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特許7587276一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）アンタゴニスト及び関連する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-12
(45)【発行日】2024-11-20
(54)【発明の名称】一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）アンタゴニスト及び関連する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/166 20060101AFI20241113BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241113BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20241113BHJP
C07C 233/65 20060101ALN20241113BHJP
【ＦＩ】
A61K31/166
A61P43/00 111
A61P25/04
C07C233/65
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021544656
(86)(22)【出願日】2020-01-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-21
(86)【国際出願番号】 US2020016200
(87)【国際公開番号】W WO2020160464
(87)【国際公開日】2020-08-06
【審査請求日】2023-01-27
(31)【優先権主張番号】62/800,114
(32)【優先日】2019-02-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/800,143
(32)【優先日】2019-02-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/947,742
(32)【優先日】2019-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519402166
【氏名又は名称】マーシャル ユニバーシティー リサーチ コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＲＳＨＡＬＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｏｎｅ Ｊｏｈｎ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｄｒｉｖｅ， Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ， Ｗｅｓｔ Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２５７５５－８１００， Ｕ．Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100103034
【弁理士】
【氏名又は名称】野河 信久
(74)【代理人】
【識別番号】100065248
【弁理士】
【氏名又は名称】野河 信太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100159385
【弁理士】
【氏名又は名称】甲斐 伸二
(74)【代理人】
【識別番号】100163407
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 裕輔
(74)【代理人】
【識別番号】100166936
【弁理士】
【氏名又は名称】稲本 潔
(74)【代理人】
【識別番号】100174883
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 雅己
(74)【代理人】
【識別番号】100189429
【弁理士】
【氏名又は名称】保田 英樹
(74)【代理人】
【識別番号】100213849
【弁理士】
【氏名又は名称】澄川 広司
(72)【発明者】
【氏名】ジョルニガン，ベルベット ブレア
【審査官】三上 晶子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００６－５０９１８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５２６８５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５００８２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０３４８６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ０７Ｃ １／００－４０９／４４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：【化1】
【化2】
を含むＴＲＰＭ８アンタゴニスト。
【請求項2】
以下の式（ＶＩＩ）：【化3】
【請求項3】
以下の式（ＩＸ）：【化4】
【請求項4】
以下の式（ＸＩ）：【化5】
【請求項5】
以下の式（ＸＩＩ）：【化6】
【請求項6】
以下の式（ＸＩＶ）：【化7】
【請求項7】
以下の式（ＸＶ）：【化8】
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載のＴＲＰＭ８アンタゴニストと、薬学的に許容されるビヒクル、キャリア又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項9】
疼痛の処置のための請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記疼痛が神経障害性疼痛である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記疼痛が異痛症である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記疼痛が慢性神経障害性疼痛である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記疼痛が化学療法誘導神経障害性疼痛である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項14】
静脈内、腹腔内、筋内又は皮下注射用の請求項８～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
ヒトを処置するための、請求項８～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
[0001]
本出願は、２０１９年２月１日出願の米国仮特許出願第６２／８００，１１４号、２０１９年２月１日出願の米国仮特許出願第６２／８００，１４３号及び２０１９年１２月１３日出願の米国仮特許出願第６２／９４７，７４２号からの優先権を主張し、これらのそれぞれの開示の全体は、本明細書にこの参照により組み込まれる。
[0001]
本出願は、２０１９年２月１日出願の米国仮特許出願第６２／８００，１１４号、２０１９年２月１日出願の米国仮特許出願第６２／８００，１４３号及び２０１９年１２月１３日出願の米国仮特許出願第６２／９４７，７４２号からの優先権を主張し、これらのそれぞれの開示の全体は、本明細書にこの参照により組み込まれる。
【0002】
技術分野
[0002]
ここに開示する主題は、全般的に、一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）アンタゴニスト及び関連する方法に関する。特に、ここに開示する主題のあるいくつかの実施形態は、ＴＲＰＭ８アンタゴニスト及びこれらのアンタゴニストを疼痛の処置のために用いる方法に関する。
[0002]
ここに開示する主題は、全般的に、一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）アンタゴニスト及び関連する方法に関する。特に、ここに開示する主題のあるいくつかの実施形態は、ＴＲＰＭ８アンタゴニスト及びこれらのアンタゴニストを疼痛の処置のために用いる方法に関する。
【背景技術】
【0003】
[0003]
「冷覚受容器」ともしばしば呼ばれるＴＲＰＭ８は、体性感覚神経系のポリモーダルな侵害受容器であり、ヒトにおける冷覚侵害受容の主要な感知器である。他の温度感応性ＴＲＰチャネルであるＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１とは異なって比較されるが、ＴＲＰＭ８は、後根神経節（ＤＲＧ）及び三叉神経節（ＴＧ）の一次感覚ニューロン（Ａδ及びＣ線維）、並びにいくつかの他の非神経組織において発現される。一次感覚ニューロン内で、ＴＲＰＭ８は、末梢及び中枢神経末端の両方に存在し、体性感覚及び中枢神経系における役割を支える。この冷覚感知侵害受容器は、少し冷たい温度（１５～２５℃）、化学物質、例えば（－）－メントール（（１Ｒ，２Ｓ，５Ｒ）－５－メチル－２－（１－メチルエチル）－シクロヘキサノール）、「スーパーアゴニスト」であるイシリン（３－（２－ヒドロキシフェニル）－６－（３－ニトロフェニル）－３，４－ジヒドロピリミジン－２（１Ｈ）－オン、（ＡＧ３－５としても知られる）及び内在性脂質ＰＩＰ2による活性化の後に、感覚神経活動電位を開始する。メントールによるＴＲＰＭ８の最大限の刺激は、１つの機能的ＴＲＰＭ８四量体のうちの単量体それぞれを占める４つのメントール分子のリガンド化学量論を介して発生する。
「冷覚受容器」ともしばしば呼ばれるＴＲＰＭ８は、体性感覚神経系のポリモーダルな侵害受容器であり、ヒトにおける冷覚侵害受容の主要な感知器である。他の温度感応性ＴＲＰチャネルであるＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１とは異なって比較されるが、ＴＲＰＭ８は、後根神経節（ＤＲＧ）及び三叉神経節（ＴＧ）の一次感覚ニューロン（Ａδ及びＣ線維）、並びにいくつかの他の非神経組織において発現される。一次感覚ニューロン内で、ＴＲＰＭ８は、末梢及び中枢神経末端の両方に存在し、体性感覚及び中枢神経系における役割を支える。この冷覚感知侵害受容器は、少し冷たい温度（１５～２５℃）、化学物質、例えば（－）－メントール（（１Ｒ，２Ｓ，５Ｒ）－５－メチル－２－（１－メチルエチル）－シクロヘキサノール）、「スーパーアゴニスト」であるイシリン（３－（２－ヒドロキシフェニル）－６－（３－ニトロフェニル）－３，４－ジヒドロピリミジン－２（１Ｈ）－オン、（ＡＧ３－５としても知られる）及び内在性脂質ＰＩＰ2による活性化の後に、感覚神経活動電位を開始する。メントールによるＴＲＰＭ８の最大限の刺激は、１つの機能的ＴＲＰＭ８四量体のうちの単量体それぞれを占める４つのメントール分子のリガンド化学量論を介して発生する。
【0004】
[0004]
ＴＲＰＭ８は、複数の治療介入の有力な標的とみられている。ＴＲＰＭ８アゴニストは、良性前立腺肥大症及び前立腺癌について探求されているが、アンタゴニストは、なかでも神経障害性疼痛及び片頭痛における冷覚過敏症についての興味が大きくなっている。
ＴＲＰＭ８は、複数の治療介入の有力な標的とみられている。ＴＲＰＭ８アゴニストは、良性前立腺肥大症及び前立腺癌について探求されているが、アンタゴニストは、なかでも神経障害性疼痛及び片頭痛における冷覚過敏症についての興味が大きくなっている。
【0005】
[0005]
いくつかの知的所有権下にあるＴＲＰＭ８アンタゴニストがあり、多くが企業内での化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングにより見いだされたものである。しかし、これらのアンタゴニストがどのようにしてヒトＴＲＰＭ８と結合してそのゲーティング機構にその後影響するのか、またその基礎をなすファーマコフォアの正確な分子的詳細は、特に、クリオ電子顕微鏡観察（クリオＥＭ）により明らかにされたＴＲＰＭ８及びＴＲＰチャネル構造生物学の近年の成功があった今、これから解明されるであろう。
いくつかの知的所有権下にあるＴＲＰＭ８アンタゴニストがあり、多くが企業内での化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングにより見いだされたものである。しかし、これらのアンタゴニストがどのようにしてヒトＴＲＰＭ８と結合してそのゲーティング機構にその後影響するのか、またその基礎をなすファーマコフォアの正確な分子的詳細は、特に、クリオ電子顕微鏡観察（クリオＥＭ）により明らかにされたＴＲＰＭ８及びＴＲＰチャネル構造生物学の近年の成功があった今、これから解明されるであろう。
【0006】
[0006]
ＴＲＰＭ８媒介Ｃａ2+フラックスアッセイにおいて、公知のＴＲＰＭ８アンタゴニストは、控えめな又は変動する効力を表すとみられる。例えば、キノリンベースのＰＦ－０５１０５６７９（Ｐｆｉｚｅｒ、第１相、ＮＣＴ０１３９３６５２）は、ヒトＴＲＰＭ８での電位及びＷＳ－１２により媒介される活性化の影響を、１０３±９．４ｎＭ及び１８１±７．２１ｎＭのＩＣ50値で阻害するが、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，７－ナフチリジンアナログＡＭＧ２８５０（Ａｍｇｅｎ）は、ラット及びヒトのＴＲＰＭ８にてメントール、イシリン及び低温活性化に対して７～１５６ｎＭの範囲のＩＣ50値を示す。２－ベンジルオキシ－安息香酸アミド誘導体ＡＭＴＢ（Ｂａｙｅｒ）は、ヒトＴＲＰＭ８にてイシリンにより媒介される応答に対して、ｐＩＣ50：６．２３±０．０２でより弱く阻害する。現在までに、しかし、臨床使用まで進んだＴＲＰＭ８アンタゴニストはない。例えば、ＰＦ－０５１０５６７９は、そのＩＣ50値より大きい非結合血漿濃度を達成するために必要な高用量（６００ｍｇ及び９００ｍｇ）での測定可能な治療指標を有さない。同様に、ニコチン酸アナログＡＭＧ３３３（Ａｍｇｅｎ、ＮＣＴ０２１３２４２９）の第１相研究は、開示されない理由により中止された。効力があり、ある程度特異的で、よって、成功した前臨床開発の後に臨床試験をうまく通過する可能性を維持できるＴＲＰＭ８アンタゴニストをより多く導入する必要性がいまだに存在する。
ＴＲＰＭ８媒介Ｃａ2+フラックスアッセイにおいて、公知のＴＲＰＭ８アンタゴニストは、控えめな又は変動する効力を表すとみられる。例えば、キノリンベースのＰＦ－０５１０５６７９（Ｐｆｉｚｅｒ、第１相、ＮＣＴ０１３９３６５２）は、ヒトＴＲＰＭ８での電位及びＷＳ－１２により媒介される活性化の影響を、１０３±９．４ｎＭ及び１８１±７．２１ｎＭのＩＣ50値で阻害するが、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，７－ナフチリジンアナログＡＭＧ２８５０（Ａｍｇｅｎ）は、ラット及びヒトのＴＲＰＭ８にてメントール、イシリン及び低温活性化に対して７～１５６ｎＭの範囲のＩＣ50値を示す。２－ベンジルオキシ－安息香酸アミド誘導体ＡＭＴＢ（Ｂａｙｅｒ）は、ヒトＴＲＰＭ８にてイシリンにより媒介される応答に対して、ｐＩＣ50：６．２３±０．０２でより弱く阻害する。現在までに、しかし、臨床使用まで進んだＴＲＰＭ８アンタゴニストはない。例えば、ＰＦ－０５１０５６７９は、そのＩＣ50値より大きい非結合血漿濃度を達成するために必要な高用量（６００ｍｇ及び９００ｍｇ）での測定可能な治療指標を有さない。同様に、ニコチン酸アナログＡＭＧ３３３（Ａｍｇｅｎ、ＮＣＴ０２１３２４２９）の第１相研究は、開示されない理由により中止された。効力があり、ある程度特異的で、よって、成功した前臨床開発の後に臨床試験をうまく通過する可能性を維持できるＴＲＰＭ８アンタゴニストをより多く導入する必要性がいまだに存在する。
【0007】
[0007]
さらに、広い化学的多様性を有する多様なアゴニスト及びアンタゴニスト両方の足場が、様々な疾患状態、例えば口腔顔面及び神経障害性疼痛、過活動膀胱（ＯＡＢ）及び疼痛性膀胱症候群、温度調節に関与する疾患、口腔扁平上皮癌、ニコチン嗜癖行動並びに慢性閉塞性肺疾患におけるＴＲＰＭ８の役割を解明するために用いられている。いくつかの場合では、ＴＲＰＭ８の薬理学をつきとめるためのツール分子としてのこれらのリガンドの使用は、特に慢性神経障害性疼痛におけるその役割の決定において、矛盾したデータを導いている。アンタゴニストプロフィールを有する同族リガンド（－）－メントールに基づく効力の高い化学プローブは、初期の薬物開発の背景からＴＲＰＭ８分野に立ち戻るために必要であるが、この化学種のこのような小分子は、現在存在しない。
さらに、広い化学的多様性を有する多様なアゴニスト及びアンタゴニスト両方の足場が、様々な疾患状態、例えば口腔顔面及び神経障害性疼痛、過活動膀胱（ＯＡＢ）及び疼痛性膀胱症候群、温度調節に関与する疾患、口腔扁平上皮癌、ニコチン嗜癖行動並びに慢性閉塞性肺疾患におけるＴＲＰＭ８の役割を解明するために用いられている。いくつかの場合では、ＴＲＰＭ８の薬理学をつきとめるためのツール分子としてのこれらのリガンドの使用は、特に慢性神経障害性疼痛におけるその役割の決定において、矛盾したデータを導いている。アンタゴニストプロフィールを有する同族リガンド（－）－メントールに基づく効力の高い化学プローブは、初期の薬物開発の背景からＴＲＰＭ８分野に立ち戻るために必要であるが、この化学種のこのような小分子は、現在存在しない。
【0008】
[0008]
アポ体結合及びアゴニスト結合両方の鳥類ＴＲＰＭ８（ＴＲＰＭ８FA、ＰＤＢコード６ＢＰＱ（４．１Å）、６ＮＲ２（４Å）及び６ＮＲ３（３．４Å））の最近のクリオＥＭ構造は、マウス、ラット、リス及びヒトのオルソログでのインビトロ及びインビボ突然変異誘発研究により支持されるように、冷覚感知から切り離されている可能性があるプロトタイプリガンドであるメントール及びイシリンについての決定的な結合部位を指し示している。突然変異誘発研究は、電位感知器様ドメイン（ＶＳＬＤ）の膜貫通Ｓ１ヘリックスの真ん中に位置する保存されたＴｙｒ７４５が、［3Ｈ］－メントールを用いる放射性リガンド置き換え研究により決定されるようにメントール結合と、有効性との両方に重要であることを示唆している。これらの研究は、メントールアナログＷＳ－１２と複合体形成した鳥類ＴＲＰＭ８（ＰＤＢ ６ＮＲ２）の構造と一貫している。単離されたＳ１－Ｓ４感知ドメインの構築物も、マイクロスケール熱泳動及びＮＭＲにより決定されるように、この領域がメントール認識のために重要であることを示唆する。他のメントール感応性残基は、Ｔｙｒ１００５及びＬｅｕ１００９を含み、これらはともに、細胞質ゾルドメイン界面の近くのＴＲＰヘリックス膜貫通ドメイン中にあり、保存されている。これらの２つの残基の位置的な等価物は、ＷＳ－１２と結合した構造（ＴＲＰＭ８FA中のＴｙｒ１００４及びＬｅｕ１００８）において見ることができる。このポケットは、Ｔｙｒ７４５及びＬｅｕ１００９を含む類似の残基とともに、Ｓ３ヘリックス中のＧｌｙ８０５、Ａｓｎ７９９及びＡｓｐ８０２でイシリンとも結合する。イシリンと結合した鳥類ＴＲＰＭ８のクリオＥＭ構造は、全てのＴＲＰＭサブタイプにわたって保存された残基であるＴｙｒ７４５が、メントール及びイシリンの両方の認識について、それらの化学種が異なることにもかかわらず、共通するＴＲＰＭ８残基であるが、Ａｓｎ７９９及びＡｓｐ８０２は、Ｇｌｎ７８２及びＧｌｕ７８５とともに、Ｃａ2+依存性イシリン結合のために必要であるという概念を強化する。Ｐｈｅ８３８、Ａｒｇ８４１、Ｈｉｓ８４４及びＴｙｒ１００４（ｈＴＲＰＭ８にてそれぞれＰｈｅ８３９、Ａｒｇ８４２、Ｈｉｓ８４５及びＴｙｒ１００５）を含むさらなるイシリン結合残基は整列して、ＶＳＬＤ及びＴＲＰヘリックス内でオルソステリック部位を形成する。このリガンド結合部位は、重要な電位及び冷覚感応性残基、Ｓ４ヘリックス内の保存されたＡｒｇ８４１（ｈＴＲＰＭ８にてＡｒｇ８４２）ともオーバーラップし、このことは、リガンド及び電位刺激の多重感知器として機能するＴＲＰＭ８の能力が、部分的に、ＶＳＬＤ内のＳ１～Ｓ４ヘリックスに含まれるこの共通部位に由来することを示す。冬眠するジリス及びラットのトランスジェニックモデルは、ポアヘリックス（ＰＨ）とＳ６ヘリックスとを連結するループ内の７２６位（プレＳ１ドメイン）、７６２位（Ｓ１－Ｓ２ループ）、８１９位（Ｓ３－Ｓ４ループ）及び９２７、９４６、９４７位にてＴＭヘリックスをつなぐループ中でＶＳＬＤ全体に散らばっているイシリン活性化に対して冷覚活性化を担う残基を関連させる。ラット、リス及びヒトのＴＲＰＭ８オルソログの配列アラインメントから、ラットにおける６つの冷覚授与残基のうちの４つが、ヒトオルソログにおいて保存され（Ｔｙｒ７２６、Ｓｅｒ７６２、Ｓｅｒ８１９及びＡｓｎ９４７）、このことは、ヒトにおけるリガンド対冷覚活性化が、トポグラフィー的に別個の領域で発生する可能性を生じさせる。一方、残りの２つのミスマッチ残基は、ヒト及び低温耐性ジリスにおいて保存され（Ａｌａ９２７、Ｈｉｓ９４６）、このことは、これらの残基が冷覚表現型を支持しないか、又はアロステリック調節によって冷覚応答に寄与することを示唆する。
アポ体結合及びアゴニスト結合両方の鳥類ＴＲＰＭ８（ＴＲＰＭ８FA、ＰＤＢコード６ＢＰＱ（４．１Å）、６ＮＲ２（４Å）及び６ＮＲ３（３．４Å））の最近のクリオＥＭ構造は、マウス、ラット、リス及びヒトのオルソログでのインビトロ及びインビボ突然変異誘発研究により支持されるように、冷覚感知から切り離されている可能性があるプロトタイプリガンドであるメントール及びイシリンについての決定的な結合部位を指し示している。突然変異誘発研究は、電位感知器様ドメイン（ＶＳＬＤ）の膜貫通Ｓ１ヘリックスの真ん中に位置する保存されたＴｙｒ７４５が、［3Ｈ］－メントールを用いる放射性リガンド置き換え研究により決定されるようにメントール結合と、有効性との両方に重要であることを示唆している。これらの研究は、メントールアナログＷＳ－１２と複合体形成した鳥類ＴＲＰＭ８（ＰＤＢ ６ＮＲ２）の構造と一貫している。単離されたＳ１－Ｓ４感知ドメインの構築物も、マイクロスケール熱泳動及びＮＭＲにより決定されるように、この領域がメントール認識のために重要であることを示唆する。他のメントール感応性残基は、Ｔｙｒ１００５及びＬｅｕ１００９を含み、これらはともに、細胞質ゾルドメイン界面の近くのＴＲＰヘリックス膜貫通ドメイン中にあり、保存されている。これらの２つの残基の位置的な等価物は、ＷＳ－１２と結合した構造（ＴＲＰＭ８FA中のＴｙｒ１００４及びＬｅｕ１００８）において見ることができる。このポケットは、Ｔｙｒ７４５及びＬｅｕ１００９を含む類似の残基とともに、Ｓ３ヘリックス中のＧｌｙ８０５、Ａｓｎ７９９及びＡｓｐ８０２でイシリンとも結合する。イシリンと結合した鳥類ＴＲＰＭ８のクリオＥＭ構造は、全てのＴＲＰＭサブタイプにわたって保存された残基であるＴｙｒ７４５が、メントール及びイシリンの両方の認識について、それらの化学種が異なることにもかかわらず、共通するＴＲＰＭ８残基であるが、Ａｓｎ７９９及びＡｓｐ８０２は、Ｇｌｎ７８２及びＧｌｕ７８５とともに、Ｃａ2+依存性イシリン結合のために必要であるという概念を強化する。Ｐｈｅ８３８、Ａｒｇ８４１、Ｈｉｓ８４４及びＴｙｒ１００４（ｈＴＲＰＭ８にてそれぞれＰｈｅ８３９、Ａｒｇ８４２、Ｈｉｓ８４５及びＴｙｒ１００５）を含むさらなるイシリン結合残基は整列して、ＶＳＬＤ及びＴＲＰヘリックス内でオルソステリック部位を形成する。このリガンド結合部位は、重要な電位及び冷覚感応性残基、Ｓ４ヘリックス内の保存されたＡｒｇ８４１（ｈＴＲＰＭ８にてＡｒｇ８４２）ともオーバーラップし、このことは、リガンド及び電位刺激の多重感知器として機能するＴＲＰＭ８の能力が、部分的に、ＶＳＬＤ内のＳ１～Ｓ４ヘリックスに含まれるこの共通部位に由来することを示す。冬眠するジリス及びラットのトランスジェニックモデルは、ポアヘリックス（ＰＨ）とＳ６ヘリックスとを連結するループ内の７２６位（プレＳ１ドメイン）、７６２位（Ｓ１－Ｓ２ループ）、８１９位（Ｓ３－Ｓ４ループ）及び９２７、９４６、９４７位にてＴＭヘリックスをつなぐループ中でＶＳＬＤ全体に散らばっているイシリン活性化に対して冷覚活性化を担う残基を関連させる。ラット、リス及びヒトのＴＲＰＭ８オルソログの配列アラインメントから、ラットにおける６つの冷覚授与残基のうちの４つが、ヒトオルソログにおいて保存され（Ｔｙｒ７２６、Ｓｅｒ７６２、Ｓｅｒ８１９及びＡｓｎ９４７）、このことは、ヒトにおけるリガンド対冷覚活性化が、トポグラフィー的に別個の領域で発生する可能性を生じさせる。一方、残りの２つのミスマッチ残基は、ヒト及び低温耐性ジリスにおいて保存され（Ａｌａ９２７、Ｈｉｓ９４６）、このことは、これらの残基が冷覚表現型を支持しないか、又はアロステリック調節によって冷覚応答に寄与することを示唆する。
【0009】
[0009]
したがって、上記の研究に鑑みて、疼痛の処置において有用なさらなるＴＲＰＭ８アンタゴニストが、非常に望まれており、有益であろう。
したがって、上記の研究に鑑みて、疼痛の処置において有用なさらなるＴＲＰＭ８アンタゴニストが、非常に望まれており、有益であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
[0010]
ここに開示する主題は、本書面で提供される情報を精査した後に当業者に明らかになるように、上記の必要性のいくつか又は全てを満たす。
ここに開示する主題は、本書面で提供される情報を精査した後に当業者に明らかになるように、上記の必要性のいくつか又は全てを満たす。
【0011】
[0011]
この要旨は、ここに開示する主題のいくつかの実施形態について記載し、多くの場合、これらの実施形態の変形及び並べ替えを列挙する。この要旨は、多数の変動した実施形態の単なる例である。ある実施形態の１つ以上の代表的な特徴についての言及も、同様に例示である。このような実施形態は、言及される特徴とともに又はそれなしで典型的に存在できる。同様に、これらの特徴は、この要旨に列挙されていてもいなくてもここに開示する主題の他の実施形態に当てはめることができる。過剰な繰り返しを避けるために、この要旨は、このような特徴の全ての可能な組み合わせを列挙又は示唆しない。
この要旨は、ここに開示する主題のいくつかの実施形態について記載し、多くの場合、これらの実施形態の変形及び並べ替えを列挙する。この要旨は、多数の変動した実施形態の単なる例である。ある実施形態の１つ以上の代表的な特徴についての言及も、同様に例示である。このような実施形態は、言及される特徴とともに又はそれなしで典型的に存在できる。同様に、これらの特徴は、この要旨に列挙されていてもいなくてもここに開示する主題の他の実施形態に当てはめることができる。過剰な繰り返しを避けるために、この要旨は、このような特徴の全ての可能な組み合わせを列挙又は示唆しない。
【0012】
[0012]
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、式（Ｉ）：
（式中、Ｒ1は、各々５～１２の炭素原子を有する、飽和であっても部分的に不飽和であってもよいシクロアルキル、ビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基であって、１～５の炭素原子を有するアルキル基又は４～１２の炭素原子を有するシクロアルキル基で置換されていてもよいシクロアルキル、ビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基から選択される）を含むＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。いくつかの実施形態において、Ｒ1は、ビシクロアルキル基であり、ビシクロアルキル基は、縮合、橋かけ又はスピロ連結ビシクロアルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ1は、シクロアルキル基、例えば、あるいくつかの実施形態において、分岐又は置換シクロアルキル基であるシクロアルキル基である。
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、式（Ｉ）：
【化1】
【0013】
[0013]
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択される。
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化2】
【0014】
[0014]
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化3】
【0015】
[0015]
さらなる実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基である。
さらなる実施形態において、Ｒ1は、
【化4】
【0016】
[0016]
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるシクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化5】
【0017】
[0017]
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるスピロ連結ビシクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化6】
【0018】
[0018]
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるシクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化7】
【0019】
[0019]
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化8】
【0020】
[0020]
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、医薬組成物がさらに提供される。いくつかの実施形態において、ここに開示する主題のＴＲＰＭ８アンタゴニスト（例えば式（Ｉ）のＴＲＰＭ８アンタゴニストと、薬学的に許容されるビヒクル、キャリア又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、医薬組成物がさらに提供される。いくつかの実施形態において、ここに開示する主題のＴＲＰＭ８アンタゴニスト（例えば式（Ｉ）のＴＲＰＭ８アンタゴニストと、薬学的に許容されるビヒクル、キャリア又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
【0021】
[0021]
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、疼痛を処置する方法がさらに提供される。いくつかの実施形態において、必要とする対象に、有効量の上記の式（Ｉ）を含むＴＲＰＭ８アンタゴニストを投与することを含む、疼痛を処置する方法が提供される。この治療方法のいくつかの実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛、例えば、あるいくつかの実施形態において、異痛症、慢性神経障害性疼痛又は化学療法誘発神経障害性疼痛である。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭ８アンタゴニストを投与することは、ＴＲＰＭ８アンタゴニストを静脈内、腹腔内、筋内又は皮下注射することを含み得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、疼痛を処置する方法がさらに提供される。いくつかの実施形態において、必要とする対象に、有効量の上記の式（Ｉ）を含むＴＲＰＭ８アンタゴニストを投与することを含む、疼痛を処置する方法が提供される。この治療方法のいくつかの実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛、例えば、あるいくつかの実施形態において、異痛症、慢性神経障害性疼痛又は化学療法誘発神経障害性疼痛である。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭ８アンタゴニストを投与することは、ＴＲＰＭ８アンタゴニストを静脈内、腹腔内、筋内又は皮下注射することを含み得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
【0022】
[0022]
本発明のさらなる特徴及び利点は、本書面の説明、図面及び非限定的な実施例を精査した後に当業者に明らかになる。
本発明のさらなる特徴及び利点は、本書面の説明、図面及び非限定的な実施例を精査した後に当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】[0023]図１は、メントール及び／又はイシリン（イシリン：３－（２－ヒドロキシフェニル）－６－（３－ニトロフェニル）－３，４－ジヒドロピリミジン－２（１Ｈ）－オン）の効果に対するＣａ2+フラックスアッセイにおいて決定されたアンタゴニストについてのＩＣ50値を含む、報告されたＴＲＰＭ８アンタゴニストを示すチャートである。
【図2】[0024]図２Ａ～２Ｄは、ＭＤシミュレーション中の（－）－メンチル１及びｈＴＲＰＭ８の収束パラメータを示す図及びグラフを含み、以下を含む：（図２Ａ）ｈＴＲＰＭ８中の化合物１のドッキングポーズ（プレＭＤ）を示す図であり、ここで、（－）－メンチル化合物１は、マゼンタの棒として示し、重要な残基は、棒で示し、個別のヘリックスを示し（１（青）、Ｓ２（色褪せた緑）、Ｓ４（黄緑）、ＴＲＰヘリックス（赤））、Ｃａ2+イオン（緑）は、ＣＰＫ表示中に示す；（図２Ｂ）１００ｎｓ ＭＤ後のｈＴＲＰＭ８中の化合物１の結合モード（ポストＭＤ）を示す図であり、ここで、（－）－メンチル化合物１は、灰色の棒で示す；（図２Ｃ）ＭＤシミュレーション中の化合物１とｈＴＲＰＭ８の標準偏差（ＲＭＳＤ）を示すグラフであり、（図２Ｄ）化合物１の結合に寄与するｈＴＲＰＭ８中の鍵となる残基のエネルギー分解を示すグラフであり、ここで、ｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルを、鋳型としてＴＲＰＭ８FA（ＰＤＢ ６ＢＰＱ）のクリオＥＭ構造を用いて構築した。
【図3】[0025]図３Ａ～３Ｄは、ＭＤシミュレーション中のＡＭＧ２８５０及びｈＴＲＰＭ８の収束パラメータを示す図及び画像を含み、以下を含む：（図３Ａ）ｈＴＲＰＭ８中のＡＭＧ２８５０のドッキングポーズ（プレＭＤ）を示す図であり、ここで、ＡＭＧ２８５０は、マゼンタの棒として示し、重要な残基は、棒で示し、個別のヘリックスを示し（Ｓ２（色褪せた緑）、Ｓ３（緑）、Ｓ４（黄緑）、ＴＲＰヘリックス（赤））、Ｃａ2+イオン（緑）は、ＣＰＫ表示中に示す；（図３Ｂ）１００ｎｓ ＭＤ後のｈＴＲＰＭ８中のＡＭＧ２８５０の結合モード（ポストＭＤ）を示す図であり、ここで、ＡＭＧ２８５０は、灰色の棒で示す；（図３Ｃ）ＭＤシミュレーション中のＡＭＧ２８５０とｈＴＲＰＭ８のＲＭＳＤを示すグラフであり、（図３Ｄ）ＡＭＧ２８５０の結合に寄与するｈＴＲＰＭ８中の鍵となる残基のエネルギー分解を示すグラフであり、ここで、ｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルを、鋳型としてＴＲＰＭ８FA（ＰＤＢ ６ＢＰＱ）のクリオＥＭ構造を用いて構築した。
【図4】[0026]図４は、ＭＤポーズからのＡＭＧ２８５０及び（－）－メンチル化合物１の重ね合わせを示す図である（緑及びマゼンタ：ＴＲＰＭ８と（－）－メンチル化合物１のＭＤポーズ、青及び灰色：ＴＲＰＭ８とＡＭＧ２８５０のＭＤポーズ）。
【図5】[0027]図５は、ヒトＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞のｆｕｒａ－２ベースのＣａ2+イメージングを用いた、イシリン誘導Ｃａ2+侵入シグナルに対するいずれかの影響についての試験化合物の評価を示すグラフであり、ここで、Ｃａ2+フリー細胞外溶液中に浸かったｆｕｒａ－２負荷細胞を、様々な濃度の合成化合物又は既知のＴＲＰＭ８アンタゴニストＲＱ－００２０３０７８とともに又はなしでイシリン（５００ｎＭ）に曝露し（この図について、全て３ｎＭであったが、対応するヒストグラムを図１５に示す）、化合物を添加したおよそ４分後に、Ｃａ2+フリー浴液を、２ｍＭのＣａ2+を含むものに交換し、ここでＣａ2+流入をｆｕｒａ－２蛍光比（Ｆ355／Ｆ380）としてモニタリングし、各データ点は、平均±ＳＥＭを表す（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧３５細胞）。
【図6】[0028]図６Ａ～６Ｂは、ｈＴＲＰＭ８における化合物５（図６Ａ）及び化合物７（図６Ｂ）の結合モードを示す画像を含み、ここで、化合物５及び７は、それぞれ黄色及びオレンジ色の棒として示し、重要な残基は、棒として示し、個別のヘリックスを示し（Ｓ１（青）、Ｓ２（色褪せた緑）、Ｓ４（黄緑）及びＴＲＰヘリックス（赤））、Ｃａ2+イオン（緑）をＣＰＫ表示中に示し、ｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルを、鋳型としてＴＲＰＭ８FA（ＰＤＢ ６ＢＰＱ）のクリオ電子顕微鏡観察（クリオＥＭ）構造を用いて構築した。
【図7】[0029]図７Ａ～７Ｂは、化合物１４によるメントール誘発ＴＲＰＭ８電流の阻害を示すグラフを含み、ここで、電流は、ヒトＴＲＰＭ８で一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３細胞のホールセルホールセルパッチクランプクランプ電気生理学により測定したが、以下を含む：（図７Ａ）５００μＭの飽和濃度のメントール及び様々な濃度の化合物１４に曝露した際に＋８０ｍＶ電圧パルスにより測定した平均電流トレース（ｎ＝４）を示すグラフであり；（図７Ｂ）１ｎＭから１μＭまでの濃度にて＋８０ｍＶで５００μＭメントールの存在下で測定した、化合物１４の用量応答を示すグラフであり、ここで、電流応答は、各細胞についてアンタゴニストなしで測定した最大電流規模に対して標準化し、データは、単一結合部位Ｈｉｌｌ等式を用いて適合し、ＩＣ50は、６４±２ｎＭ（ｎ＝６細胞）と計算され、誤差バーは、平均の標準誤差を示す。
【図8】[0030]図８Ａ～８Ｄは、ＭＤシミュレーション中の１４及びｈＴＲＰＭ８の収束パラメータを示す図及びグラフを含み、以下を含む：（図８Ａ）ｈＴＲＰＭ８中の化合物１４の結合モード（プレＭＤ）を示すグラフであり、ここで、化合物１４は、マゼンタの棒として示し、重要な残基は、棒で示し、個別のヘリックスを示し（Ｓ１（青）、Ｓ２（色褪せた緑）、Ｓ３（緑）、Ｓ４（黄緑）、ＴＲＰヘリックス（赤））、Ｃａ2+イオン（緑）は、ＣＰＫ表示中に示す；（図８Ｂ）ｈＴＲＰＭ８中の化合物１４の結合モード（ポストＭＤ）を示す図であり；（図８Ｃ）化合物１４及びｈＴＲＰＭ８のＲＭＳＤを示すグラフであり；（図８Ｄ）化合物１４の結合に寄与するｈＴＲＰＭ８中の鍵となる残基のエネルギー分解を示すグラフであり、ここで、ｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルを、鋳型としてＴＲＰＭ８FA（ＰＤＢ ６ＢＰＱ）のクリオＥＭ構造を用いて構築した。
【図9】[0031]図９は、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１中の化合物１４の結合ポケット並びにそれらの結合モードを示す関連する図を含み、以下を含む：（パネル（ａ））ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１中の化合物１４の結合ポケットの位置を示す図であり；（パネル（ｂ））；ｈＴＲＰＡ１（ＰＤＢ ３Ｊ９Ｐ）中の化合物１４の結合モードを示す図であり；（パネル（ｃ））ｈＴＲＰＭ８中の化合物１４の結合モードを示す図であり、ここで、ｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルを、鋳型としてＴＲＰＭ８FA（ＰＤＢ ６ＢＰＱ）のクリオ電子顕微鏡観察（クリオＥＭ）構造を用いて構築し；（パネル（ｄ））ｈＴＲＰＶ１（ＰＤＢ ３Ｊ５Ｒ）中の化合物１４の結合モードを示す図である。
【図10】[0032]図１０は、ＩＣＲ（ＣＤ１）マウスにおけるイシリン誘導身震い行動（ｗｅｔ－ｄｏｇ ｓｈａｋｅｓ；ＷＤＳ）に対する化合物１４の影響を示すグラフであり、ここで、化合物又はビヒクルを、イシリン注射の３０分前に投与し、ガバペンチン（２５ｍｇ／ｋｇ）を、イシリン注射の１時間前に投与し、イシリン（１０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射の後に、ＷＤＳの数を３０分間計数し、データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示す（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図11】[0033]図１１は、雄性Ｃ５７マウスにおけるオキサリプラチン（ＯＸＰ）誘導冷覚異痛症に対する化合物１４の影響を示すグラフであり、ここで、マウスに、ＯＸＰ （６ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル（生理食塩水及び５％マンニトール溶液、黒線（対照））の３回のｉ．ｐ．注射を１日おきに与え、投与後７日目に、アセトン試験により冷覚異痛症を評価し、化合物注射なし（緑線）又は０．１μｇ（青線）若しくは１．０μｇ（赤線）の化合物１４の注射の冷覚異痛症の時間経過を示し、データは、平均±ＳＥＭ ｎ＝６（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）で示す。
【図12】[0034]図１２は、シロエリヒタキ（ｃｏｌｌａｒｅｄ ｆｌｙｃａｔｃｈｅｒ）（鳥類）、ヒト及びラットのＴＲＰＭ８についてのＳ１～Ｓ４ヘリックス（ＶＳＬＤ）、Ｓ５～Ｓ６ヘリックス（ポアドメイン）、ポアヘリックス（ＰＨ）及びＴＲＰヘリックスの配列アラインメントを示す図であり、ここで、ＴＲＰＭ８FA（Ｕ３ＪＤ０３、１１０３残基）、ｈＴＲＰＭ８（Ｑ７Ｚ２Ｗ７、１１０４残基）及びｒＴＲＰＭ８（Ｑ８Ｒ４５５、１１０４残基）の全長配列からのＶＳＬＤドメイン（Ｓ１～Ｓ４）、ポアドメイン（Ｓ５～Ｓ６及びポアヘリックスＰＨ）及びＴＲＰヘリックスを、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔから取得し、３つのドメインを、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａプログラムを用いてアラインメントし、ここで、類似アミノ酸をハイライトし、ＴＲＰＭ８FAは、上記の領域においてヒト及びラットのＴＲＰＭ８との相同性が高いことが示され（それぞれ８６％及び８７％の配列同一性）、アステリスクは、メントール（緑）、イシリン（黄）、電位（金）及びＣａ2+（マゼンタ）に感応性の残基を示す。
【図13】[0035]図１３は、ｈＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるイシリンについての濃度応答曲線を示すグラフであり、ここで、応答は、記載するイシリン濃度での細胞内遊離Ｃａ2+濃度の最大の変化を示すピーク蛍光（Ｆｕｒａ－２）比により報告し、各データ点は、平均±ＳＥＭとしてのピーク蛍光比を表す（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧３０細胞）。
【図14】[0036]図１４は、ＨＥＫ－２９３－ｈＴＲＰＭ８細胞における（－）メントール誘発Ｃａ2+侵入の濃度応答曲線を示すグラフであり、ここで、各データ点は、Ｆｕｒａ－２ベースのＣａ2+イメージングアッセイにおける最大Ｃａ2+侵入のパーセントとして表される同族濃度での平均応答を表し、誤差バーは、ＳＥＭを表し（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧３５細胞）、線は、Ｐｒｉｓｍ７（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｃ．）を用いて行った四パラメータロジスティック曲線適合を表す。
【図15】[0037]図１５は、ヒトＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞におけるイシリン誘発Ｃａ2+侵入に対する化合物の影響の評価を示すグラフを含み、ここで、各バーは、イシリン（５００ｎＭ）応答のものに対して標準化され、平均±ＳＥＭ（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧３５細胞）で表されるピークＦｕｒａ－２比を表し、一元配置ＡＮＯＶＡの後にＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いて、対照（イシリン）のものに対する試験化合物の有効性を比較した（＊Ｐ＜０．００１）。
【図16】[0038]図１６は、ＲＱ－００２０３０７８の濃度応答曲線を示すグラフであり、ここで、応答は、５００ｎＭのイシリン単独により引き起こしたピーク応答に対して標準化したピーク蛍光（Ｆｕｒａ－２）比により報告し、各データ点は、平均±ＳＥＭを表す（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧３０細胞）。
【図17】[0039]図１７は、化合物１４の濃度応答曲線を示すグラフであり、ここで、応答は、５００ｎＭのイシリン単独により引き起こしたピーク応答に対して標準化したピーク蛍光（Ｆｕｒａ－２）比により報告し、各データ点は、平均±ＳＥＭを表す（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧３０細胞）。
【図18A】[0040]図１８Ａは、ＨＥＫ－２９３－ｈＴＲＭ８細胞のＦｕｒａ－２ベースのＣａ２＋イメージングを用いた、（－）－メントール（１００μＭ）誘発Ｃａ2+侵入シグナルに対する化合物１４（３ｎＭ）の影響を表す典型的なトレースを示すグラフであり、ここで、各データ点は、平均±ＳＥＭを表す（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧３５細胞）。
【図18B】[0041]図１８Ｂは、ＨＥＫ－２９３－ｈＴＲＰＭ８における（－）メントール誘発Ｃａ2+侵入に対する３ｎＭの化合物１４の影響の評価を示すグラフであり、ここで、各バーは、メントール（１００μＭ）応答のものに対して標準化し、平均±ＳＥＭ（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧３５細胞）として表すピークＦｕｒａ－２比を表し、２つの群の間の平均応答は、Ｓｔｕｄｅｎｔの対応のない両側ｔ検定を用いて比較した。
【図19】[0042]図１９は、選択されたビフェニルアミドアナログの固有のｈＴＲＰＭ８活性を示すグラフであり、ここで、Ｆｕｒａ－２ベースのレシオメトリックＣａ2+イメージングを、Ｃａ2+（２ｍＭ）含有細胞外溶液を用いて行い、各データ点は、平均±ＳＥＭを表す（３日の異なる日に行った３つの独立した実験からのｎ≧２０細胞）。
【図20】[0043]図２０は、ｈＴＲＰＡ１ｍのＡＩＴＣ活性化のアゴニスト用量応答を示すグラフであり、ここで、ＥＣ50＝７．６２±０．８９μＭであり、各データ点は、平均±ＳＥＭを表し、ｎ＝５又は１０の独立した実験である。
【図21】[0044]図２１は、ＡＩＴＣ活性化（１０μＭ）ｈＴＲＰＡ１応答のルテニウムレッド遮断を示すグラフであり、ここで、ＩＣ50＝１６２±３３ｎＭであり、各データ点は、平均±ＳＥＭを表し、ｎ＝５の独立した実験である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
[0047]
ここに開示する主題の１つ以上の実施形態の詳細を、本書面に示す。本書面に記載する実施形態及びその他の実施形態に対する変更は、本書面で提供する情報を精査した後に当業者に明らかになる。本書面で提供する情報、特に記載する例示的な実施形態の具体的な詳細は、まず明確な理解のために提供され、不必要な限定はそこから理解されるべきでない。矛盾する場合は、定義を含む本書面の規定が支配する。
ここに開示する主題の１つ以上の実施形態の詳細を、本書面に示す。本書面に記載する実施形態及びその他の実施形態に対する変更は、本書面で提供する情報を精査した後に当業者に明らかになる。本書面で提供する情報、特に記載する例示的な実施形態の具体的な詳細は、まず明確な理解のために提供され、不必要な限定はそこから理解されるべきでない。矛盾する場合は、定義を含む本書面の規定が支配する。
【0025】
[0048]
本明細書で用いる用語は、当業者によく理解されると考えるが、あるいくつかの定義を、ここに開示する主題の説明を容易にするために示す。
本明細書で用いる用語は、当業者によく理解されると考えるが、あるいくつかの定義を、ここに開示する主題の説明を容易にするために示す。
【0026】
[0049]
そうでないと定義しない限り、本明細で用いる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術における当業者により通常理解されるものと同じ意味である。
そうでないと定義しない限り、本明細で用いる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術における当業者により通常理解されるものと同じ意味である。
【0027】
[0050]
本開示全体を通して言及する全ての特許、特許出願、公開された出願及び出版物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、ＵｎｉＰｒｏｔ又はＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベース、ウェブサイト並びにその他の出版物は、そうでないと記載しない限り、その全体が参照により組み込まれる。
本開示全体を通して言及する全ての特許、特許出願、公開された出願及び出版物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、ＵｎｉＰｒｏｔ又はＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベース、ウェブサイト並びにその他の出版物は、そうでないと記載しない限り、その全体が参照により組み込まれる。
【0028】
[0051]
ＵＲＬ又はその他のそのような識別子若しくはアドレスについて言及する場合、そのような識別子は、変わることができ、インターネット上の特定の情報は、変動できるが、等価な情報は、インターネット上を検索することにより見出すことができることが理解される。それについての言及は、そのような情報が入手可能であり、公に伝播していることを示す。
ＵＲＬ又はその他のそのような識別子若しくはアドレスについて言及する場合、そのような識別子は、変わることができ、インターネット上の特定の情報は、変動できるが、等価な情報は、インターネット上を検索することにより見出すことができることが理解される。それについての言及は、そのような情報が入手可能であり、公に伝播していることを示す。
【0029】
[0052]
本明細書で用いる場合、任意の保護基、アミノ酸及びその他の化合物の略語は、そうでないと記載しない限り、それらの通常の使用、認識された略語又は生化学的命名法に対するＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７２）１１（９）：１７２６～１７３２を参照されたい）に従う。
本明細書で用いる場合、任意の保護基、アミノ酸及びその他の化合物の略語は、そうでないと記載しない限り、それらの通常の使用、認識された略語又は生化学的命名法に対するＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７２）１１（９）：１７２６～１７３２を参照されたい）に従う。
【0030】
[0053]
本明細書に記載するものと類似又は等価な任意の方法、装置及び材料をここに開示する主題の実施又は試験において用いることができるが、代表的な方法、装置及び材料を本明細書に記載する。
本明細書に記載するものと類似又は等価な任意の方法、装置及び材料をここに開示する主題の実施又は試験において用いることができるが、代表的な方法、装置及び材料を本明細書に記載する。
【0031】
[0054]
本出願は、ここに開示する主題の構成成分及び本明細書に記載するその他の材料又は要素「を含む」（オープンエンド）、「からなる」（クローズドエンド）又は「から本質的になる」ことができる。本明細書で用いる場合、「含む」はオープンエンドであり、記載する要素又は構造若しくは機能におけるその等価物と、記載していない任意のその他の１つ以上の要素を意味する。用語「有する」及び「含む」も、文脈がそうでないと示唆しない限り、オープンエンドと解釈される。
本出願は、ここに開示する主題の構成成分及び本明細書に記載するその他の材料又は要素「を含む」（オープンエンド）、「からなる」（クローズドエンド）又は「から本質的になる」ことができる。本明細書で用いる場合、「含む」はオープンエンドであり、記載する要素又は構造若しくは機能におけるその等価物と、記載していない任意のその他の１つ以上の要素を意味する。用語「有する」及び「含む」も、文脈がそうでないと示唆しない限り、オープンエンドと解釈される。
【0032】
[0055]
古くからの特許法の申し合わせに従って、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特許請求の範囲を含む本出願において用いる場合「１つ以上」のことをいう。よって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」についての言及は、複数のそのような細胞を含む、などである。
古くからの特許法の申し合わせに従って、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特許請求の範囲を含む本出願において用いる場合「１つ以上」のことをいう。よって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」についての言及は、複数のそのような細胞を含む、などである。
【0033】
[0056]
そうでないと示さない限り、明細書及び特許請求の範囲で用いる材料、特性、例えば反応条件などの量を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」で修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないと示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載する数値パラメータは、ここに開示する主題が得ようとする所望の特性に依存して変動し得る近似値である。
そうでないと示さない限り、明細書及び特許請求の範囲で用いる材料、特性、例えば反応条件などの量を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」で修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないと示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載する数値パラメータは、ここに開示する主題が得ようとする所望の特性に依存して変動し得る近似値である。
【0034】
[0057]
本明細書で用いる場合、用語「約」は、質量、重量、時間、容量、濃度又はパーセンテージの価値又は量に言及する場合、特定する量の、いくつかの実施形態において±２０％、いくつかの実施形態において±１０％、いくつかの実施形態において±５％、いくつかの実施形態において±１％、いくつかの実施形態において±０．５％、いくつかの実施形態において±０．１％の変動を含むことを意味するが、これは、そのような変動が開示する方法を実施するために適切であるからである。
本明細書で用いる場合、用語「約」は、質量、重量、時間、容量、濃度又はパーセンテージの価値又は量に言及する場合、特定する量の、いくつかの実施形態において±２０％、いくつかの実施形態において±１０％、いくつかの実施形態において±５％、いくつかの実施形態において±１％、いくつかの実施形態において±０．５％、いくつかの実施形態において±０．１％の変動を含むことを意味するが、これは、そのような変動が開示する方法を実施するために適切であるからである。
【0035】
[0058]
本明細書で用いる場合、範囲は、「約」一つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までと表すことができる。本明細書にはいくつかの値が開示され、それぞれの値が、その値自体とともに「約」その特定の値としても本明細書に開示されているとも理解される。例えば、値「１０」が開示されているならば、「約１０」も開示されている。２つの特定の単位の間のそれぞれの単位も開示されていると理解される。例えば、１０及び１５が開示されているならば、１１、１２、１３及び１４も開示されている。
本明細書で用いる場合、範囲は、「約」一つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までと表すことができる。本明細書にはいくつかの値が開示され、それぞれの値が、その値自体とともに「約」その特定の値としても本明細書に開示されているとも理解される。例えば、値「１０」が開示されているならば、「約１０」も開示されている。２つの特定の単位の間のそれぞれの単位も開示されていると理解される。例えば、１０及び１５が開示されているならば、１１、１２、１３及び１４も開示されている。
【0036】
[0059]
本明細書で用いる場合、「任意の」又は「所望により」は、それに続いて記載される事象又は状況が生じるか又は生じず、その記載が、その事象又は状況が生じる場合及びそれが生じない場合を含むことを意味する。例えば、所望により変動する部分は、その部分が変動するか又は不変であることを意味する。
本明細書で用いる場合、「任意の」又は「所望により」は、それに続いて記載される事象又は状況が生じるか又は生じず、その記載が、その事象又は状況が生じる場合及びそれが生じない場合を含むことを意味する。例えば、所望により変動する部分は、その部分が変動するか又は不変であることを意味する。
【0037】
[0060]
ここに開示する主題は、少なくとも部分的に、構造的類似性及び立体配座安定性の両方を有する小分子ＴＲＰＭ８アンタゴニストの開発に基づき、これらは、鳥類のクリオＥＭ構造ＴＲＰＭ８FA（ＰＤＢ ６ＢＰＱ、約４．１Å）に基づくヒトＴＲＰＭ８ホモロジーモデルにおける分子動力学（ＭＤ）シミュレーションからのポーズにより、リガンド認識についての類似の分子決定因子を明らかにするために用いられた。これらの洞察により、いくつかの実施形態では、現在知られているＴＲＰＭ８アンタゴニスト、例えば２－ベンジルオキシ－安息香酸アミド誘導体ＡＭＴＢ並びに二官能性ＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性を有するＴＲＰＶ１ アンタゴニスト、例えばピリジルピペラジンカルボキサミドＢＣＴＣ及び尿素ＳＢ－４５２５３３（図１）よりも大きい効力を有するとして同定されたＴＲＰＭ８媒介感覚性ニューロパチーのための新規なＴＲＰＭ８化学プローブ及び治療化合物の設計が可能になった。
ここに開示する主題は、少なくとも部分的に、構造的類似性及び立体配座安定性の両方を有する小分子ＴＲＰＭ８アンタゴニストの開発に基づき、これらは、鳥類のクリオＥＭ構造ＴＲＰＭ８FA（ＰＤＢ ６ＢＰＱ、約４．１Å）に基づくヒトＴＲＰＭ８ホモロジーモデルにおける分子動力学（ＭＤ）シミュレーションからのポーズにより、リガンド認識についての類似の分子決定因子を明らかにするために用いられた。これらの洞察により、いくつかの実施形態では、現在知られているＴＲＰＭ８アンタゴニスト、例えば２－ベンジルオキシ－安息香酸アミド誘導体ＡＭＴＢ並びに二官能性ＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性を有するＴＲＰＶ１ アンタゴニスト、例えばピリジルピペラジンカルボキサミドＢＣＴＣ及び尿素ＳＢ－４５２５３３（図１）よりも大きい効力を有するとして同定されたＴＲＰＭ８媒介感覚性ニューロパチーのための新規なＴＲＰＭ８化学プローブ及び治療化合物の設計が可能になった。
【0038】
[0061]
前臨床モデルでは、トリプトファンベースのＴＲＰＭ８アンタゴニストが、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるオキサリプラチン誘導冷覚異痛症を反転させることが認識されている。この点において、高いナノモル効力及び穏やかなＴＲＰＭ８選択性を有するここに開示する化学的に新規なビフェニルアミドベースのＴＲＰＭ８アンタゴニストは、化学療法（オキサリプラチン）誘導慢性神経障害性疼痛（化学療法誘導末梢神経障害又はＣＩＰＮとも呼ばれる）を有するＣ５７／ＢＬ６マウスにおける冷覚異痛症を反転させることが見いだされた。さらに、本明細書に開示するＴＲＰＭ８アンタゴニストは、その他の疼痛状態、例えば慢性神経障害性疼痛に関連する冷覚異痛症及び機械的異痛症においても有用であり得る。従来のＴＲＰＭ８アンタゴニストであるＤＦＬ２３４４８及びＤＦＬ２３６９３は、神経障害性疼痛の慢性絞扼損傷（ＣＣＩ）誘導冷覚異痛症及び機械的異痛症モデルにおける侵害受容反応を著しく減弱させる。同様に、従来のＴＲＰＭ８アンタゴニストＰＢＭＣは、前臨床モデルにおけるＣＣＩ誘導冷覚異痛症を減少させる。これらの観察と一致して、ＴＲＰＭ８-/-マウスは、坐骨神経のＣＣＩ後の冷却誘導感応性（冷覚異痛症）の増加を示さず、同様に、ＴＲＰＭ８アンチセンスオリゴヌクレオチド（くも膜下腔内投与）を用いるＣＣＩ誘導神経損傷と同側のＬ５後根神経節（ＤＲＧ）におけるＴＲＰＭ８の下方制御は、冷痛覚過敏の減弱をもたらす。いずれの特定の理論又は機構と結び付けられることを望まないが、よって、本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストは、慢性疼痛の処置のための新規でオピオイドでない療法をもたらす可能性を有して、慢性神経障害性疼痛状態における熱的及び機械的異痛症を緩和でき（alieve）、よって、オピオイド嗜癖に対する新しい処置を提供できると考えられた。本発明のいくつかの実施形態において、ＴＲＰＭ８は、末梢及び／又はＣＮＳのレベルでの疼痛刺激に対する感覚性応答を制御する新規な疼痛薬物療法のための本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストの標的である。いくつかの実施形態において、ここに記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストは、その他の疾患、例えば炎症性疼痛における冷覚過敏症、口腔顔面痛、過活動膀胱及び疼痛性膀胱症候群、低体温の誘導又は体温の減少が有利である疾患（例えば、心停止の間、新生児脳症、脳卒中など）を含む温度調節に関与する疾患、片頭痛、前立腺癌、経口扁平上皮癌、ニコチン嗜癖行動などにおいても利用性を見出すことができる。
前臨床モデルでは、トリプトファンベースのＴＲＰＭ８アンタゴニストが、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるオキサリプラチン誘導冷覚異痛症を反転させることが認識されている。この点において、高いナノモル効力及び穏やかなＴＲＰＭ８選択性を有するここに開示する化学的に新規なビフェニルアミドベースのＴＲＰＭ８アンタゴニストは、化学療法（オキサリプラチン）誘導慢性神経障害性疼痛（化学療法誘導末梢神経障害又はＣＩＰＮとも呼ばれる）を有するＣ５７／ＢＬ６マウスにおける冷覚異痛症を反転させることが見いだされた。さらに、本明細書に開示するＴＲＰＭ８アンタゴニストは、その他の疼痛状態、例えば慢性神経障害性疼痛に関連する冷覚異痛症及び機械的異痛症においても有用であり得る。従来のＴＲＰＭ８アンタゴニストであるＤＦＬ２３４４８及びＤＦＬ２３６９３は、神経障害性疼痛の慢性絞扼損傷（ＣＣＩ）誘導冷覚異痛症及び機械的異痛症モデルにおける侵害受容反応を著しく減弱させる。同様に、従来のＴＲＰＭ８アンタゴニストＰＢＭＣは、前臨床モデルにおけるＣＣＩ誘導冷覚異痛症を減少させる。これらの観察と一致して、ＴＲＰＭ８-/-マウスは、坐骨神経のＣＣＩ後の冷却誘導感応性（冷覚異痛症）の増加を示さず、同様に、ＴＲＰＭ８アンチセンスオリゴヌクレオチド（くも膜下腔内投与）を用いるＣＣＩ誘導神経損傷と同側のＬ５後根神経節（ＤＲＧ）におけるＴＲＰＭ８の下方制御は、冷痛覚過敏の減弱をもたらす。いずれの特定の理論又は機構と結び付けられることを望まないが、よって、本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストは、慢性疼痛の処置のための新規でオピオイドでない療法をもたらす可能性を有して、慢性神経障害性疼痛状態における熱的及び機械的異痛症を緩和でき（alieve）、よって、オピオイド嗜癖に対する新しい処置を提供できると考えられた。本発明のいくつかの実施形態において、ＴＲＰＭ８は、末梢及び／又はＣＮＳのレベルでの疼痛刺激に対する感覚性応答を制御する新規な疼痛薬物療法のための本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストの標的である。いくつかの実施形態において、ここに記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストは、その他の疾患、例えば炎症性疼痛における冷覚過敏症、口腔顔面痛、過活動膀胱及び疼痛性膀胱症候群、低体温の誘導又は体温の減少が有利である疾患（例えば、心停止の間、新生児脳症、脳卒中など）を含む温度調節に関与する疾患、片頭痛、前立腺癌、経口扁平上皮癌、ニコチン嗜癖行動などにおいても利用性を見出すことができる。
【0039】
[0062]
ここに開示する主題は、よって、ＴＲＰＭ８アンタゴニスト及び関連する方法を含む。特に、ここに開示する主題のあるいくつかの実施形態は、ＴＲＰＭ８アンタゴニスト、及び疼痛の処置のためにこれらのアンタゴニストを用いる方法に関する。
ここに開示する主題は、よって、ＴＲＰＭ８アンタゴニスト及び関連する方法を含む。特に、ここに開示する主題のあるいくつかの実施形態は、ＴＲＰＭ８アンタゴニスト、及び疼痛の処置のためにこれらのアンタゴニストを用いる方法に関する。
【0040】
[0063]
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、以下の式（Ｉ）：
（式中、Ｒ1は、それぞれ炭素数４～１２であり、それぞれ炭素数１～６のアルキル基又は炭素数４～１２のシクロアルキル基により所望により置換されていてもよく、それぞれ所望により飽和又は部分的に不飽和であるシクロアルキル、ビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基から選択される）を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。以下に示すように、
は、本明細書において、様々なＲ1基についての結合点を示すために用いられる。
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、以下の式（Ｉ）：
【化9】
【化10】
【0041】
[0064]
用語「シクロアルキル」は、炭素数約３から約１２、例えば炭素数３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の非芳香族単環式環系のことを一般的に言うために用いるが、あるいくつかの実施形態において、このようなシクロアルキル基は、芳香環をさらに含む。代表的な単環式シクロアルキル環は、それらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどを含む。
用語「シクロアルキル」は、炭素数約３から約１２、例えば炭素数３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の非芳香族単環式環系のことを一般的に言うために用いるが、あるいくつかの実施形態において、このようなシクロアルキル基は、芳香環をさらに含む。代表的な単環式シクロアルキル環は、それらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどを含む。
【0042】
[0065]
いくつかの実施形態において、このようなシクロアルキル基を組み合わせて、多環式環系、例えばいくつかの実施形態において、２つの環系を含む「ビシクロアルキル」基又はその他の実施形態において３つの環系を含む「トリシクロアルキル」基を創出することもできる。いくつかの実施形態において、このようなビシクロアルキル基は、２つの環が互いに直接連結され、２つの隣り合う原子を共有する縮合ビシクロアルキル基であり得る。その他の実施形態において、ビシクロアルキル基は、２つの環が、２つの環に共有され、少なくとも１原子を含む橋により分けられている２つの橋頭原子と３つ以上の原子を共有する橋掛けビシクロアルキル基である。その他の実施形態において、ビシクロアルキル基は、２つの環が単一原子により連結されているスピロ連結ビシクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、このようなシクロアルキル基を組み合わせて、多環式環系、例えばいくつかの実施形態において、２つの環系を含む「ビシクロアルキル」基又はその他の実施形態において３つの環系を含む「トリシクロアルキル」基を創出することもできる。いくつかの実施形態において、このようなビシクロアルキル基は、２つの環が互いに直接連結され、２つの隣り合う原子を共有する縮合ビシクロアルキル基であり得る。その他の実施形態において、ビシクロアルキル基は、２つの環が、２つの環に共有され、少なくとも１原子を含む橋により分けられている２つの橋頭原子と３つ以上の原子を共有する橋掛けビシクロアルキル基である。その他の実施形態において、ビシクロアルキル基は、２つの環が単一原子により連結されているスピロ連結ビシクロアルキル基である。
【0043】
[0066]
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するシクロアルキル基は、所望により飽和又は部分的に不飽和であり得る。シクロアルキル基は、本明細書に定義するアルキル基又は別のシクロアルキル基で所望により置換され得る。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、シクロアルキル基が別の化学部分、例えばアルキル基に結合している分岐シクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するシクロアルキル基は、所望により飽和又は部分的に不飽和であり得る。シクロアルキル基は、本明細書に定義するアルキル基又は別のシクロアルキル基で所望により置換され得る。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、シクロアルキル基が別の化学部分、例えばアルキル基に結合している分岐シクロアルキル基である。
【0044】
[0067]
本明細書に記載し、ここに開示する主題のシクロアルキル、ビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基を所望により置換し得るアルキル基に関して、用語「アルキル」は、本明細書において、Ｃ１－２０（両端を含む）で線状（すなわち「直鎖」）、分岐、飽和又は少なくとも部分的、いくつかの場合において完全に不飽和の（すなわちアルケニル及びアルキニル）炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、メチルプロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル及びアレニル基のことをいうために用いる。アルキル基に関して本明細書で用いる場合、「分岐」は、典型的に低級アルキル基、例えばメチル、エチル又はプロピルが線状アルキル鎖に結合しているアルキル基のことをいう。「低級アルキル」は、炭素数１から約８（すなわちＣ１－８アルキル）、例えば炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８のアルキル基のことをいう。「高級アルキル」は、他方、炭素数約１０から約２０、例えば炭素数１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアルキル基のことをいう。あるいくつかの実施形態において、「アルキル」は、特に、Ｃ１－８直鎖アルキルのことをいう。その他の実施形態において、「アルキル」は、特に、Ｃ１－８分岐鎖アルキルのことをいう。
本明細書に記載し、ここに開示する主題のシクロアルキル、ビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基を所望により置換し得るアルキル基に関して、用語「アルキル」は、本明細書において、Ｃ１－２０（両端を含む）で線状（すなわち「直鎖」）、分岐、飽和又は少なくとも部分的、いくつかの場合において完全に不飽和の（すなわちアルケニル及びアルキニル）炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、メチルプロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル及びアレニル基のことをいうために用いる。アルキル基に関して本明細書で用いる場合、「分岐」は、典型的に低級アルキル基、例えばメチル、エチル又はプロピルが線状アルキル鎖に結合しているアルキル基のことをいう。「低級アルキル」は、炭素数１から約８（すなわちＣ１－８アルキル）、例えば炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８のアルキル基のことをいう。「高級アルキル」は、他方、炭素数約１０から約２０、例えば炭素数１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアルキル基のことをいう。あるいくつかの実施形態において、「アルキル」は、特に、Ｃ１－８直鎖アルキルのことをいう。その他の実施形態において、「アルキル」は、特に、Ｃ１－８分岐鎖アルキルのことをいう。
【0045】
[0068]
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、Ｒ1が、
及びそれらのアナログからなる群より選択される上記の式（Ｉ）の化合物が提供される。
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、Ｒ1が、
【化11】
【0046】
[0069]
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化12】
【0047】
[0070]
その他の実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるシクロアルキル基である。
その他の実施形態において、Ｒ1は、
【化13】
【0048】
[0071]
さらなる実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるスピロ連結ビシクロアルキル基である。
さらなる実施形態において、Ｒ1は、
【化14】
【0049】
[0072]
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるシクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化15】
【0050】
[0073]
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
及びそれらのアナログからなる群より選択されるビシクロアルキル又はトリシクロアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、
【化16】
【0051】
[0074]
ここに開示する主題の式（Ｉ）のまださらなる実施形態において、Ｒ1は、
からなる群より選択される。
ここに開示する主題の式（Ｉ）のまださらなる実施形態において、Ｒ1は、
【化17】
【0052】
[0075]
例えば、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１ともいう以下の式（ＩＩ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
例えば、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１ともいう以下の式（ＩＩ）：
【化18】
【0053】
[0076]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物２ともいう以下の式（ＩＩＩ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物２ともいう以下の式（ＩＩＩ）：
【化19】
【0054】
[0077]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物３ともいう以下の式（ＩＶ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物３ともいう以下の式（ＩＶ）：
【化20】
【0055】
[0078]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物４ともいう以下の式（Ｖ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物４ともいう以下の式（Ｖ）：
【化21】
【0056】
[0079]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物５ともいう以下の式（ＶＩ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物５ともいう以下の式（ＶＩ）：
【化22】
【0057】
[0080]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物６ともいう以下の式（ＶＩＩ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物６ともいう以下の式（ＶＩＩ）：
【化23】
【0058】
[0081]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物７ともいう以下の式（ＶＩＩＩ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物７ともいう以下の式（ＶＩＩＩ）：
【化24】
【0059】
[0082]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物８ともいう以下の式（ＩＸ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物８ともいう以下の式（ＩＸ）：
【化25】
【0060】
[0083]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物９ともいう以下の式（Ｘ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物９ともいう以下の式（Ｘ）：
【化26】
【0061】
[0084]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１０又は１２ともいう以下の式（ＸＩ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１０又は１２ともいう以下の式（ＸＩ）：
【化27】
【0062】
[0085]
いくつかの実施形態において、上記の式（ＸＩ）を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストは、いくつかの異性体の形で提供でき、これらに限定されないが、以下を含む：
いくつかの実施形態において、上記の式（ＸＩ）を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストは、いくつかの異性体の形で提供でき、これらに限定されないが、以下を含む：
【化28】
【0063】
[0086]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１１ともいう以下の式（ＸＩＩ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１１ともいう以下の式（ＸＩＩ）：
【化29】
【0064】
[0087]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１５ともいう以下の式（ＸＩＩＩ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１５ともいう以下の式（ＸＩＩＩ）：
【化30】
【0065】
[0088]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１３ともいう以下の式（ＸＩＶ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１３ともいう以下の式（ＸＩＶ）：
【化31】
【0066】
[0089]
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１４ともいう以下の式（ＸＶ）：
を有するＴＲＰＭ８アンタゴニストが提供される。
別の例として、いくつかの実施形態において、本明細書において化合物１４ともいう以下の式（ＸＶ）：
【化32】
【0067】
[0090]
さらに、ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストと、薬学的に許容されるビヒクル、キャリア又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。実際に、本明細書においてあるいくつかの実施形態に言及する場合に、用語「ＴＲＰＭ８アンタゴニスト」及び／又は「化合物」は、ＴＲＰＭ８アンタゴニストを含む医薬組成物に言及するために用いることもあるし、そうでないこともある。
さらに、ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストと、薬学的に許容されるビヒクル、キャリア又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。実際に、本明細書においてあるいくつかの実施形態に言及する場合に、用語「ＴＲＰＭ８アンタゴニスト」及び／又は「化合物」は、ＴＲＰＭ８アンタゴニストを含む医薬組成物に言及するために用いることもあるし、そうでないこともある。
【0068】
[0091]
用語「薬学的に許容されるキャリア」は、本明細書で用いる場合、滅菌された水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、及び使用直前の滅菌注射溶液又は分散液への再構築のための滅菌粉末のことをいう。適度な流動性は、例えば、コーティング物質、例えばレシチンの使用により分散液の場合に必要な粒子サイズを維持することにより、そして界面活性剤の使用により維持できる。これらの組成物は、補助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤も含み得る。微生物の活動は、様々な抗菌及び抗黴剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることにより確実に防止できる。等張化剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましいことがあり得る。
用語「薬学的に許容されるキャリア」は、本明細書で用いる場合、滅菌された水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、及び使用直前の滅菌注射溶液又は分散液への再構築のための滅菌粉末のことをいう。適度な流動性は、例えば、コーティング物質、例えばレシチンの使用により分散液の場合に必要な粒子サイズを維持することにより、そして界面活性剤の使用により維持できる。これらの組成物は、補助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤も含み得る。微生物の活動は、様々な抗菌及び抗黴剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることにより確実に防止できる。等張化剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましいことがあり得る。
【0069】
[0092]
注射用医薬剤形の持続吸収は、作用剤、例えば吸収を遅らせるモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらすことができる。注射用デポー剤形は、薬物のマイクロカプセルマトリクスを、生分解性高分子、例えばポリラクチド－ポリグリコリド、ポリ（オルソエステル）及びポリ（酸無水物）中に形成することにより作製される。生分解性高分子に対する化合物の割合及び用いる特定の生分解性高分子の性質に応じて、放出される化合物の速度を制御できる。デポー注射用製剤は、化合物を、体組織に適合するリポソーム又はマイクロエマルジョン中に捕捉することにより調製することもできる。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通して濾過することにより、又は使用直前に滅菌水若しくはその他の注射用滅菌媒体に溶解若しくは分散できる滅菌固形組成物の形に滅菌剤を組み込むことにより、滅菌できる。適切な不活性キャリアは、糖類、例えばラクトースを含む。
注射用医薬剤形の持続吸収は、作用剤、例えば吸収を遅らせるモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらすことができる。注射用デポー剤形は、薬物のマイクロカプセルマトリクスを、生分解性高分子、例えばポリラクチド－ポリグリコリド、ポリ（オルソエステル）及びポリ（酸無水物）中に形成することにより作製される。生分解性高分子に対する化合物の割合及び用いる特定の生分解性高分子の性質に応じて、放出される化合物の速度を制御できる。デポー注射用製剤は、化合物を、体組織に適合するリポソーム又はマイクロエマルジョン中に捕捉することにより調製することもできる。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通して濾過することにより、又は使用直前に滅菌水若しくはその他の注射用滅菌媒体に溶解若しくは分散できる滅菌固形組成物の形に滅菌剤を組み込むことにより、滅菌できる。適切な不活性キャリアは、糖類、例えばラクトースを含む。
【0070】
[0093]
適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質及び意図する受容者の体液と製剤を等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の滅菌注射用液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液をさらに含み得る。
適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質及び意図する受容者の体液と製剤を等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の滅菌注射用液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液をさらに含み得る。
【0071】
[0094]
組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形をとることもでき、処方のための剤、例えば懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤を含むことができる。代わりに、化合物は、適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で使用前に構成するための粉末の形であり得る。
組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形をとることもでき、処方のための剤、例えば懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤を含むことができる。代わりに、化合物は、適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で使用前に構成するための粉末の形であり得る。
【0072】
[0095]
製剤は、単回用量又は複数回用量容器、例えば密閉アンプル及びバイアルに入れることができ、使用直前に滅菌液体キャリアの添加のみを必要とする凍結又は凍結乾燥（freeze-dried）（凍結乾燥（lyophilized））条件で貯蔵できる。
製剤は、単回用量又は複数回用量容器、例えば密閉アンプル及びバイアルに入れることができ、使用直前に滅菌液体キャリアの添加のみを必要とする凍結又は凍結乾燥（freeze-dried）（凍結乾燥（lyophilized））条件で貯蔵できる。
【0073】
[0096]
経口投与のために、組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）、崩壊剤（例えばバレイショデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を用いる従来の技術により調製した錠剤又はカプセル剤の形をとり得る。錠剤は、当該技術において知られる方法によりコーティングされ得る。
経口投与のために、組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）、崩壊剤（例えばバレイショデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を用いる従来の技術により調製した錠剤又はカプセル剤の形をとり得る。錠剤は、当該技術において知られる方法によりコーティングされ得る。
【0074】
[0097]
経口投与のための液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤若しくは懸濁剤の形をとり得るか、又は使用前に水若しくは他の適切なビヒクルを用いる構成のための乾燥製品であり得る。このような液体製剤は薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素添加食用脂）、乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）、非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分留植物油）及び保存剤（例えば、メチル若しくはプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸）を用いる従来の技術により調製できる。調製物は、緩衝塩、香味剤、着色剤及び甘味剤を適切であれば含むこともできる。経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように適切に処方できる。頬側投与のために、組成物は、従来の様式で処方された錠剤又はロゼンジの形をとり得る。
経口投与のための液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤若しくは懸濁剤の形をとり得るか、又は使用前に水若しくは他の適切なビヒクルを用いる構成のための乾燥製品であり得る。このような液体製剤は薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素添加食用脂）、乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）、非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分留植物油）及び保存剤（例えば、メチル若しくはプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸）を用いる従来の技術により調製できる。調製物は、緩衝塩、香味剤、着色剤及び甘味剤を適切であれば含むこともできる。経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように適切に処方できる。頬側投与のために、組成物は、従来の様式で処方された錠剤又はロゼンジの形をとり得る。
【0075】
[0098]
組成物は、移植又は注射用の調製物として処方することもできる。よって、例えば、化合物は、適切な高分子又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂とともに、又はやや溶けにくい誘導体（例えばやや溶けにくい塩）として処方できる。化合物は、直腸組成物、クリーム若しくはローション剤又は経皮パッチ中に処方することもできる。
組成物は、移植又は注射用の調製物として処方することもできる。よって、例えば、化合物は、適切な高分子又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂とともに、又はやや溶けにくい誘導体（例えばやや溶けにくい塩）として処方できる。化合物は、直腸組成物、クリーム若しくはローション剤又は経皮パッチ中に処方することもできる。
【0076】
[0099]
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストを用いて疼痛を処置する方法がさらに提供される。本明細書で用いる場合、用語「処置」又は「処置する」は、それらに限定されないが、予防的処置及び治療的処置を含む興味対象の状態（例えば疼痛）のいずれの処置にも関する。よって、用語「処置」又は「処置する」は、それらに限定されないが、興味対象の状態の発生又は興味対象の状態の進展の低減、興味対象の状態の進行の阻害、興味対象の状態のさらなる進展の停止又は低減、興味対象の状態の重篤度の低減、興味対象の状態に関連する症状の改善又は軽減、及び興味対象の状態又は興味対象の状態に関連する１以上の症状の退行を引き起こすことを含む。
ここに開示する主題のいくつかの実施形態において、本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストを用いて疼痛を処置する方法がさらに提供される。本明細書で用いる場合、用語「処置」又は「処置する」は、それらに限定されないが、予防的処置及び治療的処置を含む興味対象の状態（例えば疼痛）のいずれの処置にも関する。よって、用語「処置」又は「処置する」は、それらに限定されないが、興味対象の状態の発生又は興味対象の状態の進展の低減、興味対象の状態の進行の阻害、興味対象の状態のさらなる進展の停止又は低減、興味対象の状態の重篤度の低減、興味対象の状態に関連する症状の改善又は軽減、及び興味対象の状態又は興味対象の状態に関連する１以上の症状の退行を引き起こすことを含む。
【0077】
[00100]
用語「疼痛」は、本明細書において、疾病又は損傷により引き起こされる身体的苦痛又は不快感であって、身体への実際の又は可能性のある損傷を合図で知らせるために感覚ニューロンにより対象者の脳に典型的に運ばれるものを一般的に記載するために用いられる。このような疼痛は、損傷及び疾病を含む任意の数の状況から生じ得るが、心理的状態、例えばうつ病に起因し得るか又は認識できるトリガーがないこともあり得る。疼痛は、急性疼痛及び慢性疼痛をともに含む。急性疼痛は、組織ダメージ、例えば皮膚熱傷、骨折、頭痛及び筋痙攣にの結果として生じることができ、損傷が治癒するか又は疼痛の原因（刺激）が取り除かれると通常なくなる。他方、慢性疼痛は、長期間にわたって持続又は進行し、医療処置に対してしばしば抵抗する。このような慢性疼痛は、それらに限定されないが、糖尿病、関節炎、片頭痛、線維筋痛症、がん、帯状疱疹、坐骨神経痛及び以前の外傷又は損傷を含むいくつかの異なる医療状態にしばしば起因し、環境及び／又は心理的因子に応答して悪化し得る。その他のタイプの慢性疼痛は、異痛症、痛覚過敏及び幻肢痛、並びに神経系への少なくともいくらかのダメージにより生じるか又はそれにより増悪される他のタイプの長期間持続する疼痛（すなわち神経障害性疼痛）を含む。本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストにより処置される疼痛は、慢性神経障害性疼痛である。いくつかの実施形態において、処置される疼痛は、化学療法誘導神経障害性疼痛、慢性神経障害性疼痛における冷覚異痛症、慢性神経障害性疼痛における機械的異痛症、炎症性疼痛及び神経損傷における冷覚過敏症、口腔顔面痛、冷覚誘導疼痛、片頭痛、疼痛性膀胱症候群である。
用語「疼痛」は、本明細書において、疾病又は損傷により引き起こされる身体的苦痛又は不快感であって、身体への実際の又は可能性のある損傷を合図で知らせるために感覚ニューロンにより対象者の脳に典型的に運ばれるものを一般的に記載するために用いられる。このような疼痛は、損傷及び疾病を含む任意の数の状況から生じ得るが、心理的状態、例えばうつ病に起因し得るか又は認識できるトリガーがないこともあり得る。疼痛は、急性疼痛及び慢性疼痛をともに含む。急性疼痛は、組織ダメージ、例えば皮膚熱傷、骨折、頭痛及び筋痙攣にの結果として生じることができ、損傷が治癒するか又は疼痛の原因（刺激）が取り除かれると通常なくなる。他方、慢性疼痛は、長期間にわたって持続又は進行し、医療処置に対してしばしば抵抗する。このような慢性疼痛は、それらに限定されないが、糖尿病、関節炎、片頭痛、線維筋痛症、がん、帯状疱疹、坐骨神経痛及び以前の外傷又は損傷を含むいくつかの異なる医療状態にしばしば起因し、環境及び／又は心理的因子に応答して悪化し得る。その他のタイプの慢性疼痛は、異痛症、痛覚過敏及び幻肢痛、並びに神経系への少なくともいくらかのダメージにより生じるか又はそれにより増悪される他のタイプの長期間持続する疼痛（すなわち神経障害性疼痛）を含む。本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載するＴＲＰＭ８アンタゴニストにより処置される疼痛は、慢性神経障害性疼痛である。いくつかの実施形態において、処置される疼痛は、化学療法誘導神経障害性疼痛、慢性神経障害性疼痛における冷覚異痛症、慢性神経障害性疼痛における機械的異痛症、炎症性疼痛及び神経損傷における冷覚過敏症、口腔顔面痛、冷覚誘導疼痛、片頭痛、疼痛性膀胱症候群である。
【0078】
[00101]
いくつかの実施形態において、上記のタイプの疼痛のそれぞれは、そのようなタイプの疼痛の重篤度を含めて、当業者に既知の方法により評価できる。例えば、いくつかの実施形態において、化学療法（例えばオキシプラチン（oxiplatin））誘導末梢神経障害を評価するために用いる疼痛の標準的な臨床測定は、シリンダー試験、ＦＡＣＴ／ＧＯＧ－ＮＴＸ－１３又はＦＡＣＴ／ＧＯＧ－ＮＴＸ－４（神経毒性サブスケール）及びＢＰＩ－ＳＦ平均疼痛重篤度アイテムを含む。いくつかの実施形態において、神経障害性疼痛の標準的な臨床測定は、冷覚疼痛試験、平均疼痛強度の変化の測定、特定期間中の疼痛強度スコアにおけるベースラインからの変化の測定、日平均疼痛評点の週平均におけるベースラインからの変化の測定、平均日疼痛強度スコアにおける変化の測定、バニオン切除術後の疼痛強度の低減の測定、日平均疼痛強度の測定、及び／又は数値評価スケール若しくは疼痛数値評価スケール（ＮＲＳ又はＮＰＲＳ）を用いる測定を含む。
いくつかの実施形態において、上記のタイプの疼痛のそれぞれは、そのようなタイプの疼痛の重篤度を含めて、当業者に既知の方法により評価できる。例えば、いくつかの実施形態において、化学療法（例えばオキシプラチン（oxiplatin））誘導末梢神経障害を評価するために用いる疼痛の標準的な臨床測定は、シリンダー試験、ＦＡＣＴ／ＧＯＧ－ＮＴＸ－１３又はＦＡＣＴ／ＧＯＧ－ＮＴＸ－４（神経毒性サブスケール）及びＢＰＩ－ＳＦ平均疼痛重篤度アイテムを含む。いくつかの実施形態において、神経障害性疼痛の標準的な臨床測定は、冷覚疼痛試験、平均疼痛強度の変化の測定、特定期間中の疼痛強度スコアにおけるベースラインからの変化の測定、日平均疼痛評点の週平均におけるベースラインからの変化の測定、平均日疼痛強度スコアにおける変化の測定、バニオン切除術後の疼痛強度の低減の測定、日平均疼痛強度の測定、及び／又は数値評価スケール若しくは疼痛数値評価スケール（ＮＲＳ又はＮＰＲＳ）を用いる測定を含む。
【0079】
[00102]
本明細書に記載する治療組成物（例えばＴＲＰＭ８アンタゴニスト）の投与のために、マウス動物モデルに投与した用量に基づいてヒト投与量を推定する従来の方法を、マウス投与量をヒト投与量に変換するための変換係数：１ｋｇ当たりのヒト用量＝１ｋｇあたりのマウス用量／１２（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｒｅｐ．５０：２１９～２４４）を用いて行うことができる。用量は、体表面積１平方メートル当たりのミリグラムとしても表すことができる。なぜなら、この方法は、体重よりも、ある種の代謝及び排泄機能とよい相関を達成するからである。さらに、体表面積は、成人及び小児、並びにＦｒｅｉｒｅｉｃｈら（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｒｅｐ．５０：２１９～２４４）により記載されるように、異なる動物種における薬物投与量の共通分母として用いることができる。簡単に述べると、任意の種におけるｍｇ／ｋｇ用量を等価なｍｇ／ｓｑ－ｍ用量として表すためには、用量に適切なｋｍ係数を乗じる。ヒト成人では、１００ｍｇ／ｋｇは、１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／ｓｑ－ｍ＝３７００ｍｇ／ｍ2に等しい。
本明細書に記載する治療組成物（例えばＴＲＰＭ８アンタゴニスト）の投与のために、マウス動物モデルに投与した用量に基づいてヒト投与量を推定する従来の方法を、マウス投与量をヒト投与量に変換するための変換係数：１ｋｇ当たりのヒト用量＝１ｋｇあたりのマウス用量／１２（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｒｅｐ．５０：２１９～２４４）を用いて行うことができる。用量は、体表面積１平方メートル当たりのミリグラムとしても表すことができる。なぜなら、この方法は、体重よりも、ある種の代謝及び排泄機能とよい相関を達成するからである。さらに、体表面積は、成人及び小児、並びにＦｒｅｉｒｅｉｃｈら（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｒｅｐ．５０：２１９～２４４）により記載されるように、異なる動物種における薬物投与量の共通分母として用いることができる。簡単に述べると、任意の種におけるｍｇ／ｋｇ用量を等価なｍｇ／ｓｑ－ｍ用量として表すためには、用量に適切なｋｍ係数を乗じる。ヒト成人では、１００ｍｇ／ｋｇは、１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／ｓｑ－ｍ＝３７００ｍｇ／ｍ2に等しい。
【0080】
[00103]
ここに開示する主題の方法に従って治療組成物を投与するための適切な方法は、それらに限定されないが、全身投与、非経口投与（血管内、筋内及び／又は動脈内投与を含む）、経口送達、頬側送達、直腸送達、皮下投与、腹腔内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、吸入、気管内据え付け、外科的移植、経皮送達、局所注射、鼻内送達及び超高速注射／衝撃を含む。適切であれば、連続注入は、標的部位での薬物蓄積を増進できる（例えば米国特許第６，１８０，０８２号を参照されたい）。
ここに開示する主題の方法に従って治療組成物を投与するための適切な方法は、それらに限定されないが、全身投与、非経口投与（血管内、筋内及び／又は動脈内投与を含む）、経口送達、頬側送達、直腸送達、皮下投与、腹腔内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、吸入、気管内据え付け、外科的移植、経皮送達、局所注射、鼻内送達及び超高速注射／衝撃を含む。適切であれば、連続注入は、標的部位での薬物蓄積を増進できる（例えば米国特許第６，１８０，０８２号を参照されたい）。
【0081】
[00104]
投与経路にかかわらず、ここに開示する主題の組成物は、所望の応答を達成するために有効な量で典型的に投与される。よって、用語「有効量」は、本明細書において、測定可能な生物学的応答（例えば疼痛の減少）を生じるのに十分な治療組成物（例えばＴＲＰＭ８アンタゴニスト及び薬学的に許容されるビヒクル、キャリア又は賦形剤）の量のことをいうために用いる。ここに開示する主題の治療組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象及び／又は施与について所望の治療応答を達成するために有効な活性化合物の量を投与するように変動し得る。もちろん、任意の特定の場合における有効量は、治療組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物又は処置との組み合わせ、処置される状態の重篤度、並びに処置される対象の身体状態及び以前の医療履歴を含む様々な要因に依存する。好ましくは、最少用量を投与し、用量制限毒性の非存在下での最低有効量まで用量を漸増させる。治療有効量の決定及び調節、並びにいつそしてどのようにそのような調節を行うかの評価は、当業者に知られている。
投与経路にかかわらず、ここに開示する主題の組成物は、所望の応答を達成するために有効な量で典型的に投与される。よって、用語「有効量」は、本明細書において、測定可能な生物学的応答（例えば疼痛の減少）を生じるのに十分な治療組成物（例えばＴＲＰＭ８アンタゴニスト及び薬学的に許容されるビヒクル、キャリア又は賦形剤）の量のことをいうために用いる。ここに開示する主題の治療組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象及び／又は施与について所望の治療応答を達成するために有効な活性化合物の量を投与するように変動し得る。もちろん、任意の特定の場合における有効量は、治療組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物又は処置との組み合わせ、処置される状態の重篤度、並びに処置される対象の身体状態及び以前の医療履歴を含む様々な要因に依存する。好ましくは、最少用量を投与し、用量制限毒性の非存在下での最低有効量まで用量を漸増させる。治療有効量の決定及び調節、並びにいつそしてどのようにそのような調節を行うかの評価は、当業者に知られている。
【0082】
[00105]
製剤及び用量についてのさらなる手引きについては、米国特許第５，３２６，９０２号、５，２３４，９３３号、国際特許出願公開第ＷＯ９３／２５５２１号、Ｂｅｒｋｏｗら、（１９９７）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、家庭版、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；Ｇｏｏｄｍａｎら、（１９９６）Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ'ｓ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｅｂａｄｉ、（１９９８）ＣＲＣ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｋａｔｚｕｎｇ、（２００１）Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第８版、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ／ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎら、（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；及びＳｐｅｉｇｈｔら、（１９９７）Ａｖｅｒｙ'ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｃｈｏｉｃｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、第４版、Ａｄｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｕｃｋｌａｎｄ／Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；Ｄｕｃｈら、（１９９８）Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ．１００～１０１：２５５～２６３を参照されたい。
製剤及び用量についてのさらなる手引きについては、米国特許第５，３２６，９０２号、５，２３４，９３３号、国際特許出願公開第ＷＯ９３／２５５２１号、Ｂｅｒｋｏｗら、（１９９７）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、家庭版、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；Ｇｏｏｄｍａｎら、（１９９６）Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ'ｓ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｅｂａｄｉ、（１９９８）ＣＲＣ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｋａｔｚｕｎｇ、（２００１）Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第８版、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ／ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎら、（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；及びＳｐｅｉｇｈｔら、（１９９７）Ａｖｅｒｙ'ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｃｈｏｉｃｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、第４版、Ａｄｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｕｃｋｌａｎｄ／Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；Ｄｕｃｈら、（１９９８）Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ．１００～１０１：２５５～２６３を参照されたい。
【0083】
[00106]
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、ヒト及び動物対象を共に含む。よって、獣医学的な治療的使用が、ここに開示する主題により提供される。よって、ここに開示する主題は、哺乳動物、例えばヒト、並びに危険にさらされているために重要な哺乳動物、例えばシベリアトラ；経済的に重要なもの、例えばヒトによる消費のために飼育されている動物；及び／又はヒトに対して社会的に重要な動物、例えばペットとして又は動物園で保有される動物の処置を提供する。このような動物の例は、それらに限定されないが、肉食動物、例えばネコ及びイヌ；ブタ類、例えばブタ（pig）、雄豚（hog）及びイノシシ；反芻動物及び／又は有蹄動物、例えばウシ（cattle）、雄ウシ（oxen）、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダ；並びにウマを含む。危険にさらされている、かつ／又は動物園で保有されている種類の鳥類、並びに家禽（fowl）、より具体的には家禽（domestic fowl）、すなわち家禽（poultry）、例えば七面鳥、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなど（これらは、ヒトにとって経済的に重要であるので）の処置を含む、鳥類の処置も提供される。よって、それらに限定されないが、家畜のブタ類、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競技用ウマを含む）、家禽（poultry）などを含む家畜の処置も提供される。
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、ヒト及び動物対象を共に含む。よって、獣医学的な治療的使用が、ここに開示する主題により提供される。よって、ここに開示する主題は、哺乳動物、例えばヒト、並びに危険にさらされているために重要な哺乳動物、例えばシベリアトラ；経済的に重要なもの、例えばヒトによる消費のために飼育されている動物；及び／又はヒトに対して社会的に重要な動物、例えばペットとして又は動物園で保有される動物の処置を提供する。このような動物の例は、それらに限定されないが、肉食動物、例えばネコ及びイヌ；ブタ類、例えばブタ（pig）、雄豚（hog）及びイノシシ；反芻動物及び／又は有蹄動物、例えばウシ（cattle）、雄ウシ（oxen）、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダ；並びにウマを含む。危険にさらされている、かつ／又は動物園で保有されている種類の鳥類、並びに家禽（fowl）、より具体的には家禽（domestic fowl）、すなわち家禽（poultry）、例えば七面鳥、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなど（これらは、ヒトにとって経済的に重要であるので）の処置を含む、鳥類の処置も提供される。よって、それらに限定されないが、家畜のブタ類、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競技用ウマを含む）、家禽（poultry）などを含む家畜の処置も提供される。
【0084】
[00107]
ここに開示する主題を、以下の具体的であるが非限定的な実施例によりさらに説明する。
ここに開示する主題を、以下の具体的であるが非限定的な実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【0085】
[00108]
材料及び方法
[00109]
分子モデリング
[00110]
ｈＴＲＰＭ８のホモロジーモデリング。ヒトＴＲＰＭ８モデルは、シロエリヒタキ（Ｆｉｃｅｄｕｌａ ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）のクリオＥＭ構造（ＴＲＰＭ８FA、ＰＤＢ：６ＢＰＱ、分解率：約４．１Å）に基づいて構築し、ｈＴＲＰＭ８は、ＴＲＰＭ８FAと８３％の配列同一性を有する。クリオＥＭ構造は、プロテインデータバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）からダウンロードした。ＳＹＢＹＬ－Ｘ１．３を用いて全ての残基を修復し、エネルギーを最小限にした。ｈＴＲＰＭ８の全長配列（Ｑ７Ｚ２Ｗ７、１１０４残基）は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔから得た。配列アラインメント及びホモロジーモデリングは、以前に報告されたプロトコールを用いた。
材料及び方法
[00109]
分子モデリング
[00110]
ｈＴＲＰＭ８のホモロジーモデリング。ヒトＴＲＰＭ８モデルは、シロエリヒタキ（Ｆｉｃｅｄｕｌａ ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）のクリオＥＭ構造（ＴＲＰＭ８FA、ＰＤＢ：６ＢＰＱ、分解率：約４．１Å）に基づいて構築し、ｈＴＲＰＭ８は、ＴＲＰＭ８FAと８３％の配列同一性を有する。クリオＥＭ構造は、プロテインデータバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）からダウンロードした。ＳＹＢＹＬ－Ｘ１．３を用いて全ての残基を修復し、エネルギーを最小限にした。ｈＴＲＰＭ８の全長配列（Ｑ７Ｚ２Ｗ７、１１０４残基）は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔから得た。配列アラインメント及びホモロジーモデリングは、以前に報告されたプロトコールを用いた。
【0086】
[00111]
Ｍｏｄｅｌｌｅｒ９．１８を用いて、ｈＴＲＰＭ８モデルを構築した。３Ｄモデルが一旦作製されると、ＳＹＢＹＬ－Ｘ１．３を用いて、エネルギーを最小にした。簡単に述べると、ＳＹＢＹＬにおいて定義されたパラメータは、以下の通りであった：グラジエントは０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌに設定し、最大反復は５０００に設定し、力場はＭＭＦＦ９４ｓに設定し、電荷はＭＭＦＦ９４に設定した。これらの全ての設定は、以前に記載されたものと同じであった。次いで、ｐｒｏＳＡ－ｗｅｂ Ｚ－スコア及びＰＲＯＣＨＥＣＫ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットを用いて、３Ｄモデル全体の質を確認した。
Ｍｏｄｅｌｌｅｒ９．１８を用いて、ｈＴＲＰＭ８モデルを構築した。３Ｄモデルが一旦作製されると、ＳＹＢＹＬ－Ｘ１．３を用いて、エネルギーを最小にした。簡単に述べると、ＳＹＢＹＬにおいて定義されたパラメータは、以下の通りであった：グラジエントは０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌに設定し、最大反復は５０００に設定し、力場はＭＭＦＦ９４ｓに設定し、電荷はＭＭＦＦ９４に設定した。これらの全ての設定は、以前に記載されたものと同じであった。次いで、ｐｒｏＳＡ－ｗｅｂ Ｚ－スコア及びＰＲＯＣＨＥＣＫ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットを用いて、３Ｄモデル全体の質を確認した。
【0087】
[00112]
ｈＴＲＰＭ８のリガンドへの分子ドッキング。ＳＹＢＹＬ－Ｘ１．３において実行されるドッキングプログラムＳｕｒｆｌｅｘ－Ｄｏｃｋ ＧｅｏｍＸ（ＳＦＸＣ）を用いて、ＴＲＰＭ８－リガンド複合体を構築したが、ここで、全体スコアは、－ｌｏｇ10（Ｋd）で表した。次いで、ＳＹＢＹＬ－Ｘ１．３においてＭＯＬＣＡＤモジュールを当てはめて、ｈＴＲＰＭ８の可能性のある結合ポケットを探索し、これは、以下の残基を含んだ：Ｐｈｅ７３８（Ｓ１）、Ｔｙｒ７４５（Ｓ１）、Ｇｌｕ７８２（Ｓ２）、Ｇｌｕ７８５（Ｓ２）、Ｔｒｐ７９８（Ｓ３）、Ａｓｎ７９９（Ｓ３）、Ａｓｐ８０２（Ｓ３）、Ａｌａ８０５（Ｓ３）、Ａｒｇ８４２（Ｓ４）、Ｈｉｓ８４５（Ｓ４）、Ｉｌｅ８４６（Ｓ４）、Ｖａｌ８４９（Ｓ４）、Ｇｌｕ１００４（ＴＲＰヘリックス）、Ｔｙｒ１００５（ＴＲＰヘリックス）、Ａｒｇ１００８（ＴＲＰヘリックス）及びＬｅｕ１００９（ＴＲＰヘリックス）。全てのパラメータ及び分子ドッキングのプロトコールは、以前の報告で見出すことができる。
ｈＴＲＰＭ８のリガンドへの分子ドッキング。ＳＹＢＹＬ－Ｘ１．３において実行されるドッキングプログラムＳｕｒｆｌｅｘ－Ｄｏｃｋ ＧｅｏｍＸ（ＳＦＸＣ）を用いて、ＴＲＰＭ８－リガンド複合体を構築したが、ここで、全体スコアは、－ｌｏｇ10（Ｋd）で表した。次いで、ＳＹＢＹＬ－Ｘ１．３においてＭＯＬＣＡＤモジュールを当てはめて、ｈＴＲＰＭ８の可能性のある結合ポケットを探索し、これは、以下の残基を含んだ：Ｐｈｅ７３８（Ｓ１）、Ｔｙｒ７４５（Ｓ１）、Ｇｌｕ７８２（Ｓ２）、Ｇｌｕ７８５（Ｓ２）、Ｔｒｐ７９８（Ｓ３）、Ａｓｎ７９９（Ｓ３）、Ａｓｐ８０２（Ｓ３）、Ａｌａ８０５（Ｓ３）、Ａｒｇ８４２（Ｓ４）、Ｈｉｓ８４５（Ｓ４）、Ｉｌｅ８４６（Ｓ４）、Ｖａｌ８４９（Ｓ４）、Ｇｌｕ１００４（ＴＲＰヘリックス）、Ｔｙｒ１００５（ＴＲＰヘリックス）、Ａｒｇ１００８（ＴＲＰヘリックス）及びＬｅｕ１００９（ＴＲＰヘリックス）。全てのパラメータ及び分子ドッキングのプロトコールは、以前の報告で見出すことができる。
【0088】
[00113]
分子動力学（ＭＤ）シミュレーション。ＭＤシミュレーションを加速させるために、ｈＴＲＰＭ８の膜貫通ドメイン（Ｇｌｎ６７１からＡｓｎ１０１０までの残基）を選択して、異なるリガンドとのＴＲＰＭ８のシミュレーションを行った。ＴＲＰＭ８受容器の各単量体を１つのリガンドと複合体形成させたので、各シミュレーションについて４つの（同じ）リガンドがあった。次いで、系を、５１４ １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）脂質、５１４７０ 水分子及び１５６ Ｃｌ-及び１４０ Ｎａ+イオンを含む０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液中に溶媒和化した。ＴＲＰＭ８とリガンドの初期の立体配座は、分子ドッキング研究から得た。初期シミュレーションボックスのサイズは、約１５１Å＊１５１Å＊１１９Åに設定した。ＡＭＢＥＲ ｆｆ１４ＳＢ力場をＴＲＰＭ８に印加し、ＡＭＢＥＲ Ｌｉｐｉｄ１４力場を脂質に印加した。水分子は、ＴＩＰ３Ｐ水モデルを用いて処理した。
分子動力学（ＭＤ）シミュレーション。ＭＤシミュレーションを加速させるために、ｈＴＲＰＭ８の膜貫通ドメイン（Ｇｌｎ６７１からＡｓｎ１０１０までの残基）を選択して、異なるリガンドとのＴＲＰＭ８のシミュレーションを行った。ＴＲＰＭ８受容器の各単量体を１つのリガンドと複合体形成させたので、各シミュレーションについて４つの（同じ）リガンドがあった。次いで、系を、５１４ １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）脂質、５１４７０ 水分子及び１５６ Ｃｌ-及び１４０ Ｎａ+イオンを含む０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液中に溶媒和化した。ＴＲＰＭ８とリガンドの初期の立体配座は、分子ドッキング研究から得た。初期シミュレーションボックスのサイズは、約１５１Å＊１５１Å＊１１９Åに設定した。ＡＭＢＥＲ ｆｆ１４ＳＢ力場をＴＲＰＭ８に印加し、ＡＭＢＥＲ Ｌｉｐｉｄ１４力場を脂質に印加した。水分子は、ＴＩＰ３Ｐ水モデルを用いて処理した。
【0089】
[00114]
全てのＭＤシミュレーションを、次いで、ＡＭＢＥＲ１６パッケージ中のＰＭＥＭＤ．ｍｐｉ及びＰＭＥＭＤ．ｃｕｄａモジュールを用いて行った。立体衝突の可能性を避けるために、各系について数回の最小化工程を行った。次いで、各系を、加熱段階において０Ｋから３００Ｋまで徐々に加熱した後に、２ｆｓの時間工程の平衡化及び生成段階（３００Ｋ）を行った。周期的境界条件を採用して、一定温度及び圧力（ＮＰＴ）の調和を維持した。圧力は１ａｔｍに設定し、１ｐｓの圧力緩和時間で異方性（ｘ-、ｙ-、ｚ-）圧力スケーリングプロトコールにより制御した。温度は、２ｐｓ-1の衝突頻度でのＬａｎｇｅｖｉｎ動力学により拘束したままにした。長距離静電学は、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｓｈ Ｅｗａｌｄ（ＰＭＥ）法により扱い、リアルスペース相互作用のカットオフ値は、１０Åに設定した。水素原子が関与する全ての共有結合は、ＳＨＡＫＥアルゴリズムにより拘束した。各系は、１００ｎｓ ＭＤシミュレーションで行い、それぞれのシミュレートした系の軌道は、１００ｐｓごとに保存した。
全てのＭＤシミュレーションを、次いで、ＡＭＢＥＲ１６パッケージ中のＰＭＥＭＤ．ｍｐｉ及びＰＭＥＭＤ．ｃｕｄａモジュールを用いて行った。立体衝突の可能性を避けるために、各系について数回の最小化工程を行った。次いで、各系を、加熱段階において０Ｋから３００Ｋまで徐々に加熱した後に、２ｆｓの時間工程の平衡化及び生成段階（３００Ｋ）を行った。周期的境界条件を採用して、一定温度及び圧力（ＮＰＴ）の調和を維持した。圧力は１ａｔｍに設定し、１ｐｓの圧力緩和時間で異方性（ｘ-、ｙ-、ｚ-）圧力スケーリングプロトコールにより制御した。温度は、２ｐｓ-1の衝突頻度でのＬａｎｇｅｖｉｎ動力学により拘束したままにした。長距離静電学は、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｓｈ Ｅｗａｌｄ（ＰＭＥ）法により扱い、リアルスペース相互作用のカットオフ値は、１０Åに設定した。水素原子が関与する全ての共有結合は、ＳＨＡＫＥアルゴリズムにより拘束した。各系は、１００ｎｓ ＭＤシミュレーションで行い、それぞれのシミュレートした系の軌道は、１００ｐｓごとに保存した。
【0090】
[00115]
分子力学/一般化Ｂｏｒｎ表面領域（molecular mechanics/generalized born surface area；ＭＭ／ＧＢＳＡ）計算。各ＭＤシミュレーションの保存した軌道について、ＭＭ／ＧＢＳＡ法を当てはめて、異なるリガンドの処理の元でのＴＲＰＭ８の結合エネルギーを計算した。平均結合エネルギーを計算するために、５０のスナップショットを各軌道から２００ｐｓごとに９０から１００ｎｓまで、以下の式を用いて抽出した：
ΔＥbind＝ΔＥMM＋ΔＥSOL＝ΔＥMM＋ΔＥGB＋ΔＥSA
ここで、ΔＥbindは、結合エネルギーであり、ΔＥMMは、真空中での分子力学的エネルギーの総計を表し、静電、ファンデルワールス力及び内部エネルギーからの寄与にさらに分割できる。この項は、分子力学的方法によりコンピュータで計算できる。ΔＥSOLは、一般化Ｂｏｒｎ（ＧＢ）近似モデルを用いて計算される極性溶媒和エネルギー（ΔＥGB）と、溶媒露出表面領域（ＳＡＳＡ）をペアワイズオーバーラップの一次結合（linear combinations of pairwise overlaps；ＬＣＰＯ）モデルを用いて適合させることにより得られる非極性部分（ΔＥSA）とを含む溶媒和エネルギーである。さらに、各残基のエネルギーを、主鎖及び側鎖原子に分解した。エネルギー分解により、生物活性に対するカギとなる残基の寄与を分析することができた。
分子力学/一般化Ｂｏｒｎ表面領域（molecular mechanics/generalized born surface area；ＭＭ／ＧＢＳＡ）計算。各ＭＤシミュレーションの保存した軌道について、ＭＭ／ＧＢＳＡ法を当てはめて、異なるリガンドの処理の元でのＴＲＰＭ８の結合エネルギーを計算した。平均結合エネルギーを計算するために、５０のスナップショットを各軌道から２００ｐｓごとに９０から１００ｎｓまで、以下の式を用いて抽出した：
ΔＥbind＝ΔＥMM＋ΔＥSOL＝ΔＥMM＋ΔＥGB＋ΔＥSA
ここで、ΔＥbindは、結合エネルギーであり、ΔＥMMは、真空中での分子力学的エネルギーの総計を表し、静電、ファンデルワールス力及び内部エネルギーからの寄与にさらに分割できる。この項は、分子力学的方法によりコンピュータで計算できる。ΔＥSOLは、一般化Ｂｏｒｎ（ＧＢ）近似モデルを用いて計算される極性溶媒和エネルギー（ΔＥGB）と、溶媒露出表面領域（ＳＡＳＡ）をペアワイズオーバーラップの一次結合（linear combinations of pairwise overlaps；ＬＣＰＯ）モデルを用いて適合させることにより得られる非極性部分（ΔＥSA）とを含む溶媒和エネルギーである。さらに、各残基のエネルギーを、主鎖及び側鎖原子に分解した。エネルギー分解により、生物活性に対するカギとなる残基の寄与を分析することができた。
【0091】
[00116]
化学。薄層クロマトグラフィーを、ＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲルＧＦ２５０ミクロンＴＬＣプレートで行った。プレートを、２５４ｎＭ ＵＶ光とヨウ素での染色により視覚化した。フラッシュクロマトグラフィーを、Ｆ６０シリカゲル、２３０～４００メッシュ、６０Å（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ（登録商標）ＳｉｌｉａＦｌａｓｈ（登録商標））で行った。自動化フラッシュクロマトグラフィーを、多変動波長（２００～４００ｎｍ）検出器（モデルＩＳＯ－ＰＳＶ）を有するＢｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ Ｐｒｉｍｅ自動化フラッシュ精製システムで、Ｂｉｏｔａｇｅ ＨＰ－Ｓｐｈｅｒｅ（商標）２５ミクロン球状シリカを充填したＢｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａカートリッジ（１０ｇ又は２５ｇ）を用いて、溶媒Ａ（ジクロロメタン）／溶媒Ｂ（ジエチルエーテル）の二元勾配（２について：９９／１→９４／６、化合物４について：１００／０→９６：４、化合物５、６、９、１０、１２、１４及び１５について：１００／０→９８／２、化合物７について：９６／４→９４／６；化合物１３について：１００／０→９４／６）を用いて、１２又は２５ｍＬ／分の流速で行った。溶出ピークは、２５４及び２８０ｎｍにてモニタリングした。ＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｔ ４００ＭＨｚ ＮＭＲで、ＣＤＣｌ3を用いて記録した。質量分析スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ及び６４９０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＬＣ／ＭＳで、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モードを用いて得た。化合物２及びその異性体（２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）並びに化合物１０及び１２のＬＣ－ＵＶ－ＭＳは、Ａｃｃｅｌａ １２５０ポンプ、オープンオートサンプラー及びＰＤＡ検出器を含み、その後にＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に連結したＡｃｃｅｌａ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。クロマトグラフィー分離は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ Ｃ１８カラム（１．８μｍ粒子及び２．１ｍｍ×１００ｍｍの寸法で、２．１ｍｍ×５ｍｍのガードカラムを有する）で、Ａ：ＬＣ－ＭＳグレード水中の０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）及びＢ：アセトニトリル中の０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）からなる移動相、並びに２つの異なる溶出法を用いて行った。化合物２及びその異性体（２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）について勾配溶出法を用いたが、これは、８分間での０％Ｂから９５％Ｂまでの後に、合計２０分間でのカラム洗浄及び平衡化時間からなった。定組成溶出法は、化合物１０及び１２について用い、これは、２０分間一定に保った５８％Ｂであった。両方のクロマトグラフィー法について、流速は、３００μｌ／分であり、５μｌの試料を注入した。ＵＶ検出は、２００から６００ｎｍの範囲にわたってＰＤＡ検出器を用いて達成し、特定のチャネル波長をモニタリングした（２８０ｎｍ、２５４ｎｍ及び２１４ｎｍ）。質量分析計パラメータは、３．７ｋＶエレクトロスプレー電圧でのフルＭＳモード、７０，０００の解像度設定、ＡＧＣターゲット１ｅ６、最大ＩＴ １００ｍｓ及び走査範囲ｍ／ｚ １５０～１０００で走査するポジティブイオンモードでのエレクトロスプレーイオン化からなった。データプロセシングは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒバージョン４．１．３１．９でＱｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて行った。元素分析は、Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡが行った。全ての最終化合物の純度は、９９．６％を超えていた。
化学。薄層クロマトグラフィーを、ＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲルＧＦ２５０ミクロンＴＬＣプレートで行った。プレートを、２５４ｎＭ ＵＶ光とヨウ素での染色により視覚化した。フラッシュクロマトグラフィーを、Ｆ６０シリカゲル、２３０～４００メッシュ、６０Å（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ（登録商標）ＳｉｌｉａＦｌａｓｈ（登録商標））で行った。自動化フラッシュクロマトグラフィーを、多変動波長（２００～４００ｎｍ）検出器（モデルＩＳＯ－ＰＳＶ）を有するＢｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ Ｐｒｉｍｅ自動化フラッシュ精製システムで、Ｂｉｏｔａｇｅ ＨＰ－Ｓｐｈｅｒｅ（商標）２５ミクロン球状シリカを充填したＢｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａカートリッジ（１０ｇ又は２５ｇ）を用いて、溶媒Ａ（ジクロロメタン）／溶媒Ｂ（ジエチルエーテル）の二元勾配（２について：９９／１→９４／６、化合物４について：１００／０→９６：４、化合物５、６、９、１０、１２、１４及び１５について：１００／０→９８／２、化合物７について：９６／４→９４／６；化合物１３について：１００／０→９４／６）を用いて、１２又は２５ｍＬ／分の流速で行った。溶出ピークは、２５４及び２８０ｎｍにてモニタリングした。ＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｔ ４００ＭＨｚ ＮＭＲで、ＣＤＣｌ3を用いて記録した。質量分析スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ及び６４９０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＬＣ／ＭＳで、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モードを用いて得た。化合物２及びその異性体（２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）並びに化合物１０及び１２のＬＣ－ＵＶ－ＭＳは、Ａｃｃｅｌａ １２５０ポンプ、オープンオートサンプラー及びＰＤＡ検出器を含み、その後にＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に連結したＡｃｃｅｌａ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。クロマトグラフィー分離は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ Ｃ１８カラム（１．８μｍ粒子及び２．１ｍｍ×１００ｍｍの寸法で、２．１ｍｍ×５ｍｍのガードカラムを有する）で、Ａ：ＬＣ－ＭＳグレード水中の０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）及びＢ：アセトニトリル中の０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）からなる移動相、並びに２つの異なる溶出法を用いて行った。化合物２及びその異性体（２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）について勾配溶出法を用いたが、これは、８分間での０％Ｂから９５％Ｂまでの後に、合計２０分間でのカラム洗浄及び平衡化時間からなった。定組成溶出法は、化合物１０及び１２について用い、これは、２０分間一定に保った５８％Ｂであった。両方のクロマトグラフィー法について、流速は、３００μｌ／分であり、５μｌの試料を注入した。ＵＶ検出は、２００から６００ｎｍの範囲にわたってＰＤＡ検出器を用いて達成し、特定のチャネル波長をモニタリングした（２８０ｎｍ、２５４ｎｍ及び２１４ｎｍ）。質量分析計パラメータは、３．７ｋＶエレクトロスプレー電圧でのフルＭＳモード、７０，０００の解像度設定、ＡＧＣターゲット１ｅ６、最大ＩＴ １００ｍｓ及び走査範囲ｍ／ｚ １５０～１０００で走査するポジティブイオンモードでのエレクトロスプレーイオン化からなった。データプロセシングは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒバージョン４．１．３１．９でＱｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて行った。元素分析は、Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡが行った。全ての最終化合物の純度は、９９．６％を超えていた。
【0092】
[00117]
一般的なアミド化手順。ＴＨＦ中の［１，１’－ビフェニル］－４－カルボン酸（１．００～１．５当量）（０．１Ｍ）の溶液に、撹拌しながら、ＥＤＣＩ（１．０４～１．５６当量）、ＨＯＢｔ（１．０４～１．５６当量）及びＥｔ3Ｎ（１．２～３．３当量）を加え、反応物を室温にて1時間撹拌した。この混合物に、ＴＨＦ中の置換アミン（１．０～１．２当量）の溶液を加え、反応物を４０℃にて２～３時間又は室温にて１～３日間撹拌した。反応物を、ＥｔＯＡｃ及びＨ2Ｏで希釈した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ（ａｑ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過して濃縮した。
一般的なアミド化手順。ＴＨＦ中の［１，１’－ビフェニル］－４－カルボン酸（１．００～１．５当量）（０．１Ｍ）の溶液に、撹拌しながら、ＥＤＣＩ（１．０４～１．５６当量）、ＨＯＢｔ（１．０４～１．５６当量）及びＥｔ3Ｎ（１．２～３．３当量）を加え、反応物を室温にて1時間撹拌した。この混合物に、ＴＨＦ中の置換アミン（１．０～１．２当量）の溶液を加え、反応物を４０℃にて２～３時間又は室温にて１～３日間撹拌した。反応物を、ＥｔＯＡｃ及びＨ2Ｏで希釈した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ（ａｑ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過して濃縮した。
【0093】
[00118]
Ｎ－（２－イソプロピル－５－メチルシクロヘキシル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物２、ＬＣＭＳにより３０：２１：４９の比率で存在する３種の異性体の混合物）。５－メチル－２－（プロパン－２－イル）シクロヘキサン－１－アミン（６２ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗製残渣を、ヘキサン／ジエチルエーテル／ＮＨ4ＯＨ（１００／０／０→９５／５／０．５）を用いるフラッシュクロマトグラフィーと、その後の自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、８３ｍｇの標題物質を６２％の収率で得た。1H NMR (混合物) (400 MHz, CDCl3) δ 7.87-7.78 (m, 6H), 7.69-7.63 (m, 7H), 7.63-7.58 (m, 6H), 7.51-7.35 (m, 8H), 6.22 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.16 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.63 4.55 (m, 2H), 4.39 (tt, J = 7.8, 3.9 Hz, 1H), 4.03 (qd, J = 10.9, 3.9 Hz, 1H), 2.15-2.07 (m, 1H), 2.06-1.91 (m, 4H), 1.90-1.60 (m, 4H), 1.56-1.23 (m, 3H), 1.22-1.11 (m, 6H), 1.09-0.82 (m, 27H). MS (ESI) (混合物) m/z 336.30 (M+H)+. LCMS (混合物), RT (ピーク1) = 8.76 min, m/z (M+H)+ = 336.2; LCMS RT (ピーク2) = 8.84 min, m/z (M+H)+ = 336.2; LCMS RT (ピーク3) = 9.05 min, m/z (M+H)+ = 336.2. C23H29NO (混合物)についての分析計算値: C, 82.34; H, 8.71; N, 4.18; 実測値: C, 82.07; H, 8.58; N, 4.29.
Ｎ－（２－イソプロピル－５－メチルシクロヘキシル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物２、ＬＣＭＳにより３０：２１：４９の比率で存在する３種の異性体の混合物）。５－メチル－２－（プロパン－２－イル）シクロヘキサン－１－アミン（６２ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗製残渣を、ヘキサン／ジエチルエーテル／ＮＨ4ＯＨ（１００／０／０→９５／５／０．５）を用いるフラッシュクロマトグラフィーと、その後の自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、８３ｍｇの標題物質を６２％の収率で得た。1H NMR (混合物) (400 MHz, CDCl3) δ 7.87-7.78 (m, 6H), 7.69-7.63 (m, 7H), 7.63-7.58 (m, 6H), 7.51-7.35 (m, 8H), 6.22 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.16 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.63 4.55 (m, 2H), 4.39 (tt, J = 7.8, 3.9 Hz, 1H), 4.03 (qd, J = 10.9, 3.9 Hz, 1H), 2.15-2.07 (m, 1H), 2.06-1.91 (m, 4H), 1.90-1.60 (m, 4H), 1.56-1.23 (m, 3H), 1.22-1.11 (m, 6H), 1.09-0.82 (m, 27H). MS (ESI) (混合物) m/z 336.30 (M+H)+. LCMS (混合物), RT (ピーク1) = 8.76 min, m/z (M+H)+ = 336.2; LCMS RT (ピーク2) = 8.84 min, m/z (M+H)+ = 336.2; LCMS RT (ピーク3) = 9.05 min, m/z (M+H)+ = 336.2. C23H29NO (混合物)についての分析計算値: C, 82.34; H, 8.71; N, 4.18; 実測値: C, 82.07; H, 8.58; N, 4.29.
【0094】
[00119]
化合物２（５０ｍｇ）の異性体分離は、分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（２０００ミクロン、２０×２０ｃｍ、Ａｎａｌｔｅｃｈ）により、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＮＨ4ＯＨ（７９．６：２０．０：０．４）を用いて行った。プレートを、上記の溶媒系に２回曝露して、異性体２Ａ（１５ｍｇ）及び異性体２Ｂ及び２Ｃの混合物（３３ｍｇ）を得た。異性体２Ｂ及び２Ｃ混合物のさらなる分取ＴＬＣは、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＮＨ4ＯＨの勾配（８９．６：９．９：０．５→８４．６／１４．９／０．５）を用いて行って、異性体２Ｂ（２．３ｍｇ）及び異性体２Ｂ及び２Ｃ（１６．６ｍｇ）を得た。
化合物２（５０ｍｇ）の異性体分離は、分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（２０００ミクロン、２０×２０ｃｍ、Ａｎａｌｔｅｃｈ）により、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＮＨ4ＯＨ（７９．６：２０．０：０．４）を用いて行った。プレートを、上記の溶媒系に２回曝露して、異性体２Ａ（１５ｍｇ）及び異性体２Ｂ及び２Ｃの混合物（３３ｍｇ）を得た。異性体２Ｂ及び２Ｃ混合物のさらなる分取ＴＬＣは、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＮＨ4ＯＨの勾配（８９．６：９．９：０．５→８４．６／１４．９／０．５）を用いて行って、異性体２Ｂ（２．３ｍｇ）及び異性体２Ｂ及び２Ｃ（１６．６ｍｇ）を得た。
【0095】
[00120]
異性体２Ａ、単離：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.84 (m, 2H), 7.70-7.67 (m, 2H), 7.65-7.62 (m, 2H), 7.51-7.48 (m, 2H), 7.44-7.39 (m, 1H), 6.24 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.64-4.59 (m, 1H), 2.08-2.03 (m, 1H), 1.99-1.95 (m, 1H), 1.85-1.81 (m, 1H), 1.54 (br s, 1H), 1.48-1.41 (m, 1H), 1.28 (s, 1H), 1.22-1.04 (m, 3H), 1.00-0.92 (m, 9H). LCMS RT = 9.26 min, m/z (M+H)+ = 336.2. TLC (SiO2) Rf 0.37 (８：２ヘキサン：ジエチルエーテル＋２滴のＮＨ4ＯＨ)。
異性体２Ａ、単離：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.84 (m, 2H), 7.70-7.67 (m, 2H), 7.65-7.62 (m, 2H), 7.51-7.48 (m, 2H), 7.44-7.39 (m, 1H), 6.24 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.64-4.59 (m, 1H), 2.08-2.03 (m, 1H), 1.99-1.95 (m, 1H), 1.85-1.81 (m, 1H), 1.54 (br s, 1H), 1.48-1.41 (m, 1H), 1.28 (s, 1H), 1.22-1.04 (m, 3H), 1.00-0.92 (m, 9H). LCMS RT = 9.26 min, m/z (M+H)+ = 336.2. TLC (SiO2) Rf 0.37 (８：２ヘキサン：ジエチルエーテル＋２滴のＮＨ4ＯＨ)。
【0096】
[00121]
異性体２Ｂ、単離：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.85-7.82 (m, 2H), 7.67-7.60 (m, 4H), 7.49-7.36 (m, 3H), 5.79 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.03 (qd, J = 10.9, 3.8 Hz, 1H), 2.16-2.12 (m, 1H), 2.05-1.85 (m, 1H), 1.79-1.70 (m, 1H), 1.25-1.15 (m, 5H), 1.04-1.00 (m, 1H), 0.95-0.85 (m, 9H). LCMS RT = 8.85 min, m/z (M+H)+ = 336.2. TLC (SiO2) Rf 0.31 (８：２ヘキサン：ジエチルエーテル＋２滴のＮＨ4ＯＨ）。
異性体２Ｂ、単離：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.85-7.82 (m, 2H), 7.67-7.60 (m, 4H), 7.49-7.36 (m, 3H), 5.79 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.03 (qd, J = 10.9, 3.8 Hz, 1H), 2.16-2.12 (m, 1H), 2.05-1.85 (m, 1H), 1.79-1.70 (m, 1H), 1.25-1.15 (m, 5H), 1.04-1.00 (m, 1H), 0.95-0.85 (m, 9H). LCMS RT = 8.85 min, m/z (M+H)+ = 336.2. TLC (SiO2) Rf 0.31 (８：２ヘキサン：ジエチルエーテル＋２滴のＮＨ4ＯＨ）。
【0097】
[00122]
異性体２Ｃ（７０：３０の比率の２Ｂ：２Ｃとして得られた）：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.87-7.83 (m, 2H), 7.69-7.67 (m, 2H), 7.64-7.62 (m, 2H), 7.51-7.47 (m, 2H), 7.43-7.39 (m, 1H), 6.18 (2C, d, J = 8 Hz, 0.5H), 5.84 (2B, J = 12 Hz, 1H), 4.39 (2C, tt, J = 7.8, 3.9 Hz, 1H), 4.05 (2B, qd, J = 10.9, 3.8 Hz, 1H), 2.16-2.12 (m, 1H), 2.05-1.99 (m, 1H), 1.89 (br s, 1H), 1.81-1.61 (m, 4H), 1.57-1.54 (m, 1H), 1.48-1.15 (m, 4H), 1.06-0.98 (2C, m, 4H), 0.96-0.88 (2B, m, 9H). LCMS RT (異性体Ｂ) = 8.93 min, m/z (M+H)+ = 336.2. LCMS RT (異性体Ｃ) = 9.00 min, m/z (M+H)+ = 336.2. TLC (異性体Ｃ) (SiO2) Rf 0.28 (８：２ヘキサン：ジエチルエーテル＋２滴のＮＨ4ＯＨ)。
異性体２Ｃ（７０：３０の比率の２Ｂ：２Ｃとして得られた）：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.87-7.83 (m, 2H), 7.69-7.67 (m, 2H), 7.64-7.62 (m, 2H), 7.51-7.47 (m, 2H), 7.43-7.39 (m, 1H), 6.18 (2C, d, J = 8 Hz, 0.5H), 5.84 (2B, J = 12 Hz, 1H), 4.39 (2C, tt, J = 7.8, 3.9 Hz, 1H), 4.05 (2B, qd, J = 10.9, 3.8 Hz, 1H), 2.16-2.12 (m, 1H), 2.05-1.99 (m, 1H), 1.89 (br s, 1H), 1.81-1.61 (m, 4H), 1.57-1.54 (m, 1H), 1.48-1.15 (m, 4H), 1.06-0.98 (2C, m, 4H), 0.96-0.88 (2B, m, 9H). LCMS RT (異性体Ｂ) = 8.93 min, m/z (M+H)+ = 336.2. LCMS RT (異性体Ｃ) = 9.00 min, m/z (M+H)+ = 336.2. TLC (異性体Ｃ) (SiO2) Rf 0.28 (８：２ヘキサン：ジエチルエーテル＋２滴のＮＨ4ＯＨ)。
【0098】
[00123]
Ｎ－シクロヘキシル－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物３）。シクロヘキシルアミンＨＣｌ（３４２ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。。粗製残渣を、３０ｍＬヘキサン／エーテル（９０／１０）を用いる粉砕の後に，１５ｍＬ ＭｅＯＨを用いる粉砕により精製して、５３６ｍｇの標題物質を７６％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.79 (m, 2H), 7.68-7.57 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 1H), 6.00 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.01 (dddd, J = 14.7, 10.7, 8.0, 4.0 Hz, 1H), 2.07-2.04 (m, 2H), 1.77 (dt, J = 13.7, 3.7 Hz, 2H), 1.67 (dt, J = 12.7, 3.7 Hz, 1H), 1.52-1.37 (m, 2H), 1.33-1.14 (m, 3H). MS (ESI) m/z 280.3 (M+H)+. C19H21NO.0.3H2Oについての分析計算値: C, 80.13; H, 7.65; N, 4.92; 実測値: C, 80.15; H, 7.37; N, 4.99.
Ｎ－シクロヘキシル－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物３）。シクロヘキシルアミンＨＣｌ（３４２ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。。粗製残渣を、３０ｍＬヘキサン／エーテル（９０／１０）を用いる粉砕の後に，１５ｍＬ ＭｅＯＨを用いる粉砕により精製して、５３６ｍｇの標題物質を７６％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.79 (m, 2H), 7.68-7.57 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 1H), 6.00 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.01 (dddd, J = 14.7, 10.7, 8.0, 4.0 Hz, 1H), 2.07-2.04 (m, 2H), 1.77 (dt, J = 13.7, 3.7 Hz, 2H), 1.67 (dt, J = 12.7, 3.7 Hz, 1H), 1.52-1.37 (m, 2H), 1.33-1.14 (m, 3H). MS (ESI) m/z 280.3 (M+H)+. C19H21NO.0.3H2Oについての分析計算値: C, 80.13; H, 7.65; N, 4.92; 実測値: C, 80.15; H, 7.37; N, 4.99.
【0099】
[00124]
Ｎ－（ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物４、単一異性体）。ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－アミンＨＣｌ（１０６ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、８０ｍｇの標題物質を３８％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.88-7.77 (m, 2H), 7.69-7.58 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.47-7.34 (m, 1H), 6.17 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.35 (dddd, J = 11.3, 6.8, 4.4, 1.6 Hz, 1H), 2.59 (br s, 1H), 2.39-2.14 (m, 2H), 1.71-1.44 (m, 2H), 1.39 (ddt, J = 9.9, 3.2, 1.7 Hz, 1H), 1.34-1.23 (m, 1H), 0.86 (ddd, J = 12.9, 4.7, 3.0 Hz, 1H). MS (ESI) m/z 292.4 (M+H)+. C20H21NOについての分析計算値: C, 82.44; H, 7.26; N, 4.81; 実測値: C, 82.05; H, 7.10; N, 4.84.
Ｎ－（ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物４、単一異性体）。ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－アミンＨＣｌ（１０６ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、８０ｍｇの標題物質を３８％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.88-7.77 (m, 2H), 7.69-7.58 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.47-7.34 (m, 1H), 6.17 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.35 (dddd, J = 11.3, 6.8, 4.4, 1.6 Hz, 1H), 2.59 (br s, 1H), 2.39-2.14 (m, 2H), 1.71-1.44 (m, 2H), 1.39 (ddt, J = 9.9, 3.2, 1.7 Hz, 1H), 1.34-1.23 (m, 1H), 0.86 (ddd, J = 12.9, 4.7, 3.0 Hz, 1H). MS (ESI) m/z 292.4 (M+H)+. C20H21NOについての分析計算値: C, 82.44; H, 7.26; N, 4.81; 実測値: C, 82.05; H, 7.10; N, 4.84.
【0100】
[00125]
Ｎ－シクロヘプチル－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物５）。シクロヘプチルアミン（１００ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、２００ｍｇの標題物質を、７７％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.78 (m, 2H), 7.69-7.57 (m, 4H), 7.50-7.43 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.18 (ddt, J = 12.8, 8.4, 3.6 Hz, 1H), 2.17-1.98 (m, 3H), 1.73-1.60 (m, 4H), 1.58-1.49 (m, 5H). MS (ESI) m/z 294.3 (M+H)+. C20H23NOについての分析計算値: C, 81.87; H, 7.90; N, 4.77; 実測値: C, 81.84; H, 7.76; N, 4.67.
Ｎ－シクロヘプチル－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物５）。シクロヘプチルアミン（１００ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、２００ｍｇの標題物質を、７７％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.78 (m, 2H), 7.69-7.57 (m, 4H), 7.50-7.43 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.18 (ddt, J = 12.8, 8.4, 3.6 Hz, 1H), 2.17-1.98 (m, 3H), 1.73-1.60 (m, 4H), 1.58-1.49 (m, 5H). MS (ESI) m/z 294.3 (M+H)+. C20H23NOについての分析計算値: C, 81.87; H, 7.90; N, 4.77; 実測値: C, 81.84; H, 7.76; N, 4.67.
【0101】
[00126]
Ｎ－（ビシクロ［３．２．１］オクタン－３－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物６）。ビシクロ［３．２．１］オクタン－３－アミンＨＣｌ（９０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、５４ｍｇの標題物質を、３２％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.84-7.77 (m, 2H), 7.70-7.56 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 1H), 5.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.33 (tdt, J = 11.5, 8.4, 5.8 Hz, 1H), 2.31 (br s, 2H), 2.06-1.97 (m, 2H), 1.69 (br s, 4H), 1.54-1.44 (m, 1H), 1.40 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 1.33-1.23 (m, 2H). MS (ESI) m/z 306.3 (M+H)+. C21H23NOについての分析計算値: C, 82.58; H, 7.59; N, 4.59; 実測値: C, 82.35; H, 7.68; N, 4.58.
Ｎ－（ビシクロ［３．２．１］オクタン－３－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物６）。ビシクロ［３．２．１］オクタン－３－アミンＨＣｌ（９０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、５４ｍｇの標題物質を、３２％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.84-7.77 (m, 2H), 7.70-7.56 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 1H), 5.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.33 (tdt, J = 11.5, 8.4, 5.8 Hz, 1H), 2.31 (br s, 2H), 2.06-1.97 (m, 2H), 1.69 (br s, 4H), 1.54-1.44 (m, 1H), 1.40 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 1.33-1.23 (m, 2H). MS (ESI) m/z 306.3 (M+H)+. C21H23NOについての分析計算値: C, 82.58; H, 7.59; N, 4.59; 実測値: C, 82.35; H, 7.68; N, 4.58.
【0102】
[00127]
Ｎ－シクロオクチル－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物７）。シクロオクチルアミン（５００ｍｇ、３．９３ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（９５／５→３０／７０）を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した後に、自動化フラッシュクロマトグラフィーを行って、６０５ｍｇの標題物質を、５０％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.78 (m, 2H), 7.68-7.56 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 1H), 6.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.23 (ddq, J = 12.0, 8.0, 3.7 Hz, 1H), 2.01-1.89 (m, 2H), 1.78-1.60 (m, 12H). MS (ESI) m/z 308.3 (M+H)+. C21H25NOについての分析計算値: C, 82.04; H, 8.20; N, 4.56; 実測値: C, 81.93; H, 8.10; N, 4.58.
Ｎ－シクロオクチル－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物７）。シクロオクチルアミン（５００ｍｇ、３．９３ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（９５／５→３０／７０）を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した後に、自動化フラッシュクロマトグラフィーを行って、６０５ｍｇの標題物質を、５０％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.78 (m, 2H), 7.68-7.56 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 1H), 6.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.23 (ddq, J = 12.0, 8.0, 3.7 Hz, 1H), 2.01-1.89 (m, 2H), 1.78-1.60 (m, 12H). MS (ESI) m/z 308.3 (M+H)+. C21H25NOについての分析計算値: C, 82.04; H, 8.20; N, 4.56; 実測値: C, 81.93; H, 8.10; N, 4.58.
【0103】
[00128]
Ｎ－（デカヒドロナフタレン－１－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物８、３つの異性体の混合物）。デカヒドロナフタレン－１－アミンＨＣｌ（９１ｍｇ、０．４８３ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、１５ｍＬ ＭｅＯＨを用いる粉砕により精製して、１３６ｍｇの標題物質を、８４％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.87-7.79 (m, 6H), 7.72-7.57 (m, 12H), 7.51-7.42 (m, 6H), 7.42-7.35 (m, 3H), 6.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 4.15 (ddt, J = 11.8, 7.9, 4.0 Hz, 1H), 3.89-3.75 (m, 2H), 2.16-2.06 (m, 3H), 1.97-0.81 (m, 45H). MS (ESI) m/z 334.30 (M+H)+. C23H27NO.0.3 H2Oについての分析計算値: C, 81.52; H, 8.21; N, 4.13; 実測値: C, 81.44; H, 7.94; N, 4.16.
Ｎ－（デカヒドロナフタレン－１－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物８、３つの異性体の混合物）。デカヒドロナフタレン－１－アミンＨＣｌ（９１ｍｇ、０．４８３ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、１５ｍＬ ＭｅＯＨを用いる粉砕により精製して、１３６ｍｇの標題物質を、８４％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.87-7.79 (m, 6H), 7.72-7.57 (m, 12H), 7.51-7.42 (m, 6H), 7.42-7.35 (m, 3H), 6.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 4.15 (ddt, J = 11.8, 7.9, 4.0 Hz, 1H), 3.89-3.75 (m, 2H), 2.16-2.06 (m, 3H), 1.97-0.81 (m, 45H). MS (ESI) m/z 334.30 (M+H)+. C23H27NO.0.3 H2Oについての分析計算値: C, 81.52; H, 8.21; N, 4.13; 実測値: C, 81.44; H, 7.94; N, 4.16.
【0104】
[00129]
Ｎ－（１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－１－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物９）．１，２，３，４－テトラヒドロ－１－ナフチルアミン（２５０ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、３８４ｍｇの標題物質を、６９％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.90-7.82 (m, 2H), 7.69-7.57 (m, 4H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 2H), 7.24-7.12 (m, 3H), 6.37 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.48-5.38 (m, 1H), 2.94-2.75 (m, 2H), 2.24-2.12 (m, 1H), 2.03-1.86 (m, 3H). MS (ESI) m/z 328.20 (M+H)+. C23H21NOについての分析計算値: C, 84.37; H, 6.46; N, 4.28; 実測値: C, 84.14; H, 6.37; N, 4.17.
Ｎ－（１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－１－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物９）．１，２，３，４－テトラヒドロ－１－ナフチルアミン（２５０ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、３８４ｍｇの標題物質を、６９％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.90-7.82 (m, 2H), 7.69-7.57 (m, 4H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 2H), 7.24-7.12 (m, 3H), 6.37 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.48-5.38 (m, 1H), 2.94-2.75 (m, 2H), 2.24-2.12 (m, 1H), 2.03-1.86 (m, 3H). MS (ESI) m/z 328.20 (M+H)+. C23H21NOについての分析計算値: C, 84.37; H, 6.46; N, 4.28; 実測値: C, 84.14; H, 6.37; N, 4.17.
【0105】
[00130]
Ｎ－（デカヒドロナフタレン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１０、ＬＣＭＳにより８６：１３の比率で存在する２つの異性体の混合物）及びＮ－（（２ＳＲ，９ＲＳ，１０ＳＲ）－デカヒドロナフタレン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１２、単一異性体）。デカヒドロナフタレン－２－アミン（６３ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１０（１１１ｍｇ、８０％）及び１２（２８ｍｇ、２０％）を得た。1H NMR (混合物) (400 MHz, CDCl3, 10) δ7.87-7.78 (m, 3H), 7.69-7.57 (m, 6H), 7.50-7.42 (m, 3H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.00 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 8.4 Hz, 0.31H), 4.20 (s, 0.26H), 4.00 (tdt, J = 11.9, 8.2, 4.2 Hz, 1H), 2.18-1.59 (m, 9H), 1.57-0.84 (m, 8H). MS (ESI) (混合物) m/z 334.3 (M+H)+. LCMS (混合物) RT (ピーク1 (主異性体)、12に相当する) = 7.91 min, m/z (M+H)+ = 334.2; LCMS RT (ピーク2 (副異性体)) = 8.70 min, m/z (M+H)+ = 334.2. C23H27NO(混合物)についての分析計算値: C, 82.84; H, 8.16; N, 4.20; 実測値: C, 82.57; H, 7.97; N, 4.20. TLC (主異性体、12に相当) (SiO2) Rf 0.54 (8:2ヘキサン: EtOAc). TLC (副異性体) (SiO2) Rf 0.59 (8:2ヘキサン: EtOAc).
Ｎ－（デカヒドロナフタレン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１０、ＬＣＭＳにより８６：１３の比率で存在する２つの異性体の混合物）及びＮ－（（２ＳＲ，９ＲＳ，１０ＳＲ）－デカヒドロナフタレン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１２、単一異性体）。デカヒドロナフタレン－２－アミン（６３ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１０（１１１ｍｇ、８０％）及び１２（２８ｍｇ、２０％）を得た。1H NMR (混合物) (400 MHz, CDCl3, 10) δ7.87-7.78 (m, 3H), 7.69-7.57 (m, 6H), 7.50-7.42 (m, 3H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.00 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 8.4 Hz, 0.31H), 4.20 (s, 0.26H), 4.00 (tdt, J = 11.9, 8.2, 4.2 Hz, 1H), 2.18-1.59 (m, 9H), 1.57-0.84 (m, 8H). MS (ESI) (混合物) m/z 334.3 (M+H)+. LCMS (混合物) RT (ピーク1 (主異性体)、12に相当する) = 7.91 min, m/z (M+H)+ = 334.2; LCMS RT (ピーク2 (副異性体)) = 8.70 min, m/z (M+H)+ = 334.2. C23H27NO(混合物)についての分析計算値: C, 82.84; H, 8.16; N, 4.20; 実測値: C, 82.57; H, 7.97; N, 4.20. TLC (主異性体、12に相当) (SiO2) Rf 0.54 (8:2ヘキサン: EtOAc). TLC (副異性体) (SiO2) Rf 0.59 (8:2ヘキサン: EtOAc).
【0106】
[00131]
1H NMR (400 MHz, CDCl3, 化合物12, 単一異性体) δ7.87-7.79 (m, 2H), 7.70-7.57 (m, 4H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.00 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.01 (tdt, J = 12.0, 8.4, 4.3 Hz, 1H), 1.96-1.58 (m, 8H), 1.56-1.20 (m, 8H). MS (ESI) (単一異性体) m/z 334.3 (M+H)+. LCMS (単一異性体) RT = 8.04 min, m/z (M+H)+ = 334.2. C23H27NO (単一異性体)についての分析計算値: C, 82.84; H, 8.16; N, 4.20; 実測値: C, 82.73; H, 8.13; N, 4.14. TLC (SiO2) Rf 0.54 (8:2ヘキサン: EtOAc).
1H NMR (400 MHz, CDCl3, 化合物12, 単一異性体) δ7.87-7.79 (m, 2H), 7.70-7.57 (m, 4H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.00 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.01 (tdt, J = 12.0, 8.4, 4.3 Hz, 1H), 1.96-1.58 (m, 8H), 1.56-1.20 (m, 8H). MS (ESI) (単一異性体) m/z 334.3 (M+H)+. LCMS (単一異性体) RT = 8.04 min, m/z (M+H)+ = 334.2. C23H27NO (単一異性体)についての分析計算値: C, 82.84; H, 8.16; N, 4.20; 実測値: C, 82.73; H, 8.13; N, 4.14. TLC (SiO2) Rf 0.54 (8:2ヘキサン: EtOAc).
【0107】
[00132]
化合物１２の1Ｈ、13Ｃ、ｇＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ｇＨＳＱＣＡＤ、ｇＨＭＢＣＡＤ、ｇＨ２ＢＣ。全ての実験は、1Ｈ及び13Ｃ共鳴周波数についてそれぞれ４９９．９０ＭＨｚ及び１２５．７１ＭＨｚで運転するＯｎｅＮＭＲプローブを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＤＤＲ２ ５００ＭＨｚ分光計で行った。実験は、室温にて、ＣＤＣｌ3を溶媒として用いて行った。1Ｈスペクトルは、残存プロトン化溶媒（７．２６ｐｐｍ）に対して、13Ｃは７７ｐｐｍに対して参照した。スペクトルは、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａ（１２．０．３）ＮＭＲ処理プログラムを用いて処理した。
化合物１２の1Ｈ、13Ｃ、ｇＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ｇＨＳＱＣＡＤ、ｇＨＭＢＣＡＤ、ｇＨ２ＢＣ。全ての実験は、1Ｈ及び13Ｃ共鳴周波数についてそれぞれ４９９．９０ＭＨｚ及び１２５．７１ＭＨｚで運転するＯｎｅＮＭＲプローブを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＤＤＲ２ ５００ＭＨｚ分光計で行った。実験は、室温にて、ＣＤＣｌ3を溶媒として用いて行った。1Ｈスペクトルは、残存プロトン化溶媒（７．２６ｐｐｍ）に対して、13Ｃは７７ｐｐｍに対して参照した。スペクトルは、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａ（１２．０．３）ＮＭＲ処理プログラムを用いて処理した。
【0108】
[00133]
1Ｈ ＮＭＲ：１０秒の待ち時間、８０１３Ｈｚのスペクトルウィンドウ、２．０４秒の収集時間、８スキャン、ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて適用した。
1Ｈ ＮＭＲ：１０秒の待ち時間、８０１３Ｈｚのスペクトルウィンドウ、２．０４秒の収集時間、８スキャン、ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて適用した。
【0109】
[00134]
13Ｃ ＮＭＲ：広帯域1Ｈ－デカップリング、１秒の待ち時間、５１２スキャン、３１２５０Ｈｚのスペクトルウィンドウ、１．０５秒の収集時間。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて適用し、０．５Ｈｚの指数関数的増倍を適用した。
13Ｃ ＮＭＲ：広帯域1Ｈ－デカップリング、１秒の待ち時間、５１２スキャン、３１２５０Ｈｚのスペクトルウィンドウ、１．０５秒の収集時間。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて適用し、０．５Ｈｚの指数関数的増倍を適用した。
【0110】
[00135]
ｇＣＯＳＹ：１秒の待ち時間、増分当たり４スキャン、２００増分、４８８２Ｈｚのスペクトルウィンドウ、０．１５秒の収集時間。Ｆ１及びＦ２は、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａにより実行されるように、正弦二乗ＩＩ関数（５０％）を乗じた後に、フーリエ変換した。Ｆ１において１０２４点まで線形予測（Ｚｈｕ－Ｂａｘ）を適用した。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて両方の次元に適用した。
ｇＣＯＳＹ：１秒の待ち時間、増分当たり４スキャン、２００増分、４８８２Ｈｚのスペクトルウィンドウ、０．１５秒の収集時間。Ｆ１及びＦ２は、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａにより実行されるように、正弦二乗ＩＩ関数（５０％）を乗じた後に、フーリエ変換した。Ｆ１において１０２４点まで線形予測（Ｚｈｕ－Ｂａｘ）を適用した。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて両方の次元に適用した。
【0111】
[00136]
ｇＨ２ＢＣ：１秒の待ち時間、増分当たり８スキャン、２００増分、８０１３、２５１４１Ｈｚスペクトルウィンドウ（それぞれ1Ｈ及び13Ｃ）、０．１５秒の収集時間。ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａにより実行されるように、Ｆ１にはガウスを、Ｆ２には正弦二乗ＩＩ関数（５０％）を乗じた後に、フーリエ変換した。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて両方の次元に適用した。Ｆ１において２０４８点まで線形予測（Ｚｈｕ－Ｂａｘ）を適用した。
ｇＨ２ＢＣ：１秒の待ち時間、増分当たり８スキャン、２００増分、８０１３、２５１４１Ｈｚスペクトルウィンドウ（それぞれ1Ｈ及び13Ｃ）、０．１５秒の収集時間。ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａにより実行されるように、Ｆ１にはガウスを、Ｆ２には正弦二乗ＩＩ関数（５０％）を乗じた後に、フーリエ変換した。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて両方の次元に適用した。Ｆ１において２０４８点まで線形予測（Ｚｈｕ－Ｂａｘ）を適用した。
【0112】
[00137]
ｇＨＭＢＣＡＤ：１秒の待ち時間、増分当たり８スキャン、３２０増分；８０１３、３０１６６Ｈｚスペクトルウィンドウ（それぞれ1Ｈ及び13Ｃ）、０．１５秒の収集時間。ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａにより実行されるように、Ｆ２にはガウスを、Ｆ１には正弦二乗ＩＩ関数（５０％）を乗じた後に、フーリエ変換した。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて両方の次元に適用した。Ｆ１において２０４８点まで線形予測（Ｚｈｕ－Ｂａｘ）を適用した。
ｇＨＭＢＣＡＤ：１秒の待ち時間、増分当たり８スキャン、３２０増分；８０１３、３０１６６Ｈｚスペクトルウィンドウ（それぞれ1Ｈ及び13Ｃ）、０．１５秒の収集時間。ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａにより実行されるように、Ｆ２にはガウスを、Ｆ１には正弦二乗ＩＩ関数（５０％）を乗じた後に、フーリエ変換した。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて両方の次元に適用した。Ｆ１において２０４８点まで線形予測（Ｚｈｕ－Ｂａｘ）を適用した。
【0113】
[00138]
ｇＨＳＱＣＡＤ：１秒の待ち時間、増分当たり４スキャン、２００増分；８０１３、２５１４１Ｈｚスペクトルウィンドウ（それぞれ1Ｈ及び13Ｃ）、０．１５秒の収集時間。Ｆ１及びＦ２にガウスを乗じた後に、フーリエ変換した。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて両方の次元に適用した。Ｆ１において２０４８点まで線形予測（Ｚｈｕ－Ｂａｘ）を適用した。
ｇＨＳＱＣＡＤ：１秒の待ち時間、増分当たり４スキャン、２００増分；８０１３、２５１４１Ｈｚスペクトルウィンドウ（それぞれ1Ｈ及び13Ｃ）、０．１５秒の収集時間。Ｆ１及びＦ２にガウスを乗じた後に、フーリエ変換した。ベースライン補正は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒスムーザ（自動検出）を用いて両方の次元に適用した。Ｆ１において２０４８点まで線形予測（Ｚｈｕ－Ｂａｘ）を適用した。
【0114】
[00139]
Ｎ－（１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１１）。１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－２－アミンＨＣｌ（１９７ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、１５ｍＬ ＭｅＯＨを用いる粉砕により精製して、３２８ｍｇの標題物質を、７５％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.95-7.93 (m, 2H), 7.77-7.71 (m, 4H), 7.57-7.50 (m, 3H), 7.37 (s, 1H), 7.23-7.26 (m, 3H), 6.29 (d, J = 4 Hz, 1H), 4.65 (br s, 1H), 3.39 (d, J = 20 Hz, 1H), 3.07 (br s, 1H), 2.88-2.94 (m, 1H), 2.33-2.30 (m, 1H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.70 (s, 1H). MS (ESI) m/z 328.2 (M+H)+. C23H21NOについての析計算値: C, 84.37; H, 6.46; N, 4.28; 実測値: C, 84.10; H, 6.42; N, 4.25.
Ｎ－（１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１１）。１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－２－アミンＨＣｌ（１９７ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、１５ｍＬ ＭｅＯＨを用いる粉砕により精製して、３２８ｍｇの標題物質を、７５％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.95-7.93 (m, 2H), 7.77-7.71 (m, 4H), 7.57-7.50 (m, 3H), 7.37 (s, 1H), 7.23-7.26 (m, 3H), 6.29 (d, J = 4 Hz, 1H), 4.65 (br s, 1H), 3.39 (d, J = 20 Hz, 1H), 3.07 (br s, 1H), 2.88-2.94 (m, 1H), 2.33-2.30 (m, 1H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.70 (s, 1H). MS (ESI) m/z 328.2 (M+H)+. C23H21NOについての析計算値: C, 84.37; H, 6.46; N, 4.28; 実測値: C, 84.10; H, 6.42; N, 4.25.
【0115】
[00140]
Ｎ－（スピロ［５．５］ウンデカン－３－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１３）。スピロ［５．５］ウンデカン－３－アミンＨＣｌ（９０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１３０ｍｇの標題物質を、８４％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.79 (m, 2H), 7.69-7.57 (m, 4H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.02 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.97 (dddd, J = 14.9, 10.7, 8.3, 4.2 Hz, 1H), 1.88 (ddd, J = 13.1, 6.2, 3.8 Hz, 3H), 1.67 (d, J = 13.6 Hz, 3H), 1.42 (br s, 8H), 1.25 (td, J = 12.7, 4.4 Hz, 4H). MS (ESI) m/z 348.4 (M+H)+. C24H29NOについての分析計算値: C, 82.95; H, 8.41; N, 4.03; 実測値: C, 82.99; H, 8.42; N, 3.99.
Ｎ－（スピロ［５．５］ウンデカン－３－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１３）。スピロ［５．５］ウンデカン－３－アミンＨＣｌ（９０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１３０ｍｇの標題物質を、８４％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86-7.79 (m, 2H), 7.69-7.57 (m, 4H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.02 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.97 (dddd, J = 14.9, 10.7, 8.3, 4.2 Hz, 1H), 1.88 (ddd, J = 13.1, 6.2, 3.8 Hz, 3H), 1.67 (d, J = 13.6 Hz, 3H), 1.42 (br s, 8H), 1.25 (td, J = 12.7, 4.4 Hz, 4H). MS (ESI) m/z 348.4 (M+H)+. C24H29NOについての分析計算値: C, 82.95; H, 8.41; N, 4.03; 実測値: C, 82.99; H, 8.42; N, 3.99.
【0116】
[00141]
Ｎ－（スピロ［４．５］デカン－８－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１４）。スピロ［４．５］デカン－８－アミンＨＣｌ（９１ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１１０ｍｇの標題物質を、６８％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.87-7.79 (m, 2H), 7.69-7.57 (m, 4H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.01 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.05-3.93 (m, 1H), 2.00-1.91 (m, 2H), 1.67-1.60 (m, 3H), 1.58-1.31 (m, 11H). MS (ESI) m/z 334.3 (M+H)+. C23H27NOについての分析計算値: C, 82.84; H, 8.16; N, 4.20; 実測値: C, 82.57; H, 8.16; N, 4.22.
Ｎ－（スピロ［４．５］デカン－８－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１４）。スピロ［４．５］デカン－８－アミンＨＣｌ（９１ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１１０ｍｇの標題物質を、６８％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.87-7.79 (m, 2H), 7.69-7.57 (m, 4H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1H), 6.01 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.05-3.93 (m, 1H), 2.00-1.91 (m, 2H), 1.67-1.60 (m, 3H), 1.58-1.31 (m, 11H). MS (ESI) m/z 334.3 (M+H)+. C23H27NOについての分析計算値: C, 82.84; H, 8.16; N, 4.20; 実測値: C, 82.57; H, 8.16; N, 4.22.
【0117】
[00142]
Ｎ－（アダマンタン－１－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１５）．１－アダマンタンアミンＨＣｌ（１００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１１０ｍｇの標題物質を、６２％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.83-7.75 (m, 2H), 7.67-7.57 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 1H), 5.84 (s, 1H), 2.15 (br s, 9H), 1.73 (br s, 6H). MS (ESI) m/z 332.3 (M+H)+. C23H25NO.0.1H2Oについての分析計算値: C, 82.89; H, 7.62; N, 4.20; 実測値: C, 82.87; H, 7.47; N, 4.18.
Ｎ－（アダマンタン－１－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１５）．１－アダマンタンアミンＨＣｌ（１００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を用いて一般的な手順に従って調製。粗精残渣を、自動化フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１１０ｍｇの標題物質を、６２％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.83-7.75 (m, 2H), 7.67-7.57 (m, 4H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 1H), 5.84 (s, 1H), 2.15 (br s, 9H), 1.73 (br s, 6H). MS (ESI) m/z 332.3 (M+H)+. C23H25NO.0.1H2Oについての分析計算値: C, 82.89; H, 7.62; N, 4.20; 実測値: C, 82.87; H, 7.47; N, 4.18.
【0118】
[00143]
インビトロ薬理学
[00144]
Ｃａ2+イメージングを用いるＴＲＰＭ８アゴニスト及びアンタゴニスト活性の評価。Ｆｕｒａ－２ベースのＣａ2+イメージングを用いて、イシリン誘発Ｃａ2+シグナルに対する合成化合物の影響を評価した。ヒトＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞（Thomas Voets教授、Laboratory of Ion Channels Research、KU Leuven、Belgiumからの進物）に、まず、Ｆｕｒａ－２ ＡＭを４５分間負荷し、次いで、さらに４０分かけて色素を脱エステル化した。細胞を、次いで、Ｃａ2+フリーＨＢＳＳ緩衝液に浸し、試験化合物とともに５分間インキュベートし、次いで、公知のＴＲＰＭ８アゴニストであるイシリン（５００ｎＭ、Ｔｏｃｒｉｓから）を浴液に加えた。イシリン添加の１分後に、２ｍＭ Ｃａ2+を浴液に加えた。
インビトロ薬理学
[00144]
Ｃａ2+イメージングを用いるＴＲＰＭ８アゴニスト及びアンタゴニスト活性の評価。Ｆｕｒａ－２ベースのＣａ2+イメージングを用いて、イシリン誘発Ｃａ2+シグナルに対する合成化合物の影響を評価した。ヒトＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞（Thomas Voets教授、Laboratory of Ion Channels Research、KU Leuven、Belgiumからの進物）に、まず、Ｆｕｒａ－２ ＡＭを４５分間負荷し、次いで、さらに４０分かけて色素を脱エステル化した。細胞を、次いで、Ｃａ2+フリーＨＢＳＳ緩衝液に浸し、試験化合物とともに５分間インキュベートし、次いで、公知のＴＲＰＭ８アゴニストであるイシリン（５００ｎＭ、Ｔｏｃｒｉｓから）を浴液に加えた。イシリン添加の１分後に、２ｍＭ Ｃａ2+を浴液に加えた。
【0119】
[00145]
レシオ蛍光画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｓ顕微鏡に搭載したＱＩＣｌｉｃｋ（商標）デジタルＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて取得した。連続的励起を、３５５ｎｍ（Ｆ355）及び３８０ｎｍ（Ｆ380）波長ＬＥＤの間で交替するＤｕａｌ ＯｐｔｏＬＥＤ電源（Ｃａｉｒｎ）によりもたらした。発光蛍光は、５１０ｎｍ（４７０ｎｍ～５５０ｎｍ）にて収集した。１２ビット画像を５秒ごとに、ＭｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）で取得した。各時点での蛍光は、３５５ｎｍ及び３８０ｎｍの両方の波長で抽出し、自己蛍光について補正し、３５５ｎｍ／３８０ｎｍ比（Ｆ355／Ｆ380）を、次いで、計算して、Ｃａ2+流入を表した。全てのＣａ2+イメージング実験は、室温（２２℃）で行った。比較のために、各化合物についてのピークＣａ2+応答を、イシリン（５００ｎＭ）のものに対して標準化した。ＲＱ－００２０３０７８は、Ｔｏｃｒｉｓから購入した。
レシオ蛍光画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｓ顕微鏡に搭載したＱＩＣｌｉｃｋ（商標）デジタルＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて取得した。連続的励起を、３５５ｎｍ（Ｆ355）及び３８０ｎｍ（Ｆ380）波長ＬＥＤの間で交替するＤｕａｌ ＯｐｔｏＬＥＤ電源（Ｃａｉｒｎ）によりもたらした。発光蛍光は、５１０ｎｍ（４７０ｎｍ～５５０ｎｍ）にて収集した。１２ビット画像を５秒ごとに、ＭｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）で取得した。各時点での蛍光は、３５５ｎｍ及び３８０ｎｍの両方の波長で抽出し、自己蛍光について補正し、３５５ｎｍ／３８０ｎｍ比（Ｆ355／Ｆ380）を、次いで、計算して、Ｃａ2+流入を表した。全てのＣａ2+イメージング実験は、室温（２２℃）で行った。比較のために、各化合物についてのピークＣａ2+応答を、イシリン（５００ｎＭ）のものに対して標準化した。ＲＱ－００２０３０７８は、Ｔｏｃｒｉｓから購入した。
【0120】
[00146]
イシリンの濃度応答プロフィールを得るために、異なるペトリ皿中の、ヒトＴＲＰＭ８を安定的に発現する、Ｆｕｒａ－２を負荷したＨＥＫ－２９３細胞を、Ｃａ2+フリーＨＢＳＳに浸し、まず、勾配濃度のイシリンとインキュベートした（１０-9から１０-6Ｍ）。イシリン添加の１分後に、２ｍＭ Ｃａ2+を浴液に加え、得られたＣａ2+流入（Ｆｕｒａ－２蛍光比として）を記録した。ＥＣ50は、対応する濃度応答曲線から得た。
イシリンの濃度応答プロフィールを得るために、異なるペトリ皿中の、ヒトＴＲＰＭ８を安定的に発現する、Ｆｕｒａ－２を負荷したＨＥＫ－２９３細胞を、Ｃａ2+フリーＨＢＳＳに浸し、まず、勾配濃度のイシリンとインキュベートした（１０-9から１０-6Ｍ）。イシリン添加の１分後に、２ｍＭ Ｃａ2+を浴液に加え、得られたＣａ2+流入（Ｆｕｒａ－２蛍光比として）を記録した。ＥＣ50は、対応する濃度応答曲線から得た。
【0121】
[00147]
設計した化合物（例えば以下の表１）のアンタゴニスト活性を決定するために、Ｃａ2+フリーハンクス平衡塩類溶液（Ｃａ2+フリーＨＢＳＳ）中に浸した細胞を、まず、異なる濃度（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び１００μＭ）の化合物２～１５と３分間インキュベートした。次いで、５００ｎＭのイシリンを加え、さらに１分後に、Ｃａ2+フリーＨＢＳＳを、２ｍＭ遊離Ｃａ2+を含むＨＢＳＳに置き換え、得られたＣａ2+シグナルを測定した。ＴＲＰＭ８アンタゴニストＲＱ－００２０３０７８を陽性対照として、そして文献において報告された他のアンタゴニストに対するｈＴＲＰＭ８での高いナノモル効力（＜１０ｎＭ）を理由として、比較のために用いた。ＩＣ５０値≦１００ｎＭを有する化合物は、Ｃａ2+流入を誘導するその固有の（アゴニスト）能力について、１０μＭの単一濃度にて単独で試験し、５００ｎＭイシリンの影響と比較した。
設計した化合物（例えば以下の表１）のアンタゴニスト活性を決定するために、Ｃａ2+フリーハンクス平衡塩類溶液（Ｃａ2+フリーＨＢＳＳ）中に浸した細胞を、まず、異なる濃度（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び１００μＭ）の化合物２～１５と３分間インキュベートした。次いで、５００ｎＭのイシリンを加え、さらに１分後に、Ｃａ2+フリーＨＢＳＳを、２ｍＭ遊離Ｃａ2+を含むＨＢＳＳに置き換え、得られたＣａ2+シグナルを測定した。ＴＲＰＭ８アンタゴニストＲＱ－００２０３０７８を陽性対照として、そして文献において報告された他のアンタゴニストに対するｈＴＲＰＭ８での高いナノモル効力（＜１０ｎＭ）を理由として、比較のために用いた。ＩＣ５０値≦１００ｎＭを有する化合物は、Ｃａ2+流入を誘導するその固有の（アゴニスト）能力について、１０μＭの単一濃度にて単独で試験し、５００ｎＭイシリンの影響と比較した。
【0122】
[00148]
ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１選択性アッセイ。Ｆｌｕｏ－８ Ｃａ2+色素及び蛍光を用いるＣａ2+フラックスアッセイを、４７０～４９５ｎｍの励起波長及び５１５～５７５ｎｍの発光波長にて、ＦＬＩＰＲTETRAプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。合計８の化合物を、アゴニスト（固有）及びアンタゴニスト活性の両方について、ＴＲＰＭ８に対してほぼＩＣ90及び１０×ＩＣ90に対応する濃度にて試験して、１０倍の選択性を証明した。ヒトＴＲＰＡ１を安定的に発現する組換えＨＥＫ２９３株化細胞（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｃａｔ ＃ＣＹＬ３０６６）及びヒトＴＲＰＶ１（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｃａｔ＃ＣＹＬ３０６３）を研究のために用いた。細胞は、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸及び４００μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを補ったＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で培養及び維持した。アリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及びカプサイシン（Ｔｏｃｒｉｓ）を参照アゴニストとして用い、ルテニウムレッド（Ｔｏｃｒｉｓ）及びカプサゼピン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を、それぞれＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１に対する参照アンタゴニストとして用いた。実験のために、細胞を、平底コラーゲンコーティング３８４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後に、培地を吸引し、Ｆｌｕｏ－８ Ｃａ2+色素を５μｇ／ｍｌで含む４０μｌのダイローディング緩衝液（改変ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ＨＢＳＳが、ｐＨ７．４にて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍＭプロベネシドを含むように補ったもの）を各ウェル中の細胞に加え、３０℃（５％ＣＯ2）にて、湿潤チャンバー中で８０分間インキュベートした後に、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａプロトコールを開始した。試験化合物は、まず、ＤＭＳＯ中に溶解して３００×最終アッセイ濃度にし、次いで、アッセイ緩衝液（改変ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ＨＢＳＳが、ｐＨ７．４にて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むように補ったもの）で、最終希釈倍率まで希釈した。アゴニストアッセイについて、試験化合物、ビヒクル対照及び参照アゴニスト（Ｅmax＝３００μＭ（ＡＩＴＣ）及び３μＭ（カプサイシン））を、アッセイプレートに、蛍光ベースラインを確立した後に、１８０秒間加えた。アンタゴニストアッセイについて、細胞を、試験化合物又は陽性対照（既知アンタゴニスト）と５分間室温にてプレインキュベーションし、次いで、ＥＣ80濃度の参照アゴニスト（ＡＩＴＣ ＥＣ80＝１０μＭ、カプサイシンＥＣ80＝０．１μＭ）で、蛍光ベースライン確立の後に、１８０秒間負荷した。アゴニスト：Ｅmaxに標準化した場合に２５％の活性化。アンタゴニスト：ＥＣ80に標準化した場合に２５％の阻害。
ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１選択性アッセイ。Ｆｌｕｏ－８ Ｃａ2+色素及び蛍光を用いるＣａ2+フラックスアッセイを、４７０～４９５ｎｍの励起波長及び５１５～５７５ｎｍの発光波長にて、ＦＬＩＰＲTETRAプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。合計８の化合物を、アゴニスト（固有）及びアンタゴニスト活性の両方について、ＴＲＰＭ８に対してほぼＩＣ90及び１０×ＩＣ90に対応する濃度にて試験して、１０倍の選択性を証明した。ヒトＴＲＰＡ１を安定的に発現する組換えＨＥＫ２９３株化細胞（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｃａｔ ＃ＣＹＬ３０６６）及びヒトＴＲＰＶ１（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｃａｔ＃ＣＹＬ３０６３）を研究のために用いた。細胞は、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸及び４００μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを補ったＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で培養及び維持した。アリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及びカプサイシン（Ｔｏｃｒｉｓ）を参照アゴニストとして用い、ルテニウムレッド（Ｔｏｃｒｉｓ）及びカプサゼピン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を、それぞれＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１に対する参照アンタゴニストとして用いた。実験のために、細胞を、平底コラーゲンコーティング３８４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後に、培地を吸引し、Ｆｌｕｏ－８ Ｃａ2+色素を５μｇ／ｍｌで含む４０μｌのダイローディング緩衝液（改変ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ＨＢＳＳが、ｐＨ７．４にて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍＭプロベネシドを含むように補ったもの）を各ウェル中の細胞に加え、３０℃（５％ＣＯ2）にて、湿潤チャンバー中で８０分間インキュベートした後に、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａプロトコールを開始した。試験化合物は、まず、ＤＭＳＯ中に溶解して３００×最終アッセイ濃度にし、次いで、アッセイ緩衝液（改変ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ＨＢＳＳが、ｐＨ７．４にて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むように補ったもの）で、最終希釈倍率まで希釈した。アゴニストアッセイについて、試験化合物、ビヒクル対照及び参照アゴニスト（Ｅmax＝３００μＭ（ＡＩＴＣ）及び３μＭ（カプサイシン））を、アッセイプレートに、蛍光ベースラインを確立した後に、１８０秒間加えた。アンタゴニストアッセイについて、細胞を、試験化合物又は陽性対照（既知アンタゴニスト）と５分間室温にてプレインキュベーションし、次いで、ＥＣ80濃度の参照アゴニスト（ＡＩＴＣ ＥＣ80＝１０μＭ、カプサイシンＥＣ80＝０．１μＭ）で、蛍光ベースライン確立の後に、１８０秒間負荷した。アゴニスト：Ｅmaxに標準化した場合に２５％の活性化。アンタゴニスト：ＥＣ80に標準化した場合に２５％の阻害。
【0123】
[00149]
ホールセルパッチクランプ電気生理学
[00150]
ＨＥＫ－２９３細胞培養。ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）を、９０％ダルベッコ改変イーグル培地、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ・ｍＬ－１ペニシリン－ストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含む成長培地で培養した。細胞を、３５ｍｍポリスチレンディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）で３７℃にて５％ＣＯ2の存在下で培養した。細胞を、ＥＧＦＰをレポータとして含むｐＩＲＥＳ２プラスミド中のヒトＴＲＰＭ８で一過的にトランスフェクションした。このプラスミドは、バイシストロニックｍＲＮＡを、ＴＲＰＭ８遺伝子と蛍光タンパク質レポーター遺伝子との間の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とともに、レポーターがＴＲＰＭ８と共有的に融合しないように発現する。一過性トランスフェクションは、３５ｍｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）中のＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び０．５μｇのプラスミドを用いて、製造業者のプロトコールに従ってプラスミド１μｇ当たり３μＬのトランスフェクション試薬の比率で行った。ＨＥＫ－２９３細胞は、多型遺伝子マーカ試験（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ）により立証された。
ホールセルパッチクランプ電気生理学
[00150]
ＨＥＫ－２９３細胞培養。ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）を、９０％ダルベッコ改変イーグル培地、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ・ｍＬ－１ペニシリン－ストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含む成長培地で培養した。細胞を、３５ｍｍポリスチレンディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）で３７℃にて５％ＣＯ2の存在下で培養した。細胞を、ＥＧＦＰをレポータとして含むｐＩＲＥＳ２プラスミド中のヒトＴＲＰＭ８で一過的にトランスフェクションした。このプラスミドは、バイシストロニックｍＲＮＡを、ＴＲＰＭ８遺伝子と蛍光タンパク質レポーター遺伝子との間の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とともに、レポーターがＴＲＰＭ８と共有的に融合しないように発現する。一過性トランスフェクションは、３５ｍｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）中のＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び０．５μｇのプラスミドを用いて、製造業者のプロトコールに従ってプラスミド１μｇ当たり３μＬのトランスフェクション試薬の比率で行った。ＨＥＫ－２９３細胞は、多型遺伝子マーカ試験（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ）により立証された。
【0124】
[00151]
ホールセルパッチクランプ電気生理学。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）に短時間曝露することにより培養ディッシュから遊離させ、補充ＤｕｌＤＭＥＭに再懸濁し、カバーガラス上に播種し、１～２時間３７℃にて５％ＣＯ2に回復させた。トランスフェクションの成功を示す緑色蛍光を示す細胞を、電気生理学的測定のために選択した。ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整し、ショ糖を用いて浸透圧を３１０ｍＯｓｍに調整した、（ｍＭで）ＮａＣｌ １３２、ＫＣｌ ４．８、ＭｇＣｌ2 １．２、ＣａＣｌ2 ２、ＨＥＰＥＳ １０及びグルコース５を含む細胞外溶液を含むチャンバーに細胞を入れた。ＫＯＨでｐＨを７．２に調整し、ショ糖で浸透圧を３００ｍＯｓｍに調整した、（ｍＭで）グルコン酸Ｋ＋ １３５、ＫＣｌ ５、ＭｇＣｌ2 １、ＥＧＴＡ ５及びＨＥＰＥＳ １０を含む溶液でピペットを満たした。化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。浸透圧は、Ｖａｐｒｏ ５６００蒸気圧浸透圧計（Ｗｅｓｃｏｒ）を用いて測定した。ホールセル電位－クランプ電流測定は、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びｐＣｌａｍｐ１０．３ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。データは、２ｋＨｚで取得し、１ｋＨｚでフィルタリングした。Ｐ－２０００レーザプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてホウケイ酸ガラスキャピラリー（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からパッチピペットを引っ張り、ＭＦ－８３０マイクロフォージ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）を用いて熱ポリッシュした。ピペットは、細胞外溶液中で測定して、２～５ＭΩの抵抗を有した。参照電極を、グルコースを加えずに細胞外溶液と同様の組成を有する２％寒天ブリッジ中に置いた。実験は、２３±１℃にて行った。メントール及び化合物１４ストック溶液は、ＤＭＳＯ中でそれぞれ１Ｍ及び３．６ｍＭで調製した。細胞外溶液中で、メントールを５００μＭメントールに、そして化合物１４を様々な濃度（１から１０００ｎＭまで）に希釈することにより、一連の灌流溶液を調製した。灌流キャピラリーを細胞の近くに置き、記録している間溶液を灌流させた。各細胞からの電流応答を、各濃度の化合物１４の下で測定した。カバーガラス当たり１つの細胞のみを測定して、メントール及び化合物１４への以前の曝露の交絡する影響を防いだ。
ホールセルパッチクランプ電気生理学。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）に短時間曝露することにより培養ディッシュから遊離させ、補充ＤｕｌＤＭＥＭに再懸濁し、カバーガラス上に播種し、１～２時間３７℃にて５％ＣＯ2に回復させた。トランスフェクションの成功を示す緑色蛍光を示す細胞を、電気生理学的測定のために選択した。ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整し、ショ糖を用いて浸透圧を３１０ｍＯｓｍに調整した、（ｍＭで）ＮａＣｌ １３２、ＫＣｌ ４．８、ＭｇＣｌ2 １．２、ＣａＣｌ2 ２、ＨＥＰＥＳ １０及びグルコース５を含む細胞外溶液を含むチャンバーに細胞を入れた。ＫＯＨでｐＨを７．２に調整し、ショ糖で浸透圧を３００ｍＯｓｍに調整した、（ｍＭで）グルコン酸Ｋ＋ １３５、ＫＣｌ ５、ＭｇＣｌ2 １、ＥＧＴＡ ５及びＨＥＰＥＳ １０を含む溶液でピペットを満たした。化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。浸透圧は、Ｖａｐｒｏ ５６００蒸気圧浸透圧計（Ｗｅｓｃｏｒ）を用いて測定した。ホールセル電位－クランプ電流測定は、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びｐＣｌａｍｐ１０．３ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。データは、２ｋＨｚで取得し、１ｋＨｚでフィルタリングした。Ｐ－２０００レーザプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてホウケイ酸ガラスキャピラリー（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からパッチピペットを引っ張り、ＭＦ－８３０マイクロフォージ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）を用いて熱ポリッシュした。ピペットは、細胞外溶液中で測定して、２～５ＭΩの抵抗を有した。参照電極を、グルコースを加えずに細胞外溶液と同様の組成を有する２％寒天ブリッジ中に置いた。実験は、２３±１℃にて行った。メントール及び化合物１４ストック溶液は、ＤＭＳＯ中でそれぞれ１Ｍ及び３．６ｍＭで調製した。細胞外溶液中で、メントールを５００μＭメントールに、そして化合物１４を様々な濃度（１から１０００ｎＭまで）に希釈することにより、一連の灌流溶液を調製した。灌流キャピラリーを細胞の近くに置き、記録している間溶液を灌流させた。各細胞からの電流応答を、各濃度の化合物１４の下で測定した。カバーガラス当たり１つの細胞のみを測定して、メントール及び化合物１４への以前の曝露の交絡する影響を防いだ。
【0125】
[00152]
データ分析。各細胞について、各濃度の化合物１４での電流の大きさを、５００μＭメントールあり、アンタゴニストなしで測定した最大電流で除することにより標準化した。６つの細胞からの標準化した電流を、各濃度のアンタゴニストにて平均し、平均の標準誤差を各点にて計算した。データは、ＳｉｇｍａＰｌｏｔにプロットし、以下の等式
を用いて単一部位競合モデルに適合させた。式中、Ｉは、電流強度であり、［アンタゴニスト］は、特定のＩの値での化合物１４の濃度である。
データ分析。各細胞について、各濃度の化合物１４での電流の大きさを、５００μＭメントールあり、アンタゴニストなしで測定した最大電流で除することにより標準化した。６つの細胞からの標準化した電流を、各濃度のアンタゴニストにて平均し、平均の標準誤差を各点にて計算した。データは、ＳｉｇｍａＰｌｏｔにプロットし、以下の等式
【数1】
【0126】
[00153]
肝臓代謝安定性
[00154]
肝臓ミクロソームでの安定性。雄性ＣＤ－１マウス肝臓ミクロソーム（Ｌｏｔ＃１７１００６９）を、ＸｅｎｏＴｅｃｈから購入した。反応混合物マイナスＮＡＤＰＨを、以下に記載するようにして調製した。化合物１４を、１μＭの最終濃度にて反応混合物に加えた。対照化合物であるテストステロンを、別反応において化合物１４と同時に行った。反応混合物の分割量（補因子なし）を、３７℃の振とう水浴中で３分間平衡化した。反応を、補因子の添加により開始し、混合物を、３７℃の振とう水浴中でインキュベートした。分割量（１００μＬ）を、０、１０、２０、３０及び６０分にて取り出した。化合物１４及びテストステロン試料を、０．１％ギ酸及び内部標準を含む４００μＬの氷冷５０／５０アセトニトリル（ＡＣＮ）／Ｈ2Ｏと直ちに併せて、反応を停止した。試料を、次いで、混合し、遠心分離して、タンパク質を沈殿させた。全ての試料を、エレクトロスプレーイオン化を用いるＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりアッセイした。分析条件を、時間０にてＰＡＲＲと比較して、各時点にて残存するパーセンテージを決定した。半減期及び固有クリアランスを、単一相指数関数的減衰等式に適合させるＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて計算した。
肝臓代謝安定性
[00154]
肝臓ミクロソームでの安定性。雄性ＣＤ－１マウス肝臓ミクロソーム（Ｌｏｔ＃１７１００６９）を、ＸｅｎｏＴｅｃｈから購入した。反応混合物マイナスＮＡＤＰＨを、以下に記載するようにして調製した。化合物１４を、１μＭの最終濃度にて反応混合物に加えた。対照化合物であるテストステロンを、別反応において化合物１４と同時に行った。反応混合物の分割量（補因子なし）を、３７℃の振とう水浴中で３分間平衡化した。反応を、補因子の添加により開始し、混合物を、３７℃の振とう水浴中でインキュベートした。分割量（１００μＬ）を、０、１０、２０、３０及び６０分にて取り出した。化合物１４及びテストステロン試料を、０．１％ギ酸及び内部標準を含む４００μＬの氷冷５０／５０アセトニトリル（ＡＣＮ）／Ｈ2Ｏと直ちに併せて、反応を停止した。試料を、次いで、混合し、遠心分離して、タンパク質を沈殿させた。全ての試料を、エレクトロスプレーイオン化を用いるＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりアッセイした。分析条件を、時間０にてＰＡＲＲと比較して、各時点にて残存するパーセンテージを決定した。半減期及び固有クリアランスを、単一相指数関数的減衰等式に適合させるＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて計算した。
【0127】
反応組成。
肝臓ミクロソーム ０．５ｍｇ／ｍＬ
ＮＡＤＰＨ（補因子） １ｍＭ
リン酸カリウム、ｐＨ７．４ １００ｍＭ
塩化マグネシウム ５ｍＭ
アナログ１４ １μＭ
肝臓ミクロソーム ０．５ｍｇ／ｍＬ
ＮＡＤＰＨ（補因子） １ｍＭ
リン酸カリウム、ｐＨ７．４ １００ｍＭ
塩化マグネシウム ５ｍＭ
アナログ１４ １μＭ
【0128】
【表1】
【0129】
【表2】
【0130】
[00155]
インビトロアッセイ。Ｃ５７マウス（約３０ｇ）（Ｈａｒｌａｍ、Ｈｏｌｌａｎｄ）を研究のために用いた。全ての実験は、実験を行ったＵｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ｍｉｇｕｅｌ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚの施設動物倫理員会により承認され、欧州経済共同体及び国際疼痛学会の研究及び倫理問題に関する委員会のガイドラインに従っていた。動物の保護に関する研究の全ての部分は、獣医師の管理のもとに行った。
インビトロアッセイ。Ｃ５７マウス（約３０ｇ）（Ｈａｒｌａｍ、Ｈｏｌｌａｎｄ）を研究のために用いた。全ての実験は、実験を行ったＵｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ｍｉｇｕｅｌ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚの施設動物倫理員会により承認され、欧州経済共同体及び国際疼痛学会の研究及び倫理問題に関する委員会のガイドラインに従っていた。動物の保護に関する研究の全ての部分は、獣医師の管理のもとに行った。
【0131】
[00156]
身震い行動アッセイ。ＴＲＰＭ８アゴニストであるイシリンを、蒸留水中の２０％ＤＭＳＯ及び１％Ｔｗｅｅｎ８０に溶解し、１０ｍｇ／ｋｇの容量で腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。各動物は、２日連続で３０分間馴化させた後にイシリンを投与した。化合物１４ストックは、ＤＭＳＯ中で調製し、注射のために生理食塩水で希釈した。ガバペンチンを生理食塩水に溶解し、２５ｍｇ／ｋｇの用量でｓ．ｃ．投与し、６０分後にイシリンを注射した。対照動物は、ビヒクル注射を受けた。
身震い行動アッセイ。ＴＲＰＭ８アゴニストであるイシリンを、蒸留水中の２０％ＤＭＳＯ及び１％Ｔｗｅｅｎ８０に溶解し、１０ｍｇ／ｋｇの容量で腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。各動物は、２日連続で３０分間馴化させた後にイシリンを投与した。化合物１４ストックは、ＤＭＳＯ中で調製し、注射のために生理食塩水で希釈した。ガバペンチンを生理食塩水に溶解し、２５ｍｇ／ｋｇの用量でｓ．ｃ．投与し、６０分後にイシリンを注射した。対照動物は、ビヒクル注射を受けた。
【0132】
[00157]
冷覚異痛症。オキサリプラチン（Ｔｏｃｒｉｓ）を、緩やかに温めながら水に溶解し、６ｍｇ／ｋｇの用量で第１、３及び５日に皮下注射した（ｓ．ｃ．）。投与の第７日後に、実験を行った。オキサリプラチン注射とともに、生理食塩水及び５％マンニトール溶液を腹腔内注射して、腎臓損傷及び脱水を防止した。化合物１４ストックは、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で調製し、注射のために生理食塩水で希釈した。異なる用量（０．１から１μｇ）の化合物を、マウスの右後脚の足底表面（２５μＬ）に注射した。冷感化学物質熱的感応性を、アセトン滴下法を用いて評価した。マウスを、金属メッシュの檻に入れ、およそ３０分間慣らして、順応させた。新しく調製したアセトン滴（１０μＬ）を、後脚の足底中部表面に静かに施与した。脚をなめることに関する冷感化学物質感応性反応を、正の応答（侵害受容応答）として記録した。応答は、デジタルストップウォッチを用いて２０秒間測定した。各測定について、脚を２回試料として抜き出し、平均を計算した。アセトンの施与の間の間隔は、およそ５分であった。
冷覚異痛症。オキサリプラチン（Ｔｏｃｒｉｓ）を、緩やかに温めながら水に溶解し、６ｍｇ／ｋｇの用量で第１、３及び５日に皮下注射した（ｓ．ｃ．）。投与の第７日後に、実験を行った。オキサリプラチン注射とともに、生理食塩水及び５％マンニトール溶液を腹腔内注射して、腎臓損傷及び脱水を防止した。化合物１４ストックは、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で調製し、注射のために生理食塩水で希釈した。異なる用量（０．１から１μｇ）の化合物を、マウスの右後脚の足底表面（２５μＬ）に注射した。冷感化学物質熱的感応性を、アセトン滴下法を用いて評価した。マウスを、金属メッシュの檻に入れ、およそ３０分間慣らして、順応させた。新しく調製したアセトン滴（１０μＬ）を、後脚の足底中部表面に静かに施与した。脚をなめることに関する冷感化学物質感応性反応を、正の応答（侵害受容応答）として記録した。応答は、デジタルストップウォッチを用いて２０秒間測定した。各測定について、脚を２回試料として抜き出し、平均を計算した。アセトンの施与の間の間隔は、およそ５分であった。
【0133】
[00158]
薬理学的評価
[00159]
Ｃａ2+イメージングを用いるＴＲＰＭ８アゴニスト及びアンタゴニスト活性の評価。化合物２～１５を、ｈＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞におけるＦｕｒａ－２ベースのＣａ2+イメージングを用いて、ＴＲＰＭ８機能を改変するその能力について評価した。後者は、Thomas Voets（Laboratory of Ion Channels Research、KU Leuven、Belgium）からの進物であった。細胞内遊離Ｃａ2+（［Ｃａ2+］i）の濃度を、Ｆｕｒａ－２蛍光比（Ｆ355／Ｆ380）として測定した。
薬理学的評価
[00159]
Ｃａ2+イメージングを用いるＴＲＰＭ８アゴニスト及びアンタゴニスト活性の評価。化合物２～１５を、ｈＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞におけるＦｕｒａ－２ベースのＣａ2+イメージングを用いて、ＴＲＰＭ８機能を改変するその能力について評価した。後者は、Thomas Voets（Laboratory of Ion Channels Research、KU Leuven、Belgium）からの進物であった。細胞内遊離Ｃａ2+（［Ｃａ2+］i）の濃度を、Ｆｕｒａ－２蛍光比（Ｆ355／Ｆ380）として測定した。
【0134】
[00160]
化合物を、イシリン（ＡＧ－３－５）により誘発されるＣａ2+流入（［Ｃａ2+］i）に対して評価した。イシリンは、５００ｎＭで用い、最大Ｃａ2+侵入は、我々の用量応用研究においてこの濃度で生じることが見いだされた。イシリンを、このアッセイにおいてＴＲＰＭ８を刺激するために選択した。なぜなら、これは、初期の濃度応答研究（図１３～１４）において、（－）－メントールよりも著しく効力があり（ＥＣ50：およそ７０ｎＭ対６μＭ）、以前の報告ともほぼ一致していたからである。
化合物を、イシリン（ＡＧ－３－５）により誘発されるＣａ2+流入（［Ｃａ2+］i）に対して評価した。イシリンは、５００ｎＭで用い、最大Ｃａ2+侵入は、我々の用量応用研究においてこの濃度で生じることが見いだされた。イシリンを、このアッセイにおいてＴＲＰＭ８を刺激するために選択した。なぜなら、これは、初期の濃度応答研究（図１３～１４）において、（－）－メントールよりも著しく効力があり（ＥＣ50：およそ７０ｎＭ対６μＭ）、以前の報告ともほぼ一致していたからである。
【0135】
[00161]
ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１アゴニスト及びアンタゴニストＣａ2+フラックスアッセイ（選択性プロファイリング）。ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ５値≦１００ｎＭの化合物を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐｈａｒｍａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ）にてハイスループットＦＬＩＰＲベースのＣａ2+フラックスアッセイを用いて、２つの関連する温度感応性サブタイプであるｈＴＲＰＡ１及びｈＴＲＰＶ１でのオフターゲット効果について評価した。化合物は、ＴＲＰＭ８でのおよそ９０％のターゲットカバー範囲に相当する単一濃度にて評価した後に、＞１０倍選択性を証明するために、１０倍高い濃度にて単独点アッセイを行った。アゴニスト（固有）活性を、ヒトＴＲＰＡ１又はＴＲＰＶ１のいずれかを安定的に発現する組換えＨＥＫ２９３株化細胞で評価し、アゴニストであるそれぞれアリルイソチオシアネート又はカプサイシンの最大効果（Ｅmax）に対して標準化した。アンタゴニスト活性は、これらの株化細胞においてＣａ2+流入を阻害することにより、ＡＩＴＣ又はカプサイシンが誘導するサイトゾルの［Ｃａ2+］における増加を阻害するアナログの能力を測定することにより評価し、参照アンタゴニストとして用いたルテニウムレッド（ＴＲＰＡ１）及びカプサゼピン（ＴＲＰＶ１）の効果と比較した。
ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１アゴニスト及びアンタゴニストＣａ2+フラックスアッセイ（選択性プロファイリング）。ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ５値≦１００ｎＭの化合物を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐｈａｒｍａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ）にてハイスループットＦＬＩＰＲベースのＣａ2+フラックスアッセイを用いて、２つの関連する温度感応性サブタイプであるｈＴＲＰＡ１及びｈＴＲＰＶ１でのオフターゲット効果について評価した。化合物は、ＴＲＰＭ８でのおよそ９０％のターゲットカバー範囲に相当する単一濃度にて評価した後に、＞１０倍選択性を証明するために、１０倍高い濃度にて単独点アッセイを行った。アゴニスト（固有）活性を、ヒトＴＲＰＡ１又はＴＲＰＶ１のいずれかを安定的に発現する組換えＨＥＫ２９３株化細胞で評価し、アゴニストであるそれぞれアリルイソチオシアネート又はカプサイシンの最大効果（Ｅmax）に対して標準化した。アンタゴニスト活性は、これらの株化細胞においてＣａ2+流入を阻害することにより、ＡＩＴＣ又はカプサイシンが誘導するサイトゾルの［Ｃａ2+］における増加を阻害するアナログの能力を測定することにより評価し、参照アンタゴニストとして用いたルテニウムレッド（ＴＲＰＡ１）及びカプサゼピン（ＴＲＰＶ１）の効果と比較した。
【0136】
[00162]
化合物１４のホールセルパッチクランプ電気生理学。カルシウムフラックスアッセイにおける化合物１４の機能的活性を、ホールセルパッチクランプ電気生理学を用いて確認した。ヒトＴＲＰＭ８ホールセルパッチクランプ電気生理学は、２３±１℃にて、以前に記載したようにして、多型遺伝子マーカ試験（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ）により立証されたヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）に対して行った。５００μＭメントールと様々な濃度（０から１μＭ）の化合物１４の一連の溶液を用いた。細胞電流応答を、各濃度の化合物１４にて測定した。ＩＣ50を決定するために、６つの細胞からの標準化した電流を、各濃度のアンタゴニストにて平均し、平均の標準誤差を各点にて計算した。データを、単一部位競合モデルに適合させて、ＩＣ50を得た。ＩＣ50ホールセルパッチクランプ実験を、飽和（５００μＭ）メントール濃度に対して故意に行った。なぜなら、メントール電流は、Ｃａ2+依存性でなく、再現可能な堅固な電流を与えるからである。同様に、飽和メントールに対する化合物１４の阻害効果を研究することにより、ホールセルパッチクランプ測定においてこれらの条件を用いたその他の公開されたＴＲＰＭ８拮抗作用研究と直接比較ができる。
化合物１４のホールセルパッチクランプ電気生理学。カルシウムフラックスアッセイにおける化合物１４の機能的活性を、ホールセルパッチクランプ電気生理学を用いて確認した。ヒトＴＲＰＭ８ホールセルパッチクランプ電気生理学は、２３±１℃にて、以前に記載したようにして、多型遺伝子マーカ試験（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ）により立証されたヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）に対して行った。５００μＭメントールと様々な濃度（０から１μＭ）の化合物１４の一連の溶液を用いた。細胞電流応答を、各濃度の化合物１４にて測定した。ＩＣ50を決定するために、６つの細胞からの標準化した電流を、各濃度のアンタゴニストにて平均し、平均の標準誤差を各点にて計算した。データを、単一部位競合モデルに適合させて、ＩＣ50を得た。ＩＣ50ホールセルパッチクランプ実験を、飽和（５００μＭ）メントール濃度に対して故意に行った。なぜなら、メントール電流は、Ｃａ2+依存性でなく、再現可能な堅固な電流を与えるからである。同様に、飽和メントールに対する化合物１４の阻害効果を研究することにより、ホールセルパッチクランプ測定においてこれらの条件を用いたその他の公開されたＴＲＰＭ８拮抗作用研究と直接比較ができる。
【0137】
[00163]
インビトロ代謝安定性。化合物１４をＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）により、ＮＡＤＰＨの存在下でマウス肝臓ミクロソームとインキュベートした場合に、０、１０、２０、３０及び６０分にて残存パーセントを決定することにより、マウス肝臓ミクロソームにおける代謝安定性について評価した。化合物１４の半減期（ｔ1/2）及びインビトロ固有クリアランス（ＣＬint）を、対照（テストステロン）に加えて、計算した。
インビトロ代謝安定性。化合物１４をＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）により、ＮＡＤＰＨの存在下でマウス肝臓ミクロソームとインキュベートした場合に、０、１０、２０、３０及び６０分にて残存パーセントを決定することにより、マウス肝臓ミクロソームにおける代謝安定性について評価した。化合物１４の半減期（ｔ1/2）及びインビトロ固有クリアランス（ＣＬint）を、対照（テストステロン）に加えて、計算した。
【0138】
[00164]
結果及び考察
[00165]
（－）－メンチル化合物１及びＡＭＧ２８５０を含む既知のＴＲＰＭ８アンタゴニストについての入手可能な機能的データは、ラット及びヒトＴＲＰＭ８からであり、これについては、まだ解明されていない構造の問題があるが、鳥類のオルソログの構造は、最近、クリオＥＭを用いて解明された。まずこれらの種にわたって配列保存の程度を評価するために、鳥類、ヒト及びラットのＴＲＰＭ８の膜貫通Ｓ１～Ｓ４ヘリックス（ＶＳＬＤ）、Ｓ５～Ｓ６ヘリックス（ポアドメイン）、ポアヘリックス（ＰＨ）及びＴＲＰヘリックスの配列アラインメントを行った（図１２）。上で詳述したように、ＶＳＬＤ及びＴＲＰヘリックス内の残基は、アゴニスト（メントール）結合、アゴニスト（メントール、イシリン）応答又は有効性及び電位感応性のために重要であることが報告されている。興味深いことに、全長鳥類及びヒトＴＲＰＭ８間の高い相同性（８３％）が、リガンド結合部位（８６％）を含むこの膜貫通領域内で保持され、さらに、この同じ領域において鳥類及びラットのオルソログ間で比較的高い配列同一性（８７％）がある（図１２）。鳥類ＴＲＰＭ８構造は、よって、既知のＴＲＰＭ８アンタゴニストである（－）－メンチル化合物１及びＡＭＧ２８５０のもっともらしい結合様式をまず予測し、適当な構造－機能相関を確立する観点から、ｈＴＲＰＭ８のホモロジーモデルを構築するための信頼できる鋳型であると考えられた。後者は、次いで、新規なＴＲＰＭ８アンタゴニストプローブを設計するために構造ベースの方策を与えることができる。
結果及び考察
[00165]
（－）－メンチル化合物１及びＡＭＧ２８５０を含む既知のＴＲＰＭ８アンタゴニストについての入手可能な機能的データは、ラット及びヒトＴＲＰＭ８からであり、これについては、まだ解明されていない構造の問題があるが、鳥類のオルソログの構造は、最近、クリオＥＭを用いて解明された。まずこれらの種にわたって配列保存の程度を評価するために、鳥類、ヒト及びラットのＴＲＰＭ８の膜貫通Ｓ１～Ｓ４ヘリックス（ＶＳＬＤ）、Ｓ５～Ｓ６ヘリックス（ポアドメイン）、ポアヘリックス（ＰＨ）及びＴＲＰヘリックスの配列アラインメントを行った（図１２）。上で詳述したように、ＶＳＬＤ及びＴＲＰヘリックス内の残基は、アゴニスト（メントール）結合、アゴニスト（メントール、イシリン）応答又は有効性及び電位感応性のために重要であることが報告されている。興味深いことに、全長鳥類及びヒトＴＲＰＭ８間の高い相同性（８３％）が、リガンド結合部位（８６％）を含むこの膜貫通領域内で保持され、さらに、この同じ領域において鳥類及びラットのオルソログ間で比較的高い配列同一性（８７％）がある（図１２）。鳥類ＴＲＰＭ８構造は、よって、既知のＴＲＰＭ８アンタゴニストである（－）－メンチル化合物１及びＡＭＧ２８５０のもっともらしい結合様式をまず予測し、適当な構造－機能相関を確立する観点から、ｈＴＲＰＭ８のホモロジーモデルを構築するための信頼できる鋳型であると考えられた。後者は、次いで、新規なＴＲＰＭ８アンタゴニストプローブを設計するために構造ベースの方策を与えることができる。
【0139】
[00166]
実施例１－ＭＤシミュレーション。
[00167]
ｈＴＲＰＭ８の構造は、入手可能でなかった。よって、ｈＴＲＰＭ８のホモロジーモデルをまず、シロエリヒタキ（Ｆｉｃｅｄｕｌａ ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）のクリオＥＭ構造（ＴＲＰＭ８FA、ＰＤＢ：６ＢＰＱ）に基づいて構築し、これは、ｈＴＲＰＭ８と全長ＴＲＰＭ８FAについて８３％と、リガンド結合部位を含む領域において８６％の配列同一性とを有する。ＶＳＬＤ（Ｓ１～Ｓ４ヘリックス、感知ドメイン、ＳＤともいう）及びポアドメイン並びにＴＲＰヘリックスで構成されるＴＲＰＭ８の膜貫通領域に主に焦点を当てて、ｈＴＲＰＭ８のホモロジーモデルを、Ｇｌｎ６７１からＡｓｎ１０１０まで（３４０残基）の配列を用いて構築した。ＶＳＬＤ及びＴＲＰヘリックスは、上で論じたように、小分子アゴニストと結合するが、単離ＶＳＬＤ（プレＳ１ドメインを含む）は、全長ｈＴＲＰＭ８（１１０４残基）の機能的活性化に一致する結合表現型を反復することが報告されている。
実施例１－ＭＤシミュレーション。
[00167]
ｈＴＲＰＭ８の構造は、入手可能でなかった。よって、ｈＴＲＰＭ８のホモロジーモデルをまず、シロエリヒタキ（Ｆｉｃｅｄｕｌａ ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）のクリオＥＭ構造（ＴＲＰＭ８FA、ＰＤＢ：６ＢＰＱ）に基づいて構築し、これは、ｈＴＲＰＭ８と全長ＴＲＰＭ８FAについて８３％と、リガンド結合部位を含む領域において８６％の配列同一性とを有する。ＶＳＬＤ（Ｓ１～Ｓ４ヘリックス、感知ドメイン、ＳＤともいう）及びポアドメイン並びにＴＲＰヘリックスで構成されるＴＲＰＭ８の膜貫通領域に主に焦点を当てて、ｈＴＲＰＭ８のホモロジーモデルを、Ｇｌｎ６７１からＡｓｎ１０１０まで（３４０残基）の配列を用いて構築した。ＶＳＬＤ及びＴＲＰヘリックスは、上で論じたように、小分子アゴニストと結合するが、単離ＶＳＬＤ（プレＳ１ドメインを含む）は、全長ｈＴＲＰＭ８（１１０４残基）の機能的活性化に一致する結合表現型を反復することが報告されている。
【0140】
[00168]
Ｃａ2+イオンを、Ｇｌｕ７８２、Ｇｌｎ７８５、Ａｓｎ７９９及びＡｓｐ８０２に配位させてＶＬＳＤ中に置いて、ヒトモデルが、関連するヒトメラスタチンサブタイプＭ２（ＰＤＢ ６ＭＪ２）及びＭ４（ＰＤＢ ６ＢＱＶ）のクリオＥＭ構造により類似し、かつ活性化剤としてＴＲＰＭ８アゴニストであるイシリンを用いる我々のＣａ2+フラックス研究の構造上の関係を与えるようにした（表１）。これらの構造は、ＶＬＳＤにおいて同様に配向している４つの側鎖（このうち３つはＴＲＰＭ８、ＴＲＰＭ２及びＴＲＰＭ４の間で保存されている）に配位結合するＣａ2+イオンをつかむ：Ｇｌｕ７８２（ＴＲＰＭ８、Ｓ２ヘリックス）／Ｇｌｕ８４３（ＴＲＰＭ２、Ｓ２）／Ｇｌｕ８２８（ＴＲＰＭ４、Ｓ２）；Ｇｌｎ７８５（ＴＲＰＭ８、Ｓ２）／Ｇｌｎ８４６（ＴＲＰＭ２、Ｓ２）／Ｇｌｎ８３１（ＴＲＰＭ４、Ｓ２）；及びＡｓｎ７９９（ＴＲＰＭ８、Ｓ３）／Ａｓｎ８６９（ＴＲＰＭ２、Ｓ３）／Ａｓｎ８６５（ＴＲＰＭ４、Ｓ３）。残りの非保存Ｃａ2+結合残基を考慮して、Ａｓｐ８０２（Ｓ３）を、Ｍ４サブタイプにおけるＡｓｐ８６８（Ｓ３ヘリックス）に対応する、四面体複合体を満足する最終キレートアミノ酸として選択した。特に、Ａｓｎ７９９及びＡｓｐ８０２はともに、公知のイシリン感応性残基である。最近報告されたＴＲＰＭ８のイシリン結合構造（ＰＤＢ ６ＮＲ３、３．４Å）により、本ホモロジーモデルと一致して、今ではよく定義されたＣａ2+結合部位内でこれらの４残基と結合するＣａ2+イオンが明らかになっている。。
Ｃａ2+イオンを、Ｇｌｕ７８２、Ｇｌｎ７８５、Ａｓｎ７９９及びＡｓｐ８０２に配位させてＶＬＳＤ中に置いて、ヒトモデルが、関連するヒトメラスタチンサブタイプＭ２（ＰＤＢ ６ＭＪ２）及びＭ４（ＰＤＢ ６ＢＱＶ）のクリオＥＭ構造により類似し、かつ活性化剤としてＴＲＰＭ８アゴニストであるイシリンを用いる我々のＣａ2+フラックス研究の構造上の関係を与えるようにした（表１）。これらの構造は、ＶＬＳＤにおいて同様に配向している４つの側鎖（このうち３つはＴＲＰＭ８、ＴＲＰＭ２及びＴＲＰＭ４の間で保存されている）に配位結合するＣａ2+イオンをつかむ：Ｇｌｕ７８２（ＴＲＰＭ８、Ｓ２ヘリックス）／Ｇｌｕ８４３（ＴＲＰＭ２、Ｓ２）／Ｇｌｕ８２８（ＴＲＰＭ４、Ｓ２）；Ｇｌｎ７８５（ＴＲＰＭ８、Ｓ２）／Ｇｌｎ８４６（ＴＲＰＭ２、Ｓ２）／Ｇｌｎ８３１（ＴＲＰＭ４、Ｓ２）；及びＡｓｎ７９９（ＴＲＰＭ８、Ｓ３）／Ａｓｎ８６９（ＴＲＰＭ２、Ｓ３）／Ａｓｎ８６５（ＴＲＰＭ４、Ｓ３）。残りの非保存Ｃａ2+結合残基を考慮して、Ａｓｐ８０２（Ｓ３）を、Ｍ４サブタイプにおけるＡｓｐ８６８（Ｓ３ヘリックス）に対応する、四面体複合体を満足する最終キレートアミノ酸として選択した。特に、Ａｓｎ７９９及びＡｓｐ８０２はともに、公知のイシリン感応性残基である。最近報告されたＴＲＰＭ８のイシリン結合構造（ＰＤＢ ６ＮＲ３、３．４Å）により、本ホモロジーモデルと一致して、今ではよく定義されたＣａ2+結合部位内でこれらの４残基と結合するＣａ2+イオンが明らかになっている。。
【0141】
[00169]
続いて、（－）－メンチル化合物１、ＡＭＧ２８５０及び化合物１４を、ｈＴＲＰＭ８のリガンド結合部位にドッキングさせ、ｈＴＲＰＭ８内で各化合物について１００ｎｓ分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを行い、以下に詳述するようにして結果を分析した。Ｃａ2+フラックスアッセイにおいてラットＴＲＰＭ８にて効力が高く選択的なＴＲＰＭ８アンタゴニストと記載された（－）－メンチル１（ＩＣ50対２０μＭメントール、２０±２ｎＭ；ＩＣ50対０．２５μＭイシリン、５０±１０ｎＭ）は、ＡＭＧ２８５０とともに、ＴＲＰＭ８ツール分子（ＯＭＤＭ２３３とも記載する）として文献で現在用いられている。
続いて、（－）－メンチル化合物１、ＡＭＧ２８５０及び化合物１４を、ｈＴＲＰＭ８のリガンド結合部位にドッキングさせ、ｈＴＲＰＭ８内で各化合物について１００ｎｓ分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを行い、以下に詳述するようにして結果を分析した。Ｃａ2+フラックスアッセイにおいてラットＴＲＰＭ８にて効力が高く選択的なＴＲＰＭ８アンタゴニストと記載された（－）－メンチル１（ＩＣ50対２０μＭメントール、２０±２ｎＭ；ＩＣ50対０．２５μＭイシリン、５０±１０ｎＭ）は、ＡＭＧ２８５０とともに、ＴＲＰＭ８ツール分子（ＯＭＤＭ２３３とも記載する）として文献で現在用いられている。
【0142】
[00170]
実施例２－（－）－メンチル化合物１及びｈＴＲＰＭ８。
[00171]
図２Ｃに示すように、結果は、ｈＴＲＰＭ８（約３．９Å）及び（－）－メンチル化合物１（１．８Å）の標準偏差（ＲＭＳＤ）がともに、シミュレーション中の５０ｎｓ後に安定に保持されたことを示し、このことは、１００ｎｓの時間尺度が適切であることを示した。
実施例２－（－）－メンチル化合物１及びｈＴＲＰＭ８。
[00171]
図２Ｃに示すように、結果は、ｈＴＲＰＭ８（約３．９Å）及び（－）－メンチル化合物１（１．８Å）の標準偏差（ＲＭＳＤ）がともに、シミュレーション中の５０ｎｓ後に安定に保持されたことを示し、このことは、１００ｎｓの時間尺度が適切であることを示した。
【0143】
[00172]
拡張立体配座中の結合キャビティの底へＴＲＰヘリックスに向かって突き出る化合物１のビフェニルは、ＭＤシミュレーション中安定に保持されたが、これは、図２Ｂに示すように、Ａｓｎ７４１（Ｓ１、約４．０Å、示さず）及びＶａｌ８４９（Ｓ４、４．４Å）と強い疎水性相互作用を形成し、ＷＳ－１２の対応するメトキシフェニルと同様の空間を占める。このポーズは、この足場についてのＳＡＲ研究と一貫しており、ここで、ビフェニル置換は、研究した全てのアナログのうちで最高のＴＲＰＭ８効力をもたらす。
拡張立体配座中の結合キャビティの底へＴＲＰヘリックスに向かって突き出る化合物１のビフェニルは、ＭＤシミュレーション中安定に保持されたが、これは、図２Ｂに示すように、Ａｓｎ７４１（Ｓ１、約４．０Å、示さず）及びＶａｌ８４９（Ｓ４、４．４Å）と強い疎水性相互作用を形成し、ＷＳ－１２の対応するメトキシフェニルと同様の空間を占める。このポーズは、この足場についてのＳＡＲ研究と一貫しており、ここで、ビフェニル置換は、研究した全てのアナログのうちで最高のＴＲＰＭ８効力をもたらす。
【0144】
[00173]
ビフェニル部分とは対照的に、化合物１の可動性部分である、（－）－メンチル部分は、その結合様式をプレＭＤ（図２Ａ）とポストＭＤ（図２Ｂ）の間で比較した場合に、ＭＤシミュレーション中の立体配座の変化に耐えることが見いだされた。しかし、化合物１といくらかの残基との間の相互作用は、ＭＤ中に観察できる。例えば、化合物１の（－）－メンチルは、保存されたＡｒｇ１００８（ＴＲＰヘリックス、３．５Å、示さず）（図２Ｂ）と相互作用し、このことから、ＷＳ－１２が結合した構造で見られるものと同様の折り畳まれた立体配座が想定され、小分子リガンドについての一般的なＴＲＰＭ８結合残基を表し得る。化合物１の結合に対するこれらの残基の寄与を探索するために、ＭＭ／ＧＢＳＡ法を用いて、図２Ｄに示すようにして、自由エネルギーを分解した。エネルギー分解から、Ａｒｇ１００８が、化合物１の結合に大きく寄与したことが見いだされた。化合物１とＡｒｇ８４２（Ｓ４）との間の距離は約３．９Åであったが、（－）－メンチル部分は、ＭＤシミュレーション中に、保存されたＬｅｕ７７８（Ｓ２、約３．８Å、示さず）に近づき（図２Ｂ）、それぞれＷＳ－１２及びイシリンの（－）－メンチル及びニトロフェニル結合領域と重複し、結合自由エネルギーへのＡｒｇ８４２の寄与が、Ｌｅｕ７７８よりも小さくなる。結果は、ＭＭ／ＧＢＳＡ法を用いた自由エネルギー分解のものと一貫している（図２Ｄ）。興味深いことに、（－）－メンチル基は、放射性リガンド置換研究により（－）－メントールについて示唆されたように、おそらくビフェニルの係留する性質のために、オルソステリック部位の底と広い疎水性相互作用を形成するＷＳ－１２結合構造と同様に、Ｔｙｒ７４５（Ｓ１）と接触しない。ここでの研究は、現在までに記載されたＴＲＰＭ８構造生物学を用いるメントールベースのアンタゴニスト媒介分子事象の研究に向けて最初の進出をもたらす。
ビフェニル部分とは対照的に、化合物１の可動性部分である、（－）－メンチル部分は、その結合様式をプレＭＤ（図２Ａ）とポストＭＤ（図２Ｂ）の間で比較した場合に、ＭＤシミュレーション中の立体配座の変化に耐えることが見いだされた。しかし、化合物１といくらかの残基との間の相互作用は、ＭＤ中に観察できる。例えば、化合物１の（－）－メンチルは、保存されたＡｒｇ１００８（ＴＲＰヘリックス、３．５Å、示さず）（図２Ｂ）と相互作用し、このことから、ＷＳ－１２が結合した構造で見られるものと同様の折り畳まれた立体配座が想定され、小分子リガンドについての一般的なＴＲＰＭ８結合残基を表し得る。化合物１の結合に対するこれらの残基の寄与を探索するために、ＭＭ／ＧＢＳＡ法を用いて、図２Ｄに示すようにして、自由エネルギーを分解した。エネルギー分解から、Ａｒｇ１００８が、化合物１の結合に大きく寄与したことが見いだされた。化合物１とＡｒｇ８４２（Ｓ４）との間の距離は約３．９Åであったが、（－）－メンチル部分は、ＭＤシミュレーション中に、保存されたＬｅｕ７７８（Ｓ２、約３．８Å、示さず）に近づき（図２Ｂ）、それぞれＷＳ－１２及びイシリンの（－）－メンチル及びニトロフェニル結合領域と重複し、結合自由エネルギーへのＡｒｇ８４２の寄与が、Ｌｅｕ７７８よりも小さくなる。結果は、ＭＭ／ＧＢＳＡ法を用いた自由エネルギー分解のものと一貫している（図２Ｄ）。興味深いことに、（－）－メンチル基は、放射性リガンド置換研究により（－）－メントールについて示唆されたように、おそらくビフェニルの係留する性質のために、オルソステリック部位の底と広い疎水性相互作用を形成するＷＳ－１２結合構造と同様に、Ｔｙｒ７４５（Ｓ１）と接触しない。ここでの研究は、現在までに記載されたＴＲＰＭ８構造生物学を用いるメントールベースのアンタゴニスト媒介分子事象の研究に向けて最初の進出をもたらす。
【0145】
[00174]
実施例３－ＡＭＧ２８５０及びｈＴＲＰＭ８。
[00175]
１００ｎｓ ＭＤシミュレーションを、ＡＭＧ２８５０とｈＴＲＰＭ８に対しても行った。図３Ｃに示すように、ｈＴＲＰＭ８のＲＭＳＤは６０ｎｓ後に平衡に達する（約４．４Å）ことが見いだされた。ＡＭＧ２８５０のＲＭＳＤは、１．６Åにて一定に保持された（図３Ｃ）。ＡＭＧ２８５０の安定性のために、その可能性のある結合様式を探索するために１００ｎｓの時間尺度は妥当であった。ＡＭＧ２８５０の結合様式をプレＭＤ（図３Ａ）とポストＭＤ（図３Ｂ）との間で比較すると、ＡＭＧ２８５０とｈＴＲＰＭ８との間のいくつかの重要な相互作用が安定に保持されたことがわかった。例えば、保存されたＡｒｇ８４２（Ｓ４）は、ＷＳ－１２アミドカルボニル及びイシリンのジヒドロピリミジノンカルボニルと同様に、ＡＭＧ２８５０の尿素カルボニル（３．１／３．０Å）と強い水素結合を形成し、このことは、この共通残基によるＴＲＰＭ８リガンド認識についての共通のＨ結合アクセプターの特徴を示唆する。この予測される相互作用と一貫して、テトラヒドロチエノピリジンコアを含むＡＭＧ２８５０前駆体シリーズのＳＡＲ研究は、尿素部分の重要性を強調し、この基を欠失させると、ＴＲＰＭ８活性が打ち消される（Ｔａｍａｙｏらにより報告される誘導体２４～２６）。ＭＤの結果は、保存されたＴｒｐ７９８（Ｓ３）が、テトラヒドロチエノピリジン前駆体シリーズのＳＡＲ研究と一致して、ＡＭＧ２８５０のトリフルオロフェニルＣＦ3基と３．２Åの距離で水素結合を形成することも示し、ここで、４－ＣＦ3は、最適な機能的及び薬物動態学的特性を与える。興味深いことに、ＡＭＧ２８５０の関連するテトラヒドロイソキノリンアナログの不活性Ｓエナンチオマーは、このトリフルオロフェニルをＴｒｐ７９８から遠ざかる反対の方向に位置させるが、対応するＲエナンチオマーは、ＴＲＰＭ８ ＩＣ50：５６±２４ｎＭを有することが報告されている（Ｔａｍａｙｏらにより報告される誘導体８７～８８）。さらに、Ｌｅｕ８４１（Ｓ４）（距離：４．２Å、示さず）及びＡｒｇ８４２の主鎖（距離：３．３Å、示さず）は、ＡＭＧ２８５０のトリフルオロフェニルＣＦ3基と疎水性相互作用により相互作用する。Ｔｙｒ１００５（保存された残基、ＴＲＰヘリックス）は、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，７－ナフチリジンと、４．４Åの距離で強い疎水性相互作用を形成する。この残基（ＴＲＰＭ８FA中のＴｙｒ１００４）は、イシリンニトロ基及びＷＳ－１２アミド窒素と水素結合し、このことは、メントールの機能的研究と一致して、別の共通ＴＲＰＭ８結合残基を示唆する。ここでもまた、この相互作用は、このシリーズのＳＡＲデータと一貫しており、このことは、イオンチャネルとアザテトラヒドロキノリンとの間の疎水性相互作用の重要性を示唆する。芳香環の除去、ピペリジンを１炭素延長すること（アゼピンへ）及び８位でのメチル置換による立体配座拘束を含む改変は、ＴＲＰＭ８活性の著しい喪失又は打ち消しをもたらし（Ｈｏｒｎｅら及びＴａｍａｙｏらにより報告される誘導体３２、７２及び８６）、これは、この疎水性相互作用を妨げる可能性がある。あるいは、これらのアナログは、ＡＭＧ２８５０のＡｒｇ８４２と尿素カルボニルとの間の水素結合を破壊する可能性があり、ＴＲＰＭ８活性の劇的な喪失をもたらし得る。
実施例３－ＡＭＧ２８５０及びｈＴＲＰＭ８。
[00175]
１００ｎｓ ＭＤシミュレーションを、ＡＭＧ２８５０とｈＴＲＰＭ８に対しても行った。図３Ｃに示すように、ｈＴＲＰＭ８のＲＭＳＤは６０ｎｓ後に平衡に達する（約４．４Å）ことが見いだされた。ＡＭＧ２８５０のＲＭＳＤは、１．６Åにて一定に保持された（図３Ｃ）。ＡＭＧ２８５０の安定性のために、その可能性のある結合様式を探索するために１００ｎｓの時間尺度は妥当であった。ＡＭＧ２８５０の結合様式をプレＭＤ（図３Ａ）とポストＭＤ（図３Ｂ）との間で比較すると、ＡＭＧ２８５０とｈＴＲＰＭ８との間のいくつかの重要な相互作用が安定に保持されたことがわかった。例えば、保存されたＡｒｇ８４２（Ｓ４）は、ＷＳ－１２アミドカルボニル及びイシリンのジヒドロピリミジノンカルボニルと同様に、ＡＭＧ２８５０の尿素カルボニル（３．１／３．０Å）と強い水素結合を形成し、このことは、この共通残基によるＴＲＰＭ８リガンド認識についての共通のＨ結合アクセプターの特徴を示唆する。この予測される相互作用と一貫して、テトラヒドロチエノピリジンコアを含むＡＭＧ２８５０前駆体シリーズのＳＡＲ研究は、尿素部分の重要性を強調し、この基を欠失させると、ＴＲＰＭ８活性が打ち消される（Ｔａｍａｙｏらにより報告される誘導体２４～２６）。ＭＤの結果は、保存されたＴｒｐ７９８（Ｓ３）が、テトラヒドロチエノピリジン前駆体シリーズのＳＡＲ研究と一致して、ＡＭＧ２８５０のトリフルオロフェニルＣＦ3基と３．２Åの距離で水素結合を形成することも示し、ここで、４－ＣＦ3は、最適な機能的及び薬物動態学的特性を与える。興味深いことに、ＡＭＧ２８５０の関連するテトラヒドロイソキノリンアナログの不活性Ｓエナンチオマーは、このトリフルオロフェニルをＴｒｐ７９８から遠ざかる反対の方向に位置させるが、対応するＲエナンチオマーは、ＴＲＰＭ８ ＩＣ50：５６±２４ｎＭを有することが報告されている（Ｔａｍａｙｏらにより報告される誘導体８７～８８）。さらに、Ｌｅｕ８４１（Ｓ４）（距離：４．２Å、示さず）及びＡｒｇ８４２の主鎖（距離：３．３Å、示さず）は、ＡＭＧ２８５０のトリフルオロフェニルＣＦ3基と疎水性相互作用により相互作用する。Ｔｙｒ１００５（保存された残基、ＴＲＰヘリックス）は、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，７－ナフチリジンと、４．４Åの距離で強い疎水性相互作用を形成する。この残基（ＴＲＰＭ８FA中のＴｙｒ１００４）は、イシリンニトロ基及びＷＳ－１２アミド窒素と水素結合し、このことは、メントールの機能的研究と一致して、別の共通ＴＲＰＭ８結合残基を示唆する。ここでもまた、この相互作用は、このシリーズのＳＡＲデータと一貫しており、このことは、イオンチャネルとアザテトラヒドロキノリンとの間の疎水性相互作用の重要性を示唆する。芳香環の除去、ピペリジンを１炭素延長すること（アゼピンへ）及び８位でのメチル置換による立体配座拘束を含む改変は、ＴＲＰＭ８活性の著しい喪失又は打ち消しをもたらし（Ｈｏｒｎｅら及びＴａｍａｙｏらにより報告される誘導体３２、７２及び８６）、これは、この疎水性相互作用を妨げる可能性がある。あるいは、これらのアナログは、ＡＭＧ２８５０のＡｒｇ８４２と尿素カルボニルとの間の水素結合を破壊する可能性があり、ＴＲＰＭ８活性の劇的な喪失をもたらし得る。
【0146】
[00176]
分子の反対側では、Ａｓｐ７８１（Ｓ２）が、トリフルオロプロパニルＣＦ3と３．４Åの距離で水素結合により相互作用することが観察された。以前に論じた相互作用と同様に、この相互作用は、アザテトラヒドロキノリノン及びテトラヒドロイソキノリン足場に対するこの領域のＳＡＲ研究と一貫しており、ここでは、トリフルオロプロパニル基が、高いＴＲＰＭ８効力をもたらす。Ａｒｇ８４２及びＴｒｐ７９８との水素結合相互作用と一緒に、これらは、ＡＭＧ２８５０をＴ形の立体配座に配向させ、分子の両端は、ＶＳＬＤポケットの上部にまたがり、これは、（－）－メンチル化合物１で見られる広い立体配座と対照的である。他方、ＡＭＧ２８５０のアザテトラヒドロキノリン環は、化合物１のビフェニルと同様に、ＴＲＰヘリックスに向かってキャビティに深く貫通する。さらに、Ｌｅｕ７７８が、化合物１の（－）－メンチルと同様に、トリフルオロプロパニルＣＦ3と３．６Åの距離で（示さず）強い疎水性相互作用を形成することが観察された。これらの結果は、ＭＭ／ＧＢＳＡ法（図３Ｄ）を用いる自由エネルギー分解のものと一貫していた。
分子の反対側では、Ａｓｐ７８１（Ｓ２）が、トリフルオロプロパニルＣＦ3と３．４Åの距離で水素結合により相互作用することが観察された。以前に論じた相互作用と同様に、この相互作用は、アザテトラヒドロキノリノン及びテトラヒドロイソキノリン足場に対するこの領域のＳＡＲ研究と一貫しており、ここでは、トリフルオロプロパニル基が、高いＴＲＰＭ８効力をもたらす。Ａｒｇ８４２及びＴｒｐ７９８との水素結合相互作用と一緒に、これらは、ＡＭＧ２８５０をＴ形の立体配座に配向させ、分子の両端は、ＶＳＬＤポケットの上部にまたがり、これは、（－）－メンチル化合物１で見られる広い立体配座と対照的である。他方、ＡＭＧ２８５０のアザテトラヒドロキノリン環は、化合物１のビフェニルと同様に、ＴＲＰヘリックスに向かってキャビティに深く貫通する。さらに、Ｌｅｕ７７８が、化合物１の（－）－メンチルと同様に、トリフルオロプロパニルＣＦ3と３．６Åの距離で（示さず）強い疎水性相互作用を形成することが観察された。これらの結果は、ＭＭ／ＧＢＳＡ法（図３Ｄ）を用いる自由エネルギー分解のものと一貫していた。
【0147】
[00177]
特に、ＭＤ研究から、研究した２つのアンタゴニストとＣａ2+結合残基との間の直接の相互作用は見いだされず、このことは、これらがアンタゴニストとして機能する能力の構造に基づく説明の可能性を指し示し得る。相互作用は、ＡＭＧ２８５０とＡｒｇ８４２との間で観察され、このことは、ヒトＴＲＰＭ４構造において観察されたこと（対応するＴＲＰＭ４残基は、Ａｒｇ９０５及びＡｓｐ８６８である）と同様に、ヒトＴＲＰＭ８におけるＡｓｐ８０２による四面体Ｃａ2+複合体を理論的に補強し得る。Ａｒｇ８４２とのこのような相互作用は、結合したＣａ2+を不安定化するために働く可能性があり、チャネル阻害がもたらされる。他方、ＴＲＰＭ８FA（鳥類）構造は、対応する残基Ａｒｇ８４１がＣａ2+結合残基と相互作用することを示さず、代わりに、イシリンカルボニルと直接相互作用を形成する。
特に、ＭＤ研究から、研究した２つのアンタゴニストとＣａ2+結合残基との間の直接の相互作用は見いだされず、このことは、これらがアンタゴニストとして機能する能力の構造に基づく説明の可能性を指し示し得る。相互作用は、ＡＭＧ２８５０とＡｒｇ８４２との間で観察され、このことは、ヒトＴＲＰＭ４構造において観察されたこと（対応するＴＲＰＭ４残基は、Ａｒｇ９０５及びＡｓｐ８６８である）と同様に、ヒトＴＲＰＭ８におけるＡｓｐ８０２による四面体Ｃａ2+複合体を理論的に補強し得る。Ａｒｇ８４２とのこのような相互作用は、結合したＣａ2+を不安定化するために働く可能性があり、チャネル阻害がもたらされる。他方、ＴＲＰＭ８FA（鳥類）構造は、対応する残基Ａｒｇ８４１がＣａ2+結合残基と相互作用することを示さず、代わりに、イシリンカルボニルと直接相互作用を形成する。
【0148】
[00178]
実施例４－構造ベースの設計。
[00179]
ＭＤシミュレーションからのＡＭＧ２８５０及び（－）－メンチル化合物１の予測結合様式を重ね合わせることにより、Ｓ２及びＴＲＰヘリックス中のＶＳＬＤ内で疎水性ポケットを形成するいくつかの重要な残基を観察した（図４）。Ｌｅｕ７７８（Ｓ２）は、化合物１及びＡＭＧ２８５０の（－）－メンチル及びトリフルオロプロパニル基の両方と相互作用する。同じ近傍で、Ａｒｇ１００８（ＴＲＰヘリックス）は（）－メンチル基と鍵となる疎水性相互作用を形成する。これらの相互作用は、上記の基がＶＳＬＤ中で重なり合うことを可能にし、化合物１足場を他の親油性基、例えばコアシクロヘキシル環、二及び三環式環、芳香族含有基及びスピロ置換二環の環拡大アナログで置換できることを示唆する。
実施例４－構造ベースの設計。
[00179]
ＭＤシミュレーションからのＡＭＧ２８５０及び（－）－メンチル化合物１の予測結合様式を重ね合わせることにより、Ｓ２及びＴＲＰヘリックス中のＶＳＬＤ内で疎水性ポケットを形成するいくつかの重要な残基を観察した（図４）。Ｌｅｕ７７８（Ｓ２）は、化合物１及びＡＭＧ２８５０の（－）－メンチル及びトリフルオロプロパニル基の両方と相互作用する。同じ近傍で、Ａｒｇ１００８（ＴＲＰヘリックス）は（）－メンチル基と鍵となる疎水性相互作用を形成する。これらの相互作用は、上記の基がＶＳＬＤ中で重なり合うことを可能にし、化合物１足場を他の親油性基、例えばコアシクロヘキシル環、二及び三環式環、芳香族含有基及びスピロ置換二環の環拡大アナログで置換できることを示唆する。
【0149】
[00180]
これらの置換は、レシオメトリックＣａ2+イメージング（代表的な実験を図５に示し、対応するヒストグラムを図１５に示す）によりヒトＴＲＰＭ８にて化合物１足場に対して、ビフェニルを維持しながら（なぜならこれは、以前のＳＡＲ研究から、効力のあるＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性のための最適置換であったからである）、探索した。このために、化合物１の（－）－メンチル部分の様々な親油性置換を、以下のスキーム１に示すように、商業的に入手可能な置換アミン及び［１，１’－ビフェニル］－４－カルボン酸Ｉ－１の標準的ＥＤＣＩ／ＨＯＢｔ媒介アミド化により調製した。
これらの置換は、レシオメトリックＣａ2+イメージング（代表的な実験を図５に示し、対応するヒストグラムを図１５に示す）によりヒトＴＲＰＭ８にて化合物１足場に対して、ビフェニルを維持しながら（なぜならこれは、以前のＳＡＲ研究から、効力のあるＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性のための最適置換であったからである）、探索した。このために、化合物１の（－）－メンチル部分の様々な親油性置換を、以下のスキーム１に示すように、商業的に入手可能な置換アミン及び［１，１’－ビフェニル］－４－カルボン酸Ｉ－１の標準的ＥＤＣＩ／ＨＯＢｔ媒介アミド化により調製した。
【0150】
【化33】
【0151】
[00181]
実施例５－（－）－メンチル化合物１の構造活性相関（ＳＡＲ）分析。
[00182]
このアッセイにおけるプロトタイプイシリンの用量応答研究は、Ｃａ2+流入を７４±３ｎＭのＥＣ50にて誘導し（図１３）、１２０～２００ｎＭの範囲内にある以前に報告された値よりも効力があるように見受けられるが、これは、細胞種（ＣＨＯ対ＨＥＫ細胞）又はイシリン感応性における種依存性変動（ヒト対マウス）における違いによる可能性が大きい。本研究において、イシリン誘発Ｃａ2+シグナルは、５００ｎＭにてプラトーに達し始めた。ＲＱ－００２０３０７８を、その効力のあるＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性のために、ＳＡＲ研究のための陽性対照及び参照標準物質として用いた。アッセイにおいて、ＲＱ－００２０３０７８は、イシリン誘発Ｃａ2+シグナルを、２．９６±０．９９ｎＭのＩＣ50にて阻害し（図１６）、これは、ｈＴＲＰＭ８を発現するＨＥＫ細胞における３０μＭメントール誘発Ｃａ2+流入に対して以前に報告された値（約８ｎＭ）よりも低い。
実施例５－（－）－メンチル化合物１の構造活性相関（ＳＡＲ）分析。
[00182]
このアッセイにおけるプロトタイプイシリンの用量応答研究は、Ｃａ2+流入を７４±３ｎＭのＥＣ50にて誘導し（図１３）、１２０～２００ｎＭの範囲内にある以前に報告された値よりも効力があるように見受けられるが、これは、細胞種（ＣＨＯ対ＨＥＫ細胞）又はイシリン感応性における種依存性変動（ヒト対マウス）における違いによる可能性が大きい。本研究において、イシリン誘発Ｃａ2+シグナルは、５００ｎＭにてプラトーに達し始めた。ＲＱ－００２０３０７８を、その効力のあるＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性のために、ＳＡＲ研究のための陽性対照及び参照標準物質として用いた。アッセイにおいて、ＲＱ－００２０３０７８は、イシリン誘発Ｃａ2+シグナルを、２．９６±０．９９ｎＭのＩＣ50にて阻害し（図１６）、これは、ｈＴＲＰＭ８を発現するＨＥＫ細胞における３０μＭメントール誘発Ｃａ2+流入に対して以前に報告された値（約８ｎＭ）よりも低い。
【0152】
[00183]
ここで合成した化合物について、ＩＣ50値を表１に示し、イシリンで刺激されたＣａ2+流入の最大阻害の半分を生じるために必要な濃度として表した。（－）－メンチル化合物１も、以前に報告された方法を用いて再合成して、カルシウムフラックスアッセイにおけるｒＴＲＰＭ８での効力のあるアンタゴニスト活性（２０μＭメントールに対するＩＣ50、２０±２ｎＭ；０．２５μＭメントールに対するＩＣ50、５０±１０ｎＭ）並びにｈＴＲＰＶ１及びｒＴＲＰＡ１での弱い固有（アゴニスト）活性のために、ｈＴＲＰＭ８での生化学的アッセイについての追加の標準物質として用いた。興味深いことに、化合物１は、ヒトＴＲＰＭ８でトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３細胞におけるアッセイにおいて、効力が劇的に低減した（１６±１μＭのＩＣ50）（表１）。ヒト対ラットのＴＲＰＭ８でのカルシウムフラックスアッセイにおいて観察されたＩＣ50値の違いは、この化合物についてのＴＲＰＭ８オルソログのうちでの種の違いを示唆する。高い配列保存にもかかわらず、異なるＴＲＰＭ８オルソログ間で種の違いが存在することが知られている。ｒＴＲＰＭ８での追加の研究を、このシリーズの全てのアナログに対して行って、同様の効力のシフトが観察されるかを決定することができるであろう。ヒトＴＲＰＭ８は、ラットオルソログと、ＶＳＬＤドメイン、ポアドメイン及びＴＲＰヘリックス（残基７３４～１００９、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａにより計算、データは示さず）における９６％配列同一性を有して、相同性が高いが，少数の異なるアミノ酸残基があり、カルシウムフラックスアッセイにおけるこれらのオルソログ間で見られる不一致の原因である可能性がある。ＴＲＰヘリックス中の１００７位のこのような残基の一つは、結合ポケット中にある（ｈＴＲＰＭ８にてセリン、ｒＴＲＰＭ８にてアスパラギン）。１をさらに特徴決定するための研究が進んでおり、そのうち報告される。
ここで合成した化合物について、ＩＣ50値を表１に示し、イシリンで刺激されたＣａ2+流入の最大阻害の半分を生じるために必要な濃度として表した。（－）－メンチル化合物１も、以前に報告された方法を用いて再合成して、カルシウムフラックスアッセイにおけるｒＴＲＰＭ８での効力のあるアンタゴニスト活性（２０μＭメントールに対するＩＣ50、２０±２ｎＭ；０．２５μＭメントールに対するＩＣ50、５０±１０ｎＭ）並びにｈＴＲＰＶ１及びｒＴＲＰＡ１での弱い固有（アゴニスト）活性のために、ｈＴＲＰＭ８での生化学的アッセイについての追加の標準物質として用いた。興味深いことに、化合物１は、ヒトＴＲＰＭ８でトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３細胞におけるアッセイにおいて、効力が劇的に低減した（１６±１μＭのＩＣ50）（表１）。ヒト対ラットのＴＲＰＭ８でのカルシウムフラックスアッセイにおいて観察されたＩＣ50値の違いは、この化合物についてのＴＲＰＭ８オルソログのうちでの種の違いを示唆する。高い配列保存にもかかわらず、異なるＴＲＰＭ８オルソログ間で種の違いが存在することが知られている。ｒＴＲＰＭ８での追加の研究を、このシリーズの全てのアナログに対して行って、同様の効力のシフトが観察されるかを決定することができるであろう。ヒトＴＲＰＭ８は、ラットオルソログと、ＶＳＬＤドメイン、ポアドメイン及びＴＲＰヘリックス（残基７３４～１００９、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａにより計算、データは示さず）における９６％配列同一性を有して、相同性が高いが，少数の異なるアミノ酸残基があり、カルシウムフラックスアッセイにおけるこれらのオルソログ間で見られる不一致の原因である可能性がある。ＴＲＰヘリックス中の１００７位のこのような残基の一つは、結合ポケット中にある（ｈＴＲＰＭ８にてセリン、ｒＴＲＰＭ８にてアスパラギン）。１をさらに特徴決定するための研究が進んでおり、そのうち報告される。
【0153】
[00184]
化合物１のキラリティーを除いて異性体混合物化合物２を得ることにより、化合物１に比べてここに記載するアッセイ（ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50：４６８±１ｎＭ）におけるｈＴＲＰＭ８活性が３０倍増加し（表１）、このことは、混合物が、Ｃ１、Ｃ２及びＣ５位にて化合物１よりも最適な立体化学的配置を有する異性体を含むことを示す。メントール異性体混合物化合物２に比べて、Ｃ５メチル及びＣ２イソプロピル基の除去（化合物３でのような）並びにコアシクロヘキシル環の立体配座拘束（化合物４でのような）は、μＭ範囲でのＴＲＰＭ８効力の低減をもたらし、このことは、（－）－メンチル足場全体及びシクロヘキシル間の立体配座の可動性を強調し、我々のＭＤ研究により示唆されるように、Ｌｅｕ７７８及びＡｒｇ１００８との疎水性相互作用を置き換える可能性がある。
化合物１のキラリティーを除いて異性体混合物化合物２を得ることにより、化合物１に比べてここに記載するアッセイ（ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50：４６８±１ｎＭ）におけるｈＴＲＰＭ８活性が３０倍増加し（表１）、このことは、混合物が、Ｃ１、Ｃ２及びＣ５位にて化合物１よりも最適な立体化学的配置を有する異性体を含むことを示す。メントール異性体混合物化合物２に比べて、Ｃ５メチル及びＣ２イソプロピル基の除去（化合物３でのような）並びにコアシクロヘキシル環の立体配座拘束（化合物４でのような）は、μＭ範囲でのＴＲＰＭ８効力の低減をもたらし、このことは、（－）－メンチル足場全体及びシクロヘキシル間の立体配座の可動性を強調し、我々のＭＤ研究により示唆されるように、Ｌｅｕ７７８及びＡｒｇ１００８との疎水性相互作用を置き換える可能性がある。
【0154】
表１．ｈＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞での細胞Ｃａ2+フラックスアッセイにより決定し、３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして表す、ｎＭでの化合物のＩＣ50値。ＩＣ50は、イシリン誘発Ｃａ2+侵入の５０％を阻害する化合物の濃度と定義される。
【表3-1】
【0155】
【表3-2】
【0156】
[00185]
他方、環拡大アナログ（シクロヘプチル化合物５及びシクロオクチル化合物７）は、ｈＴＲＰＭ８効力を化合物２に対して８～９倍改善し、ＩＣ50値はそれぞれ５２±１ｎＭ及び６２±１ｎＭであり、このことは、ポケット中に追加の相互作用を捕捉する能力を示唆する。これらの結果を合理的に解釈するために、化合物５と７をｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルにおいてドッキングした（図６）。両方の化合物について、ビフェニル環は、化合物１と同様に、Ｓ１及びＳ４ヘリックスとＴＲＰヘリックスとの間にあった。両方のアナログのビフェニル環は、Ｐｈｅ７３８（保存された、Ｓ１、３．５／３．７Å）、Ｌｅｕ１００１（保存された、ＴＲＰヘリックス、３．７／３．７Å）並びにメントール－及びイシリン感応性Ｔｙｒ１００５（保存された、ＴＲＰヘリックス、４．０／４．０Å）に加えて、Ｖａｌ８４９（保存された、Ｓ４、３．８／３．８Å）と強い疎水性相互作用を形成し、これは、化合物１ビフェニルについて見られるのと同じ相互作用である。１－フェニル基は、Ｐｈｅ７３８及びＴｙｒ１００５の両方とＴ型（edge-to-face）π－πスタッキングを形成する。これらの追加の相互作用は、化合物１に対して、Ｃａ2+フラックスアッセイにおけるこれらのアナログの効力の増進に寄与している可能性がある。興味深いことに、ＡＭＧ２８５０の５，６，７，８－テトラヒドロ－１，７－ナフチリジンは、化合物１の１－フェニルと同じ近傍（図４）において、Ｔｙｒ１００５と疎水性接触を形成する（図３）。このことは、共通の小分子結合残基としてのＴｙｒ１００５の概念を補強する。化合物５及び７のアミドＮＨ及びカルボニルＯはともに、Ａｒｇ１００８（保存された、ＴＲＰヘリックス）と強い水素結合相互作用で相互作用し、この残基が、（－）－メンチル部分と疎水性接触を形成しているだけの化合物１において見られるものに対して、その効力のある機能的活性を駆動している可能性がある。これらの結果は、Ａｒｇ１００８が、化合物１及びそのアナログの両方の認識のための鍵となる残基であることを示唆する。さらに、両方のリガンドのシクロヘプチル及びシクロオクチル部分は、類似の疎水性相互作用で、Ｌｅｕ７７８及びＡｒｇ１００８に対してＶＳＬＤの反対側にある電位及びイシリン感応性Ａｒｇ８４２（保存された、Ｓ４、４．２／４．０Å）、イシリン感応性Ｈｉｓ８４５（保存された、Ｓ４、３．７／４．０Å）及びＩｌｅ８４６（保存された、Ｓ４、３．６／３．５Å）を含む３つの残基に近づいた。まとめて、これらの結果は、オルソステリック部位が、化合物１において見られるものよりも大きい疎水性置換を、上記のいくつかの他の親油性残基で、受け入れることができるが、ビフェニルは、キャビティの床に向かって係留相互作用を提供することを示唆する。
他方、環拡大アナログ（シクロヘプチル化合物５及びシクロオクチル化合物７）は、ｈＴＲＰＭ８効力を化合物２に対して８～９倍改善し、ＩＣ50値はそれぞれ５２±１ｎＭ及び６２±１ｎＭであり、このことは、ポケット中に追加の相互作用を捕捉する能力を示唆する。これらの結果を合理的に解釈するために、化合物５と７をｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルにおいてドッキングした（図６）。両方の化合物について、ビフェニル環は、化合物１と同様に、Ｓ１及びＳ４ヘリックスとＴＲＰヘリックスとの間にあった。両方のアナログのビフェニル環は、Ｐｈｅ７３８（保存された、Ｓ１、３．５／３．７Å）、Ｌｅｕ１００１（保存された、ＴＲＰヘリックス、３．７／３．７Å）並びにメントール－及びイシリン感応性Ｔｙｒ１００５（保存された、ＴＲＰヘリックス、４．０／４．０Å）に加えて、Ｖａｌ８４９（保存された、Ｓ４、３．８／３．８Å）と強い疎水性相互作用を形成し、これは、化合物１ビフェニルについて見られるのと同じ相互作用である。１－フェニル基は、Ｐｈｅ７３８及びＴｙｒ１００５の両方とＴ型（edge-to-face）π－πスタッキングを形成する。これらの追加の相互作用は、化合物１に対して、Ｃａ2+フラックスアッセイにおけるこれらのアナログの効力の増進に寄与している可能性がある。興味深いことに、ＡＭＧ２８５０の５，６，７，８－テトラヒドロ－１，７－ナフチリジンは、化合物１の１－フェニルと同じ近傍（図４）において、Ｔｙｒ１００５と疎水性接触を形成する（図３）。このことは、共通の小分子結合残基としてのＴｙｒ１００５の概念を補強する。化合物５及び７のアミドＮＨ及びカルボニルＯはともに、Ａｒｇ１００８（保存された、ＴＲＰヘリックス）と強い水素結合相互作用で相互作用し、この残基が、（－）－メンチル部分と疎水性接触を形成しているだけの化合物１において見られるものに対して、その効力のある機能的活性を駆動している可能性がある。これらの結果は、Ａｒｇ１００８が、化合物１及びそのアナログの両方の認識のための鍵となる残基であることを示唆する。さらに、両方のリガンドのシクロヘプチル及びシクロオクチル部分は、類似の疎水性相互作用で、Ｌｅｕ７７８及びＡｒｇ１００８に対してＶＳＬＤの反対側にある電位及びイシリン感応性Ａｒｇ８４２（保存された、Ｓ４、４．２／４．０Å）、イシリン感応性Ｈｉｓ８４５（保存された、Ｓ４、３．７／４．０Å）及びＩｌｅ８４６（保存された、Ｓ４、３．６／３．５Å）を含む３つの残基に近づいた。まとめて、これらの結果は、オルソステリック部位が、化合物１において見られるものよりも大きい疎水性置換を、上記のいくつかの他の親油性残基で、受け入れることができるが、ビフェニルは、キャビティの床に向かって係留相互作用を提供することを示唆する。
【0157】
[00186]
化合物３及び４と同様に、（ビシクロ［３．２．１］オクタン－３－イル、化合物６への）化合物５の立体配座拘束は、効力の急な減少をもたらし、これは、おそらくＡｒｇ１００８への複数のＨ結合接触の喪失による。二環及び三環式環置き換えを用いる探求を行って、我々のシリーズの周辺での親油性空間をさらに調べた。
化合物３及び４と同様に、（ビシクロ［３．２．１］オクタン－３－イル、化合物６への）化合物５の立体配座拘束は、効力の急な減少をもたらし、これは、おそらくＡｒｇ１００８への複数のＨ結合接触の喪失による。二環及び三環式環置き換えを用いる探求を行って、我々のシリーズの周辺での親油性空間をさらに調べた。
【0158】
[00187]
デカヒドロナフタレン－１－イル、化合物８は、化合物５及び７に対して、μＭ範囲でのｈＴＲＰＭ８効力の著しい下落をもたらし、このことは、ポケットが容量を識別するものであることを示す。同様に、テトラヒドロナフタレン－１－イル（化合物９）は、化合物８に対して３倍の効力の喪失に苦しみ、これもまた、足場のこの領域にて可動性が必要であることを示唆する。著しく対照的に、２つの異性体混合物であるデカヒドロナフタレン－２－イル（化合物１０）は、化合物８に対してＴＲＰＭ８効力が３，５００倍増進され（ＩＣ50：６±１ｎＭ）、シクロヘプチル（化合物５）及びシクロオクチル（化合物７）アナログの両方よりも１０倍高い効力を有し、このことは、デカヒドロナフタレン－２－イル環が、親油性ポケットを占めて、利用可能な疎水性相互作用を最大にしたことを示唆する。化合物８及び９で見られたＳＡＲでの傾向と一貫して、テトラヒドロナフタレン－２－イル基での置換（化合物１１）は、ｈＴＲＰＭ８効力を９倍減少させるが、ｈＴＲＰＭ８でのｎＭ効力はＩＣ50：５２±１ｎＭで保持する。クロマトグラフィーにより化合物１０の異性体の一方を分離して化合物１２を得ることにより、１桁のｎＭ範囲の効力が良好に得られ、ＩＣ50は、ジアステレオマー混合物よりも４倍高い１．４±１．０ｎＭであった。化合物１０が、単一異性体化合物１２と同様に、ＶＳＬＤ内の残基と複数の接触を形成して高いｈＴＲＰＭ８効力を与える可能性がある。化合物１０及び１２のＬＣ－ＭＳ分析は、２つのジアステレオマーの混合物である化合物１０が＞８５％の化合物１２異性体から成り立ち、よってその効力のあるＩＣ50値をもたらすことが示された。
デカヒドロナフタレン－１－イル、化合物８は、化合物５及び７に対して、μＭ範囲でのｈＴＲＰＭ８効力の著しい下落をもたらし、このことは、ポケットが容量を識別するものであることを示す。同様に、テトラヒドロナフタレン－１－イル（化合物９）は、化合物８に対して３倍の効力の喪失に苦しみ、これもまた、足場のこの領域にて可動性が必要であることを示唆する。著しく対照的に、２つの異性体混合物であるデカヒドロナフタレン－２－イル（化合物１０）は、化合物８に対してＴＲＰＭ８効力が３，５００倍増進され（ＩＣ50：６±１ｎＭ）、シクロヘプチル（化合物５）及びシクロオクチル（化合物７）アナログの両方よりも１０倍高い効力を有し、このことは、デカヒドロナフタレン－２－イル環が、親油性ポケットを占めて、利用可能な疎水性相互作用を最大にしたことを示唆する。化合物８及び９で見られたＳＡＲでの傾向と一貫して、テトラヒドロナフタレン－２－イル基での置換（化合物１１）は、ｈＴＲＰＭ８効力を９倍減少させるが、ｈＴＲＰＭ８でのｎＭ効力はＩＣ50：５２±１ｎＭで保持する。クロマトグラフィーにより化合物１０の異性体の一方を分離して化合物１２を得ることにより、１桁のｎＭ範囲の効力が良好に得られ、ＩＣ50は、ジアステレオマー混合物よりも４倍高い１．４±１．０ｎＭであった。化合物１０が、単一異性体化合物１２と同様に、ＶＳＬＤ内の残基と複数の接触を形成して高いｈＴＲＰＭ８効力を与える可能性がある。化合物１０及び１２のＬＣ－ＭＳ分析は、２つのジアステレオマーの混合物である化合物１０が＞８５％の化合物１２異性体から成り立ち、よってその効力のあるＩＣ50値をもたらすことが示された。
【0159】
[00188]
化合物１２の相対的立体化学的構造を、1Ｈ、13Ｃ、ｇＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ｇＨＳＱＣＡＤ、ｇＨＭＢＣＡＤ及びｇＨ２ＢＣにより確立した（表２）。デカリン環プロトン及び炭素化学シフトの文献値との比較を含むＮＭＲデータの分析は、この化合物が、２位にビフェニルアミド部分を有するシス－デカリンであることを示す。ＮＯＥＳＹデータの分析は、アミド基が、デカリンブリッジプロトンに対してトランスであることを示す（以下の構造を参照されたい、絶対的立体化学は確立できない）。
化合物１２の相対的立体化学的構造を、1Ｈ、13Ｃ、ｇＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ｇＨＳＱＣＡＤ、ｇＨＭＢＣＡＤ及びｇＨ２ＢＣにより確立した（表２）。デカリン環プロトン及び炭素化学シフトの文献値との比較を含むＮＭＲデータの分析は、この化合物が、２位にビフェニルアミド部分を有するシス－デカリンであることを示す。ＮＯＥＳＹデータの分析は、アミド基が、デカリンブリッジプロトンに対してトランスであることを示す（以下の構造を参照されたい、絶対的立体化学は確立できない）。
【0160】
表２．Ｎ－（（２ＳＲ，９ＲＳ，１０ＳＲ）－デカヒドロナフタレン－２－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキサミド（化合物１２）の1Ｈ－及び13Ｃ－ＮＭＲ化学シフトの割り当て。
【表4】
【0161】
[00189]
構造はシス－デカリンと決定した。なぜなら、炭素及びプロトン化学シフトがこの構造と矛盾しにくいからである（Ｄｏｄｚｉｕｋらを参照されたい）。シス－デカリンブリッジ炭素（Ｃ９、１０）は、３６．１ｐｐｍにて共鳴するが、トランス－デカリン中のものは４２．５ｐｐｍにて共鳴する。さらに、橋頭プロトンは、この構造で観察されるよりもトランス－デカリンにおいてより低いｐｐｍで共鳴する（１．９１、１．６８ｐｐｍをトランス－デカリンについての０．８７ｐｐｍと比較されたい）。また、Ｂｒｏｗｎｅらを参照されたい。
構造はシス－デカリンと決定した。なぜなら、炭素及びプロトン化学シフトがこの構造と矛盾しにくいからである（Ｄｏｄｚｉｕｋらを参照されたい）。シス－デカリンブリッジ炭素（Ｃ９、１０）は、３６．１ｐｐｍにて共鳴するが、トランス－デカリン中のものは４２．５ｐｐｍにて共鳴する。さらに、橋頭プロトンは、この構造で観察されるよりもトランス－デカリンにおいてより低いｐｐｍで共鳴する（１．９１、１．６８ｐｐｍをトランス－デカリンについての０．８７ｐｐｍと比較されたい）。また、Ｂｒｏｗｎｅらを参照されたい。
【0162】
[00190]
アミド部分の相対的立体化学は、突き止めるのがより困難であった。ＮＯＥＳＹデータは、提案された構造と一貫していた。しかし、特にＨ１０及びＨ１との化学シフトの重なりがひどく、はっきりした割り当てを不可能にした。ＮＯＥＳＹデータは、Ｈ９（１．９１ｐｐｍ）及びＨ２（４．０１ｐｐｍ）が同じ面上にあったことを確立した。化学シフトデータと組み合わせたこの結果は、トランス－２位においてビフェニルカルボキサミドで置換されたシス－デカリンと一貫していた。
アミド部分の相対的立体化学は、突き止めるのがより困難であった。ＮＯＥＳＹデータは、提案された構造と一貫していた。しかし、特にＨ１０及びＨ１との化学シフトの重なりがひどく、はっきりした割り当てを不可能にした。ＮＯＥＳＹデータは、Ｈ９（１．９１ｐｐｍ）及びＨ２（４．０１ｐｐｍ）が同じ面上にあったことを確立した。化学シフトデータと組み合わせたこの結果は、トランス－２位においてビフェニルカルボキサミドで置換されたシス－デカリンと一貫していた。
【0163】
[00191]
化合物１の（－）－メンチル基のスピロ置換二環での置き換えについて、次いで調べた。スピロ［５．５］－ウンデカン－３－イル（化合物１３）は、化合物５及び７と類似の効力を保持し、ＩＣ50は、４０±１ｎＭであったが、デカヒドロナフタレン－１－イル（化合物１０及び１２）ほど高いｎＭ範囲にはなく、このことは、受容器キャビティの相補領域の容量が固定されており、２つのシクロヘキシル環のスピロ配置に耐えることができないことを示唆する。
化合物１の（－）－メンチル基のスピロ置換二環での置き換えについて、次いで調べた。スピロ［５．５］－ウンデカン－３－イル（化合物１３）は、化合物５及び７と類似の効力を保持し、ＩＣ50は、４０±１ｎＭであったが、デカヒドロナフタレン－１－イル（化合物１０及び１２）ほど高いｎＭ範囲にはなく、このことは、受容器キャビティの相補領域の容量が固定されており、２つのシクロヘキシル環のスピロ配置に耐えることができないことを示唆する。
【0164】
[00192]
（スピロ［４．５］デカン－８－イル、化合物１４への）化合物１３の１炭素の環収縮は、デカヒドロナフタレン－１－イル異性体（化合物１２）の効力のある活性を反復し（ＩＣ50：２．４±１．０ｎＭ）、アッセイにおいて効力が高いＴＲＰＭ８アンタゴニストＲＱ－００２０３０７８に匹敵する活性である。スピロ［４．５］デカン－８－イル（化合物１４）は、化合物１２と類似の効力であり、このことは、ポケットの性質が拘束的であるか又は識別可能であることをさらに示唆する。このシリーズについての結合部位は、構造生物学の技術、例えばクリオＥＭ又はＸ線結晶学を用いて明確に決定して、突然変異誘発研究と結び付けたヒトＴＲＰＭ８のリガンド結合構造を得ることができた。現在、ヒトＴＲＰＭ８の構造は、知られていない。特に、化合物１４は、科学文献及び特許文献で報告されている他の効力のあるＴＲＰＭ８アンタゴニストと共通の構造的特徴をいくつか有している。スピロ基（スピロ－イソキサゾリン）及びビフェニル芳香族配置もともに、効力が高いベンズイミダゾールベースのＴＲＰＭ８アンタゴニストＪＮＪ４１８７６６６６／ＴＣ－Ｉ２０１４（ｃＴＲＰＭ８ ＩＣ50（イシリン）：０．８ｎＭ）で見られている。Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより報告された別のＴＲＰＭ８アンタゴニスト、（Ｒ）－（－）－１０ｅ（ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50（45Ｃａ2+取り込み）：８．９ｎＭ）は、３，４－ジヒドロスピロ［クロメン－２，４’－ピペリジンを含む。同様に、Ｒａｑｕａｌｉａ Ｐｈａｒｍａは、芳香環及びヘテロ環でパラ置換されたフェニル環にケトンを介して連結された環系、例えば１－オキサ－３－アザスピロ［４．５］デカン－２－オン、１，３－ジアザスピロ［４．５］デカン－２，４－ジオン及び１－オキサ－３－アザスピロ［４．５］デカン－２，４－ジオンを含む一連のアザスピロＴＲＰＭ８アンタゴニストを報告した。
（スピロ［４．５］デカン－８－イル、化合物１４への）化合物１３の１炭素の環収縮は、デカヒドロナフタレン－１－イル異性体（化合物１２）の効力のある活性を反復し（ＩＣ50：２．４±１．０ｎＭ）、アッセイにおいて効力が高いＴＲＰＭ８アンタゴニストＲＱ－００２０３０７８に匹敵する活性である。スピロ［４．５］デカン－８－イル（化合物１４）は、化合物１２と類似の効力であり、このことは、ポケットの性質が拘束的であるか又は識別可能であることをさらに示唆する。このシリーズについての結合部位は、構造生物学の技術、例えばクリオＥＭ又はＸ線結晶学を用いて明確に決定して、突然変異誘発研究と結び付けたヒトＴＲＰＭ８のリガンド結合構造を得ることができた。現在、ヒトＴＲＰＭ８の構造は、知られていない。特に、化合物１４は、科学文献及び特許文献で報告されている他の効力のあるＴＲＰＭ８アンタゴニストと共通の構造的特徴をいくつか有している。スピロ基（スピロ－イソキサゾリン）及びビフェニル芳香族配置もともに、効力が高いベンズイミダゾールベースのＴＲＰＭ８アンタゴニストＪＮＪ４１８７６６６６／ＴＣ－Ｉ２０１４（ｃＴＲＰＭ８ ＩＣ50（イシリン）：０．８ｎＭ）で見られている。Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより報告された別のＴＲＰＭ８アンタゴニスト、（Ｒ）－（－）－１０ｅ（ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50（45Ｃａ2+取り込み）：８．９ｎＭ）は、３，４－ジヒドロスピロ［クロメン－２，４’－ピペリジンを含む。同様に、Ｒａｑｕａｌｉａ Ｐｈａｒｍａは、芳香環及びヘテロ環でパラ置換されたフェニル環にケトンを介して連結された環系、例えば１－オキサ－３－アザスピロ［４．５］デカン－２－オン、１，３－ジアザスピロ［４．５］デカン－２，４－ジオン及び１－オキサ－３－アザスピロ［４．５］デカン－２，４－ジオンを含む一連のアザスピロＴＲＰＭ８アンタゴニストを報告した。
【0165】
[00193]
化合物１４の用量応答曲線を、次いで、図１５に示すデータから構築した。化合物１４は、化合物１２とは異なってキラル中心を有さないことに鑑みて、さらなる特徴決定のために選択した。図１７に示すように、化合物１４は、イシリン誘導Ｃａ2+流入をＩＣ50＝２．４±１．０ｎＭで用量依存的に阻害し、より高い濃度では、Ｃａ2+流入をほぼ廃止する（図１５及び１７）。
化合物１４の用量応答曲線を、次いで、図１５に示すデータから構築した。化合物１４は、化合物１２とは異なってキラル中心を有さないことに鑑みて、さらなる特徴決定のために選択した。図１７に示すように、化合物１４は、イシリン誘導Ｃａ2+流入をＩＣ50＝２．４±１．０ｎＭで用量依存的に阻害し、より高い濃度では、Ｃａ2+流入をほぼ廃止する（図１５及び１７）。
【0166】
[00194]
Ｃａ2+フラックスアッセイにおいてメントールを阻害する化合物１４の能力を決定するために、メントール応答を、まず、ｈＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞において評価し、約６μＭのＥＣ50を見出した（図１４）。観察されたメントール効力は、ＨＥＫ２９３細胞の類似のカルシウムイメージングにおいてｈＴＲＰＭ８について以前に報告された値に匹敵した。化合物１４がまだイシリン誘発ＴＲＰＭ８媒介Ｃａ2+侵入の著しい低減を引き起こすことができる最低濃度は、３ｎＭであった（図１７）。化合物１４を、同じ最低（すなわち３ｎＭ）濃度にて、最大（１００μＭ）メントール誘発ＴＲＰＭ８媒介Ｃａ2+侵入に対して試験した（図Ｓ６ａ）。図１８Ｂからわかるように、３ｎＭの化合物１４も、メントールにより引き起こされたＴＲＰＭ８媒介Ｃａ2+侵入を有意に（Ｐ＜０．０１）低減できた。これらの研究は、イシリンを用いて行った我々のＳＡＲ研究に加えて、メントールをアゴニストとして用いるこのアッセイにおける化合物１４の効果を探求するための追加の裏付けを提供する。
Ｃａ2+フラックスアッセイにおいてメントールを阻害する化合物１４の能力を決定するために、メントール応答を、まず、ｈＴＲＰＭ８を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞において評価し、約６μＭのＥＣ50を見出した（図１４）。観察されたメントール効力は、ＨＥＫ２９３細胞の類似のカルシウムイメージングにおいてｈＴＲＰＭ８について以前に報告された値に匹敵した。化合物１４がまだイシリン誘発ＴＲＰＭ８媒介Ｃａ2+侵入の著しい低減を引き起こすことができる最低濃度は、３ｎＭであった（図１７）。化合物１４を、同じ最低（すなわち３ｎＭ）濃度にて、最大（１００μＭ）メントール誘発ＴＲＰＭ８媒介Ｃａ2+侵入に対して試験した（図Ｓ６ａ）。図１８Ｂからわかるように、３ｎＭの化合物１４も、メントールにより引き起こされたＴＲＰＭ８媒介Ｃａ2+侵入を有意に（Ｐ＜０．０１）低減できた。これらの研究は、イシリンを用いて行った我々のＳＡＲ研究に加えて、メントールをアゴニストとして用いるこのアッセイにおける化合物１４の効果を探求するための追加の裏付けを提供する。
【0167】
[00195]
アダマンチル（化合物１５）は、ＩＣ50：１６±１ｎＭで、化合物１４よりもわずかに低い効力をもたらし、このことは、三環式環が、二環（化合物１０～１４）と同様に、耐えたことを示す。まとめて、Ｃａ2+フラックスアッセイにおける化合物１０、１２、１４及び１５のアンタゴニスト活性は、ヒトＴＲＰＭ８でトランスフェクションされた細胞における≦１０ｎＭ範囲でのＩＣ50値とともに、ＰＦ－０５１０５６７９（Ｐｆｉｚｅｒ、第１相、ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50＝１８１ｎＭ）、ＡＭＧ３３３（Ａｍｇｅｎ、第１相、ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50＝１３±４ｎＭ）、ＡＭＧ２８５０（Ａｍｇｅｎ）、ＲＱ－００２０３０７８（ＲａＱｕａｌｉａ Ｐｈａｒｍａ）、ＡＭＴＢ（Ｂａｙｅｒ）、アリールグリシン誘導体１２及びビニルシクロアルキル置換ベンズイミダゾール２５（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＤＦＬ２３４４８及びＤＦＬ２３６９３、Ｍ８－Ｂ、Ｍ８－Ａｎ、トリプトファン誘導体１４などを含む、インビボ活性を有する報告されたＴＲＰＭ８アンタゴニストのＣａ2+フラックス活性を超えるか又は匹敵する。Ｃａ2+フラックスアッセイにおけるｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50値が≦１００ｎＭの化合物（化合物５、７、１０～１５）はいずれも、１０μＭの単一の高い濃度ではチャネル単独を刺激できず（図１９）、このことは、我々のアンタゴニストアッセイで得られた結果と一致する。
アダマンチル（化合物１５）は、ＩＣ50：１６±１ｎＭで、化合物１４よりもわずかに低い効力をもたらし、このことは、三環式環が、二環（化合物１０～１４）と同様に、耐えたことを示す。まとめて、Ｃａ2+フラックスアッセイにおける化合物１０、１２、１４及び１５のアンタゴニスト活性は、ヒトＴＲＰＭ８でトランスフェクションされた細胞における≦１０ｎＭ範囲でのＩＣ50値とともに、ＰＦ－０５１０５６７９（Ｐｆｉｚｅｒ、第１相、ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50＝１８１ｎＭ）、ＡＭＧ３３３（Ａｍｇｅｎ、第１相、ｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50＝１３±４ｎＭ）、ＡＭＧ２８５０（Ａｍｇｅｎ）、ＲＱ－００２０３０７８（ＲａＱｕａｌｉａ Ｐｈａｒｍａ）、ＡＭＴＢ（Ｂａｙｅｒ）、アリールグリシン誘導体１２及びビニルシクロアルキル置換ベンズイミダゾール２５（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＤＦＬ２３４４８及びＤＦＬ２３６９３、Ｍ８－Ｂ、Ｍ８－Ａｎ、トリプトファン誘導体１４などを含む、インビボ活性を有する報告されたＴＲＰＭ８アンタゴニストのＣａ2+フラックス活性を超えるか又は匹敵する。Ｃａ2+フラックスアッセイにおけるｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50値が≦１００ｎＭの化合物（化合物５、７、１０～１５）はいずれも、１０μＭの単一の高い濃度ではチャネル単独を刺激できず（図１９）、このことは、我々のアンタゴニストアッセイで得られた結果と一致する。
【0168】
[00196]
実施例６－ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１でのインビトロ選択性プロファイリング。
[00197]
新規化合物５、７及び１０～１５の選択性プロフィールを、次いで、２つの温度関連ＴＲＰサブタイプであるｈＴＲＰＡ１及びｈＴＲＰＶ１に対して決定した。多くのＴＲＰリガンドが逆の挙動を有し、例えば、ＴＲＰＭ８アゴニストメントールは、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１を遮断するが、低濃度にてＴＲＰＡ１を活性化する。同様に、ＴＲＰＶ１アゴニストカプサイシンは、ＴＲＰＭ８媒介応答を阻害できる。他方、ＴＲＰＶ１アンタゴニストであるカプサゼピン、ＢＣＴＣ及びＳＢ－４５２５３３などは、ＴＲＰＭ８を用量依存的に遮断する。これらの研究は、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の間でリガンド認識が重複していることを示唆する。ＴＲＰＭ８と同様に、ＴＲＰＡ１は、わずかにより低い温度であるが、インビトロ及びインビボで低温により活性化される。イシリンも、ＴＲＰＡ１をμＭ濃度にてＣａ2+フラックスアッセイにおいて活性化する。
実施例６－ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１でのインビトロ選択性プロファイリング。
[00197]
新規化合物５、７及び１０～１５の選択性プロフィールを、次いで、２つの温度関連ＴＲＰサブタイプであるｈＴＲＰＡ１及びｈＴＲＰＶ１に対して決定した。多くのＴＲＰリガンドが逆の挙動を有し、例えば、ＴＲＰＭ８アゴニストメントールは、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１を遮断するが、低濃度にてＴＲＰＡ１を活性化する。同様に、ＴＲＰＶ１アゴニストカプサイシンは、ＴＲＰＭ８媒介応答を阻害できる。他方、ＴＲＰＶ１アンタゴニストであるカプサゼピン、ＢＣＴＣ及びＳＢ－４５２５３３などは、ＴＲＰＭ８を用量依存的に遮断する。これらの研究は、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の間でリガンド認識が重複していることを示唆する。ＴＲＰＭ８と同様に、ＴＲＰＡ１は、わずかにより低い温度であるが、インビトロ及びインビボで低温により活性化される。イシリンも、ＴＲＰＡ１をμＭ濃度にてＣａ2+フラックスアッセイにおいて活性化する。
【0169】
[00198]
このＴＲＰＡ１ Ｃａ2+フラックスアッセイにおいて、ＴＲＰＡ１アゴニストＡＩＴＣの用量応答研究により、７．６２±０．８９μＭのＥＣ50が得られ（図２０）、以前の研究と一致する。アッセイにおいて標準物質及び陽性対照として用いたＴＲＰＡ１アンタゴニストルテニウムレッドは、ＡＩＴＣ（１０μＭ）活性化［Ｃａ2+］i放出を、８０μＭ ＡＩＴＣの影響に対して２９±６ｎＭのＩＣ50を報告したＫｌｉｏｎｓｋｙらと同じ範囲において１６２±３３ｎＭのＩＣ50にて用量依存的に遮断した（図２１に示す用量応答曲線）。ＴＲＰＶ１にて、ＴＲＰＶ１アゴニストカプサイシン（ＥＣ50 １９±２．５ｎＭ、図２２）及びアンタゴニストカプサゼピン（ＩＣ50 ４５１±４８ｎＭ、図２３）についてのＥＣ50及びＩＣ50は、Ｅｌ Ｋｏｕｈｅｎらにより報告された値と同様である。図２０～２３に含める曲線は、±９５％信頼区間で列挙している。
このＴＲＰＡ１ Ｃａ2+フラックスアッセイにおいて、ＴＲＰＡ１アゴニストＡＩＴＣの用量応答研究により、７．６２±０．８９μＭのＥＣ50が得られ（図２０）、以前の研究と一致する。アッセイにおいて標準物質及び陽性対照として用いたＴＲＰＡ１アンタゴニストルテニウムレッドは、ＡＩＴＣ（１０μＭ）活性化［Ｃａ2+］i放出を、８０μＭ ＡＩＴＣの影響に対して２９±６ｎＭのＩＣ50を報告したＫｌｉｏｎｓｋｙらと同じ範囲において１６２±３３ｎＭのＩＣ50にて用量依存的に遮断した（図２１に示す用量応答曲線）。ＴＲＰＶ１にて、ＴＲＰＶ１アゴニストカプサイシン（ＥＣ50 １９±２．５ｎＭ、図２２）及びアンタゴニストカプサゼピン（ＩＣ50 ４５１±４８ｎＭ、図２３）についてのＥＣ50及びＩＣ50は、Ｅｌ Ｋｏｕｈｅｎらにより報告された値と同様である。図２０～２３に含める曲線は、±９５％信頼区間で列挙している。
【0170】
表Ｓ１．ＴＲＰＡ１アゴニストデータ（Ｅmax対照に対して標準化したパーセンテージ活性化）。全てのデータは、参照アゴニストＡＩＴＣについてのＥmaxに対して標準化している。
【表5】
【0171】
表Ｓ２．ＴＲＰＡ１アンタゴニストデータ（ＥＣ80対照に対して標準化したパーセンテージ阻害）。全てのデータは、参照アゴニストＡＩＴＣについてのＥＣ80に対して標準化している。
【表6】
【0172】
表Ｓ３．ＴＲＰＶ１アゴニストデータ（Ｅmax対照に対して標準化したパーセンテージ活性化）。全てのデータは、参照アゴニストカプサイシンについてのＥmaxに対して標準化している。
【表7】
【0173】
表Ｓ４．ＴＲＰＶ１アンタゴニストデータ（ＥＣ80対照に対して標準化したパーセンテージ阻害）。全てのデータは、参照アゴニストカプサイシンについてのＥＣ80に対して標準化している。
【表8】
【0174】
[00199]
著しいＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性を有する化合物のうち、化合物５、７及び１１以外の全てのアナログは、それらのｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50値のおよそ２倍に相当する濃度、かつ以前の値の１０倍を超える濃度にてｈＴＲＰＶ１及びｈＴＲＰＡ１の両方でのＣａ2+フラックスアッセイにおいて無視できる程度の固有（アゴニスト）及びアンタゴニスト活性を有した。特に、どの化合物も、参照アゴニストであるＡＩＴＣ（３００μＭ）及びカプサイシン（３μＭ）のＥmax濃度に対して標準化した場合に、試験した両方の濃度で、ｈＴＲＰＡ１及びｈＴＲＰＶ１にて２５％を超える活性化を示さなかった。同様に、これらのアナログのいずれも、ＥＣ80濃度のＡＩＴＣ及びカプサイシン（それぞれ１０μＭ及び０．１μＭ）を負荷した場合に２５％を超えてどちらのサブタイプも阻害できなかった。例えば、そのｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50値６±１ｎＭの１７倍高い濃度でさえ、化合物１０は、ｈＴＲＰＡ１又はｈＴＲＰＶ１を活性化又は阻害しなかった。同様に、化合物１２、１３、１４及び１５は、それぞれそのｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50値１．４±１ｎＭ、４０±１ｎＭ、２．４±１．０ｎＭ及び１６±１ｎＭより２１、２５、１３及び１９倍高い濃度にてｈＴＲＰＡ１及びｈＴＲＰＶ１媒介応答に影響しない。よって、本シリーズ中の多くの化合物は、関連する熱的ＴＲＰであるＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１に対して、ＴＲＰＭ８について少なくとも１０倍選択的である。
著しいＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性を有する化合物のうち、化合物５、７及び１１以外の全てのアナログは、それらのｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50値のおよそ２倍に相当する濃度、かつ以前の値の１０倍を超える濃度にてｈＴＲＰＶ１及びｈＴＲＰＡ１の両方でのＣａ2+フラックスアッセイにおいて無視できる程度の固有（アゴニスト）及びアンタゴニスト活性を有した。特に、どの化合物も、参照アゴニストであるＡＩＴＣ（３００μＭ）及びカプサイシン（３μＭ）のＥmax濃度に対して標準化した場合に、試験した両方の濃度で、ｈＴＲＰＡ１及びｈＴＲＰＶ１にて２５％を超える活性化を示さなかった。同様に、これらのアナログのいずれも、ＥＣ80濃度のＡＩＴＣ及びカプサイシン（それぞれ１０μＭ及び０．１μＭ）を負荷した場合に２５％を超えてどちらのサブタイプも阻害できなかった。例えば、そのｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50値６±１ｎＭの１７倍高い濃度でさえ、化合物１０は、ｈＴＲＰＡ１又はｈＴＲＰＶ１を活性化又は阻害しなかった。同様に、化合物１２、１３、１４及び１５は、それぞれそのｈＴＲＰＭ８ ＩＣ50値１．４±１ｎＭ、４０±１ｎＭ、２．４±１．０ｎＭ及び１６±１ｎＭより２１、２５、１３及び１９倍高い濃度にてｈＴＲＰＡ１及びｈＴＲＰＶ１媒介応答に影響しない。よって、本シリーズ中の多くの化合物は、関連する熱的ＴＲＰであるＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１に対して、ＴＲＰＭ８について少なくとも１０倍選択的である。
【0175】
表３．Ｃａ2+フラックスアッセイにおいて決定した、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１受容器での選択されたビフェニルアミドの固有及びアンタゴニスト機能的活性。
【表9】
【0176】
[00200]
実施例７－化合物１４のホールセルパッチクランプ電気生理学。
[00201]
ホールセルパッチクランプ電気生理学を用いて、チャネルを刺激する同族リガンドメントールを用いて、ｈＴＲＰＭ８での化合物１４のアンタゴニスト活性をさらに探求及び確認した（図７）。パッチクランプ実験では、トランスフェクションされたＨＥＫ－２９３細胞又はＴＲＰＭ８発現アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるイシリンによるＴＲＰＭ８の活性化は、細胞外Ｃａ2+の存在に依存し、さらに、イシリンは、高度に変動する潜伏期及び著しい脱感作を有してチャネルを活性化し、この効果は、メントールでは見られない。これらのことを考慮して、我々は、以前の出版物に詳細に記載されているようにして、化合物１４がｈＴＲＰＭ８にてメントール媒介応答を阻害する能力についてさらに探求した。ホールセル記録におけるＣａ2+及びｐＨ依存性イシリン誘発応答とは対照的に、メントールは、電位クランプアッセイにおいて堅固なＴＲＰＭ８活性化を誘導して、よりよい比較研究が可能になる。これらのことを考慮して、アゴニストメントールにより誘導される電流に影響する化合物１４の能力を評価した。
実施例７－化合物１４のホールセルパッチクランプ電気生理学。
[00201]
ホールセルパッチクランプ電気生理学を用いて、チャネルを刺激する同族リガンドメントールを用いて、ｈＴＲＰＭ８での化合物１４のアンタゴニスト活性をさらに探求及び確認した（図７）。パッチクランプ実験では、トランスフェクションされたＨＥＫ－２９３細胞又はＴＲＰＭ８発現アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるイシリンによるＴＲＰＭ８の活性化は、細胞外Ｃａ2+の存在に依存し、さらに、イシリンは、高度に変動する潜伏期及び著しい脱感作を有してチャネルを活性化し、この効果は、メントールでは見られない。これらのことを考慮して、我々は、以前の出版物に詳細に記載されているようにして、化合物１４がｈＴＲＰＭ８にてメントール媒介応答を阻害する能力についてさらに探求した。ホールセル記録におけるＣａ2+及びｐＨ依存性イシリン誘発応答とは対照的に、メントールは、電位クランプアッセイにおいて堅固なＴＲＰＭ８活性化を誘導して、よりよい比較研究が可能になる。これらのことを考慮して、アゴニストメントールにより誘導される電流に影響する化合物１４の能力を評価した。
【0177】
[00202]
イシリンを用いるＣａ2+フラックス研究と一致して、この化合物は、メントール誘導ＴＲＰＭ８応答を、６４±４ｎＭのＩＣ50で、濃度依存的様式で阻害し、このことは、化合物１４が、異なる化学的刺激により誘導されるＴＲＰＭ８応答をｎＭ濃度で阻害する能力を有する、真の、機能的に堅固なＴＲＰＭ８アンタゴニストであることを証明する。化合物１４のアンタゴニスト活性は、トリプタミンベースのアンタゴニストより同じアッセイにおいて６倍多く、３つの不安定なエステル基を含むβ－ラクタムアンタゴニストと類似の効力を有する。化合物１４のＩＣ50値は、このアッセイにおいて、公知のＴＲＰＭ８アンタゴニストＰＢＭＣのものには近づかないが（ＩＣ50：０．４～０．６ｎＭ）、不安定なエステル及びカルバメート基を有するこのＡＭＴＢのベンジルオキシ－フェニルメチルカルバメートアナログは、化学プローブとしては有用性が制限されるとみられる。ＰＢＭＣは、神経障害性疼痛の異なる行動モデルにおいて様々な応答を与え、ＣＩＰＮモデルにおいて冷覚感作を遮断できない。まとめると、化合物１４は、異なる化学活性化因子に関するアッセイ特異的なニュアンスを克服でき、このことは、イシリン及びメントールの両方を負荷した場合の、Ｃａ2+フラックス及びホールセルパッチクランプアッセイの両方において堅固で高い効力のアンタゴニスト活性を証明する。化合物１４は、薬理学的によく特徴決定されており、他の小分子ＴＲＰＭ８リガンドと比べていくつかのアッセイにおいてＴＲＰＭ８活性を有し、このことは、ＴＲＰＭ８媒介薬理学をつきとめるための化学ツールとしてのその可能性を証明する。以下に論じるように、化合物１４は、イシリン及びメントールアナログＷＳ－１２と結合することも示されているＡｒｇ８４２及びＴｙｒ１００５と相互作用する。これらの残基と結合することは、それぞれＣａ2+フラックス及び電気生理学的アッセイにおいてなぜ化合物１４がイシリン及びメントールの両方により媒介される応答を阻害できるのかを示唆するかもしれない。しかし、部位特異的突然変異誘発研究が、さらなる見識を与え得る。
イシリンを用いるＣａ2+フラックス研究と一致して、この化合物は、メントール誘導ＴＲＰＭ８応答を、６４±４ｎＭのＩＣ50で、濃度依存的様式で阻害し、このことは、化合物１４が、異なる化学的刺激により誘導されるＴＲＰＭ８応答をｎＭ濃度で阻害する能力を有する、真の、機能的に堅固なＴＲＰＭ８アンタゴニストであることを証明する。化合物１４のアンタゴニスト活性は、トリプタミンベースのアンタゴニストより同じアッセイにおいて６倍多く、３つの不安定なエステル基を含むβ－ラクタムアンタゴニストと類似の効力を有する。化合物１４のＩＣ50値は、このアッセイにおいて、公知のＴＲＰＭ８アンタゴニストＰＢＭＣのものには近づかないが（ＩＣ50：０．４～０．６ｎＭ）、不安定なエステル及びカルバメート基を有するこのＡＭＴＢのベンジルオキシ－フェニルメチルカルバメートアナログは、化学プローブとしては有用性が制限されるとみられる。ＰＢＭＣは、神経障害性疼痛の異なる行動モデルにおいて様々な応答を与え、ＣＩＰＮモデルにおいて冷覚感作を遮断できない。まとめると、化合物１４は、異なる化学活性化因子に関するアッセイ特異的なニュアンスを克服でき、このことは、イシリン及びメントールの両方を負荷した場合の、Ｃａ2+フラックス及びホールセルパッチクランプアッセイの両方において堅固で高い効力のアンタゴニスト活性を証明する。化合物１４は、薬理学的によく特徴決定されており、他の小分子ＴＲＰＭ８リガンドと比べていくつかのアッセイにおいてＴＲＰＭ８活性を有し、このことは、ＴＲＰＭ８媒介薬理学をつきとめるための化学ツールとしてのその可能性を証明する。以下に論じるように、化合物１４は、イシリン及びメントールアナログＷＳ－１２と結合することも示されているＡｒｇ８４２及びＴｙｒ１００５と相互作用する。これらの残基と結合することは、それぞれＣａ2+フラックス及び電気生理学的アッセイにおいてなぜ化合物１４がイシリン及びメントールの両方により媒介される応答を阻害できるのかを示唆するかもしれない。しかし、部位特異的突然変異誘発研究が、さらなる見識を与え得る。
【0178】
[00203]
実施例８－化合物１４及びｈＴＲＰＭ８。
[00204]
ヒトＴＲＰＭ８ホモロジーモデルの関係における化合物１４の効力のあるアンタゴニスト活性を合理的に説明するために、１００ｎｓ ＭＤシミュレーションを行うことにより、実験を次いで行った。簡単に述べると、１００ｎｓ ＭＤシミュレーションを、効力が高いアンタゴニスト、スピロ［４．５］デカン－８－イル化合物１４についてｈＴＲＰＭ８において行った。ｈＴＲＰＭ８（約３．９Å）及び化合物１４のＲＭＳＤ（１．９Å）は、図８Ｃに示すように３０ｎｓ後に安定に維持され、このことは、１００ｎｓの時間尺度が適当であることを示す。
実施例８－化合物１４及びｈＴＲＰＭ８。
[00204]
ヒトＴＲＰＭ８ホモロジーモデルの関係における化合物１４の効力のあるアンタゴニスト活性を合理的に説明するために、１００ｎｓ ＭＤシミュレーションを行うことにより、実験を次いで行った。簡単に述べると、１００ｎｓ ＭＤシミュレーションを、効力が高いアンタゴニスト、スピロ［４．５］デカン－８－イル化合物１４についてｈＴＲＰＭ８において行った。ｈＴＲＰＭ８（約３．９Å）及び化合物１４のＲＭＳＤ（１．９Å）は、図８Ｃに示すように３０ｎｓ後に安定に維持され、このことは、１００ｎｓの時間尺度が適当であることを示す。
【0179】
[00205]
図８Ａに示すように、化合物１４のシクロペンチルは、化合物５及び７のシクロヘプチル及びシクロオクチルと同様に、下部のＳ４ヘリックス内の保存されたＡｒｇ８４２（Ｓ４、側鎖、３．４Å）及びＩｌｅ８４６（Ｓ４、４．０Å）残基と強い疎水性相互作用を形成する（図６）。ビフェニルは、ＭＤシミュレーション前に、ＴＲＰヘリックス中の保存されたＬｅｕ１００１（約３．１Å、示さず）及びＴｙｒ１００５（メントール感応性、３．８Å）残基と接触する。図８Ｂに示すように、ＭＤシミュレーション後のＴＲＰＭ８内の化合物１４の結合ポーズを示す。化合物１４のビフェニルと、Ｉｌｅ８４６（３．６Å）／Ｌｅｕ１００１（３．３Ａ、示さず）／Ｔｙｒ１００５（３．４Å）との間の相互作用は、図８Ｂに示すように、ＭＤ中安定に維持されたことが観察された。Ｉｌｅ８４６は、むしろ、Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５と同様に、ビフェニル基と疎水性接触するようにシフトする。Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５との相互作用は、ここでもまた、以前に論じたように、化合物５及び７のドッキングポーズと一貫している。
図８Ａに示すように、化合物１４のシクロペンチルは、化合物５及び７のシクロヘプチル及びシクロオクチルと同様に、下部のＳ４ヘリックス内の保存されたＡｒｇ８４２（Ｓ４、側鎖、３．４Å）及びＩｌｅ８４６（Ｓ４、４．０Å）残基と強い疎水性相互作用を形成する（図６）。ビフェニルは、ＭＤシミュレーション前に、ＴＲＰヘリックス中の保存されたＬｅｕ１００１（約３．１Å、示さず）及びＴｙｒ１００５（メントール感応性、３．８Å）残基と接触する。図８Ｂに示すように、ＭＤシミュレーション後のＴＲＰＭ８内の化合物１４の結合ポーズを示す。化合物１４のビフェニルと、Ｉｌｅ８４６（３．６Å）／Ｌｅｕ１００１（３．３Ａ、示さず）／Ｔｙｒ１００５（３．４Å）との間の相互作用は、図８Ｂに示すように、ＭＤ中安定に維持されたことが観察された。Ｉｌｅ８４６は、むしろ、Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５と同様に、ビフェニル基と疎水性接触するようにシフトする。Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５との相互作用は、ここでもまた、以前に論じたように、化合物５及び７のドッキングポーズと一貫している。
【0180】
[00206]
Ｉｌｅ８４６、Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５は、ビフェニルをＶＳＬＤの底に係留し、ここでは、化合物１のビフェニルよりも深く埋め込まれ、ここでもまた、このことが、これらの化学種についてのアゴニスト対アンタゴニスト媒介挙動についてのもっともらしい理論的解釈であることが示唆される。重要なことに、Ｔｙｒ１００５とビフェニルとの間で観察される疎水性相互作用は、ＡＭＧ２８５０のポストＭＤポーズでも見られる。この残基は、以前に論じたように、極性相互作用によりＷＳ－１２及びイシリンと接触し、リガンド認識のための共通ＴＲＰＭ８残基としてのＴｙｒ１００５の概念を補強する。化合物１及びＷＳ－１２と違って、芳香族含有基は、ＶＳＬＤにおいて重複しない。
Ｉｌｅ８４６、Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５は、ビフェニルをＶＳＬＤの底に係留し、ここでは、化合物１のビフェニルよりも深く埋め込まれ、ここでもまた、このことが、これらの化学種についてのアゴニスト対アンタゴニスト媒介挙動についてのもっともらしい理論的解釈であることが示唆される。重要なことに、Ｔｙｒ１００５とビフェニルとの間で観察される疎水性相互作用は、ＡＭＧ２８５０のポストＭＤポーズでも見られる。この残基は、以前に論じたように、極性相互作用によりＷＳ－１２及びイシリンと接触し、リガンド認識のための共通ＴＲＰＭ８残基としてのＴｙｒ１００５の概念を補強する。化合物１及びＷＳ－１２と違って、芳香族含有基は、ＶＳＬＤにおいて重複しない。
【0181】
[00207]
驚くべきことに、スピロ［４．５］デカン－８－イル基は、シクロヘキシル環を介してＡｒｇ８４２との疎水性接触を維持することが見いだされた。Ｉｌｅ８４６、Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５と一緒に、鍵となる残基のエネルギー分解は、図８Ｄに示すように、ＴＲＰＭ８における化合物１４の認識に、これらの４残基が他の残基よりも大きい程度に寄与し得るという概念をさらに支持する。Ａｒｇ８４２は、メントール結合部位に対してＶＳＬＤの反対側にあり、結合したＣａ2+イオン及びＳ２～Ｓ３ヘリックス中の配位結合残基に近づく、ＡＭＧ２８５０についての以前のクリオＥＭ研究及びＭＤ研究から示唆される小分子結合のための別の共通残基である。このことにより、分子は、広いコンフォメーションに押し込められる。ＶＳＬＤオルソステリック部位のこの領域（下部Ｓ２ヘリックス、及びＳ３～Ｓ４ヘリックス）は、いくつかの疎水性かつ極性残基を含み、我々のビフェニルアミドシリーズに対してより大きい疎水性置換、例えば、我々の実験的に観察されたＳＡＲの傾向についての構造的関係をもたらす、Ｓ１及び上部Ｓ２ヘリックス中のメントール結合領域に対して、我々の効力のあるナノモルアンタゴニスト／化合物５、７及び１０～１５において見られるもののようなものを優先的に受け入れることができる。この近傍の残基（なかでもＧｌｕ７８２、Ａｒｇ８４２（ＴＲＰＭ８FAにおいてＡｒｇ８４１）及びＨｉｓ８４５（ＴＲＰＭ８FAにおいてＨｉｓ８４４））は、複数の立体配座を採用して、ＴＲＰＭ８がＷＳ－１２及びイシリンの両方と結合できるようにすることが報告されている。
驚くべきことに、スピロ［４．５］デカン－８－イル基は、シクロヘキシル環を介してＡｒｇ８４２との疎水性接触を維持することが見いだされた。Ｉｌｅ８４６、Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５と一緒に、鍵となる残基のエネルギー分解は、図８Ｄに示すように、ＴＲＰＭ８における化合物１４の認識に、これらの４残基が他の残基よりも大きい程度に寄与し得るという概念をさらに支持する。Ａｒｇ８４２は、メントール結合部位に対してＶＳＬＤの反対側にあり、結合したＣａ2+イオン及びＳ２～Ｓ３ヘリックス中の配位結合残基に近づく、ＡＭＧ２８５０についての以前のクリオＥＭ研究及びＭＤ研究から示唆される小分子結合のための別の共通残基である。このことにより、分子は、広いコンフォメーションに押し込められる。ＶＳＬＤオルソステリック部位のこの領域（下部Ｓ２ヘリックス、及びＳ３～Ｓ４ヘリックス）は、いくつかの疎水性かつ極性残基を含み、我々のビフェニルアミドシリーズに対してより大きい疎水性置換、例えば、我々の実験的に観察されたＳＡＲの傾向についての構造的関係をもたらす、Ｓ１及び上部Ｓ２ヘリックス中のメントール結合領域に対して、我々の効力のあるナノモルアンタゴニスト／化合物５、７及び１０～１５において見られるもののようなものを優先的に受け入れることができる。この近傍の残基（なかでもＧｌｕ７８２、Ａｒｇ８４２（ＴＲＰＭ８FAにおいてＡｒｇ８４１）及びＨｉｓ８４５（ＴＲＰＭ８FAにおいてＨｉｓ８４４））は、複数の立体配座を採用して、ＴＲＰＭ８がＷＳ－１２及びイシリンの両方と結合できるようにすることが報告されている。
【0182】
[00208]
スピロシクロヘキシル基から３．６及び３．８Å離れた嵩高い残基、例えばＴｒｐ７９８（Ｓ３）及びＨｉｓ８４５（Ｓ４）の存在は、化合物８及び９のデカヒドロナフタレン－１－イル及びテトラヒドロナフタレン－１－イル環を立体的に反発させるように働くことがあり、この領域にてより大きい程度の立体配座的可動性（化合物５及び７におけるような）又はより最適な二環式配置（化合物１０～１４）を有する我々のシリーズの他のアナログに対して、それらのＴＲＰＭ８効力をμＭ範囲まで効率的に減少させる。
スピロシクロヘキシル基から３．６及び３．８Å離れた嵩高い残基、例えばＴｒｐ７９８（Ｓ３）及びＨｉｓ８４５（Ｓ４）の存在は、化合物８及び９のデカヒドロナフタレン－１－イル及びテトラヒドロナフタレン－１－イル環を立体的に反発させるように働くことがあり、この領域にてより大きい程度の立体配座的可動性（化合物５及び７におけるような）又はより最適な二環式配置（化合物１０～１４）を有する我々のシリーズの他のアナログに対して、それらのＴＲＰＭ８効力をμＭ範囲まで効率的に減少させる。
【0183】
[00209]
興味深いことに、化合物１４は、Ａｒｇ１００８と相互作用しないし（化合物１、５及び７の場合のように）、水素結合も形成しないが、代わりに、Ｐａｒｕｓ ｍａｊｏｒ（オウム）のＴＲＰＭ８（ｐｍＴＲＰＭ８）と結合した、アンタゴニストであるＡＭＴＢ及びＪＮＪ４１８７６６６６／ＴＣ－Ｉ２０１４の最近報告された構造（それぞれＰＤＢ ６Ｏ６Ｒ及び６Ｏ７２）で見られるものと同様に、結合キャビティ内で広い疎水性接触を形成する。ＪＮＪ４１８７６６６６／ＴＣ－Ｉ２０１４複合体構造との化合物１４のポストＭＤポーズの比較により、両方のアンタゴニストのビフェニルが、ＶＳＬＤ内で重なり合うことが明らかになり、このことは、我々のＭＤの結果を支持するが、スピロ含有部分は、ポケット中で反対向きに配向する。ＪＮＪ４１８７６６６６／ＴＣ－Ｉ２０１４のスピロ－イソキサゾリンに対して、化合物１４のスピロ［４．５］デカン－８－イルについて見られる反対向きの配向は、立体配座的に堅いベンズイミダゾールに対して、アミド（三角平面幾何学的配置、１２０°）から離れて突出するいずれかの基に起因する。
興味深いことに、化合物１４は、Ａｒｇ１００８と相互作用しないし（化合物１、５及び７の場合のように）、水素結合も形成しないが、代わりに、Ｐａｒｕｓ ｍａｊｏｒ（オウム）のＴＲＰＭ８（ｐｍＴＲＰＭ８）と結合した、アンタゴニストであるＡＭＴＢ及びＪＮＪ４１８７６６６６／ＴＣ－Ｉ２０１４の最近報告された構造（それぞれＰＤＢ ６Ｏ６Ｒ及び６Ｏ７２）で見られるものと同様に、結合キャビティ内で広い疎水性接触を形成する。ＪＮＪ４１８７６６６６／ＴＣ－Ｉ２０１４複合体構造との化合物１４のポストＭＤポーズの比較により、両方のアンタゴニストのビフェニルが、ＶＳＬＤ内で重なり合うことが明らかになり、このことは、我々のＭＤの結果を支持するが、スピロ含有部分は、ポケット中で反対向きに配向する。ＪＮＪ４１８７６６６６／ＴＣ－Ｉ２０１４のスピロ－イソキサゾリンに対して、化合物１４のスピロ［４．５］デカン－８－イルについて見られる反対向きの配向は、立体配座的に堅いベンズイミダゾールに対して、アミド（三角平面幾何学的配置、１２０°）から離れて突出するいずれかの基に起因する。
【0184】
[00210]
実施例９－ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１でのインシリコ選択性プロファイリング
[00211]
化合物１４の選択性プロフィールを合理的に説明するために、この化合物を、ｒＴＲＰＶ１（ＰＤＢ ３Ｊ５Ｒ）及びｈＴＲＰＡ１（ＰＤＢ ３Ｊ９Ｐ）のクリオＥＭ構造にドッキングさせ、これらのポーズを、ｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルにおけるプレＭＤ（ドッキング済み）ポーズと比較した。興味深いことに、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１の結合ポケットは、ＶＬＳＤ（Ｓ１～Ｓ４）、Ｓ５～Ｓ６により形成されるポアドメイン、及びポアヘリックスの異なる領域を占める（図９）。バニロイドリガンド、レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）、カプサイシン様ホモバニリルエステルアンタゴニストである及び競合アンタゴニストカプサゼピンは、ＴＲＰＶ１残基と、Ｓ３及びＳ４ヘリックス、並びにＳ４～Ｓ５リンカー中で、２．９Å及び３．４Åで結合する。Ｓ１～Ｓ４ヘリックス及びＴＲＰヘリックス内に結合ポケットが規定される鳥類ＴＲＰＭ８のリガンドを有する（liganded）クリオＥＭ構造と一緒にすると、これらの構造は、両方のＴＲＰサブタイプについての構造的に共通点のない天然生成物リガンド、すなわちそれぞれメントール及びカプサイシンについて、中心的結合部位がないことを示唆した。むしろ、これらの分子は、各チャネルのＶＳＬＤ内の異なる領域と結合する。ＴＲＰＡ１の構造はリガンドを有さないが（約４Å）、鍵となるＰｈｅ９０９残基の突然変異誘発研究とともにクリオＥＭは、天然生成物アゴニストアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）及びアンタゴニストＡ－９６７０７９が、Ｓ５、Ｓ６及びポアヘリックス中の残基により規定される部位に結合することを示唆し、このことは、また、天然からのプロトタイプのＴＲＰチャネルアゴニストが、それらのそれぞれのサブタイプに対して異なるポケットに結合することを示唆した。
実施例９－ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１でのインシリコ選択性プロファイリング
[00211]
化合物１４の選択性プロフィールを合理的に説明するために、この化合物を、ｒＴＲＰＶ１（ＰＤＢ ３Ｊ５Ｒ）及びｈＴＲＰＡ１（ＰＤＢ ３Ｊ９Ｐ）のクリオＥＭ構造にドッキングさせ、これらのポーズを、ｈＴＲＰＭ８ホモロジーモデルにおけるプレＭＤ（ドッキング済み）ポーズと比較した。興味深いことに、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１の結合ポケットは、ＶＬＳＤ（Ｓ１～Ｓ４）、Ｓ５～Ｓ６により形成されるポアドメイン、及びポアヘリックスの異なる領域を占める（図９）。バニロイドリガンド、レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）、カプサイシン様ホモバニリルエステルアンタゴニストである及び競合アンタゴニストカプサゼピンは、ＴＲＰＶ１残基と、Ｓ３及びＳ４ヘリックス、並びにＳ４～Ｓ５リンカー中で、２．９Å及び３．４Åで結合する。Ｓ１～Ｓ４ヘリックス及びＴＲＰヘリックス内に結合ポケットが規定される鳥類ＴＲＰＭ８のリガンドを有する（liganded）クリオＥＭ構造と一緒にすると、これらの構造は、両方のＴＲＰサブタイプについての構造的に共通点のない天然生成物リガンド、すなわちそれぞれメントール及びカプサイシンについて、中心的結合部位がないことを示唆した。むしろ、これらの分子は、各チャネルのＶＳＬＤ内の異なる領域と結合する。ＴＲＰＡ１の構造はリガンドを有さないが（約４Å）、鍵となるＰｈｅ９０９残基の突然変異誘発研究とともにクリオＥＭは、天然生成物アゴニストアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）及びアンタゴニストＡ－９６７０７９が、Ｓ５、Ｓ６及びポアヘリックス中の残基により規定される部位に結合することを示唆し、このことは、また、天然からのプロトタイプのＴＲＰチャネルアゴニストが、それらのそれぞれのサブタイプに対して異なるポケットに結合することを示唆した。
【0185】
[00212]
化合物の選択性を合理的に説明するために、化合物１４をＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１にドッキングさせ、これらの結果を、ＴＲＰＭ８にドッキングした化合物１４のポーズ（プレＭＤ）（ＴＲＰＭ８でのドッキングエネルギー－９．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と比較した。図９Ｃに示すように、ドッキングポーズは、化合物１４が、ＴＲＰＭ８と広い相互作用を形成することを示す。Ｔｒｐ７９８、Ａｒｇ８４２、Ｈｉｓ８４５、Ｉｌｅ８４６、Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５を含むいくつかの重要な残基が、化合物１４の結合に寄与した。図９Ｂは、化合物１４とＴＲＰＡ１との間の相互作用を示す。ＴＲＰＡ１の結合ポケットは、Ｐｈｅ９０９（ポアヘリックス１）、Ｌｅｕ８８１（Ｓ５）、Ｉｌｅ８７８（Ｓ５）、Ｐｈｅ８７７（Ｓ５）及びＴｈｒ８７４（Ｓ５）（これは、報告された結合部位と一貫している）を含むＳ５、Ｓ６及び第一ポアヘリックスで形成されるポケット内の独特の密度を明らかにした。相互作用を分析することにより、Ｔｈｒ８７４が化合物１４と水素結合を形成するが、Ｐｈｅ９０９、Ｌｅｕ８８１、Ｉｌｅ８７８及びＬｅｕ８７１は、疎水性相互作用に寄与することが見いだされた。図９Ｄは、ＴＲＰＶ１における化合物１４の結合ポーズを示す。ＴＲＰＶ１におけるポケットは、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ４－Ｓ５リンカー、Ｓ５及びＳ６を含む２つの隣接する単量体からの５つの膜貫通ドメインにより形成された。Ｔｙｒ５１１（Ｓ３）、Ｌｅｕ５１５（Ｓ３）、Ｌｅｕ５７４（Ｓ４）、Ｔｈｒ５５０（Ｓ４）、Ａｒｇ５５７（Ｓ４－Ｓ５リンカー）、Ｇｌｕ５７０（第一単量体のＳ５）及びＬｅｕ６７２（第二単量体のＳ６）を含む、結合ポケット内のいくつかの重要な残基を、図９Ｄに示す。Ｔｈｒ５５０が化合物１４と強い水素結合を形成するが、Ｌｅｕ５１５及びＬｅｕ５７４は、化合物１４と疎水性接触を形成することが見いだされた。ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１での化合物１４のドッキングエネルギーは、－９．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－７．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び－８．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、化合物１４が優先的にＴＲＰＭ８と結合するはずであることを示した。表３におけるハイスループットＦＬＩＰＲアッセイから、化合物１４は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１と比べて、ＴＲＰＭ８に緩やかに選択的（１３倍）であった。
化合物の選択性を合理的に説明するために、化合物１４をＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１にドッキングさせ、これらの結果を、ＴＲＰＭ８にドッキングした化合物１４のポーズ（プレＭＤ）（ＴＲＰＭ８でのドッキングエネルギー－９．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と比較した。図９Ｃに示すように、ドッキングポーズは、化合物１４が、ＴＲＰＭ８と広い相互作用を形成することを示す。Ｔｒｐ７９８、Ａｒｇ８４２、Ｈｉｓ８４５、Ｉｌｅ８４６、Ｌｅｕ１００１及びＴｙｒ１００５を含むいくつかの重要な残基が、化合物１４の結合に寄与した。図９Ｂは、化合物１４とＴＲＰＡ１との間の相互作用を示す。ＴＲＰＡ１の結合ポケットは、Ｐｈｅ９０９（ポアヘリックス１）、Ｌｅｕ８８１（Ｓ５）、Ｉｌｅ８７８（Ｓ５）、Ｐｈｅ８７７（Ｓ５）及びＴｈｒ８７４（Ｓ５）（これは、報告された結合部位と一貫している）を含むＳ５、Ｓ６及び第一ポアヘリックスで形成されるポケット内の独特の密度を明らかにした。相互作用を分析することにより、Ｔｈｒ８７４が化合物１４と水素結合を形成するが、Ｐｈｅ９０９、Ｌｅｕ８８１、Ｉｌｅ８７８及びＬｅｕ８７１は、疎水性相互作用に寄与することが見いだされた。図９Ｄは、ＴＲＰＶ１における化合物１４の結合ポーズを示す。ＴＲＰＶ１におけるポケットは、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ４－Ｓ５リンカー、Ｓ５及びＳ６を含む２つの隣接する単量体からの５つの膜貫通ドメインにより形成された。Ｔｙｒ５１１（Ｓ３）、Ｌｅｕ５１５（Ｓ３）、Ｌｅｕ５７４（Ｓ４）、Ｔｈｒ５５０（Ｓ４）、Ａｒｇ５５７（Ｓ４－Ｓ５リンカー）、Ｇｌｕ５７０（第一単量体のＳ５）及びＬｅｕ６７２（第二単量体のＳ６）を含む、結合ポケット内のいくつかの重要な残基を、図９Ｄに示す。Ｔｈｒ５５０が化合物１４と強い水素結合を形成するが、Ｌｅｕ５１５及びＬｅｕ５７４は、化合物１４と疎水性接触を形成することが見いだされた。ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１での化合物１４のドッキングエネルギーは、－９．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－７．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び－８．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、化合物１４が優先的にＴＲＰＭ８と結合するはずであることを示した。表３におけるハイスループットＦＬＩＰＲアッセイから、化合物１４は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１と比べて、ＴＲＰＭ８に緩やかに選択的（１３倍）であった。
【0186】
[00213]
化合物１４の代謝安定性試験を、マウス肝臓ミクロソームにおいて行って、インビボでのＴＲＰＭ８化学プローブとしてのその適格性を決定した。化合物１４は、マウス肝臓ミクロソームにおいて３０分の半減期（ｔ1/2）及び０．０４５５ｍＬ／分／ｍｇの固有クリアランス（ＣＬint）を有し、行動アッセイを行うための十分な代謝安定性を示す（表Ｓ５）。化合物１４は、スピロ又は芳香族環のＣＹＰ４５０ヒドロキシル化を受け、ｔ1/2＝３０分を導き得る。
化合物１４の代謝安定性試験を、マウス肝臓ミクロソームにおいて行って、インビボでのＴＲＰＭ８化学プローブとしてのその適格性を決定した。化合物１４は、マウス肝臓ミクロソームにおいて３０分の半減期（ｔ1/2）及び０．０４５５ｍＬ／分／ｍｇの固有クリアランス（ＣＬint）を有し、行動アッセイを行うための十分な代謝安定性を示す（表Ｓ５）。化合物１４は、スピロ又は芳香族環のＣＹＰ４５０ヒドロキシル化を受け、ｔ1/2＝３０分を導き得る。
【0187】
表Ｓ５．マウス肝臓ミクロソームにおける化合物１４の安定性。
【表10】
【0188】
[00214]
実施例１０－インビボ分析。
[00215]
身震い行動（ＷＤＳ）アッセイ。インビトロでＴＲＰＭ８を有効に阻害する化合物１４の観察された能力が、インビボでのＴＲＰＭ８依存性の抗侵害受容性活性とも解釈できるかを決定するために、「身震い行動」（ＷＤＳ）アッセイを行った。このアッセイでは、イシリン（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内ｉ．ｐ．）を、化合物１４又はビヒクルで処理したマウスに注射した。マウスにおいて、ＴＲＰＭ８は、インビトロアッセイにおいて用いていたラットＴＲＰＭ８と高いホモロジーを有することが知られている。マウスにおけるイシリン注射は鮮明で定量可能なＴＲＰＭ８媒介身震い行動を生じる。化合物１４（１、３０及び５０ｍｇ／ｋｇ）又はそのビヒクルを、皮下投与（ｓ．ｃ．）した３０分後にイシリンを注射した。
実施例１０－インビボ分析。
[00215]
身震い行動（ＷＤＳ）アッセイ。インビトロでＴＲＰＭ８を有効に阻害する化合物１４の観察された能力が、インビボでのＴＲＰＭ８依存性の抗侵害受容性活性とも解釈できるかを決定するために、「身震い行動」（ＷＤＳ）アッセイを行った。このアッセイでは、イシリン（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内ｉ．ｐ．）を、化合物１４又はビヒクルで処理したマウスに注射した。マウスにおいて、ＴＲＰＭ８は、インビトロアッセイにおいて用いていたラットＴＲＰＭ８と高いホモロジーを有することが知られている。マウスにおけるイシリン注射は鮮明で定量可能なＴＲＰＭ８媒介身震い行動を生じる。化合物１４（１、３０及び５０ｍｇ／ｋｇ）又はそのビヒクルを、皮下投与（ｓ．ｃ．）した３０分後にイシリンを注射した。
【0189】
[00216]
冷覚異痛症。化学療法誘発末梢神経障害（ＣＩＰＮ）により引き起こされる冷覚過敏症を模倣する状態である、オキサリプラチン（ＯＸＰ）により誘発される化学療法誘発神経障害性疼痛のマウスモデルにおいて、ＴＲＰＭ８が役割を演じることを示唆する証拠が増えてきている。急性及び慢性の両方のＯＸＰ誘導冷覚過敏症は、ラットにおいて再現され、ＴＲＰＭ８発現及び機能と関連づけられている。Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉらは、げっ歯類モデルにおいて、ＯＸＰ注射後の急性冷覚異痛症が、ＴＲＰＭ８遮断薬であるＮ－（２－アミノエチル）－Ｎ－［４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシベンジル］－Ｎ’－（１Ｓ）－１－（フェニル）エチル］尿素及びＴＣ－Ｉ２０１４により改善されたことを報告した。これらの知見に従って、アセトンを冷感刺激として用いるＯＸＰ誘導冷覚異痛症モデルにおける化合物１４の影響を調べた。冷覚疼痛閾値がＯＸＰ処置患者においておよそ１２℃からおよそ２６℃に増加することを考慮して、アセトン刺激は、ＯＸＰ処理マウスにおいて疼痛を誘発すると考えれる。
冷覚異痛症。化学療法誘発末梢神経障害（ＣＩＰＮ）により引き起こされる冷覚過敏症を模倣する状態である、オキサリプラチン（ＯＸＰ）により誘発される化学療法誘発神経障害性疼痛のマウスモデルにおいて、ＴＲＰＭ８が役割を演じることを示唆する証拠が増えてきている。急性及び慢性の両方のＯＸＰ誘導冷覚過敏症は、ラットにおいて再現され、ＴＲＰＭ８発現及び機能と関連づけられている。Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉらは、げっ歯類モデルにおいて、ＯＸＰ注射後の急性冷覚異痛症が、ＴＲＰＭ８遮断薬であるＮ－（２－アミノエチル）－Ｎ－［４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシベンジル］－Ｎ’－（１Ｓ）－１－（フェニル）エチル］尿素及びＴＣ－Ｉ２０１４により改善されたことを報告した。これらの知見に従って、アセトンを冷感刺激として用いるＯＸＰ誘導冷覚異痛症モデルにおける化合物１４の影響を調べた。冷覚疼痛閾値がＯＸＰ処置患者においておよそ１２℃からおよそ２６℃に増加することを考慮して、アセトン刺激は、ＯＸＰ処理マウスにおいて疼痛を誘発すると考えれる。
【0190】
[00217]
図１０に示すように、化合物１４は、著しい、用量応答性の抗侵害受容性行動を生じる。５０ｍｇ／ｋｇの最高の用量にて、化合物１４は、マウスにおけるＷＤＳ様冷覚過敏症を、標準的な鎮痛性用量のガバペンチン（２５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）で観察されるものに匹敵する有効性で阻害する。
図１０に示すように、化合物１４は、著しい、用量応答性の抗侵害受容性行動を生じる。５０ｍｇ／ｋｇの最高の用量にて、化合物１４は、マウスにおけるＷＤＳ様冷覚過敏症を、標準的な鎮痛性用量のガバペンチン（２５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）で観察されるものに匹敵する有効性で阻害する。
【0191】
[00218]
これらの結果は、Ｃａ2+フラックスアッセイ及びパッチクランプアッセイの両方における化合物１４のアンタゴニスト活性を、動物全体モデルにおいて、機械論的にＴＲＰＭ８に結び付ける。なぜなら、イシリン誘導ＷＤＳ行動は、ＴＲＰＭ８ヌルマウスにおいて再現可能でないからである。このデータは、化学的又は薬理学的プローブ分子のための鍵となる属性を証明する。
これらの結果は、Ｃａ2+フラックスアッセイ及びパッチクランプアッセイの両方における化合物１４のアンタゴニスト活性を、動物全体モデルにおいて、機械論的にＴＲＰＭ８に結び付ける。なぜなら、イシリン誘導ＷＤＳ行動は、ＴＲＰＭ８ヌルマウスにおいて再現可能でないからである。このデータは、化学的又は薬理学的プローブ分子のための鍵となる属性を証明する。
【0192】
[00219]
ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２及びＴＲＰＶ４を含む熱的ＴＲＰは、化学療法誘発末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を処置するための可能性のある新しい標的として文献に記載されている。冷覚に対する感覚による認識における欠陥は、なかでも、通常は無痛性の冷覚刺激から経験する疼痛と定義される冷覚異痛症、及び有痛性の冷覚刺激からの疼痛応答の高まりである冷覚痛覚過敏として現れる。このような冷覚障害は、化学療法誘発異痛症、神経障害性疼痛、複合性局所疼痛症候群及び疼痛性膀胱症候群において臨床的にみられる。冷覚曝露に対する異常な急性の感覚応答は、結腸直腸癌などに最も一般的に用いられる抗腫瘍処置である化学治療剤オキサリプラチンでの１回目の処置の後に発生する。さらに、オキサリプラチンは、おそらくＴＲＰＭ８の過剰発現又は活性により、メントールに対する感応性の増加を促進する。特に、結腸直腸癌は、がん死亡率の第２位の原因であり、最も一般的な悪性疾患の第４位である。嚥下障害に導く冷覚感応性知覚異常及び咽頭攣縮は、オキサリプラチン処置の結果として発生し、オキサリプラチンに関連する感覚神経毒性（ｓＮＴ）である。さらに、肺癌、精巣癌及び卵巣癌を処置するために用いられるシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンを含むすべての白金薬剤は、感覚神経障害を誘導することが知られている。
ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２及びＴＲＰＶ４を含む熱的ＴＲＰは、化学療法誘発末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を処置するための可能性のある新しい標的として文献に記載されている。冷覚に対する感覚による認識における欠陥は、なかでも、通常は無痛性の冷覚刺激から経験する疼痛と定義される冷覚異痛症、及び有痛性の冷覚刺激からの疼痛応答の高まりである冷覚痛覚過敏として現れる。このような冷覚障害は、化学療法誘発異痛症、神経障害性疼痛、複合性局所疼痛症候群及び疼痛性膀胱症候群において臨床的にみられる。冷覚曝露に対する異常な急性の感覚応答は、結腸直腸癌などに最も一般的に用いられる抗腫瘍処置である化学治療剤オキサリプラチンでの１回目の処置の後に発生する。さらに、オキサリプラチンは、おそらくＴＲＰＭ８の過剰発現又は活性により、メントールに対する感応性の増加を促進する。特に、結腸直腸癌は、がん死亡率の第２位の原因であり、最も一般的な悪性疾患の第４位である。嚥下障害に導く冷覚感応性知覚異常及び咽頭攣縮は、オキサリプラチン処置の結果として発生し、オキサリプラチンに関連する感覚神経毒性（ｓＮＴ）である。さらに、肺癌、精巣癌及び卵巣癌を処置するために用いられるシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンを含むすべての白金薬剤は、感覚神経障害を誘導することが知られている。
【0193】
[00220]
熱痛覚過敏は、初期の発症におけるオキサリプラチン神経毒性の臨床マーカーであり、重篤な神経障害を予測できる。冷覚過敏症は、オキサリプラチン誘導神経障害の特徴である。前臨床的に、無害及び有害の冷覚刺激に対するオキサリプラチン誘導過敏症は、ノックアウト研究により確認されたように、ＴＲＰＭ８依存性機構により前進する。二機能性ＴＲＰＭ８／ＴＲＰＶ１アンタゴニストカプサゼピンでのＴＲＰＭ８遮断は、オキサリプラチン誘導冷覚異痛症をインビボにて用量依存的に阻害し、これは、ＴＲＰＶ１アンタゴニスト５’－ヨードレシニフェラトキシンを用いては見られない効果である。同様に、ＤＲＧにおけるＴＲＰＭ８ ｍＲＮＡ発現は、オキサリプラチンの単回注射により誘導される冷覚異痛症の後に著しく増加し、これは、インビボでのＴＲＰＭ８刺激に対する応答の増加と機能的に結び付く効果である。これらの研究は、オキサリプラチン処置及びオキサリプラチン代謝産物オキサレートでの処置による冷覚痛覚過敏の誘導後の、Ｌ４－Ｌ６ ＤＲＧにおけるＴＲＰＭ８ ｍＲＮＡ発現の同様の増加を報告する以前の文献と一致している。インビトロでは、ＴＲＰＭ８ ｍＲＮＡレベルは、オキサリプラチン処置ＤＲＧニューロンにおいても著しく増加した。化合物１４を、オキサリプラチンにより誘発される末梢神経障害性疼痛モデルにおける冷覚に対する感覚応答を遮断する能力について評価した。なぜなら、冷覚過敏症は、オキサリプラチン誘導神経障害の特徴であるからである。新しくより標的化した化学療法でのがん処置の発展にもかかわらず、現在、ＣＩＰＮの薬物療法はない。糖尿病性神経障害のために用いられるデュロキセチンは、オキサリプラチンにより誘導されるＣＩＰＮの患者において穏やかな鎮痛性の効果を有するのみである。
熱痛覚過敏は、初期の発症におけるオキサリプラチン神経毒性の臨床マーカーであり、重篤な神経障害を予測できる。冷覚過敏症は、オキサリプラチン誘導神経障害の特徴である。前臨床的に、無害及び有害の冷覚刺激に対するオキサリプラチン誘導過敏症は、ノックアウト研究により確認されたように、ＴＲＰＭ８依存性機構により前進する。二機能性ＴＲＰＭ８／ＴＲＰＶ１アンタゴニストカプサゼピンでのＴＲＰＭ８遮断は、オキサリプラチン誘導冷覚異痛症をインビボにて用量依存的に阻害し、これは、ＴＲＰＶ１アンタゴニスト５’－ヨードレシニフェラトキシンを用いては見られない効果である。同様に、ＤＲＧにおけるＴＲＰＭ８ ｍＲＮＡ発現は、オキサリプラチンの単回注射により誘導される冷覚異痛症の後に著しく増加し、これは、インビボでのＴＲＰＭ８刺激に対する応答の増加と機能的に結び付く効果である。これらの研究は、オキサリプラチン処置及びオキサリプラチン代謝産物オキサレートでの処置による冷覚痛覚過敏の誘導後の、Ｌ４－Ｌ６ ＤＲＧにおけるＴＲＰＭ８ ｍＲＮＡ発現の同様の増加を報告する以前の文献と一致している。インビトロでは、ＴＲＰＭ８ ｍＲＮＡレベルは、オキサリプラチン処置ＤＲＧニューロンにおいても著しく増加した。化合物１４を、オキサリプラチンにより誘発される末梢神経障害性疼痛モデルにおける冷覚に対する感覚応答を遮断する能力について評価した。なぜなら、冷覚過敏症は、オキサリプラチン誘導神経障害の特徴であるからである。新しくより標的化した化学療法でのがん処置の発展にもかかわらず、現在、ＣＩＰＮの薬物療法はない。糖尿病性神経障害のために用いられるデュロキセチンは、オキサリプラチンにより誘導されるＣＩＰＮの患者において穏やかな鎮痛性の効果を有するのみである。
【0194】
[00221]
化合物１４の活性を、冷覚異痛症が発生した時である、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける３回のＯＸＰの腹腔内注射（６ｍｇ／ｋｇ）の７日後に評価した。化合物１４（０．１及び１μｇ）の単回皮下投与の後に、減弱した冷覚異痛症が１５分に明白になり、用量依存的な様式で、投与の３０分後に最大阻害に達する（図１１）。このデータは、化合物１４が、ＣＩＰＮの処置のための能力のある治療的足場であり得ることを示唆する。
化合物１４の活性を、冷覚異痛症が発生した時である、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける３回のＯＸＰの腹腔内注射（６ｍｇ／ｋｇ）の７日後に評価した。化合物１４（０．１及び１μｇ）の単回皮下投与の後に、減弱した冷覚異痛症が１５分に明白になり、用量依存的な様式で、投与の３０分後に最大阻害に達する（図１１）。このデータは、化合物１４が、ＣＩＰＮの処置のための能力のある治療的足場であり得ることを示唆する。
【0195】
[00222]
化合物１４の抗侵害受容性活性は、同じアッセイにおいて、他の報告されている効力のあるＴＲＰＭ８アンタゴニスト（Ｒ）－（－）－１０ｅを越える。（Ｒ）－（－）－１０ｅは、ｐ．ｏ．投与された場合に＞１０，０００倍高い用量であるが、オキサリプラチン誘導侵害防御機構の脚なめ行動を阻害する。同様に、トリプトファンベースのＴＲＰＭ８アンタゴニストは、化合物１４と同じ用量でＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるオキサリプラチン誘導冷覚異痛症を逆にするが、この効果は、おそらく不安定なエステル基のために長続きしない。化合物１４は、ＯＸＰの影響を、２つのｔ1/2値に等しい６０分にて著しく抑制し、このことは、さらなる現象が間近にあることを示唆する。例えば、化合物１４は、その親油性により与えられた薬物デポー効果によりインビボで機能する可能性がある。等しい重要性で、化合物１４及び本明細書に報告するその他のメントール様アンタゴニストは、他の疼痛状態、例えばインビボの慢性神経障害性疼痛（これについてのこのイオンチャネルの役割は、議論の余地がある）におけるＴＲＰＭ８の役割を探求するための有用な化学ツールであり得る。このような小分子足場は、よって、感覚性ニューロパチーのための薬物療法を提供できる。
化合物１４の抗侵害受容性活性は、同じアッセイにおいて、他の報告されている効力のあるＴＲＰＭ８アンタゴニスト（Ｒ）－（－）－１０ｅを越える。（Ｒ）－（－）－１０ｅは、ｐ．ｏ．投与された場合に＞１０，０００倍高い用量であるが、オキサリプラチン誘導侵害防御機構の脚なめ行動を阻害する。同様に、トリプトファンベースのＴＲＰＭ８アンタゴニストは、化合物１４と同じ用量でＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるオキサリプラチン誘導冷覚異痛症を逆にするが、この効果は、おそらく不安定なエステル基のために長続きしない。化合物１４は、ＯＸＰの影響を、２つのｔ1/2値に等しい６０分にて著しく抑制し、このことは、さらなる現象が間近にあることを示唆する。例えば、化合物１４は、その親油性により与えられた薬物デポー効果によりインビボで機能する可能性がある。等しい重要性で、化合物１４及び本明細書に報告するその他のメントール様アンタゴニストは、他の疼痛状態、例えばインビボの慢性神経障害性疼痛（これについてのこのイオンチャネルの役割は、議論の余地がある）におけるＴＲＰＭ８の役割を探求するための有用な化学ツールであり得る。このような小分子足場は、よって、感覚性ニューロパチーのための薬物療法を提供できる。
【0196】
[00223]
手短に言えば、化合物１の（－）－メンチル環の親油性部分での置き換えをつきとめることは、ここに記載し、上記のヒトＴＲＰＭ８ホモロジーモデルにおいて行われるようなＴＲＰＭ８アンタゴニスト足場のコンピュータ研究により示されるように、Ｃａ2+フラックスアッセイにおいて高い効力のｈＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性を有し、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１に対して＞１０倍の選択性を有する新しいシリーズの小分子リガンドの発見を可能にする。これらのメントール最適化アナログは、ヒトＴＲＰＭ８にてナノモルアゴニスト活性を有する、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ（Ｄ－３２６３など）及びＰｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅにより報告されたメントールベースのアゴニストとともに、ＴＲＰＭ８薬理学、構造機能研究及び構造生物学研究を調べるための化学プローブとしての使用を見出すことができる。このシリーズは、オキサリプラチンにより誘導されるＣＩＰＮ及び他のＴＲＰＭ８関連感覚性ニューロパチーのための薬物療法への可能性も提供できる。なぜなら、化合物１４は、オキサリプラチン誘導冷感異痛症をインビボにて減弱できるからである。さらに、これらの化合物は、小分子リガンド及び治療足場の合理的設計のためのＴＲＰＭ８ファーマコフォアの同定を支援することもできる。同定された最も効力のあるアナログの１つ（化合物１４）は、Ｃａ2+フラックス及びパッチクランプアッセイの両方において優れたアンタゴニスト活性を有し、一連のインビトロ及びインビボアッセイにわたって複数のＴＲＰＭ８活性化因子（イシリン、メントール及び冷覚）の影響を用量依存的に阻害できる。化合物１４は、アミド化反応から合成により容易に入手可能であり、キラル中心を有さず、よって、その魅力が増進される。化合物１４は、現在までに記載された最も効力の高いＴＲＰＭ８アンタゴニストの１つである。上記のＳＡＲ研究は、そのスピロ［４．５］デカン－８－イル部分が、同族リガンド（－）－メントールに対して、ＴＲＰＭ８認識についての好ましい足場であり、最適なメントール代用物であることを示唆する。分野は、特に天然生成物ベースの足場の関係において、チャネル活性化対不活性化を取り囲む巧妙さに対処するために、メントール由来アンタゴニストと複合体を形成したＴＲＰＭ８構造を待っている。アンタゴニスト化合物１４は、メントールアナログＷＳ－１２とともに、ＴＲＰＭ８でのアンタゴニスト対アゴニスト媒介分子事象を説明するために、これらの研究のための能力のある選択肢である。
手短に言えば、化合物１の（－）－メンチル環の親油性部分での置き換えをつきとめることは、ここに記載し、上記のヒトＴＲＰＭ８ホモロジーモデルにおいて行われるようなＴＲＰＭ８アンタゴニスト足場のコンピュータ研究により示されるように、Ｃａ2+フラックスアッセイにおいて高い効力のｈＴＲＰＭ８アンタゴニスト活性を有し、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１に対して＞１０倍の選択性を有する新しいシリーズの小分子リガンドの発見を可能にする。これらのメントール最適化アナログは、ヒトＴＲＰＭ８にてナノモルアゴニスト活性を有する、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ（Ｄ－３２６３など）及びＰｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅにより報告されたメントールベースのアゴニストとともに、ＴＲＰＭ８薬理学、構造機能研究及び構造生物学研究を調べるための化学プローブとしての使用を見出すことができる。このシリーズは、オキサリプラチンにより誘導されるＣＩＰＮ及び他のＴＲＰＭ８関連感覚性ニューロパチーのための薬物療法への可能性も提供できる。なぜなら、化合物１４は、オキサリプラチン誘導冷感異痛症をインビボにて減弱できるからである。さらに、これらの化合物は、小分子リガンド及び治療足場の合理的設計のためのＴＲＰＭ８ファーマコフォアの同定を支援することもできる。同定された最も効力のあるアナログの１つ（化合物１４）は、Ｃａ2+フラックス及びパッチクランプアッセイの両方において優れたアンタゴニスト活性を有し、一連のインビトロ及びインビボアッセイにわたって複数のＴＲＰＭ８活性化因子（イシリン、メントール及び冷覚）の影響を用量依存的に阻害できる。化合物１４は、アミド化反応から合成により容易に入手可能であり、キラル中心を有さず、よって、その魅力が増進される。化合物１４は、現在までに記載された最も効力の高いＴＲＰＭ８アンタゴニストの１つである。上記のＳＡＲ研究は、そのスピロ［４．５］デカン－８－イル部分が、同族リガンド（－）－メントールに対して、ＴＲＰＭ８認識についての好ましい足場であり、最適なメントール代用物であることを示唆する。分野は、特に天然生成物ベースの足場の関係において、チャネル活性化対不活性化を取り囲む巧妙さに対処するために、メントール由来アンタゴニストと複合体を形成したＴＲＰＭ８構造を待っている。アンタゴニスト化合物１４は、メントールアナログＷＳ－１２とともに、ＴＲＰＭ８でのアンタゴニスト対アゴニスト媒介分子事象を説明するために、これらの研究のための能力のある選択肢である。
【0197】
[00224]
本明細書で言及する全ての出版物、特許及び特許出願は、以下のリストで述べる参考文献を含めて、参照により本明細書に組込まれている。
本明細書で言及する全ての出版物、特許及び特許出願は、以下のリストで述べる参考文献を含めて、参照により本明細書に組込まれている。
【0198】
参考文献
1. Winchester, W. J.; Gore, K.; Glatt, S.; Petit, W.; Gardiner, J. C.; Conlon, K.; Postlethwaite, M.; Saintot, P. P.; Roberts, S.; Gosset, J. R.; Matsuura, T.; Andrews, M. D.; Glossop, P. A.; Palmer, M. J.; Clear, N.; Collins, S.; Beaumont, K.; Reynolds, D. S. (2014) Inhibition of TRPM8 channels reduces pain in the cold pressor test in humans. J. Pharmacol. Exp. Ther. 351, 259-269.
2. Kobayashi, K.; Fukuoka, T.; Obata, K.; Yamanaka, H.; Dai, Y.; Tokunaga, A.; Noguchi, K. (2005) Distinct expression of TRPM8, TRPA1, and TRPV1 mRNAs in rat primary afferent neurons with adelta/c-fibers and colocalization with trk receptors. J. Comp. Neurol. 493, 596-606.
3. Proudfoot, C. J.; Garry, E. M.; Cottrell, D. F.; Rosie, R.; Anderson, H.; Robertson, D. C.; Fleetwood-Walker, S. M.; Mitchell, R. (2006) Analgesia mediated by the TRPM8 cold receptor in chronic neuropathic pain. Curr. Biol. 16, 1591-1605.
4. McKemy, D. D.; Neuhausser, W. M.; Julius, D. (2002) Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 416, 52-58.
5. Janssens, A.; Voets, T. (2011) Ligand stoichiometry of the cold- and menthol-activated channel TRPM8. J. Physiol. 589, 4827-4835.
6. Perez de Vega, M. J.; Gomez-Monterrey, I.; Ferrer-Montiel, A.; Gonzalez-Muniz, R. (2016) Transient Receptor Potential Melastatin 8 Channel (TRPM8) Modulation: Cool Entryway for Treating Pain and Cancer. J. Med. Chem. 59, 10006-10029.
7. Yin, Y.; Wu, M.; Zubcevic, L.; Borschel, W. F.; Lander, G. C.; Lee, S. Y. (2017) Structure of the cold- and menthol-sensing ion channel TRPM8. Science. 359, 237-241.
8. Yin, Y.; Le, S. C.; Hsu, A. L.; Borgnia, M. J.; Yang, H.; Lee, S. Y. (2019) Structural basis of cooling agent and lipid sensing by the cold-activated TRPM8 channel. Science. 363, eaav9334.
9. Andrews, M. D.; Af Forselles, K.; Beaumont, K.; Galan, S. R.; Glossop, P. A.; Grenie, M.; Jessiman, A.; Kenyon, A. S.; Lunn, G.; Maw, G.; Owen, R. M.; Pryde, D. C.; Roberts, D.; Tran, T. D. (2015) Discovery of a Selective TRPM8 Antagonist with Clinical Efficacy in Cold-Related Pain. ACS Med. Chem. Lett. 6, 419-424.
10. Horne, D. B.; Tamayo, N. A.; Bartberger, M. D.; Bo, Y.; Clarine, J.; Davis, C. D.; Gore, V. K.; Kaller, M. R.; Lehto, S. G.; Ma, V. V.; Nishimura, N.; Nguyen, T. T.; Tang, P.; Wang, W.; Youngblood, B. D.; Zhang, M.; Gavva, N. R.; Monenschein, H.; Norman, M. H. (2014) Optimization of potency and pharmacokinetic properties of tetrahydroisoquinoline transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) antagonists. J. Med. Chem. 57, 2989-3004.
1. Winchester, W. J.; Gore, K.; Glatt, S.; Petit, W.; Gardiner, J. C.; Conlon, K.; Postlethwaite, M.; Saintot, P. P.; Roberts, S.; Gosset, J. R.; Matsuura, T.; Andrews, M. D.; Glossop, P. A.; Palmer, M. J.; Clear, N.; Collins, S.; Beaumont, K.; Reynolds, D. S. (2014) Inhibition of TRPM8 channels reduces pain in the cold pressor test in humans. J. Pharmacol. Exp. Ther. 351, 259-269.
2. Kobayashi, K.; Fukuoka, T.; Obata, K.; Yamanaka, H.; Dai, Y.; Tokunaga, A.; Noguchi, K. (2005) Distinct expression of TRPM8, TRPA1, and TRPV1 mRNAs in rat primary afferent neurons with adelta/c-fibers and colocalization with trk receptors. J. Comp. Neurol. 493, 596-606.
3. Proudfoot, C. J.; Garry, E. M.; Cottrell, D. F.; Rosie, R.; Anderson, H.; Robertson, D. C.; Fleetwood-Walker, S. M.; Mitchell, R. (2006) Analgesia mediated by the TRPM8 cold receptor in chronic neuropathic pain. Curr. Biol. 16, 1591-1605.
4. McKemy, D. D.; Neuhausser, W. M.; Julius, D. (2002) Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 416, 52-58.
5. Janssens, A.; Voets, T. (2011) Ligand stoichiometry of the cold- and menthol-activated channel TRPM8. J. Physiol. 589, 4827-4835.
6. Perez de Vega, M. J.; Gomez-Monterrey, I.; Ferrer-Montiel, A.; Gonzalez-Muniz, R. (2016) Transient Receptor Potential Melastatin 8 Channel (TRPM8) Modulation: Cool Entryway for Treating Pain and Cancer. J. Med. Chem. 59, 10006-10029.
7. Yin, Y.; Wu, M.; Zubcevic, L.; Borschel, W. F.; Lander, G. C.; Lee, S. Y. (2017) Structure of the cold- and menthol-sensing ion channel TRPM8. Science. 359, 237-241.
8. Yin, Y.; Le, S. C.; Hsu, A. L.; Borgnia, M. J.; Yang, H.; Lee, S. Y. (2019) Structural basis of cooling agent and lipid sensing by the cold-activated TRPM8 channel. Science. 363, eaav9334.
9. Andrews, M. D.; Af Forselles, K.; Beaumont, K.; Galan, S. R.; Glossop, P. A.; Grenie, M.; Jessiman, A.; Kenyon, A. S.; Lunn, G.; Maw, G.; Owen, R. M.; Pryde, D. C.; Roberts, D.; Tran, T. D. (2015) Discovery of a Selective TRPM8 Antagonist with Clinical Efficacy in Cold-Related Pain. ACS Med. Chem. Lett. 6, 419-424.
10. Horne, D. B.; Tamayo, N. A.; Bartberger, M. D.; Bo, Y.; Clarine, J.; Davis, C. D.; Gore, V. K.; Kaller, M. R.; Lehto, S. G.; Ma, V. V.; Nishimura, N.; Nguyen, T. T.; Tang, P.; Wang, W.; Youngblood, B. D.; Zhang, M.; Gavva, N. R.; Monenschein, H.; Norman, M. H. (2014) Optimization of potency and pharmacokinetic properties of tetrahydroisoquinoline transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) antagonists. J. Med. Chem. 57, 2989-3004.
【0199】
11. Gavva, N. R.; Davis, C.; Lehto, S. G.; Rao, S.; Wang, W.; Zhu, D. X. (2012) Transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) channels are involved in body temperature regulation. Mol. Pain. 8, 36.
12. Lashinger, E. S.; Steiginga, M. S.; Hieble, J. P.; Leon, L. A.; Gardner, S. D.; Nagilla, R.; Davenport, E. A.; Hoffman, B. E.; Laping, N. J.; Su, X. (2008) AMTB, a TRPM8 channel blocker: evidence in rats for activity in overactive bladder and painful bladder syndrome. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 295, F803-810.
13. Horne, D. B.; Biswas, K.; Brown, J.; Bartberger, M. D.; Clarine, J.; Davis, C. D.; Gore, V. K.; Harried, S.; Horner, M.; Kaller, M. R.; Lehto, S. G.; Liu, Q.; Ma, V. V.; Monenschein, H.; Nguyen, T. T.; Yuan, C.; Youngblood, B. D.; Zhang, M.; Zhong, W.; Allen, J. R.; Chen, J. J.; Gavva, N. (2018) Discovery of TRPM8 Antagonist (S)-6-(((3-fluoro-4-(trifluoromethoxy)phenyl)(3-fluoropyridin-2-yl)methyl)carbamo yl)nicotinic acid (AMG 333), a Clinical Candidate for the Treatment of Migraine. J. Med. Chem. 61, 8186-8201.
14. De Caro, C.; Russo, R.; Avagliano, C.; Cristiano, C.; Calignano, A.; Aramini, A.; Bianchini, G.; Allegretti, M.; Brandolini, L. (2018) Antinociceptive effect of two novel transient receptor potential melastatin 8 antagonists in acute and chronic pain models in rat. Br. J. Pharmacol. 175, 1691-1706.
15. Almeida, M. C.; Hew-Butler, T.; Soriano, R. N.; Rao, S.; Wang, W.; Wang, J.; Tamayo, N.; Oliveira, D. L.; Nucci, T. B.; Aryal, P.; Garami, A.; Bautista, D.; Gavva, N. R.; Romanovsky, A. A. (2012) Pharmacological blockade of the cold receptor TRPM8 attenuates autonomic and behavioral cold defenses and decreases deep body temperature. J. Neurosci. 32, 2086-2099.
16. Okamoto, Y.; Ohkubo, T.; Ikebe, T.; Yamazaki, J. (2012) Blockade of TRPM8 activity reduces the invasion potential of oral squamous carcinoma cell lines. Int. J. Oncol. 40, 1431-1440.
17. Willis, D. N.; Liu, B.; Ha, M. A.; Jordt, S. E.; Morris, J. B. (2011) Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarette smoke irritants. FASEB J. 25, 4434-4444.
18. Lin, A. H.; Liu, M. H.; Ko, H. B.; Perng, D. W.; Lee, T. S.; Kou, Y. R. (2017) Inflammatory Effects of Menthol vs. Non-menthol Cigarette Smoke Extract on Human Lung Epithelial Cells: A Double-Hit on TRPM8 by Reactive Oxygen Species and Menthol. Front. Physiol. 8, 263.
19. Patel, R.; Goncalves, L.; Leveridge, M.; Mack, S. R.; Hendrick, A.; Brice, N. L.; Dickenson, A. H. (2014) Anti-hyperalgesic effects of a novel TRPM8 agonist in neuropathic rats: a comparison with topical menthol. Pain 155, 2097-2107.
20. Voets, T.; Owsianik, G.; Janssens, A.; Talavera, K.; Nilius, B. (2007) TRPM8 voltage sensor mutants reveal a mechanism for integrating thermal and chemical stimuli. Nat. Chem. Biol. 3, 174-182.
12. Lashinger, E. S.; Steiginga, M. S.; Hieble, J. P.; Leon, L. A.; Gardner, S. D.; Nagilla, R.; Davenport, E. A.; Hoffman, B. E.; Laping, N. J.; Su, X. (2008) AMTB, a TRPM8 channel blocker: evidence in rats for activity in overactive bladder and painful bladder syndrome. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 295, F803-810.
13. Horne, D. B.; Biswas, K.; Brown, J.; Bartberger, M. D.; Clarine, J.; Davis, C. D.; Gore, V. K.; Harried, S.; Horner, M.; Kaller, M. R.; Lehto, S. G.; Liu, Q.; Ma, V. V.; Monenschein, H.; Nguyen, T. T.; Yuan, C.; Youngblood, B. D.; Zhang, M.; Zhong, W.; Allen, J. R.; Chen, J. J.; Gavva, N. (2018) Discovery of TRPM8 Antagonist (S)-6-(((3-fluoro-4-(trifluoromethoxy)phenyl)(3-fluoropyridin-2-yl)methyl)carbamo yl)nicotinic acid (AMG 333), a Clinical Candidate for the Treatment of Migraine. J. Med. Chem. 61, 8186-8201.
14. De Caro, C.; Russo, R.; Avagliano, C.; Cristiano, C.; Calignano, A.; Aramini, A.; Bianchini, G.; Allegretti, M.; Brandolini, L. (2018) Antinociceptive effect of two novel transient receptor potential melastatin 8 antagonists in acute and chronic pain models in rat. Br. J. Pharmacol. 175, 1691-1706.
15. Almeida, M. C.; Hew-Butler, T.; Soriano, R. N.; Rao, S.; Wang, W.; Wang, J.; Tamayo, N.; Oliveira, D. L.; Nucci, T. B.; Aryal, P.; Garami, A.; Bautista, D.; Gavva, N. R.; Romanovsky, A. A. (2012) Pharmacological blockade of the cold receptor TRPM8 attenuates autonomic and behavioral cold defenses and decreases deep body temperature. J. Neurosci. 32, 2086-2099.
16. Okamoto, Y.; Ohkubo, T.; Ikebe, T.; Yamazaki, J. (2012) Blockade of TRPM8 activity reduces the invasion potential of oral squamous carcinoma cell lines. Int. J. Oncol. 40, 1431-1440.
17. Willis, D. N.; Liu, B.; Ha, M. A.; Jordt, S. E.; Morris, J. B. (2011) Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarette smoke irritants. FASEB J. 25, 4434-4444.
18. Lin, A. H.; Liu, M. H.; Ko, H. B.; Perng, D. W.; Lee, T. S.; Kou, Y. R. (2017) Inflammatory Effects of Menthol vs. Non-menthol Cigarette Smoke Extract on Human Lung Epithelial Cells: A Double-Hit on TRPM8 by Reactive Oxygen Species and Menthol. Front. Physiol. 8, 263.
19. Patel, R.; Goncalves, L.; Leveridge, M.; Mack, S. R.; Hendrick, A.; Brice, N. L.; Dickenson, A. H. (2014) Anti-hyperalgesic effects of a novel TRPM8 agonist in neuropathic rats: a comparison with topical menthol. Pain 155, 2097-2107.
20. Voets, T.; Owsianik, G.; Janssens, A.; Talavera, K.; Nilius, B. (2007) TRPM8 voltage sensor mutants reveal a mechanism for integrating thermal and chemical stimuli. Nat. Chem. Biol. 3, 174-182.
【0200】
21. Bandell, M.; Dubin, A. E.; Petrus, M. J.; Orth, A.; Mathur, J.; Hwang, S. W.; Patapoutian, A. (2006) High-throughput random mutagenesis screen reveals TRPM8 residues specifically required for activation by menthol. Nat. Neurosci. 9, 493-500.
22. Rath, P.; Hilton, J. K.; Sisco, N. J.; Van Horn, W. D. (2016) Implications of Human Transient Receptor Potential Melastatin 8 (TRPM8) Channel Gating from Menthol Binding Studies of the Sensing Domain. Biochemistry 55, 114-124.
23. Chuang, H. H.; Neuhausser, W. M.; Julius, D. (2004) The super-cooling agent icilin reveals a mechanism of coincidence detection by a temperature-sensitive TRP channel. Neuron 43, 859-869.
24. Autzen, H. E.; Myasnikov, A. G.; Campbell, M. G.; Asarnow, D.; Julius, D.; Cheng, Y. (2018) Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science 359, 228-232.
25. Matos-Cruz, V.; Schneider, E. R.; Mastrotto, M.; Merriman, D. K.; Bagriantsev, S. N.; Gracheva, E. O. (2017) Molecular Prerequisites for Diminished Cold Sensitivity in Ground Squirrels and Hamsters. Cell. Rep. 21, 3329-3337.
26. Ortar, G.; De Petrocellis, L.; Morera, L.; Moriello, A. S.; Orlando, P.; Morera, E.; Nalli, M.; Di Marzo, V. (2010) (-)-Menthylamine derivatives as potent and selective antagonists of transient receptor potential melastatin type-8 (TRPM8) channels. Bioorg Med. Chem. Lett. 20, 2729-2732.
27. Lampe, T.; Alonso-Alija, C.; Beck, H.; Rosentreter, U.; Sandner, P.; Stahl, E.; Stelte-Ludwig, B. Preparation of substituted 2-benzyloxy-benzoic acid amide derivatives as Cold Menthol Receptor 1 (CMR-1) modulators for treating and preventing urological diseases or disorders. 2007017093 A1.
28. Gavva, N. R.; Klionsky, L.; Qu, Y.; Shi, L.; Tamir, R.; Edenson, S.; Zhang, T. J.; Viswanadhan, V. N.; Toth, A.; Pearce, L. V.; Vanderah, T. W.; Porreca, F.; Blumberg, P. M.; Lile, J.; Sun, Y.; Wild, K.; Louis, J. C.; Treanor, J. J. (2004) Molecular determinants of vanilloid sensitivity in TRPV1. J. Biol. Chem. 279, 20283-20295.
29. Behrendt, H. J.; Germann, T.; Gillen, C.; Hatt, H.; Jostock, R. (2004) Characterization of the mouse cold-menthol receptor TRPM8 and vanilloid receptor type-1 VR1 using a fluorometric imaging plate reader (FLIPR) assay. Br. J. Pharmacol. 141, 737-745.
30. Rami, H. K.; Thompson, M.; Wyman, P.; Jerman, J. C.; Egerton, J.; Brough, S.; Stevens, A. J.; Randall, A. D.; Smart, D.; Gunthorpe, M. J.; Davis, J. B. (2004) Discovery of small molecule antagonists of TRPV1. Bioorg Med. Chem. Lett. 14, 3631-3634.
22. Rath, P.; Hilton, J. K.; Sisco, N. J.; Van Horn, W. D. (2016) Implications of Human Transient Receptor Potential Melastatin 8 (TRPM8) Channel Gating from Menthol Binding Studies of the Sensing Domain. Biochemistry 55, 114-124.
23. Chuang, H. H.; Neuhausser, W. M.; Julius, D. (2004) The super-cooling agent icilin reveals a mechanism of coincidence detection by a temperature-sensitive TRP channel. Neuron 43, 859-869.
24. Autzen, H. E.; Myasnikov, A. G.; Campbell, M. G.; Asarnow, D.; Julius, D.; Cheng, Y. (2018) Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science 359, 228-232.
25. Matos-Cruz, V.; Schneider, E. R.; Mastrotto, M.; Merriman, D. K.; Bagriantsev, S. N.; Gracheva, E. O. (2017) Molecular Prerequisites for Diminished Cold Sensitivity in Ground Squirrels and Hamsters. Cell. Rep. 21, 3329-3337.
26. Ortar, G.; De Petrocellis, L.; Morera, L.; Moriello, A. S.; Orlando, P.; Morera, E.; Nalli, M.; Di Marzo, V. (2010) (-)-Menthylamine derivatives as potent and selective antagonists of transient receptor potential melastatin type-8 (TRPM8) channels. Bioorg Med. Chem. Lett. 20, 2729-2732.
27. Lampe, T.; Alonso-Alija, C.; Beck, H.; Rosentreter, U.; Sandner, P.; Stahl, E.; Stelte-Ludwig, B. Preparation of substituted 2-benzyloxy-benzoic acid amide derivatives as Cold Menthol Receptor 1 (CMR-1) modulators for treating and preventing urological diseases or disorders. 2007017093 A1.
28. Gavva, N. R.; Klionsky, L.; Qu, Y.; Shi, L.; Tamir, R.; Edenson, S.; Zhang, T. J.; Viswanadhan, V. N.; Toth, A.; Pearce, L. V.; Vanderah, T. W.; Porreca, F.; Blumberg, P. M.; Lile, J.; Sun, Y.; Wild, K.; Louis, J. C.; Treanor, J. J. (2004) Molecular determinants of vanilloid sensitivity in TRPV1. J. Biol. Chem. 279, 20283-20295.
29. Behrendt, H. J.; Germann, T.; Gillen, C.; Hatt, H.; Jostock, R. (2004) Characterization of the mouse cold-menthol receptor TRPM8 and vanilloid receptor type-1 VR1 using a fluorometric imaging plate reader (FLIPR) assay. Br. J. Pharmacol. 141, 737-745.
30. Rami, H. K.; Thompson, M.; Wyman, P.; Jerman, J. C.; Egerton, J.; Brough, S.; Stevens, A. J.; Randall, A. D.; Smart, D.; Gunthorpe, M. J.; Davis, J. B. (2004) Discovery of small molecule antagonists of TRPV1. Bioorg Med. Chem. Lett. 14, 3631-3634.
【0201】
31. Weil, A.; Moore, S. E.; Waite, N. J.; Randall, A.; Gunthorpe, M. J. (2005) Conservation of functional and pharmacological properties in the distantly related temperature sensors TRVP1 and TRPM8. Mol. Pharmacol. 68, 518-527.
32. Knowlton, W. M.; Daniels, R. L.; Palkar, R.; McCoy, D. D.; McKemy, D. D. (2011) Pharmacological blockade of TRPM8 ion channels alters cold and cold pain responses in mice. PLoS One 6, e25894.
33. Andersson, D. A.; Chase, H. W.; Bevan, S. (2004) TRPM8 activation by menthol, icilin, and cold is differentially modulated by intracellular pH. J. Neurosci. 24, 5364-5369.
34. Andersson, D. A.; Nash, M.; Bevan, S. (2007) Modulation of the cold-activated channel TRPM8 by lysophospholipids and polyunsaturated fatty acids. J. Neurosci. 27, 3347-3355.
35. Hilton, J. K.; Salehpour, T.; Sisco, N. J.; Rath, P.; Van Horn, W. D. (2018) Phosphoinositide-interacting regulator of TRP (PIRT) has opposing effects on human and mouse TRPM8 ion channels. J. Biol. Chem. 293, 9423-9434.
36. Bertamino, A.; Ostacolo, C.; Ambrosino, P.; Musella, S.; Di Sarno, V.; Ciaglia, T.; Soldovieri, M. V.; Iraci, N.; Fernandez Carvajal, A.; de la Torre-Martinez, R.; Ferrer-Montiel, A.; Gonzalez Muniz, R.; Novellino, E.; Taglialatela, M.; Campiglia, P.; Gomez-Monterrey, I. (2016) Tryptamine-Based Derivatives as Transient Receptor Potential Melastatin Type 8 (TRPM8) Channel Modulators. J. Med. Chem. 59, 2179-2191.
37. de la Torre-Martinez, R.; Bonache, M. A.; Llabres-Campaner, P. J.; Balsera, B.; Fernandez-Carvajal, A.; Fernandez-Ballester, G.; Ferrer-Montiel, A.; Perez de Vega, M. J.; Gonzalez-Muniz, R. (2017) Synthesis, high-throughput screening and pharmacological characterization of beta-lactam derivatives as TRPM8 antagonists. Sci. Rep. 7, 10766.
38. Bertamino, A.; Iraci, N.; Ostacolo, C.; Ambrosino, P.; Musella, S.; Di Sarno, V.; Ciaglia, T.; Pepe, G.; Sala, M.; Soldovieri, M. V.; Mosca, I.; Gonzalez-Rodriguez, S.; Fernandez-Carvajal, A.; Ferrer-Montiel, A.; Novellino, E.; Taglialatela, M.; Campiglia, P.; Gomez-Monterrey, I. (2018) Identification of a Potent Tryptophan-Based TRPM8 Antagonist With in Vivo Analgesic Activity. J. Med. Chem. 61, 6140-6152.
39. Wang, L.; Fu, T. M.; Zhou, Y.; Xia, S.; Greka, A.; Wu, H. (2018) Structures and gating mechanism of human TRPM2. Science 362, eaav4809.
40. De Petrocellis, L.; Ligresti, A.; Schiano Moriello, A.; Iappelli, M.; Verde, R.; Stott, C. G.; Cristino, L.; Orlando, P.; Di Marzo, V. (2013) Non-THC cannabinoids inhibit prostate carcinoma growth in vitro and in vivo: pro-apoptotic effects and underlying mechanisms. Br. J. Pharmacol. 168, 79-102.
32. Knowlton, W. M.; Daniels, R. L.; Palkar, R.; McCoy, D. D.; McKemy, D. D. (2011) Pharmacological blockade of TRPM8 ion channels alters cold and cold pain responses in mice. PLoS One 6, e25894.
33. Andersson, D. A.; Chase, H. W.; Bevan, S. (2004) TRPM8 activation by menthol, icilin, and cold is differentially modulated by intracellular pH. J. Neurosci. 24, 5364-5369.
34. Andersson, D. A.; Nash, M.; Bevan, S. (2007) Modulation of the cold-activated channel TRPM8 by lysophospholipids and polyunsaturated fatty acids. J. Neurosci. 27, 3347-3355.
35. Hilton, J. K.; Salehpour, T.; Sisco, N. J.; Rath, P.; Van Horn, W. D. (2018) Phosphoinositide-interacting regulator of TRP (PIRT) has opposing effects on human and mouse TRPM8 ion channels. J. Biol. Chem. 293, 9423-9434.
36. Bertamino, A.; Ostacolo, C.; Ambrosino, P.; Musella, S.; Di Sarno, V.; Ciaglia, T.; Soldovieri, M. V.; Iraci, N.; Fernandez Carvajal, A.; de la Torre-Martinez, R.; Ferrer-Montiel, A.; Gonzalez Muniz, R.; Novellino, E.; Taglialatela, M.; Campiglia, P.; Gomez-Monterrey, I. (2016) Tryptamine-Based Derivatives as Transient Receptor Potential Melastatin Type 8 (TRPM8) Channel Modulators. J. Med. Chem. 59, 2179-2191.
37. de la Torre-Martinez, R.; Bonache, M. A.; Llabres-Campaner, P. J.; Balsera, B.; Fernandez-Carvajal, A.; Fernandez-Ballester, G.; Ferrer-Montiel, A.; Perez de Vega, M. J.; Gonzalez-Muniz, R. (2017) Synthesis, high-throughput screening and pharmacological characterization of beta-lactam derivatives as TRPM8 antagonists. Sci. Rep. 7, 10766.
38. Bertamino, A.; Iraci, N.; Ostacolo, C.; Ambrosino, P.; Musella, S.; Di Sarno, V.; Ciaglia, T.; Pepe, G.; Sala, M.; Soldovieri, M. V.; Mosca, I.; Gonzalez-Rodriguez, S.; Fernandez-Carvajal, A.; Ferrer-Montiel, A.; Novellino, E.; Taglialatela, M.; Campiglia, P.; Gomez-Monterrey, I. (2018) Identification of a Potent Tryptophan-Based TRPM8 Antagonist With in Vivo Analgesic Activity. J. Med. Chem. 61, 6140-6152.
39. Wang, L.; Fu, T. M.; Zhou, Y.; Xia, S.; Greka, A.; Wu, H. (2018) Structures and gating mechanism of human TRPM2. Science 362, eaav4809.
40. De Petrocellis, L.; Ligresti, A.; Schiano Moriello, A.; Iappelli, M.; Verde, R.; Stott, C. G.; Cristino, L.; Orlando, P.; Di Marzo, V. (2013) Non-THC cannabinoids inhibit prostate carcinoma growth in vitro and in vivo: pro-apoptotic effects and underlying mechanisms. Br. J. Pharmacol. 168, 79-102.
【0202】
41. Ha, M. A.; Smith, G. J.; Cichocki, J. A.; Fan, L.; Liu, Y. S.; Caceres, A. I.; Jordt, S. E.; Morris, J. B. (2015) Menthol attenuates respiratory irritation and elevates blood cotinine in cigarette smoke exposed mice. PLoS One 10, e0117128.
42. Tamayo, N. A.; Bo, Y.; Gore, V.; Ma, V.; Nishimura, N.; Tang, P.; Deng, H.; Klionsky, L.; Lehto, S. G.; Wang, W.; Youngblood, B.; Chen, J.; Correll, T. L.; Bartberger, M. D.; Gavva, N. R.; Norman, M. H. (2012) Fused piperidines as a novel class of potent and orally available transient receptor potential melastatin type 8 (TRPM8) antagonists. J. Med. Chem. 55, 1593-1611.
43. Ohmi, M.; Shishido, Y.; Inoue, T.; Ando, K.; Fujiuchi, A.; Yamada, A.; Watanabe, S.; Kawamura, K. (2014) Identification of a novel 2-pyridyl-benzensulfonamide derivative, RQ-00203078, as a selective and orally active TRPM8 antagonist. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, 5364-5368.
44. Caceres, A. I.; Liu, B.; Jabba, S. V.; Achanta, S.; Morris, J. B.; Jordt, S. E. (2017) Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily M Member 8 channels mediate the anti-inflammatory effects of eucalyptol. Br. J. Pharmacol. 174, 867-879.
45. Dodziuk, H.; Jaszunski, M.; Schilf, W. (2005) 1H and 13C NMR chemical shifts and spin-spin coupling constants in trans- and cis-decalins. Magn. Reson. Chem. 43, 639-646.
46. Browne, L. M.; Klinck, R. E.; Stothers, J. B. (1979) Carbon‐13 NMR Studies: 82.† Carbon‐13 spectra of several 10‐methyl‐cis‐decalins. Conformational preferences of some cis‐decalin derivatives. Org. Magn. Reson. 12, 561-568.
47. Player, M. R.; Parks, D. J.; Parsons, W.; Meegalla, S. K.; Illig, C. R.; Ballentine, S. K. Heterocyclic benzimidazoles as TRPM8 modulators. US 20100093788 A1.
48. Chaudhari, S. S.; Kadam, A. B.; Khairatkar-Joshi, N.; Mukhopadhyay, I.; Karnik, P. V.; Raghuram, A.; Rao, S. S.; Vaiyapuri, T. S.; Wale, D. P.; Bhosale, V. M.; Gudi, G. S.; Sangana, R. R.; Thomas, A. (2013) Synthesis and pharmacological evaluation of novel N-aryl-3,4-dihydro-1'H-spiro[chromene-2,4'-piperidine]-1'-carboxamides as TRPM8 antagonists. Bioorg. Med. Chem. 21, 6542-6553.
49. Shishido, Y.; Ohmi, M.; Ando, K. Preparation of azaspiro derivatives as TRPM8 antagonists. WO 2015136947 A1.
50. Klein, A. H.; Iodi Carstens, M.; McCluskey, T. S.; Blancher, G.; Simons, C. T.; Slack, J. P.; Furrer, S.; Carstens, E. (2011) Novel menthol-derived cooling compounds activate primary and second-order trigeminal sensory neurons and modulate lingual thermosensitivity. Chem. Senses 36, 649-658.
42. Tamayo, N. A.; Bo, Y.; Gore, V.; Ma, V.; Nishimura, N.; Tang, P.; Deng, H.; Klionsky, L.; Lehto, S. G.; Wang, W.; Youngblood, B.; Chen, J.; Correll, T. L.; Bartberger, M. D.; Gavva, N. R.; Norman, M. H. (2012) Fused piperidines as a novel class of potent and orally available transient receptor potential melastatin type 8 (TRPM8) antagonists. J. Med. Chem. 55, 1593-1611.
43. Ohmi, M.; Shishido, Y.; Inoue, T.; Ando, K.; Fujiuchi, A.; Yamada, A.; Watanabe, S.; Kawamura, K. (2014) Identification of a novel 2-pyridyl-benzensulfonamide derivative, RQ-00203078, as a selective and orally active TRPM8 antagonist. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, 5364-5368.
44. Caceres, A. I.; Liu, B.; Jabba, S. V.; Achanta, S.; Morris, J. B.; Jordt, S. E. (2017) Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily M Member 8 channels mediate the anti-inflammatory effects of eucalyptol. Br. J. Pharmacol. 174, 867-879.
45. Dodziuk, H.; Jaszunski, M.; Schilf, W. (2005) 1H and 13C NMR chemical shifts and spin-spin coupling constants in trans- and cis-decalins. Magn. Reson. Chem. 43, 639-646.
46. Browne, L. M.; Klinck, R. E.; Stothers, J. B. (1979) Carbon‐13 NMR Studies: 82.† Carbon‐13 spectra of several 10‐methyl‐cis‐decalins. Conformational preferences of some cis‐decalin derivatives. Org. Magn. Reson. 12, 561-568.
47. Player, M. R.; Parks, D. J.; Parsons, W.; Meegalla, S. K.; Illig, C. R.; Ballentine, S. K. Heterocyclic benzimidazoles as TRPM8 modulators. US 20100093788 A1.
48. Chaudhari, S. S.; Kadam, A. B.; Khairatkar-Joshi, N.; Mukhopadhyay, I.; Karnik, P. V.; Raghuram, A.; Rao, S. S.; Vaiyapuri, T. S.; Wale, D. P.; Bhosale, V. M.; Gudi, G. S.; Sangana, R. R.; Thomas, A. (2013) Synthesis and pharmacological evaluation of novel N-aryl-3,4-dihydro-1'H-spiro[chromene-2,4'-piperidine]-1'-carboxamides as TRPM8 antagonists. Bioorg. Med. Chem. 21, 6542-6553.
49. Shishido, Y.; Ohmi, M.; Ando, K. Preparation of azaspiro derivatives as TRPM8 antagonists. WO 2015136947 A1.
50. Klein, A. H.; Iodi Carstens, M.; McCluskey, T. S.; Blancher, G.; Simons, C. T.; Slack, J. P.; Furrer, S.; Carstens, E. (2011) Novel menthol-derived cooling compounds activate primary and second-order trigeminal sensory neurons and modulate lingual thermosensitivity. Chem. Senses 36, 649-658.
【0203】
51. Bodding, M.; Wissenbach, U.; Flockerzi, V. (2007) Characterisation of TRPM8 as a pharmacophore receptor. Cell Calcium 42, 618-628.
52. Zhu, B.; Xia, M.; Xu, X.; Ludovici, D. W.; Tennakoon, M.; Youngman, M. A.; Matthews, J. M.; Dax, S. L.; Colburn, R. W.; Qin, N.; Hutchinson, T. L.; Lubin, M. L.; Brandt, M. R.; Stone, D. J.; Flores, C. M.; Macielag, M. J. (2013) Arylglycine derivatives as potent transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 2234-2237.
53. Calvo, R. R.; Meegalla, S. K.; Parks, D. J.; Parsons, W. H.; Ballentine, S. K.; Lubin, M. L.; Schneider, C.; Colburn, R. W.; Flores, C. M.; Player, M. R. (2012) Discovery of vinylcycloalkyl-substituted benzimidazole TRPM8 antagonists effective in the treatment of cold allodynia. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 1903-1907.
54. Patel, R.; Goncalves, L.; Newman, R.; Jiang, F. L.; Goldby, A.; Reeve, J.; Hendrick, A.; Teall, M.; Hannah, D.; Almond, S.; Brice, N.; Dickenson, A. H. (2014) Novel TRPM8 antagonist attenuates cold hypersensitivity after peripheral nerve injury in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 349, 47-55.
55. Takaishi, M.; Uchida, K.; Suzuki, Y.; Matsui, H.; Shimada, T.; Fujita, F.; Tominaga, M. (2016) Reciprocal effects of capsaicin and menthol on thermosensation through regulated activities of TRPV1 and TRPM8. J. Physiol. Sci. 66, 143-155.
56. Macpherson, L. J.; Hwang, S. W.; Miyamoto, T.; Dubin, A. E.; Patapoutian, A.; Story, G. M. (2006) More than cool: promiscuous relationships of menthol and other sensory compounds. Mol. Cell Neurosci. 32, 335-343.
57. Karashima, Y.; Damann, N.; Prenen, J.; Talavera, K.; Segal, A.; Voets, T.; Nilius, B. (2007) Bimodal action of menthol on the transient receptor potential channel TRPA1. J. Neurosci. 27, 9874-9884.
58. Story, G. M.; Peier, A. M.; Reeve, A. J.; Eid, S. R.; Mosbacher, J.; Hricik, T. R.; Earley, T. J.; Hergarden, A. C.; Andersson, D. A.; Hwang, S. W.; McIntyre, P.; Jegla, T.; Bevan, S.; Patapoutian, A. (2003) ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell 112, 819-829.
59. Karashima, Y.; Talavera, K.; Everaerts, W.; Janssens, A.; Kwan, K. Y.; Vennekens, R.; Nilius, B.; Voets, T. (2009) TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 106, 1273-1278.
60. McNamara, C. R.; Mandel-Brehm, J.; Bautista, D. M.; Siemens, J.; Deranian, K. L.; Zhao, M.; Hayward, N. J.; Chong, J. A.; Julius, D.; Moran, M. M.; Fanger, C. M. (2007) TRPA1 mediates formalin-induced pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 104, 13525-13530.
52. Zhu, B.; Xia, M.; Xu, X.; Ludovici, D. W.; Tennakoon, M.; Youngman, M. A.; Matthews, J. M.; Dax, S. L.; Colburn, R. W.; Qin, N.; Hutchinson, T. L.; Lubin, M. L.; Brandt, M. R.; Stone, D. J.; Flores, C. M.; Macielag, M. J. (2013) Arylglycine derivatives as potent transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 2234-2237.
53. Calvo, R. R.; Meegalla, S. K.; Parks, D. J.; Parsons, W. H.; Ballentine, S. K.; Lubin, M. L.; Schneider, C.; Colburn, R. W.; Flores, C. M.; Player, M. R. (2012) Discovery of vinylcycloalkyl-substituted benzimidazole TRPM8 antagonists effective in the treatment of cold allodynia. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 1903-1907.
54. Patel, R.; Goncalves, L.; Newman, R.; Jiang, F. L.; Goldby, A.; Reeve, J.; Hendrick, A.; Teall, M.; Hannah, D.; Almond, S.; Brice, N.; Dickenson, A. H. (2014) Novel TRPM8 antagonist attenuates cold hypersensitivity after peripheral nerve injury in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 349, 47-55.
55. Takaishi, M.; Uchida, K.; Suzuki, Y.; Matsui, H.; Shimada, T.; Fujita, F.; Tominaga, M. (2016) Reciprocal effects of capsaicin and menthol on thermosensation through regulated activities of TRPV1 and TRPM8. J. Physiol. Sci. 66, 143-155.
56. Macpherson, L. J.; Hwang, S. W.; Miyamoto, T.; Dubin, A. E.; Patapoutian, A.; Story, G. M. (2006) More than cool: promiscuous relationships of menthol and other sensory compounds. Mol. Cell Neurosci. 32, 335-343.
57. Karashima, Y.; Damann, N.; Prenen, J.; Talavera, K.; Segal, A.; Voets, T.; Nilius, B. (2007) Bimodal action of menthol on the transient receptor potential channel TRPA1. J. Neurosci. 27, 9874-9884.
58. Story, G. M.; Peier, A. M.; Reeve, A. J.; Eid, S. R.; Mosbacher, J.; Hricik, T. R.; Earley, T. J.; Hergarden, A. C.; Andersson, D. A.; Hwang, S. W.; McIntyre, P.; Jegla, T.; Bevan, S.; Patapoutian, A. (2003) ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell 112, 819-829.
59. Karashima, Y.; Talavera, K.; Everaerts, W.; Janssens, A.; Kwan, K. Y.; Vennekens, R.; Nilius, B.; Voets, T. (2009) TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 106, 1273-1278.
60. McNamara, C. R.; Mandel-Brehm, J.; Bautista, D. M.; Siemens, J.; Deranian, K. L.; Zhao, M.; Hayward, N. J.; Chong, J. A.; Julius, D.; Moran, M. M.; Fanger, C. M. (2007) TRPA1 mediates formalin-induced pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 104, 13525-13530.
【0204】
61. Klionsky, L.; Tamir, R.; Gao, B.; Wang, W.; Immke, D. C.; Nishimura, N.; Gavva, N. R. (2007) Species-specific pharmacology of Trichloro(sulfanyl)ethyl benzamides as transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) antagonists. Mol. Pain 3, 39.
62. El Kouhen, R.; Surowy, C. S.; Bianchi, B. R.; Neelands, T. R.; McDonald, H. A.; Niforatos, W.; Gomtsyan, A.; Lee, C. H.; Honore, P.; Sullivan, J. P.; Jarvis, M. F.; Faltynek, C. R. (2005) A-425619 [1-isoquinolin-5-yl-3-(4-trifluoromethyl-benzyl)-urea], a novel and selective transient receptor potential type V1 receptor antagonist, blocks channel activation by vanilloids, heat, and acid. J. Pharmacol. Exp. Ther. 314, 400-409.
63. Diver, M. M.; Cheng, Y.; Julius, D. (2019) Structural insights into TRPM8 inhibition and desensitization. Science 365, 1434-1440.
64. Gao, Y.; Cao, E.; Julius, D.; Cheng, Y. (2016) TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature 534, 347-351.
65. Paulsen, C. E.; Armache, J. P.; Gao, Y.; Cheng, Y.; Julius, D. (2015) Structure of the TRPA1 ion channel suggests regulatory mechanisms. Nature 525, 552.
66. Wei, E. T. (1983) Inhibition of shaking movements in rats by central administration of cholinergic and adrenergic agents. Psychopharmacology (Berl) 81, 111-114.
67. Wei, E. T.; Seid, D. A. (1983) AG-3-5: a chemical producing sensations of cold. J. Pharm. Pharmacol. 35, 110-112.
68. Colburn, R. W.; Lubin, M. L.; Stone, D. J., Jr.; Wang, Y.; Lawrence, D.; D'Andrea, M. R.; Brandt, M. R.; Liu, Y.; Flores, C. M.; Qin, N. (2007) Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron 54, 379-386.
69. Kono, T.; Satomi, M.; Suno, M.; Kimura, N.; Yamazaki, H.; Furukawa, H.; Matsubara, K. (2012) Oxaliplatin-induced neurotoxicity involves TRPM8 in the mechanism of acute hypersensitivity to cold sensation. Brain Behav. 2, 68-73.
70. Ling, B.; Authier, N.; Balayssac, D.; Eschalier, A.; Coudore, F. (2007) Behavioral and pharmacological description of oxaliplatin-induced painful neuropathy in rat. Pain 128, 225-234.
62. El Kouhen, R.; Surowy, C. S.; Bianchi, B. R.; Neelands, T. R.; McDonald, H. A.; Niforatos, W.; Gomtsyan, A.; Lee, C. H.; Honore, P.; Sullivan, J. P.; Jarvis, M. F.; Faltynek, C. R. (2005) A-425619 [1-isoquinolin-5-yl-3-(4-trifluoromethyl-benzyl)-urea], a novel and selective transient receptor potential type V1 receptor antagonist, blocks channel activation by vanilloids, heat, and acid. J. Pharmacol. Exp. Ther. 314, 400-409.
63. Diver, M. M.; Cheng, Y.; Julius, D. (2019) Structural insights into TRPM8 inhibition and desensitization. Science 365, 1434-1440.
64. Gao, Y.; Cao, E.; Julius, D.; Cheng, Y. (2016) TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature 534, 347-351.
65. Paulsen, C. E.; Armache, J. P.; Gao, Y.; Cheng, Y.; Julius, D. (2015) Structure of the TRPA1 ion channel suggests regulatory mechanisms. Nature 525, 552.
66. Wei, E. T. (1983) Inhibition of shaking movements in rats by central administration of cholinergic and adrenergic agents. Psychopharmacology (Berl) 81, 111-114.
67. Wei, E. T.; Seid, D. A. (1983) AG-3-5: a chemical producing sensations of cold. J. Pharm. Pharmacol. 35, 110-112.
68. Colburn, R. W.; Lubin, M. L.; Stone, D. J., Jr.; Wang, Y.; Lawrence, D.; D'Andrea, M. R.; Brandt, M. R.; Liu, Y.; Flores, C. M.; Qin, N. (2007) Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron 54, 379-386.
69. Kono, T.; Satomi, M.; Suno, M.; Kimura, N.; Yamazaki, H.; Furukawa, H.; Matsubara, K. (2012) Oxaliplatin-induced neurotoxicity involves TRPM8 in the mechanism of acute hypersensitivity to cold sensation. Brain Behav. 2, 68-73.
70. Ling, B.; Authier, N.; Balayssac, D.; Eschalier, A.; Coudore, F. (2007) Behavioral and pharmacological description of oxaliplatin-induced painful neuropathy in rat. Pain 128, 225-234.
【0205】
71. Mizoguchi, S.; Andoh, T.; Yakura, T.; Kuraishi, Y. (2016) Involvement of c-Myc-mediated transient receptor potential melastati 8 expression in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Pharmacol. Rep. 68, 645-648.
72. Deuis, J. R.; Dvorakova, L. S.; Vetter, I. (2017) Methods Used to Evaluate Pain Behaviors in Rodents. Front. Mol. Neurosci. 10, 284.
73. Naziroglu, M.; Braidy, N. (2017) Thermo-Sensitive TRP Channels: Novel Targets for Treating Chemotherapy-Induced Peripheral Pain. Front. Physiol. 8, 1040.
74. Jensen, T. S.; Finnerup, N. B. (2014) Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13, 924-935.
75. Binder, A.; Stengel, M.; Maag, R.; Wasner, G.; Schoch, R.; Moosig, F.; Schommer, B.; Baron, R. (2007) Pain in oxaliplatin-induced neuropathy--sensitisation in the peripheral and central nociceptive system. Eur. J. Cancer. 43, 2658-2663.
76. Attal, N.; Bouhassira, D.; Gautron, M.; Vaillant, J. N.; Mitry, E.; Lepere, C.; Rougier, P.; Guirimand, F. (2009) Thermal hyperalgesia as a marker of oxaliplatin neurotoxicity: a prospective quantified sensory assessment study. Pain 144, 245-252.
77. Grothey, A. (2003) Oxaliplatin-safety profile: neurotoxicity. Semin. Oncol. 30, 5-13.
78. Kelland, L. (2007) The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy. Nat. Rev. Cancer 7, 573-584.
79. Descoeur, J.; Pereira, V.; Pizzoccaro, A.; Francois, A.; Ling, B.; Maffre, V.; Couette, B.; Busserolles, J.; Courteix, C.; Noel, J.; Lazdunski, M.; Eschalier, A.; Authier, N.; Bourinet, E. (2011) Oxaliplatin-induced cold hypersensitivity is due to remodelling of ion channel expression in nociceptors. EMBO Mol. Med. 3, 266-278.
80. Gauchan, P.; Andoh, T.; Kato, A.; Kuraishi, Y. (2009) Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neurosci. Lett. 458, 93-95.
72. Deuis, J. R.; Dvorakova, L. S.; Vetter, I. (2017) Methods Used to Evaluate Pain Behaviors in Rodents. Front. Mol. Neurosci. 10, 284.
73. Naziroglu, M.; Braidy, N. (2017) Thermo-Sensitive TRP Channels: Novel Targets for Treating Chemotherapy-Induced Peripheral Pain. Front. Physiol. 8, 1040.
74. Jensen, T. S.; Finnerup, N. B. (2014) Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13, 924-935.
75. Binder, A.; Stengel, M.; Maag, R.; Wasner, G.; Schoch, R.; Moosig, F.; Schommer, B.; Baron, R. (2007) Pain in oxaliplatin-induced neuropathy--sensitisation in the peripheral and central nociceptive system. Eur. J. Cancer. 43, 2658-2663.
76. Attal, N.; Bouhassira, D.; Gautron, M.; Vaillant, J. N.; Mitry, E.; Lepere, C.; Rougier, P.; Guirimand, F. (2009) Thermal hyperalgesia as a marker of oxaliplatin neurotoxicity: a prospective quantified sensory assessment study. Pain 144, 245-252.
77. Grothey, A. (2003) Oxaliplatin-safety profile: neurotoxicity. Semin. Oncol. 30, 5-13.
78. Kelland, L. (2007) The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy. Nat. Rev. Cancer 7, 573-584.
79. Descoeur, J.; Pereira, V.; Pizzoccaro, A.; Francois, A.; Ling, B.; Maffre, V.; Couette, B.; Busserolles, J.; Courteix, C.; Noel, J.; Lazdunski, M.; Eschalier, A.; Authier, N.; Bourinet, E. (2011) Oxaliplatin-induced cold hypersensitivity is due to remodelling of ion channel expression in nociceptors. EMBO Mol. Med. 3, 266-278.
80. Gauchan, P.; Andoh, T.; Kato, A.; Kuraishi, Y. (2009) Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neurosci. Lett. 458, 93-95.
【0206】
81. Kawashiri, T.; Egashira, N.; Kurobe, K.; Tsutsumi, K.; Yamashita, Y.; Ushio, S.; Yano, T.; Oishi, R. (2012) L type Ca(2)+ channel blockers prevent oxaliplatin-induced cold hyperalgesia and TRPM8 overexpression in rats. Mol. Pain 8, 7.
82. Ta, L. E.; Bieber, A. J.; Carlton, S. M.; Loprinzi, C. L.; Low, P. A.; Windebank, A. J. (2010) Transient Receptor Potential Vanilloid 1 is essential for cisplatin-induced heat hyperalgesia in mice. Mol. Pain 6, 15.
83. Staff, N. P.; Grisold, A.; Grisold, W.; Windebank, A. J. (2017) Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: A current review. Ann. Neurol. 81, 772-781.
84. Shapiro, C. L. (2016) Highlights of Recent Findings on Quality-of-Life Management for Patients With Cancer and Their Survivors. JAMA Oncol. 2, 1401-1402.
85. Moran, M. M.; Szallasi, A. (2018) Targeting nociceptive transient receptor potential channels to treat chronic pain: current state of the field. Br. J. Pharmacol. 175, 2185-2203.
86. Yelm, K. E.; Wos, J. A.; Bunke, G. M.; Frederick, H.; Haught, J. C.; Hoke, S. H.; Sreekrishna, K. T.; Lin, Y. Synthesis of aryl cyclohexane carboxamide derivatives useful as sensates in consumer products. 20170057911 A1.
87. Wos, J. A.; Yelm, K. E.; Bunke, G. M.; Frederick, H. A.; Reilly, M.; Haught, J. C.; Sreekrishna, K. T.; Lin, Y. Synthesis of cyclohexane ester derivatives useful as cooling sensates in consumer products. 2017106279 A1.
88. Moreno, O.; Natarajan, S.; Duncan, D. F. Small-molecule modulators of Trp-p8 activity. 20080255185 A1.
89. SYBYL-X; 1.3 Tripos International, 1699 South Hanley Rd. St. Louis, Missouri, 63144, USA., 2010.
90. Xie, X. Q.; Chen, J. Z.; Billings, E. M. (2003) 3D structural model of the G-protein-coupled cannabinoid CB2 receptor. Proteins 53, 307-319.
82. Ta, L. E.; Bieber, A. J.; Carlton, S. M.; Loprinzi, C. L.; Low, P. A.; Windebank, A. J. (2010) Transient Receptor Potential Vanilloid 1 is essential for cisplatin-induced heat hyperalgesia in mice. Mol. Pain 6, 15.
83. Staff, N. P.; Grisold, A.; Grisold, W.; Windebank, A. J. (2017) Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: A current review. Ann. Neurol. 81, 772-781.
84. Shapiro, C. L. (2016) Highlights of Recent Findings on Quality-of-Life Management for Patients With Cancer and Their Survivors. JAMA Oncol. 2, 1401-1402.
85. Moran, M. M.; Szallasi, A. (2018) Targeting nociceptive transient receptor potential channels to treat chronic pain: current state of the field. Br. J. Pharmacol. 175, 2185-2203.
86. Yelm, K. E.; Wos, J. A.; Bunke, G. M.; Frederick, H.; Haught, J. C.; Hoke, S. H.; Sreekrishna, K. T.; Lin, Y. Synthesis of aryl cyclohexane carboxamide derivatives useful as sensates in consumer products. 20170057911 A1.
87. Wos, J. A.; Yelm, K. E.; Bunke, G. M.; Frederick, H. A.; Reilly, M.; Haught, J. C.; Sreekrishna, K. T.; Lin, Y. Synthesis of cyclohexane ester derivatives useful as cooling sensates in consumer products. 2017106279 A1.
88. Moreno, O.; Natarajan, S.; Duncan, D. F. Small-molecule modulators of Trp-p8 activity. 20080255185 A1.
89. SYBYL-X; 1.3 Tripos International, 1699 South Hanley Rd. St. Louis, Missouri, 63144, USA., 2010.
90. Xie, X. Q.; Chen, J. Z.; Billings, E. M. (2003) 3D structural model of the G-protein-coupled cannabinoid CB2 receptor. Proteins 53, 307-319.
【0207】
91. Marti-Renom, M. A.; Stuart, A. C.; Fiser, A.; Sanchez, R.; Melo, F.; Sali, A. (2000) Comparative protein structure modeling of genes and genomes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 291-325.
92. Chen, J. Z.; Wang, J.; Xie, X. Q. (2007) GPCR structure-based virtual screening approach for CB2 antagonist search. J. Chem. Inf. Model. 47, 1626-1637.
93. Feng, Z.; Alqarni, M. H.; Yang, P.; Tong, Q.; Chowdhury, A.; Wang, L.; Xie, X. Q. (2014) Modeling, molecular dynamics simulation, and mutation validation for structure of cannabinoid receptor 2 based on known crystal structures of GPCRs. J. Chem Inf. Model. 54, 2483-2499.
94. Teramachi, J.; Silbermann, R.; Yang, P.; Zhao, W.; Mohammad, K. S.; Guo, J.; Anderson, J. L.; Zhou, D.; Feng, R.; Myint, K. Z.; Maertz, N.; Beumer, J. H.; Eiseman, J. L.; Windle, J. J.; Xie, X. Q.; Roodman, G. D.; Kurihara, N. (2016) Blocking the ZZ domain of sequestosome1/p62 suppresses myeloma growth and osteoclast formation in vitro and induces dramatic bone formation in myeloma-bearing bones in vivo. Leukemia 30, 390-398.
95. Feng, Z.; Pearce, L. V.; Xu, X.; Yang, X.; Yang, P.; Blumberg, P. M.; Xie, X. Q. (2015) Structural insight into tetrameric hTRPV1 from homology modeling, molecular docking, molecular dynamics simulation, virtual screening, and bioassay validations. J. Chem. Inf. Model. 55, 572-588.
96. Wiederstein, M.; Sippl, M. J. (2007) ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Res. 35, W407-410.
97. Laskowski, R. A.; MacArthur, M. W.; Moss, D. S.; Thornton, J. M. (1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal of Applied Crystallography 26, 283-291.
98. Jain, A. N. (1996) Scoring noncovalent protein-ligand interactions: a continuous differentiable function tuned to compute binding affinities. J. Comput. Aided Mol. Des. 10, 427-440.
99. Maier, J. A.; Martinez, C.; Kasavajhala, K.; Wickstrom, L.; Hauser, K. E.; Simmerling, C. (2015) ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. J. Chem. Theory Comput. 11, 3696-3713.
100. Dickson, C. J.; Madej, B. D.; Skjevik, A. A.; Betz, R. M.; Teigen, K.; Gould, I. R.; Walker, R. C. (2014) Lipid14: The Amber Lipid Force Field. J. Chem. Theory Comput. 10, 865-879.
92. Chen, J. Z.; Wang, J.; Xie, X. Q. (2007) GPCR structure-based virtual screening approach for CB2 antagonist search. J. Chem. Inf. Model. 47, 1626-1637.
93. Feng, Z.; Alqarni, M. H.; Yang, P.; Tong, Q.; Chowdhury, A.; Wang, L.; Xie, X. Q. (2014) Modeling, molecular dynamics simulation, and mutation validation for structure of cannabinoid receptor 2 based on known crystal structures of GPCRs. J. Chem Inf. Model. 54, 2483-2499.
94. Teramachi, J.; Silbermann, R.; Yang, P.; Zhao, W.; Mohammad, K. S.; Guo, J.; Anderson, J. L.; Zhou, D.; Feng, R.; Myint, K. Z.; Maertz, N.; Beumer, J. H.; Eiseman, J. L.; Windle, J. J.; Xie, X. Q.; Roodman, G. D.; Kurihara, N. (2016) Blocking the ZZ domain of sequestosome1/p62 suppresses myeloma growth and osteoclast formation in vitro and induces dramatic bone formation in myeloma-bearing bones in vivo. Leukemia 30, 390-398.
95. Feng, Z.; Pearce, L. V.; Xu, X.; Yang, X.; Yang, P.; Blumberg, P. M.; Xie, X. Q. (2015) Structural insight into tetrameric hTRPV1 from homology modeling, molecular docking, molecular dynamics simulation, virtual screening, and bioassay validations. J. Chem. Inf. Model. 55, 572-588.
96. Wiederstein, M.; Sippl, M. J. (2007) ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Res. 35, W407-410.
97. Laskowski, R. A.; MacArthur, M. W.; Moss, D. S.; Thornton, J. M. (1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal of Applied Crystallography 26, 283-291.
98. Jain, A. N. (1996) Scoring noncovalent protein-ligand interactions: a continuous differentiable function tuned to compute binding affinities. J. Comput. Aided Mol. Des. 10, 427-440.
99. Maier, J. A.; Martinez, C.; Kasavajhala, K.; Wickstrom, L.; Hauser, K. E.; Simmerling, C. (2015) ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. J. Chem. Theory Comput. 11, 3696-3713.
100. Dickson, C. J.; Madej, B. D.; Skjevik, A. A.; Betz, R. M.; Teigen, K.; Gould, I. R.; Walker, R. C. (2014) Lipid14: The Amber Lipid Force Field. J. Chem. Theory Comput. 10, 865-879.
【0208】
101. Jorgensen, W. L.; Chandrasekhar, J.; Madura, J. D.; Impey, R. W.; Klein, M. L. (1983) Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. The Journal of Chemical Physics 79, 926-935.
102. Gotz, A. W.; Williamson, M. J.; Xu, D.; Poole, D.; Le Grand, S.; Walker, R. C. (2012) Routine Microsecond Molecular Dynamics Simulations with AMBER on GPUs. 1. Generalized Born. J.. Chem. Theory Comput. 8, 1542-1555.
103. Salomon-Ferrer, R.; Gotz, A. W.; Poole, D.; Le Grand, S.; Walker, R. C. (2013) Routine Microsecond Molecular Dynamics Simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit Solvent Particle Mesh Ewald. J. Chem. Theory Comput. 9, 3878-3888.
104. Case, D.; Cerutti, D.; Cheatham, T.; Darden, T.; Duke, R.; Giese, T.; Gohlke, H.; Goetz, A.; Greene, D.; Homeyer, N. AMBER 16, University of California: San Francisco, 2016.
105. Loncharich, R. J.; Brooks, B. R.; Pastor, R. W. (1992) Langevin dynamics of peptides: the frictional dependence of isomerization rates of N-acetylalanyl-N'-methylamide. Biopolymers 32, 523-535.
106. Izaguirre, J. A.; Catarello, D. P.; Wozniak, J. M.; Skeel, R. D. (2001) Langevin stabilization of molecular dynamics. The Journal of Chemical Physics 114, 2090-2098.
107. Darden, T.; York, D.; Pedersen, L. (1993) Particle mesh Ewald: An N・log(N) method for Ewald sums in large systems. The Journal of Chemical Physics 98, 10089-10092.
108. Essmann, U.; Perera, L.; Berkowitz, M. L.; Darden, T.; Lee, H.; Pedersen, L. G. (1995) A smooth particle mesh Ewald method. The Journal of Chemical Physics 103, 8577-8593.
109. Ryckaert, J. P.; Ciccotti, G.; Berendsen, H. J. C. (1977) Numerical integration of the cartesian equations of motion of a system with constraints: molecular dynamics of n-alkanes. Journal of Computational Physics 23, 327-341.
102. Gotz, A. W.; Williamson, M. J.; Xu, D.; Poole, D.; Le Grand, S.; Walker, R. C. (2012) Routine Microsecond Molecular Dynamics Simulations with AMBER on GPUs. 1. Generalized Born. J.. Chem. Theory Comput. 8, 1542-1555.
103. Salomon-Ferrer, R.; Gotz, A. W.; Poole, D.; Le Grand, S.; Walker, R. C. (2013) Routine Microsecond Molecular Dynamics Simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit Solvent Particle Mesh Ewald. J. Chem. Theory Comput. 9, 3878-3888.
104. Case, D.; Cerutti, D.; Cheatham, T.; Darden, T.; Duke, R.; Giese, T.; Gohlke, H.; Goetz, A.; Greene, D.; Homeyer, N. AMBER 16, University of California: San Francisco, 2016.
105. Loncharich, R. J.; Brooks, B. R.; Pastor, R. W. (1992) Langevin dynamics of peptides: the frictional dependence of isomerization rates of N-acetylalanyl-N'-methylamide. Biopolymers 32, 523-535.
106. Izaguirre, J. A.; Catarello, D. P.; Wozniak, J. M.; Skeel, R. D. (2001) Langevin stabilization of molecular dynamics. The Journal of Chemical Physics 114, 2090-2098.
107. Darden, T.; York, D.; Pedersen, L. (1993) Particle mesh Ewald: An N・log(N) method for Ewald sums in large systems. The Journal of Chemical Physics 98, 10089-10092.
108. Essmann, U.; Perera, L.; Berkowitz, M. L.; Darden, T.; Lee, H.; Pedersen, L. G. (1995) A smooth particle mesh Ewald method. The Journal of Chemical Physics 103, 8577-8593.
109. Ryckaert, J. P.; Ciccotti, G.; Berendsen, H. J. C. (1977) Numerical integration of the cartesian equations of motion of a system with constraints: molecular dynamics of n-alkanes. Journal of Computational Physics 23, 327-341.
【0209】
110. Yang, P.; Wang, L.; Xie, X. Q. (2012) Latest advances in novel cannabinoid CB(2) ligands for drug abuse and their therapeutic potential. Future Med. Chem. 4, 187-204.
111. Hawkins, G. D.; Cramer, C. J.; Truhlar, D. G. (1996 ) Parametrized Models of Aqueous Free Energies of Solvation Based on Pairwise Descreening of Solute Atomic Charges from a Dielectric Medium. The Journal of Physical Chemistry 100, 19824-19839.
112. Kollman, P. A.; Massova, I.; Reyes, C.; Kuhn, B.; Huo, S.; Chong, L.; Lee, M.; Lee, T.; Duan, Y.; Wang, W.; Donini, O.; Cieplak, P.; Srinivasan, J.; Case, D. A.; Cheatham, T. E., 3rd (2000) Calculating structures and free energies of complex molecules: combining molecular mechanics and continuum models. Acc. Chem. Res. 33, 889-897.
113. Tsui, V.; Case, D. A. (2000) Theory and applications of the generalized Born solvation model in macromolecular simulations. Biopolymers 56, 275-291.
114. Bashford, D.; Case, D. A. (2000) Generalized born models of macromolecular solvation effects. Annu. Rev. Phys. Chem. 51, 129-152.
115. Sitkoff, D.; Sharp, K. A.; Honig, B. (1994) Accurate Calculation of Hydration Free Energies Using Macroscopic Solvent Models. The Journal of Physical Chemistry 98 1978-1988.
116. Still, W. C.; Tempczyk, A.; Hawley, R. C.; Hendrickson, T. (1990) Semianalytical treatment of solvation for molecular mechanics and dynamics. Journal of the American Chemical Society 112, 6127-6129.
117. Weiser, J.; Shenkin, P. S.; Still, W. C. (1999) Approximate atomic surfaces from linear combinations of pairwise overlaps (LCPO). Journal of Computational Chemistry 20, 217-230.
118. Hu, J.; Feng, Z.; Ma, S.; Zhang, Y.; Tong, Q.; Alqarni, M. H.; Gou, X.; Xie, X. Q. (2016) Difference and Influence of Inactive and Active States of Cannabinoid Receptor Subtype CB2: From Conformation to Drug Discovery. J. Chem. Inf. Model. 56, 1152-1163.
111. Hawkins, G. D.; Cramer, C. J.; Truhlar, D. G. (1996 ) Parametrized Models of Aqueous Free Energies of Solvation Based on Pairwise Descreening of Solute Atomic Charges from a Dielectric Medium. The Journal of Physical Chemistry 100, 19824-19839.
112. Kollman, P. A.; Massova, I.; Reyes, C.; Kuhn, B.; Huo, S.; Chong, L.; Lee, M.; Lee, T.; Duan, Y.; Wang, W.; Donini, O.; Cieplak, P.; Srinivasan, J.; Case, D. A.; Cheatham, T. E., 3rd (2000) Calculating structures and free energies of complex molecules: combining molecular mechanics and continuum models. Acc. Chem. Res. 33, 889-897.
113. Tsui, V.; Case, D. A. (2000) Theory and applications of the generalized Born solvation model in macromolecular simulations. Biopolymers 56, 275-291.
114. Bashford, D.; Case, D. A. (2000) Generalized born models of macromolecular solvation effects. Annu. Rev. Phys. Chem. 51, 129-152.
115. Sitkoff, D.; Sharp, K. A.; Honig, B. (1994) Accurate Calculation of Hydration Free Energies Using Macroscopic Solvent Models. The Journal of Physical Chemistry 98 1978-1988.
116. Still, W. C.; Tempczyk, A.; Hawley, R. C.; Hendrickson, T. (1990) Semianalytical treatment of solvation for molecular mechanics and dynamics. Journal of the American Chemical Society 112, 6127-6129.
117. Weiser, J.; Shenkin, P. S.; Still, W. C. (1999) Approximate atomic surfaces from linear combinations of pairwise overlaps (LCPO). Journal of Computational Chemistry 20, 217-230.
118. Hu, J.; Feng, Z.; Ma, S.; Zhang, Y.; Tong, Q.; Alqarni, M. H.; Gou, X.; Xie, X. Q. (2016) Difference and Influence of Inactive and Active States of Cannabinoid Receptor Subtype CB2: From Conformation to Drug Discovery. J. Chem. Inf. Model. 56, 1152-1163.
【0210】
[00225]
ここに開示する主題の様々な詳細は、ここに開示する主題の範囲を逸脱せずに変更できることが理解される。さらに、上記の記載は、説明のためだけであり、限定を目的としない。
ここに開示する主題の様々な詳細は、ここに開示する主題の範囲を逸脱せずに変更できることが理解される。さらに、上記の記載は、説明のためだけであり、限定を目的としない。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
