組織病理学評価を行う、デジタルパソロジー(RFP)方法であって、
マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査で、光学虚像を切り出し、H着色された核を視覚化するための非線形マルチハーモニック生成信号と、E着色された組織病理特徴を視覚化するための非線形多光子励起蛍光信号と、を収集し、
少なくとも1平方ミリメートル(mm²)の一枚の画像のフィールド・オブ・ビュー(FOV)において、有効デジタルの横置き解像度が、1ミクロン(μm)より小さく、
一枚の画像或いは、複数の画像から組み合わせられた蓄積撮像エリアの範囲が、1mm²乃至400mm²の間にあり、
持続的な有効データ処理量が、少なくとも、各秒に、500メガビット(Mbps)である
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項2】

請求項1に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、切除された未定の生体試料は、肝組織や乳腺組織、膵臓組織、脳組織、胸腺組織、前立腺組織、結腸組織、リンパ組織及び実体組織から得られ、不透明な完全体積組織であり、固定や、冷凍、物理スライス及び組織透明化が、行われていない、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項3】

請求項1に記載のデジタルパソロジー方法において、
組織着色の流れで、上記の、切除された未定の生体試料に対して、H-やE-或いはHE-着色を行う、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項4】

請求項3に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、組織着色の流れは、組織腔や組織容器において、上記の、切除された未定の生体試料に対して行われる、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項5】

請求項3に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、切除された未定の生体試料に対して、上記の、組織着色の流れを行うことは、
固定液で、短時間に固定することと、
Gillヘマチン溶液と/或いは、Mayerヘマチン溶液で、H着色を行うことと、
蒸留水と/或いは洗浄液で、洗浄行程を行うことと、
アンモニア水で、青みづけ行程を行うことと、
エオジン液で、E着色を行うことと、
アルコール溶液と/或いは洗浄溶液で、洗浄行程を行うことと、
カバーガラスで、上記の、切除された未定の生体試料を、カバーすることが、含まれる、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項6】

請求項3または請求項5に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、組織着色の流れの時間は、6分間より短い、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項7】

請求項1に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査は、2分間より少ない時間で、10×10平方ミリメートル領域の点スキャンを行い、また、170ナノメートル(nm)より小さい画素サイズを維持できる、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項8】

請求項1に記載のデジタルパソロジー方法において、
1平方センチメートルの試料面積の表面に対して、オプティカルセクショニングのレーザラスタ走査を行い、消費する着色時間が、6分間より少なく、スキャン時間が、2分間より少ないため、切除された未定の生体試料に対して、総評価時間が8分間より少なくなる、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項9】

請求項1に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査は、
発光スペクトルが、1000nm到1100nmの範囲内にあって、繊維ベースのパルスレーザソースであり、H着色の第三調波生成(THG)信号と/或いはE着色の2光子励起蛍光(TPEF)信号を収集するか、
発光スペクトルが、1200nm乃至1300nmの範囲にある、クロムフォルステライト(Cr:F)ベースのパルスレーザソースであり、H着色の第三調波生成(THG)信号と/或いはE着色の3光子励起蛍光(3PEF)を収集する、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項10】

請求項1に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査に利用された集束レンズは、対物レンズの開口数が、少なくとも、0.7である、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項11】

請求項1に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査に利用されるレゾナントスキャナー或いは、ポリゴンスキャナは、少なくとも、4kHzのラインレートで、高速軸スキャンを行う、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【請求項12】

請求項1に記載のデジタルパソロジー方法において、
上記の、複数の画像から組み合わせられた蓄積撮像エリアは、補助として、2つの互いに垂直して連接される電子リニア移動ステージからなる、2次元のエレクトロンステージユニットが、設置される、
ことを特徴とするデジタルパソロジー方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、格別な訓練を必要しなく、病理医に援助できる、Ｈ＆Ｅを利用する、快速的且つ鮮やかなデジタルパソロジー方法（ＲＦＰ）に関し、特に、ヘマチン（Ｈ）やエオシン（Ｅ）或いは、ヘマチンとエオシン（ＨＥ）の着色染料によって着色されて、切除された未定の生体試料に対して、組織病理学評価を行うことができる、快速的且つ鮮やかなデジタルパソロジー方法（ＲＦＰ）に関する。

【背景技術】

【0002】

ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）病理方法は、非常に高い信頼度を有するが、１－２日の処理時間を必要するため、術中腫瘍評価（ＩＴＡ）に適用しない。また、凍結切片（ＦＳ）－病理方法は、そのサンプル処置や評価時間が比較的に短いため、ＩＴＡの世界標準になる。それから、冷凍切片の場合、サンプルの冷凍や切片、着色には、膨大な労働力を要し、また、単一の流れに、３０分間の時間が消費され、ＩＴＡの実行回数が制限される。そして、ＦＳ生検の評価は、容易に、幾種類のアーチファクトによって影響される。そのため、ＦＳの代替方案の開発が、重要視され、それは、切片を必要しなく、便利的に携帯でき、快速的且つ正確的、アーチファクトなし、新鮮標本に適用でき、ＦＦＰＥ生検と同じように信頼でき、そして、グローバルスタンダードである病理染料－Ｈ＆Ｅ染料に基づくことにより、その技術がより信頼的になり、病理医は、格別な学習と／或いは訓練を必要しない。

【0003】

計算機使用のデジタルパソロジーの現代において、ホールスライドイメージング（ＷＳＩ）とステッチ・パノラマ・バーチャルスライド（ＶＳ）が素早く発展しているため、デジタル形式で、数十億枚のＦＳ／ＦＦＰＥ組織病理切片の画像を貯蓄することに有利で、これにより、何時でも、評価し直し、そして、病理医は、遠いところから、簡単に、ＷＳＩ－ＶＳに対して、快速的且つ遠隔的な評価を行うことができる。しかしながら、デジタルの元において、高い診断信頼度を維持するため、標本からデジタル表示システムの撮像経路において、優れた解像度を維持する。デジタルパソロジー協会の実務指針によれば、標準×２０拡大倍率のＷＳＩ－ＶＳは、０．５ミクロン（μｍ）デジタル分解能を有し、一般として、標準的な観察と判読に適用でき、また、標準×４０拡大倍率では、ナイキスト０．２５μｍのデジタル分解能を有するため、２４ビットの色深度を維持することが期待される。この場合、１×１平方ミリメートル（ｍｍ^２）の領域に、≧３８４メガビットが含まれ、１平方センチメートル（ｃｍ^２）の領域である場合、≧３８．４Ｇビット或いは１．６ Ｇ画素までに広げる。このような、高い開口数（ＮＡ、１に近づく或いはより大きいもの）の×４０乃至×２０の対物レンズは、そのシステム視野（ＦＯＶ）が、一般として、１ｍｍ^２より小さいように制限され、そのため、シリーズにアーチファクトなしのステッチ流れにより、診断の信頼度が影響されない。

【0004】

外科病理学ＩＴＡの環境において、快速的に評価することは、手術時間を最小化できるため、患者の安全が確保される。ＦＳ／ＦＦＰＥの物理スライスと異なり、ＩＴＡ能力を有するデジタルの画像診断法に関連する現有技術を利用して、より素早く光学虚像切り出しを評価できる。しかしながら、現有技術は、最新のＷＳＩ標準のナイキストや、十億画素の試料採取の半ミクロンデジタル分解能と／或いは、実時間の広視野、アーチファクトなしのステッチ／モーセ機能と／或いはサブミニュート十億画素採取やディジタル表示能力、そして、"標本からディジタル表示まで"の画素経路において、十分の解像度を有することに、満足できない恐れがある。また、国際において、ゴールドスタンダード－ヘマチンの代わりに、異なる核着色の染料を利用する時、病理医は、判読できるために、特定の訓練を受けなければならない。ＦＳ／ＦＦＰＥ生検に比べると、これにより、正確性が低下する恐れがある。しかし、不透明且つ細胞核がヘマチン染料によって着色された３ 次元の生体試料に対して、オプティカルセクショニングを行うために、非線形マルチハーモニックの生成方法を利用して、高対比で細胞核を視覚化する。

【0005】

既存の物理スライスを必要しない快速ＩＴＡ方法は、一部の特定の外科病理学に応用できる。誘導ラマン顕微鏡によって提供された化学情報で、細胞異常を検査できるが、ロ－信号雑音比（ＳＮＲ）のため、快速的にセンチスケールサイズの検体を検測することに向いていない。光干渉断層撮影は、高速的に結像できるが、空間分解能や信号雑音比及び対比が悪い問題が残される。オプティカルセクショニングの有効方法として、光シート蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡及び紫外線表面励起顕微鏡が注目されるが、例えば、ゴールドスタンダード－ヘマチンであり、蛍光の無い染料に適用できなく、特に、生物サンプルの本質に、所定の厚さを有しながら、不透明の場合である。変えていえば、ＨＥ着色の生体試料全体に対して、オプティカルセクショニングを行う時、高解像度且つハイスループットなセンチスケールのレーザスキャンの下において、既存技術は、実用的とは言えない。

【0006】

本発明者は、上記欠点を解消するため、慎重に研究し、また、学理を活用して、有効に上記欠点を解消でき、設計が合理である本発明を提案する。

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、全試料表面結像（ＷＳＳＩ）のデジタルＩＴＡ解決策として、ＲＦＰ方法と略称される、快速的且つ鮮やかなデジタルパソロジーを提案し、地球全体のＦＳ生検標準と比べると、そのサンプルの評価速度が、４倍に高くなり、その中、ＲＦＰが、従来のＦＳ－やＦＦＰＥ－生検の標準のＨとＥ染料との相性が良い。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、上記の目的を達成するために、ヘマチン（Ｈ）やエオシン（Ｅ）或いは、ヘマチンとエオシン（ＨＥ）の染料によって着色されて、切除された未定の生物サンプルに対して、組織病理学評価を行うＲＦＰ方法を提供し、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査で、光学虚像を切り出し、非線形マルチハーモニックと／或いは非線形多光子励起蛍光シグナルを収集して、Ｈ－やＥ－或いはＨＥ－のマルチチャンネルのデジタル化とリアルタイムのディジタル表示の特定組織病理特徴とし、少なくとも、１平方ミリメートルのレーザラスタ走査による一枚のフィールド・オブ・ビュー（ＦＯＶ）において、有効デジタルの横置き解像度が、１ミクロン（μｍ）より小さく、ＦＯＶ解像度が、１０００より大きくて、また、１ｍｍ^２ 乃至４００ｍｍ^２ の範囲内の一枚の画像や複数枚の画像から組み合わせられた蓄積撮像エリアに、少なくとも、各秒に５００メガビット（Ｍｂｐｓ）の持続的な有効データ処理量を有する。

【0009】

その中、切除された未定の生体試料は、肝組織や乳腺組織、膵臓組織、脳組織、胸腺組織、前立腺組織、結腸組織、リンパ組織及び実体組織から得られ、不透明な完全体積組織であり、固定や、冷凍、物理スライス及び組織透明化が、行わていない。

【0010】

ＲＦＰ方法において、快速組織着色（ＲＴＳ）の流れは、切除された未定の生体試料に対して、ＨやＥ或いはＨＥ着色を行う。

【0011】

切除された未定の生体試料に対して、組織腔や組織容器において、ＲＴＳの流れを行う。切除された未定の生体試料に対して、ＲＴＳの流れを行うことには、
固定液で、固定する過程と、
Ｇｉｌｌヘマチン溶液と／或いは、Ｍａｙｅｒヘマチン溶液で、Ｈ着色を行う過程と、
蒸留水と／或いは洗浄液で、洗浄を行う過程と、
アンモニア水で、青みづけ行程を行う過程と、
エオジン液で、Ｅ着色を行う過程と、
アルコール溶液と／或いは洗浄溶液で、洗浄行程を行う過程と、
カバーガラスで、切除された未定の生物標本を、カバー処理を行う過程とが、含まれる。
而ＲＴＳ流れ所消費的ＨＥ着色時間少於６分間。

【0012】

マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査は、２分間より少ない時間で、１０×１０ｍｍ^２領域の点スキャンを行い、また、１７０ナノメートル（ｎｍ）より小さい画素サイズを維持できる。また、ＲＦＰ方法は、１ｃｍ^２サイズの標本の表面に対して、オプティカルセクショニングレーザラスタ走査を行い、消費する着色時間が、６分間より少なく、スキャン時間が、２分間より少ないため、切除された未定の生体試料に対して、総評価時間が、８分間より少なくなる。

【0013】

マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査は、
（１）発光スペクトルが、１０００ｎｍ乃至１１００ｎｍの範囲内にあって、繊維ベースのパルスレーザソースであり、Ｈ着色の第三調波生成（ＴＨＧ）信号と／或いはＥ着色の２光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）信号収集するか或いは、、
（２）発光スペクトルが、１２００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲にある、クロムフォルステライト（Ｃｒ：Ｆ）ベースのパルスレーザソースであり、その中、Ｈ着色から、ＴＨＧ信号を収集し、Ｅ着色から３光子励起蛍光（３ＰＥＦ）信号を収集する。

【0014】

マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査に利用される集束レンズは、対物レンズの開口数が、少なくとも、０．７である。

【0015】

マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査に利用されるレゾナントスキャナー或いは、ポリゴンスキャナは、少なくとも、４ｋＨｚのラインレートで、高速軸スキャンを行う。

【0016】

複数の画像から組み合わせられた蓄積撮像エリアは、補助として、２つの互いに垂直して連接される電子リニア移動ステージからなる、２次元のエレクトロンステージユニットが、設置される。

【0017】

以下、図面を参照しながら、本発明の特徴や技術内容について、詳しく説明するが、それらの図面等は、参考や説明のためであり、本発明は、それによって制限されることが無い。

【発明を実施するための最良の形態】

【0018】

以下、本発明を実行するための実施形態の特徴や構造を説明する。

【0019】

図１乃至図４は、ＲＦＰ方法の概念図である。

【0020】

図１は、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査方法のＲＦＰ方法の概念図である。図２は、ＲＴＳ方法の流れ（プロトコル、あるは、フローや手順、工程、アルゴリズムと言い換えてもよい）の概念図である。図３は、ＲＦＰ法によって得られた画像例である。

【0021】

図のように、本発明は、ヘマチン（Ｈ）やエオシン（Ｅ）或いは、ヘマチンとエオシン（ＨＥ）の着色染料によって着色されて、切除された未定の生体試料に対して、組織病理学評価を行う、ＲＦＰ方法［１］であり、
（ａ）マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査で、光学虚像を切り出し［１５］、マルチチャンネルのデジタル化と、実時間の非線形マルチハーモニックと／或いは非線形多光子励起蛍光信号ＨやＥ或いはＨＥ特定の組織病理特徴のディジタル表示に適用され［１７］［２７］、
（ｂ）少なくとも、１ｍｍ^２［１６２］のレーザラスタ走査による一枚のフィールド・オブ・ビュー（ＦＯＶ）［１６１］において、有効デジタル分解能が、１ミクロン（μｍ）［１６３］より小さく、ＦＯＶ解像度［１６４］が、１０００より大きくて、
（ｃ）一枚或いは複数の画像から組み合わせられた蓄積撮像エリア［１６２］の範囲が、１ｍｍ^２乃至４００ｍｍ^２の間にあり、持続的な有効データ処理量［１６５］が、少なくとも、各秒に、５００メガビット（Ｍｂｐｓ）である。

【0022】

切除された未定の生物標本［１１］は、固定や、冷凍、物理スライス及び組織透明化が行わていなく、肝組織や乳腺組織、膵臓組織、脳組織、胸腺組織、前立腺組織、結腸組織、リンパ組織及び実体組織から得られた、不透明な完全体積組織である。

【0023】

ＲＦＰ方法［１］において、ＲＴＳ［３］の流れで、切除された未定の生体試料に対して、ＨやＥ或いはＨＥ着色［１３］を行う。ＲＴＳ［３］の流れは、組織腔や組織容器［１２］において、切除された未定の生体試料に対して行う。

【0024】

図２と図３において、６分間以下のＲＴＳ流れのＲＦＰ［１］方法において、切除された組織が、顕微鏡スライドのｉＳｐａｃｅｒとによって形成された空間に設置される。短時間の固定［１３１］と両段階のＨ細胞核着色［１３２］、中間洗浄行程［１３３］、青みづけ行程［１３４］、Ｅ着色［１３５］及び最後洗浄［１３６］がふくまれて、ＲＴＳ［３］の流れの総時間が、６分間以下である。ＲＴＳ［３］の流れの終了後、カバーガラス［１３７］を加え、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査システム［３３］において、結像する。

【0025】

ＲＦＰ方法［１］は、１平方センチメートル試料面積の表面に対して、オプティカルセクショニングレーザラスタ走査する時、消費する着色時間が、６分間以下で、スキャン時間が、２分間より少ないため、切除された未定の生体試料の総評価時間が、８分間より少ない。

【0026】

また、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査［１４］は、生成した非線形マルチハーモニックと／或いは非線形多光子励起蛍光シグナル［２５］を検測して、マルチチャンネルのデジタル化と、実時間のＨやＥ或いはＨＥ特定の組織病理特徴［１７］のディジタル表示に適用される。

【0027】

マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査［１４］の特性は、
（１）レーザラスタ走査の一枚の画像ＦＯＶ［１６１］は、少なくとも、１ｍｍ^２であり、有効デジタルの横置き解像度［１６３］が、１μｍより小さく、ＦＯＶ 解像度［１６４］が、１０００より大きく、
（２）１ｍｍ^２乃至４００ｍｍ^２ の範囲内の一枚或いは複数の画像から組み合わせられた総撮像エリア［１６２］は、持続的な有効データ処理量［１６５］が、少なくとも、各秒に５００メガビット（Ｍｂｐｓ）であり、
（３）２分間以下の時間で、１０×１０ｍｍ^２領域の点スキャンを終了でき、同時に、１７０ナノメートル（ｎｍ）より小さい画素サイズ［１６６］を維持できる。また、多画像組合せ過程は、実時間のモーセステッチ［１６］で行い、後処理ないセンチスケールレーザスキャン［２６］に適用される。

【0028】

マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査に利用された集束レンズ［２３］は、対物レンズの開口数が、少なくとも、０．７である。

【0029】

マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査［１４］に利用されるレゾナントスキャナー或いは、ポリゴンスキャナ［２２］は、少なくとも、４ｋＨｚのラインレートで、高速軸スキャンを行う。

【0030】

複数枚の画像から組み合わせられた蓄積撮像エリアは、補助として、２つの互いに垂直して連接される電子リニア移動ステージからなる、２次元のエレクトロンステージユニット［２４］が、設置される。

【0031】

マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査［１４］は、
（ａ）発光スペクトル範囲が、１０００ｎｍ乃至１１００ｎｍである繊維ベースのパルスレーザソース［２１］は、Ｈ着色と／或いはＥ着色からの２光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）信号［２５］を収集するか、
（ｂ）発光スペクトルが、１２００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲にある、クロムフォルステライト（Ｃｒ：Ｆ）ベースのパルスレーザソース［２１］は、Ｈ着色のＴＨＧ信号と／或いはＥ着色の３光子励起蛍光（３ＰＥＦ）信号［２５］を収集する。

【0032】

図４において、画像例は、新鮮なヒトグリオーマ組織に対して、ＲＦＰ［１］方法を行うことによって得られる。センチスケールサイズの画像とその拡大画像には、特定の組織病理特徴が見られ、その中、（Ａ）は、１．３Ｇｉｇａｐｉｘｅｌの色変換された後のＲＦＰ画像であり、スケールバーが０．５ｍｍで、ＦＯＶが６．４×５．６ｍｍ^２であり、４４秒の総結像時間で、約３０Ｍ／ｓの有効画素レートを有して、１ｍｍ^２／ｓ の有効スキャン率より大きい。（Ｂ）－（Ｉ）は、（Ａ）において、表記されたＲ１－８を、切り取って拡大したＲｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＲＯＩ）で、その中、各ＲＯＩの画素数が、６７００×３３００で、スケールバーが１５０μｍである。（Ｊ）－（Ｑ）は、（Ｂ）－（Ｉ）において、表記されたＲ９－１６が、切り取られて拡大されたＲｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＲＯＩ）であり、その中、各ＲＯＩの画素数が、３２００×２５００で、スケールバーが、７０μｍである。細胞核や他の構造（例えば、血管）の分布や形状及びサイズは、（Ｂ）－（Ｑ）において、視覚化された。白色破線によって、血管構造がマークされる。白色破線の円によって、細胞数が明白的に増加する領域が例示される。（Ｋ）や（Ｍ）、（Ｎ）及び（Ｑ）において、典型的でない血管において、典型的でない細胞構造が明白的であるため、微小血管の増生現象が示される。

【0033】

本発明は、ＲＦＰ方法と略称される、快速的且つ鮮やかなデジタルパソロジーを導入し、標本全体の表面に結像できるデジタルＩＴＡの解決策であり、地球全体のＦＳ生検標準と比べると、その評価速度が４倍に高くなり、また、ＲＦＰは、従来のＦＳ／ＦＦＰＥ生検の標準のＨとＥ染料との相性が良い。また、本技術は、５０の人体脳部組織標本（正常や神経膠腫）の盲検試験により、１００％の腫瘍判読正確率が表示されて、ＦＳ／ＦＦＰＥに匹敵できる、正確性と１００％の感度と特定の組織病理特徴が表される。

【0034】

本発明において、１ｃｍ^２面積の着色やスキャン及び表示の総時間が、約８分間であり、その中、快速着色の過程が、６分間以下で、その後のスキャンと表示過程が、２分間程度を消費する。後続の着色パラメーターの最適化により、蓄積評価時間が更に低下される。

【0035】

本発明に係るＲＦＰ方法は、特に、切除された新鮮的な人体脳部組織標本の腫瘍組織の研究に適用される。そして、柔らかく、損害しやすい新鮮な脳標本に優しく、ＲＴＳ流れにおいて、従来のＨ＆Ｅ染料を利用できる。また、ＲＦＰは、他のタイプの生体試料にも適用でき、例えば、乳房や前立腺及び皮膚等に限られず、快速的且つ正確的及び信頼的のＩＴＡを提供できる。以上は、ただ、本発明のより良い実施例であり、本発明は、それによって制限されることが無く、本発明に係わる特許請求の範囲や明細書の内容に基づいて行った等価の変更や修正は、全てが、本発明の特許請求の範囲内に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】快速的且つ鮮やかなデジタルパソロジー（ＲＦＰ）方法の概念図である。

【図2】マルチモーダル非線形光學レーザラスタ走査方法で、ＲＦＰ方法を補助する場合の概念図である。

【図3】快速的に組織を着色（ＲＴＳ）方法の流れを表示する概念図である。

【図4】ＲＦＰ方法によって得られた画像例の図である。

【符号の説明】

【0037】

１ ＲＦＰ方法
１１ 切除された未定の生体試料
１２ 組織腔や組織容器に収納する
１３ ＨやＥ或いはＨＥ着色を行う
１３１ 短時間の固定
１３２ ヘマチン着色
１３３ 洗浄
１３４ 青みづけ
１３５ Ｅ着色
１３６ 洗浄
１３７ カバーガラスで、カバーする
１４ マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査システム
１５ マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査で、光学虚像を切り出す
１６ 実時間のモーセステッチで多画像組合せ過程を行う
１６１ 視野
１６２ 結像領域
１６３ 有効デジタルの横置き解像度
１６４ ＦＯＶ解像度
１６５ 有効データ処理量
１６６ ポイントスキャン
１７ マルチチャンネルのデジタル化と、実時間の非線形マルチハーモニックと／或いは非線形多光子励起蛍光信号ＨやＥ或いはＨＥ特定の組織病理特徴のディジタル表示
２１ パルスレーザソース
２２ スキャナ
２３ 集束レンズ
２４ エレクトロンステージユニット
２５ マルチモーダル検測システム
２６ 実時間のモーセステッチ
２７ ＨやＥ或いはＨＥ特定の組織病理特徴のリアルタイムのディジタル表示
３ ＲＴＳ
３３ マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査システム

【要約】

【課題】ヘマチン（Ｈ）やエオシン（Ｅ）或いは、ヘマチンとエオシン（ＨＥ）の染料によって着色されて切除された未定の生体試料を評価する、快速的且つ鮮やかなデジタルパソロジー（ＲＦＰ）方法を提供する。
【解決手段】ＲＦＰ方法は、快速組織着色（ＲＴＳ）の流れにより、切除された未定の生体試料に対して、短時間固定やＨ着色、洗浄、青みづけ、Ｅ着色及び洗浄を行い、最後に、カバーガラスで、着色標本を覆う。ＲＦＰ方法は、マルチモーダル非線形光レーザラスタ走査方法を補助として、非線形マルチハーモニックと／或いは非線形多光子励起蛍光シグナルを生成し、マルチチャンネルのデジタル化と、ＨやＥ或いはＨＥの特定の組織病理特徴のリアルタイムのディジタル表示に適され、同時に、センチスケール撮像エリアやサブミクロンのデジタル分解能及び、少なくとも、各秒５００メガビット（Ｍｂｐｓ）の持続的な有効データ処理量を提供する。
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】