特許 7526405 頭皮組織由来の毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-24

(45)【発行日】2024-08-01

(54)【発明の名称】頭皮組織由来の毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240725BHJP

   C12N 5/02 20060101ALI20240725BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12N5/02

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2022577397

(86)(22)【出願日】2021-03-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-14

(86)【国際出願番号】 KR2021002736

(87)【国際公開番号】W WO2021256663

(87)【国際公開日】2021-12-23

【審査請求日】2022-12-14

(31)【優先権主張番号】10-2020-0073493

(32)【優先日】2020-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】522486612

【氏名又は名称】ハンモバイオ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＭＯＢＩＯ ＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】＃１２０１，２，Ｎｏｎｇｓｉｍ－ｒｏ，Ｇｕｎｐｏ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １５８４５，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(73)【特許権者】

【識別番号】522486623

【氏名又は名称】ハンバイオ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】２Ｆ，８，Ｔｅｈｅｒａｎ－ｒｏ ２－ｇｉｌ，Ｇａｎｇｎａｍ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ ０６２３２，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(73)【特許権者】

【識別番号】522486634

【氏名又は名称】カン、ダ ウィット

【氏名又は名称原語表記】ＫＡＮＧ，Ｄａ Ｗｉｔｔ

【住所又は居所原語表記】＃１０１－９１０，２５，Ｉｒｗｏｎ－ｒｏ １４－ｇｉｌ，Ｇａｎｇｎａｍ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ ０６３５６，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】カン、ダ ウィット

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ジョン イン

(72)【発明者】

【氏名】ノ、ジョン ウォン

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】特開平１１－１８０８７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／１１５０７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】J. Dermatol. Sci.，2005年，Vol. 37，pp.58-60

【文献】Korean J. Physiol. Pharmacol.，2018年，Vol. 22, No. 5，pp.555-566

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）頭皮組織から分離された毛球を処理するステップと、
（Ｂ）毛球から毛乳頭細胞を分離するステップと、
（Ｃ）継代培養するステップと、
を含む毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法であって、
前記（Ｂ）毛球から毛乳頭細胞を分離するステップは、
（ｂ１）細胞培養ディッシュに剥離培地及び毛球を入れた後、精密微細ハサミにて毛球をチョッピングのみ行うステップと、
（ｂ２）チョッピングされた毛球をチューブに集め、遠心分離するステップと、を含み、
前記ステップ（ｂ１）においてチョッピングされた毛球の大きさは、１５μｍ～１２０μｍであり、
前記（Ｃ）継代培養するステップは、
（ｃ１）細胞数に応じて継代培養すべき培養ディッシュを決定した後、培養ディッシュに入れられていた培地を捨て、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて清浄するステップと、
（ｃ２）トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を処理し、大量増殖機にかけてインキュベーションするステップと、
（ｃ３）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入り最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを入れ、遠心管に集めた後、遠心分離するステップと、
（ｃ４）上澄み液は捨て、底に沈殿しているペレットをタッピングした後、最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ胎児血清、ペニシリン-ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを含む拡大培養用培地を入れ、細胞数を確認するステップと、
（ｃ５）計数された細胞数に応じて、所定数になるように次のステップの培養ディッシュに接種した後、大量増殖機において所定時間おきに培地を交換しながら、増殖するステップと、を含み、
前記（Ｃ）継代培養するステップは、ステップ（ｃ１）～（ｃ５）を３回繰り返し行う
ことを特徴とする毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法。

【請求項2】

前記（Ａ）頭皮組織から分離された毛球を処理するステップは、
（ａ１）滅菌されたペトリディッシュに最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを被験者から採取された頭皮組織が沈漬されるように充填するステップと、
（ａ２）ペトリディッシュの蓋体に最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを用いてドロップを形成し、微細手術用のハサミと鉗子（ｆｏｒｃｅｐ）を用いて、真皮層の毛球を一つずつ分離して、用意したドロップに移動させるステップと、
（ａ３）ドロップに移動された毛球を実体顕微鏡にて観察しながら、シリンジと微細手術用の鉗子を用いて、毛球の末端に付着されている脂肪組織及び毛幹（ｈａｉｒ ｓｈａｆｔ）を取り除くステップと、を含む
請求項１に記載の毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法。

【請求項3】

前記（Ｃ）継代培養するステップは、
（ｃ１）細胞数に応じて継代培養すべき培養ディッシュを決定した後、培養ディッシュに入れられていた培地を捨て、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて清浄するステップと、
（ｃ２）０．２５％ トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を処理し、３７℃、５％ ＣＯ_２ 大量増殖機において５分間かけてインキュベーションするステップと、
（ｃ３）１％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入り最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを入れ、５０ｍｌの遠心管に集めた後、遠心分離するステップと、
（ｃ４）上澄み液は捨て、底に沈殿しているペレットをタッピングした後、最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ、塩基性線維芽細胞成長因子、１０％ ウシ胎児血清、ペニシリン-ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを含む拡大培養用培地を入れ、細胞数を確認するステップと、
（ｃ５）計数された細胞数に応じて、１，５００個／ｃｍ^２になるように次のステップの培養ディッシュに接種した後、３７℃、５％ ＣＯ_２の大量増殖機において３日おきに培地を交換しながら、培養ディッシュが細胞によりいっぱいになるまで増殖するステップと、を含む
請求項１に記載の毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、頭皮組織由来の毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法に関する発明であり、さらに詳しくは、チョッピングを通じて頭皮組織から分離された毛球から毛乳頭細胞を分離した後、継代培養して大量に毛乳頭細胞を増殖する方法に関する発明である。

【背景技術】

【0002】

脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ）は、疾病、栄養不足、老化、ホルモンの不均衡などにより発症すると言われている。多くの研究が行われてきたにも拘わらず、根本的な脱毛に関わる機序はまだはっきりとは判明されていないものの、一般に、毛髪は、一定の毛周期（ヘアサイクル）を経ることになり、毛乳頭（ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ）の刺激を受けた毛母細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）が盛んに分裂・増殖をして毛髪が成長する成長期（ａｎａｇｅｎ）、毛球（ｈａｉｒ ｂｕｌｂ）への血液の供給が絶たれ、毛乳頭が毛包から分離される退行期（ｃａｔａｇｅｎ）及び細胞の増殖が止まって毛髪が成長しない休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）を経て再び成長期に移行したり、毛髪が頭皮から抜ける脱落期（ｅｘｏｇｅｎ）に移行したりすることになる。人間の毛髪は、それぞれ独立した成長周期を有して、一部は脱落期に、一部は成長期に移行し、全体的に同じレベルの毛髪の本数を保つことになるが、このようなバランスが崩れて、脱落期に移行して正常に毛髪が存在すべき個所に毛髪がなくなる状態を脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ）と称する。

【0003】

また、脱毛を治療するための努力も絶えず注がれてきた。それにも拘わらず、これまでただ二種類の薬物（フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）及びミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ））のみが脱毛の治療のためにアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ：Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（Ｕ．Ｓ．Ａ）から認可された。

【0004】

人体の毛髪は、約１０万～１５万本ほどであり、毛包（ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）において形成される。毛包には乳頭があるが、この部位には、小さな血管が分布されて毛髪の成長に必要な栄養分を供給し、乳頭の上の側方には毛髪に潤いを与える油を供給する脂腺がある。毛包は、色々な異なる上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）及び毛乳頭細胞からなる。毛乳頭細胞は、毛包の基底部に位置している間葉由来の繊維芽細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）であり、育毛に重要な役割を果たす。特に、ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）は、毛乳頭細胞の増殖及び抗細胞の死滅効果を有することが報告されている。しかしながら、育毛に重要な役割を果たす毛乳頭細胞は、頭皮からの分離及び培養が行われ難く、大量培養に際して毛髪の再生能が低下するという不都合があった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、頭皮組織から分離された毛球からチョッピングを通じて毛乳頭細胞を分離し、かつ継代培養して、毛乳頭細胞を大量増殖する方法を提供しようとする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記のような不都合を解決するために、本発明は、（Ａ）頭皮組織から毛球を分離するステップと、（Ｂ）毛球から毛乳頭細胞を分離するステップと、（Ｃ）継代培養するステップと、を含む毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法を提供する。

【0007】

本発明において、（Ａ）頭皮組織から毛球を分離するステップは、（ａ１）滅菌されたペトリディッシュに最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを被験者から採取した頭皮組織（表皮から真皮層まで）が沈漬されるように充填するステップと、（ａ２）ペトリディッシュの蓋体に最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを用いてドロップを形成し、微細手術用のハサミと鉗子（ｆｏｒｃｅｐ）を用いて、真皮層の毛球を一つずつ分離して、用意したドロップに移動させるステップと、（ａ３）ドロップに移動された毛球を実体顕微鏡にて観察しながら、シリンジと微細手術用の鉗子を用いて、毛球の末端に付着されている脂肪組織及び毛幹（ｈａｉｒ ｓｈａｆｔ）を取り除くステップと、を含んでいてもよい。

【0008】

また、本発明において、（Ｂ）毛球から毛乳頭細胞を分離するステップは、（ｂ１）細胞培養ディッシュに剥離培地及び毛球を入れた後、精密微細ハサミにて毛球をチョッピングするステップと、（ｂ２）チョッピングされた毛球をチューブに集め、遠心分離するステップと、を含んでいてもよい。

【0009】

さらに、本発明において、ステップ（ｂ１）においてチョッピングされた毛球の大きさは、１５μｍ～１２０μｍであってもよい。

【0010】

さらにまた、本発明において、遠心分離は、２２００ｒｐｍにて５分間かけて行われてもよい。

【0011】

さらにまた、本発明において、（Ｃ）継代培養するステップは、（ｃ１）細胞数に応じて継代培養すべき培養ディッシュを決定した後、培養ディッシュに入れられていた培地を捨て、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて清浄するステップと、（ｃ２）０．２５％ トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を処理し、３７℃、５％ ＣＯ_２ 大量増殖機において５分間かけてインキュベーションするステップと、（ｃ３）１％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入り最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを入れ、５０ｍｌの遠心管に集めた後、遠心分離するステップと、（ｃ４）上澄み液は捨て、底に沈殿しているペレットをタッピングした後、最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ、塩基性線維芽細胞成長因子、１０％ ウシ胎児血清、ペニシリン-ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを含む拡大培養用培地２を入れ、細胞数を確認するステップと、（ｃ５）計数された細胞数に応じて、１，５００個／ｃｍ^２になるように次のステップの培養ディッシュに接種した後、３７℃、５％ ＣＯ_２の大量増殖機において３日おきに培地を交換しながら、培養ディッシュが細胞によりいっぱいになるまで増殖するステップと、を含んでいてもよい。

【0012】

これらに加えて、本発明において、継代培養は、ステップ（ｃ１）～（ｃ５）を３回繰り返し行うことにより行われてもよい。

【発明の効果】

【0013】

本発明により大量に増殖された毛乳頭細胞は、育毛に重要な役割を果たせることから、毛乳頭細胞を大量増殖する方法に関する本発明は、医療分野、美容分野など様々な産業分野において活用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】毛球から毛乳頭細胞を分離する方法に応じた細胞取得率の差を比較して示すものである。

【図2】毛乳頭細胞の分離方法と培地の組成に応じた大量増殖結果の差を比較して示すものである。

【図3】ｃａｓｅごとの継代培養に応じた細胞取得率の差を比較して示すものである。

【図4】ｃａｓｅごとの継代培養に応じた、毛乳頭細胞と関わる成長因子の分泌量の差を比較して示すものである。

【図5】チョッピングの段階に応じた毛球の大きさの変化を示すものである。

【図6】チョッピングの段階に応じた細胞増殖の差を比較して示すものである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明による一実施形態においては、（Ａ）頭皮組織から毛球を分離するステップと、（Ｂ）毛球から毛乳頭細胞を分離するステップと、（Ｃ）継代培養するステップと、を含む毛乳頭細胞の分離及び大量増殖方法を提供する。

【0016】

本発明において、「毛球」は、毛包により包まれている毛根の下部に形成されている厚い棍棒状構造のものであって、毛細血管、毛乳頭細胞、毛母細胞などが位置する組織を意味する。

【0017】

本発明による別の実施形態において、（Ａ）頭皮組織から毛球を分離するステップは、（ａ１）滅菌されたペトリディッシュに最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを被験者から採取した頭皮組織（表皮から真皮層まで）が沈漬されるように充填するステップと、（ａ２）ペトリディッシュの蓋体に最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを用いてドロップを形成し、微細手術用のハサミと鉗子（ｆｏｒｃｅｐ）を用いて、真皮層の毛球を一つずつ分離して、用意したドロップに移動させるステップと、（ａ３）ドロップに移動された毛球を実体顕微鏡にて観察しながら、シリンジと微細手術用の鉗子を用いて、毛球の末端に付着されている脂肪組織及び毛幹（ｈａｉｒ ｓｈａｆｔ）を取り除くステップと、を含んでいてもよい。

【0018】

本発明によるさらに別の実施形態において、（Ｂ）毛球から毛乳頭細胞を分離するステップは、（ｂ１）細胞培養ディッシュに剥離培地及び毛球を入れた後、精密微細ハサミにて毛球をチョッピングするステップと、（ｂ２）チョッピングされた毛球をチューブに集め、遠心分離するステップと、を含んでいてもよい。

【0019】

本発明によるさらに別の実施形態において、ステップ（ｂ１）においてチョッピングされた毛球の大きさは、１５μｍ～１２０μｍであってもよい。

【0020】

本発明によるさらに別の実施形態において、遠心分離は、２２００ｒｐｍにて５分間かけて行われてもよい。

【0021】

本発明によるさらに別の実施形態において、（Ｃ）継代培養するステップは、（ｃ１）細胞数に応じて継代培養すべき培養ディッシュを決定した後、培養ディッシュに入れられていた培地を捨て、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて清浄するステップと、（ｃ２）０．２５％ トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を処理し、３７℃、５％ ＣＯ_２ 大量増殖機において５分間かけてインキュベーションするステップと、（ｃ３）１％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入り最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを入れ、５０ｍｌの遠心管に集めた後、遠心分離するステップと、（ｃ４）上澄み液は捨て、底に沈殿しているペレットをタッピングした後、最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ、塩基性線維芽細胞成長因子、１０％ ウシ胎児血清、ペニシリン-ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを含む拡大培養用培地２を入れ、細胞数を確認するステップと、（ｃ５）計数された細胞数に応じて、１，５００個／ｃｍ^２になるように次のステップの培養ディッシュに接種した後、３７℃、５％ ＣＯ_２の大量増殖機において３日おきに培地を交換しながら、培養ディッシュが細胞によりいっぱいになるまで増殖するステップと、を含んでいてもよい。

【0022】

本発明によるさらに別の実施形態において、継代培養は、ステップ（ｃ１）～（ｃ５）を３回繰り返し行うことにより行われてもよい。

【0023】

以下、具体的な実施例を挙げて本発明についてさらに詳しく説明する。しかし、これらの実施例は本発明についての理解への一助となるために例示の目的で提供されたものにすぎず、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないということは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。

【0024】

実施例１．頭皮組織からの毛球の分離

【0025】

滅菌された９０ｍｍのペトリディッシュに最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを被験者から採取した頭皮組織（表皮から真皮層まで）が沈漬されるように充填した後、９０ｍｍのペトリディッシュ蓋体に最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを用いて多数のドロップを形成し、微細手術用のハサミと鉗子（フォーセップ）を用いて、真皮層の毛球を一つずつ分離して、用意したドロップに移した。次いで、ドロップに移された毛球を実体顕微鏡にて観察しながら、２６Ｇシリンジと微細手術用の鉗子を用いて、毛球の末端に付着されている脂肪組織及び毛幹（ｈａｉｒ ｓｈａｆｔ）などを取り除いて、頭皮組織から毛球を分離した。

【0026】

実施例２．毛球からの毛乳頭細胞の分離

【0027】

毛球から毛乳頭細胞を分離する最適な方法を選択するために、下記のような比較実験を行った。

【0028】

まず、分離方法１は、３５ｍｍの細胞培養ディッシュに１ｍｌの剥離培地を入れ、毛球約５０個を入れた後、精密微細ハサミにてチョッピングした後にチューブに集め、２２００ｒｐｍにて５分間かけて遠心分離する方法である。

【0029】

次いで、分離方法２は、約５０個の毛球が入れられている３５ｍｍの細胞培養ディッシュに０．０２５％のコラゲナーゼタイプＩ試薬を入れた後、３７℃、シェイキングインキュベーターにおいて２時間３０分間かけてインキュベーションし、チューブに集めて２２００ｒｐｍにて５分間遠心分離する方法である。

【0030】

前記分離方法１と分離方法２の結果を比較するために、それぞれのペレットをタッピングし、下記の表１の組成を有する接着培地２ｍｌにてピペッティングを十分に行った後、３５ｍｍの細胞培養ディッシュに接種し、３７℃、５％ ＣＯ_２の大量増殖機において三日おきに培地を交換しながら、培養ディッシュが細胞によりいっぱいになるまで増殖した。

【0031】

【表1】

【0032】

上記の比較実験を行った結果、０．０２５％のコラゲナーゼタイプＩ試薬を入れた分離方法２と比較して、毛球それ自体に他の処理を施さず、チョッピングのみを行った分離方法１の方において、細胞の大きさがさらに小さく、かつ、細胞の大きさが揃っており、しかも、細胞取得率もまた高く得られるということを確認することができた（図１）。

【0033】

実施例３．継代培養ステップ

【0034】

初代細胞（Ｐａｓｓａｇｅ ０）から第一継代細胞（Ｐａｓｓａｇｅ １）へと継代培養するステップは、次のようにして行った。まず、３５ｍｍの細胞培養ディッシュにおいて集められた細胞数に応じて、継代培養すべき培養ディッシュを決定した後、３５ｍｍの細胞培養ディッシュに入れられていた培地を捨て、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて１回清浄した。次いで、０．２５％のトリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を処理し、３７℃、５％ ＣＯ_２の大量増殖機において５分間かけてインキュベーションした。次いで、不活性化のために１％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入り最小必須培地（ＭＥＭ）アルファを入れ、５０ｍｌの遠心管に集めた後、２２００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上澄み液は捨て、底に沈殿しているペレットを十分にタッピングした後、表２に示す適量の拡大培養用培地１または２を入れ、細胞数を確認した。

【0035】

【表2】

【0036】

計数された細胞数に応じて、１，５００個／ｃｍ^２になるように次のステップの培養ディッシュに接種した後、３７℃、５％ ＣＯ_２の大量増殖機において三日おきに培地を交換しながら、培養ディッシュが細胞によりいっぱいになるまで増殖した。

【0037】

次いで、初代細胞（Ｐａｓｓａｇｅ ０）から第四継代細胞（Ｐａｓｓａｇｅ ４）へと継代培養するステップは、上記の順序と同様にして行われ、計数される細胞数に応じて培養ディッシュの大きさを揃えて、第四継代細胞（Ｐａｓｓａｇｅ ４）まで継代培養し、中間の継代段階において凍結してから解凍する場合には、３，０００個／ｃｍ^２になるように培養ディッシュに接種した。

【0038】

実施例４．毛乳頭細胞の分離及び大量増殖の条件に応じた結果の導出

【0039】

実施例４－１．細胞の分離方法と培地の組成に応じた違い

【0040】

毛乳頭細胞の分離方法と培地の組成に応じた大量増殖の結果を図２に示す。図２において、ｃａｓｅ １は、チョッピングにより毛球から毛乳頭細胞を分離した後、増殖培地１において大量増殖を行った結果であり、ｃａｓｅ ２は、チョッピングにより毛球から毛乳頭細胞を分離した後、拡大培養用培地２において大量増殖を行った結果であり、ｃａｓｅ ３は、０．０２５％のコラゲナーゼタイプＩ試薬処理により毛球から毛乳頭細胞を分離した後、増殖培地１において大量増殖を行った結果であり、ｃａｓｅ ４は、０．０２５％のコラゲナーゼタイプＩ試薬処理により毛球から毛乳頭細胞を分離した後、増殖培地１において大量増殖を行った結果を示すものである。各ｃａｓｅごとに細胞のモルフォロジーを確認してみたところ、チョッピングにより毛球から毛乳頭細胞を分離した後、拡大培養用培地２を用いた場合であるｃａｓｅ ２において細胞の形状が良好に保持され、毛乳頭細胞の大量増殖増殖率が著しく向上するということを確認することができた。

【0041】

また、ｃａｓｅごとに継代大量増殖に応じた細胞の大きさの変化を下記の表３に示す。

【0042】

【表3】

【0043】

上記の表３によれば、ｃａｓｅ ２の細胞の大きさが最も小さく、かつ、最も均一に保持されており、ｃａｓｅ １を除いた残りの群においては、継代培養数が増えることにつれて、細胞の大きさもまた大きくなるという傾向を示している。さらに、ｃａｓｅ ２の場合には、Ｐ１からＰ４まではこれといった大きな変化なしに細胞の大きさが保持されることから、細胞の取得率もまた高いことを予想してみることができ、これを確認した結果を図３に示す。図３によれば、細胞の取得率もまた、全体の継代にわたってｃａｓｅ ２が最も高いということを確認することができ、特に、Ｐ３において最も多い量の細胞が集められたということが確認された。

【0044】

次いで、ｃａｓｅごとに継代培養に応じた、毛乳頭細胞と関わる成長因子の分泌量を図４に示す。図４によれば、人体の毛乳頭細胞を刺激して上皮小嚢細胞の増殖を促す肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管の拡張に与って毛髪の成長を誘導する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、毛包組織の成長を促す線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（（表皮細胞増殖因子（ＫＧＦ））など毛乳頭細胞の成長因子であると知られている様々な成長因子の分泌量を測定してみたところ、全般的にｃａｓｅ ２のＰ３において最も多い量の成長因子が分泌されるということを確認することができた。

【0045】

実施例４－２．チョッピング範囲に伴う違い

【0046】

上記の実験結果を踏まえて、最適なチョッピング範囲を決定するための実験を行った。まず、頭皮組織から打ち抜かれてきた毛球をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または基礎培地が充填されているペトリディッシュに集め、３５ｍｍの細胞培養ディッシュに１ｍｌの剥離培地と毛球を入れ、精密微細ハサミにて毛球をチョッピングした後、チョッピングの度合いに応じた毛球の大きさの変化を顕微鏡にて観察した。チョッピングの段階に応じた毛球の大きさを測定したところ、チョッピング前には７５０μｍ～９００μｍ、チョッピング第１段階においては４９０μｍ～６３０μｍ、第２段階においては３００μｍ～４１０μｍ、第３段階においては１８０μｍ～２６０μｍ、第４段階においては１５μｍ～１２０μｍの大きさの毛球を確認することができた（図５）。

【0047】

次いで、チョッピングされた毛球をチューブに集め、２２００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上澄み液は捨て、ペレットを集めて３５ｍｍの細胞培養ディッシュに１ｍｌの接着培地を入れ、３７℃、５％ ＣＯ_２ 大量増殖機において細胞の増殖を確認し、その結果は図６に示す。

【0048】

図６によれば、チョッピング範囲に応じて計４つの段階に分けて細胞の増殖及び付着の形態を確認してみたところ、チョッピングの度合いに応じて細胞の付着の形態が異なるということを確認することができた。図６の左側は、チョッピング後に付着してから三日目の細胞の写真であり、右側は、チョッピング後に付着してから五日目の細胞の写真である。培養三日目に観察したところ、チョッピングの段階が低い場合、細胞培養ディッシュの底面に細胞が均一に付着できずに塊状になって成長するという現象が起きた。これに対し、チョッピングの段階が高くなるにつれて、細胞培養ディッシュの底面に細胞が一定の間隔をあけて均一に付着されて成長し、両端が尖った方錐状に増殖された。さらに、培養五日目に観察したところ、チョッピングの段階が低い状態の場合、塊状になって成長した個所と塊状になっていない個所における細胞の増殖に著しく差が出ており、細胞が処々に散らばって成長する傾向を示したが、チョッピングの段階が高くなるにつれて、細胞培養ディッシュの底面の全体にわたって均一に細胞がいっぱいに詰まっているということを確認することができた。

【0049】

また、チョッピングの段階に応じた細胞取得率にも差が出たため、これを下記の表４に示す。

【0050】

【表4】

【0051】

上記の表４によれば、チョッピングの度合いに応じて、細胞の付着の形態だけではなく、取得率にも差が出るということを確認することができた。チョッピングの度合いに応じて、細胞が細胞培養ディッシュに付着される形態が異なってき、細胞同士の間隔及び増殖される形状に応じて取得率に大きく影響を及ぼすと認められる。概ね第１段階から第２段階のチョッピングの度合いにおいては、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成して増殖され、それにより、細胞が散らばって成長する傾向にあるため、１．０Ｅ＋０５～１．３Ｅ＋０５レベルの細胞取得率を示し、第３段階のチョッピングの度合いにおいては、細胞の集塊化は、第１段階から第２段階のチョッピングよりもあまり観察されないとはいえ、僅かな集塊化により初期の付着時に細胞の散在が観察され、第４段階のチョッピングにおいて、細胞が初期からシングルの状態でしっかりと付着されて細胞の散在や集塊化は全く観察されず、培養の日数が増えるにつれて、細胞培養ディッシュの底面の全体にわたって均一に付着されて増殖されるということを観察することができ、これにより、チョッピング第１段階と比較したとき、取得率に約２倍ほど差が出るということを確認することができた。しかしながら、１５μｍ以下にチョッピングを行った場合には、毛球の内部の毛乳頭細胞が損なわれて細胞取得率が格段に低くなるという不都合があり、１２０μｍ以上にチョッピングを行った場合には、上記の実験から確認したように、細胞の集塊化が起きて細胞が培養ディッシュの底面の全体にわたって均一に分布されない結果、細胞の増殖が格段に低下してしまうという不都合があったが、これは、均一に分布される細胞に比べて、集塊化した細胞は栄養分の吸収率が低下し、細胞の密度の上昇に起因する外部のストレスの増加の結果であると認められる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】