特許 7588602 抗菌剤および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-14

(45)【発行日】2024-11-22

(54)【発明の名称】抗菌剤および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20241115BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241115BHJP

   C12N 15/70 20060101ALI20241115BHJP

   C12N 15/74 20060101ALI20241115BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20241115BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20241115BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20241115BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20241115BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N1/21 ZNA

C12N15/70 Z

C12N15/74 Z

C12N15/87 Z

A61K35/74 A

A61K31/711

A61P31/04

【請求項の数】 30

(21)【出願番号】P 2021567824

(86)(22)【出願日】2020-05-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-21

(86)【国際出願番号】 EP2020062957

(87)【国際公開番号】W WO2020229372

(87)【国際公開日】2020-11-19

【審査請求日】2023-05-02

(31)【優先権主張番号】1906668.7

(32)【優先日】2019-05-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】521492964

【氏名又は名称】フォリアム フード サイエンス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗 由美

(72)【発明者】

【氏名】ウッドワード，マルティン

(72)【発明者】

【氏名】コガン，トリスタン

(72)【発明者】

【氏名】フュー，エドワード

(72)【発明者】

【氏名】クヌーパー，ホルガー

(72)【発明者】

【氏名】リッチオ，アレッサンドロ

(72)【発明者】

【氏名】グロンダル，クリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】クルーブ，ジャスパー

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２７３９４０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／００２４７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１７－０１２２０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１２５００（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

家畜動物の成長または重量を増進させるための非医学的方法であって、
前記方法が前記動物への複数のＥ．ｃｏｌｉキャリア細胞の投与を含み、前記動物が細菌標的細胞を含み、それぞれのＥ．ｃｏｌｉキャリア細胞が標的細胞に対して毒性であるが前記Ｅ．ｃｏｌｉキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含み、前記Ｅ．ｃｏｌｉキャリア細胞が前記抗菌剤の標的細胞中における発現のために前記第１のエピソームＤＮＡを前記標的細胞中に接合移入することができ、第１のエピソームＤＮＡが標的細胞中における発現のためにＥ．ｃｏｌｉキャリア細胞から前記標的細胞に移入されて前記抗菌剤を産生し、それにより前記動物中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、前記動物の成長または重量を増進させ、
ここで標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞であり、
前記抗菌剤は、前記標的細胞中のＣａｓヌクレアーゼとともに作動して前記標的細胞に含まれる１つ又は複数の染色体プロトスペーサー配列を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、およびプロトスペーサー配列は、ｉｎｖＢ、ｓｓｅＥ、およびｓｉｃＰから選択される遺伝子の１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む、前記方法。

【請求項2】

前記方法が前記動物における飼料転換率（ＦＣＲ）を改善する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的細胞がＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

複数の異なるＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型を死滅させ、任意にそれぞれの血液型亜型がＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｒｃｈｏｗ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｈａｄａｒ、Ｂｉｎｚａ、Ｂｒｅｄｅｎｅｙ、Ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ、Ｓｅｆｔｅｎｂｅｒｇ、Ｍｂａｎｄａｋａ、Ａｎａｔｕｍ、Ａｇｏｎａ、およびＤｕｂｌｉｎからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記Ｅ．ｃｏｌｉキャリア細胞がＦ１８、Ｎｉｓｓｌｅ、またはＳ１７ Ｅ ｃｏｌｉ細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記方法が前記動物の胃腸管における標的細胞を低減させ、任意に前記動物が鳥であり、前記方法が前記鳥の盲腸、素嚢、肝、脾、および／または回腸中の標的細胞を低減させる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１のＤＮＡがプラスミドに含まれ、前記プラスミドがＲＰ４移入起点（ｏｒｉＴ）および／またはｐ１５Ａ ｏｒｉを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記抗菌剤が前記標的細胞に含まれるプロトスペーサー配列を切断するように前記標的細胞中で操作可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つ又は複数の構成要素を含み、前記標的細胞がＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａの第１および第２の株を含み、それぞれの株が前記プロトスペーサー配列を含み、前記株の標的細胞を死滅させる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、前記標的細胞ゲノムに含まれる少なくとも３つの異なるプロトスペーサー配列を切断するように操作可能である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記抗菌剤が、
標的核酸配列を認識および改変することができるガイドされたヌクレアーゼを含み、前記標的配列が前記標的細胞の内因性染色体に含まれるが、前記キャリア細胞には含まれず、前記ヌクレアーゼが前記標的細胞を死滅させまたは前記標的細胞の成長もしくは増殖を阻害するように前記染色体を改変する、
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記キャリア細胞が細菌標的細胞に対して毒性であるが前記キャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、前記キャリア細胞が前記抗菌剤の前記標的細胞中における発現のために前記ＤＮＡを前記標的細胞中に接合移入することができ、それにより前記標的細胞を死滅させ、前記標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞であり、前記キャリア細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞であり、前記抗菌剤は、前記標的細胞中のＣａｓヌクレアーゼとともに作動して前記標的細胞に含まれる１つ又は複数のプロトスペーサー配列を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、およびプロトスペーサー配列は、ｉｎｖＢ、ｓｓｅＥ、およびｓｉｃＰから選択される遺伝子の１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキャリア細胞。

【請求項12】

病原性細菌標的細胞による感染を処置するための対象へのキャリア細胞の投与を含む方法における使用のための複数のキャリア細胞を含む組成物であって、それぞれのキャリア細胞が標的細胞に対して毒性であるが前記キャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、前記キャリア細胞が前記抗菌剤の標的細胞中における発現のために前記第１のエピソームＤＮＡを前記標的細胞中に接合移入することができ、第１のエピソームＤＮＡが標的細胞中における発現のために前記キャリア細胞から前記標的細胞に移入されて前記抗菌剤を産生し、それにより前記家畜動物中の前記標的細胞を死滅させまたは前記標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、前記標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、前記キャリア細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞であり、前記抗菌剤は、前記標的細胞中のＣａｓヌクレアーゼとともに作動して前記標的細胞に含まれる１つ又は複数のプロトスペーサー配列を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、およびプロトスペーサー配列は、ｉｎｖＢ、ｓｓｅＥ、およびｓｉｃＰから選択される遺伝子の１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む、前記組成物。

【請求項13】

家畜動物における人畜共通細菌標的細胞を死滅させる非医学的方法であって、前記方法が複数のキャリア細胞を前記動物に投与することを含み、それぞれのキャリア細胞が前記標的細胞に対して毒性であるが前記キャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、前記キャリア細胞が前記抗菌剤の標的細胞中における発現のために前記第１のエピソームＤＮＡを前記標的細胞中に接合移入することができ、第１のエピソームＤＮＡが標的細胞中における発現のために前記キャリア細胞から前記標的細胞に移入されて前記抗菌剤を産生し、それにより家畜動物中の前記標的細胞を死滅させまたは前記標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、前記標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞であり、前記キャリア細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞であり、前記抗菌剤は、前記標的細胞中のＣａｓヌクレアーゼとともに作動して前記標的細胞に含まれる１つ又は複数のプロトスペーサー配列を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、およびプロトスペーサー配列は、ｉｎｖＢ、ｓｓｅＥ、およびｓｉｃＰから選択される遺伝子の１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む、前記方法。

【請求項14】

前記方法が前記対象の胃腸管におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａを低減させる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項15】

前記方法が前記対象の胃腸管におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａを低減させる、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記方法が動物の群（任意に一団または群れ）において行われ、前記動物の一部または全部が前記標的細胞を含み、前記標的種の標的細胞の拡散が前記群において低減され、または前記群から動物の第２の群への拡散が低減される、請求項１２または１４に記載の組成物。

【請求項17】

前記方法が動物の群（任意に一団または群れ）において行われ、前記動物の一部または全部が前記標的細胞を含み、前記標的種の標的細胞の拡散が前記群において低減され、または前記群から動物の第２の群への拡散が低減される、請求項１３または１５に記載の方法。

【請求項18】

前記標的細胞が、死滅させる様々なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．型を含む、請求項１２、１４および１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記標的細胞が、死滅させる様々なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．型を含む、請求項１３、１５、および１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記キャリア細胞、標的細胞、またはＤＮＡがそれぞれ、請求項１から１０のいずれか一項で定義されるキャリア細胞、標的細胞、またはＤＮＡである、請求項１１に記載のキャリア細胞、請求項１２、１４、１６、および１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記キャリア細胞、標的細胞、またはＤＮＡがそれぞれ、請求項１から１０のいずれか一項で定義されるキャリア細胞、標的細胞、またはＤＮＡである、請求項１３、１５、１７、および１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

請求項１～１０または１３、１５、１７、１９、および２１のいずれか一項に記載の方法における使用のためのＤＮＡ、請求項１１または２０に記載のキャリア細胞、あるいは請求項１２、１４、１６、１８、および２０のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＤＮＡが標的細胞中に導入することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の複数のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、前記ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡが前記標的細胞ゲノムに含まれる複数の染色体プロトスペーサー配列を認識するように前記標的細胞中においてＣａｓヌクレアーゼとともに操作可能であり、前記標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞であり、
前記プロトスペーサー配列がｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、またはｓｓｅＥから選択される遺伝子から選択される遺伝子の１つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む、前記ＤＮＡ、キャリア細胞、または組成物。

【請求項23】

細菌宿主細胞中における前記ＤＮＡの複製のために操作可能な移入起点（ｏｒｉＴ）および複製起点（ｏｒｉＶ）を含むプラスミドに含まれる、請求項２２に記載のＤＮＡ。

【請求項24】

前記ＤＮＡが、配列番号１５を含み、任意にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ標的細胞への接合のためのキャリア細菌細胞中のプラスミドに含まれる、請求項２２または２３に記載のＤＮＡ。

【請求項25】

ＣＲＩＳＰＲリピート配列およびスペーサー配列を含み、
（ａ）前記リピート配列がそれぞれ配列番号１６を含み、ならびに／または
（ｂ）前記スペーサー配列が配列番号１７～１９から選択される１つ、２つ、もしくは３つの配列およびその相補配列を含み、任意に前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ標的細胞への接合のための前記キャリア細菌細胞中のプラスミドに含まれる、請求項２２または２３に記載のＤＮＡ。

【請求項26】

（任意に５’から３’への順序で）配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９を含む、請求項２５に記載のＤＮＡ。

【請求項27】

前記標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞であり、前記ＤＮＡがプラスミドに含まれ、前記プラスミドがＩｎｃＦＩ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦＩｌｌ、ＩｎｃＦＩＶ、ＩｎｃＦＶ、ＩｎｃＭ、Ｉｎｃ９、ＩｎｃｌＯ、Ｉｎｃｌ、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＨ、ＩｎｃＩａ、ＩｎｃｌＩｃ、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩｙ、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＬ、ＩｎｃＮ、Ｉｎｃ２ｅ、ＩｎｃＯ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、およびＩｎｃＷプラスミドから選択される、請求項１～１０、１３、１５、１７、１９、および２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞であり、前記ＤＮＡがプラスミドに含まれ、前記プラスミドがＩｎｃＦＩ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦＩｌｌ、ＩｎｃＦＩＶ、ＩｎｃＦＶ、ＩｎｃＭ、Ｉｎｃ９、ＩｎｃｌＯ、Ｉｎｃｌ、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＨ、ＩｎｃＩａ、ＩｎｃｌＩｃ、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩｙ、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＬ、ＩｎｃＮ、Ｉｎｃ２ｅ、ＩｎｃＯ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、およびＩｎｃＷプラスミドから選択される、請求項１１、または２１に記載のキャリア細胞、請求項１２、１４、１６，１８、および２０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２２～２６のいずれか一項に記載のＤＮＡ。

【請求項29】

家畜動物が、ニワトリ（例えば、ブロイラーまたは産卵鶏）である、請求項１～１０、１３、１５、１７，１９、２１、および２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

家畜動物が、ニワトリ（例えば、ブロイラーまたは産卵鶏）である、請求項１１、２１、または２８に記載のキャリア細胞、請求項１２、１４、１６，１８、２０、および２８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２２～２６、および２８のいずれか一項に記載のＤＮＡ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は細菌の間の接合を行う手段に関し、特に本発明は抗菌剤を含むキャリア細菌および使用の方法に関する。キャリア細菌は薬剤をコードするＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができる。

【0002】

本発明はさらに、動物における成長または飼料転換率（ＦＣＲ）の促進に関する。本発明はさらに、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの死滅またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの成長もしくは増殖の阻害に関する。本発明はさらに、例えば植物の成長、乾燥重量、湿潤重量、または作物生産の促進に有用な、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの死滅またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの成長もしくは増殖の阻害に関する。

【背景技術】

【0003】

染色体外複製（ｏｒｉ）と移入（ｔｒａ）を制御するＤＮＡ配列は互いに区別できる。したがって、複製配列は一般にプラスミドの移入を制御せず、逆もそうである。複製と移入はいずれもプラスミドおよびホストにコードされた機能を利用する複雑な分子プロセスである。細菌の接合は１つの細菌から別の細菌への遺伝情報の一方向で水平な伝染である。移入される遺伝物質はプラスミドであることも、染色体の一部であることもある。接合性プラスミドを有する細菌細胞は、ドナー細胞とレシピエント細胞のカップリングおよび遺伝情報の移入に関与する表面構造（性繊毛）を含む。接合は細胞間の接触を伴い、遺伝属性の移入には多くのプラスミドが介在し得る。全ての天然の移入機構の中で、接合が最も効率的である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＦプラスミド、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｐＣＦｌＯプラスミド、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｐＸ０１６プラスミドは、交配対の確立のために異なる機構を採用しており、交配凝集体のサイズは様々であり、これらはグラム陰性細菌（Ｆ）ならびにグラム陽性細菌（ｐＣＦｌＯおよびｐＸ０１６）の中で異なる宿主域を有している。これらのプラスミドサイズも異なっており、それぞれ５４、１００、および２００ｋｂである。しかし注目すべきことに、これらの接合システムは共通して極めて重要な特徴を有している。これらは液体媒体中で接合移入を持続することができ、極めて短い時間で１００％に近い移入効率に達することが多い。したがって、接合プロセスによって環境のヌクレアーゼに対するプラスミドＤＮＡの保護およびレシピエント細胞へのプラスミドＤＮＡの極めて効率的な送達が可能になる。接合機能は生来プラスミドにコードされている。関連する遺伝子を１つの種の中で（狭い宿主域）または多くの種の間で（広い宿主域）移入することができる数多くの接合性プラスミド（およびトランスポゾン）が知られている。伝染性のプラスミドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、およびＮｏｃａｒｄｉａの病原性株を含むがこれらに限定されない数多くのグラム陽性の属において報告されてきた。接合の早期の段階は一般にグラム陰性細菌とグラム陽性細菌で異なる。グラム陰性細菌由来の接合性プラスミドにおけるいくつかの移入遺伝子の役割は、繊毛媒介細胞間接触、接合ポアの形成、および関連する形態学的機能を提供することである。繊毛はグラム陽性細菌における接合を開始することには関与していないようである。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明は、
対象の成長または重量を増進させるための（例えば非医学的または医学的）方法を提供し、対象は細菌標的細胞を含み、本方法は標的細胞に対して毒性である抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを対象に投与することを含み、第１のＤＮＡが標的細胞に移入されて薬剤が発現され、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、対象の成長または重量を増進させる。

【0005】

一実施形態では、
対象の成長または重量を増進させるための（例えば非医学的または医学的）方法が提供され、本方法は対象への複数のキャリア細胞の投与を含み、対象は細菌標的細胞を含み、それぞれのキャリア細胞は標的細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、キャリア細胞は薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、第１のＤＮＡは標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、対象の成長または重量を増進させる。

【0006】

有利には、対象におけるＦＣＲが改善され（すなわち増進され）、すなわちＦＣＲ数が低下する。対象の群（例えば家畜動物等の動物の群）において本発明の方法を実施するとき、群の中の個体においてＦＣＲが低下し、または群において平均ＦＣＲが低下する。低下は、キャリア細胞の投与の前のＦＣＲとの比較として評価でき、または同じ種、年齢群、および同程度のもしくは同じ餌で飼育された動物についての平均と比較される。当業者であれば、例えば家畜動物、例えば子豚、ブタ、ヒツジ、ウシ（乳牛または肉牛）、魚類、甲殻類、家禽（例えばニワトリ（ブロイラーまたは産卵鶏）、ガチョウ、アヒル、またはシチメンチョウ）等についての標準的なＦＣＲは熟知している。

【0007】

本発明はまた、キャリア細胞を提供し、
細胞は細菌標的細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、キャリア細胞は抗菌剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、それにより標的細胞を死滅させ、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、キャリア細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である。

【0008】

病原性細菌標的細胞による感染を処置するための対象への細胞の投与を含む方法における使用のための複数のキャリア細胞を含む組成物であって、それぞれのキャリア細胞は標的細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、キャリア細胞は薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、第１のＤＮＡは標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、キャリア細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である、組成物。

【0009】

動物（任意に家畜動物）における人畜共通細菌標的細胞を死滅させる非医学的方法であって、本方法が複数のキャリア細胞を動物に投与することを含み、それぞれのキャリア細胞は標的細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、キャリア細胞は薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、第１のＤＮＡは標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、任意にキャリア細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である、方法。

【0010】

（任意に本発明の方法における使用のための）ＤＮＡであって、標的細胞中に導入することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の複数のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡが標的細胞ゲノムに含まれる複数のプロトスペーサー配列を認識するように標的細胞中においてＣａｓヌクレアーゼとともに操作可能であり、
（ａ）プロトスペーサー配列が標的細胞ゲノムの１つもしくは複数の病原性アイランドヌクレオチド配列を含み、
（ｂ）プロトスペーサー配列が標的細胞ゲノムの１つもしくは複数の侵入遺伝子配列を含み、
（ｃ）プロトスペーサー配列が標的細胞ゲノムの１つもしくは複数の分泌系遺伝子配列を含み、ならびに／または
（ｄ）プロトスペーサー配列がＳａｌｍｏｎｅｌｌａのａｖｒＡ、ｓｐｔＰ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＤ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＢ、ｓｉｃＡ、ｉｎｖＢ、ｓｓａＥ、ｓｓｅＡ、ｓｓｅＢ、ｓｓｃＡ、ｓｓｅＣ、ｓｓｅＤ、ｓｓｅＥ、ｓｓｃＢ、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｍｇｔＣ、ｃｉｇＲ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｓｏｐＢ、およびｐｉｐＤから選択される（任意に、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、ｓｓｅＥ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｍａｒＴ、およびｓｏｐＢから選択される）遺伝子から選択される遺伝子の１つもしくは複数のヌクレオチド配列、およびそれらのオルソログもしくはホモログを含む、ＤＮＡ。

【0011】

本発明は以下の構成も提供する。

【0012】

第１の構成において：
第１のエピソームＤＮＡを含むキャリア細菌細胞であって、ＤＮＡが目的の核酸配列（ＮＳＩ）をコードするか、または標的細菌細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードし、キャリア細胞が薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、任意に、
（ａ）キャリア細胞が第１のＤＮＡとは異なる第２のＤＮＡを含み、第２のＤＮＡが第１のＤＮＡの複製のために必要な第１の因子を含むかまたはコードし、
（ｂ）第１のＤＮＡが前記第１の因子を含まずまたはコードせず、第１のＤＮＡが第１の因子の非存在下では非自己複製性であるが、第２のＤＮＡによって提供される第１の因子の存在下ではキャリア細胞中で複製することができ、
（ｃ）細胞が標的細菌細胞中への第１のＤＮＡの接合移入を行うために十分な１つまたは複数の接合因子をコードする遺伝子を含む、キャリア細菌細胞。

【0013】

実施形態では、本発明は、標的細胞ゲノム中における標的配列の認識によって作用するがキャリア細胞中では作用しない抗菌剤を使用することの利点を有用に認識し、これは第１のＤＮＡがキャリア細胞に対する毒性なしにキャリア細胞中で自由に複製する能力を解放するものである。

【0014】

第２の構成において：
ＮＳＩをコードするか、または標的細菌細胞に対して毒性であるが標的細胞中への接合移入のためにＤＮＡを運搬することができるキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする、ＤＮＡであって、第１のＤＮＡが第１のＤＮＡの複製のために必要な第１の因子を含まずまたはコードせず、第１のＤＮＡが標的細菌細胞中に第１のＤＮＡを接合移入するために必要な構成要素を欠いている、ＤＮＡ。

【0015】

第３の構成において：
ヒトまたは動物の対象の成長または重量を増進させるための方法であって、本方法が対象の微生物群への本発明による複数のキャリア細胞の投与を含み、微生物群が標的細胞を含み、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞）を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる、方法。

【0016】

第４の構成において：
植物の成長または重量を増進させるための方法であって、本方法が植物の微生物群への本発明による複数のキャリア細胞の投与を含み、微生物群が標的細胞を含み、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより植物中の標的細胞（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞）を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる、方法。

【0017】

第５の構成において：
対象に含まれまたは表面に含まれるバイオフィルムを低減させるための方法であって、バイオフィルムが標的細胞（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞）を含み、本方法がバイオフィルムへの本発明による複数のキャリア細胞の投与を含み、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それによりバイオフィルム中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる、方法。

【0018】

第６の構成において：
（例えば接合性プラスミドに含まれる）第１のＤＮＡを複製して前記ＤＮＡの複数のコピーを産生する方法であって、本方法が本発明による複数のキャリア細菌細胞を培養することを含み、前記第１のＤＮＡを細胞中で複製し、任意にキャリア細胞から第１のＤＮＡの複数のコピーを単離する、方法。

【0019】

第７の構成において：
複数の標的細菌細胞を死滅させまたはその成長もしくは増殖を低減させる方法であって、
（ａ）本発明によるまたは第６の構成の方法によって得られるキャリア細胞の試料を得ること、
（ｂ）キャリア細胞の試料を複数の標的細菌細胞と接触させてキャリア細胞と標的細胞とを接合させること、および
（ｃ）接合移入によって第１のＤＮＡのコピーをキャリア細胞から標的細胞に移入し、抗菌剤が標的細胞中に提供され、標的細胞が死滅しまたは標的細胞の成長もしくは増殖が低減されること、
（ｄ）第１のＤＮＡが標的細胞中で複製可能でない（または実質的に複製可能でない）こと、
を含む方法。

【0020】

第８の構成において：
本発明による複数のキャリア細胞を含む、医薬組成物、家畜成長促進用組成物、人畜共通感染症制御剤、家畜への投与のための殺生物剤、土壌改良剤、除草剤、植物用肥料、食品もしくは食材の殺菌用組成物、歯科用組成物、個人用衛生組成物もしくは消毒用組成物（例えば家庭用もしくは工業用）。

【0021】

第９の構成において：
第１の態様では、
動物（例えば家畜動物、例えば家禽動物）の成長を促進する方法であって、本方法がガイドされたヌクレアーゼ系またはその構成要素を動物に投与すること、および動物に含まれる標的細菌中に系または構成要素を導入することを含み、ガイドされたヌクレアーゼは標的細菌に含まれる標的ヌクレオチド配列を認識および改変（例えば切断）することができ、それにより標的細菌を死滅させまたは標的細菌の成長もしくは増殖を阻害して動物の成長を促進する、方法。

【0022】

本方法は非医学的方法であり、動物における標的細菌の存在が動物の成長の阻害を可能にする。したがって、本方法は動物におけるかかる細菌の負荷を低減し、成長を促進する。

【0023】

第２の態様では、
動物（例えば家畜動物、例えば家禽動物）における飼料転換率（ＦＣＲ）を増進させる方法であって、本方法がガイドされたヌクレアーゼ系またはその構成要素を動物に投与すること、および動物に含まれる標的細菌中に系または構成要素を導入することを含み、ガイドされたヌクレアーゼは標的細菌に含まれる標的ヌクレオチド配列を認識および改変（例えば切断）することができ、それにより標的細菌を死滅させまたは標的細菌の成長もしくは増殖を阻害して動物のＦＣＲを増大させる、方法。

【0024】

本方法は非医学的方法であり、動物における標的細菌の存在が動物のＦＣＲの増大を可能にする。したがって、本方法は動物におけるかかる細菌の負荷を低減し、ＦＣＲを増進させる（すなわち、ＦＣＲ数を低減する）。

【0025】

第３の態様では、
動物（例えば家畜動物、例えば家禽動物）の成長を促進する方法であって、本方法がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌に毒性である抗菌剤を動物に投与することを含み、動物に含まれるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ標的細菌が薬剤に曝露されて死滅し、または標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて、動物の成長が促進される、方法。

【0026】

本方法は非医学的方法であり、動物における標的細菌の存在が動物の成長の阻害を可能にする。したがって、本方法は動物におけるかかる細菌の負荷を低減し、成長を促進する。

【0027】

第４の態様では、
動物（例えば家畜動物、例えば家禽動物）における飼料転換率（ＦＣＲ）を増進させる方法であって、本方法がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌に毒性である抗菌剤を動物に投与することを含み、動物に含まれるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ標的細菌が薬剤に曝露されて死滅し、または標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて、動物のＦＣＲが増進される、方法。

【0028】

本方法は非医学的方法であり、動物における標的細菌の存在が動物のＦＣＲの増大を可能にする。したがって、本方法は動物におけるかかる細菌の負荷を低減し、ＦＣＲを増進させる（すなわち、ＦＣＲ数を低減させる）。

【0029】

第１０の構成において：
第１の態様では：
植物の成長、乾燥重量、湿潤重量、または作物生産を促進する方法であって、植物が標的細菌を含む微生物群を含み、本方法が微生物群を標的細菌に対して毒性である抗菌剤と接触させることを含み、標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて、植物の成長、乾燥重量、湿潤重量、または作物生産が増大する、方法。

【0030】

第２の態様では、
植物の微生物群に含まれる標的細菌が薬剤と接触させられる方法における標的細菌に対して毒性である抗菌剤の使用であって、それにより植物の成長、乾燥重量、湿潤重量、または作物生産を促進するために標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害される、使用。

【0031】

第３の態様では、
植物の収率を増大させる方法であって、植物が標的細菌を含む微生物群を含み、本方法が微生物群を標的細菌に対して毒性である抗菌剤と接触させることを含み、標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて、植物の成長、乾燥重量、湿潤重量、または作物生産が増大する、方法。

【0032】

第４の態様では、
植物の微生物群に含まれる標的細菌が薬剤と接触させられる方法における標的細菌に対して毒性である抗菌剤の使用であって、それにより植物の作物収量を増大させるために、標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害される、使用。

【0033】

第５の態様では、
植物の葉の葉緑素を増大させる方法であって、植物が標的細菌を含む微生物群を含み、本方法が微生物群を標的細菌に対して毒性である抗菌剤と接触させることを含み、標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて、植物の葉の葉緑素が増大する、方法。

【0034】

第６の態様では、
植物の微生物群に含まれる標的細菌が薬剤と接触させられる方法における標的細菌に対して毒性である抗菌剤の使用であって、それにより植物の葉の葉緑素を増大させるために標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害される、使用。

【0035】

第７の態様では、
植物の緑化を増大させる方法であって、植物が標的細菌を含む微生物群を含み、本方法が微生物群を標的細菌に対して毒性である抗菌剤と接触させることを含み、標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて植物の緑化が増大する、方法。

【0036】

第８の態様では、
植物の微生物群に含まれる標的細菌が薬剤と接触させられる方法における標的細菌に対して毒性である抗菌剤の使用であって、それにより植物の緑化を増大させるために標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害される、使用。

【0037】

第９の態様では、
植物に含まれるバイオフィルム（例えば葉のバイオフィルム）を減少させる方法であって、植物が標的細菌を含むバイオフィルムを含み、本方法が微生物群を標的細菌に対して毒性である抗菌剤と接触させることを含み、標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて植物のバイオフィルムが減少する、方法。

【0038】

第１０の態様では、
植物のバイオフィルム（例えば葉のバイオフィルム）に含まれる標的細菌が薬剤と接触させられる方法における標的細菌に対して毒性である抗菌剤の使用であって、それにより植物のバイオフィルムを阻害するために標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害される、使用。

【0039】

任意に、標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌、例えばＰ ｓｙｒｉｎｇａｅまたはＰ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細菌、または本明細書で開示した他の任意のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌である。

【0040】

任意に、薬剤はガイドされたヌクレアーゼ系またはその構成要素、例えば標的細菌に含まれる標的核酸配列を改変（例えば切断）するための本明細書で開示した任意のかかる系または構成要素である。

【0041】

任意に、植物は本明細書で開示した任意の植物である。

【0042】

任意に、葉緑素は葉緑素ａおよび／または葉緑素ｂである。

【0043】

任意に、薬剤は本発明のキャリア細胞に含まれ、前記接触させることは細胞をキャリア細胞と接触させることを含む。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】レシピエントのコロニーに対して行われたＰＣＲを示す図である。左から右に：１）プラスミドｐＦＳＭｏｂＣ^＊（対照）、２）Ｓ１７内のプラスミドｐＦＳＭｏｂＣ^＊（対照）、３）接合完了体プレート（Ｃｍ３０＋Ｎａｌ２５）からのコロニー、４）接合完了体プレート（Ｃｍ３０＋Ｎａｌ２５）からの２番目のコロニー。

【図2】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＦＳ２６に対する、接合によって送達されたｐＦＳＭｏｂＳａｌ７の生存の影響を示す図である。

【図3】感染後７日目の盲腸におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの数を示す図である。群当たりＮ＝１５の鳥。

【図4】感染後７日目の盲腸におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出頻度を示す図である。群当たりＮ＝１５の鳥。

【図5】６週齢の鳥の死骸の重量を示す図である。

【図6】チャレンジの７日後の素嚢消化物におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの数（ＣＦＵ／ｇ）を示す図である。Ｎ＝９の鳥、Ｐ＝０．０３。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本発明は細菌の間の接合を行う手段に関し、特に本発明は抗菌剤を含むキャリア細菌および使用の方法に関する。キャリア細菌は薬剤をコードするＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができる。

【0046】

本発明はさらに、動物における成長、重量、または飼料転換率（ＦＣＲ）の促進に関する。本発明はさらに、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの死滅またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの成長または増殖の阻害に関する。

【0047】

したがって、対象の成長または重量を増進するための（例えば非医学的または医学的）方法であって、対象が細菌標的細胞を含み、本方法が標的細胞に対して毒性である抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを対象に投与することを含み、第１のＤＮＡが標的細胞に移入されて薬剤が発現され、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、対象の成長または重量を増進させる、方法が提供される。

【0048】

有利には、対象においてＦＣＲが増進される。任意に、ＦＣＲは、薬剤またはキャリア細胞の投与の前の対象のＦＣＲと比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％、例えば２～６％、または２～５％（例えば２、３、４、５または６％）増進される（すなわち低下する）。任意に、ＦＣＲは、薬剤またはキャリア細胞の投与を受けていない同種、同性の対照対象のＦＣＲと比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％、例えば２～５％（例えば２、３、４、または５％）増進される。一実施形態では、対象は鳥、家禽、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、またはアヒル（好ましくはニワトリ）であり、ＦＣＲ数は０．０３～０．０７、例えば０．０４～０．０６、例えば０．０４、０．０５、または０．０６の量で低下する。したがって、例えば、対照の鳥と比較して、対照の鳥のＦＣＲは１．７（ｇ飼料／ｇ鳥）であり、本発明を使用して処置した後の対象の鳥は１．６４～１．６６のＦＣＲを有している。本発明の対象と同種、同性、および同齢の、同じ餌（飼料）で飼育した対照の鳥（例えばニワトリ）は、本発明の処置を受けない。鳥は同じ一団のものでよい。したがって一実施形態では、鳥（例えばニワトリ）は１．６４～１．６６のＦＣＲを有し、対象は本発明の方法によって処置されている。

【0049】

一例では、本方法は対象の群（例えば同種の対象、例えば家畜動物の群、例えば家禽の一団またはウシもしくはヒツジの群れ）について行われる。本例では、群の平均ＦＣＲは、同種、同亜種、または同型の対照動物群と比較して、または本方法によって処置する前の群の平均ＦＣＲと比較して、本方法によって増進される（すなわち、ＦＣＲ数は低下する）。対照群は本発明の群と同じ種、同じ平均齢、同じ雌雄割合の動物群で、同じ餌で飼育されたものでよい。例えば、本発明の群と対照群とは、いずれも例えば１世代、２世代、または３世代遡って共通の先祖を有する家禽（例えばニワトリ）の一団である。一団はブロイラーニワトリまたは産卵鶏の一団であってよい。例えば、本発明の群と対照群とは、いずれも例えば１世代、２世代、または３世代遡って共通の先祖を有する肉牛の群れ、または乳牛の群れである。

【0050】

ＦＣＲ、ＦＥ、およびＥＣＩ
畜産業において、飼料転換率（ＦＣＲ）は、家畜の体が動物用飼料を所望のアウトプットに転換する効率を測定する比率である。乳牛については、例えばアウトプットはミルクであり、食肉用に飼育される動物（例えば肉牛、ブタ、ニワトリ、および魚類）では、アウトプットは肉、したがって動物が獲得した体質量であり、動物の最終体重または加工されたアウトプットの質量で表わされる。ＦＣＲはインプット質量をアウトプットで除したもの（すなわち乳または肉の質量あたりの飼料の質量）である。いくつかの産業分野では、アウトプットをインプットで除した飼料効率（ＦＥ）（すなわち、ＦＣＲの逆数）が使用される。これらの概念は、摂取された食料の転換効率（ＥＣＩ）とも密接に関連している。ＦＣＲはブタおよび家禽の生産において広く使用されており、ＦＥはウシにおいてより一般的に使用されている。ＦＣＲは比であるので無次元であり、すなわち、これはＦＣＲを決定するために使用される測定単位に影響されない。低いＦＣＲを有する動物は、飼料を有効に利用していると考えられる。

【0051】

好ましくは、本発明によって産生される増進は対象の体質量の増大である。ＦＣＲの増進の代わりに、本発明は対象における飼料効率（ＦＥ）を増進するため、または対象における摂取食料の転換効率（ＥＣＩ）を増進するための方法であってよい。

【0052】

ＦＣＲは飼料の乾燥質量を使用して計算してよく、または給餌されたままの湿潤質量基準で計算してよい。

【0053】

一実施形態では、ＦＣＲ、ＦＥ、またはＥＣＩ数は、０．２、０．５、１、１．５、または２、変化する。例えばＦＣＲは１、１．５、または２、低減する。

【0054】

家畜についての転換比
肉牛
米国において２０１３年現在で、生体重増加について計算した４．５～７．５のＦＣＲが正常範囲であり、６を超えるＦＣＲが典型的であった。したがって、本発明の例において該または各動物は肉牛であり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は、本方法によって（動物の生体重を使用して計算して）６未満、例えば５．５、５、４．５、４、または３．５未満（任意に、前記ＦＣＲまたは平均ＦＣＲは３．５～５．９、例えば４～５．５）に低下する。

【0055】

乳牛
米国においては、ミルクの価格はタンパク質および脂肪の含量に基づいており、したがってＦＣＲはこれを考慮して計算されることが多い。２０１１年現在で動物から得られたミルクにおけるタンパク質と脂肪の重量のみに基づいて計算したＦＣＲを使用すれば、ＦＣＲ１３は貧弱であり、ＦＣＲ８は極めて良好である。したがって、本発明の例において、該または各動物は乳牛であり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって１１、１０、９、または８未満（かつ任意に５または６より大きい）に低減し、ここでＦＣＲは本発明の方法によって処置された動物から得られたミルクのＦＣＲであり、ＦＣＲはミルク中のタンパク質と脂肪を合わせた重量を使用して計算されている。

【0056】

タンパク質および脂肪に基づいて価格設定に対処する別の方法は、エネルギー補正したミルク（ＥＣＭ）を使用することであり、これは最終の乳製品におけるある量の脂肪およびタンパク質を仮定して正規化する因子を付加する。その式は（０．３２７×ミルク質量）＋（１２．９５×脂肪質量）＋（７．２×タンパク質質量）である。酪農業では、飼料効率（ＥＣＭ／摂取量）がＦＣＲ（摂取量／ＥＣＭ）の代わりに使用されることが多い。１．３未満のＦＥは問題ありと考えられる。したがって、本発明の例では、該または各動物は乳牛であり、動物のＦＥ数（または動物の平均ＦＥ）は本方法によって１．３、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、または３を超えて（かつ任意に４または５を超えずに）増大する。任意に、ＦＥは１．３、１．５、１．６を超え、１．７を超えずに増大する。

【0057】

単にミルクの重量に基づくＦＥも使用される。１．３０～１．７０のＦＥが正常である。したがって、本発明の例では、該または各動物は乳牛であり、動物のＦＥ数（または動物のＦＥの平均）は本方法によって１．３、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、または３を超えて（かつ任意に４または５を超えずに）増大する。任意に、ＦＥは１．３、１．５、１．６を超え、１．７を超えずに増大する。

【0058】

ブタ
２０１１年現在、英国および欧州で商業的に使用されているブタは、体重増加を使用して計算して、子豚では約１、屠畜時には約３で終了するＦＣＲを有していた。２０１２年現在でオーストラリアでは、アウトプットについての加工重量を使用して、加工肉の重量を使用して計算した４．５のＦＣＲはほぼ良好であり、４．０は「良好」、３．８は「極めて良好」であった。２０１２年現在で米国では、市販のブタは体重増加を使用して計算して、体重２４０～２５０ポンドで３．４６、２５０～２６０ポンドで３．６５、２６０～２７０ポンドで３．８７、および２８０～２７０ポンドで４．０９のＦＣＲを有していた。したがって、本発明の例では、該または各動物は子豚であり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって１またはそれ未満に低減し、ＦＣＲは動物の体重増加を使用して計算している。したがって、本発明の例では、該または各動物は３月齢までのブタであり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって１またはそれ未満に低減し、ＦＣＲは動物の体重増加を使用して計算している。したがって、本発明の例では、該または各動物は３月齢より大きく６～７月齢までのブタであり、動物におけるＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって３またはそれ未満（例えば１～３）に低減し、ＦＣＲは動物の体重増加を使用して計算している。子豚は１．５～３月齢であってよく、屠畜するブタは３月齢を超え、６月齢までであってよい。したがって、本発明の例では、該または各動物はその体重が２４０～２５０ポンドのブタであり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって３．５またはそれ未満（例えば３．４またはそれ未満であるが、任意に３または２．５以上）に低減し、ＦＣＲは動物の体重増加を使用して計算している。したがって、本発明の例では、該または各動物はその体重が２５０～２６０ポンドのブタであり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって３．７またはそれ未満（例えば３．６５またはそれ未満であるが、任意に３または３．５以上）に低減し、ＦＣＲは動物の体重増加を使用して計算している。したがって、本発明の例では、該または各動物はその体重が２６０～２７０ポンドのブタであり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本発明によって３．９またはそれ未満（例えば３．８またはそれ未満であるが、任意に３．７または３．５以上）に低下し、ＦＣＲは動物の体重増加を使用して計算している。したがって、本発明の例では、該または各動物はその体重が２８０～２７０ポンドのブタであり、動物におけるＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって４．１またはそれ未満（例えば４またはそれ未満であるが、任意に３．８または３．９以上）に低下し、ＦＣＲは動物の体重増加を使用して計算している。

【0059】

ヒツジ
ヒツジについてのいくつかのデータは、ＦＣＲにおける変動を示している。子羊についてのＦＣＲ（生体質量増ｋｇあたりの飼料乾燥物摂取量ｋｇ）は、約４～６の範囲であることが多い。したがって、本発明の例では、該または各動物はヒツジであり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって６またはそれ未満（例えば４～６）に低減し、ＦＣＲは動物の生体質量増ｋｇあたりの飼料乾燥物摂取量ｋｇを使用して計算している。

【0060】

家禽
２０１１年現在で米国では、ブロイラーニワトリは典型的には体重増加に基づいて１．６のＦＣＲを有し、３９日で成熟する。ほぼ同じ頃、ブラジルにおけるブロイラーの体重増加に基づくＦＣＲは１．８であった。したがって、本発明の例では、該または各動物は家禽（例えばブロイラーニワトリ）であり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって１．９、１．８、１．７、１．６、またはそれ未満（例えば１．９～１．５、または１．８～１．６）に低減し、ＦＣＲは体重増加に基づいて計算している。任意に、ＦＣＲはそれぞれの動物が３５～４０日齢、例えば３９日齢であるときに計算する。

【0061】

２０１１年現在で米国における採卵用のニワトリについては、ＦＣＲは約２であり、それぞれの雌鶏は１年あたり３３０個を産卵した。したがって、本発明の例では、該または各動物は家禽（例えば産卵鶏、例えばニワトリ）であり、動物のＦＣＲ数（または動物の平均ＦＣＲ）は本方法によって２またはそれ未満（例えば２～１．５）に低減し、ＦＣＲは体重増加に基づいて計算している。したがって、本発明の例では、該または各動物は家禽（例えば産卵鶏、例えばニワトリ）であり、動物が産む卵の数（または動物が産む卵の平均数）は１年あたり（または異なる期間については按分して）３３０個を超え、例えば１年あたり（または按分した期間で）３４０、３５０、または４００個を超える。

【0062】

肉食性魚類
ＦＩＦＯ比（またはフィッシュイン－フィッシュアウト比）は、水産養殖に適用される転換比であり、１番目の数字は養殖魚に与えるために使用する捕獲した魚の質量であり、２番目の数字は得られた養殖魚の質量である。ＦＩＦＯは、水産飼料に使用する捕獲した野生の魚の寄与を食用の養殖魚の量と比較した比として表わす方式である。水産飼料における魚粉および魚油の含有率は、水産養殖業が成長してより多くの飼料が生産されるとともに経時的に連続減少してきたが、魚粉および魚油の年間供給は有限である。計算によって、全体の飼料水産養殖ＦＩＦＯは２０００年の０．６３から２０１０年の０．３３および２０１５年の０．２２に減少した。２０１５年には、捕獲して飼料中に用いた野生魚１ｋｇごとにほぼ４．５５ｋｇの養殖魚が生産された。魚粉および魚油の生産において使用する魚は人による消費には使用されないが、水産飼料における魚粉および魚油としてのそれらの使用によって、それらは世界的な食糧生産に寄与している。したがって、例において本発明の方法は、動物が魚類（例えばサケ、テラピア、またはナマズ）である場合に、ＦＩＦＯ比を増進（すなわち増大）させる。例えば、ＦＩＦＯは０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、もしくは０．８、１、１．５、もしくは２またはそれ以上に増大する。例えば、魚類はサケまたはナマズであり、ＦＩＦＯは１、１．５、または２を超え（任意に２または２．５を超えず）上昇する。例えば、魚類はテラピアであり、ＦＩＦＯは１．５または２を超え（任意に２または２．５を超えず）上昇する。

【0063】

成長または重量の増進は、ミルクの生産または収率の増進（増大）、例えば対照群と比較した本発明の群についての平均増大であり得る。対照群は本発明の群と同じ種、同じ平均齢、同じ雌雄割合の動物群で、同じ餌で飼育されたものでよい。例えば、ここで対象は乳牛であってよい。

【0064】

成長または重量の増進は、卵の生産または収率の増進（増大）、例えば対照群と比較した本発明の群についての平均増大であり得る。対照群は本発明の群と同じ種、同じ平均齢、同じ雌雄割合の動物群で、同じ餌で飼育されたものでよい。例えば、ここで対象は産卵鶏であってよい。

【0065】

成長または重量の増進は、食肉の生産または収率の増進（増大）、例えば対照群と比較した本発明の群についての平均増大であり得る。対照群は本発明の群と同じ種、同じ平均齢、同じ雌雄割合の動物群で、同じ餌で飼育されたものでよい。例えば、ここで対象は乳牛、家禽（例えばニワトリ）、魚類、甲殻類、ヒツジ、またはブタであってよい。

【0066】

成長または重量の増進は、脂肪の生産または収率の増進（増大）、例えば対照群と比較した本発明の群についての平均増大であり得る。対照群は本発明の群と同じ種、同じ平均齢、同じ雌雄割合の動物群で、同じ餌で飼育されたものでよい。例えば、ここで対象は乳牛、家禽（例えばニワトリ）、魚類（例えばサケ、テラピア、またはナマズ）、甲殻類、ヒツジ、またはブタであってよい。

【0067】

成長または重量の増進は、毛皮または皮革の生産または収率の増進（増大）、例えば対照群と比較した本発明の群についての平均増大であり得る。対照群は本発明の群と同じ種、同じ平均齢、同じ雌雄割合の動物群で、同じ餌で飼育されたものでよい。例えば、ここで対象はウシであってよい。

【0068】

一例では、対象は甲殻類である。甲殻類はエビ、ザリガニ、カニ、ロブスター、ハマグリ、ホタテ、カキ、クルマエビ、およびイガイから選択され得る。

【0069】

対象は本明細書で開示した任意の対象であってよい。対象は家畜動物、例えば鳥（例えば家禽、またはニワトリもしくはシチメンチョウ）、またはブタ等の動物であってよい。あるいは、対象はヒト、例えば摂食障害（例えば拒食症）を患うヒト、または低体重のヒト、例えばヒトが１８．５、１８、１７、１６、または１５未満の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する場合であってよい。例えば、ヒトは軽度の拒食症（すなわちヒトが１７．５未満のＢＭＩを有している）、中程度の拒食症（すなわちヒトが１６～１６．９９のＢＭＩを有している）、重度の拒食症（すなわちヒトが１５～１５．９９のＢＭＩを有している）、または極端な拒食症（すなわちヒトが１５未満のＢＭＩを有している）を有する。

【0070】

一選択肢では、対象は植物であり、例えば標的細菌は植物病原細菌である。一例では、標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えばＰ ｓｙｒｉｎｇａｅまたはＰ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。

【0071】

一選択肢では、標的細胞は古細菌細胞である。例えば、標的細胞はメタン細菌細胞である。

【0072】

例えば、標的細胞はメタン生成細胞である。例えば、標的細胞は
・Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｙａｎｔｉｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｕｍ
・Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ
・Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ
・Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈｕｎｇｈｓｉｎｇｅｎｓｉｓ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｏｌｉｃｕｓ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｌｔａｅ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ ｌａｂｒｅａｎｕｍ
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ ｂｏｕｒｇｅｎｓｉｓ（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｏｌｅｎｔａｎｇｙｉおよびＭｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｂｏｕｒｇｅｎｓｅ）
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ ｍａｒｉｓｎｉｇｒｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｆｌｏｒｅｎｓ ｓｔｏｒｄａｌｅｎｍｉｒｅｎｓｉｓ［３４］
・Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ
・Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｃａｒｉａｃｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｆｒｉｇｉｄｕｍ
・Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ
・Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｗｏｌｆｅｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｏｂｉｌｅ
・Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ ｂｏｏｎｅｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｃｏｎｃｉｌｉｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ
・Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ
・Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ ｓｔａｄｔｍａｎａｅ
・Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ
・Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｆｌｕｖｉｉ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｆｌｕｖｉｉ）
・Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）
・Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｍ）
・Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｗｏｌｆｅｉ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｌｆｅｉ）
・Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｒｉｘ ｓｏｃｈｎｇｅｎｉｉ
から選択される１つまたは複数の細胞の種を含む。

【0073】

任意に、例えば本方法が非医学的方法である場合に、標的細胞は対象に対して病原性ではない。一例では、本方法は美容のための方法である。

【0074】

例えば、標的細胞はメタン産生細胞であり、任意に、対象は家畜動物、好ましくは反芻動物、またはウシ（例えば肉牛または乳牛）である。かかる動物においてメタン産生細胞を低減することにより、本発明は一実施形態において動物の体重を増進させ（例えば動物からの食肉の収率を増進し）、および／またはミルクもしくは動物の別の生産物、例えば毛皮もしくは脂肪の収率を増進させ得る。

【0075】

一例では、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ細胞から選択される。一例では、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの細胞である。一例では、それぞれの動物はニワトリ（例えばブロイラーまたは産卵鶏）であり、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ細胞である。一例では、それぞれの動物はウシ（例えば肉牛または乳牛）であり、標的細胞はメタン細菌細胞である。

【0076】

一例では、標的細胞はＭｙｃｏｐｌａｓｍａ（例えばＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ（例えばＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ亜種Ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｌｅａｃｈｉｉまたはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｈａｕｖｏｅｉまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔｉｃｕｍ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ（例えばＬ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌ．ｈａｒｄｊｏ、またはＬ．Ｐｏｍｏｎａ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７）、またはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（例えばＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｂ：２、Ｅ：２、Ａ：１、またはＡ：３）から選択される。本例では、任意に、対象または動物は家畜動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、またはニワトリ（好ましくはウシ）である。

【0077】

任意に、例えば対象が動物（例えば家畜動物または野生動物）である場合に、標的細胞は人畜共通細菌細胞、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（例えば動物がウシである場合）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ（例えば動物が家禽動物である場合）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ（例えば動物が魚類である場合）、志賀毒素産生Ｅ．Ｃｏｌｉ（例えば動物が反芻動物である場合）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ（例えば動物がウシまたはヒツジである場合）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｂｏｒｔｕｓ（例えば動物がヒツジである場合）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ（例えば動物がウシ、ヒツジ、またはヤギである場合）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ（例えば動物が家禽動物である場合）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ（例えば動物がブタである場合）、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＣ ｕｌｃｅｒａｎｓ）（例えば動物がウシである場合）から選択される種の細胞である。

【0078】

一例では、本明細書に記載した複数のキャリア細胞（例えば本明細書に記載した任意の構成、態様、実施例、または実施形態のキャリア細胞）が対象に投与され、キャリア細胞は薬剤をコードするＤＮＡを含む。

【0079】

一例では、それぞれの動物はニワトリ（例えばブロイラーまたは産卵鶏）であり、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ細胞である。一例では、それぞれの動物はウシ（例えば肉牛または乳牛）であり、標的細胞はメタン細菌細胞である。

【0080】

したがって、一実施形態では、
対象の成長または重量を増進させるための（例えば非医学的または医学的）方法であって、本方法が対象への複数のキャリア細胞の投与を含み、対象が細菌標的細胞を含み、それぞれのキャリア細胞が標的細胞に対して毒性であるが前記キャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、キャリア細胞が薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、対象の成長または重量を増進させる、方法が提供される。

【0081】

任意に、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である。一例では、標的細胞はＳ ｅｎｔｅｒｉｃａおよび／またはＳ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞を含み；任意に、Ｓ ｅｎｔｅｒｉｃａはＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａである。任意に、本方法は複数の異なるＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型を死滅させる；任意に、それぞれの血液型亜型はＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｒｃｈｏｗ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｈａｄａｒ、Ｂｉｎｚａ、Ｂｒｅｄｅｎｅｙ、Ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ、Ｓｅｆｔｅｎｂｅｒｇ、Ｍｂａｎｄａｋａ、Ａｎａｔｕｍ、Ａｇｏｎａ、およびＤｕｂｌｉｎからなる群から選択される。任意に、本方法はＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｉｎｆａｎｔｉｓ、およびＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを死滅させる。任意に、本方法はＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを死滅させる。任意に、本方法はＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＩｎｆａｎｔｉｓを死滅させる。任意に、本方法はＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＩｎｆａｎｔｉｓを死滅させる。ニワトリにおいて最も蔓延している血液型亜型はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｉｎｆａｎｔｉｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである。一般に、感染したヒトおよびニワトリにおいてＳａｌｍｏｎｅｌｌａの類似の血液型亜型（Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が見られる。家畜動物においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａを死滅させることによって、本発明は（例えば家畜または家畜から製造された製品、例えばヒトの消費のための食肉または乳製品を食べること等による）ヒトへの伝染のために利用され得る人畜共通細菌のプールを低減するために有用である。

【0082】

有利には、キャリア細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞、任意に、Ｅ ｃｏｌｉ細胞である。以下の実施例で例示するように、本発明者らは驚くべきことに、（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でかかる細胞からＳａｌｍｏｎｅｌｌａ標的細胞に抗菌剤を効率的に移入できること、および（ｉｉ）薬剤をＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ細胞からＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞に接合によって移入した場合に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの１００％の死滅が可能であったことを見出した。さらに驚くべきことに、ガイドされたヌクレアーゼ抗菌剤をコードするＤＮＡは、臨床的にも人畜共通感染症としても重要なＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｉｎｆａｎｔｉｓ、およびＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含む１８種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．血清型を死滅させることができた。任意に、本方法は、Ｓ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ血液型亜型を死滅させる。任意に、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｉａｅ細胞は、表５に示すＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｉａｅ種の細胞である。

【0083】

重要なことに、標的細胞の低減は、対象のＧＩ管で観察された。したがって、任意に、本方法は動物の胃腸管において標的細胞を低減させる。任意に、本方法は動物の空腸、回腸、結腸、肝、脾、または盲腸において標的細胞を低減させる；任意に、動物は鳥であり、本方法は鳥の盲腸において標的細胞を低減させる。これは、家畜動物等の対象の糞便中における人畜共通またはその他の有害な標的株の拡散を低減させるために重要であり得る。したがって、一例では本方法は対象の群（例えば群れまたは一団、例えばブタの群れまたは鳥の一団）について行われ、標的種の細胞の拡散がその群において低減される。本発明者らは、本発明を使用してＳａｌｍｏｎｅｌｌａを死滅させる家禽の一団においてこれを実証し、ここではガイドされたヌクレアーゼを使用して標的細胞中の複数のプロトスペーサー配列を切断し、それにより細胞を死滅させてその一団における細胞の拡散を低減する。

【0084】

したがって、一例では本方法は動物の群（任意に、一団または群れ）において行われ、動物の一部または全部が標的細胞を含み、標的種の細胞の拡散はその群において低減され、またはその群から動物の第２の群への拡散が低減される。

【0085】

任意に、第１のＤＮＡはプラスミドに含まれ、例えばプラスミドはＲＰ４移入起点（ｏｒｉＴ）を含む。プラスミドは本明細書で開示した任意の型のプラスミドであってよい。

【0086】

薬剤は本明細書で開示した任意の抗菌剤、好ましくは標的細胞中の１つまたは複数の標的配列を切断するようにプログラムされた、ガイドされたヌクレアーゼであってよい。好適なヌクレアーゼはＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼであってよい。例えば、薬剤は、標的細胞に含まれるプロトスペーサー配列を切断するように標的細胞中で操作可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成要素（例えばＣａｓヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ）を含み、任意に、標的細胞は細菌種の第１および第２の株を含み、それぞれの株はプロトスペーサー配列を含み、その株の細胞が死滅する。例えば、系は細胞ゲノムに含まれる少なくとも３つの異なるプロトスペーサー配列を切断するように操作可能である。任意に、前記プロトスペーサー配列のそれぞれまたはいくつかは、細胞に含まれる病原性アイランドに含まれる。実施例で示すように、これは標的細胞の死滅に高度に効果的である。任意に、薬剤は標的細胞ゲノムに含まれる複数の異なるプロトスペーサー配列を切断するように操作可能である。任意に、薬剤は、標的細胞ゲノムに含まれる（例えば標的細胞の染色体に含まれる）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異なるプロトスペーサー配列を切断するように標的細胞中で操作可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成要素を含む。

【0087】

一実施形態では、薬剤は、
（ａ）標的核酸配列を認識し改変することができるガイドされたヌクレアーゼを含み、標的配列は標的細胞の内因性染色体またはエピソームに含まれるがキャリア細胞には含まれず、ヌクレアーゼは染色体またはエピソームを改変して標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を阻害し、および／または
（ｂ）標的細胞に含まれるプロトスペーサー配列を切断するように標的細胞中でＣａｓヌクレアーゼとともに作動するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする。

【0088】

（任意に、本発明の方法における使用のための）キャリア細胞であって、細胞が細菌標的細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない殺菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、キャリア細胞が抗菌剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、それにより標的細胞を死滅させ、標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、キャリア細胞がＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である、キャリア細胞も提供される。

【0089】

病原性細菌標的細胞による感染を処置するための対象への細胞の投与を含む方法における使用のための複数のキャリア細胞を含む組成物であって、それぞれのキャリア細胞が標的細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、キャリア細胞が薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、キャリア細胞がＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である、組成物も提供される。一選択肢では、本方法は病原性標的細胞による感染の症状を処置しまたは低減する。

【0090】

本明細書における対象への細胞のいずれの投与も、経口投与であってよい。本明細書における対象への細胞のいずれの投与も、好ましくはＧＩ管への投与である。本明細書における対象への細胞のいずれの投与も、全身、経鼻、または吸入投与であってよい。

【0091】

動物における人畜共通細菌標的細胞を死滅させる非医学的方法であって、本方法が複数のキャリア細胞を動物に投与することを含み、それぞれのキャリア細胞が標的細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする第１のエピソームＤＮＡを含む細菌細胞であり、キャリア細胞が薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させ、標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、任意にキャリア細胞がＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である、方法も提供される。

【0092】

動物は本明細書で開示した任意の動物、例えば家畜動物、馴化された動物、または野生の動物（例えばコウモリまたは鳥）であってよい。

【0093】

任意に、本明細書におけるいずれの方法も、対象の胃腸管におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａを低減する。任意に、標的細胞は、死滅させる様々なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．型を含む。

【0094】

いずれの態様、構成、実施例、概念、または実施形態でも、キャリア細胞、標的細胞、またはＤＮＡはそれぞれ、他の任意の態様、構成、実施例、概念、または実施形態で定義したキャリア細胞、標的細胞、またはＤＮＡである。

【0095】

本発明はまた、標的細胞中に導入することができるＤＮＡであって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の複数のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡが標的細胞ゲノムに含まれる複数のプロトスペーサー配列を認識するように標的細胞中においてＣａｓヌクレアーゼとともに操作可能であり、任意に、標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞または表５に開示した種の細胞であり、
（ａ）プロトスペーサー配列が標的細胞ゲノムの１つもしくは複数の病原性アイランドヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）プロトスペーサー配列が標的細胞ゲノムの１つもしくは複数の侵入遺伝子配列を含み；
（ｃ）プロトスペーサー配列が標的細胞ゲノムの１つもしくは複数の分泌系遺伝子配列を含み；
ならびに／または
（ｄ）プロトスペーサー配列がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）のａｖｒＡ、ｓｐｔＰ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＤ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＢ、ｓｉｃＡ、ｉｎｖＢ、ｓｓａＥ、ｓｓｅＡ、ｓｓｅＢ、ｓｓｃＡ、ｓｓｅＣ、ｓｓｅＤ、ｓｓｅＥ、ｓｓｃＢ、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｍｇｔＣ、ｃｉｇＲ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｓｏｐＢ、およびｐｉｐＤから選択される（任意に、ｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、ｓｓｅＥ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｍａｒＴ、およびｓｏｐＢから選択される）遺伝子、または前記遺伝子のオルソログまたはホモログの１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡが提供される。

【0096】

ホモログ：共通の先祖のＤＮＡまたはタンパク質の配列からの家系で第２の遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質の配列に関係付けられる遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質の配列。用語「ホモログ」は、遺伝子複製の事象によって分離された遺伝子の間の関係または遺伝子複製の事象によって分離された遺伝子の間の関係に適用され得る。

【0097】

オルソログ：オルソログは、共通の先祖の遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質の配列からスペシエーションによって進化した異なる種における遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質の配列である。通常、オルソログは進化の過程において同じ機能を保持する。

【0098】

「前記遺伝子のオルソログまたはホモログ」は、プロトスペーサーが標的細胞ゲノムの遺伝子に含まれる配列であってよく、遺伝子がａｖｒＡ、ｓｐｔＰ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＤ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＢ、ｓｉｃＡ、ｉｎｖＢ、ｓｓａＥ、ｓｓｅＡ、ｓｓｅＢ、ｓｓｃＡ、ｓｓｅＣ、ｓｓｅＤ、ｓｓｅＥ、ｓｓｃＢ、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｍｇｔＣ、ｃｉｇＲ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｓｏｐＢ、およびｐｉｐＤから選択される（任意に、ｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、ｓｓｅＥ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｍａｒＴ、およびｓｏｐＢから選択される）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ遺伝子のオルソログまたはホモログであることを意味する。

【0099】

任意に、ＤＮＡは本発明の方法における使用のための第１のＤＮＡである。好ましくは、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ細胞等のＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞である。

【0100】

任意に、本明細書におけるいずれのＳａｌｍｏｎｅｌｌａもＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＬＴ２である。

【0101】

任意に、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種以外の表５に開示した種の細胞であり、（ｄ）の配列はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）のａｖｒＡ、ｓｐｔＰ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＤ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＢ、ｓｉｃＡ、ｉｎｖＢ、ｓｓａＥ、ｓｓｅＡ、ｓｓｅＢ、ｓｓｃＡ、ｓｓｅＣ、ｓｓｅＤ、ｓｓｅＥ、ｓｓｃＢ、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｍｇｔＣ、ｃｉｇＲ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｓｏｐＢ、およびｐｉｐＤのオルソログまたはホモログから選択される（任意に、ｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、ｓｓｅＥ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｍａｒＴ、およびｓｏｐＢから選択される）遺伝子の配列である。

【0102】

ＤＮＡは１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲスペーサーを含んでよく、それぞれのスペーサーは分泌系遺伝子（任意に、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのＩＩＩ型タンパク質分泌系またはＳＰＩ－１もしくはＳＰＩ－２の分泌系）、またはＴ３ＳＳ遺伝子座遺伝子、またはそれらから１０、９、８、７、６、５、４、３、もしくは２までのヌクレオチド差のヌクレオチド配列からなる。

【0103】

任意に、ＤＮＡ（例えばキャリア細胞のＤＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の複数のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは標的細胞ゲノムに含まれる複数のプロトスペーサー配列を認識するように標的細胞中でＣａｓヌクレアーゼとともに操作可能であり、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、プロトスペーサー配列はｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、およびｓｓｅＥから選択される遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。例えば、プロトスペーサー配列は遺伝子ｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、およびｓｓｅＥのヌクレオチド配列を含む。一例では、ＤＮＡはまた、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、ＣａｓＸ、またはＣａｓＹをコードする。一実施形態では、ＣａｓはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣａｓ、好ましくはＩ型またはＩＩ型のＣａｓである。一例では、ＤＮＡはまたＣａｓ３および関連するＣａｓｃａｄｅタンパク質（例えばＣａｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）をコードする。任意に、Ｃａｓ（および現在のＣａｓｃａｄｅ）はＥ．ｃｏｌｉ Ｃａｓ（およびＣａｓｃａｄｅ）である。

【0104】

任意に、標的細胞の遺伝子はシャペロンまたは分泌されたエフェクタータンパク質、例えば病原性アイランドまたはＩＩＩ型タンパク質分泌系（任意に、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのＳＰＩ－１およびＳＰＩ－２の分泌系等のＴ３ＳＳ遺伝子座）によってコードされるタンパク質をコードする。

【0105】

ＤＮＡは１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲスペーサーを含んでよく、それぞれのスペーサーは、標的細胞のゲノムに含まれる遺伝子の２０～４０、２５～３５、または３０～３５の連続したヌクレオチド、例えば
（ａ）ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのａｖｒＡ、ｓｐｔＰ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＤ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＢ、ｓｉｃＡ、ｉｎｖＢ、ｓｓａＥ、ｓｓｅＡ、ｓｓｅＢ、ｓｓｃＡ、ｓｓｅＣ、ｓｓｅＤ、ｓｓｅＥ、ｓｓｃＢ、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｍｇｔＣ、ｃｉｇＲ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｓｏｐＢ、およびｐｉｐＤ、またはそのホモログもしくはオルソログ、
（ｂ）標的細胞ゲノムに含まれる病原性アイランドに含まれる遺伝子、
（ｃ）標的細胞ゲノムに含まれる分泌系（例えばＩＩＩ型タンパク質分泌系）遺伝子
からなる。

【0106】

任意に、ＤＮＡは、ＤＮＡの複製のために細菌宿主細胞中で操作可能な移入起点（ｏｒｉＴ）および複製起点（ｏｒｉＶ）を含むプラスミドに含まれる。任意に、第１のＤＮＡはプラスミドに含まれ、プラスミドはＲＰ４移入起点（ｏｒｉＴ）および／またはｐ１５Ａ複製起点を含む。

【0107】

任意に、ＤＮＡは配列番号１５を含み、任意に、ＤＮＡはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ標的細胞への接合のためにキャリア細菌細胞中のプラスミドに含まれる。一例では、本発明のＤＮＡは接合性プラスミドまたはファージミドに含まれる。

【0108】

一例では、ＤＮＡはＣＲＩＳＰＲリピート配列およびスペーサー配列を含み、
（ｅ）リピート配列はそれぞれ配列番号１６を含み、ならびに／または
（ｆ）スペーサー配列は配列番号１７～１９から選択される１つ、２つ、もしくは３つの配列およびその相補配列を含み、
任意にＤＮＡはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ標的細胞への接合のためのキャリア細菌細胞中のプラスミドに含まれる。

【0109】

任意に、ＤＮＡは（任意に５’から３’への順で）配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９を含む。任意に、ＤＮＡは表６に示す１つまたは複数の（例えば、少なくとも３つの）スペーサー配列を含む。

【0110】

一例では、ＤＮＡはＣａｓ３および任意に１つまたは複数のＣａｓｃａｄｅタンパク質（例えばＣａｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの１つ又は複数）をコードする。一実施形態では、第１のＤＮＡはＣａｓ３ならびにＣａｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥをコードする。一実施形態では、第１のＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ Ｃａｓ３ならびにＣａｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥをコードする。任意に、ガイドされたヌクレアーゼ（例えばＣａｓ３）はＩ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄ、－Ｅ、－Ｆ、または－Ｕ型Ｃａｓである。

【0111】

一例では、本明細書の任意の構成、実施例、選択肢、または実施形態における薬剤は、標的細胞に含まれるプロトスペーサー配列を切断するように標的細胞中で操作可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成要素を含む。

【0112】

一例では、系は標的細胞ゲノムに含まれる少なくとも３つの異なるプロトスペーサー配列を切断するように操作可能である。一実施形態では、前記プロトスペーサー配列のそれぞれまたはいくつかは、標的細胞に含まれる病原性アイランドに含まれる。

【0113】

一例では、本明細書の任意の構成、実施例、選択肢、または実施形態における薬剤は、
（ａ）標的核酸配列を認識および改変することができるガイドされたヌクレアーゼを含み、標的配列は標的細胞の内因性染色体またはエピソームに含まれるが、キャリア細胞には含まれず、ヌクレアーゼは標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を阻害するように染色体またはエピソームを改変し、ならびに／または
（ｂ）標的細胞中のＣａｓヌクレアーゼとともに作動して標的細胞に含まれるプロトスペーサー配列を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする。

【0114】

任意に、ＤＮＡはガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの発現のための構成的プロモーターを含む。任意に、ＤＮＡは標的細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変（例えば切断）するようにガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとともに標的細胞中で操作可能なＣａｓヌクレアーゼの発現のための構成的プロモーターを含む。

【0115】

任意に、Ｃａｓ、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質、ｇＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡは、それぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＭＧ１６５５）のＣａｓ、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質、ｇＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡである。任意に、ＤＮＡはＣａｓ１およびＣａｓ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を欠いている。

【0116】

本発明はまた、所望のタンパク質またはＲＮＡをコードする（例えば抗菌剤をコードする）キャリア細菌および使用の方法に関する。実施形態では、薬剤は、キャリア細胞（これに対して薬剤は毒性でない）と標的細胞との接合によって標的細胞に移入することができ、薬剤は標的細胞に対して毒性であり、標的細胞を死滅させる。他の実施形態では、標的細胞の成長または増殖が（薬剤の非存在時における成長と比較して、例えば少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、または９０％）低減する。それぞれのキャリア細胞は、標的細菌細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない（または毒性が低い）抗菌剤をコードするエピソームＤＮＡを含む。本発明は、例えばヒト、動物、または植物に対して病原性である標的細菌を制御しまたは死滅させることに用途がある。本発明は、例えば動物（例えば家畜動物）に含まれる人畜共通標的細菌を制御しまたは死滅させることに用途がある。例えば、キャリア細胞は、ヒトまたは動物における疾患または状態を処置または防止するための医薬；動物の成長を促進するための動物に投与する成長促進剤；動物における人畜共通細菌を死滅させること、殺虫剤として家畜に投与するため；植物に施す殺虫剤、または植物用肥料に含まれ得る。

【0117】

本発明の利点は、キャリア細胞が、抗菌剤をコードするＤＮＡがその中で複製され得るプロデューサー細胞として使用され得ることである。本発明の例のもう１つの利点は、かかる複製のために必要な１つまたは複数の因子を含まない標的細胞においてＤＮＡのさらなる複製が避けられるということである。したがって、キャリア細胞の中に因子が存在し（かつ薬剤をコードするＤＮＡが複製されて標的細胞中への引き続く接合移入のための多くのコピーを提供し）、標的細胞中ではＤＮＡはさらに複製されないというスキームが想定され、これは、抗菌剤の作用を、例えば環境中、またはヒトもしくは動物の体内、または植物の中（もしくはその上）に封じ込めるために有用である。非標的細胞の望ましくない死滅を避けるため、または一般に過剰摂取および／もしくは死滅活性レジメンの投与を制御するために、封じ込めが必要な場合がある。

【0118】

第１のＤＮＡはキャリア細胞中で複製可能であり（しかし標的細胞中では複製可能でなく）、その場合には薬剤がキャリア細胞に対して毒性でなく、一方で標的細胞に対して毒性であることが重要である。ある特定の実施形態では、この選択性を達成するために、本発明は標的細胞の配列特異的死滅を使用する。この目的のため、一例では、第１のＤＮＡは標的細胞の染色体の標的配列を認識および切断するように標的細胞中で操作可能なガイドされたヌクレアーゼをコードし、それにより細胞を死滅させまたは細胞の成長もしくは増殖を低減させる。これは、その作用において識別性が低く、いくつかの種または株を死滅させることができる（例えばおそらくキャリア細胞に対してもある程度毒性がある）他の種類の毒性薬剤の使用に対して有利である。ガイドされたヌクレアーゼ（例えばＴＡＬＥＮまたはＣａｓヌクレアーゼ）を使用することにより、標的細胞ゲノム中に存在する（例えば標的細胞の染色体またはエピソームに含まれる）がキャリア細胞のゲノム中には存在しない標的配列を認識するように、これらをプログラムすることができる。

【0119】

したがって、この場合には、第１のＤＮＡの複製は、コードされた薬剤および薬剤をコードする配列の複製によって細胞を死滅させまたはその成長もしくは増殖を低減させるというリスクなしに、キャリア細胞中で自由に起こることができる。したがって、第１のＤＮＡがガイドされたヌクレアーゼをコードする例では、ガイドされたヌクレアーゼは、標的細胞のゲノム（例えば染色体）に含まれる標的核酸配列を認識および切断することができ、標的細胞はキャリア細胞の中に存在しない。

【0120】

特に有用な例は、第１のＤＮＡがガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとともに標的細胞中で操作可能なＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＣａｓ３）をコードする場合であり、ＲＮＡはＣａｓを標的配列にガイドするように操作可能であり、Ｃａｓは標的配列を改変（例えば切断）し、標的細胞が死滅しまたは標的細胞の成長もしくは増殖が阻害される。一実施形態では、第１のＤＮＡはＣａｓおよびガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする。別の実施形態では、第１のＤＮＡはガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするが、関連するＣａｓをコードしない。この実施形態では、ＲＮＡは標的細胞ゲノムによってコードされる内因性Ｃａｓとともに標的細胞中で操作可能であり、ＲＮＡはＣａｓを標的配列にガイドするように操作可能であり、Ｃａｓは標的配列を改変（例えば切断）して標的細胞が死滅しまたは標的細胞の成長もしくは増殖が阻害される。この意味で、薬剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素（例えばＣａｓヌクレアーゼ、ＣａｓｃａｄｅＣａｓ、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。したがって、本発明は、標的細胞中における標的認識によって作用するがキャリア細胞中では作用しない抗菌剤を使用することの利点を有用に認識し、これは第１のＤＮＡがキャリア細胞に対する顕著な毒性なしにキャリア細胞中で自由に複製する能力を広げるものである。

【0121】

プラスミドの例
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（またはその構成要素）等の任意の薬剤の送達の方法は、細菌の接合、したがってドナー細菌がＤＮＡをそれ自体からレシピエント細菌に移入する天然のプロセスによってよい。ドナー細菌は表面構造、したがってシリンジまたはストローのようにそれを通してＤＮＡを送達すると考えられる繊毛を巧緻に構成している。ドナーの繊毛は受容するレシピエントの表面に結合し、この事象がＤＮＡ移入のプロセスを誘発する。この接合プロセスにはプラスミドが好適であり、プラスミドは本発明の薬剤をコードするＤＮＡを含む。

【0122】

接合によるＤＮＡの移入は、「感受性のあるレシピエント」についてのみ起こり得るが、類似の型のプラスミドを含むレシピエントについて一般には起こらない。接合は繊毛の架橋を経るので、その架橋がそれ自体をレシピエントにではなくドナー細菌に付着させる可能性がある。これはプラスミドＤＮＡのそれ自体への移入の無駄なサイクルをもたらすことがある。したがってプラスミドは不適合性因子を天然にコードする。１つは、細菌自体または同じプラスミドを含む他の任意の細菌のような表面タンパク質を呈示する細菌への繊毛の結合を阻止する表面に整列したタンパク質である。さらに、プラスミドは、細菌内部のプラスミドのコピー数を緊密に規制する別の不適合性系を天然にコードする。したがって、接合事象が表面における排除を何とか免れて接合によるＤＮＡの移入を開始したとしても、プラスミドは既に現在のコピー数を維持しており、望ましくないさらなる別のコピーを受容して維持することがないので、レシピエントはそのプラスミドが確立することを阻止することになる。

【0123】

本発明の一例では、薬剤をコードするＤＮＡはプラスミドに含まれる。一実施形態では、プラスミドはプラスミド不適合性群の一員であり、標的細胞は前記群のプラスミドを含まない。任意に、本発明のプラスミドは不適合性群Ｐの一員である（すなわち、プラスミドはｉｎｃＰプラスミドである）。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａがｉｎｃＰプラスミドを含むことは極めて稀であり、したがってこのｉｎｃＰプラスミドは標的細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である場合に有用である。例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの中で以下のものが送達に使用し得る可能性のあるプラスミドの非排他的なリストである。ＩｎｃＦＩ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦＩｌｌ、ＩｎｃＦＩＶ、ＩｎｃＦＶ、ＩｎｃＭ、Ｉｎｃ９、ＩｎｃｌＯ、Ｉｎｃｌ、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＨ、ＩｎｃＩａ、ＩｎｃｌＩｃ、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩｙ、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＬ、ＩｎｃＮ、Ｉｎｃ２ｅ、ＩｎｃＯ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、および／またはＩｎｃＷ。したがって、任意に、標的細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞であり、本発明のＤＮＡはプラスミドに含まれ、プラスミドはＩｎｃＦＩ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦＩｌｌ、ＩｎｃＦＩＶ、ＩｎｃＦＶ、ＩｎｃＭ、Ｉｎｃ９、ＩｎｃｌＯ、Ｉｎｃｌ、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＨ、ＩｎｃＩａ、ＩｎｃｌＩｃ、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩｙ、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＬ、ＩｎｃＮ、Ｉｎｃ２ｅ、ＩｎｃＯ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、およびＩｎｃＷプラスミドから選択される。

【0124】

一例では、本発明のキャリア細胞は２つ以上のプラスミドを含み、それぞれのプラスミドは、抗菌剤をコードする本発明のＤＮＡを含み、前記プラスミドの第１は第１の不適合性群の一員であって標的細胞は前記第１の群のプラスミドを含まず、前記プラスミドの第２は第２の不適合性群の一員であって標的細胞は前記第２の群のプラスミドを含まない。例えば、キャリア細胞は、抗標的細胞ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはその構成要素をコードする（例えば標的細胞ゲノムの第１のプロトスペーサー配列を標的とする第１のｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする）ｉｎｃＰプラスミドを含み、キャリア細胞は抗標的細胞ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはその構成要素をコードする（例えば標的細胞ゲノムの第２のプロトスペーサー配列を標的とする第２のｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする）ｉｎｃＦ１プラスミドをさらに含み、プロトスペーサーは異なるヌクレオチド配列を含む。例えば、プロトスペーサーは、標的細胞ゲノムの異なる遺伝子に含まれる。例えば、プロトスペーサーは、標的細胞ゲノムの１つ又は複数の病原性アイランドに含まれる。任意に、標的細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である。任意に、キャリア細胞は、２、３、４、５、６、またはそれ以上の異なる型のプラスミドを含むプラスミドの群を含み、それぞれのプラスミドは標的細胞中に接合移入されることができ、プラスミドは異なる薬剤または抗菌剤の異なる構成要素をコードする。例えば、プラスミドは、標的細胞ゲノムに含まれる異なるプロトスペーサーを標的とする異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする。例えば、プラスミドの群はｎ個までの異なる型のプラスミドを含み、プラスミドはｎ個までの異なる不適合性群、例えばＩｎｃＦＩ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦＩｌｌ、ＩｎｃＦＩＶ、ＩｎｃＦＶ、ＩｎｃＭ、Ｉｎｃ９、ＩｎｃｌＯ、Ｉｎｃｌ、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＨ、ＩｎｃＩａ、ＩｎｃｌＩｃ、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩｙ、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＬ、ＩｎｃＮ、Ｉｎｃ２ｅ、ＩｎｃＯ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、およびＩｎｃＷから選択される群のメンバーである。例えば、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

【0125】

例えば、キャリア細胞は、（ｉ）標的細胞ゲノムに含まれる第１のプロトスペーサーを標的とする第１の型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするかまたは前記系の構成要素をコードする第１のプラスミド、および（ｉｉ）標的細胞ゲノムに含まれる第２のプロトスペーサーを標的とする第２の型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするかまたは前記系の構成要素をコードする第２のプラスミドを含み、第１および第２の型は異なっている。例えば、第１の型はＩ型系であり、第２の型はＩＩ型系である（例えば、第１のプラスミドは、Ｃａｓ３、Ｃａｓｃａｄｅ、ならびに第１のプロトスペーサーを改変するように標的細胞中でＣａｓ３およびＣａｓｃａｄｅとともに操作可能なｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードし、第２のプラスミドは、Ｃａｓ９および第２のプロトスペーサーを改変するように標的細胞中でＣａｓ９とともに操作可能なｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする）。一選択肢では、Ｃａｓ３およびＣａｓｃａｄｅは内因性標的細胞遺伝子によってコードされ、第１のプラスミドは第１のプロトスペーサーを改変するように標的細胞中で内因性Ｃａｓ３およびＣａｓｃａｄｅとともに操作可能なｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする。一選択肢では、Ｃａｓ９は内因性標的細胞遺伝子によってコードされ、第２のプラスミドは第２のプロトスペーサーを改変するように標的細胞中で内因性Ｃａｓ９とともに操作可能なｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする。任意に、Ｃａｓ３およびＣａｓｃａｄｅは標的細胞の内因性遺伝子によってコードされ、Ｃａｓ９は第２のプラスミドによってコードされる。

【0126】

Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素、例えばＣａｓ３またはｃｒＲＮＡもしくはｇＲＮＡ）をコードする第１のプラスミド、およびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。

【0127】

Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素、例えばＣａｓ９またはｃｒＲＮＡもしくはｇＲＮＡ）をコードする第１のプラスミド、およびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。

【0128】

Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素、例えばＣａｓ１２ａまたはｃｒＲＮＡ）をコードする第１のプラスミド、およびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態でＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１のプラスミド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（又はその構成要素）をコードする第２のプラスミドを提供する。

【0129】

Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態で、それぞれＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１および第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態で、それぞれＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１および第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態で、それぞれＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１および第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態で、それぞれＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１および第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態で、それぞれＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１および第２のプラスミドを提供する。Ｉ型およびＩＩ型の系の代わりに、本発明は代替として一実施形態で、それぞれＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（またはその構成要素）をコードする第１および第２のプラスミドを提供する。

【0130】

任意に、プラスミドは異なる不適合性群、例えばＩｎｃＦＩ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦＩｌｌ、ＩｎｃＦＩＶ、ＩｎｃＦＶ、ＩｎｃＭ、Ｉｎｃ９、ＩｎｃｌＯ、Ｉｎｃｌ、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＨ、ＩｎｃＩａ、ＩｎｃｌＩｃ、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩｙ、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＬ、ＩｎｃＮ、Ｉｎｃ２ｅ、ＩｎｃＯ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、およびＩｎｃＷから選択される群のメンバーである。本明細書における一例では、標的細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である。

【0131】

実施形態
したがって、例として、本発明は以下の実施形態を提供する。

【0132】

１．第１のエピソームＤＮＡを含むキャリア細菌細胞であって、前記ＤＮＡが標的細菌細胞中において目的のタンパク質（ＰＯＩ）または目的のＲＮＡ（ＲＯＩ）を発現させるためにＰＯＩまたはＲＯＩをコードする目的の核酸（ＮＳＩ）を含み、キャリア細胞がＰＯＩ、ＲＯＩ、または薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、
（ａ）キャリア細胞が第１のＤＮＡとは異なる第２のＤＮＡを含み、第２のＤＮＡが第１のＤＮＡの複製のために必要な第１の因子を含むかまたはコードし、
（ｂ）第１のＤＮＡが前記第１の因子を含まずまたはコードせず、第１のＤＮＡが第１の因子の非存在下では非自己複製性であるが、第２のＤＮＡによって提供される第１の因子の存在下ではキャリア細胞中で複製することができ、
（ｃ）キャリア細胞が標的細菌細胞中への第１のＤＮＡの接合移入を行うために十分な１つまたは複数の接合因子をコードする遺伝子を含む、
キャリア細菌細胞。

【0133】

第１の選択肢において、実施形態１は、
第１のエピソームＤＮＡを含むキャリア細菌細胞であって、前記ＤＮＡが標的細菌細胞中において目的のタンパク質（ＰＯＩ）または目的のＲＮＡ（ＲＯＩ）を発現させるためにＰＯＩまたはＲＯＩをコードする目的の核酸（ＮＳＩ）を含み、キャリア細胞がＰＯＩまたはＲＯＩの標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができる、キャリア細菌細胞を提供する。

【0134】

第２の選択肢において、実施形態１は、
第１のエピソームＤＮＡを含むキャリア細菌細胞であって、前記ＤＮＡが標的細菌細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードし、キャリア細胞が薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができる、キャリア細菌細胞を提供する。
一例では、前記薬剤は標的細胞ゲノムに含まれる標的核酸配列を認識および切断することができるガイドされたヌクレアーゼを含み、標的配列はキャリア細胞に含まれない。したがってこの意味で、抗菌剤は標的細菌細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない。

【0135】

例えば、
第１のエピソームＤＮＡを含むキャリア細菌細胞であって、前記ＤＮＡが標的細菌細胞に対して毒性であるが前記キャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードし、キャリア細胞が薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、前記薬剤が標的細胞ゲノムに含まれる（例えば標的細胞の染色体に含まれる）標的核酸配列を改変するように標的細胞中で操作可能であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素である、キャリア細菌細胞が提供される。

【0136】

別の例は、
第１のエピソームＤＮＡを含むキャリア細菌細胞であって、前記ＤＮＡが標的細菌細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードし、キャリア細胞が薬剤の標的細胞中における発現のためにＤＮＡを標的細胞中に接合移入することができ、
（ａ）キャリア細胞が第１のＤＮＡとは異なる第２のＤＮＡを含み、第２のＤＮＡが第１のＤＮＡの複製のために必要な第１の因子を含むかまたはコードし、
（ｂ）第１のＤＮＡが前記第１の因子を含まずまたはコードせず、第１のＤＮＡが第１の因子の非存在下では非自己複製性であるが、第２のＤＮＡによって提供される第１の因子の存在下ではキャリア細胞中で複製することができ、
（ｃ）キャリア細胞が標的細菌細胞中への第１のＤＮＡの接合移入を行うために十分な１つまたは複数の接合因子をコードする遺伝子を含む、
キャリア細菌細胞を提供する。

【0137】

一例はまた、
第１のＤＮＡを含むプラスミドを含むキャリア細菌細胞であって、前記ＤＮＡが標的核酸配列を認識し改変することができるガイドされたヌクレアーゼをコードし、キャリア細胞がヌクレアーゼの標的細胞中における発現のためにプラスミドを標的細胞中に接合移入することができ、標的配列が標的細胞の内因性染色体またはエピソームに含まれるがキャリア細胞には含まれず、ヌクレアーゼが染色体またはエピソームを改変（例えば切断）して標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を阻害することができる、キャリア細菌細胞を提供する。

【0138】

任意に、ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮである。

【0139】

任意に、ヌクレアーゼはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓヌクレアーゼである。

【0140】

一例はまた、
第１のＤＮＡを含むプラスミドを含むキャリア細菌細胞であって、前記ＤＮＡが標的核酸配列を認識し改変することができるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素をコードし、キャリア細胞が構成要素の標的細胞中における発現のためにプラスミドを標的細胞中に接合移入することができ、それにより発現された構成要素が標的細胞中における前記系の一部を形成し、標的配列が標的細胞の内因性染色体またはエピソームに含まれるがキャリア細胞には含まれず、系が染色体またはエピソームを改変（例えば切断）して標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を阻害することができる、キャリア細菌細胞を提供する。

【0141】

一態様では、構成要素は標的細胞の標的配列にハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡである。系はＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ系であってよい。

【0142】

任意に、
（ａ）キャリア細胞は第１のＤＮＡとは異なる第２のＤＮＡを含み、第２のＤＮＡは第１のＤＮＡの複製のために必要な第１の因子を含むかまたはコードし、
（ｂ）第１のＤＮＡは前記第１の因子を含まずまたはコードせず、第１のＤＮＡは第１の因子の非存在下では非自己複製性であるが、第２のＤＮＡによって提供される第１の因子の存在下ではキャリア細胞中で複製することができ、
（ｃ）キャリア細胞は標的細菌細胞中への第１のＤＮＡの接合移入を行うために十分な１つまたは複数の接合因子をコードする遺伝子を含む。

【0143】

第２のＤＮＡはキャリア細胞の染色体またはエピソーム（例えばプラスミド）に含まれてよい。本発明のいずれかの方法は、これらの実施例のいずれかのキャリア細胞を使用してよい。

【0144】

有利には、細胞はヒトまたは動物の対象（例えばニワトリ、ウシ、ブタ、魚類、または甲殻類）における標的細胞の感染を処置または防止するためである。有利には、キャリア細胞は前記対象に対してプロビオティックな、またはヒトもしくは動物（例えばニワトリ）に対してプロビオティックな種の細胞である。例えば、キャリア細胞はプロビオティックなＥ．ｃｏｌｉ細胞である。例えば、キャリア細胞はプロビオティックなＢａｃｉｌｌｕｓ細胞である。一例では、標的細胞は前記対象に対して病原性の、またはヒトもしくは動物（例えばニワトリ）に対して病原性の種の細胞である。有利には、第１のＤＮＡは、標的細胞中でそれぞれの標的核酸配列にハイブリダイズすることができる１つもしくは複数のガイドＲＮＡまたは１つもしくは複数のｃｒＲＮＡをコードし、標的配列は標的細胞の内因性染色体および／または内因性エピソームに含まれる。例えば、第１のＤＮＡはそれぞれの標的配列にハイブリダイズする２、３、４、５、６、７、７、９、または１０個の（または１０を超える）異なるｇＲＮＡまたは異なるｃｒＲＮＡをコードし、標的配列は互いに異なる。例えば、第１のＤＮＡによって３つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって２つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって３つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって４つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって３つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって５つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって６つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって７つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって８つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって９つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって１０個の異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって１１個の異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって１２個の異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。例えば、第１のＤＮＡによって１３個の異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがコードされる。一例では、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である（例えば対象はニワトリである）。一例では、標的細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。一例では、標的細胞はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ細胞である（例えば対象はニワトリである）。一例では、標的細胞はＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ細胞である（例えば対象は魚類または甲殻類、例えばナマズ、またはエビ、またはクルマエビである）。一例では、標的細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。

【0145】

本明細書における一選択肢では、キャリア細胞および標的細胞は古細菌細胞である。本明細書における一選択肢では、キャリア細胞および標的細胞は酵母細胞であり、「接合」はむしろ酵母の「交配」を指すと読むべきであり、例えば第２のＤＮＡはキャリア酵母細胞の染色体に含まれる。

【0146】

好ましい例では、ＮＯＩは標的細菌細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードする。一例では、ＰＯＩは抗生剤、抗体、抗体鎖、または抗体可変ドメインである。一例では、ＲＯＩは関連するＣａｓ（例えば標的細胞の染色体またはエピソームに含まれるプロトスペーサー配列を標的として切断するＣａｓヌクレアーゼ）とともに標的細胞中で操作可能なガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡである。一例では、ＲＮＡは、標的細胞の内因性標的核酸配列にハイブリダイズしてその転写および／または翻訳を沈黙させることができるｓｉＲＮＡである。

【0147】

キャリア細胞は、第１のＤＮＡとは異なる染色体または第２のエピソームＤＮＡを含む。したがって、例えば第２のＤＮＡはキャリア細胞の染色体に含まれる。別の例では、第２のＤＮＡはキャリア細胞のプラスミドに含まれる。

【0148】

２．実施形態１のキャリア細胞であって、
（ｄ）第１のＤＮＡが標的細菌細胞中への第１のＤＮＡの接合移入に必要な構成要素を欠き、
（ｅ）キャリア細胞が前記構成要素を含み、前記構成要素がキャリア細胞に含まれる第２のＤＮＡまたは第３のＤＮＡに含まれまたはそれらによってコードされる、キャリア細胞。

【0149】

第３のＤＮＡは染色体またはエピソーム（例えばプラスミド）に含まれてよい。実施形態２以下に明示的に引用した場合、文脈により明らかになるように、構成要素は接合移入に必要な構成要素を意味している。

【0150】

３．実施形態２のキャリア細胞であって、前記構成要素がＭｐｆまたはＤｔｒモジュールに含まれる、キャリア細胞。
例えば、モジュールはＲＫ２、ＲＰ４、またはＲ６Ｋ ｔｒａモジュールである。任意に、前記構成要素はＭｐｆ（交配対形成）モジュール、例えばＲＫ２もしくはＲＰ４ ｔｒａ１モジュールまたはそのホモログに含まれる。任意に、前記構成要素はＤｔｒ（ＤＮＡ移入複製）モジュール、例えばＲＫ２もしくはＲＰ４ ｔｒａ２モジュールまたはそのホモログに含まれる。

【0151】

４．実施形態２のキャリア細胞であって、前記構成要素がＭｐｆ（例えばｔｒａ１）またはＤｔｒ（例えばｔｒａ２）モジュールのオペロンによってコードされる、キャリア細胞。
例えば、モジュールはＲＫ２、ＲＰ４、またはＲ６Ｋ ｔｒａモジュールである。任意に、モジュールはＭｐｆ（交配対形成）モジュール、例えばＲＫ２もしくはＲＰ４ ｔｒａ１モジュールまたはそのホモログである。任意に、モジュールはＤｔｒ（ＤＮＡ移入複製）モジュール、例えばＲＫ２もしくはＲＰ４ ｔｒａ２モジュールまたはそのホモログである。

【0152】

ＲＰ４またはＲＫ２のＭｐｆオペロンは、遺伝子ｔｒａＦとともにｔｒａ２オペロン（ｔｒｂ遺伝子ｔｒｂＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬを含む）である。遺伝子ｔｒａＦは（ｔｒａＪＸＩＨＧとともに）ｔｒａ１オペロン中のＲＫ２またはＲＰ４に含まれる。したがって、一実施形態では、前記構成要素はｔｒｂＢ、ｔｒｂＣ、ｔｒｂＤ、ｔｒｂＥ、ｔｒｂＦ、ｔｒｂＧ、ｔｒｂＨ、ｔｒｂＩ、ｔｒｂＪ、ｔｒｂＫ、ｔｒｂＬ、およびｔｒａＦから選択される遺伝子である。一実施形態では、第１のＤＮＡはＲＰ４ ｔｒｂＢ、ｔｒｂＣ、ｔｒｂＤ、ｔｒｂＥ、ｔｒｂＦ、ｔｒｂＧ、ｔｒｂＨ、ｔｒｂＩ、ｔｒｂＪ、ｔｒｂＫ、ｔｒｂＬ、およびｔｒａＦまたはそれらのホモログから選択される２つ以上の遺伝子を欠いている。一実施形態では、第１のＤＮＡはＲＫ２ ｔｒｂＢ、ｔｒｂＣ、ｔｒｂＤ、ｔｒｂＥ、ｔｒｂＦ、ｔｒｂＧ、ｔｒｂＨ、ｔｒｂＩ、ｔｒｂＪ、ｔｒｂＫ、ｔｒｂＬ、およびｔｒａＦまたはそれらのホモログから選択される２つ以上の遺伝子を欠いている。一例では、前記構成要素はｔｒａＫ、ｔｒａＬ、またはｔｒａＭ遺伝子である。一実施形態では、第１のＤＮＡはＲＰ４ ｔｒａＫ、ｔｒａＬ、およびｔｒａＭまたはそれらのホモログから選択される２つ以上の遺伝子を欠いている。一実施形態では、第１のＤＮＡはＲＫ２ ｔｒａＫ、ｔｒａＬ、およびｔｒａＭまたはそれらのホモログから選択される２つ以上の遺伝子を欠いている。任意に、これらの実施形態では、第１のＤＮＡはＲＰ４またはＲＫ２型のプラスミドに含まれる。

【0153】

Ｒ６Ｋ Ｍｐｆは、ＤｔｒモジュールのｃｌｐＸ１をも含むｓｌｔＸ１ｔｉｖＢ１Ｂ２Ｂ３－４Ｂ５Ｂ６Ｂ７Ｂ８Ｂ９Ｂ１０Ｂ１１オペロンによってコードされる。したがって、一実施形態では、前記構成要素はＲＫ６ ｓｌｔＸ１ｔｉｖＢ１Ｂ２Ｂ３－４Ｂ５Ｂ６Ｂ７Ｂ８Ｂ９Ｂ１０Ｂ１１オペロンに含まれる遺伝子である。一実施形態では、前記構成要素はＲＫ６ ＤｔｒモジュールのｃｌｐＸ１である。一実施形態では、前記構成要素はｃｌｐＸ１およびｄｔｒＸ１ｒｌｘＸ１から選択される遺伝子である。一実施形態では、前記構成要素はＲＫ６ ｃｌｐＸ１およびｄｔｒＸ１ｒｌｘＸ１またはそれらのホモログから選択される遺伝子である。任意に、これらの実施形態では、第１のＤＮＡはＲＫ６型のプラスミドに含まれる。

【0154】

前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、キャリア細胞の染色体および／またはキャリア細胞のエピソーム（第１のＤＮＡを含むエピソーム以外）が発現可能なｔｒａ１および／もしくはｔｒａ２モジュールまたはそれらのホモログを含む、キャリア細胞。
本明細書におけるいずれのエピソームも、プラスミドであってよい。

【0155】

５．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、キャリア細胞の染色体および／またはキャリア細胞のエピソーム（第１のＤＮＡを含むエピソーム以外）がｔｒａ１および／もしくはｔｒａ２モジュールの発現可能なオペロンまたはそれらのホモログを含む、キャリア細胞。

【0156】

６．実施形態３から６のいずれか一のキャリア細胞であって、前記構成要素がｔｒａ１構成要素である、キャリア細胞。

【0157】

７．実施形態３から６のいずれか一のキャリア細胞であって、前記構成要素がｔｒａ２構成要素である、キャリア細胞。

【0158】

８．実施形態２から７のいずれか一のキャリア細胞であって、キャリア細胞染色体が第１の因子をコードし、前記構成要素を含む、キャリア細胞。

【0159】

９．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、第１の因子がｒｅｐタンパク質であり、任意に、前記タンパク質がｐｉｒもしくはｔｒｆＡまたはそれらのホモログによってコードされる、キャリア細胞。

【0160】

１０．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、第１のＤＮＡがＲＫ２またはＲ６Ｋプラスミドに含まれる、キャリア細胞。

【0161】

１１．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、第１のＤＮＡがＲＫ２もしくはＲ６ＫプラスミドのｏｒｉＶまたはそれらのホモログを含む、キャリア細胞。

【0162】

１２．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、第１のＤＮＡがＲＫ２もしくはＲ６ＫプラスミドのｏｒｉＴまたはそれらのホモログを含む、キャリア細胞。

【0163】

１３．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、第１のＤＮＡがプラスミドに含まれる、キャリア細胞。

【0164】

１４．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、第２のＤＮＡがプラスミドに含まれるか、またはキャリア細胞の染色体に含まれる、キャリア細胞。

【0165】

１５．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、前記薬剤が標的細胞に含まれるプロトスペーサー配列を切断するように標的細胞中で操作可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成要素を含み、例えばプロトスペーサー配列が細胞染色体に含まれる、キャリア細胞。

【0166】

一実施形態では、本明細書における切断することは標的細胞を死滅させる。別の実施形態では、切断することは標的細胞の成長または増殖を阻害する。

【0167】

１６．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、前記薬剤が標的細胞に含まれるプロトスペーサー配列を切断するようにＣａｓヌクレアーゼとともに標的細胞中で操作可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、例えばプロトスペーサー配列が細胞染色体に含まれる、キャリア細胞。

【0168】

一例では、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であり、プロトスペーサーはｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｓｉｃＰ、ｍａｒｔ、またはｓｏｐＢ遺伝子に含まれる。一例では、プロトスペーサーはＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｓｉｃＰ、ｓｓｅＦ、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｓｉｃＰ、ｍａｒｔ、またはｓｏｐＢ遺伝子のホモログまたはオルソログである遺伝子に含まれる。

【0169】

１７．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、第１のＤＮＡが産生物をコードする遺伝子を含み、前記産生物が産生物を欠く環境にある場合のキャリア細胞の生存または増殖に必須であり、キャリア細胞の染色体が産生物をコードする発現可能な遺伝子を含まず、任意に、第１のＤＮＡが産生物をコードするキャリア細胞に含まれる唯一のエピソームＤＮＡである、キャリア細胞。

【0170】

１８．実施形態１７のキャリア細胞であって、前記遺伝子がａｒｏＡ、ａｒｇＨ、ｈｉｓＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｍｅｔＢ、ｐｒｏＣ、ｔｈｒＣ、ｐｈｅＡ、ｔｙｒＡ、ｔｒｐＣ、およびｐｆｌＡ遺伝子から選択され、前記遺伝子が抗毒素遺伝子であり、任意に、第１のＤＮＡが関連する毒素をコードする、キャリア細胞。

【0171】

１９．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、Ｅ ｃｏｌｉ（例えばＮｉｓｓｌｅ、Ｆ１８、またはＳ１７ Ｅ ｃｏｌｉ株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えばＢ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞である、キャリア細胞。

【0172】

任意に、キャリア細胞はヒト、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ウシ、魚類（例えばナマズまたはサケ）、または甲殻類（例えばエビまたはロブスター）の片利共生細菌株（例えば片利共生Ｅ．ｃｏｌｉ株）の細胞である。

【0173】

２０．前記いずれかの実施形態のキャリア細胞であって、医療用途のためのヒトまたは動物の対象の微生物群への投与のためである、キャリア細胞。

【0174】

例えば、医療用途は、本明細書で開示した疾患を処置または防止するためである。例えば、医療用途は、本明細書で開示した状態を処置または防止するためである。

【0175】

２１．実施形態２０のキャリアであって、前記医療用途が前記対象細胞によって媒介される疾患または状態の処置または防止のためである、キャリア。

【0176】

２２．動物の成長または重量を増進させるために動物に投与するための、実施形態１から２０のいずれか一のキャリア。

【0177】

選択肢では、投与はヒトの成長または重量の増進のためのヒトへのものである。任意に、増進することは医学的治療ではない。任意に、増進することは医学的治療である。

【0178】

２３．実施形態２０から２２のいずれか一のキャリアであって、前記使用が対象の微生物群（例えば腸微生物群）への複数のキャリア細胞の投与を含み、微生物群が標的細胞を含み、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のために標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる、キャリア。

【0179】

２４．標的細菌細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対して毒性でない抗菌剤をコードするＤＮＡであって、第１のＤＮＡが複製起点を含むが第１のＤＮＡの複製に必要な第１の因子を含まずまたはコードせず、第１のＤＮＡが移入起点を含むが第１のＤＮＡを標的細菌細胞中に接合移入するために必要な構成要素を欠き、前記構成要素が存在する場合にＤＮＡが標的細胞中に接合移入されることができる、ＤＮＡ。

【0180】

したがって、ＤＮＡがキャリア細胞中に存在する場合には、ＤＮＡは標的細胞中に接合移入されることができる。

【0181】

２５．実施形態２４のＤＮＡであって、実施形態１から２３のいずれか一で引用したＤＮＡによるＤＮＡ。

【0182】

２６．実施形態２４または２５のＤＮＡであって、前記細胞が実施形態１から２３のいずれか一で引用した細胞によるＤＮＡ。

【0183】

２７．動物対象（例えばニワトリ）の成長または重量を増進させる方法であって、前記方法が対象の微生物群への実施形態１から２３のいずれか一による複数のキャリア細胞の投与を含み、前記微生物群が標的細胞を含み、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞）を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる、方法。

【0184】

選択肢では、投与はヒトの成長または重量の増進のためのヒトへのものである。任意に、増進することは医学的治療ではない。任意に、増進することは医学的治療である。

【0185】

２８．植物（例えばトマト植物）の成長または重量を増進させる方法であって、前記方法が植物の微生物群への実施形態１から２３のいずれか一による複数のキャリア細胞の投与を含み、前記微生物群が標的細胞を含み、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それにより植物中の標的細胞（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞）を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる、方法。

【0186】

植物は本明細書で開示した任意の植物であってよい。例えば、本発明の任意の構成または実施形態における本明細書の植物は、トマト植物、ジャガイモ植物、コムギ植物、トウモロコシ植物、メイズ植物、リンゴ樹、マメ産生植物、エンドウマメ植物、ビート根植物、核果植物、オオムギ植物、ホップ植物、および草から選択される。例えば、植物は樹木、例えばヤシ、トチノキ、マツ、オーク、またはハードウッド樹である。例えば、植物はイチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、レッドカラント、キーウィ、バナナ、リンゴ、アプリコット、アボガド、チェリー、オレンジ、クレメンタイン、ミカン、グレープフルーツ、プラス、デーツ、イチジク、ライム、レモン、メロン、マンゴー、ナシ、オリーブ、またはブドウから選択される果実を産生する植物である。任意に、植物は双子葉植物である。任意に、植物は顕花植物である。任意に、植物は単子葉植物である。

【0187】

本明細書におけるいずれの構成、実施形態、または実施例においても、標的細菌は（例えば植物に含まれる）Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ細菌である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅは単子葉植物と双子葉植物の両方で世界的に病気を惹起する一般的な植物関連細菌である。一例では、標的細菌はＰ．ｓ．ｐｖ．ａｃｅｒｉｓ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｐｔａｔａ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｄｙｓｏｘｙｌｉｓ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｌａｐｓａ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐａｎｉｃｉ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐａｐｕｌａｎｓ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐｉｓｉ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ、およびＰ．ｓ．ｐｖ．ｍｏｒｓｐｒｕｎｏｒｕｍから選択される病原型のＰ ｓｙｒｉｎｇａｅ細菌である。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｃｅｒｉｓはカエデＡｃｅｒ種を攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｃｔｉｎｉｄｉａｅはキーウィ果実Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｅｓｃｕｌｉはトチノキＡｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍを攻撃し、潰瘍病を惹起する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｐｔａｔａはビートＢｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓはコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｄｙｓｏｘｙｌｉｓコエコエ樹Ｄｙｓｏｘｙｌｕｍ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｅを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｊａｐｏｎｉｃａはオオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｌａｐｓａはコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐａｎｉｃｉはキビ草種を攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐａｐｕｌａｎｓはクラブアップルＭａｌｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ種を攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａはマメのカサ枯れ病を惹起する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐｉｓｉはエンドウマメＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅはＳｙｒｉｎｇａ、Ｐｒｕｎｕｓ、およびＰｈａｓｅｏｌｕｓ種を攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａはダイズを攻撃し、ダイズの斑点細菌病を惹起する。

【0188】

一例では、標的細菌は、直前のパラグラフにおいて箇条書きで引用した血液型亜型から選択されるＰ ｓｙｒｉｎｇａｅであり、細菌はその箇条書きでも述べた植物に含まれる。

【0189】

一例では、重量は乾燥重量である。例えば、本方法は（例えば前記投与の１または２週以内に）乾燥重量を増加させるためである。任意に、増加は、全ての植物が同じ環境条件下に保たれ、キャリア細胞の投与がなかった場合の同じ種または株の対照植物と比較して、少なくとも５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０％の増加である。例えば、かかる増加は、キャリア細胞の最初の投与の後、１、２、３、４、５、６、または８週以内である。一例では、本方法は植物、例えばトマト植物の葉および／または果実の乾燥重量を増加させるためである。

【0190】

一例では、重量は湿潤重量である。例えば、本方法は（例えば前記投与の１または２週以内に）湿潤重量を増加させるためである。任意に、増加は、全ての植物が同じ環境条件下に保たれ、キャリア細胞の投与がなかった場合の同じ種または株の対照植物と比較して、少なくとも５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０％の増加である。例えば、かかる増加は、キャリア細胞の最初の投与の後、１、２、３、４、５、６、または８週以内である。一例では、本方法は植物、例えばトマト植物の葉および／または果実の乾燥重量を増加させるためである。

【0191】

２９．前記微生物群が植物の葉、幹、根、または茎に含まれる、実施形態２８の方法。

【0192】

一例では、本明細書のいずれの構成または実施形態においても、標的細菌（または標的細胞）は、植物の微生物群に含まれる。一例では、微生物群は葉に含まれる。一例では、微生物群は木質部に含まれる。一例では、微生物群は師部に含まれる。一例では、微生物群は根に含まれる。一例では、微生物群は塊茎に含まれる。一例では、微生物群は球根に含まれる。一例では、微生物群は種子に含まれる。一例では、微生物群は外果皮〔exocarp〕、外果皮〔epicarp〕、中果皮、または内果皮に含まれる。一例では、微生物群は果実、例えば単果、複合果、または多花果に含まれる。一例では、微生物群は種子または胚、例えば種皮、子葉、双葉、または幼根に含まれる。一例では、微生物群は花に含まれ、例えば花柄、萼片、花弁、雄しべ、花糸、葯、または雌しべに含まれる。一例では、微生物群は根、例えば主根系または髭根系に含まれる。一例では、微生物群は葉に含まれ、例えば葉身、葉柄、または托葉に含まれる。一例では、微生物群は茎に含まれ、例えば樹皮、表皮、師部、形成層、木質部、または髄に含まれる。

【0193】

３０．対象に含まれまたは表面上に含まれるバイオフィルムを低減させる方法であって、前記バイオフィルムが標的細胞（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞）を含み、前記方法がバイオフィルムへの実施形態１から２３のいずれか一による複数のキャリア細胞の投与を含み、第１のＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それによりバイオフィルム中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる、方法。

【0194】

一例では、「バイオフィルムを低減させること」は、バイオフィルムの被覆面積を低減させることを含む。一例では、「バイオフィルムを低減させること」は、バイオフィルムの増殖を低減させることを含む。一例では、「バイオフィルムを低減させること」は、バイオフィルムの永続性を低減させることを含む。一例では、「バイオフィルムを低減させること」は、バイオフィルムの拡散を低減させること（例えば対象の中または上における、例えば対象を含む環境への拡散）を含む。

【0195】

３１．対象がヒトまたは動物である、実施形態３０の方法。

【0196】

例えば、バイオフィルムは対象の肺に含まれ、例えば標的細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞である。これは、対象が肺炎または嚢胞性線維症等の肺の疾患または状態に罹患している場合に有用であり得る。

【0197】

例えば、バイオフィルムは、本明細書で開示した動物またはヒトの臓器に含まれる。例えば、バイオフィルムは本明細書で開示したヒトまたは動物の微生物群に含まれる。

【0198】

３２．前記対象が植物（例えば本明細書で開示した任意の植物）である、実施形態３０の方法。

【0199】

任意に、本実施形態では、標的細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ細胞である。

【0200】

３３．前記バイオフィルムが植物の葉、幹、根、または茎に含まれる、実施形態３１または３２の方法。

【0201】

一例では、本明細書のいずれの構成または実施形態においても、標的細菌（または標的細胞）は植物のバイオフィルムに含まれる。一例では、バイオフィルムは葉に含まれる。一例では、バイオフィルムは木質部に含まれる。一例では、バイオフィルムは師部に含まれる。一例では、バイオフィルムは根に含まれる。一例では、バイオフィルムは塊茎に含まれる。一例では、バイオフィルムは球根に含まれる。一例では、バイオフィルムは種子に含まれる。一例では、バイオフィルムは外果皮〔exocarp〕、外果皮〔epicarp〕、中果皮、または内果皮に含まれる。一例では、バイオフィルムは果実、例えば単果、複合果、または多花果に含まれる。一例では、バイオフィルムは種子または胚、例えば種皮、子葉、双葉、または幼根に含まれる。一例では、バイオフィルムは花に含まれ、例えば花柄、萼片、花弁、雄しべ、花糸、葯、または雌しべに含まれる。一例では、バイオフィルムは根、例えば主根系または髭根系に含まれる。一例では、バイオフィルムは葉に含まれ、例えば葉身、葉柄、または托葉に含まれる。一例では、バイオフィルムは茎に含まれ、例えば樹皮、表皮、師部、形成層、木質部、または髄に含まれる。

【0202】

３４．前記表面がｅｘ ｖｉｖｏの表面、例えば家庭用または工業用の装置または容器に含まれる表面である、実施形態３０から３３（例えば３０）のいずれか一の方法。

【0203】

３５．第１のＤＮＡを複製して前記ＤＮＡの複数のコピーを産生する方法であって、前記方法が実施形態１から２３のいずれか一による複数のキャリア細菌細胞を培養することを含み、第１のＤＮＡが細胞中で複製される、方法。

【0204】

任意に、本方法は前記培養の後で第１のＤＮＡを単離することをさらに含む。当業者であれば、使用できる細胞を培養するための手法および条件は熟知している。

【0205】

３６．（ａ）培養後にキャリア細胞の試料を得ること、
（ｂ）キャリア細胞の試料を複数の標的細菌細胞と接触させてキャリア細胞と標的細胞とを接合させること、および
（ｃ）接合移入によって第１のＤＮＡのコピーをキャリア細胞から標的細胞に移入し、抗菌剤が標的細胞中で提供され、標的細胞が死滅しまたは標的細胞の成長もしくは増殖が低減される、実施形態３５の方法であって、
（ｄ）第１のＤＮＡが標的細胞中で複製可能でない、方法。

【0206】

例えば、第１のＤＮＡは標的細胞中で実質的に複製可能でない（例えば１０、５、４、３、２、または１％未満の複製）。

【0207】

第１のＤＮＡは、標的細胞中にそれをコードする第１の因子または配列が存在しないために、標的細胞中で複製可能でない（または実質的に複製可能でない）。

【0208】

３７．複数の標的細菌細胞を死滅させまたはその成長もしくは増殖を低減させる方法であって、
（ａ）実施形態１から２３のいずれか一によるまたは実施形態３５の方法によって得られるキャリア細胞の試料を得ること、
（ｂ）キャリア細胞の試料を複数の標的細菌細胞と接触させてキャリア細胞と標的細胞とを接合させること、および
（ｃ）接合移入によって第１のＤＮＡのコピーをキャリア細胞から標的細胞に移入し、抗菌剤が標的細胞中で提供され、標的細胞が死滅しまたは標的細胞の成長もしくは増殖が低減されること
を含み、
（ｄ）第１のＤＮＡが標的細胞中で複製可能でない（または実質的に複製可能でない）、方法。

【0209】

３８．標的細胞がバイオフィルム、例えば本明細書で開示したバイオフィルムに含まれる、実施形態３６または３７の方法。

【0210】

３９．抗菌剤の作用を環境中に封じ込める方法であって、前記薬剤が標的細菌細胞に対して毒性であり、前記方法が実施形態３７または３８の方法を行うことを含み、前記薬剤が実施形態で引用した前記薬剤である、方法。

【0211】

４０．環境がヒトまたは動物の対象に含まれ、前記標的細胞が対象のバイオフィルムに含まれ、前記方法がキャリア細胞の試料を対象のバイオフィルムに投与することを含み、前記キャリア細胞がステップ（ｂ）において標的細胞と接触させられ、前記方法が対象中の標的細胞によって媒介される疾患または状態を処置または防止するための封じ込められた方法である、実施形態３９の方法。

【0212】

４１．標的細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌である、前記いずれかの実施形態のキャリア細胞、ＤＮＡ、または方法。

【0213】

４２．標的細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ細菌である、前記いずれかの実施形態のキャリア細胞、ＤＮＡ、または方法。

【0214】

例えば、標的細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ、血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｒｃｈｏｗ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｈａｄａｒ、およびＢｉｎｚａからなる群から選択される。

【0215】

４３．標的細菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰ ｓｙｒｉｎｇａｅまたはＰ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細菌である、実施形態１から４１のいずれか一のキャリア細胞、ＤＮＡ、または方法。

【0216】

４４．標的細菌がＥ．ｃｏｌｉ細菌である、実施形態１から４１のいずれか一のキャリア細胞または方法。

【0217】

任意に、標的細菌は腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１５７：Ｈ７、または志賀毒素産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）である。一例では、標的細菌は
・志賀毒素産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）（ＳＴＥＣはベロサイトトキシン産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＶＴＥＣ）とも称される）、
・腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）（この病原型は食中毒に関連するニュースで最も一般的に聞かれる病原型である）、
・エンテロトキシン産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、
・腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、
・腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）、
・腸管侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、および
・散在付着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）
から選択される。

【0218】

腸管出血性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）血清型Ｏ１５７：Ｈ７は、世界的な出血性下痢および溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）の突発に関与するヒト病原体である。従来の抗微生物剤はＥＨＥＣにおいてＳＯＳ応答を誘発し、これがＥＨＥＣ感染に伴う罹患率および死亡率の多くに関与する強力な志賀毒素の放出を促進する。ウシはＥＨＥＣの天然の保有宿主であり、ＥＨＥＣのアウトブレイクのほぼ７５％は汚染されたウシ由来製品の消費に関連している。ＥＨＥＣはヒトで疾患を惹起するが、成長した反芻動物では無症状である。Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）感染の特徴には、腹部の痙攣および出血性下痢、ならびに致命的な合併症である溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）が含まれる。現在、ＥＨＥＣ感染の処置に対するニーズがある（Ｇｏｌｄｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｔｔｅｌｈｅｉｍ，２０１２）。従来の抗生剤の使用は、志賀毒素媒介細胞傷害性を悪化させる。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによって行われた疫学研究では、ＥＨＥＣ腸炎のための抗生剤で処置された患者は、ＨＵＳを発症するリスクが高い（Ｓｌｕｔｓｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。さらなる研究は、ＥＨＥＣ感染において抗生剤が禁忌であることを支持しており、ＥＨＥＣに伴う出血性腸炎のために抗生剤治療を受けた小児は、ＨＵＳを発症する危険が増加した（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｚｉｍｍｅｒｈａｃｋｌ，２０００、Ｓａｆｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｔａｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。従来の抗生剤は、染色体内で一体化されたラムダ形プロファージゲノムの中でコードされるｓｔｘ遺伝子の複製および発現を増進することによって、志賀毒素の産生を促進する。本発明のいくつかの構成のアプローチは、ヌクレアーゼの切断に依拠している。ｓｔｘの誘導は、ＥＨＥＣ細胞のエンベロープのファージ媒介溶解をも促進し、環境への志賀毒素の放出および散布を可能にする（Ｋａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｍａｔｓｕｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。したがって、有利には、本発明のこれらの構成は、ヒトおよび動物の対象においてＥＨＥＣを処置するための代替の手段を提供する。以下、ヌクレアーゼの作用によって産生される抗ＥＨＥＣ作用の（従来の抗生剤の作用とは反対の）速度および持続についての驚くべき結果とともにこれを例示する。

【0219】

一例では、対象（例えばヒトまたは動物）は、溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）に罹患しているか、そのリスクにあり、例えば対象はＥ ｃｏｌｉ感染、例えばＥＨＥＣ Ｅ ｃｏｌｉ感染に罹患している。

【0220】

４５．実施形態１から２３のいずれか一による複数のキャリア細胞を含む医薬組成物、家畜成長促進用組成物、土壌改良剤、除草剤、植物用肥料、食品または食材滅菌用組成物、歯科用組成物、個人衛生用組成物、または消毒用組成物（例えば家庭用または工業用）。

【0221】

本明細書において、キャリア細胞は、例えばヒトまたは動物の対象に投与するためのプロビオティックな細胞である。例えば、キャリア細胞はヒトまたは動物の対象のマイクロバイオーム（例えば腸または血液のマイクロバイオーム）において片利共生的であり、キャリアは対象への投与のためである。一例では、キャリア細胞は細菌細胞である（また任意に標的細胞は細菌細胞である）。一例では、キャリア細胞は古細菌細胞である（また任意に標的細胞は古細菌細胞である）。

【0222】

任意に、キャリア細胞はグラム陽性細菌細胞であり、標的細胞はグラム陽性細菌細胞である。

【0223】

任意に、キャリア細胞はグラム陽性細菌細胞であり、標的細胞はグラム陰性細菌細胞である。

【0224】

任意に、キャリア細胞はグラム陰性細菌細胞であり、標的細胞はグラム陽性細菌細胞である。

【0225】

任意に、キャリア細胞はグラム陰性細菌細胞であり、標的細胞はグラム陰性細菌細胞である。

【0226】

任意に、キャリア細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ細菌細胞であり、標的細胞はグラム陽性細菌細胞である。

【0227】

任意に、キャリア細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ細菌細胞であり、標的細胞はグラム陰性細菌細胞である。

【0228】

任意に、キャリア細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ細菌細胞であり、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌細胞である。

【0229】

任意に、キャリア細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ細菌であり、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞である。

【0230】

任意に、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌細胞である。

【0231】

任意に、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はグラム陽性細菌細胞である。

【0232】

任意に、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はグラム陰性細菌細胞である。

【0233】

任意に、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌細胞である。

【0234】

任意に、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞である。

【0235】

任意に、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌細胞である。

【0236】

本明細書においてＢａｃｉｌｌｕｓ細胞は任意にＢ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である。

【0237】

任意に、キャリア細胞はヒトまたは動物の対象への投与のためのプロビオティックまたは片利共生Ｅ ｃｏｌｉ細菌細胞である。任意に、キャリア細胞はヒトまたは動物の対象への投与のためのプロビオティックまたは片利共生Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌細胞である。

【0238】

本明細書では、任意に、第１のＤＮＡはプラスミド、例えば閉環状ＤＮＡに含まれる。

【0239】

一実施形態では、一例において第１のＤＮＡはｄｓＤＮＡである。一実施形態では、一例において第１のＤＮＡはｓｓＤＮＡである。

【0240】

代替の構成では、第１のＤＮＡはその代わりに第１のＲＮＡである。

【0241】

任意に、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞（例えばここでキャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細胞である）、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｒｃｈｏｗ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｈａｄａｒ、またはＢｉｎｚａである。

【0242】

例えば、標的細菌はＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｐ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；Ｅ ｃｏｌｉ、Ｋ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｃ ｊｕｊｅｎｉ；Ｈ ｐｙｌｏｒｉ；Ａ ｂａｕｍａｎｉｉ；Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；Ｓ ａｕｒｅｕｓ；Ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ；またはＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される。

【0243】

一例では、標的細胞はヒトに院内感染を惹起する種の細胞である。

【0244】

任意に、標的細胞は動物（例えば家禽動物（例えばニワトリ）、ブタ、ウシ、魚類（例えばナマズまたはサケ）、または甲殻類（例えばエビまたはロブスター））のマイクロバイオームに含まれる。任意に、マイクロバイオームは腸マイクロバイオームである。例えば、標的細胞はニワトリの腸のバイオフィルムに含まれるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である。例えば、標的細胞はｅｘ ｖｉｖｏでニワトリの腸のバイオフィルム試料に含まれるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である。

【0245】

一実施形態では、第１のＤＮＡは細菌のｏｒｉＶおよび／またはｏｒｉＴを含む。一実施形態では、第１のＤＮＡはプラスミドに含まれ、プラスミドはｏｒｉＶおよび／またはｏｒｉＴを含む。

【0246】

第１の因子はタンパク質またはＲＮＡであってよい。例えば、第１の因子はｐｉｒまたはｔｒｆＡである。一例では、第１の因子はその複製のために第１のＤＮＡに含まれるｏｒｉＶとともに操作可能である。

【0247】

一実施形態では、第１のＤＮＡはプラスミドに含まれ、プラスミドはｏｒｉＶを含み、プラスミドの複製を開始するようにｏｒｉＶとともに操作可能ないずれの複製タンパク質（例えばｐｉｒまたはｔｒｆＡ）をもコードしない。

【0248】

一実施形態では、第１のＤＮＡは標的細菌細胞中に第１のＤＮＡを接合移入するために必要な構成要素を欠いている。任意に、構成要素はタンパク質である。任意に、構成要素はＲＮＡである。任意に、構成要素はｔｒａ１構成要素である。任意に、構成要素はｔｒａ２構成要素である。一例では、キャリア細胞は前記構成要素を含み、構成要素はキャリア細胞中のキャリア細胞染色体、第２のＤＮＡ、または第３のＤＮＡに含まれまたはそれらによってコードされる。好ましくは、構成要素はキャリア細胞染色体に含まれまたはそれによってコードされる。

【0249】

任意に、接合移入に必要な構成要素はＲＰ４プラスミド構成要素、例えばＲＰ４ｔｒａモジュール（例えばｔｒａ１またはｔｒａ２モジュール）の構成要素である。

【0250】

任意に、接合移入に必要な構成要素はＲＫ２プラスミド構成要素、例えばＲＫ２ｔｒａモジュール（例えばｔｒａ１またはｔｒａ２モジュール）の構成要素である。

【0251】

任意に、接合移入に必要な構成要素はＲ６Ｋプラスミド構成要素、例えばＲ６Ｋｔｒａモジュール（例えばｔｒａ１またはｔｒａ２モジュール）の構成要素である。

【0252】

任意に、第１のＤＮＡは抗生剤耐性マーカー遺伝子および／またはプラスミド依存系遺伝子を含まないプラスミドに含まれる。実施例のセクションで説明したように、これはｔｒｆＡ（またはこの構成要素が第１のＤＮＡを含むプラスミドによってコードされていない場合に接合のために必要な他の構成要素）を提供する同一のＩｎｃＰプラスミドが標的細胞中に存在する稀な場合には有利であり、両方のプラスミドは利用可能なｔｒｆＡ（またはその他の構成要素）について競合して１つのプラスミドの損失をもたらし、それによりいずれの子孫の標的細胞からも急速に失われる。

【0253】

任意に、第１のＤＮＡを含むプラスミドは、Ｉ型制限酵素を阻害する抗制限遺伝子として、標的細胞の制限酵素（例えばＩ型制限酵素）を阻害するための産生物をコードする抗制限遺伝子をさらに含む（例えば、抗制限遺伝子産生物は、Ｔ７のｏｃｒ、ＲＫ２のｋｌｃＡ、ａｒｄまたはａｒｄＢである）。

【0254】

さらにまたはその代わりに、プラスミドはＩＶ型分泌系の必須の構成要素をコードする遺伝子を含み、キャリア細胞の染色体は分泌系の残りの部分をコードする遺伝子を含み、必須の構成要素はキャリア細胞から標的細胞へのプラスミドの接合移入のために必要である。例えば、必須の構成要素をコードするｔｒａ１およびｔｒａ２遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＫ２型プラスミドである場合に）染色体はＲＫ２ｔｒａ１のｔｒａＫＬＭ、ｔｒａＪＸＩＨＧＦ遺伝子の残り全て、およびＲＫ２ｔｒａ２のｔｒｂＢＣＥＦＧＨＪＬ遺伝子の残り全てを含む。代替の例では、必須の構成要素をコードする遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＫ６型プラスミドである場合に）染色体はＲＫ２ｔｒａ１のｔｒａＫＬＭ、ｔｒａＪＸＩＨＧＦ遺伝子のＲＫ６ホモログの残り全て、およびＲＫ２ｔｒａ２のｔｒｂＢＣＥＦＧＨＪＬ遺伝子のＲＫ６ホモログの残り全てを含む。一代替例では、必須の構成要素をコードする遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＰ４型プラスミドである場合に）染色体はＲＫ２ｔｒａ１のｔｒａＫＬＭ、ｔｒａＪＸＩＨＧＦ遺伝子のＲＰ４ホモログの残り全て、およびＲＫ２ｔｒａ２のｔｒｂＢＣＥＦＧＨＪＬ遺伝子のＲＰ４ホモログの残り全てを含む。

【0255】

例えば、必須の構成要素をコードするｔｒａ１またはｔｒａ２遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＫ２型プラスミドである場合に）染色体はｔｒａＦからｔｒａＭまでのＲＫ２プラスミドのＤＮＡ断片の残り全て、およびｔｒｂＢからｔｒＫまでのＲＫ２プラスミドのＤＮＡ断片の残り全てを含む。例えば、必須の構成要素をコードするｔｒａ１またはｔｒａ２遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＫ２型プラスミドである場合に）染色体はｔｒａＦからｔｒａＭまでのＲＫ２プラスミド遺伝子の残り全部、およびｔｒｂＢからｔｒＫまでのＲＫ２プラスミド遺伝子の残り全てを含む。例えば、染色体は（以下の順序、５’から３’、または３’から５’で）以下のＲＫ２ｔｒａ１遺伝子：ｔｒａＦＧＨＩＸＪＫＬＭ、またはｔｒａＫＬＭ、またはｔｒａＪＸＩＨＧＦを含む。例えば、染色体は（以下の順序、５’から３’、または３’から５’で）以下のＲＫ２ｔｒａ２遺伝子：ｔｒｂＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬまたはｔｒｂＢＣＥＦＧＨＪＬを含む。

【0256】

例えば、必須の構成要素をコードする遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＫ６型プラスミドである場合に）染色体はＲＫ２ｔｒａＦのホモログからＲＫ２ｔｒａＭのホモログまでのＲＫ６プラスミドのＤＮＡ断片の残り全て、およびＲＫ２ｔｒｂＢのホモログからＲＫ２ｔｒＫのホモログまでのＲＫ６プラスミドのＤＮＡ断片の残り全てを含む。例えば、必須の構成要素をコードする遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＫ６型プラスミドである場合に）染色体はＲＫ２ｔｒａＦのホモログからＲＫ２ｔｒａＭのホモログまでのＲＫ６プラスミド遺伝子の残り全て、およびＲＫ２ｔｒｂＢのホモログからＲＫ２ｔｒＫのホモログまでのＲＫ６プラスミド遺伝子の残り全てを含む。例えば、染色体は（以下の順序、５’から３’、または３’から５’で）以下のＲＫ２ｔｒａ１遺伝子：ｔｒａＦＧＨＩＸＪＫＬＭ、またはｔｒａＫＬＭ、またはｔｒａＪＸＩＨＧＦのＲＫ６ホモログを含む。例えば、染色体は（以下の順序、５’から３’、または３’から５’で）以下のＲＫ２ｔｒａ２遺伝子：ｔｒｂＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬまたはｔｒｂＢＣＥＦＧＨＪＬのＲＫ６ホモログを含む。

【0257】

例えば、必須の構成要素をコードする遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＰ４型プラスミドである場合に）染色体はＲＫ２ｔｒａＦのホモログからＲＫ２ｔｒａＭのホモログまでのＲＰ４プラスミドのＤＮＡ断片の残り全て、およびＲＫ２ｔｒｂＢのホモログからＲＫ２ｔｒＫのホモログまでのＲＰ４プラスミドのＤＮＡ断片の残り全てを含む。例えば、必須の構成要素をコードする遺伝子を例外として、（好ましくはプラスミドがＲＰ４型プラスミドである場合に）染色体はＲＫ２ｔｒａＦのホモログからＲＫ２ｔｒａＭのホモログまでのＲＰ４プラスミド遺伝子の残り全て、およびＲＫ２ｔｒｂＢのホモログからＲＫ２ｔｒＫのホモログまでのＲＰ４プラスミド遺伝子の残り全てを含む。例えば、染色体は（以下の順序、５’から３’、または３’から５’で）以下のＲＫ２ｔｒａ１遺伝子：ｔｒａＦＧＨＩＸＪＫＬＭ、またはｔｒａＫＬＭ、またはｔｒａＪＸＩＨＧＦのＲＰ４ホモログを含む。例えば、染色体は（以下の順序、５’から３’、または３’から５’で）以下のＲＫ２ｔｒａ２遺伝子：ｔｒｂＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬまたはｔｒｂＢＣＥＦＧＨＪＬのＲＰ４ホモログを含む。

【0258】

好ましくは、第２のＤＮＡまたは第２のＤＮＡを含む染色体はｏｒｉＴを欠いている。好ましくは、第３のＤＮＡまたは第３のＤＮＡを含む染色体はｏｒｉＴを欠いている。

【0259】

例えば、ｏｒｉＴは第１のＤＮＡ（またはこれを含むプラスミド）にのみ含まれ、キャリア細胞中の他のいずれのＤＮＡにも含まれない。したがって、移入は第１のＤＮＡまたはそのプラスミドのみに限定されている。

【0260】

全ての実施形態および構成における第１のＤＮＡは、好ましくは暴走複製プラスミドに含まれなくてよい。天然に存在するプラスミドは、特徴的な濃度（本明細書で特定のプラスミドの「コピー数」と称する）で宿主細胞中に存在する。制御エレメントを破壊する変異は、プラスミドコピー数の増加によって現れる過複製表現型（「コピーアップ」表現型）を惹起する。コピー数変異の極端な場合には、プラスミドの複製はコピー制御機構の喪失のために完全に抑制不能になる。これは「暴走プラスミド複製」または単に「暴走複製」と称され、かかる暴走複製に関与するプラスミドは「暴走複製プラスミド」である。

【0261】

一例では、本発明は複数の本発明のキャリア細胞を含む組成物に関する（例えば第１のＤＮＡのコピーがそれぞれのプラスミドに含まれる）。任意に、キャリア細胞の全ては同一の前記第１および第２のＤＮＡを含む。任意に、複数はキャリア細胞の第１の亜集団（第１の細胞）およびキャリア細胞の第２の亜集団（第２の細胞）を含み、第１の細胞は同一の第１のＤＮＡを含み、第２の細胞は同一の第１のＤＮＡを含む（これらは第１の細胞の第１のＤＮＡとは異なる）。例えば、前者のＤＮＡは他のＤＮＡに含まれるＮＳＩとは異なるＮＳＩを含む。例えば、第１のＤＮＡは第１のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、第２のＤＮＡは第２のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、第１のガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡは第１の標的細胞中の第１のプロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができ、第２のガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡは第２の標的細胞中の第２のプロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができ、プロトスペーサーは異なる。任意に、第１の標的細胞は第２の標的細胞とは異なる。任意に、第１の標的細胞は第２の標的細胞と同じ種または株である。あるいは、第１の標的細胞は第２の標的細胞の種または株とは異なる種または株である（このようにして、例えば異なる種または株の複数の標的細胞を標的化して死滅させるために、ヒトまたは動物または植物に投与するためのキャリア細胞のカクテルが提供される）。

【0262】

一例では、該または各第１のＤＮＡは複数の（例えば第１および第２の）ＮＳＩを含み、第１のＮＳＩは第２のＮＳＩとは異なる（例えば、これらは異なるタンパク質またはＲＮＡ、例えば異なるガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする）。一例では、該または各第１のＤＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なる種類のＮＳＩを含む。一例では、該または各第１のＤＮＡは２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なるガイドＲＮＡをコードするＮＳＩを含む。一例では、該または各第１のＤＮＡは２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なるｃｒＲＮＡをコードするＮＳＩを含む。一例では、該または各第１のＤＮＡは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なるガイドＲＮＡをコードするＮＳＩを含む。一例では、該または各第１のＤＮＡは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なるｃｒＲＮＡをコードするＮＳＩを含む。

【0263】

任意に、組成物は液体（例えば水性液体または水）に含まれ、組成物は１×１０^３～１×１０^１０（例えば、１×１０^４～１×１０^１０、１×１０^４～１×１０^９ 、１×１０^４～１×１０^８、１×１０^４～１×１０^７、１×１０^３～１×１０^１０、１×１０^３～１×１０^９、１×１０^３～１×１０^８、１×１０^３～１×１０^７、１×１０^５～１×１０^１０ 、１×１０^５～１×１０^９、１×１０^５～１×１０^８、１×１０^５～１×１０^７、１×１０^６～１×１０^１０ 、１×１０^６～１×１０^９、１×１０^６～１×１０^８、または１×１０^６～１×１０^７）ｃｆｕ／ｍｌの量でキャリア細胞を含む。例えば、液体は例えばヒトまたは動物の消費のための飲料である。例えば、飲料は家畜用飲料、例えば家禽用飲料（すなわちニワトリ等の家禽による消費のための飲料）である。

【0264】

一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための食品（例えば補助食品）組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための痩身用組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための成長促進組成物である。一例では、組成物はヒトによる消費のためのボディビル組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のためのプロビオティック組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための殺生物性組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための殺虫性組成物である。一例では、組成物は動物による消費のための人畜共通感染症制御用組成物である。

【0265】

一例では、組成物はキャリア細胞に加えてビタミン類を含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えてビタミンＡ、Ｂ（例えばＢ１２）、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および／またはＫを含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えて脂質を含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えて炭水化物を含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えてタンパク質および／またはアミノ酸を含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えてミネラルを含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えて金属イオン（例えばＭｇ^２＋、Ｃｕ^２＋、および／またはＺｎ^２＋）を含む。一例では、組成物はナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、銅イオン、亜鉛イオン、および／またはモリブデンイオンを含む。

【0266】

一例では、組成物は植物用肥料組成物である。一例では、組成物は除草剤である。一例では、組成物は植物に適用するための殺虫剤組成物である。

【0267】

いずれの実施形態または実施例でも、適用可能な場合には、植物は例えば作物である。植物は、例えばコムギである。植物は、例えばトウモロコシである。植物は、例えばメイズである。植物は、例えば果樹である。植物は、例えば野菜である。植物は、例えばトマト植物である。植物は、例えばジャガイモ植物である。植物は、例えば草植物である。植物は、例えば顕花植物である。植物は、例えば樹木である。植物は、例えば灌木である。

【0268】

一例では、組成物は環境用途向けであり、環境は屋外環境（例えば野外または水路または貯水池への用途）である。

【0269】

一例では、組成物は食品または食品成分（例えばヒトまたは動物の消費のための）に含まれる。一例では、組成物は飲料または飲料成分（例えばヒトまたは動物の消費のための）に含まれる。

【0270】

一例では、標的細胞はヒトバイオフィルム細胞であり、例えばバイオフィルムは腸、皮膚、肺、眼、鼻、耳、胃腸管（ＧＩ管）、胃、毛髪、腎、尿道、気管支、口腔、口、肝、心臓、肛門、直腸、膀胱、大腸、小腸、陰茎、膣、または陰嚢のバイオフィルムである。一例では、標的細胞は動物のバイオフィルム細胞であり、例えばバイオフィルムは腸、皮膚、肺、眼、鼻、耳、胃腸管（ＧＩ管）、盲腸、空腸、回腸、結腸、胃、毛髪、羽毛、鱗、腎、尿道、気管支、口腔、口、肝、脾、心臓、肛門、直腸、膀胱、大腸、小腸、陰茎、膣、または陰嚢のバイオフィルムである。例えば、バイオフィルムは鳥（例えばニワトリ）盲腸のバイオフィルムである。例えば、バイオフィルムは鳥（例えばニワトリ）の胃腸管（ＧＩ管）、盲腸、空腸、回腸、結腸、または胃のバイオフィルムである。

【0271】

一例では、本明細書におけるいずれの方法もｅｘ ｖｉｖｏである。一例では、本明細書における方法はｉｎ ｖｉｖｏである。一例では、本明細書における方法はｉｎ ｖｉｔｒｏである。一例では、本明細書における方法は環境中、例えば家庭内（例えば屋内）、工業的（例えば工場内）、または農業的環境（例えば野外）で行われる。一例では、本明細書における方法は容器の中もしくはその上、または表面上で行われる。

【0272】

一例では、ＮＳＩ（またはそのＲＮＡ産生物）は、標的細胞に含まれる標的細胞の染色体またはエピソームと組み換えて、染色体またはエピソームを改変することができる。任意に、これは、染色体またはエピソームが（例えばＣａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼ等のガイドされたヌクレアーゼを使用して所定の部位で）切断され、同時にもしくは逐次的に第１のＤＮＡがキャリア細胞との接合によって標的細胞に導入され、ＮＳＩまたはその配列が切断された部位またはその近傍で染色体またはエピソームに挿入される方法によって、行われる。

【0273】

一例では、第１のＤＮＡは標的細胞中でプロトスペーサー切断が成し遂げられるように操作可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成要素を含む（例えばプロトスペーサーは、ＮＳＩによってコードされるｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡと標的細胞中でハイブリダイズすることができる１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～１００、１２～１５、または１２～２０の連続したヌクレオチドを含む）。

【0274】

例えば、系はＩ、ＩＩ，ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。

【0275】

一例では、ＮＳＩはＣａｓ９（および任意に第２の異なるＣａｓ、例えばＣａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１０）をコードする。一例では、ＮＳＩはＣａｓ３（および任意に第２の異なるＣａｓ、例えばＣａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１０）をコードする。一例では、ＮＳＩはＣａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、およびＣａｓ１０から選択されるＣａｓをコードする。さらにまたはその代わりに、第１のＤＮＡ（例えばＮＳＩ）は、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡをコードする。例えば、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡは第１のＣａｓに関連している（すなわち、標的細胞中でこれとともに操作可能である）。

【0276】

一例では、本明細書においてＣａｓはＣａｓ９である。一例では、本明細書においてＣａｓはＣａｓ３である。Ｃａｓは、標的細菌によってコードされるＣａｓと同一であってよい。

【0277】

一実施形態では、標的細菌中におけるＮＳＩまたはそれによってコードされるタンパク質もしくはＲＮＡの存在は、標的細胞の死滅または標的細胞の成長もしくは増殖の下方制御を媒介する。一実施形態では、標的細菌中におけるＮＳＩまたはそれによってコードされるタンパク質もしくはＲＮＡの存在は、標的細胞のゲノムによってコードされる１つまたは複数のＲＮＡもしくはタンパク質の発現のスイッチオフまたはその下方制御を媒介する。

【0278】

一実施形態では、標的細菌中におけるＮＳＩまたはそれによってコードされるタンパク質もしくはＲＮＡの存在は、標的細胞の成長もしくは増殖の上方制御を媒介する。一実施形態では、標的細菌中におけるＮＳＩまたはそれによってコードされるタンパク質もしくはＲＮＡの存在は、標的細胞のゲノムによってコードされる１つまたは複数のＲＮＡもしくはタンパク質の発現のスイッチオンまたはその上方制御を媒介する。

【0279】

一実施形態では、ＮＳＩは標的細菌に対して毒性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素をコードする。

【0280】

一実施形態では、第１のＤＮＡはプラスミドまたはシャトルベクターに含まれる。一実施形態では、第２のＤＮＡはベクター（例えばプラスミドまたはシャトルベクター）、ヘルパーファージ（例えばヘルパーファージミド）に含まれるか、または宿主細菌細胞のゲノムに一体化される。

【0281】

任意に、標的細胞は第１のＤＮＡ、例えば標的細胞中で機能性であって標的細胞に対して毒性である外因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素を含む第１のＤＮＡがその中に移入される前には、機能性内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を欠いている。一実施形態は、複数の本発明のキャリア細胞を含む抗菌性組成物を提供し、それぞれの標的細胞は任意にこのパラグラフにより、医療用途のためにヒトまたは動物の対象に投与するためである。

【0282】

一例では、本発明の組成物は除草剤、殺虫剤、殺昆虫剤、植物用肥料、または洗浄剤である。

【0283】

任意に、本明細書における標的細菌は対象のマイクロバイオーム、例えば腸のマイクロバイオームに含まれる。あるいは、マイクロバイオームは皮膚、頭皮、毛髪、眼、耳、口腔、咽喉、肺、血液、直腸、肛門、膣、陰嚢、陰茎、鼻、または舌のマイクロバイオームである。

【0284】

一例では、対象（例えばヒトまたは動物）は、キャリア細胞の投与と同時にまたは逐次的に、医薬がさらに投与される。一例では、医薬は抗生剤、抗体、免疫チェックポイント阻害剤（例えば抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ４抗体）、養子細胞療法（例えばＣＡＲ－Ｔ療法）、またはワクチンである。

【0285】

一実施形態では、ＮＳＩはガイドされたヌクレアーゼ、例えばＣａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼをコードする。したがって、毒性薬剤はガイドされたヌクレアーゼ、例えばＣａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含んでよい。任意に、ＮＳＩは標的細胞の染色体を切断することができる制限ヌクレアーゼをコードする。

【0286】

任意に、組成物は、ヒトもしくは動物の対象において実施される医療における使用のための医薬組成物である。

【0287】

一例では、動物は家畜または伴侶ペット動物（例えばウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、またはウサギ）である。一例では、動物は昆虫（そのライフサイクルの任意のステージ、例えば卵、幼虫、またはさなぎにある昆虫）である。一例では、動物は原生動物である。一例では、動物は頭足動物である。

【0288】

任意に、組成物は除草剤、殺虫剤、食品もしくは飲料の加工剤、食品もしくは飲料の添加剤、石油化学もしくは燃料の加工剤、水精製剤、化粧品添加剤、洗剤添加剤、または環境（例えば土壌）添加剤または洗浄剤である。

【0289】

本発明はまた、標的細菌細胞またはそれぞれが前記第１のＤＮＡを含む複数の標的細菌細胞を提供する。

【0290】

例えば、キャリア細菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（例えばＬ ｒｅｕｔｅｒｉまたはＬ ｌａｃｔｉｓ）、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えばＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌である。有用には、キャリアは第１のＤＮＡを周囲の環境から保護することができる。キャリアの使用は、キャリアが対象における酸性の胃またはその他の厳しい環境から第１のＤＮＡを保護することができる場合に、経口投与またはその他の経路に有用であり得る。さらに、キャリアは飲料、例えばプロビオティック飲料、例えば適合化させたＹａｋｕｌｔ（商標）、Ａｃｔｉｍｅｌ（商標）、Ｋｅｖｉｔａ（商標）、Ａｃｔｉｖａ（商標）、Ｊａｒｒｏｗ（商標）、またはヒトの消費用の同様の飲料に配合することができる。

【0291】

任意に、キャリア細胞または組成物は、薬剤またはＮＳＩの発現産生物を使用して標的細菌を死滅させることを含む医療用途のためのヒトまたは動物への投与のためのものであり、標的細菌は対象における疾患または状態を媒介する。一例では、対象がヒトである場合には、対象は胚ではない。一例では、キャリア細胞は対象においてプロビオティックである。

【0292】

本発明はまた、環境中の標的細菌細胞を死滅させる方法を提供し、任意に本方法はヒトまたは動物の身体では実施されず、本方法は本発明のキャリア細胞または組成物に環境を曝露してＮＳＩの産生物を標的細胞中で発現させることを含み、標的細菌は前記産生物の存在下で死滅する。例えば、産生物はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはその構成要素、例えば本明細書で開示した系または構成要素をコードする。したがって、本系は標的細胞の染色体プロトスペーサー配列を認識および切断することができ、それにより標的細胞が死滅する。任意に、死滅した標的細胞はさらなるステップで単離される。

【0293】

本発明はまた、標的細菌を含むヒトまたは動物の対象における疾患または状態の処置のための、標的細菌を死滅させる抗菌剤の製造における本発明の組成物または細胞の使用を提供する。

【0294】

任意に、環境は土壌のマイクロバイオーム；植物、植物の部分（例えば葉、果実、野菜、または花）もしくは植物製品（例えばパルプ）；水；水路；流体、食材もしくはその成分；飲料もしくはその成分；医療用デバイス；化粧品；洗剤；血液；体液；医療用装置；産業用装置；オイルリグ；石油化学加工；保存もしくは輸送の装置；ビヒクルまたは容器である。

【0295】

任意に、環境はｅｘ ｖｉｖｏ体液（例えば尿、血液、血液製剤、汗、涙、痰、または唾）、体固形物（例えば糞便）、または組成物を投与されたヒトもしくは動物の対象の組織である。

【0296】

任意に、環境はｉｎ ｖｉｖｏの体液（例えば尿、血液、血液製剤、汗、涙、痰、または唾液）、体固形物（例えば糞便）、または組成物を投与されたヒトもしくは動物の対象の組織である。

【0297】

一実施形態では、第１のＤＮＡはファージミドまたはクローニングベクター（例えばシャトルベクター、例えばｐＵＣベクター）に含まれる。

【0298】

一実施形態では、第２のＤＮＡは細菌キャリア細胞の染色体に含まれる。

【0299】

任意に、毒性薬剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成要素、例えばＩ型Ｃａｓｃａｄｅの１つまたは複数の構成要素（例えばＣａｓＡ）をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0300】

任意に、毒性薬剤はガイドされたヌクレアーゼ、例えばＣａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む。

【0301】

一例では、キャリア細胞または組成物は、医療用容器、例えばシリンジ、バイアル、ＩＶバッグ、吸入器、点眼器、またはネブライザーに含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、無菌の容器に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、医療用に適合した容器に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、発酵容器、例えば金属、ガラス、またはプラスチックの容器に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、農業用装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、食品の製造用または加工用の装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、園芸用装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、飼育用装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、石油化学の回収用または加工用の装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、蒸留用装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、（例えば少なくとも５０、１００、１０００、１００００、または１０００００リットルの容積を有する）細胞培養用容器に含まれる。さらにまたはその代わりに、標的細胞はこれらの装置等のいずれかに含まれる。

【0302】

一例では、キャリア細胞または組成物は、医薬に、例えばヒトまたは動物の対象への経口、ＩＶ、皮下、鼻内、眼内、経膣、局所、経直腸、または吸入による投与によって医薬を投与するための指示書を含む説明書またはパッケージラベルと組み合わせて、含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、経口医薬製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、鼻内または経眼医薬製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、個人衛生用組成物（例えばシャンプー、石鹸、または脱臭剤）または化粧用製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、洗剤製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、例えば医療用または工業用のデバイスまたは装置を洗浄するための洗浄用製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、食材、食材成分、または食材加工剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、飲料、飲料成分、または飲料加工剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、医療用バンデージ、繊維製品、プラスター、またはスワブに含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、除草剤または殺虫剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、殺昆虫剤に含まれる。

【0303】

一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を含む（例えばＳ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、またはＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣａｓ３をコードするヌクレオチド配列を含む（例えばＥ ｃｏｌｉ Ｃａｓ３、Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ Ｃａｓ３、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃａｓ３）。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣｐｆをコードするヌクレオチド配列を含む。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を含む。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣａｓＹをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0304】

一例では、それぞれのキャリア細胞は、標的細菌中で操作可能なプロモーターを含むヌクレオチド配列（ＮＳＩ）からの目的のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素またはタンパク質をコードする。

【0305】

任意に、標的細菌はグラム陰性細菌（例えばらせん菌またはビブリオ）である。任意に、標的細菌はグラム陽性細菌である。任意に、標的細菌はマイコプラズマ、クラミジア、スピロヘータ、またはマイコバクテリウム細菌である。任意に、標的細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えばｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。任意に、標的細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えばａｕｒｅｕｓ、例えばＭＲＳＡ）である。任意に、標的細菌はＥ．ｃｏｌｉ（例えばＯ１５７：Ｈ７）であり、例えばＣａｓはベクターによってコードされ、または内因性標的細胞Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ３）活性は脱抑制されている。任意に、標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばｓｙｒｉｎｇａｅまたはａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。任意に、標的細菌はＶｉｂｒｏ（例えばｃｈｏｌｅｒａｅ（例えばＯ１３９）またはｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）である。任意に、標的細菌はＮｅｉｓｓｅｒｉａ（例えばｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。任意に、標的細菌はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えばｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）である。任意に、標的細菌はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えばｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）である。任意に、標的細菌はＳｈｉｇｅｌｌａ（例えばｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）である。任意に、標的細菌はＢｒｕｃｅｌｌａ（例えばａｂｏｒｔｕｓ）である。任意に、標的細菌はＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ宿主である。任意に、標的細菌はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓである。任意に、標的細菌はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。任意に、標的細菌はＥｒｗｉｎｉａである。任意に、標的細菌はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えばｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）である。任意に、標的細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ（例えばｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。任意に、標的細菌はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えばｊｅｊｕｎｉ）である。任意に、標的細菌はＹｅｒｓｉｎｉａ（例えばｐｅｓｔｉｓ）である。任意に、標的細菌はＢｏｒｅｌｉａ（例えばｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）である。任意に、標的細菌はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えばｐｙｌｏｒｉ）である。任意に、標的細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えばｄｉｆｉｃｉｌｅまたはｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）である。任意に、標的細菌はＥｒｌｉｃｈｉａ（例えばｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）である。任意に、標的細菌はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばｔｙｐｈｉまたはｅｎｔｅｒｉｃａ、例えば血清型ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えばＤＴ１０４）である。任意に、標的細菌はＣｈｌａｍｙｄｉａ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。任意に、標的細菌はＰａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ宿主である。任意に、標的細菌はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）である。任意に、標的細菌はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。任意に、標的細菌はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えばｆａｅｃａｌｉｓまたはｆａｅｃｉｍ、例えばリネゾリド耐性）である。任意に、標的細菌はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（例えばｂａｕｍａｎｎｉｉ、例えば多剤耐性）である。

【0306】

標的細胞のさらなる例は、以下の通りである。
１．任意に、標的細菌は、例えばメチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、キヌプリスチン、ダルフォプリスチン、およびテイコプラニンから選択される抗生剤に耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ細胞である。
２．任意に、標的細菌は、例えばセファロスポリン類（例えばセフタジジム）、カルバペネム類（例えばイミペネムまたはメロペネム）、フルオロキノロン、アミノグリコシド類（例えばゲンタマイシンまたはトブラマイシン）およびコリスチンから選択される抗生剤に耐性のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞である。
３．任意に、標的細菌は、例えばカルバペネムに耐性のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞である。
４．任意に、標的細菌は、例えばエリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ－ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン、およびペニシリンから選択される抗生剤に耐性のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えばｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはｐｙｏｇｅｎｅｓ）細胞である。
５．任意に、標的細菌は、例えばセフトリアキソン、アジスロマイシン、およびシプロフロキサシンから選択される抗生剤に耐性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば血清型Ｔｙｐｈｉ）細胞である。
６．任意に、標的細菌は、例えばシプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生剤に耐性のＳｈｉｇｅｌｌａ細胞である。
７．任意に、標的細菌は、例えばイソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＭＰ）、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン、およびカプレオマイシン、およびアジスロマイシンへの耐性から選択される抗生剤に耐性のｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞である。
８．任意に、標的細菌は、例えばバンコマイシンに耐性のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞である。
９．任意に、標的細菌は、例えばセファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生剤に耐性のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である。
１０．任意に、標的細菌は、例えばトリメトプリム、イトロフラントイン、セファレキシン、およびアモキシシリンから選択される抗生剤に耐性のＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
１１．任意に、標的細菌は、例えばフルオロキノロン抗生剤およびカルバペネムから選択される抗生剤に耐性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えばｄｉｆｉｃｉｌｅ）細胞である。
１２．任意に、標的細菌は、例えばセフィキシム（例えば経口セファロスポリン）、セフトリアキソン（注射用セファロスポリン）、アジスロマイシン、およびテトラサイクリンから選択される抗生剤に耐性のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａ細胞である。
１３．任意に、標的細菌は、例えばベータ－ラクタム、メロペネム、およびカルバペネムから選択される抗生剤に耐性のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ〔Acinetoebacter〕 ｂａｕｍａｎｎｉｉ細胞である。
１４．任意に、標的細菌は例えばシプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生剤に耐性のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えばｊｅｊｕｎｉ）細胞である。
１５．任意に、標的細胞はベータ（β）－ラクタマーゼを産生する（例えばＥＳＢＬ産生Ｅ ｃｏｌｉまたはＥＳＢＬ産生Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）。
１６．任意に、標的細胞は、例１～１４のいずれか１つに引用した抗生剤に耐性の細菌細胞である。

【0307】

一例では、標的細胞はＳｈｉｇｅｌｌａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒから選択される種の細胞である。

【0308】

任意に、組成物は、それぞれまたは組み合わせて、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒのうち２つ以上から選択される種の標的細胞中に第１のＤＮＡを接合移入することができるキャリア細胞を含む。

【0309】

一例では、キャリア細胞の成長または増殖の低減は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、または９５％である。任意に、組成物またはキャリア細胞は、標的細胞に対して毒性である抗生剤と同時にまたは逐次的に投与される。例えば、抗生剤は本明細書で開示した任意の抗生剤であってよい。

【0310】

任意に、ＮＳＩの発現は、標的細胞中で操作可能な誘起性プロモーターの制御下にある。任意に、ＮＳＩの発現は、標的細胞中で操作可能な構造性プロモーターの制御下にある。

【0311】

実施形態では、（例えばプラスミドに含まれる）第１のＤＮＡは、スクリーニング可能なまたは選択可能なマーカー遺伝子を含む。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、抗生剤耐性遺伝子である。

【0312】

キャリア細菌は、表５に現れる種または属から選択される種または属の細菌であってよい。例えば、種は温血動物（例えば家畜脊椎動物）で見出される。例えば、種はヒトで見出される。例えば、種は植物で見出される。好ましくは、ヒトまたは動物の体内の非無菌部分（例えば皮膚、消化管、尿生殖器領域、口、鼻道、咽喉および上気道、耳、ならびに眼）にコロニーを形成する非病原性細菌がキャリア細胞として利用され、一例ではヒトまたは動物の体内のかかる部分の標的細胞細菌感染と闘うために本発明の方法が使用される。別の実施形態では、感染は全身性感染である。特に好ましいキャリア細菌種の例には、それだけに限らないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの非病原性株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆ１８、Ｓ１７、およびＥ． ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの種々の種（例えばＬ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｚｅａｅ、およびＬ．ｇａｓｓｅｒｉ）、またはその他の皮膚またはＧＩにコロニーを形成する非病原性もしくはプロビオティックな細菌、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ、および死滅するように運命付けられているが、それでもプラスミドを移入することができる無核様体細胞である細菌性ミニ細胞が含まれる（例えばＡｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５７；３２１－３２６，１９７０、Ｆｒａｚｅｒ ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６９：１－８４，１９７５、Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩへの米国特許第４，９６８，６１９号を参照）。一部の実施形態では、標的レシピエント細胞は、ヒト、動物、または植物に、例えば皮膚の上または消化管、尿生殖器領域、口、鼻道、咽喉および上気道、眼、および耳の中に含まれる病原性細菌である。ターゲティングおよび撲滅のために特に興味あるものは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびその他の種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性株である。一例では、標的細胞の属または種は、表５に列挙した任意の属または種である。

【0313】

本発明は、米国特許第６，２７１，３５９号、第６，２６１，８４２号、第６，２２１，５８２号、第６，１５３，３８１号、第６，１０６，８５４号、および第５，６２７，２７５号に記載されたものを含むが、それだけに限らない幅広い設定または環境、例えば治療用、農業用、またはその他の設定において用途を見出す。その他の用途も本明細書で論じており、さらに他の用途も当業者には容易に明らかになる。

【0314】

第１のＤＮＡを含む数多い種類のプラスミドが、本発明における使用のために好適である。この観点において、当業者であれば単一のキャリア細菌株が（例えばそれらがコードする抗菌剤が異なる）２種以上のかかるプラスミドを含み得ることを認識することになる。さらに、別の例では、それぞれが１つまたは複数のかかるプラスミドを含む２つ以上の異なるキャリア細菌株を、マルチターゲット効果のために、すなわち２つ以上の異なる標的種または株を死滅させるために、または標的細胞の同じ種または株の細胞を死滅させるために、組み合わせてよい。

【0315】

本発明は、ヒトの処置および種々の獣医学、農業、園芸、および食品加工への応用に用途がある。ヒトおよび獣医学への用途については、保護のために目標とする細胞集団または組織に応じて、本発明のキャリア細菌の以下の投与様式、したがって局所、経口、経鼻、経眼、経耳、経肺（例えば吸入器を介する）、眼科、直腸、尿生殖器、皮下、腹腔内、および静脈内が意図される。細菌は、処置される患者のために選択される投与の様式に適した送達ビヒクル中で、医薬組成物として供給され得る。本明細書で使用する用語「患者」または「対象」は、ヒトまたは動物を指す（動物は例えば特定のドナー株の臨床的有効性のモデルとして特に有用であり、または飼育された動物もしくは家畜動物である）。商業的に関連のある動物はニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ナマズ、サケ、タラ、ニシン、ロブスター、エビ、クルマエビ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ヤギ、ガチョウ、またはウサギである。

【0316】

例えば、キャリア細菌を胃腸管または鼻道に送達するために、好ましい投与様式は経口摂取もしくは経鼻エアロゾル、または（単独の、または対象の飼料もしくは食料、および／または飲料、例えば飲水に組み込んだ）給餌であってよい。これに関して、キャリア細胞は家畜（または飼育された動物もしくはコンパニオン動物）の食料に含まれてよく、例えばキャリア細菌は家畜用の食料添加物に含まれてよい。あるいは、添加物は家畜用の飲料（例えば飲水）添加物である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ等のプロビオティック細菌は、細菌細胞とマンニトール等の固相支持体との凍結乾燥された混合物を含むゲルカプセルとして販売されていることに注目されたい。ゲルカプセルが液体とともに摂取された場合には、凍結乾燥された細胞が再水和され、生存してコロニー形成性の細菌になる。したがって、同様にして、本発明のキャリア細菌細胞は、例えば食品または飲料に散布するためのゲルカプセルまたはバルクで、粉末化され凍結乾燥された製剤として供給することができる。再水和され生存する細菌細胞は、次いで上部および／または下部の胃腸管系にわたる部位に生息し、および／またはコロニーを形成し、その後、標的細菌と接触することになる。

【0317】

局所的適用のため、キャリア細菌は、罹患した皮膚表面上に塗布する軟膏またはクリームとして製剤化することができる。軟膏またはクリームの製剤は、坐剤等の他の標準的な製剤とともに、直腸または膣での送達にも適している。局所、膣、および直腸への投与のための適切な製剤は、医化学者には周知である。

【0318】

本発明は、種々の細菌感染または細菌に関連する望ましくない状態を処置するための局所または経粘膜投与に特に有用である。これらの使用のいくつかの代表的な例には、（１）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．によって惹起される結膜炎、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって惹起される角膜潰瘍、（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって惹起される外耳炎、（３）多くのグラム陽性球菌およびグラム陰性桿菌によって惹起される慢性副鼻腔炎、または気管支の一般的な汚染除去、（４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに伴う嚢胞性線維症、（５）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．によって惹起される腸炎（例えば胃潰瘍を処置または防止するため）、（６）例えば予防手段としての手術または非手術としての開放創傷、（７）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはその他のグラム陰性病原体を除去するための熱傷、（８）例えばＰｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｃｎｅｓによって惹起される座瘡、（９）例えばメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＲＡ）によって惹起される鼻または皮膚の感染、（１０）例えばグラム陽性嫌気性菌によって惹起される体臭（すなわち、脱臭剤におけるキャリア細胞の使用）、（１１）例えばＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓまたはその他の嫌気性細菌に伴う細菌性膣炎、ならびに（１２）種々の生命体によって惹起される歯肉炎および／または齲蝕の処置が含まれる。

【0319】

一例では、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ細胞であり、ヒトにおいて処置すべき疾患または状態は子宮管の感染または呼吸器関連の感染、例えば肺炎である。

【0320】

他の実施形態では、本発明のキャリア細胞は、望ましくない標的細菌の除去または減衰のための表面の処置における応用、例えば標的細菌を含むかかる表面または環境を処置する方法における使用に用途があり、本方法は表面または環境を本発明のキャリア細菌と接触させてキャリアから標的細菌に本発明の第１のＤＮＡを接合移入させ、抗菌剤に標的細胞を死滅させることを含む。例えば、表面における細菌汚染による対象の感染を防止するために、手術、カテーテル挿入、その他の侵襲的処置において使用される表面を処置してよい。その上における細菌汚染を制御するために、本発明の方法および組成物を使用して数多くの表面、対象物、材料、その他（例えば医療用または救急用の装置、看護施設、ならびに厨房用の装置および表面）を処置することができることが意図されている。

【0321】

キャリア細菌を含む医薬製剤またはその他の組成物は、投与を容易にし、用量を均一にするために、用量単位形態に製剤化することができる。用量単位形態は、本明細書で使用する場合、処置を受ける患者または植物または環境または表面に適した医薬製剤の物理的に離散した単位を意味する。それぞれの用量は、選択したキャリアと共同して所望の抗菌効果を生じるように計算された量のキャリア細菌を含む必要がある。適切な用量単位を決定するための手順は、当業者には周知である。用量単位は、患者、植物、表面、または環境の重量に基づいて比例的に増加または減少してよい。（例えば患者の組織に含まれる）病原性標的細胞の撲滅を達成するための適切な濃度は、当技術で既知の用量濃度曲線の計算によって決定してよい。

【0322】

本発明のキャリア細菌のその他の使用も意図されている。これらには、種々の農業用、園芸用、環境用、および食品加工用の用途が含まれる。例えば、農業および園芸においては、植物の疾患を最小化するために種々の植物病原性細菌が標的化され得る。標的化に適した植物病原体の一例は、Ｅｒｗｉｎｉａ（例えば、Ｅ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、火傷病の病原体）である。切り花の立ち枯れを低減または防止するために同様の戦略が利用され得る。獣医または動物飼育のために、本発明のキャリア細胞を動物の飼料（ニワトリ、ブタ、家禽、ヤギ、ヒツジ、魚類、甲殻類、またはウシの飼料）に組み込んで生体負荷を低減し、またはある種の病原性生命体（例えばニワトリ、シチメンチョウ、またはその他の家禽におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）を除去してよい。他の実施形態では、望ましくないまたは病原性の細菌を除去するために本発明を食肉またはその他の食品に適用してよい（例えば食肉におけるＥ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、または海産物の「魚臭」の一因であるＰｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．）。

【0323】

環境への効用には、（例えばマラリアまたは西ナイルウイルスを蔓延させる蚊を制御するために）例えば抗菌剤に加えてまたはその代わりに殺昆虫剤を送達し、条件に応じて発現するためのキャリア細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｅｎｇｉｅｎｓｉｓおよびその接合性プラスミドの１つを操作することが含まれる。かかる応用においては、上記の農業用および園芸用またはその他の応用と同様に、溶液、エアロゾル、またはゲルカプセルとしてのキャリア細菌の製剤が意図される。

【0324】

本発明の好ましい実施形態では、環境における操作されたＤＮＡまたは遺伝子的に改変された生命体の使用に伴うリスクの可能性を最小化するために、本発明のＤＮＡ、プラスミド、およびキャリア細胞においてある種の特徴が採用される。例えば、環境的に慎重であるべき状況では、自己伝染性でないＤＮＡまたはプラスミドを利用することが有利であろう。その代わりに、ＤＮＡまたはプラスミドは接合機構によって移動可能となるが自己伝染性ではなくなる。これは、一部の実施形態では、その産生物が接合機構のアセンブリーに必要なｔｒａ遺伝子の全部または一部をキャリア細胞の染色体に一体化することによって達成され得る。かかる実施形態では、本発明のＤＮＡまたはプラスミドは、移入起点（ｏｒｉＴ）を有するが細胞の染色体に提供されるｔｒａ遺伝子を有しないように構成される。この特徴により、レシピエントキラー細胞が、それが死滅する前またはその後でさえもキラーＤＮＡまたはプラスミドをさらに移入することが防止される。別の生物安全性の特徴には、所定の宿主域を有する接合系を利用することが含まれる。あるエレメントは関係する僅かな細菌においてのみ機能する（狭い宿主域）ことが知られている一方、他のエレメントは多くの無関係な細菌において機能する（広い宿主域または無差別）ことが知られている（ｄｅｌ Ｓｏｌａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：６６１－６６６，１９９６、Ｚａｔｙｋａ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２１：２９１－３１９，１９９８）。また、これらの接合系の多くはグラム陽性またはグラム陰性の細菌のいずれかにおいて機能し得るが、一般に両方では機能しない（ｄｅｌ Ｓｏｌａｒ，１９９６，上掲、Ｚａｔｙｋａ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，１９９８）。

【0325】

抗生剤耐性の不注意による増殖は、標的細胞中に接合移入される本発明のＤＮＡまたはプラスミドにおける抗生剤耐性マーカーの使用を避けることにより、実施形態において最小化することができる。代替のアプローチでは、アミノ酸（すなわちセリン）の合成に関与する遺伝子を変異させて、ドナーにおけるこのアミノ酸に対する要求を発生させることができる。かかるミュータント細菌は、これらの細菌が、その産生物が成長に必要なｓｅｒ遺伝子を有するプラスミドを含むことを前提として、セリンを欠く培地で増殖することになる。したがって、本発明は、ｓｅｒ遺伝子または別の栄養遺伝子マーカーを含むプラスミドの有利な使用を意図している。これらのマーカーによって、キャリア細胞中のＤＮＡまたはプラスミドの選択および維持が可能になる。別の生物安全性のアプローチには、ＤＮＡまたはプラスミドの宿主域を調節するための制限改変系の使用が含まれる。接合およびプラスミドの確立は、その中でプラスミドが制限系を免れて複製することができる分類学的に関連する種の間でより頻繁に起こることが予想される。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの特定の認識配列の中またはその近くで二本鎖切断を生じる。関連する改変酵素は同じ配列をメチル化して、それを切断から保護することができる。制限改変系（ＲＭ）は細菌および古細菌において普遍的であるが、真核細胞には存在しない。ＲＭ系のいくつかはプラスミドによってコードされるが、他のものは細菌の染色体の上にある（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｍａｃｅｌｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２２３－２３５，１９９８）。制限酵素は、ウイルスまたはプラスミドのＤＮＡのような外来のＤＮＡが適切な改変酵素によって改変されていない場合には、このＤＮＡを切断する。このようにして、細胞は外来のＤＮＡの侵入から保護される。したがって、１つまたは複数のメチラーゼを産生するキャリア株を使用することによって、１つまたは複数の制限酵素による切断を免れることができる。特定の制限部位を欠くかまたは新規な部位を含むプラスミドＤＮＡを産生し、エンドヌクレアーゼに対してそれぞれプラスミドＤＮＡを保護するかまたは脆弱にするために、部位指向変異が使用される。広い宿主域のプラスミド（例えばＲＰ４）は、典型的には狭い宿主域のプラスミドの上に存在する制限切断部位の多くを単に有しないことによって、制限系を免れることができる（Ｗｉｌｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２５８，４４７－４５６）。本発明の好ましい実施形態はまた、キャリアとして環境に安全な細菌を利用する。例えば、弱毒化した細胞内グラム陽性およびグラム陰性の細菌によるＤＮＡワクチンの送達が報告されている（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｖａｃｃｉｎｅ １９，２５０６－２５１２、Ｇｒｉｌｌｏｔ－Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９９ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０，４７７－４８１）。さらに、ドナー株は身体の非無菌部分（例えば皮膚、胃腸、尿生殖器、口、鼻道、咽喉、および上気道の系）にコロニーを形成する数千の無害な細菌の１つであってよい。好ましいドナー（すなわち、キャリア）細菌種の例は、本明細書の上記で説明している。

【0326】

別の戦略では、分裂せず成長しないキャリア細胞が、生細胞の代わりに利用される。ミニ細胞およびマキシ細胞は、代謝的に活性であるが自力で生存できない細菌細胞のよく研究されたモデル系である。ミニ細胞は染色体ＤＮＡを欠いており、ＤＮＡの複製なしに細胞分裂する特別な変異細胞によって生成する。細胞がマルチコピープラスミドを含む場合には、ミニ細胞の多くはプラスミドを含むことになる。ミニ細胞は分裂も成長もしない。しかし、接合性プラスミドを有するミニ細胞は、プラスミドＤＮＡを接合複製して生きたレシピエント細胞に移入することができる（Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７０，上掲、Ｆｒａｚｅｒ ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓｓ，１９７５，上掲、米国特許第４，９６８，６１９号，上掲）。マキシ細胞は、重要なＤＮＡ修復経路において変異を有するＥ．ｃｏｌｉの株から得ることができる（ｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、およびｐｈｒ）。マキシ細胞は多くのＤＮＡ修復機能を欠いているので、これらは低線量のＵＶ照射によって死滅する。重要なことに、ＵＶ照射を受けていないプラスミド分子（例えばｐＢＲ３２２）は複製を続ける。かかる条件の下では、（プラスミドに指示された）複製および翻訳は効率的に起こることができ（Ｓａｎｃａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３７：６９２－６９３，１９７９）、照射の前に生成したタンパク質は接合を維持するために十分である。これは以下の２つの観察によって支持される。ｉ）ストレプトマイシンによって死滅した細胞は活性なドナーであり続ける。ｉｉ）ｄｅ ｎｏｖｏの遺伝子発現を防止する抗生剤の存在下に、接合性プラスミドの移入が起こり得る（Ｈｅｉｎｅｍａｎ ａｎｄ Ａｎｋｅｎｂａｕｅｒ，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５，５８３－５８８、Ｃｏｏｐｅｒ ａｎｄ Ｈｅｉｎｅｍａｎ，２０００．Ｐｌａｓｍｉｄ ４３，１７１－１７５）。したがって、ＵＶ処理したマキシ細胞は、プラスミドＤＮＡを生きたレシピエントに移入することができる。細菌の間でのｒｅｃＡおよびｕｖｒＡ遺伝子の保存によってＥ．ｃｏｌｉ以外のドナー株のマキシ細胞が得られることにも注目されたい。

【0327】

必須の細胞機能（例えば上掲の米国特許第４，９６８，６１９号に記載されている細胞壁、タンパク質合成、ＲＮＡ合成）をコードする遺伝子における温度感受性変異を含むために機能することができない改変された細菌のいずれかも、本発明における使用が意図されている。

【0328】

一選択肢では、キャリア細胞のために、古細菌が細菌の代わりに使用される。さらにまたはその代わりに、標的細胞は古細菌細胞である。

【0329】

本明細書で使用する場合、用語「キャリア細胞」は、分裂するおよび／または分裂しない細菌細胞（ミニ細胞およびマキシ細胞）、または条件によって機能性のない細胞を含む。

【0330】

一例では、第１のＤＮＡは操作されたＲＫ２プラスミド（すなわち、組換えＤＮＡ技術によって改変されたＲＫ２プラスミド、またはかかる改変されたプラスミドの子孫）に含まれる。プラスミドＲＫ２は、２９種類の（およびおそらくそれより多い）グラム陰性種の中で複製することができる無差別なプラスミドである（Ｇｕｉｎｅｙ ａｎｄ Ｌａｎｋａ，１９８９，ｐ２７－５４．Ｉｎ Ｃ．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓ（ｅｄ）Ｐｒｏｍｉｓｃｏｕｓ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｌｔｄ Ｌｏｎｄｏｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。プラスミドＲＫ２は、完全なヌクレオチド配列が知られている６０ｋｂの自己伝染性プラスミドである（Ｐａｎｓｅｇｒａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９，６２３－６６３）。この大きなプラスミドから誘導され、ＴｒｆＡと呼ばれるプラスミドのＲｅｐタンパク質および栄養複製の起点であるｏｒｉＶをコードするｔｒｆＡ遺伝子を除いて全ての遺伝子を欠く最小のレプリコンが得られている。ＲＫ２複製およびＴｒｆＡタンパク質によるその制御の総説については、Ｈｅｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６（Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（ｅｄ．Ｆ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ｅｔ ａｌ．，２２９５－２３２４，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。

【0331】

一例では、第１のＤＮＡは操作されたＲ６Ｋプラスミド（すなわち、組換えＤＮＡ技術によって改変されたＲ６Ｋプラスミド、またはかかる改変されたプラスミドの子孫）に含まれる。

【0332】

本発明は任意に産業用または家庭用の使用のためであるか、またはかかる使用のための方法において使用される。例えば、これは農業、油もしくは石油の産業、食品もしくは飲料の産業、被服産業、包装産業、電子産業、コンピュータ産業、環境産業、化学産業、航空宇宙〔aeorspace〕産業、自動車産業、バイオテクノロジー産業、医療産業、ヘルスケア産業、歯科産業、エネルギー産業、消費者製品産業、医薬産業、鉱業、クリーニング産業、森林産業、水産業、レジャー産業、リサイクル業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプもしくは製紙産業、テキスタイル産業、被服産業、皮革もしくはスエードもしくは動物革産業、タバコ産業、または製鋼業のためであるかまたはこれらにおいて使用される。

【0333】

本発明は任意に、産業における使用のためであり、または環境は産業的環境であり、産業は医療およびヘルスケア、医薬、ヒト用食料、飼料、植物用肥料、飲料、乳業、食肉加工、農業、牧畜業、養鶏業、魚介水産業、獣医学、油、ガス、石油化学、水処理、下水処理、包装、電子およびコンピュータ、パーソナルヘルスケアおよびトイレタリー、化粧品、歯科、非医療歯科、眼科、非医療眼科、鉱業および鉱産物加工、金属鉱業および金属加工、採石業、航空、自動車、鉄道、輸送、宇宙、環境、土壌処理、パルプおよび紙、被服製造、染料、印刷、接着剤、空調、溶剤、生体防御、ビタミン補給、低温保存、繊維の浸漬および生産、バイオテクノロジー、化学、産業用洗浄製品、家庭用洗浄製品、石鹸および洗剤、消費者製品、森林業、水産業、レジャー、リサイクル、プラスチック、皮革、レザーおよびスエード、廃棄物処理、葬儀および請負、燃料、建設、エネルギー、鉄鋼、ならびにタバコ産業の分野からなる群から選択される分野の産業である。

【0334】

一例では、第１のＤＮＡは標的細菌を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを含み、アレイは、標的細菌のゲノムを標的とする１つまたは２つもしくはそれ以上の異なるスペーサー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上のスペーサー）を含む。

【0335】

一例では、標的細菌は以下のように環境に含まれる。一例では、環境はヒトのマイクロバイオーム、例えば口腔マイクロバイオームもしくは腸マイクロバイオーム、または血流である。一例では、環境はヒトの中またはその上の環境ではない。一例では、環境は非ヒト動物の中またはその上の環境ではない。一実施形態では、環境は空気環境である。一実施形態では、環境は農業環境である。一実施形態では、環境は油または石油の回収環境、例えば油または石油の油田または油井である。一例では、環境はヒトまたは非ヒト動物による消費のための食料または飲料の中またはその上における環境である。一例では、環境は海洋環境、例えば海水中または船上（例えば船またはボートのバラスト水）である。

【0336】

一例では、環境はヒトまたは動物のマイクロバイオーム（例えば腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚、または口腔のマイクロバイオーム）である。一例では、標的細菌はヒトまたは動物のマイクロバイオーム（例えば腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚、または口腔のマイクロバイオーム）に含まれる。

【0337】

一例では、本発明のキャリア細菌、または組成物は、鼻内、局所、もしくは経口でヒトもしくは非ヒト動物に投与されるか、またはかかる投与のためのものである。ヒトまたは動物のマイクロバイオームを処置しようとする当業者は、目的のマイクロバイオームに応じて最良の投与経路を決定することができる。例えば、マイクロバイオームが腸のマイクロバイオームである場合には、投与は経鼻または経口であってよい。マイクロバイオームが頭皮または腋窩のマイクロバイオームである場合には、投与は局所であってよい。マイクロバイオームが口または咽頭である場合には、投与は経口であってよい。

【0338】

一例では、環境は飲料もしくは水（例えばヒトの消費のための水路または飲料水）または土壌に含まれる。水は任意に加熱、冷却、もしくは産業用のシステムの中にあるか、または飲料水保存容器の中にある。

【0339】

一例では、キャリアおよび／または標的細菌はＡｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｉｎｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃａｐｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｄｏｒｅａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍｅｌｌａ、Ｈｅｓｐｅｌｌｉａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ、Ｍｏｒｙｅｌｌａ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｅｉｎｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｕｒｉｂａｃｔｅｒ、およびＷｅｉｓｅｌｌａから選択されるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓである。

【0340】

一例では、キャリア細菌、組成物、使用、または方法は、病原性感染を低減するため、または腸もしくは口腔のバイオフィルムのバランスを調整するため、例えばヒトまたは動物における肥満または疾患を処置または防止するため、またはＧＩの状態（例えばクローン病、ＩＢＤ、または腸炎）を処置または防止するためである。例えば、ＤＮＡ、キャリア細菌、組成物、使用、または方法は、ヒトまたは動物または植物、好ましくはヒトまたは動物の腸のバイオフィルムにおいてＳａｌｍｏｍｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｏｕｓ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅまたはＥ ｃｏｌｉ細菌をノックダウンするためである。

【0341】

一例では、動物は例えばニワトリであり、標的細菌はＳａｌｍｏｍｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである。一例では、動物は例えば魚類（例えばナマズまたはサケ）または甲殻類（例えばエビまたはロブスター）であり、標的細菌はＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａである。一例では、植物は例えばジャガイモ植物であり、標的細菌はＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。一例では、植物は例えばキャベツ植物であり、標的細菌はＸａｎｔｈｏｍｏｎｏｕｓ（例えばＸ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。一例では、植物はマリファナ植物であり、例えば標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰ ｃａｎｎａｂｉｎａまたはＰ ａｍｙｇｄａｌｉ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＡ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（例えばＸ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。一例では、植物は麻植物であり、例えば標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰ ｃａｎｎａｂｉｎａまたはＰ ａｍｙｇｄａｌｉ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＡ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（例えばＸ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。

【0342】

一例では、疾患または状態はがん、炎症性もしくは自己免疫の疾患または状態、例えば肥満、糖尿病ＩＢＤ、ＧＩ管の状態または口腔の状態である。

【0343】

任意に、環境または標的細菌は、腸バイオフィルム、皮膚バイオフィルム、口腔バイオフィルム、咽喉バイオフィルム、毛髪バイオフィルム、腋窩バイオフィルム、膣バイオフィルム、直腸バイオフィルム、肛門バイオフィルム、眼バイオフィルム、鼻バイオフィルム、舌バイオフィルム、肺バイオフィルム、肝バイオフィルム、腎バイオフィルム、生殖器バイオフィルム、陰茎バイオフィルム、陰嚢バイオフィルム、乳腺バイオフィルム、耳バイオフィルム、尿道バイオフィルム、陰唇バイオフィルム、臓器バイオフィルム、または歯科バイオフィルムに含まれる。任意に、環境は、または標的細菌は、植物（例えばタバコ、作物、果樹、野菜、またはタバコ、例えば植物の表面上もしくは植物に含まれる）または環境（例えば土壌または水もしくは水路または水性液体）に含まれる。

【0344】

一例では、キャリア細胞または組成物は、動物またはヒトにおける疾患または状態を処置するためである。一例では、疾患または状態は、対象または患者に含まれる標的細胞の感染によって惹起されまたは媒介される。一例では、疾患または状態は、対象または患者に含まれる標的細胞の感染に伴う。一例では、疾患または状態の症状は、対象または患者に含まれる標的細胞の感染である。

【0345】

任意に、ヒトまたは動物の対象の疾患または状態は、
（ａ）神経変性の疾患または状態、
（ｂ）脳の疾患または状態、
（ｃ）ＣＮＳの疾患または状態、
（ｄ）記憶の喪失または損傷、
（ｅ）心臓または心臓血管の疾患または状態、例えば心臓麻痺、発作、または心房細動、
（ｆ）肝臓の疾患または状態、
（ｇ）腎臓の疾患または状態、例えば慢性腎疾患（ＣＫＤ）、
（ｈ）膵臓の疾患または状態、
（ｉ）肺の疾患または状態、例えば嚢胞性線維症またはＣＯＰＤ、
（ｊ）胃腸の疾患または状態、
（ｋ）咽喉または口腔の疾患または状態、
（ｌ）眼の疾患または状態、
（ｍ）生殖器の疾患または状態、例えば膣、陰唇、陰茎、または陰嚢の疾患または状態、
（ｎ）性感染性の疾患または状態、例えば淋病、ＨＩＶ感染、梅毒、またはクラミジア感染、
（ｏ）耳の疾患または状態、
（ｐ）皮膚の疾患または状態、
（ｑ）心臓の疾患または状態、
（ｒ）鼻の疾患または状態、
（ｓ）血液の疾患または状態、例えば貧血、例えば慢性疾患またはがんの貧血、
（ｔ）ウイルス感染、
（ｕ）病原性細菌感染、
（ｖ）がん、
（ｗ）自己免疫性の疾患または状態、例えばＳＬＥ、
（ｘ）炎症性の疾患または状態、例えばリウマチ性関節炎、乾癬、皮膚炎、喘息、潰瘍性大腸炎、大腸炎、クローン病、またはＩＢＤ、
（ｙ）自閉症、
（ｚ）ＡＤＨＤ、

【0346】

（ａａ）双極性障害、
（ｂｂ）ＡＬＳ（筋委縮性側索硬化症）、
（ｃｃ）骨関節炎、
（ｄｄ）先天性または発育の欠陥または状態、
（ｅｅ）流産、
（ｆｆ）血液凝固状態、
（ｇｇ）気管支炎、
（ｈｈ）乾燥または湿潤ＡＭＤ、
（ｉｉ）新生血管形成（例えば腫瘍または眼の）、
（ｊｊ）一般的な風邪、
（ｋｋ）てんかん、
（ｌｌ）線維症、例えば肝臓または肺の線維症、
（ｍｍ）真菌性の疾患または状態、例えば鵞口瘡、
（ｎｎ）代謝性の疾患または状態、例えば肥満、拒食症、糖尿病、Ｉ型もしくはＩＩ型の糖尿病、
（ｏｏ）潰瘍、例えば胃潰瘍または皮膚潰瘍、
（ｐｐ）乾燥皮膚、
（ｑｑ）シェーグレン症候群、
（ｒｒ）サイトカインストーム、
（ｓｓ）難聴、聴覚の喪失または損傷、
（ｔｔ）代謝の遅延または亢進（したがって、対象の体重、性別、および年齢の平均より遅延または亢進）
（ｕｕ）受胎障害、例えば不妊または受精能低下、
（ｖｖ）黄疸、
（ｗｗ）皮膚発疹、
（ｘｘ）川崎病、
（ｙｙ）ライム病、
（ｚｚ）アレルギー、例えばナッツ、草、花粉、イエダニ、ネコ、またはイヌの毛皮または鱗屑に対するアレルギー、

【0347】

（ａａａ）マラリア、腸チフス熱、結核、またはコレラ、
（ｂｂｂ）うつ病、
（ｃｃｃ）精神発達遅滞、
（ｄｄｄ）小頭症、
（ｅｅｅ）栄養不良、
（ｆｆｆ）結膜炎、
（ｇｇｇ）肺炎、
（ｈｈｈ）肺塞栓症、
（ｉｉｉ）肺高血圧症、
（ｊｊｊ）骨障害、
（ｋｋｋ）敗血症または敗血性ショック、
（ｌｌｌ）静脈洞炎、
（ｍｍｍ）ストレス（例えば職業性ストレス）、
（ｎｎｎ）サラセミア、貧血、フォンウィレブラント病、または血友病、
（ｏｏｏ）帯状疱疹またはヘルペス、
（ｐｐｐ）月経、
（ｑｑｑ）精子数減少
から選択される。

【0348】

本発明による処置または防止のための神経変性またはＣＮＳの疾患または状態
一例では、神経変性またはＣＮＳの疾患または状態は、アルツハイマー病、老年期精神病、ダウン症候群、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、糖尿病性神経障害、パーキンソン症候群、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋委縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、およびクロイツフェルト・クロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択される。例えば、疾患はアルツハイマー病である。例えば、疾患はパーキンソン症候群である。

【0349】

本発明の方法がＣＮＳまたは神経変性の疾患または状態を処置するためにヒトまたは動物の対象に対して実施される例では、本方法は対象におけるＴｒｅｇ細胞の下方制御を惹起し、それにより全身的な単球誘導マクロファージおよび／またはＴｒｅｇ細胞が脈絡叢を横切って対象の脳の中に進入することを促進し、それにより疾患または状態（例えばアルツハイマー病）を処置し、防止し、またはその進行を低減する。一実施形態では、本方法は対象のＣＮＳシステムにおける（例えば脳および／またはＣＳＦにおける）ＩＦＮ－ガンマの増加を惹起する。一例では、本方法は神経線維を回復し、および／または神経線維の損傷の進行を低減する。一例では、本方法は神経ミエリンを回復し、および／または神経ミエリンの損傷の進行を低減する。一例では、本発明の方法はＷＯ２０１５１３６５４１に開示された疾患または状態を処置または防止し、および／または本方法はＷＯ２０１５１３６５４１に開示された任意の方法とともに使用することができる（本書類の開示は、例えばＣＮＳおよび神経変性の疾患および状態の処置および／または防止をもたらすために対象に投与することができるかかる方法、疾患、状態、および可能性のある治療剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ３、または本明細書で開示したその他の抗体などの薬剤の開示を提供するために、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。

【0350】

本方法による処置または防止のためのがん
処置し得るがんは、血管新生していない、または実質的に血管新生していない腫瘍、ならびに血管新生した腫瘍を含む。がんは非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫など）を含み得る、または固形腫瘍を含み得る。本発明によって処置すべきがんの型には、癌腫、芽腫、および肉腫、ならびにある種の白血病またはリンパ悪性疾患、良性および悪性の腫瘍、および悪性疾患、例えば肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／がんおよび小児の腫瘍／がんも含まれる。
血液がんは血液または骨髄のがんである。血液の（または造血性の）がんの例には、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄原性白血病、および骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球、単球、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄原性白血病、および慢性リンパ性白血病など）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（不活性および高グレードの形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストロームのマクログロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、および骨髄異形成が挙げられる。

【0351】

固形腫瘍は、通常嚢胞または液体の区域を含まない組織の異常な塊である。固形腫瘍は良性または悪性であり得る。様々な型の固形腫瘍の名称は、それらを形成する細胞の型に由来する（肉腫、癌腫、およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、およびその他の肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞脂肪腺癌腫、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、ウィルムズ腫瘍、子宮頸がん、睾丸腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（例えば神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られている）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫〔craniopharyogioma〕、上衣腫、松果体腫〔pineaioma〕、血管芽細胞腫、聴覚神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫〔menangioma〕、神経芽細胞腫、網膜芽腫、および脳転移）が挙げられる。

【0352】

本方法による処置または防止のための自己免疫疾患
１．急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）
２．急性壊死性出血性白質脳炎
３．アジソン病
４．無ガンマグロブリン血症
５．円形脱毛症
６．アミロイドーシス
７．強直性脊髄炎
８．抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎
９．抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）
１０．自己免疫性血管性浮腫
１１．自己免疫性再生不良性貧血
１２．自己免疫性自律神経障害
１３．自己免疫性肝炎
１４．自己免疫性高脂血症
１５．自己免疫性免疫不全
１６．自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）
１７．自己免疫性心筋炎
１８．自己免疫性卵巣炎
１９．自己免疫性膵炎
２０．自己免疫性網膜炎
２１．自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）
２２．自己免疫性甲状腺疾患
２３．自己免疫性蕁麻疹
２４．軸索およびニューロンの神経障害
２５．バロー病
２６．ベーチェット病
２７．水疱性類天疱瘡
２８．心筋ミオパチー
２９．キャスルマン病
３０．セリアック病
３１．チャガス病
３２．慢性疲労症候群
３３．慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）
３４．慢性再発性多発性骨髄炎〔ostomyelitis〕（ＣＲＭＯ）
３５．チャーグ・ストラウス症候群
３６．瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡
３７．クローン病
３８．コーガンス症候群
３９．寒冷凝集素症
４０．先天性心ブロック
４１．コクサッキー心筋炎
４２．ＣＲＥＳＴ病
４３．本態性混合クリオグロブリン血症
４４．脱髄性神経障害
４５．疱疹状皮膚炎
４６．皮膚筋炎
４７．デビッチ病（視神経脊髄炎）
４８．ディスコイドループス
４９．ドレスラー症候群
５０．子宮内膜症

【0353】

５１．好酸球性食道炎
５２．好酸球性筋膜炎
５３．結節性紅斑
５４．実験性アレルギー性脳脊髄炎
５５．エバンス症候群
５６．線維筋痛症
５７．線維化性肺胞炎
５８．巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）
５９．巨細胞性心筋炎
６０．糸球体腎炎
６１．グッドパスチャー症候群
６２．多発性血管炎を伴う内芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー内芽腫症と呼ばれていた）
６３．グレーブス病
６４．ギランバレー症候群
６５．橋本脳炎
６６．橋本甲状腺炎
６７．溶血性貧血
６８．ヘノッホ・シェーンライン紫斑病
６９．妊娠性ヘルペス
７０．低ガンマグロブリン血症
７１．特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
７２．ＩｇＡ腎症
７３．ＩｇＧ４関連硬化性疾患
７４．免疫調節性リポタンパク質
７５．封入体筋炎
７６．間質性膀胱炎
７７．若年性関節炎
７８．若年性糖尿病（１型糖尿病）
７９．若年性筋炎
８０．川崎症候群
８１．ランバート・イートン症候群
８２．白血球破砕性血管炎
８３．扁平苔癬
８４．硬化性苔癬
８５．木質性結膜炎
８６．線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）
８７．ループス（ＳＬＥ）
８８．ライム病、慢性
８９．メニエール病
９０．顕微鏡的多発性血管炎
９１．混合結合組織病（ＭＣＴＤ）
９２．モーレン潰瘍
９３．ムッカ・ハーベルマン病
９４．多発性硬化症
９５．重症筋無力症
９６．筋炎
９７．ナルコレプシー
９８．視神経脊髄炎（デビッチの）
９９．好中球減少症
１００．眼瘢痕性類天疱瘡

【0354】

１０１．視神経炎
１０２．回帰性リウマチ
１０３．ＰＡＮＤＡＳ（ストレプトコッカス関連小児自己免疫性神経精神障害）
１０４．傍腫瘍性小脳変性症
１０５．発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）
１０６．パリー・ロンバーグ症候群
１０７．パーソナージ・ターナー症候群
１０８．扁平部炎（末梢ぶどう膜炎）
１０９．天疱瘡
１１０．末梢神経障害
１１１．静脈周囲脳脊髄炎
１１２．悪性貧血
１１３．ＰＯＥＭＳ症候群
１１４．結節性多発性動脈炎
１１５．Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型の自己免疫性多腺性症候群
１１６．リウマチ性多発性筋痛
１１７．多発性筋炎
１１８．心筋梗塞後症候群
１１９．心膜切開術後症候群
１２０．プロゲステロン皮膚炎
１２１．原発性胆汁性肝硬変
１２２．原発性硬化性胆管炎
１２３．乾癬
１２４．乾癬性関節炎
１２５．特発性肺線維症
１２６．壊疽性膿皮症
１２７．赤芽球癆
１２８．レイノー現象
１２９．反応性関節炎
１３０．反射性交感神経性ジストロフィー
１３１．ライター症候群
１３２．再発性多発性軟骨炎
１３３．下肢静止不能症候群
１３４．後腹膜線維化症
１３５．リウマチ熱
１３６．リウマチ性関節炎
１３７．サルコイドーシス
１３８．シュミット症候群
１３９．強膜炎
１４０．強皮症
１４１．シェーグレン症候群
１４２．精子および睾丸の自己免疫
１４３．スティッフパーソン症候群
１４４．亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）
１４５．スーザック症候群
１４６．交感性眼炎
１４７．高安動脈炎
１４８．側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎
１４９．血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
１５０．トロサ・ハント症候群

【0355】

１５１．横断性脊髄炎
１５２．１型糖尿病
１５３．潰瘍性大腸炎
１５４．未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）
１５５．ブドウ膜炎
１５６．血管炎
１５７．小水疱水疱性皮膚病
１５８．白斑
１５９．ウェゲナー肉芽腫症（現在では多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）と称する）

【0356】

本方法による処置または防止のための炎症性疾患
１．アルツハイマー病
２．強直性脊椎炎
３．関節炎（骨関節炎、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎）
４．喘息
５．アテローム性動脈硬化
６．クローン病
７．結腸炎
８．皮膚炎
９．憩室炎
１０．線維筋痛
１１．肝炎
１２．過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
１３．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
１４．腎炎
１５．パーキンソン病
１６．潰瘍性大腸炎

【0357】

成長プロモーターおよび飼料転換率の低下
本実施例は、家禽において成長を促進しＦＣＲを増進させるために、抗菌剤を使用して標的細菌を標的化することができることを実証する。本実施例では、ガイドされたヌクレアーゼ系を使用して、家禽におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａを特異的に標的化した。
第１の態様では、
動物（例えば家畜動物、例えば家禽動物）の成長を促進する方法であって、本方法がガイドされたヌクレアーゼ系またはその構成要素を動物に投与すること、および動物に含まれる標的細菌に系または構成要素を導入することを含み、ガイドされたヌクレアーゼが標的細菌に含まれる標的ヌクレオチド配列を認識および改変（例えば切断）することができ、それにより標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて動物の成長が促進される、方法が提供される。
本方法は非医学的方法であり、動物における標的細菌の存在が動物の成長を阻害することができる。したがって、本方法は動物におけるかかる細菌の負荷を低減し、成長を促進する。

【0358】

第２の態様では、
動物（例えば家畜動物、例えば家禽動物）における飼料転換率（ＦＣＲ）を増進させる方法であって、本方法がガイドされたヌクレアーゼ系またはその構成要素を動物に投与すること、および動物に含まれる標的細菌に系または構成要素を導入することを含み、ガイドされたヌクレアーゼが標的細菌に含まれる標的ヌクレオチド配列を認識および改変（例えば切断）することができ、それにより標的細菌が死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて動物のＦＣＲが増進される、方法が提供される。
本方法は非医学的方法であり、動物における標的細菌の存在が動物のＦＣＲを増大させることができる。したがって、本方法は動物におけるかかる細菌の負荷を低減し、ＦＣＲを増進させる（すなわち、ＦＣＲ数を低減させる）。

【0359】

第３の態様では、
動物（例えば家畜動物、例えば家禽動物）の成長を促進する方法であって、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌に対して毒性である抗菌剤を動物に投与することを含み、動物に含まれるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ標的細菌が薬剤に曝露されて死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて、動物の成長が促進される、方法が提供される。
本方法は非医学的方法であり、動物における標的細菌の存在が動物の成長を阻害することができる。したがって、本方法は動物におけるかかる細菌の負荷を低減し、成長を促進する。

【0360】

第４の態様では、
動物（例えば家畜動物、例えば家禽動物）における飼料転換率（ＦＣＲ）を増進させる方法であって、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌に対して毒性である抗菌剤を動物に投与することを含み、動物に含まれるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ標的細菌が薬剤に曝露されて死滅しまたは標的細菌の成長もしくは増殖が阻害されて、動物のＦＣＲが増進される、方法が提供される。

【0361】

本方法は非医学的方法であり、動物における標的細菌の存在が動物のＦＣＲを増加させることができる。したがって、本方法は動物におけるかかる細菌の負荷を低減し、ＦＣＲを増進させる（すなわち、ＦＣＲ数を低減させる）。

【0362】

これらの態様のいずれにおいても、任意に動物は家畜動物である。任意に、動物は鳥、例えば家禽、例えばニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、またはアヒルである。好ましくは、動物はニワトリである。

【0363】

これらの態様のいずれにおいても、任意に細菌はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｉａｅ細菌、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａである。例えば、細菌はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓである。例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは本明細書で開示した任意のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種または株である。

【0364】

例えば、系、構成要素、または薬剤は、動物飼料および／または飲料（例えば飲水に混合して）で動物に供給される。飲料で供給される場合には、系、構成要素、または薬剤はキャリア細菌に含まれ、キャリア細菌は飲料中に１×１０^３～１×１０^１０（例えば１×１０^４～１×１０^１０、１×１０^４～１×１０^９、１×１０^４～１×１０^８、１×１０^４～１×１０^７、１×１０^３～１×１０^１０、１×１０^３～１×１０^９、１×１０^３～１×１０^８、１×１０^３～１×１０^７、１×１０^５～１×１０^１０、１×１０^５～１×１０^９、１×１０^５～１×１０^８、１×１０^５～１×１０^７、１×１０^６～１×１０^１０、１×１０^６～１×１０^９、１×１０^６～１×１０^８、または１×１０^６～１×１０^７）ｃｆｕ／ｍｌの量で含まれる。飲料中で供給される場合には、系、構成要素、または薬剤はキャリア細菌に含まれ、キャリア細菌は飲料中に少なくとも１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの量で含まれ、例えば、動物は家禽、例えばニワトリである。

【0365】

任意に、ガイドされたヌクレアーゼは、本明細書で開示した任意のガイドされたヌクレアーゼ、例えばＣａｓ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。一例では、構成要素は関連するＣａｓヌクレアーゼとともに標的細胞中で操作可能なｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡである。Ｃａｓヌクレアーゼは、本明細書で開示した任意のＣａｓヌクレアーゼであってよい。Ｃａｓヌクレアーゼは標的細胞の内因性Ｃａｓであってよく、または動物に投与される外因性核酸によってコードされてもよい。

【0366】

本発明の系、構成要素、および薬剤は、細菌接合（例えばキャリア細胞から標的細胞への接合移入）によって、または系、構成要素、または薬剤をコードする標的細胞の核酸の中に形質導入されるファージによって、標的細菌に導入される。

【0367】

任意に、標的細菌は、動物で見出される本明細書で開示した任意の微生物群に含まれる。好ましくは、微生物群は腸微生物群（例えばニワトリの腸微生物群）である。

【0368】

家畜動物は本明細書で開示した任意の家畜動物、例えばニワトリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、養殖魚（例えばサケまたはナマズ）、または養殖甲殻類（例えばロブスター、クルマエビ、またはエビ）であってよい。

【0369】

本明細書に記載した特定の実施形態は説明のために示されており、本発明の限定としてではないことが理解されよう。本発明の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態において本発明の主要な特徴を採用することができる。当業者であれば、日常の検討を超えることなく、本明細書に記載した特定の手順に数多くの等価物を認識し、または確定することができる。かかる等価物は本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲によって包含されている。明細書中で述べた全ての出版物および特許出願は、本発明が関係する当業者のスキルのレベルを示す。全ての出版物および特許出願、ならびに全ての等価の米国特許出願および特許は、それぞれ個別の出版物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。単語「１つ（〔a〕または〔an〕）」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む」と併せて使用される場合には、「１つ」を意味し得るが、これは「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも合致する。本開示は選択肢のみおよび「および／または」を意味する定義を支持するが、特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを意味するように明示的に指示され、または選択肢が相互に排他的である場合以外には、「および／または」を意味するように使用される。本出願を通じて、用語「約」は、ある値がデバイスについての固有の誤差変動を含むことを示すために使用され、本方法はその値または検討対象の間に存在する変動を決定するために採用される。

【0370】

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、語句「含む〔comprising〕」（および〔comprising〕の任意の形態、例えば〔comprise〕および〔comprises〕）、「有する〔having〕」（および〔having〕の任意の形態、例えば〔have〕および〔has〕）、「含む〔including〕」（および〔including〕の任意の形態、例えば〔includes〕および〔include〕）、または「含む〔containing〕」（および〔containing〕の任意の形態、例えば〔contains〕および〔contain〕）は包括的またはオープンエンドであり、引用していないさらなるエレメントまたは方法ステップを排除しない。

【0371】

用語「またはそれらの組合せ」又は同様の用語は、本明細書で使用する場合、その用語に先立って列挙された項目の全ての順列および組合せを意味する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうち少なくとも１つを、また特定の文脈において順序が重要な場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢのうち少なくとも１つを含むことも意図している。この例を続けて、１つまたは複数の項目または用語、例えばＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等々の繰り返しを含む組合せが明示的に含まれる。文脈から他が明白でない限り、典型的には任意の組合せにおいて項目または用語の数に制限がないことが当業者には理解されよう。

【0372】

文脈から他が明白でない限り、本開示のいずれの部分も本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。

【0373】

本明細書で開示し特許請求する組成物および／または方法の全ては、本開示に照らして、不必要な実験をすることなく作成し実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載しているが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、組成物および／または方法に、また本明細書に記載した方法のステップまたはステップの順列に、変更を適用できることは、当業者には明らかであろう。当業者には明らかな全てのかかる同様の置換および改変は、添付した特許請求の範囲で定義される本発明の精神、範囲、および概念に含まれるとみなされる。

【実施例】

【0374】

［実施例１］
標的遺伝子配列の評価およびｃｒＲＮＡアレイの設計
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおける推定標的遺伝子のリスト
慎重な分析および決定を介して、本発明者らは、本発明に従ったキャリア細胞から接合性プラスミドによって送達されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素を使用する切断による評価のために、以下の標的遺伝子を編集した。
１）ｐｉｐＡ 病原性アイランドによってコードされるタンパク質：ＳＰＩ５
２）ｍＶｉＭ 推定病原性因子
３）ｍＶｉＮ 推定病原性因子
４）ｐｈｏＰ 低Ｍｇ＋濃度下で発現する遺伝子（ＯｍｐＲファミリー）を転写する；病原性転写調節タンパク質ＰＨＯＰ
５）ｈｉｌＡ 侵入遺伝子の転写アクチベーター
６）ＢｉｇＡ 推定表面曝露病原性タンパク質
７）ｓｕｇＲ ＡＴＰ結合タンパク質；病原性アイランドによってコードされるタンパク質：ＳＰＩ３
８）ｒｈｕＭ 病原性アイランドによってコードされるタンパク質：ＳＰＩ３
９）ｐｉｐＣ 侵入遺伝子Ｅタンパク質／病原性アイランドによってコードされるタンパク質：ＳＰＩ５
１０）ｐｉｐＢ 病原性アイランドによってコードされるタンパク質：ＳＰＩ５
１１）ｓｉｃＰ 病原性に関連するシャペロン
１２）ｓｏｐＢ 侵入遺伝子Ｄタンパク質／病原性アイランドによってコードされるタンパク質：ＳＰＩ５
１３）ｍａｒＴ 推定転写調節タンパク質／病原性アイランドによってコードされるタンパク質：ＳＰＩ３

【0375】

標的の選択
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的遺伝子の最初の標的選択は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病原性アイランドにほぼ排他的に位置する１３の推定候補を同定した（この実施例の最初に列挙した）。細密に検査した後、標的のリストは７個の遺伝子、すなわち、ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｍａｒＴ、ｓｉｃＰ、およびｓｏｐＢに減り、これら遺伝子は、重要なことに、本発明者らが見出したところによると、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａの他の遺伝子に対して有意な配列相同性を示さず、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで、および異なる（非Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の非標的Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａを含有するマイクロバイオームにおいて、高いＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞標的特異性を可能とする。ＰＡＭモチーフ（ＮＧＧ）の存在によって規定されるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の標的部位を、分子生物学ソフトウェアにおいて利用可能なそれぞれの機能を使用して抽出した。多くの６から１４個の推定標的部位が、７個の選択された遺伝子のそれぞれにおいて同定された。

【0376】

ｃｒＲＮＡの設計および合成
ｄｓＤＮＡの効率的な制限をもたらす可能性が最も高い標的部位を選択するために、全ての潜在的な配列を、Ｃａｓ９によって導入される二本鎖切断の効率に対する正または負の効果を有することが、利用可能な文献において記載されている、重要な位置でのヌクレオチドの存在についてスクリーニングした。３つの刊行物が、ｓｇＲＮＡについてであるが、このようなデータを報告した。
（１）Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ． ２０１４， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
（２）Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ
（３）Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ

【0377】

これら３つの刊行物のそれぞれにおいて制限の効率に影響すると記載されているパラメーターのほとんどに左右された各遺伝子の１つの標的配列を、ｃｒＲＮＡアレイに組み込むために選択し、その結果、３つのアレイを試験することとなった。ｃｒＲＮＡアレイは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの配列データ（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｎａｔｕｒｅにおいて公開されている）に基づいて設計した。以下の配列を構築した：配列番号１～３。

【0378】

ｃｒＲＮＡをコードするこれらの配列のうちの２つを、同族ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９をコードする配列とアセンブルした。

【0379】

Ｃａｓ９構築物（ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ）
ｃｒＲＮＡをコードする選択された配列を、異なるバージョンのｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９モジュールと組み合わせ、その結果、変化したプラスミドセットが得られた。

【0380】

全ての構成要素（ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９、およびｃｒＲＮＡ）の構成的な発現のために、プラスミドｐＣａｓ９に基づくｔｒａｃｒ－Ｃａｓ断片（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、配列番号４で示される配列）をＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのｇＤＮＡから増幅した。本発明者らは、この断片を、利用可能なｃｒＲＮＡコード断片と繋ぎ、高コピー数の一般的なクローニングプラスミドｐＪｅｔ１．２にクローニングする。この一連の構築物は、ｐＦＳ１と名付けられる。

【0381】

低コピー数のバックグラウンドにおけるこの構成的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物の発現が効率的に機能するかどうかを判定するために、本発明者らは、上記の系を低コピー数のプラスミドに移す。ｐＦＳ２構築物はしたがって、ｐＺＳ２１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）からの低コピー数のｐＳＣ１０１起点に基づく。

【0382】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素のうちの少なくとも１つの発現を誘導性プロモーターによって制御するために、本発明者らは、構成的Ｃａｓ９プロモーターを、ＴｅｔＲ調節型プロモーターＰＬｔｅｔＯ－１で置換する。ｐＦＳ３の得られたプラスミドも同様に、ｐＺＳ２１ＭＣＳの低コピー数のｐＳＣ１０１起点に基づく。導入される変化は、以下の通りである：
－ ＲＢＳと開始ＡＴＧとの間のスペースが、７ｂｐに短縮されている（ＴＡＡＡＴＡＣ）
－ 停止コドンが、あまり効果的でないＴＧＡＣからタンデムＴＡＡＴＡＡＴ配列に変化している。

【0383】

最後に、本発明者らは、上記のｐＦＳ１およびｐＦＳ２のような移動可能なバージョンの構成的に発現されるプラスミドを産生する。この目的のために、本発明者らは、プラスミドＲＰ４の移入起点（ｏｒｉＴ）を、クロラムフェニコール耐性を有する中間コピー数のプラスミド（ｐ１５Ａ起点）にクローニングする。この構築物は、ＲＰ４および他の移動可能なプラスミドに存在するような、染色体に組み込まれた接合機構によって移動および移入することが可能であるはずである。

【0384】

さらなる構築物
最終的な選択およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａへの形質転換の前に、選択されたｃｒＲＮＡによるｄｓＤＮＡ制限の効率を決定するために、本発明者らは、標的遺伝子（またはその大部分）を、適合するプラスミドにクローニングすることを目指す。選択されたプラスミドは、上記のｐＦＳ１／ｐＦＳ２／ｐＦＳ３構築物に適合するｐ１５Ａ起点を有するｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）である。次いで、クロラムフェニコール耐性を失わせること（または、ｙｆｐ誘導体がレポーターとして存在する場合には蛍光を失わせること）によって、効率をＥ．ｃｏｌｉにおいて試験することができる。最も性能の良い標的配列をその後、将来的に、より標的化されたプラスミドとして使用することができる。

【0385】

本発明者らは、以下のプラスミドを作製した：
ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９－ｍｏｂ－ｐＺＡ３１ＭＣＳ
ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７ ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９－Ｓａｌｃｒ７－３－ｍｏｂ－ｐＺＡ３１ＭＣＳ
ｐＦＳｍｏｂＳａｌ３ ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９－Ｓａｌｃｒ３．２－ｍｏｂ－ｐＺＡ３１ＭＣＳ
ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊ Ｓａｌｃｒ７－３－ｍｏｂ－ｐＺＡ３１ＭＣＳに基づく対照

【0386】

プラスミドの詳細
プラスミド名：ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ
説明：４７６８ｂｐのインサート（ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９－ｏｒｉＴ／ｍｏｂ）を有するｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）に基づくｐ１５Ａ起点プラスミド
プラスミド長：６６８５ｂｐ
配列の検証：あり；プライマーウォーキングシーケンシングによって検証されたインサート配列
さらなる注記：ｃｒＲＮＡアレイは存在しない；対照プラスミド

【0387】

プラスミドの詳細
プラスミド名：ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７
説明：５５９８ｂｐのインサート（ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｏｒｉＴ／ｍｏｂ）を有するｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）に基づくｐ１５Ａ起点プラスミド
プラスミド長：７５１５ｂｐ
配列の検証：あり；プライマーウォーキングシーケンシングによって検証されたインサート配列

【0388】

プラスミドの詳細
プラスミド名：ｐＦＳｍｏｂＳａｌ３
説明：５３４１ｂｐのインサート（ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｏｒｉＴ／ｍｏｂ）を有するｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）に基づくｐ１５Ａ起点プラスミド
プラスミド長：７２５８ｂｐ
配列の検証：あり；プライマーウォーキングシーケンシングによって検証されたインサート配列

【0389】

プラスミドの詳細
プラスミド名：ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊
説明：ｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）に基づくｐ１５Ａ起点プラスミド
プラスミド長：７３４８ｂｐ
配列の検証：あり；プライマーウォーキングシーケンシングによって検証されたインサート配列

【0390】

［実施例２］
ガイドされたヌクレアーゼを使用する接合による望ましくないＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の選択的除去
研究の目的
この研究の目的は、接合実験によって望ましくないＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株を選択的に除去することであった。本発明者らは、ｐＦＳＭｏｂＳａｌ７プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐに移動させた。このプラスミドは、ｔｒａｃｒ－Ｃａｓ９、ｃｒＲＮＡをコードするアレイ（Ｓａｌ７－３）、および移入起点（ｏｒｉＴ）を有している。

【0391】

概要
概念証明として、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐへの移動の前に、Ｅ．ｃｏｌｉからＥ．ｃｏｌｉへの接合実験をまず行った。プラスミドｐＦＳＭｏｂＳａｌ７（クロラムフェニコール耐性、ＣｍＲ）を、移動を可能にするキャリア株に、まず形質転換した。この実験において、線毛を生じさせた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０５５ＴＭ）であった。接合機能は、染色体に組み込まれたＲＰ４プラスミドによってもたらされる。レシピエント細胞はナリジクス酸耐性であるべきであり（２５μｇ／ｍｌ）、ここで、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＡＴＣＣ（登録商標）５３３２３ＴＭ）を使用した。標的化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、本発明者らのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐコレクション由来のＦＳ２６であった。結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９への、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＦＳ２６）への良好な接合効率を示した。レシピエントとしてのＳａｌｍｏｎｅｌｌａへ接合の後、ｐＦＳＭｏｂ－３での死滅が効率的であった。

【0392】

導入
ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７プラスミドは、中間コピー数のｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）に由来するものであった。移入起点（ＯｒｉＴ）配列を合成し（ｍｏｂ２と呼ぶ）、ｔｒａｃｒ－Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡアレイ断片に加えて、アセンブリー法によってｐＺＡ３１ＭＣＳにクローニングした。

【0393】

接合実験を開始する前に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７株を標準的なプロトコールによってエレクトロコンピテントにした（Ｏ’Ｃｈａｌｌａｈａｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｂｉｔ， １９９０）。プラスミドｐＦＳＭｏｂｓａｌ７およびｐＦＳＭｏｂＣ^＊を次いで、電気穿孔によってＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７に形質転換し、クロラムフェニコール（Ｃｍ３０、３０μｇ／ｍＬ）中で選択した。

【0394】

ｐＦＳＭｏｂＳａｌ７およびｐＦＳＭｏｂＣ^＊を、フィルター上での交配によって、ドナーＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からレシピエントＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に、およびナリジクス酸耐性（ＮａｌＲ）かつクロラムフェニコール感受性（ＣｍＳ）のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐに移動させ、その後、３７℃でインキュベートした。混合物を次いで、Ｃｍ３０、Ｎａｌ２５、およびＣｍ３０＋Ｎａｌ２５中に播種した。接合完了体を二重の抗生物質Ｃｍ３０＋Ｎａｌ２５中で選択した（Ｐｈｏｒｎｐｈｉｓｕｔｔｈｉｍａｓ ｅｔ ａｌ， ２００７）。

【0395】

接合実験を開始する前に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおける形質転換によってｐＦＳＭｏｂプラスミドの死滅効率がまず試験されたことに留意されたい。

【0396】

方法論
材料：
－ ドナー株：ｐＦＳＭｏｂＳａｌ７／ｐＦＳＭｏｂＣ^＊を形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７
－ レシピエント株：ＪＭ１０９／Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＦＳ２６
－ ルリア・ベルターニ培養液（ＬＢ）（製品番号Ｌ３５２２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＬＢ Ｃｍ３０μｇ／ｍｌ
－ ＬＢ寒天１％のプレート
－ ＬＢ寒天１％ Ｃｍ３０μｇ／ｍｌのプレート
－ ＬＢ寒天１％ ＮａＬ２５μｇ／ｍｌのプレート
－ ＬＢ寒天１％ Ｃｍ３０＋ＮａＬ２５のプレート
－ Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）膜フィルターナイロン、孔サイズ０．４５μｍから１μｍ、直径２５ｍｍ。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈによって供給される参照番号２８４２０７７０。

【0397】

実験１：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９へのｐＦＳＭｏｂＣ^＊の移動
概念証明として、対照プラスミド（ｐＦＳＭｏｂＣ^＊）を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９への接合実験をまず行った。この実験は、Ｐｈｏｒｎｐｈｉｓｕｔｔｈｉｍａｓ（Ｐｈｏｒｎｐｈｉｓｕｔｔｈｉｍａｓ ｅｔ ａｌ， ２００７）のプロトコールに従った。
１． ＬＢ＋Ｃｍ３０における本発明者らのコレクション由来のドナーｐＦＳＭｏｂＣ^＊（Ｓ１７）の培養物、およびＬＢ培養液におけるレシピエント株ＪＭ１０９の培養物を、一晩成長させる。
２． 朝、実験を開始する前に、ＬＢ寒天（１％）のプレートを少なくとも３０分間、事前に温める。
３． ドナー株とレシピエントとを、１：１の比率で以下のように混合する。
４． ５０μｌのｐＦＳＭｏｂＣ^＊（Ｓ１７）＋５０μｌのＪＭ１０９
５． ５０μｌのｐＦＳＭｏｂＣ^＊（Ｓ１７）＋５０μｌのＬＢ
６． ５０μｌのＬＢ＋５０μｌのＪＭ１０９
７． 各反応で、フィルター膜（０．４５μＭから１μＭ）を、事前に温めたＬＢ寒天プレート（１％）の一番上に置く
８． 各交配試料をフィルターにロードする
９． プレートを３時間、３７℃で、振とうせずに放置し、ＬＢは吸収され、細菌はフィルター上に残る
１０． インキュベーションの後、各フィルターを１ｍｌのＬＢ培養液を有するユニバーサルチューブ内に入れ、良くボルテックスする
１１． １００μｌ（および連続希釈物）を、Ｃｍ３０、Ｎａｌ２５、およびＣｍ３０＋Ｎａｌ２５に播種し、３７℃でＯ．Ｎで放置する。

【0398】

Ｃｍ３０のプレートはドナーの数を提供する。Ｎａｌ２５のプレートはレシピエントの数を提供し、Ｎａｌ２５＋Ｃｍ３０のプレートは接合完了体（すなわち、ドナーからレシピエントに移動したプラスミド）の数を提供する。ドナーおよびレシピエントのみ（交配なし）を有するプレートは、陰性対照である。

【0399】

結果
１）３７℃で１８時間の後、計数可能の場合はコロニーを異なる希釈で個別に計数し、コロニーの数はｃｆｕ／ｍＬで表した。陰性対照プレートでは予想通り、コロニーは回収されなかった（データは示していない）。結果（表１）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９への良好な接合効率を示している。

【0400】

【表1】

【0401】

２）レシピエント株におけるｐＦＳｍｏｂＣ^＊プラスミドの移動を、ＰＣＲによって確認した。プライマーｓｐＣａｓ９－６フォワード（５’－ＡＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＧＣ）（配列番号８）およびｍｏｂ２リバース（５’－ＧＣＣＴＣＴＡＧＣＡＣＧＣＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴ）（配列番号９）を、５０℃のアニーリング温度で使用した。接合完了体を有するプレートから得た２つのコロニーがＰＣＲによって試験されている。陽性対照もまた含まれた（図１）。

【0402】

結論１：
Ｅ．ｃｏｌｉからＥ．ｃｏｌｉへの接合実験は、良好な移動効率を示している。Ｅ．ｃｏｌｉの接合についてのさらなる最適化試験は、交配物を３７℃で６時間、１：４の比率でインキュベートした場合に、より高い接合効率を示した。

【0403】

実験２：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐへのｐＦＳＭｏｂＳａｌ７の接合
この実験は、いくつかの修正を加えて、Ｐｈｏｒｎｐｈｉｓｕｔｔｈｉｍａｓ（Ｐｈｏｒｎｐｈｉｓｕｔｔｈｉｍａｓ ｅｔ ａｌ， ２００７）およびＣａｒｒａｒｏ ｅｔ ａｌ， ２０１７のプロトコールに従っている：
１． ＬＢ＋Ｃｍ３０における本発明者らのコレクション由来のｐＦＳＭｏｂＳａｌ７（Ｓ１７）および対照ｐＦＳＭｏｂＣ^＊（Ｓ１７）の培養物、ならびにＬＢ培養液におけるレシピエント株Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＦＳ２６の培養物を、一晩成長させる。
２． 朝、実験を開始する前に、ＬＢ寒天（１％）のプレートを少なくとも３０分間、事前に温める。
３． ドナー株とレシピエントとを、１：４の比率で以下のように混合する。
４． １００μｌのｐＦＳＭｏｂＣ^＊（Ｓ１７）＋４００μｌのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＦＳ２６
５． １００μｌのｐＦＳＭｏｂＳａｌ７（Ｓ１７）＋４００μｌのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＦＳ２６
６． １００μｌのｐＦＳＭｏｂＣ^＊（Ｓ１７）＋４００μｌのＬＢ
７． １００μｌのｐＦＳＭｏｂＳａｌ７（Ｓ１７）＋４００μｌのＬＢ
８． １００μｌのＬＢ＋４００μｌのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
９． ２０００×ｇで３分間回転させる
１０． ２００μｌのＬＢ中に再懸濁させる
１１． ２０００×ｇで３分間回転させる
１２． ２５μｌのＬＢ中に再懸濁させる
１３． 各反応で、フィルター膜（０．４５μＭから１μＭ）を、事前に温めたＬＢ寒天プレート（１％）の一番上に置く
１４． 各交配試料をフィルターにロードする
１５． プレートを６時間、３７℃で、振とうせずに放置し、ＬＢは吸収され、細菌はフィルター上に残る
１６． インキュベーションの後、各フィルターを１ｍｌのＬＢ培養液を有するユニバーサルチューブ内に入れ、良くボルテックスする
１７． １００μｌ（および連続希釈物）をＣｍ３０、Ｎａｌ２５、およびＣｍ３０＋Ｎａｌ２５に播種し、３７℃でＯ．Ｎで放置する。

【0404】

Ｃｍ３０プレートのプレートはドナーの数を提供する。Ｎａｌ２５のプレートはレシピエントの数を提供し、Ｎａｌ２５＋Ｃｍ３０のプレートは接合完了体（すなわち、ドナーからレシピエントに移動したプラスミド）の数を提供する。

【0405】

結果
－ ３７℃で１８時間の後、コロニーを希釈－３で個別に計数し、コロニーの数はｃｆｕ／ｍＬで表した（表２）。陰性対照プレートでは予想通り、コロニーは回収されなかった（データは示していない）。

【0406】

【表2】

【0407】

－ プラスミド対照ｐＦＳＭｏｂＣ^＊と比較すると、これらのデータは、接合によって標的株に送達されたプラスミドｐＦＳＭｏｂＳａｌ７が株Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＦＳ２６）を１００％除去し得ることを示している（図２）。

【0408】

結論
この研究は、接合がＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７からＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＦＳ２６）への良好な送達方法であること、および、ｐＦＳＭｏｂＳａｌ７が、接合によってレシピエントに送達されても依然として効率的に致死性であることを示した。接合は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの１００％を除去する（死滅させる）ことができた。

【0409】

参考文献
Ｃａｒｒａｒｏ Ｎ， Ｄｕｒａｎｄ Ｒ， Ｒｉｖａｒｄ Ｎ， Ａｎｑｕｅｔｉｌ Ｃ， Ｂａｒｒｅｔｔｅ Ｃ， Ｈｕｍｂｅｒｔ Ｍ， Ｂｕｒｒｕｓ Ｖ． （２０１７）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｓｌａｎｄ １（ＳＧＩ１） ｒｅｓｈａｐｅｓ ｔｈｅ ｍａｔｉｎｇ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｏｆ ＩｎｃＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｓｅｌｆ－ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ． ＰＬＯＳ Ｇｅｎ。
Ｏ’Ｃｈａｌｌａｈａｎ Ｄ，Ｃｈａｒｂｉｔ Ａ． （１９９０）． Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２３； １５６－８。
Ｐｈｏｒｎｐｈｉｓｕｔｔｈｉｍａｓ Ｓ， Ｔｈａｍｃｈａｉｐｅｎｅｔ Ａ， ａｎｄ Ｐａｎｉｊｐａｎ Ｂ． （２００７）． Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｍｏｌ Ｂｉｏ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｖｏｌ． ３５， Ｎｏ． ６， ４４０－４４５

【0410】

［実施例３］
全血清型接合移入およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａの死滅
研究の目的
この研究の目的は、接合によってｐＦＳｍｏｂＳａｌ７プラスミドおよびｐＦＳｍｏｂＳａｌ３プラスミドのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型を選択的に除去するｉｎ ｖｉｔｒｏでの能力を試験することであった。

【0411】

概要
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ株、すなわち、血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（４）、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（１）、Ｖｉｒｃｈｏｗ（１）、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ（１）、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（１）、Ｈａｄａｒ（１）、Ｂｉｎｚａ（１）、Ｂｒｅｄｅｎｅｙ（１）、Ｉｎｆａｎｔｉｓ（１）、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ（１）、Ｓｅｆｔｅｎｂｅｒｇ（１）、Ｍｂａｎｄａｋａ（１）、Ａｎａｔｕｍ（１）、Ａｇｏｎａ（１）、およびＤｕｂｌｉｎ（１）の１８種を、本発明者らのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．コレクションから選択した（表３）。細菌をコンピテントにし、２つのバージョンのｐＦＳｍｏｂプラスミド、すなわち、ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７およびｐＦＳｍｏｂＳａｌ３、２つのバージョンのｐＦＳｍｏｂ対照プラスミド、すなわち、ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊およびｐＦＳｍｏｂ－Ｃ、ならびにさらなる対照としてのｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）で形質転換した。電気穿孔およびＳＯＣ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ培地（ＮＥＢ、Ｂ９０２０５、ＬＯＴ－１００１９８５７）における３７℃で２時間のインキュベーションの後、オリジナル溶液の異なる希釈物を、クロラムフェニコール（Ｃｍ_３０、３０μｇ／ｍＬ）を添加した１％ＬＢ寒天に播種した。プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。結果は、コロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）として解釈した。

【0412】

導入
ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７プラスミドおよびｐＦＳｍｏｂＳａｌ３プラスミドは、それらのｃｒＲＮＡアレイに７つの標的遺伝子（ｐｉｐＡ、ｐｉｐＢ、ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｓｉｃＰ、ｍａｒｔ、ｓｏｐＢ）および３つの標的遺伝子（ｐｉｐＣ、ｈｉｌＡ、ｍａｒｔ）をそれぞれ有している。ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７プラスミドに由来する陽性対照ｐＦＳｍｏｂ－Ｃを使用し、特に、ｐＦＳｍｏｂ－Ｃは、ｃｒＲＮＡアレイを有していない。中間コピー数のｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）に由来する対照ｐＦＳｍｏｂ－Ｃをさらなる対照として使用した。陽性コロニーの選択を、クロラムフェニコール（Ｃｍ_３０、３０μｇ／ｍＬ）で行った。ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７の、形質転換によってＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｒｃｈｏｗ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｈａｄａｒ、およびＢｉｎｚａを選択的に除去するｉｎ ｖｉｔｒｏでの能力が以前に示された。この研究の目的は、本発明者らのコレクションに存在する全てのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．血清型を評価して、ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７プラスミドおよびｐＦＳｍｏｂＳａｌ３プラスミド両方の、望ましくない細菌を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏでの能力を評価した。多くの結果を集めるために、１８の異なる血清型を本発明者らのコレクションから選択し、電気穿孔によって試験した（表３）。プラスミドｐＦＳｍｏｂ－Ｃ、ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊、およびｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）を対照として使用した。

【0413】

方法論
細菌株を、－８０℃で維持した凍結ストックから回収し、３７℃で２４時間培養した（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｅｗｉｎｇ，１９８６）。Ｃｍ_３０（３０μｇ／ｍＬ）に対する感受性を、ＥＵＣＡＳＴ臨床ブレークポイントテーブルに従って寒天希釈法を使用して試験した。細菌を、Ｏ’ＣｈａｌｌａｈａｎおよびＣｈａｒｂｉｔのプロトコール（Ｏ’Ｃｈａｌｌａｈａｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｂｉｔ，１９９０）を使用してコンピテントにした。全ての選択された株を、１００ｎｇのｐＦＳｍｏｂＳａｌ７、ｐＦＳｍｏｂＳａｌ３、ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ、ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊、およびｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）で形質転換した。陰性対照もまた含まれた（ＤＮＡの付加を伴わないコンピテント細胞）（表４）。１８時間のインキュベーションの後、計数可能なコロニー（３０から３００の間のコロニー数）を、ｍＬ当たりのコロニー数（ＣＦＵ／ｍＬ）として表した（表４）。

【0414】

【表3】

【0415】

結果
全ての選択された細菌は、ＥＵＣＡＳＴブレークポイント（ＥＵＣＡＳＴ、２０１３）に従って、Ｃｍ_３０に対して感受性があることが分かった。電気穿孔、およびＣｍ_３０（３０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を添加したＬＢ寒天プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、ＢＰ１４２５－５００、ＬＯＴ－１７１７８４）への異なる希釈物（未希釈、１０^－１、１０^－２）の播種の後、プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。細菌は、Ｃｍ_３０（３０μｇ／ｍＬ）寒天プレートで成長した場合、形質転換されているとみなされた。計数可能なコロニー（３０から３００の間）を、ＣＦＵ／ｍｌとして表した（表４）。陰性対照プレートでは予想通り、コロニーは回収されなかった。１つ（ＦＳ６７、Ｓ．Ｄｕｂｌｉｎ）を除いた全ての血清型が、ｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）で効率的に形質転換された。ほぼ全ての血清型が２つの対照プラスミド（ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊およびｐＦＳｍｏｂ－Ｃ）で効率的に形質転換され、１０^２から１０^６ＣＦＵ／ｍＬの間の多くのコロニーであった。

【0416】

ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７およびｐＦＳｍｏｂＳａｌ３に関して、死滅効果は全ての血清型において生じ、これらは同様であることが分かった。大部分の血清型において、コロニー数の減少は、対照プラスミドを形質転換されたものと比較して、比較的明らかであった。１つの株（ＦＳ３８、Ｓ．Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ）を除いて、ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７とｐＦＳｍｏｂＳａｌ３との間で、それらの死滅効果に有意差は見られなかった。

【0417】

【表4】

【0418】

結論
この実験において使用した全てのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．血清型を効率的にコンピテントにし、ｐＺＡ３１ＭＣＳ（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）、ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ、および対照として使用したｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊で形質転換した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ血清型は、これまでに観察されたように、ｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊によって常に形質転換可能という訳ではないと思われる。さらに一般的には、この研究において使用された２つのｐＦＳｍｏｂ由来対照プラスミドの間に特定の違いは生じなかった（１０^２から１０^６ＣＦＵ／ｍＬの間）。その一方で、ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７およびｐＦＳｍｏｂＳａｌ３の死滅効果は同様であることが分かった（１０^１から１０^３の間）。結論として、この研究において、ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７およびｐＦＳｍｏｂＳａｌ３が、対照プラスミドと比較して、異なるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．血清型を選択的に除去し得ることが実証された。

【0419】

参考文献
Ｅｄｗａｒｄｓ ＰＲ， Ｅｗｉｎｇ ＷＨ． （１９８６）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｔｅｒｉａｃｅａｅ （４^ｔｈ ｅｄ．）． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
ＥＵＣＡＳＴ， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ． （２０１３）． Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｔａｂｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＩＣｓ ａｎｄ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒｓ． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ （ｌａｓｔ ａｃｃｅｓｓｅｄ Ａｕｇｕｓｔ １６， ２０１３．， Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．
Ｏ’Ｃｈａｌｌａｈａｎ Ｄ， Ｃｈａｒｂｉｔ Ａ．（１９９０）． Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２３；１５６－８．

【0420】

［実施例４］
ニワトリにおける飼料転換率の向上。組み合わされた第２の２週間の有効性、２週間の安全性、および６週間の生産性の試験。
研究の目的
－ ニワトリの健康、福祉、および生産性に対する抗菌性接合性プラスミド（ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７）の影響を６週間にわたり判定すること。

【0421】

方法論
Ｒｏｓｓ ３０８鳥を、制御されたバイオセキュリティーのある条件下で飼育し、水および標準的な市販の飼料を自由摂取させた。

【0422】

鳥に、以下のいずれかを継続的に投与した：
１． 添加物なしの水（６０羽の鳥）
２． １０^８ｃｆｕ／ｍｌの株Ｓ１７が入った飲用水（３０羽の鳥）
３． １０^８ｃｆｕ／ｍｌのｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊を有する株Ｓ１７が入った飲用水（３０羽の鳥）
４． １０^８ｃｆｕ／ｍｌのｐＦＳｍｏｂＳａｌ７を有する株Ｓ１７が入った飲用水（６０羽の鳥）
５． １０^９ｃｆｕ／ｍｌのｐＦＳｍｏｂＳａｌ７を有する株Ｓ１７が入った飲用水（３０羽の鳥）
６． １０^１０ｃｆｕ／ｍｌのｐＦＳｍｏｂＳａｌ７を有する株Ｓ１７が入った飲用水（３０羽の鳥）

【0423】

－７８℃で維持した凍結ストックから細菌株を回収し、ＬＢ寒天上で、３７℃で２４時間培養した。プラスミドのロスを防ぐために、培養物を、抗生物質を含有するＬＢ培養液中に、３７℃で１６時間、１８０ｒｐｍで振とうしながら、１日に１回調製し、次いで、４０００×ｇで１０分間遠心分離した。培地を除去し、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、次いで、ＰＢＳ中で希釈して、ニワトリへの投与のための溶液を得た。

【0424】

並行して、３０羽の鳥の群に、１０^５ＣＦＵ／ｍＬのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ株ＦＳ２６（Ｆｏｌｉｕｍ）０．５ｍｌを、１日目に経口投与した。鳥を、実験の３日目に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのコロニー形成について、ＩＳＯ ６７５９法を使用して総排泄腔スワブによって確認した（１）。実験の５日目に、これらの検証された、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａがコロニー形成した鳥（伝播鳥〔seeder bird〕）のうちの３羽に印を付け、群１～６のそれぞれに加えた。鳥を週に１回秤量し、飼料の消費および死亡率を記録した。

【0425】

各群から１５羽の鳥を、１２日目および１９日目（伝播鳥と混ぜた７日後および１４日後）に安楽死させた。盲腸を、ＩＳＯ ６７５９によってＳａｌｍｏｎｅｌｌａについての検査のために除去した。膝部および足部の印を記録した。１ｇの肝臓および盲腸内容物の試料を液体窒素瞬間冷凍した。

【0426】

群１および群４の各々から３０羽の鳥を次いで、４２日目まで週に１回、挙動および重量について観察し、４２日目に鳥を安楽死させ、上記のように鳥を検査した。

【0427】

結果は、書類に記録するか、または、バイオセキュリティーのある宿泊施設における電話もしくは無線を介して口述し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（商標）に書き写した。データ変換の目的で、細菌が検出されなかった鳥は、１ｇ当たり１細菌の計数値に割り当てた。計数値および重量はｌｏｇ変換し、統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）を使用して行った。データを、ダゴスティーノおよびピアソンのオムニバス正規性検定を使用して分布の正規性について評価し、非正規としては、クラスカル・ウォリス検定とダンの多重比較事後検定とを使用して分析した。鳥の割合における差を、フィッシャーの正確確率検定を使用して分析した。

【0428】

結果
全ての伝播鳥で、３日目までにＳａｌｍｏｎｅｌｌａがコロニー形成した。試験群において感染を伝播させるために使用した鳥は、糞１ｇ当たり＞１０^５ｃｆｕの計数値を有していた。

【0429】

７日目に、群当たり１５羽の鳥を安楽死させ、盲腸内のＳａｌｍｏｎｅｌｌａを測定した（図３）。図４は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが陽性／陰性の鳥を表したデータを示す。

【0430】

Ｓ１７－ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７（最低用量）およびｐＦＳｍｏｂ－Ｃ^＊を投与された鳥は、対照よりも有意に少ない数のＳａｌｍｏｎｅｌｌａを盲腸に有しており（図３）、伝播鳥と混ぜた後７日目に、検出可能なＳａｌｍｏｎｅｌｌａを盲腸に有する可能性が有意に低かった。

【0431】

いずれの群においても死亡は見られなかった。罹患は見られず、高投与量のＳ１７－ｍｏｂＳａｌ７は良く忍容された。鳥を挙動の正および負についてスコア付けしたが、群間で違いは見られなかった。

【0432】

群１および群４の各々から３０羽の鳥を、４２日齢までさらに観察した。この期間でもまた、挙動における有意差は見られなかった。群間の飼料消費は有意には異ならず、重量は、生きている間、測定された群の間で有意には異ならなかった。死後、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、直接計数によっては盲腸において検出不可能であった。膝部または足部の印は観察されなかった。Ｓ１７－ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７群における鳥の死骸重量の中央値は対照群におけるそれよりも２０５ｇ大きく、有意な増大であった（図５）。これは、群間で同等の飼料消費を伴っていたため、Ｓ１７－ｐＦＳｍｏｂＳａｌ７群は、有意に向上した飼料転換率（ＦＣＲ）を有していた。

【0433】

参考文献
ＩＳＯ． ２００７． ＩＳＯ ６５７９：２００７： Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｕｆｆｓ － Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ． （ＩＳＯ ６５７９：２００２＋Ａｍｄ １：２００７）． Ｇｅｎｅｖａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ

【0434】

［実施例５］
条件付き必須遺伝子マーカーを有する非複製性接合性プラスミド
規制上の要件を満たすために、使用される全てのプラスミドは、抗生物質選択マーカーを好ましくは有しておらず、宿主細胞（すなわちキャリア細胞）を除いた、全てではないが大部分の細胞において、非複製性である。プラスミドを非複製性にするために、極めて低コピー数のプラスミドである、宿主範囲の広いプラスミドＲＫ２の複製系を利用する。ＲＫ２の複製は、複製タンパク質、ＲＫ２上のｔｒｆＡによってコードされるＴｒｆＡ、およびプラスミドの増殖起点（ｏｒｉＶ）へのＴｒｆＡの結合の存在に依存し、複製開始のための宿主機構を利用しない。プラスミドからのｔｒｆＡの物理的分離および染色体へのこの遺伝子の組み込みは、宿主によってコードされる機能に依存するＲＫ２ ｏｒｉＶを有するプラスミドを結果として生じさせる。これは、接合を介する送達の後にプラスミドが標的株において活性に複製することを防ぐ。ｔｒｆＡを提供する標的細胞内に同一のＩｎｃＰプラスミドが存在する稀なケースでは、両プラスミドが、利用可能なＴｒｆＡに対して競合し、その結果、１つのプラスミドが失われる。この実施例における本発明者らのプラスミドは、有利な抗生物質耐性マーカーまたは類似のものをさらに有さず、また、プラスミド依存系を欠いているため、このプラスミドは子孫から速やかに失われる。

【0435】

抗生物質耐性の不存在下での選択マーカーとして、芳香族アミノ酸の生合成経路における酵素をコードするａｒｏＡ遺伝子が使用される。これは、宿主細胞が、利用可能な芳香族アミノ酸またはａｒｏＡによって触媒される反応の中間体の不存在下で成長する場合に必須の、条件付き必須遺伝子である。宿主ゲノムからプラスミド骨格へのａｒｏＡ遺伝子の移動は、この選択マーカーをもたらす。染色体のａｒｏＡ遺伝子は、宿主（キャリア細胞）株においてｔｒｆＡのコピーによって置換される。

【0436】

Ｅ．ｃｏｌｉ実験株ＤＨ１０ＢにおけるａｒｏＡのノックアウトおよびｔｒｆＡ発現カセットによる染色体コピーの置換を行って、プラスミドを試験するための試験細菌株を生成する。使用されるｔｒｆＡ発現カセットは、配列番号１０の配列を有する。

【0437】

ニワトリに由来する、最終宿主（キャリア）株である片利共生Ｅ．ｃｏｌｉ単離株を、同一の株構築手順にかける。

【0438】

ａｒｏＡコード配列（配列番号１１）を類似のプロモーターおよびターミネーター領域で増幅し、Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、およびＲＫ２のｏｒｉＶのモジュールと共にプラスミドにアセンブルする。

【0439】

さらに、代替モジュールを、Ｉ型制限酵素を阻害する抗制限遺伝子（Ｔ７のｏｃｒ、ＲＫ２のｋｌｃＡ、接合性プラスミド／トランスポゾンのａｒｄＡ、接合性プラスミドのａｒｄＢ）などこのプラスミド立体構造において試験して、標的細胞に移入した後のＤＮＡの安定性を向上させることができる。

【0440】

さらにまたはあるいは、接合のために存在するＩＶ型分泌系の必須部分をコードするモジュールがプラスミド上に位置するが、それは、これが、プラスミドが存在しない場合に細胞内に存在する非機能的移入系をもたらすためである。宿主細胞による接合を容易にするために、プラスミドＲＫ２上に存在するＩＶ型分泌系が宿主ゲノムに組み込まれる必要がある。この系の必須構成要素は、プラスミドの２つの位置ｔｒａ１およびｔｒａ２にある３つのオペロン内でコードされている。Ｔｒａ１は、ｔｒａＫＬＭオペロンおよびｔｒａＪＸＩＨＧＦオペロンをコードし、ｔｒａ２はｔｒｂＢＣＥＦＧＨＪＬ遺伝子をコードする。組み込みプロセスの間に、ｔｒａＫＬＭオペロンとｔｒａＪＸＩＨＧＦオペロンとの間に位置するｔｒａ１に存在する調節領域が修飾される。この配列は、ＤＮＡの移入開始に関与するＴｒａＪタンパク質への結合部位を有する移入起点（ｏｒｉＴ）を含む。この結合部位が、ＴｒａＪの結合を防ぐための変異生成によって改変されていない場合、接合プロセスの間の染色体ＤＮＡ断片の移入が開始され、望ましくない遺伝情報の移入が生じる。

【0441】

使用されるＲＫ２のｔｒａ１モジュールおよびｔｒａ２モジュールの配列は、配列番号１３および１４に示されている。

【0442】

［実施例６］
抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａプラスミドの構築および試験
概要
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＭＧ１６５５）のＩ－Ｅ型Ｃａｓ系は、侵入する外来の遺伝物質を分解のために標的化する原核生物での適応免疫系を表すＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質系（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）として既知の、ＲＮＡガイド特異的ＤＮａｓｅ機構である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ－Ｅ型カスケード系は、異なるＣａｓタンパク質（ｃａｓＡＢＣＤＥ１２およびｃａｓ３）から構成され、広範なＰＡＭ配列を様々な程度の有効性で認識する。主要なＰＡＭ配列は、５’－ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＴＧ、ＧＡＧ－３’である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２のＩ－Ｅ型Ｃａｓ系を使用して、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種を選択的に除去した。この系を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５におけるように修飾し、ｃａｓタンパク質複合体の主要構成要素は、２つの転写単位、ｃａｓ３およびｃａｓＡＢＣＤＥ１２からそれぞれ発現される。プラスミド構築プロセスの間に導入された修飾は、ｃａｓＡＢＣＤＥオペロンのネイティブな調節されたプロモーターエレメントの、構成的Ｊ２３１１４プロモーターでの交換、ならびに、ｃａｓ１遺伝子およびｃａｓ２遺伝子の、そのネイティブなリボソーム結合部位を含むｃａｓ３遺伝子での置換を含んでいた。これらの変化は、実質的に、構成的に発現されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓモジュールを生じさせ、このモジュールはその後、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種の特異的標的化のためのｃｒＲＮＡアレイの追加によって、機能性について試験された。

【0443】

複製起点（ｏｒｉＶ）および抗生物質選択マーカーが異なる２つのバージョンのＧｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）プラスミドを構築した。得られたプラスミドをｐＦＳ－Ｓａｌ－０８－ｒｍおよびｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍと名付け、接合性ＤＮＡの移入によるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの成長の選択的阻害についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。接合実験において、ｐＦＳ－ＥｃｏＣａｓ３－０１－ｒｍおよびｐＦＳ－ＥｃｏＣａｓ３－０３－ｒｍを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的な成長阻害についての対照プラスミドとして使用した。

【0444】

Ｉ－Ｅ型Ｅ ｃｏｌｉ Ｃａｓ３ならびに同族のｃａｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥをコードするヌクレオチド配列；Ｃａｓ３で操作可能で、Ｓ ｅｎｔｅｒｉｃａのｉｎｖＢ遺伝子の配列に相補的な第１のスペーサー、Ｓ ｅｎｔｅｒｉｃａのｓｉｃＰ遺伝子の配列に相補的な第２のスペーサー、およびＳ ｅｎｔｅｒｉｃａのｓｓｅＥ遺伝子の配列に相補的な第３のスペーサーを含む、ＣＲＩＳＰＲアレイ；ＲＰ４ ｏｒｉＴ；ｐ１５Ａ ｏｒｉ；Ｅ ｃｏｌｉのｐｒｏＡ遺伝子；ならびにＥ ｃｏｌｉのｐｒｏＢ遺伝子をそれぞれ含むプラスミドを構築した。さらなる詳細については、表７を参照されたい。

【0445】

方法論
ｃｒＲＮＡアレイの設計
ＣＲＩＳＰＲスペーサーを設計するための標的遺伝子の選択の焦点を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにとっての主要な病原性因子であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的病原性アイランド（ＳＰＩ）に当てた。選択基準は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ内での保存、ならびに、他の細菌におけるそれぞれの遺伝子の低度から極めて低度の存在および保存であった。これらの分析は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を使用して行った。非Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種におけるヒット数のカットオフは１０００に設定した。保存レベルは、検索によって＞１０００のヒットが生じた場合、高いと見なした。１００から１０００の間は中程度であり、２０から１００の間は低く、＜２０ヒットであれば非常に低い。具体的には、ＳＰＩ－１およびＳＰＩ－２のＩＩＩ型タンパク質分泌系Ｔ３ＳＳに関連する遺伝子を標的として調査し、ただし、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種の間で保存されている遺伝子候補を含めるが、他の細菌種の間で保存されている遺伝子候補は排除するように注意した。まず、検索の焦点は、Ｔ３ＳＳの調節因子および機能的構成要素を避けて、分泌されるエフェクターおよびシャペロンに当てた。

【0446】

３つの選択された高度に保存された遺伝子標的、ｓｉｃＰ、ｉｎｖＢ、およびｓｓｅＥは全て、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病原性アイランド（ＳＰＩ）、すなわち、ｓｉｃＰおよびｉｎｖＢ（共にシャペロン）のケースではＳＰＩ－１、ならびにｓｓｅＥ（分泌されるエフェクター）のケースではＳＰＩ－２によってコードされるＴ３ＳＳ遺伝子座の一部である。これら遺伝子標的は全て、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＬＴ２においてただ１つのコピーに生じ、このことは、一部の株においてこれらが二重にあることを無視することはできないが、全てのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａに当てはまる。

【0447】

候補標的遺伝子（ａ）、およびその後、スペーサー（ｂ）を、Ｂｌａｓｔで検索して、これらがＳａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的であることを確認し、オフターゲットを最小にした。検索はＲｅｆＳｅｑデータベースを使用して行い、これは、約１０６００のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａゲノムを含んでいる。
ａ）遺伝子選択のためのＢｌａｓｔ検索パラメーター：
－ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの保存：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（ｔａｘｉｄ：２８９０１）に制限されたＲｅｆＳｅｑ ＤＢ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、最大ヒット：２００００、標準パラメーター
－ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ外での存在：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（ｔａｘｉｄ：５９０）を除く細菌（ｔａｘｉｄ：２）に制限されたＲｅｆＳｅｑ ＤＢ、Ｂｌａｓｔｎ、最大ヒット１０００、標準パラメーター
ｂ）スペーサー配列のためのＢｌａｓｔ検索パラメーター（ＰＡＭを含む）：
－ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの保存：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（ｔａｘｉｄ：２８９０１）に制限されたＲｅｆＳｅｑ ＤＢ、ｂｌａｓｔｎ、最大ヒット：２００００、標準パラメーター
－ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ外での存在：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（ｔａｘｉｄ：２８９０１）を除く細菌（ｔａｘｉｄ：２）に制限されたＲｅｆＳｅｑ ＤＢ、Ｂｌａｓｔｎ、最大ヒット１０００、標準パラメーターであるが、予想値は、低いが依然として有意な相同性で配列を捕捉するために、１００に設定された。

【0448】

異なるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ遺伝子を標的化する多くのスペーサーを最初にｉｎ ｓｉｌｉｃｏでスクリーニングし、選択し、クローニングし、そして、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＦＳ２６を標的化するそれらの有効性について個別にｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した（標的遺伝子およびスペーサーの選択については概要を、また、Ｒｅｐ－２１：スペーサーレポーター系の構築およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験を参照されたい）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種に対して活性な、３つの最も性能の良いスペーサー配列を選択し、短鎖ｃｒＲＮＡアレイに組み合わせた。スペーサー配列は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病原性アイランド（ＳＰＩ）に存在する３つの高度に保存された遺伝子、ｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、およびｓｓｅＥに由来するものであった。簡潔に述べると、ＤＮＡ制限を開始し得る強力なコンセンサス５’－ＰＡＭ配列の存在を特徴とする制限された潜在的スペーサー配列を選択し、効率的な標的ＤＮＡ制限、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ単離体内での保存、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ外でのＤＮＡ相同性の欠如を伴う配列特徴に従ってランク付けした。これらの基準を満たす３つのスペーサー配列を最後に選択し、機能的ｃｒＲＮＡアレイに組み込んだ。ファイナライズされたｃｒＲＮＡアレイを、標準的なクローニングプラスミド（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に挿入された合成遺伝子配列として並べた。

【0449】

選択された遺伝子の配列は、配列番号２０～２２で示される。各遺伝子において、スペーサーは太字で強調されており、それぞれのＰＡＭはイタリック体で記載されている（ｉｎｖＢのケースでは、スペーサーは負のＤＮＡ鎖（アンチセンス）で選択され、そのため、ＰＡＭはスペーサーの３’側にある）。スペーサーの選択に使用したＰＡＭ配列は、ＡＡＧ、ＡＴＧ、ＡＧＧ、およびＧＡＧであった。スペーサーの、それらのそれぞれのＰＡＭでのＢｌａｓｔ検索を行った（表１０）。

【0450】

非Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａヒットを、それらの保存レベルについてさらに分析した（オフターゲットにおける保存レベルが＜７５％であった場合、スペーサーは許容された）。配列選択はまた、ミスマッチがオフターゲットヒットのどこに位置するかに応じ、保存されたＰＡＭおよびシード（スペーサーの最初の８ｂｐ）を示すものは除外された。本発明者らの選択のための１つのさらなる基準はまた、ヒットが存在した細菌のタイプも含んでおり、病原体に存在する場合、スペーサーは依然として、考えられる候補とみなされた。

【0451】

各スペーサーを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２６を標的化するそれらの有効性について、ｉｎ ｖｉｔｒｏで個別に試験し、その後、これらを、プラスミドｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍに存在するアレイにおいて共に組み合わせた。

【0452】

プラスミドのアセンブリー
相同性に基づくＤＮＡアセンブリーのために、個々のＤＮＡモジュールは、隣接するモジュールに対する正確な相同性を有する５’および／または３’の伸長を有していた。伸長は、モジュールのＰＣＲ増幅ステップの間に導入されたか、または、合成ＤＮＡモジュールの設計の間に組み込まれた。構成的Ｊ２３１１４プロモーターが導入された。

【0453】

ＣａｓＡ～Ｅ：４４６４ｂｐのｃａｓＡ－ｃａｓＢ－ｃａｓＣ－ｃａｓＤ－ｃａｓＥモジュールを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＭＧ１６５５）ゲノムＤＮＡから増幅した。

【0454】

Ｃａｓ３：２７０９ｂｐのＣａｓ３モジュールを増幅した。

【0455】

ｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡアレイモジュールＳａｌ－ｃｒＲＮＡ１（５４６ｂｐ）は、Ｃａｓ３モジュールの３’末端に相同な２５ｂｐの伸長を有する。Ｓａｌ－ｃｒＲＮＡアレイ１の配列は配列番号１５で示され、プロモーターの－１０領域はイタリック体で記載され、直接リピートは下線を引かれ、そしてｉｎｖＢ、ｓｉｃＰ、およびｓｅｅＥの選択されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ標的配列に対応するスペーサー領域は、太字で記載されている。

【0456】

ｐＦＳ－Ｓａｌ－０８－ｒｍおよびｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍの検証および接合によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験
両構築物の配列を確認して、プラスミドを、接合を介してプラスミドの移動を可能にしたキャリア株に形質転換して、Ｃａｓ３系がＳａｌｍｏｎｅｌｌａを選択的に死滅させる有効性を、Ｓａｌ－ｃｒＲＮＡアレイ１の存在下で評価した。この研究において、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｓ１７－１ΔＴｎ７を使用した。１００ｎｇのｐＦＳ－Ｓａｌ－０８－ｒｍおよびｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍを、電気穿孔によるＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１ΔＴｎ７の５０μｌのエレクトロコンピテント細胞の形質転換に使用し、カナマイシンおよびクロラムフェニコールでそれぞれ選択した。両プラスミドでの形質転換によって、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１ ΔＴＮ７の良好な形質転換効率がもたらされた（１０^５～１０^６形質転換ＣＦＵ／ｍＬ）。ｃｒＲＮＡアレイを欠いている対照プラスミド、ｐＦＳ－ＥｃｏＣａｓ３－０１－ｒｍおよびｐＦＳ－ＥｃｏＣａｓ３－０３もまた、Ｓ１７－１ ΔＴｎ７キャリア株に形質転換して、ｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍおよびｐＦＳ－Ｓａｌ－０８－ｒｍのＦＳ２６形質転換における対照として使用した。新たなプラスミドの移動能力を確認するために、Ｓ１７－１キャリア細胞をまず使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞（ナリジクス酸、Ｎａｌ、耐性の）を接合した。表８で報告されている結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９における、ｐＦＳ－ＥｃｏＣａｓ３－０１とｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍとの間、およびｐＦＳ－ＥｃｏＣａｓ３－０３とｐＦＳ－Ｓａｌ－０８－ｒｍとの間での、同様の接合効率を示している。接合効率は、接合完了体（二重抗生物質を有するプレート上で選択された）の数（ＣＦＵ／ｍＬ）をレシピエント（Ｎａｌを有するプレート上で選択された）の数で割って計算される。

【0457】

その後、プラスミドで事前に形質転換したＥ．ｃｏｌｉキャリア株Ｓ１７－１ ΔＴｎ７を使用して、対照プラスミドｐＦＳ－ＥｃｏＣａｓ３－０３－ｒｍと比較したｐＦＳ－Ｓａｌ－０８－ｒｍの接合によるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＦＳ２６の有意な成長阻害、およびｐＦＳ－ＥｃｏＣａｓ３－０１－ｒｍと比較したｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍの接合によるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＦＳ２６の有意な成長阻害があるかどうかを評価した。接合は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１ ΔＴｎ７からナリジクス酸（Ｎａｌ）耐性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＦＳ２６に行った。結果は、それぞれの対照プラスミドと比較した、ｐＦＳ－Ｓａｌ－０８－ｒｍと接合されたＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ株ＦＳ２６およびｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍと接合されたＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ株ＦＳ２６の両方における有意な低減（ＣＦＵ／ｍＬ）を示した（表９）。

【0458】

結論として、この本研究において生成されたＳａｌ－ｃｒＲＮＡアレイ１を有する両プラスミドによるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの成長の阻害は、修飾されたＣａｓモジュールが機能的であり、Ｉ－Ｅ型カスケード複合体、Ｃａｓ３ヌクレアーゼ、およびｃｒＲＮＡアレイという個々の構成要素の全てを、非標的Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株であるＳ１７－１およびＪＭ１０９の成長に負の影響を与えることなく発現し得たことを示した。本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｉ－Ｅ型 Ｃａｓ系に基づくプラスミドの、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１キャリア株からＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ株ＦＳ２６に接合によって移入される能力を実証した。本発明者らは、使用した対照と比較した、ｐＦＳ－Ｓａｌ－０８－ｒｍおよびｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｒｍの両方の接合を介する、選択された株のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ接合完了体における有意な成長阻害（＞９９．９％）を観察した。これらのデータは、したがって、これらのＥ．ｃｏｌｉ Ｉ－Ｅ型カスケードに基づく構築物の、例えば人畜共通感染症の制御のために、望ましくない細菌を除去する可能性を強調した。

【0459】

［実施例７］
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを含有する飼料を与えられたニワトリにおける、Ｆｏｌｉｕｍ Ｅ．ｃｏｌｉに基づく生成物の安定性および有効性の試験。
実施例４において、本発明者らは、Ｓ１７株のＥ ｃｏｌｉキャリア細胞に含まれるＧｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）プラスミドを試験した。この本実施例７において、本発明者らはその代わりとして、Ｅ ｃｏｌｉキャリアの異なる株（株Ｘ）に含まれるＧｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）プラスミド（ＧＢプラスミドｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｐｒｏＡＢ－ｒｍ、実施例６および表７）を試験した。ヘルパープラスミドｐＣｏｎ＿ａｒｏＡは、宿主細胞からレシピエント細胞への、ｏｒｉＴを含むプラスミドの移動を容易にすることがｉｎ ｖｉｔｒｏで分かっている、プラスミドＲＰ４（ｔｒａＪＸＩＨＧＦ－ｔｒａＫＬＭ－ｔｒｂＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬ）の接合機構の機能的コピーを有していた。

【0460】

研究の目的
－ 飲用水中のＧｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）でのＥ．ｃｏｌｉ株Ｘの安定性を２４時間にわたり判定する。
－ 飼料中で与えられたＳａｌｍｏｎｅｌｌａでの腸および臓器内の汚染を測定する。
－ 飼料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａでチャレンジされたニワトリにおける、活性なＧＢプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ株Ｘの有効性を判定する。

【0461】

概要
－ Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｘは、安定剤を含有する脱イオン水に投与した直後に、５×ｌｏｇ－８ＣＦＵ／ｍＬの予想レベルであることが分かり、２４時間で８×ｌｏｇ－７ＣＦＵ／ｍＬまで低下した。
－ ２４時間の飼料でのチャレンジ（飼料１ｇ当たり１０^４ＣＦＵ）の後、低レベル（約ｌｏｇ－２～５ＣＦＵ／ｇ）のＳａｌｍｏｎｅｌｌａが、チャレンジ後１日目、３日目、および７日目に、素嚢および盲腸で見られた。より低いレベル（約ｌｏｇ－１ＣＦＵ／ｇ）もまた、チャレンジの７日後に、回腸内容物、肝臓、および脾臓で見られた。
－ 活性なＧｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）、活性なＧＢプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ株Ｘは、チャレンジの７日後に、素嚢におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ数を約ｌｏｇ－１ＣＦＵ／ｇ低減させた（Ｐ＜０．０３）。

【0462】

方法論
Ｒｏｓｓ ３０８鳥（３０羽）を、制御されたバイオセキュリティーのある条件下で飼育し、水および標準的な市販の飼料を自由摂取させた。各実験群は、おがくずの床敷を敷いた個別の檻で保持した。鳥には、１８時間の明期／６時間の暗期のレジメンを与えた。温度および湿度は、表１１に示す標準的なレベルの間で維持した。

【0463】

処置群：
－ 低対照－ 水への添加物なし、７日目に、飼料１ｇ当たり１０^４ＣＦＵのＳａｌｍｏｎｅｌｌａを２４時間（１５羽の鳥）
－ ＧＢ－Ｓａｌ－ １～１４日目に飲用水中に１０^８ＣＦＵ／ｍＬの活性なＧＢプラスミド（ｐＦＳ－Ｓａｌ－０９－ｐｒｏＡＢ－ｒｍ）を含むＥ．ｃｏｌｉ株Ｘ Ｇｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）、７日目に、飼料１ｇ当たり１０^４ＣＦＵのＳａｌｍｏｎｅｌｌａを２４時間（１５羽の鳥）

【0464】

Ｇｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）株を、－７８℃で維持した凍結ストックから毎日回収し、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を加えたＬＢ寒天で、２４時間、３７℃で培養した。活性なＧＢプラスミド株を有する株ＸをＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液中に準備し、１８０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で１６時間成長させた。ＯＤ_６００を測定して細胞数を推定した後、細胞を遠心分離し、安定剤を含有する脱イオン水中に再懸濁して、ニワトリに投与するための溶液を得た（飲用水中で１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）。青の染料を含有するＶａｃ Ｐａｃを、試料採取の日に、回収の３時間前に含めて、水およびＧＢの摂取を確認した。添加物を有する水試料を、試験４～１４日目のＧＢの添加時点および２４時間後に回収し、ＧＢを測定した。水試料をＰＢＳ中に１０倍希釈し、次いで、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天第３番（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ０１１５）に播種し、次いで、３７℃で２４時間インキュベートした。

【0465】

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株（ＦＳ２６、ナリジクス酸マーカーを伴う）を、－７８℃で維持した凍結ストックから回収し、ＬＢ寒天上で、３７℃で２４時間培養した。試験培養物をＬＢ培養液中に、３７℃で１６時間、１８０ｒｐｍで振とうしながら、１日に１回調製した。ＯＤ_６００を測定して細胞数を推定した後、細胞を遠心分離し、リン酸緩衝食塩水中に再懸濁および希釈して、１×１０^７ＣＦＵ／ｍｌの溶液を得、これを、飼料を十分に混合しながら、飼料１００ｇに対して１ｍｌの細菌懸濁液の割合で飼料に滴下した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ含有量を測定するために、４つの飼料試料を回収した。

【0466】

動物試料の回収および播種
鳥の死亡は記録されなかった。照明レベル、床敷の追加、温度、湿度、および飼育密度を記録し、これらは処置間で異ならなかった。１日目および３日目に各群から得た３羽の鳥を、ならびにチャレンジ後７日目の９羽の鳥を安楽死させ、素嚢、回腸、盲腸、肝臓、および脾臓から試料を得た。安楽死、死亡、および解剖の時刻を記録した。羽毛は、水を噴霧して濡らした。鳥を使い捨てのメスで開き、このメスは開いた後に廃棄し、手袋は交換した。１ｇの肝臓、ならびに素嚢、回腸、および盲腸の内容物の試料を採取し、液体窒素中で瞬間冷凍した。メスは、各臓器を採取する度に廃棄した。試料を、９倍容積のリン酸緩衝食塩水中でホモジナイズし、リン酸緩衝食塩水中で１０倍希釈し、そして、寒天を３７℃で１６～１８時間インキュベートして調べた。直接播種が陰性であった試料を、９倍容積のセレナイト・シスチン培養液（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ０６９９）中で、３７℃で１６～１８時間濃縮することによって、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａについて調べた。濃縮された培養液をその後、表１２に示す抗生物質を含有するＸＬＤ寒天（ＣＭ０４６９）上に筋状に載せ、３７℃で１６～１８時間インキュベートした。

【0467】

直接計数で細菌が検出されなかった鳥は、１ｇ当たり０細菌という計数値に割り当て、一方、直接計数は陰性であったが増強した方法では陽性であった鳥は、５０ＣＦＵ／ｇに割り当てた。結果は、書類に記録するか、または、バイオセキュリティーのある宿泊施設における電話もしくは無線を介して口述し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに書き写した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて分析した。データを、ダゴスティーノおよびピアソンのオムニバス正規性検定を使用して分布の正規性について評価し、非正規としては、マン・ホイットニーのＵ検定を使用して分析した。対応のあるデータを、対応のあるＴ検定を使用して分析した。

【0468】

結果
１．飼料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
－ 飼料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（平均９×ｌｏｇ－４ＣＦＵ／ｇ）の存在は予想通りであった。

【0469】

２．飲用水中のＧｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）レベル
－ 混合直後の飲用水中の分析されたＧＢレベル（平均５×ｌｏｇ－８ＣＦＵ／ｍＬ）は計画通りであった。２４時間後に採取された試料では、８×ｌｏｇ－７ＣＦＵ／ｍＬへの平均の低下が確認された。

【0470】

３．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ用量の効果
－ 全体として、低レベルのＳａｌｍｏｎｅｌｌａが、チャレンジ後１日目および３日目に素嚢（約ｌｏｇ１～３ＣＦＵ／ｇ）および盲腸（約ｌｏｇ４～５ＣＦＵ／ｇ）で見られた。回腸、肝臓、または脾臓の試料では、これらの時点で、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは見られなかった。
－ チャレンジ後７日目に、同様のレベルのＳａｌｍｏｎｅｌｌａが素嚢および盲腸で再び見られ、また、より低いレベル（約ｌｏｇ１）が回腸、肝臓、および脾臓で見られた。

【0471】

４．活性なＧｕｉｄｅｄ Ｂｉｏｔｉｃ（登録商標）の効果（対照対ＧＢ）
－ ＧＢは、チャレンジの７日後の素嚢におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ数を低減させた（Ｐ＜０．０３）（図６）。

【0472】

－ ３日目の素嚢（Ｐ＝０．４０）および盲腸（Ｐ＝０．５０）で、ならびに７日目の回腸（Ｐ＝０．５８）および盲腸（Ｐ＝０．６０）で、ＧＢがＳａｌｍｏｎｅｌｌａを低減させる弱い傾向があった。

【0473】

【表5】

【0474】

【表6】

【0475】

【表7】

【0476】

【表8】

【0477】

【表9】

【0478】

【表10】

【0479】

【表11】

【0480】

【表12】

【0481】

【表13】

【0482】

【表14】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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