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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-16
(45)【発行日】2025-01-24
(54)【発明の名称】ＣＤ２５抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20250117BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250117BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250117BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250117BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250117BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250117BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P37/06
C07K16/28
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2023528409
(86)(22)【出願日】2021-11-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-30
(86)【国際出願番号】 US2021059068
(87)【国際公開番号】W WO2022104009
(87)【国際公開日】2022-05-19
【審査請求日】2023-07-26
(31)【優先権主張番号】63/113,784
(32)【優先日】2020-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/524,852
(32)【優先日】2021-11-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522441541
【氏名又は名称】アイバイオ， インク．
【氏名又は名称原語表記】ｉＢｉｏ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】バリガ ラメシュ
(72)【発明者】
【氏名】プレスタ レオナード ジョージ
(72)【発明者】
【氏名】ジップ フング トゥ
(72)【発明者】
【氏名】デーノ－レーズア ハナコ
(72)【発明者】
【氏名】ザリッキ ピオトル ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】グリノビク オレグ
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／１０２５９１（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １６／４６
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３７／０６
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ １５／６３
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ２５に結合するヒト化ＣＤ２５抗体であって、配列番号１０の可変重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１１の可変重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２の可変重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号１３の可変軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の可変軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５の可変軽鎖ＣＤＲ３とを含み、かつ、
１）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号２の２番目のＶ残基、５番目のＶ残基、７番目のＳ残基、１１番目のＶ残基、１２番目のＫ残基、１３番目のＫ残基、１６番目のＡ残基、１８番目のＶ残基、２０番目のＶ残基、２４番目のＡ残基、４０番目のＡ残基、４１番目のＰ残基、４２番目のＧ残基、４３番目のＱ残基、４４番目のＧ残基、４８番目のＭ残基、６１番目のＡ残基、６５番目のＱ残基、６７番目のＲ残基、６８番目のＶ残基、７２番目のＲ残基、７４番目のＴ残基、７６番目のＴ残基、７９番目のＶ残基、８１番目のＭ残基、８４番目のＳ残基、８５番目のＳ残基、８７番目のＲ残基、８９番目のＥ残基、９１番目のＴ残基、及び９３番目のＶ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号８の７番目のＳ残基、８番目のＰ残基、１５番目のＶ残基、４０番目のＰ残基、４３番目のＡ残基、４５番目のＫ残基、４８番目のＩ残基、７０番目のＤ残基、７２番目のＴ残基、７４番目のＴ残基、７６番目のＳ残基、８４番目のＡ残基、８５番目のＴ残基、及び１００番目のＱ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、
２）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号２の２番目のＶ残基、５番目のＶ残基、７番目のＳ残基、１１番目のＶ残基、１２番目のＫ残基、１３番目のＫ残基、１６番目のＡ残基、１８番目のＶ残基、２０番目のＶ残基、２４番目のＡ残基、４０番目のＡ残基、４１番目のＰ残基、４２番目のＧ残基、４３番目のＱ残基、４４番目のＧ残基、４８番目のＭ残基、６１番目のＡ残基、６５番目のＱ残基、６７番目のＲ残基、６８番目のＶ残基、７２番目のＲ残基、７４番目のＴ残基、７６番目のＴ残基、７９番目のＶ残基、８１番目のＭ残基、８４番目のＳ残基、８５番目のＳ残基、８７番目のＲ残基、８９番目のＥ残基、９１番目のＴ残基、及び９３番目のＶ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号９の４８番目のＶ残基、及び８４番目のＧ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、
３）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号３の２４番目のＧ残基、７２番目のＶ残基、及び７９番目のＡ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号８の７番目のＳ残基、８番目のＰ残基、１５番目のＶ残基、４０番目のＰ残基、４３番目のＡ残基、４５番目のＫ残基、４８番目のＩ残基、７０番目のＤ残基、７２番目のＴ残基、７４番目のＴ残基、７６番目のＳ残基、８４番目のＡ残基、８５番目のＴ残基、及び１００番目のＱ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、
４）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号３の２４番目のＧ残基、７２番目のＶ残基、及び７９番目のＡ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号９の４８番目のＶ残基、及び８４番目のＧ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、
５）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号４の１８番目のＬ残基、２０番目のＩ残基、２４番目のＧ残基、４８番目のＩ残基、６８番目のＡ残基、７２番目のＶ残基、７９番目のＡ残基、及び８１番目のＬ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号８の７番目のＳ残基、８番目のＰ残基、１５番目のＶ残基、４０番目のＰ残基、４３番目のＡ残基、４５番目のＫ残基、４８番目のＩ残基、７０番目のＤ残基、７２番目のＴ残基、７４番目のＴ残基、７６番目のＳ残基、８４番目のＡ残基、８５番目のＴ残基、及び１００番目のＱ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、
６）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号４の１８番目のＬ残基、２０番目のＩ残基、２４番目のＧ残基、４８番目のＩ残基、６８番目のＡ残基、７２番目のＶ残基、７９番目のＡ残基、及び８１番目のＬ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号９の４８番目のＶ残基、及び８４番目のＧ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、
７）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号５の２４番目のＧ残基、７２番目のＶ残基、７４番目のＫ残基、及び７９番目のＡ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号８の７番目のＳ残基、８番目のＰ残基、１５番目のＶ残基、４０番目のＰ残基、４３番目のＡ残基、４５番目のＫ残基、４８番目のＩ残基、７０番目のＤ残基、７２番目のＴ残基、７４番目のＴ残基、７６番目のＳ残基、８４番目のＡ残基、８５番目のＴ残基、及び１００番目のＱ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、
８）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号５の２４番目のＧ残基、７２番目のＶ残基、７４番目のＫ残基、及び７９番目のＡ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号９の４８番目のＶ残基、及び８４番目のＧ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、
９）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号６の１８番目のＬ残基、２０番目のＩ残基、２４番目のＧ残基、４８番目のＩ残基、６８番目のＡ残基、７２番目のＶ残基、７４番目のＫ残基、７９番目のＡ残基、及び８１番目のＬ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号８の７番目のＳ残基、８番目のＰ残基、１５番目のＶ残基、４０番目のＰ残基、４３番目のＡ残基、４５番目のＫ残基、４８番目のＩ残基、７０番目のＤ残基、７２番目のＴ残基、７４番目のＴ残基、７６番目のＳ残基、８４番目のＡ残基、８５番目のＴ残基、及び１００番目のＱ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含むか、あるいは、
１０）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号６の１８番目のＬ残基、２０番目のＩ残基、２４番目のＧ残基、４８番目のＩ残基、６８番目のＡ残基、７２番目のＶ残基、７４番目のＫ残基、７９番目のＡ残基、及び８１番目のＬ残基を有する可変重鎖アミノ酸配列と、
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号９の４８番目のＶ残基、及び８４番目のＧ残基を有する可変軽鎖アミノ酸配列とを含む、
前記ヒト化ＣＤ２５抗体。
【請求項2】
ヒトＣＤ２５及びカニクイザルＣＤ２５に結合する、請求項１に記載のヒト化ＣＤ２５抗体。
【請求項3】
ヒトＣＤ２５及びカニクイザルＣＤ２５への結合のＥＣ５０比が０．７５～１．２５である、請求項２に記載のヒト化ＣＤ２５抗体。
【請求項4】
脱フコシル化されている、請求項１～３のいずれかに記載のヒト化ＣＤ２５抗体。
【請求項5】
請求項１～４に記載のヒト化ＣＤ２５抗体のいずれかを１つを含む医薬組成物。
【請求項6】
請求項１～４に記載のヒト化ＣＤ２５抗体のいずれか１つをコードする核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項8】
請求項１～４に記載のヒト化ＣＤ２５抗体のいずれか１つ又は請求項５に記載の医薬組成物を含む、それを必要とする対象の治療剤。
【請求項9】
請求項１～４に記載のヒト化ＣＤ２５抗体のいずれか１つ又は請求項５に記載の医薬組成物を含む、対象における制御性Ｔ細胞の数の枯渇剤。
【請求項10】
対象ががんを患っている、請求項８又は９に記載の剤。
【請求項11】
対象が自己免疫関連疾患又は障害を患っている、請求項８又は９に記載の剤。
【請求項12】
末梢血単核細胞を含む試料における制御性Ｔ細胞の数を枯渇させるための、ヒト化ＣＤ２５抗体の使用であって、前記試料を請求項１～４に記載のヒト化ＣＤ２５抗体のいずれか１つ又は請求項５に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、前記使用。
【請求項13】
請求項１～４に記載のヒト化ＣＤ２５抗体のいずれか１つ又は請求項５に記載の医薬組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月１３日出願の米国仮出願第６３／１１３，７８４号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１１月１３日出願の米国仮出願第６３／１１３，７８４号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、全体として、ＭＨＣクラスII制限Ｔ細胞受容体の分野、より詳細には、ＫＲＡＳ Ｇ１２＞Ｖ活性化変異に特異的なＴ細胞受容体に関する。
【0003】
コンパクトディスクによる提出材料の参照による組み込み
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介し、ＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１１月１１日に作成された、前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＲＵＢＲ２００２ＷＯ．ｔｘｔと命名され、１０，９５６バイトのサイズである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介し、ＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１１月１１日に作成された、前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＲＵＢＲ２００２ＷＯ．ｔｘｔと命名され、１０，９５６バイトのサイズである。
【背景技術】
【0004】
ＣＤ２５は、インターロイキン－２（ＩＬ－２，interleukin-2）受容体のアルファ鎖であり、制御性Ｔ細胞及び活性化Ｔ細胞上に存在する膜貫通タンパク質である。正常な状態では、制御性Ｔ細胞はＣＤ２５を恒常的に発現し、エフェクターＴ細胞の増大を抑制するように働く。制御性Ｔ細胞は健康な状態を維持し、エフェクターＴ細胞が自己抗原に対して反応すること又は外来性抗原に過剰反応することを阻害する。正常な防御免疫応答では、エフェクターＴ細胞は外来性抗原との接触後に増加し、制御性Ｔ細胞による阻害を克服する。しかし、増殖性疾患の場合では、がん細胞は、制御性Ｔ細胞の量を上昇させ、それによってがん細胞に対するエフェクターＴ細胞の生成を制限することによって、健常な免疫応答を無効化する。例えば、がん療法での使用のために上記の免疫系を弱めるには、又は自己免疫疾患での使用のために上記の免疫系を上方制御するには、ＣＤ２５発現制御性Ｔ細胞の増殖を変更するさらなる分子ツールが必要である。本明細書ではかかるツールが提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本明細書では、ＣＤ２５に特異的に結合するヒト化抗体（本明細書では抗ＣＤ２５抗体及びＣＤ２５抗体と互換的に呼ばれる）が提供される。一部の実施形態では、抗体はヒト化されている。また、本明細書では、記載される抗体の使用方法及び作製方法が提供される。例えば、ＣＤ２５抗体は、がんを治療するために治療目的で使用することができ、それを必要とする対象に抗体又はその医薬組成物を投与するステップを含む。また、本明細書に記載されているＣＤ２５抗体を産生する方法も提供される。
【0006】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒトＣＤ２５に結合するヒト化抗体であって、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含む、ヒト化抗体に関する。一態様では、抗体が、配列番号２の可変重鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８若しくは９の可変軽鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはさらには９９％の配列同一性を含む配列を含む。別の態様では、抗体が、配列番号３の可変重鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８若しくは９の可変軽鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはさらには９９％の配列同一性を含む配列を含む。別の態様では、抗体が、配列番号４の可変重鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８若しくは９の可変軽鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはさらには９９％の配列同一性を含む配列を含む。別の態様では、抗体が、配列番号５の可変重鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８若しくは９の可変軽鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはさらには９９％の配列同一性を含む配列を含む。別の態様では、抗体が、配列番号６の可変重鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８若しくは９の可変軽鎖アミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはさらには９９％の配列同一性を含む配列を含む。
【0007】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒト化ＣＤ２５抗体であって、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５のＣＤＲ配列を含む可変軽鎖を含み、抗体が、配列番号８及び配列番号９における１又は２以上の太字体の残基を含めて、フレームワーク領域に対する１又は２以上の変異をさらに含む、ヒト化ＣＤ２５抗体に関する。
【0008】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒト化ＣＤ２５抗体であって、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２のＣＤＲ配列を含む可変重鎖を含み、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６における１又は２以上の太字体の残基を含めて、フレームワーク領域に対する１又は２以上の変異をさらに含む、ヒト化ＣＤ２５抗体に関する。
【0009】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒト化ＣＤ２５抗体であって、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２のＣＤＲ配列を含む可変重鎖を含み、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６における１又は２以上の太字体の残基を含めて、フレームワーク領域に対する１又は２以上の変異をさらに含み；かつ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５のＣＤＲ配列を含む可変軽鎖をさらに含み、上記抗体が、配列番号８及び配列番号９における１又は２以上の太字体の残基を含めて、フレームワーク領域に対する１又は２以上の変異をさらに含む、ヒト化ＣＤ２５抗体に関する。別の態様では、抗体がヒトＣＤ２５及びカニクイザルＣＤ２５に結合する。別の態様では、ヒトＣＤ２５及びカニクイザルＣＤ２５への結合のＥＣ５０比は、約０．７５～約１．２５である。別の態様では、抗体が脱フコシル化されている。
【0010】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒトＣＤ２５に結合するヒト化抗体を含む医薬組成物であって、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含む、医薬組成物に関する。
【0011】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒトＣＤ２５に結合するヒト化抗体をコードする核酸配列であって、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含む、核酸配列に関する。
【0012】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒトＣＤ２５に結合するヒト化抗体の核酸配列を含むベクターであって、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含む、ベクターに関する。
【0013】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒトＣＤ２５に結合するヒト化抗体の治療有効量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする前記対象を治療する方法であって、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含む、方法に関する。
【0014】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒトＣＤ２５に結合するヒト化抗体の治療有効量を対象に投与するステップを含む、前記対象において制御性Ｔ細胞の数を枯渇させる方法であって、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列若しくはそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列又はそれの医薬組成物、を含む、方法に関する。一態様では、対象ががんを患っている。別の態様では、対象が自己免疫関連疾患又は障害を患っている。
【0015】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、末梢血単核細胞を含む試料をヒトＣＤ２５に結合するヒト化抗体と接触させるステップを含む、上記試料中の制御性Ｔ細胞の数を枯渇させる方法であって、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含む、方法に関する。
【0016】
本明細書で具体化され広く記載されるように、本開示の一態様は、ヒトＣＤ２５に結合するヒト化抗体を含むキットであって、抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含み；かつ、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列若しくはそれと少なくとも７０％の配列同一性を含む配列又はそれの医薬組成物、を含む、キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
本出願は、添付の図面と結びつけられた以下の説明を参照することによって理解することができる。
【図2】図２は、別々の２つの製造バッチにわたる、Ｄ１１及び本開示のＤ１１バリアントのＴａｇｇに関するナノＤＳＦベースの測定を示す。より低温では有意な凝集は検出されず、ヒト化バリアントについてのＴａｇｇは、出発点のＤ１１についてのＴａｇｇよりも全体として高かった。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書では、ＣＤ２５に特異的に結合する抗体が提供される。抗体は、ヒトのもの、キメラのもの又はヒト化のものとすることができる。また、本明細書では、記載される抗体の使用方法及び作製方法も提供される。例えば、ＣＤ２５抗体は、がんを治療するために治療目的で使用することができ、それを必要とする対象に抗体又はその医薬組成物を投与するステップを含む。また、本明細書に記載されているＣＤ２５抗体を産生する方法も提供される。
【0019】
定義
本明細書において別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験に当たり、本明細書に記載されている方法及び材料と類似の又は等価である任意の方法及び材料を使用することができるが、例示的な方法及び材料について記載する。
本明細書において別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験に当たり、本明細書に記載されている方法及び材料と類似の又は等価である任意の方法及び材料を使用することができるが、例示的な方法及び材料について記載する。
【0020】
本明細書で提供される見出しは、本発明の種々の態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、直下に定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってより完全に定義される。
【0021】
数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。
【0022】
抗体という用語には、本明細書で使用されるように、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体、一価抗体及び抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片、又はｓｃＦＶ）が含まれる。また、本明細書では、ＣＤ２５に対して特異性を呈する抗体薬物複合体、二重特異性抗体及び多重特異性抗体も提供される。非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）は、従来の技法を使用して（例えば、フレームワーク領域に変化を導入し、一方、マウスＣＤＲを保持することによって）「ヒト化」される場合もある。
【0023】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すが、これは、リボヌクレオチドであってもデオキシリボヌクレオチドであってもよい。こういった用語には、それらに限定されないが、一本鎖、二本鎖若しくは多重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいは、プリン塩基及びピリミジン塩基、又はその他の天然の、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然の又は誘導体化された各ヌクレオチド塩基を含むポリマー、が含まれる。上記用語は、特に限定又は記述されてない限り、天然ヌクレオチドの既知のアナログ含有し、類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、核酸を包含する。
【0024】
ある核酸配列又はアミノ酸配列が、別の核酸配列又はアミノ酸配列と、ある特定のパーセントの「配列同一性」若しくは「同一性」を有すると言われるか又はあるパーセント「同一」である場合、配列同士がアライメントされる場合、２つの配列を比較すると、そのような百分率の塩基又はアミノ酸は、同一であり、かつ、同一の相対位置にある。
【0025】
「個体」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、治療又は療法が望まれる任意の対象を指す。対象は哺乳動物の対象とすることができる。哺乳動物の対象には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、有蹄動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ等）等が含まれる。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、対象は愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ）である。
【0026】
抗体
本明細書では、ＣＤ２５に特異的に結合するヒト化抗体が提供される。抗体は、単独での、又は、ＣＤ２５抗原が他の分子と会合して通常は制御性Ｔ細胞上に存在する高親和性ＩＬ－２受容体を形成する場合でのいずれかで、ＣＤ２５抗原に結合することができる。
本明細書では、ＣＤ２５に特異的に結合するヒト化抗体が提供される。抗体は、単独での、又は、ＣＤ２５抗原が他の分子と会合して通常は制御性Ｔ細胞上に存在する高親和性ＩＬ－２受容体を形成する場合でのいずれかで、ＣＤ２５抗原に結合することができる。
【0027】
本開示のＣＤ２５抗体は、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭの各抗体のいずれかとすることができる。ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２抗体とすることができる。ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の各抗体とすることができる。これらの抗体のいずれかの組合せを作製し、使用することもできる。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ型のもの、例えばヒトＩｇＧ型のものである。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ１型のもの、例えばヒトＩｇＧ１型のものである。
【0028】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、２つ以上の種に対して交差反応性を呈し、例えば、ヒトＣＤ２５と非ヒトＣＤ２５の両方に特異的に結合し、例えば、ヒトＣＤ２５とカニクイザルＣＤ２５の両方に特異的に結合する。例示的な実施形態では、ヒトＣＤ２５とカニクイザルＣＤ２５の両方に対する結合親和性はおよそ等しい。一部の実施形態では、ヒト化ＣＤ２５抗体がヒトＣＤ２５及びカニクイザルＣＤ２５に結合する結合のＥＣ５０比は、約０．７５～約１．２５、又は約０．８～約１．２、又は約０．９～約１．１である。一部の実施形態では、この比は概１である。
【0029】
本明細書で提供される抗体の親和定数（ＫＤ，affinity constant）は、約１０－５ｎＭ～約１０－１４ｎＭの範囲とすることができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体のＫＤは、約１０－８ｎＭ～約１０－１２ｎＭの範囲である。例示的な実施形態では、ＣＤ２５抗体のＫＤは、少なくとも約１０－５ｎＭ、約１０－６ｎＭ、約１０－７ｎＭ、約１０－８ｎＭ、約１０－９ｎＭ、約１０－１０ｎＭ、約１０－１１ｎＭ、約１０－１２ｎＭ、約１０－１３ｎＭ、又はさらに約１０－１４ｎＭである。
【0030】
本明細書で提供される抗体の解離速度定数（Ｋｄ，off-rate constant）は、約１０－２１／ｓ～約１０－６１／ｓの範囲とすることができる。
【0031】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、生理的ｐＨ（約７．４）と非生理的ｐＨの両方でＣＤ２５抗原に対して同じ親和性（ＫＤ）を呈する。一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、生理学的ｐＨ（約７．４）と非生理学的ｐＨの両方でＣＤ２５抗原に対して同じ解離速度（Ｋｄ）を呈する。
【0032】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、生理的ｐＨ（約７．４）と非生理的ｐＨでＣＤ２５抗原に対して異なる親和性（異なるＫＤ）を呈する。一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、生理学的ｐＨ（約７．４）と非生理学的ｐＨで、ＣＤ２５抗原に対して異なる解離速度定数（異なるＫｄ）を呈する。
【0033】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、生理的ｐＨ（約７．４）よりも低いｐＨにてよりも、例えばｐＨが７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、又はそれ未満である場合よりも、生理的ｐＨ（約７．４）にてＣＤ２５抗原に対して低い親和性（高いＫＤ）を呈する。例示的な実施形態では、抗体は、約７．４のｐＨにての親和性と比較した場合、約６．５のｐＨにてのＣＤ２５抗原に対してより高い親和性を呈する。一部の実施形態では、かかる抗体は、酸性環境、低酸素環境、例えば腫瘍微小環境において、活性を保持するために又は増強された活性を呈するために有用である。
【0034】
一部の実施形態では、抗体は、非ＩＬ－２遮断抗体（非ＩＬ－２ブロッカー）である － すなわち、ＣＤ２５への抗体の結合は、ＣＤ２５（ＩＬ－２アルファ鎖）へのＩＬ－２リガンドの結合を妨害せず又は妨げず、かつ、ＩＬ－２媒介シグナル変換に、例えばＩＬ－２／ＪＡＫ３／ＳＴＡＴ－５シグナル伝達経路を通したシグナル伝達に、影響を及ぼさない。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５（ＩＬ－２アルファ鎖）へのＩＬ－２リガンドの結合を妨害せず、かつ、７Ｇ７Ｂ６抗体が結合するものとは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５（ＩＬ－２アルファ鎖）へのＩＬ－２リガンドの結合を妨害しないが、ＩＬ－２受容体のベータ、ガンマ、及びアルファ（ＣＤ２５）各鎖の三量体化を妨害する。
【0035】
一部の実施形態では、抗体は、ＩＬ－２遮断抗体（ＩＬ－２ブロッカー）であり、例えば、抗体は、受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、及び／又はガンマ鎖へのＩＬ－２リガンドの結合を妨害し又は妨げ、かつ、ＩＬ－２媒介シグナル変換を低下させる又は阻害する。ある特定の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ－２リガンドの結合を妨害する又は妨げる。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ－２リガンドの結合を妨害し又は妨げ、かつ、ダクリズマブ又はバシリキシマブのいずれかが結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。
【0036】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、部分的に遮断する抗体（部分的ＩＬ－２ブロッカー）であり、部分的に、完全にではないが、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のアルファ鎖、ベータ鎖、及び／又はガンマ鎖へのＩＬ－２リガンドの結合を妨害し、及び／又は部分的に、完全にではないが、ＩＬ－２媒介シグナル変換を低下させる。
【0037】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、アルファ、ベータ、及びガンマのＩＬ－２鎖のヘテロ三量体化を妨害する又は妨げる。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５とのＩＬ－２リガンドの結合を遮断しないが、アルファ、ベータ、及びガンマのＩＬ－２鎖のヘテロ三量体化を妨害する又は妨げる。ある特定の実施形態では、抗体は制御性Ｔ細胞に選択的に結合する。他の実施形態では、抗体はＴエフェクター細胞に選択的に結合する。
【0038】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体の結合は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇をもたらすが、一方、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ，effector T cell）の増大を可能にする。
【0039】
一部の実施形態では、抗体はトランス配向でＣＤ２５に結合する。他の実施形態では、抗体はシス配向でＣＤ２５に結合する。なおさらなる実施形態では、抗体は、シス配置又はトランス配置のいずれかでＣＤ２５に結合することができる。
【0040】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５への７Ｇ７Ｂ６（マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ受容体を有する抗ヒトＣＤ２５；ＩＬ－２非ブロッカー；BioXcell社）の結合と比較して、ＣＤ２５に対してより大きな結合親和性を呈する。
【0041】
本明細書に記載されるＣＤ２５抗体の例示的な配列を下の表に提供する。留意されるべきこととは、示されている相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity determining region）配列及びフレームワーク（ＦＲ，framework）配列は、抗体のアノテーションに関するＩＭＧＴ規約に基づいていることである。しかし、当業者であれば、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａなどの、抗体アノテーション用の他のアルゴリズム／慣例を使用して、提示されたＶＨ配列及びＶＬ配列に基づいてＣＤＲ配列及びフレームワーク配列の他の明確な表現を決定することができる。したがって、本開示のＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、下の表においてアノテーションされた例示的なＣＤＲ配列及びＦＲ配列に限定されず、それよりも、可変領域の配列を考慮すると、当業者により理解され、決定されるようなＣＤＲである。
【0042】
ヒト化ＣＤ２５抗体バリアントを本明細書で創り出した。親（元の）マウスＣＤ２５抗体は、国際公開第２０２０／１０２５９１号パンフレットからのＤ１１であった。Ｄ１１を選択し、ヒトＩｇＧ１を含有するように再フォーマットし、バリアントの次世代用の親クローンとして使用した。
【0043】
親Ｄ１１の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号７として提供する。本開示は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６のいずれかの１つアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はさらには９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｄ１１のさらなるＶＨバリアント配列を提供する。本開示はまた、配列番号８及び配列番号９のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、さらには９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｄ１１のさらなるＶＬバリアント配列も提供する。一部の実施形態では、抗体は脱フコシル化されている。
【0044】
親Ｄ１１の可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列Ｄ１１ ＶＨ（配列番号１）を、表１に示す。これに、それの例示的なヒト化バリアントのアミノ酸配列が続く：ｈＤ１１－Ｈ１（配列番号２）；ｈＤ１１－Ｈ２（配列番号３）；ｈＤ１１－Ｈ３（配列番号４；全体を通してｈＤ１１－Ｈ３ｈとも互換的に呼ばれる）；ｈＤ１１－Ｈ２ｂ（配列番号５；及びｈＤ１１－Ｈ３ｂ（配列番号６）。すぐ上のアミノ酸配列と比較して、下線が引かれた残基はＣＤＲ配列であり、太字体の残基は改変された残基である。
【0045】
【表1】
【0046】
親Ｄ１１の可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列Ｄ１１－ＶＬ（配列番号７）を表２に示すこれに、それのヒト化バリアントのアミノ酸配列が続く：ｈＤ１１－Ｌ１（配列番号：８）；及びｈＤ１１－Ｌ２（配列番号９）。直前のアミノ酸配列と比較して、下線が引かれた残基はＣＤＲ配列であり、太字体の残基は改変された残基である。
【0047】
【表2】
【0048】
したがって、一部の実施形態では、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２の可変重鎖ＣＤＲ配列を含み、ヒト化及び／又は安定化されたＣＤ２５抗体が提供される。ヒト化及び／又は安定化向けに選択される残基には、それらに限定されないが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６における１又は２以上の太字体の残基が含まれる。
【0049】
一部の実施形態では、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５の可変軽鎖ＣＤＲ配列を含み、ヒト化及び／又は安定化されたＣＤ２５抗体が提供される。ヒト化及び／又は安定化向けに選択される残基には、それらに限定されないが、配列番号８及び配列番号９における１又は２以上の太字体の残基が含まれる。
【0050】
一部の実施形態では、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２の可変重鎖ＣＤＲ配列、並びに、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５の可変軽鎖ＣＤＲ配列を含むＣＤ２５抗体が提供され、抗体がヒト化及び／又は安定化されている。ヒト化及び／又は安定化向けに選択される残基には、それらに限定されないが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、及び配列番号９における１又は２以上の太字体の残基が含まれる。一部の実施形態では、抗体が脱フコシル化されている。
【0051】
ヒト化ＣＤ２５抗体の例示的な抗体ＶＨ＋ＶＬの組合せを下の表３に提供する。
【0052】
【表3】
【0053】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体はコンジュゲートされており、それらに限定されないが、療法及び検出／診断を始めとする様々な目的に有用である。
【0054】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体はフコシル化されている。
【0055】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は脱フコシル化されている。一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は脱フコシル化されており、細胞、例えば制御性Ｔ細胞においてより高いＡＤＣＣ活性をもたらす。
【0056】
また、本明細書では、本明細書で提供されるＣＤ２５抗体のいずれか１つをコードする核酸配列も提供される。また、本明細書では、抗体をコードする核酸のいずれかを１つを含むベクター、かかるベクターを含むファージ、及びかかるベクターを含む宿主細胞も提供される。
【0057】
抗体の生成及び試験
本明細書に記載されているＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５の完全免疫原又は部分免疫原を動物に、例えばマウス又はウサギに注射し、続いてそれをヒト化することによって生成することができる。動物からＣＤ２５免疫原陽性Ｂ細胞を収集し、これからファージライブラリを生成することができる。一部の実施形態では、ファージは候補ＣＤ２５抗体のＦａｂ断片を発現させる。ファージは、例えば連続的により低濃度のＣＤ２５抗原に対して、複数回のスクリーニング（本明細書ではファージパニングと呼ばれる）をうけて、さらなる変形形態に向けて選択されるべく、高親和性でＣＤ２５に結合することができるそのようなＦａｂ断片を選択することができる。ファージは、例えば、ＣＤ２５抗原でコーティングされたビーズ又は他のいくつかの基質に対してスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、スクリーニングは生理学的ｐＨ（例えば約ｐＨ７．４）で行われる。他の実施形態では、スクリーニングを、より低いｐＨで、例えば、約６．５のｐＨで行って、例えば、治療背景での使用のために、例えば低酸素、酸性の腫瘍微小環境での使用のために、より低いｐＨでＣＤ２５抗原に結合することができるＦａｂ断片をスクリーニングすることができる。
本明細書に記載されているＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５の完全免疫原又は部分免疫原を動物に、例えばマウス又はウサギに注射し、続いてそれをヒト化することによって生成することができる。動物からＣＤ２５免疫原陽性Ｂ細胞を収集し、これからファージライブラリを生成することができる。一部の実施形態では、ファージは候補ＣＤ２５抗体のＦａｂ断片を発現させる。ファージは、例えば連続的により低濃度のＣＤ２５抗原に対して、複数回のスクリーニング（本明細書ではファージパニングと呼ばれる）をうけて、さらなる変形形態に向けて選択されるべく、高親和性でＣＤ２５に結合することができるそのようなＦａｂ断片を選択することができる。ファージは、例えば、ＣＤ２５抗原でコーティングされたビーズ又は他のいくつかの基質に対してスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、スクリーニングは生理学的ｐＨ（例えば約ｐＨ７．４）で行われる。他の実施形態では、スクリーニングを、より低いｐＨで、例えば、約６．５のｐＨで行って、例えば、治療背景での使用のために、例えば低酸素、酸性の腫瘍微小環境での使用のために、より低いｐＨでＣＤ２５抗原に結合することができるＦａｂ断片をスクリーニングすることができる。
【0058】
本明細書で生成されるＣＤ２５抗体は、いくつかのインビトロでの、インビボでの、エクスビボでの、及び／又は細胞ベースでのアッセイを使用して有効性について試験することができる。
【0059】
一部の実施形態では、本明細書のＣＤ２５抗体を、制御性Ｔ細胞を枯渇させる能力についてアッセイし、その能力に基づいてさらに選択することができる。特定の実施形態では、本明細書のＣＤ２５抗体を、酸性環境において、例えば生理的ｐＨよりも低いｐＨで、例えばｐＨ７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、又はそれ未満で、制御性Ｔ細胞を枯渇させる能力についてアッセイし、その能力に基づいてさらに選択することができる。
【0060】
一部の実施形態では、本明細書のＣＤ２５抗体を、ｐＳＴＡＴ５のインビトロでのアッセイについてアッセイし、これに基づいてさらに選択して、ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体経路を通したシグナル伝達についてアッセイすることができるが、このシグナル伝達の維持が指示するところは、この抗体はＩＬ－２遮断抗体ではないことである。
【0061】
一部の実施形態では、本明細書のＣＤ２５抗体を、バイオセンサースクリーニングを使用して分子相互作用を特徴づけることについて、アッセイすることができる。
【0062】
一部の実施形態では、本明細書のＣＤ２５抗体を、既知のメカニズムによる、結合に当たっての既知の他のＣＤ２５抗体との競合についてアッセイすることができる。
【0063】
一部の実施形態では、本明細書のＣＤ２５抗体をエピトープ特異性についてアッセイすることができる。
【0064】
一部の実施形態では、本明細書のＣＤ２５抗体を、非ＩＬ－２ブロッカー、ＩＬ－２ブロッカー、又は部分的ＩＬ－２ブロッカーであるそれらのキャパシティについてアッセイすることができる。
【0065】
治療用途
本明細書では、治療用途のための、例えばがんなどの増殖性疾患若しくは障害での使用のための、又は自己免疫疾患での使用のための、ＣＤ２５抗体が提供される。
本明細書では、治療用途のための、例えばがんなどの増殖性疾患若しくは障害での使用のための、又は自己免疫疾患での使用のための、ＣＤ２５抗体が提供される。
【0066】
したがって、本明細書では、治療用ＣＤ２５抗体の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がんを治療する方法が提供される。一部の実施形態では、がんは原発がんである。一部の実施形態では、がんは転移性がんである。一部の実施形態では、がんには固形腫瘍が関係する；他の実施形態では、がんには液性腫瘍、例えば血液ベースのがんが関係する。例示的な実施形態では、ＣＤ２５抗体は非ＩＬ－２遮断抗体である。
【0067】
したがって、本明細書では、治療用ＣＤ２５抗体の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む自己免疫関連疾患又は障害を治療する方法が提供される。例示的な実施形態では、ＣＤ２５抗体はＩＬ－２遮断抗体である。
【0068】
本明細書で使用される場合、対象とは、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、それには、ヒト、飼育動物及び家畜、並びに動物園用、スポーツ用、又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコ等が含まれる。対象は雄性であっても雌性であってもよい。
【0069】
本明細書で提供される治療用ＣＤ２５抗体のいずれかの投与は、既知の他の薬物／治療（例えば、小分子薬又は生物製剤と組合せで、行ってもよい。投与は逐次的であっても同時的であってもよい。
【0070】
本明細書に記載される治療用ＣＤ２５抗体のインビボでの投与は、静脈内に、腫瘍内に、頭蓋内に、病変内に（例えば、病変内注射、直接的接触拡散）、腔内（腹腔内、胸膜内、子宮内、直腸内）、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、移植により、吸入により、髄腔内に、脳室内に、又は鼻腔内に、実行することができる。例示的な実施形態では、投与経路は静脈内注射によるものである。
【0071】
治療用抗体の治療有効量が投与される。治療用抗体の適当な投薬量は、がんの重症度、対象の臨床状態、対象の病歴及び治療に対する応答、並びに主治医の裁量に基づいて決定することができる。
【0072】
本明細書で提供されるＣＤ２５抗体の投薬量は、投与経路に応じて、１日当たり対象の体重１ｋｇにつき約１ｎｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇまで又はそれ超で変動することができる。数日以上にわたる反復投与の場合、がんの重症度に応じて、症状に関して所望の抑制が達成されるまで治療を維持することができる。投薬レジメンは、医師が達成することを望む薬物動態学的減衰のパターンに応じて、有用とすることができる。例えば、１週間につき１回～２１回、個体に投薬することが本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、投薬頻度は、１日当たり３回、１日当たり２回、１日当たり１回、２日毎に１回、週１回、２週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回、６週間毎に１回、７週間毎に１回、８週間毎に１回、９週間毎に１回、１０週間毎に１回、又は月１回、２か月毎に１回、３か月毎に又はそれ超で１回である。療法の進行は、従来の技法及びアッセイによってモニタリングすることができる。投薬レジメンは、使用される用量とはかかわりなく、経時的に変動してもよい。
【0073】
診断用途
本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、診断及び検出の目的で使用することができる。用途に応じて、ＣＤ２５抗体はインビボで又はインビトロで検出及び定量化することができる。
本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、診断及び検出の目的で使用することができる。用途に応じて、ＣＤ２５抗体はインビボで又はインビトロで検出及び定量化することができる。
【0074】
本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、様々なイムノアッセイでの使用のために補正可能である。そういったイムノアッセイには、それらに限定されないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ，radioimmunoassay）、フローサイトメトリー、あるラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、分光光度法、ラジオグラフィー、電気泳動、高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ，high performance liquid chromatography）、又は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ，thin layer chromatography）が含まれる。
【0075】
本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、検出可能な標識、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的、蛍光性、電気的、光学的、又は化学的方法により検出可能な標識を含むことができる。本開示での有用な標識には、それらに限定されないが、蛍光色素、放射標識、酵素、比色標識、アビジン又はビオチンが含まれる。
【0076】
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、核医学装置（ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、又はシンチグラフィー）による画像化するために有用な同位元素で放射標識される。
【0077】
医薬組成物
本開示は、治療用ＣＤ２５抗体を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は無菌である。医薬組成物は、全体として、薬学的に許容される賦形剤中に治療用抗体の有効量を含む。
本開示は、治療用ＣＤ２５抗体を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は無菌である。医薬組成物は、全体として、薬学的に許容される賦形剤中に治療用抗体の有効量を含む。
【0078】
キット及び製品
本開示はまた、例えば、治療用途又は診断用途のいずれか向けの、本明細書に記載されるＣＤ２５抗体のいずれか１つを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、二次抗体、免疫組織化学解析用の試薬、薬学的に許容される賦形剤、及び使用説明書のいずれか、並びにそれらの任意の組合せから選択される構成要素をさらに含有する。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるいずれかの１又は２以上の治療用組成物を、１又は２以上の薬学的に許容される賦形剤と共に含む。
本開示はまた、例えば、治療用途又は診断用途のいずれか向けの、本明細書に記載されるＣＤ２５抗体のいずれか１つを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、二次抗体、免疫組織化学解析用の試薬、薬学的に許容される賦形剤、及び使用説明書のいずれか、並びにそれらの任意の組合せから選択される構成要素をさらに含有する。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるいずれかの１又は２以上の治療用組成物を、１又は２以上の薬学的に許容される賦形剤と共に含む。
【0079】
本出願はまた、本明細書に記載される治療用若しくは診断用組成物又はキットのいずれか１つを含む製品を提供する。製品の例としては、バイアル（例えば、密封バイアル）が挙げられる。
【0080】
本明細書に提供される説明は、多数の例示的な構造、方法、及びパラメータ等を記載するものである。しかし、かかる説明は、本開示の範囲への限定として意図されるものではなく、例示的な実施形態の一説明として代えて提供されるものであることを、理解されたい。
【0081】
以下の実施例は、例示的な目的のために含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例］
［実施例］
【実施例1】
【0082】
ＣＤ２５抗体バリアントの生成
ＢａｌｂＣマウスに尾静脈で完全長ヒトＣＤ２５を注射した。免疫プロトコル及びその後の選択及び結果として得られる抗体の特性評価については、国際公開第２０２０／１０２５９１号パンフレットに記載されており、その内容はその全体が参照により組み込まれる。
ＢａｌｂＣマウスに尾静脈で完全長ヒトＣＤ２５を注射した。免疫プロトコル及びその後の選択及び結果として得られる抗体の特性評価については、国際公開第２０２０／１０２５９１号パンフレットに記載されており、その内容はその全体が参照により組み込まれる。
【0083】
国際公開第２０２０／１０２５９１号パンフレットからのＦａｂ、Ｄ１１、を選択し、ヒトＩｇＧ１を含有するように再フォーマットし、バリアントの次世代用の親クローンとして使用した。ヒト化バリアントを創り出した。本明細書に提供されるデータでは、元のＤ１１、又は親Ｄ１１、又は単にＤ１１への言及は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと配列番号１を含む可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列と配列番号７を含む可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列とを備える抗体を指す。
【0084】
表１に、親Ｄ１１の可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列Ｄ１１ ＶＨ（配列番号１）と、これに続いて、これのヒト化バリアントのアミノ酸配列：ｈＤ１１－Ｈ１（配列番号２）；ｈＤ１１－Ｈ２（配列番号３）；ｈＤ１１－Ｈ３（配列番号４）；ｈＤ１１－Ｈ２ｂ（配列番号５）；及びｈＤ１１－Ｈ３ｂ（配列番号６）、を示す。すぐ上のアミノ酸配列と比較して、下線が引かれた残基はＣＤＲ配列であり、太字体の残基は改変された残基である。
【0085】
表２に、親Ｄ１１の可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列Ｄ１１－ＶＬ（配列番号７）と、これに続いて、これのヒト化バリアントのアミノ酸配列：ｈＤ１１－Ｌ１（配列番号８）；及びｈＤ１１－Ｌ２（配列番号９）を示す。直前のアミノ酸配列と比較して、下線が引かれた残基はＣＤＲ配列であり、太字体の残基は改変された残基である。
【0086】
本明細書に記載される抗体の特性評価及びアッセイの場合、表４に記述のように、以下の抗体を使用した。
【0087】
【表4】
【実施例2】
【0088】
ＣＤ２５抗体バリアントの特性評価
チロシン残基及びフェニルアラニン残基を使用してタンパク質の自家蛍光を測定するPrometheus NT.Plex nanoDSF機器を使用して、抗体の融解挙動（Ｔｍ，melting behavior）及び凝集挙動（Ｔａｇｇ，aggregation behavior）を測定した。Prometheus NT.Plex High Sensitivityキャピラリー（Ｃａｔ．ＰＲ－ＡＣ００６）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４で希釈した抗体０．２ｍｇ／ｍＬにての試料、１０μｌ／キャピラリーをロードし、二回繰り返しでランさせた。温度範囲は、７５分間かけて１℃／分で、２０～９５℃の勾配とした。蛍光を３３０ｎｍ、３５０ｎｍで検出し、比３５０／３３０ｎｍの変曲点を使用してＴｍを決定した。凝集光学により散乱光の測定が可能になり、後方散乱光の変曲点を使用してＴａｇｇｒを決定した。図１は、別々の４つの製造バッチにわたる、Ｄ１１及び本開示のＤ１１バリアントのＴｍに関するナノＤＳＦベースの測定を示す。バリアントは、Ｄ１１と比較した場合、より高いＴｍの傾向を示す。図２は、別々の２つの製造バッチにわたる、Ｄ１１及び本開示のＤ１１バリアントのＴａｇｇに関するナノＤＳＦベースの測定を示す。より低温では有意な凝集は検出されず、ヒト化バリアントについてのＴａｇｇは出発点のＤ１１についてのＴａｇｇよりも全体として高かった。
チロシン残基及びフェニルアラニン残基を使用してタンパク質の自家蛍光を測定するPrometheus NT.Plex nanoDSF機器を使用して、抗体の融解挙動（Ｔｍ，melting behavior）及び凝集挙動（Ｔａｇｇ，aggregation behavior）を測定した。Prometheus NT.Plex High Sensitivityキャピラリー（Ｃａｔ．ＰＲ－ＡＣ００６）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４で希釈した抗体０．２ｍｇ／ｍＬにての試料、１０μｌ／キャピラリーをロードし、二回繰り返しでランさせた。温度範囲は、７５分間かけて１℃／分で、２０～９５℃の勾配とした。蛍光を３３０ｎｍ、３５０ｎｍで検出し、比３５０／３３０ｎｍの変曲点を使用してＴｍを決定した。凝集光学により散乱光の測定が可能になり、後方散乱光の変曲点を使用してＴａｇｇｒを決定した。図１は、別々の４つの製造バッチにわたる、Ｄ１１及び本開示のＤ１１バリアントのＴｍに関するナノＤＳＦベースの測定を示す。バリアントは、Ｄ１１と比較した場合、より高いＴｍの傾向を示す。図２は、別々の２つの製造バッチにわたる、Ｄ１１及び本開示のＤ１１バリアントのＴａｇｇに関するナノＤＳＦベースの測定を示す。より低温では有意な凝集は検出されず、ヒト化バリアントについてのＴａｇｇは出発点のＤ１１についてのＴａｇｇよりも全体として高かった。
【0089】
ヒト化抗体ｈＤ１１－Ｈ３ｈ－Ｌ２は、ほとんどのものよりも高いＴａｇｇを示したが、このことが指示するところは、優れた安定性及び凝集への耐性である。
【0090】
ヒト化Ｄ１１バリアントの純度及び凝集の程度に関するｕＰＬＣベースの測定を、Chromeleon（登録商標）（バージョン７．３）ソフトウェアによってランされるDionex UltiMate（登録商標）3000-RS UHPLCシステムを使用して実施した。２８℃にてのサイズ排除カラムTSKgel UP-SW3000、２μｍ、４．６ｍｍ ＩＤ×１５ｃｍ（Tosoh社）を使用して、抗体を分離した。移動相は、５０ｍｍｏｌリン酸一ナトリウム、３００ｍｍｏｌ塩化ナトリウム、５％アセトニトリルとした；ｐＨ６．５、流速０．２ｍＬ／分のイソクラティックモードでランさせた。タンパク質は、２８０ｎｍにてＵＶ吸光度を使用して検出した。全ての試料は、２０．０μＬの容量で０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で注入した。図３は、別々の４つの製造バッチにわたる、Ｄ１１及び本開示のＤ１１バリアントの純度及び凝集に関するｕＰＬＣベースの測定の結果を示す。データが裏付けるところは、シングルステップ精製での９０％を超える純度にてＤ１１及びバリアントの一貫した精製である。下の表５は表形式のデータを示す。
【0091】
【表5】
【実施例3】
【0092】
細胞結合アッセイ
細胞上のＣＤ２５への抗体の結合及び特異性について検証するために、２つの細胞株、ＳＵＤＨＬ－１（ヒト大型びまん性組織球性リンパ腫細胞株（ＡＴＣＣ，human large diffuse histiocytic lymphoma cell line））及びＳＲ７８６細胞（未分化大細胞型Ｔ細胞リンパ腫細胞）を使用して、ＣＤ２５結合について試験した。双方ともＣＤ２５発現細胞株である。各細胞株について、１００，０００個の細胞を、９６ウェル丸底プレートに細胞緩衝剤（ＰＢＳ＋２％ＨＩ ＦＢＳ）でプレーティングし、遠心分離した。１～１０ｕｇ／ｍＬの抗体濃度を使用して、各抗体の結合について試験した。細胞を、抗体１００ｕＬ／ウェル中に再懸濁し、氷上で２０分間、インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、３００×ｇ、室温で５分間、遠心分離し、氷冷の細胞緩衝剤を用いて再懸濁及び洗浄した。次いで、細胞を、AF647にコンジュゲートされた抗ヒトＦｃ二次抗体（Biolegend社）で染色し、暗闇中、氷上で２０分間、インキュベートした。細胞を遠心分離し、洗浄し、DAPIを含む冷細胞緩衝剤中で洗浄及び再懸濁し、フローサイトメトリー（Cytoflex、Becton Dickinson社）を使用して解析した。DAPI＋細胞を解析から除外した。平均蛍光強度を、中央値を使用して計算した（FlowJo、TreeStar社）。
細胞上のＣＤ２５への抗体の結合及び特異性について検証するために、２つの細胞株、ＳＵＤＨＬ－１（ヒト大型びまん性組織球性リンパ腫細胞株（ＡＴＣＣ，human large diffuse histiocytic lymphoma cell line））及びＳＲ７８６細胞（未分化大細胞型Ｔ細胞リンパ腫細胞）を使用して、ＣＤ２５結合について試験した。双方ともＣＤ２５発現細胞株である。各細胞株について、１００，０００個の細胞を、９６ウェル丸底プレートに細胞緩衝剤（ＰＢＳ＋２％ＨＩ ＦＢＳ）でプレーティングし、遠心分離した。１～１０ｕｇ／ｍＬの抗体濃度を使用して、各抗体の結合について試験した。細胞を、抗体１００ｕＬ／ウェル中に再懸濁し、氷上で２０分間、インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、３００×ｇ、室温で５分間、遠心分離し、氷冷の細胞緩衝剤を用いて再懸濁及び洗浄した。次いで、細胞を、AF647にコンジュゲートされた抗ヒトＦｃ二次抗体（Biolegend社）で染色し、暗闇中、氷上で２０分間、インキュベートした。細胞を遠心分離し、洗浄し、DAPIを含む冷細胞緩衝剤中で洗浄及び再懸濁し、フローサイトメトリー（Cytoflex、Becton Dickinson社）を使用して解析した。DAPI＋細胞を解析から除外した。平均蛍光強度を、中央値を使用して計算した（FlowJo、TreeStar社）。
【0093】
図４は、本開示のＤ１１バリアントの結合が、親Ｄ１１と比較した場合、ＣＤ２５発現ＳＵＤＨＬ１細胞への結合に当たり、差異を呈示しないことを示す。図５は、本開示のＤ１１バリアントの結合が、Ｄ１１と比較した場合、ＣＤ２５発現ＳＲ７８６細胞への結合に当たり、差異を呈示しないことを示す。結合については市販の対照抗体、７６７Ｂ６、ダクリズマブ、及びバシリキシマブとも比較したが、有意差は観察されなかった。
【実施例4】
【0094】
組換えカニクイザルＣＤ２５へのＣＤ２５抗体の結合
組換えカニクイザル（ｃｙｎｏ，cynomolgus monkey）ＣＤ２５との結合について試験するために、マイクロタイタープレートを、５０ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ９．６）に含まれる１ｕｇ／ｍｌのＣｙｎｏ ＣＤ２５の８０ｕｌで、４℃で、一晩、コーティングした。翌日、ウェルから上記タンパク質を除去し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％tween20 ２００ｕｌで遮断した。プレートを、室温で１時間、インキュベートした。抗体を、２５ｎＭで開始し、ＰＢＴ緩衝剤で３倍段階で希釈し、ＲＴにての１時間のインキュベーション向けにプレートへ添加した。次いで、プレートを洗浄し、次いで、１：２５００希釈のＨＲＰコンジュゲート型抗Ｆａｂ抗体を添加した。プレートをＰＢＳ／tween20で５～１０回、洗浄して、非特異的結合剤を除去した。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液を添加し、発色させるのに必要とされる時間の間、インキュベートし、その終了時にＥＬＩＳＡ停止溶液８０ｕＬを添加した。次いで、ＯＤ測定値を、プレートリーダー（SpectraMax iD3 Plate Reader、Molecular Devices社）を使用して４５０ｎＭにて取得した。
組換えカニクイザル（ｃｙｎｏ，cynomolgus monkey）ＣＤ２５との結合について試験するために、マイクロタイタープレートを、５０ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ９．６）に含まれる１ｕｇ／ｍｌのＣｙｎｏ ＣＤ２５の８０ｕｌで、４℃で、一晩、コーティングした。翌日、ウェルから上記タンパク質を除去し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％tween20 ２００ｕｌで遮断した。プレートを、室温で１時間、インキュベートした。抗体を、２５ｎＭで開始し、ＰＢＴ緩衝剤で３倍段階で希釈し、ＲＴにての１時間のインキュベーション向けにプレートへ添加した。次いで、プレートを洗浄し、次いで、１：２５００希釈のＨＲＰコンジュゲート型抗Ｆａｂ抗体を添加した。プレートをＰＢＳ／tween20で５～１０回、洗浄して、非特異的結合剤を除去した。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液を添加し、発色させるのに必要とされる時間の間、インキュベートし、その終了時にＥＬＩＳＡ停止溶液８０ｕＬを添加した。次いで、ＯＤ測定値を、プレートリーダー（SpectraMax iD3 Plate Reader、Molecular Devices社）を使用して４５０ｎＭにて取得した。
【0095】
図６は、Ｄ１１バリアントＨ３ｈ－Ｌ２（Ｈ３－Ｌ２）が、ヒトＣＤ２５とカニクイザルＣＤ２５の両方と、交差反応性を維持することを示す。表６は、ｃｙｎｏ／ヒトの結合比と共にそれの定量化を示す。Ｄａｃはダクリズマブを表す。比は、ｃｙｎｏ又はヒトＣＤ２５いずれかへの結合における優先性を指示する。バリアントＨ３ｈ－Ｌ２（Ｈ３－Ｌ２）は等しい交差反応性を示すが、一方、他のバリアントはどちらか一方の種（例えばバリアントＨ１－Ｌ２）に対して明瞭な優先性を示す。
【0096】
【表6】
【実施例5】
【0097】
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ，Antibody-dependent cell cytotoxicity）
機能細胞キリングアッセイＡＤＣＣ
Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）枯渇についてのメカニズムの一つは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を通してのものである。これは、標的細胞上の特定の抗原に結合した抗体への免疫／エフェクター細胞の認識により作動される、細胞死を通常には引き起こす、細胞媒介性免疫防御メカニズムである。ＡＤＣＣを誘発するために、ヒトＦｃサブクラスを有する抗体、ＩｇＧ１が、以下の３つのＦｃ受容体に結合する能力を有するそれのエフェクター機能について一般に選択される：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦＣγＲII（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲIIIＡ（ＣＤ１６）、これらはＮＫ細胞、単球及び顆粒球などの免疫細胞上で発現される。ＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIＡを優勢に発現し、ＡＤＣＣにおける主要なエフェクター細胞であるとされている。
機能細胞キリングアッセイＡＤＣＣ
Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）枯渇についてのメカニズムの一つは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を通してのものである。これは、標的細胞上の特定の抗原に結合した抗体への免疫／エフェクター細胞の認識により作動される、細胞死を通常には引き起こす、細胞媒介性免疫防御メカニズムである。ＡＤＣＣを誘発するために、ヒトＦｃサブクラスを有する抗体、ＩｇＧ１が、以下の３つのＦｃ受容体に結合する能力を有するそれのエフェクター機能について一般に選択される：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦＣγＲII（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲIIIＡ（ＣＤ１６）、これらはＮＫ細胞、単球及び顆粒球などの免疫細胞上で発現される。ＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIＡを優勢に発現し、ＡＤＣＣにおける主要なエフェクター細胞であるとされている。
【0098】
ＡＤＣＣを、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ，Lactate dehydrogenase）細胞毒性プレートベースの比色アッセイ（Thermo Fisher社）を使用して定量化した。本アッセイでは、ＬＤＨの放出は、細胞死の量と比例する。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、全ての細胞に存在する細胞質酵素であり、原形質膜が損傷される場合に放出される。培地中の細胞外ＬＤＨは共役酵素反応により定量化されるが、この場合、ＬＤＨが、ＮＡＤＨへのＮＡＤ＋還元を介してピルベートへのラクテートの変換を触媒する。ジアホラーゼの添加により、ＮＡＤＨは、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ，tetrazolium salt）へと還元されて、４９０ｎｍで測定することができるホルマザン生成物を形成する。アッセイ用の対照には、ヒトＲａｊｉリンパ腫細胞株上でのリツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）及びＳＵＤＨＬ－１細胞上でのダクリズマブの使用が含まれる（双方の抗体がＡＤＣＣを誘導すると知られている）。さらなる対照には：陰性対照として非グリコシル化ヒトＩｇＧ１、及び陽性対照として、非フコシル化ヒトＩｇＧ１が含まれ得る。第１の最初のスクリーニングとして、再フォーマット化クローンを、ＡＤＣＣアッセイにおいて、１つの濃度（１０ｕｇ／ｍＬ）で、単一のドナー由来のＰＢＭＣを使用して、試験した。ヒトＰＢＭＣ（ASTARTE Biologics社）を、前日に解凍し、X-VIVO 15又は20培地（Lonza社）を用いて、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で一晩、培養した。実験の当日、ＰＢＭＣ及びＳＵＤＨＬ－１標的細胞を、カウントし、X-VIVO 15（Lonza社、フェノールレッド）無血清培地中に再懸濁した。抗体希釈物を、１０ｕｇ／ｍｌから開始して５倍の段階希釈で調製した。次いで、標的細胞を、９６ウェル白色平底不透明プレート（CORNING社 Ref#3917）において９６ウェル５０μＬ／ウェルでプレーティングし、抗体希釈物１０μＬ／ウェルを、標的細胞へ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３０分間、インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを標的細胞へ添加した（５０μＬ／ウェル）。自発性及び最大ＬＤＨ放出計算用の対照標的細胞の場合、アッセイ培地（X-VIVO15、フェノールレッドなし）５０μＬ／ウェルを添加した。共インキュベーション（ＡＤＣＣ誘導）を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間、プレートをインキュベートすることにより行い、共インキュベーションが完了する４５分前に、１０％Triton X100溶液（ＰＢＳ中）をウェルに添加して最大ＬＤＨ放出を計算した（１０μＬ／ウェル、１１×希釈比）。インキュベーション後、反応基質５０μＬ／ウェルを、９６ウェルプレート（透明平底）にプレーティングし、次いで、アッセイプレートの上清５０μＬ／ウェルを反応基質へ移した。プレートを、暗闇中、ＲＴで３０分間、発色させた。インキュベーション後、停止溶液５０μＬ／ウェルを添加し、吸光度４９０ｎｍ及び６８０ｎｍを、プレートリーダー（SpectraMax iD3 Plate Reader、Molecular Devices社）を使用することにより測定した。
【0099】
図７は、本開示のＤ１１バリアントが、Ｄ１１と比較した場合、がん細胞においてＡＤＣＣ活性の差異を呈示しないことを示し、このことによって、一般的な問題として、その機能性が維持されていることが示されている。
【0100】
表８が示すところは、制御性Ｔ細胞で試験した場合、ある特定のＤ１１バリアントはより高いＡＤＣＣ活性を呈することである。Ｄ１１－Ｈ３ｈ－Ｌ２及びＤ１１－Ｈ３ｂ－Ｌ２などのある特定のバリアント抗体は、Ｄ１１親抗体及び７Ｇ７Ｂ６と比較した場合、より高いＡＤＣＣ活性（より低いＥＣ５０）を呈した。
【0101】
【表7】
【0102】
図８が示すところは、さらに、キフネンシンを含有する細胞培養培地中で産生され、その結果、抗体の脱フコシル化がもたらされる場合、脱フコシル化Ｄ１１は、より高いＴｒｅｇ ＡＤＣＣ活性（Ｄ１１ ｋｉｆ）を呈することである。アッセイは、３８４ウェルプレートで２０，０００個の細胞／ウェルで実行した。
【0103】
機能的抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ，antibody-dependent cell phagocytosis）アッセイも行って、抗体が結合する場合のマクロファージがＴｒｅｇ細胞を貪食する活性を試験することができる。これは、Ｔｒｅｇ枯渇についてのさらなる作用メカニズムとすることができる。マクロファージ上のＦｃ受容体ＦＣγＲIIａ（ＣＤ３２ｂ）は、ＡＤＣＰについての優勢な誘導因子であると考えられる。本アッセイでは、一次Ｔｒｅｇが、エフェクター細胞としてのヒト単球由来マクロファージと共に標的細胞として使用される。ＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社）を使用する単球分離用に、並びにRegulatory Human CD4+CD25+ T cell kit（Dynabeads社）及びHuman Treg Cell Differentiation kit（R&D Systems社）を使用するＴｒｅｇ用に、ＰＢＭＣを白血球除去システムチャンバー（Stanford Blood Center社）から分離する。単球を、培地中のヒト血清又はＭ－ＣＳＦと共に５～７日間、培養する。５～７日目に、マクロファージを、１０：１のエフェクター：標的比で、事前標識されたＴｒｅｇ（固定可能な生死判別色素（Invitrogen社）で標識された）と共に、抗ＣＤ２５抗体及び対照が添加された状況で、２～４時間、共培養し、固定化緩衝剤（BD Biosciences社）で固定する。標識Ｔｒｅｇからマクロファージを特定するために、マクロファージをＣＤ１４に関して染色し、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ１４＋として定義される食作用性集団及びＴｒｅｇ標識＋集団について解析する。抗ＣＤ２５抗体は、ＡＤＣＰも誘導することが予想される。
【実施例6】
【0104】
ＣＤ２５抗体の機能特性評価
インビトロでの特性評価
次いで行われるインビトロでの特性評価には、Ｔｒｅｇ細胞の非存在下及び存在下における、Ｔエフェクター細胞応答へのＣＤ２５抗体の影響を評価するためのＴ細胞活性化及びＴｒｅｇ抑制の研究が含まれ得る。活性化についての読み取りには、細胞内グランザイムＢ、増殖及びサイトカイン放出（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α）が含まれ得る。具体的には、健康なドナー及び特定の抗原応答（例えば、ヒトサイトメガロウイルス又はインフルエンザフル抗原）を有するドナー由来のヒト一次通常型Ｔ細胞（Ｔ ｃｏｎｖ細胞，T conv cell）を、細胞増殖色素（例えば、ThermoFisher社）で標識し、様々な濃度のＣＤ２５抗体及び対照抗体（１～１０ｕｇ／ｍＬ）で処理し、これに続いて、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化し、Ｔｒｅｇありで又はＴｒｅｇなしで、３７℃、５％ＣＯ２で４８～７２時間のインキュベーション向けに、インキュベートする。Ｔ細胞活性化を評価するために、上清を、サイトカイン解析向けに収集し、固定可能な生死判別色素（例えば、Thermofisher社）で及び表面抗ヒトＴ細胞マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２５で細胞を染色し、これに続いて、細胞内グランザイムＢ及びＦｏｘｐ３の染色向けに固定及び透過処理を行う。細胞を、グランザイムＢ陽性細胞及び増殖性細胞についてフローサイトメトリーを使用して解析する。
インビトロでの特性評価
次いで行われるインビトロでの特性評価には、Ｔｒｅｇ細胞の非存在下及び存在下における、Ｔエフェクター細胞応答へのＣＤ２５抗体の影響を評価するためのＴ細胞活性化及びＴｒｅｇ抑制の研究が含まれ得る。活性化についての読み取りには、細胞内グランザイムＢ、増殖及びサイトカイン放出（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α）が含まれ得る。具体的には、健康なドナー及び特定の抗原応答（例えば、ヒトサイトメガロウイルス又はインフルエンザフル抗原）を有するドナー由来のヒト一次通常型Ｔ細胞（Ｔ ｃｏｎｖ細胞，T conv cell）を、細胞増殖色素（例えば、ThermoFisher社）で標識し、様々な濃度のＣＤ２５抗体及び対照抗体（１～１０ｕｇ／ｍＬ）で処理し、これに続いて、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化し、Ｔｒｅｇありで又はＴｒｅｇなしで、３７℃、５％ＣＯ２で４８～７２時間のインキュベーション向けに、インキュベートする。Ｔ細胞活性化を評価するために、上清を、サイトカイン解析向けに収集し、固定可能な生死判別色素（例えば、Thermofisher社）で及び表面抗ヒトＴ細胞マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２５で細胞を染色し、これに続いて、細胞内グランザイムＢ及びＦｏｘｐ３の染色向けに固定及び透過処理を行う。細胞を、グランザイムＢ陽性細胞及び増殖性細胞についてフローサイトメトリーを使用して解析する。
【0105】
インビボでの特性評価
マウス異種移植腫瘍モデルを使用して、ＣＤ２５抗体のインビボでの活性を評価することができる。本実験は、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを介するＣＤ２５＋腫瘍枯渇に基づいて、ＣＤ２５抗体の差異を区別するのに役立つ。バリアント抗体を、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体として産生し、免疫不全ＲＡＧ－／－ノックアウトマウス（機能性ＮＫ細胞及びＡＰＣ細胞を有するが、成熟Ｂリンパ球もＴリンパ球もない）において使用することができる。動物に、ＣＤ２５＋ヒト細胞株（例えば、ＳＵＤＨＬ－１、ＣＤ２５＋未分化大細胞リンパ腫）を皮下移植する。様々なサイズの腫瘍（触知可能、１００～５００ｍｍ３）を使用して、抗体間の差異を識別することができる。動物を、異なる用量のＣＤ２５抗体（例えば、１～１０ｍｇ／ｋｇ、週３×又は１日１回）で治療し、体重及びＴＧＩの変化についてモニタリングする。
マウス異種移植腫瘍モデルを使用して、ＣＤ２５抗体のインビボでの活性を評価することができる。本実験は、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを介するＣＤ２５＋腫瘍枯渇に基づいて、ＣＤ２５抗体の差異を区別するのに役立つ。バリアント抗体を、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体として産生し、免疫不全ＲＡＧ－／－ノックアウトマウス（機能性ＮＫ細胞及びＡＰＣ細胞を有するが、成熟Ｂリンパ球もＴリンパ球もない）において使用することができる。動物に、ＣＤ２５＋ヒト細胞株（例えば、ＳＵＤＨＬ－１、ＣＤ２５＋未分化大細胞リンパ腫）を皮下移植する。様々なサイズの腫瘍（触知可能、１００～５００ｍｍ３）を使用して、抗体間の差異を識別することができる。動物を、異なる用量のＣＤ２５抗体（例えば、１～１０ｍｇ／ｋｇ、週３×又は１日１回）で治療し、体重及びＴＧＩの変化についてモニタリングする。
【0106】
ヒト化マウスでのマウス異種移植腫瘍モデルにおける薬物有効性及びＭＯＡ研究
Ｔｒｅｇ枯渇と、Ｔエフェクター細胞活性の上昇を伴う腫瘍内Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比の上昇とを介する腫瘍増殖阻害についてより効果的なバリアント抗体を、様々なヒト腫瘍モデル（例えば、肝臓がん、乳がん、黒色腫、胃がん、ＮＳＣＬＣ、及び結腸がん）において試験して、有効性及び作用メカニズムを立証する。一部の研究には、トリプルネガティブ乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、胃細胞株、黒色腫細胞株Ａ３７５及び肝臓がん細胞株Ｈｕｈ－７、並びに、ヒトＰＤＸモデルであって、十分特徴づけられており、かつ、浸潤したＴｒｅｇと腫瘍増殖の間の相関を示しているか、及び／又はヒトＰＢＭＣ及び／若しくはＣＤ３４＋細胞を移植されたヒト化マウスにおいてＰＤ－１抗体組合せで治療されているかいずれかの、ヒトＰＤＸモデルを使用することが含まれ得る。こういったモデルでは、腫瘍を、皮下に移植し、腫瘍が触知可能から１００～５００ｍｍ３までのサイズ範囲に達するまで、様々な用量のＣＤ２５抗体及び投薬スケジュール（例えば、１～１０ｍｇ／ｋｇ、週３×又は１日１回）で治療する。動物の健康スコアリング、体重、腫瘍増殖、並びに、血液及び腫瘍の免疫表現型タイピングを行って、フローサイトメトリー、Meso Scale Discovery社製多重プレート、及び組織診断を使用して、腫瘍及び免疫細胞組成及び腫瘍浸潤細胞、並びにサイトカイン分泌を特徴づける。
Ｔｒｅｇ枯渇と、Ｔエフェクター細胞活性の上昇を伴う腫瘍内Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比の上昇とを介する腫瘍増殖阻害についてより効果的なバリアント抗体を、様々なヒト腫瘍モデル（例えば、肝臓がん、乳がん、黒色腫、胃がん、ＮＳＣＬＣ、及び結腸がん）において試験して、有効性及び作用メカニズムを立証する。一部の研究には、トリプルネガティブ乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、胃細胞株、黒色腫細胞株Ａ３７５及び肝臓がん細胞株Ｈｕｈ－７、並びに、ヒトＰＤＸモデルであって、十分特徴づけられており、かつ、浸潤したＴｒｅｇと腫瘍増殖の間の相関を示しているか、及び／又はヒトＰＢＭＣ及び／若しくはＣＤ３４＋細胞を移植されたヒト化マウスにおいてＰＤ－１抗体組合せで治療されているかいずれかの、ヒトＰＤＸモデルを使用することが含まれ得る。こういったモデルでは、腫瘍を、皮下に移植し、腫瘍が触知可能から１００～５００ｍｍ３までのサイズ範囲に達するまで、様々な用量のＣＤ２５抗体及び投薬スケジュール（例えば、１～１０ｍｇ／ｋｇ、週３×又は１日１回）で治療する。動物の健康スコアリング、体重、腫瘍増殖、並びに、血液及び腫瘍の免疫表現型タイピングを行って、フローサイトメトリー、Meso Scale Discovery社製多重プレート、及び組織診断を使用して、腫瘍及び免疫細胞組成及び腫瘍浸潤細胞、並びにサイトカイン分泌を特徴づける。
【0107】
ヒト化マウスでのマウス異種移植腫瘍モデルにおける組合せ研究。リード候補及び適応症が、有効性及びＭＯＡ研究に基づいて立証されたら、本発明者らは、免疫活性化のために免疫原性及び他の経路の活性化を向上させるための広範囲の薬剤（例えば、化学療法、チェックポイント阻害剤、ＴＬＲアゴニスト、ワクチン）を使用して組合せ研究を実施することになる。組合せ実験が、有効性及びＭＯＡ研究で使用された類似の腫瘍モデルにおいて実施されよう。
【0108】
本明細書に引用された全ての特許、特許出願、刊行物、文書、Ｗｅｂリンク、及び論文は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】