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特許7627413ガンマ定常領域（Ｃγ１）とイプシロン定常領域（Ｃε２－４）とが融合された重鎖及び軽鎖の定常領域からなる抗体断片及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-29
(45)【発行日】2025-02-06
(54)【発明の名称】ガンマ定常領域（Ｃγ１）とイプシロン定常領域（Ｃε２－４）とが融合された重鎖及び軽鎖の定常領域からなる抗体断片及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20250130BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250130BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250130BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250130BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250130BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20250130BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
A61K39/395 D
A61K39/395 M
A61P37/06
A61P37/08
C12N15/13
G01N33/53 N
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2023512658
(86)(22)【出願日】2021-08-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-12
(86)【国際出願番号】 KR2021011105
(87)【国際公開番号】W WO2022039547
(87)【国際公開日】2022-02-24
【審査請求日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】10-2020-0105462
(32)【優先日】2020-08-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0109364
(32)【優先日】2021-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】524474062
【氏名又は名称】ファチアブジェン インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＦａｔｉＡｂＧｅｎ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】クォン，ミョンヒ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ミンジェ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジョンヒョン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ジュホ
(72)【発明者】
【氏名】ソ，ヨンシル
【審査官】西澤 龍彦
(56)【参考文献】
【文献】特表２００４－５３７９９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】KIM, M et al.，Applications of the immunoglobulin Cw fragment (IgCw) composed of the constant regions of heavy and light (CH and CL) chains，Biochemical and Biophysical Research Communications，2019年05月07日，Vol. 512, No. 3，pp. 571-576
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃγ１からなるＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）断片及びＣε２、Ｃε３及びＣε４からなるＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片；並びに前記ＩｇＧ抗体の前記重鎖の定常領域断片と連結されたＣκ又はＣλからなる軽鎖の定常領域断片；を含む抗体断片であって、前記ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片及びＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片は、Ｎ末端からＣ末端方向にＣγ１－Ｃε２－Ｃε３－Ｃε４の形態で連結され、
前記抗体断片は抗体の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ）を含まない、抗体断片。
【請求項2】
前記ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片及びＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片は、ヒンジを介して連結されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体断片。
【請求項3】
前記重鎖の定常領域断片と連結された軽鎖の定常領域断片は、二硫化結合によって結合されたり、又はペプチドリンカーで結合されたことを特徴とする、請求項１に記載の抗体断片。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体断片をコードする核酸。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体断片を含むキット。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体断片を含む抗体効能評価用組成物。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体断片を含む抗体濃度測定用組成物。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体断片を含むアレルギー反応抑制用組成物。
【請求項9】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体断片を含む自己免疫反応抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体の定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）でのみ構成された抗体断片に関し、より詳細には、抗体の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）がない、重鎖（ＣＨ）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域でのみ構成された抗体断片に関する。例えば、ガンマ定常領域（Ｃγ１）とイプシロン定常領域（Ｃε２－４）とが融合された重鎖及び軽鎖の定常領域（ＣＬ）で構成された抗体断片（ＩｇＣｗ－γ１ε２－４／κと命名し、ＩｇＣｗ－γεκと略称する。）、これをコーディングする核酸、これを含むキット及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
組換え抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ効能を立証するために、レファレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）抗体、すなわち、効能を評価するための抗体の標的分子（抗原）と結合しないコントロール抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が必要である。レファレンス抗体は、多クローン（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体から分離したり、抗体の重鎖及び軽鎖領域を暗号化した発現構成物をトランスフェクションした細胞の培養から生産され得る。
【0003】
レファレンス抗体が、効能を評価するための抗体が結合する標的分子とは結合しないと予想される場合にも、レファレンス抗体もいずれかの抗原との結合に関与する可変領域を有しているので、雑音正信号（ｎｏｉｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ）が発生する交差反応性（ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の可能性、特に、他の抗原との反応による効果（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）が発生する可能性を完全に排除することはできない。
【0004】
一方、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、血液中に非常に低い濃度で存在する抗体である。血液中のＩｇＥの濃度を測定することは、ＩｇＥ－関連免疫疾患の診断及び治療効果の追跡管理において重要であるが、ＩｇＥの定量のためには、レファレンスＩｇＥタンパク質が必ず必要である。また、多様な免疫学的定性実験においてＩｇＥタンパク質が必要な状況である。
【0005】
現在、市販中のヒトＩｇＥタンパク質は、次の通りである：１）血液中のＩｇＥの濃度が高い患者（例：ＩｇＥ骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）患者）の血液から精製した単クローンＩｇＥ（例：Ａｂｃａｍ、Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、ａｎｄ Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の製品）、２）健康な人から由来したＢ細胞と骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ）とを融合して作ったハイブリドーマ細胞の培養液から精製した単クローンＩｇＥ、３）ＩｇＥ遺伝子をトランスフェクションして得た細胞株の培養液から精製した単クローンＩｇＥ。
【0006】
これらのＩｇＥ抗体は、価格がＩｇＧに比べて１００倍以上高く、可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を含んでいるので、ＩｇＥ定量実験及び多様な免疫学的実験において、未知の抗原に対する非特異的結合力を示す可能性がある。血液中の総ＩｇＥの定量のために使用されている共益的目的の国際標準ＩｇＥ［ＷＨＯ ＩｇＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ、ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｒｅｃｅｎｔ ｉｓ ｔｈｅ ３ｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（ＩＲＰ）、ｃｏｄｅｄ １１／２３４］が存在し、ＷＨＯ ＩＲＰ １１／２３４は、血液中のＩｇＥの濃度が高い多くの国の患者達の血漿（又は血清）を集めた後、これらを各アンプルに入れて凍結乾燥したものであって、血液成分を含んでおり、バイオハザード（ｂｉｏｈａｚａｒｄ）と見なされるため実験室での使用時に注意が要求され、多クローンであり、未知の抗原に対する非特異的結合可能性を排除できないという問題がある。
【0007】
そこで、本発明者等は、既存に知られているｌｇＥレファレンス抗体の各短所を避けながらもｌｇＥレファレンス抗体に取り替えられる、新しい形態の抗体断片を開発しようとした。また、高い生産収率を有しながらもＦｃイプシロン受容体（ＦｃεＲ）に結合できることによって、ＩｇＥの濃度を測定するための定量的実験のみならず、ＦｃεＲ－ＩｇＥ相互作用を抑制するための定性的実験においてＩｇＥに取り替えられる分子を開発しようと努力した。
【0008】
その結果、定常領域のみからなっており、可変領域は有していない分子、特に、ガンマ定常領域（Ｃγ１）－ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）とイプシロン定常領域（Ｃε２－４）とが融合された重鎖（Ｃγ１－ｈｉｎｇｅ－Ｃε２－４）及び軽鎖のカッパ定常領域（ＣＫ）で構成された抗体断片（ＩｇＣｗ－γεκ）を開発した。このＩｇＣｗ－γεκ分子が、ＩｇＥの濃度測定実験、ＦｃεＲ－ＩｇＥ相互作用による免疫学研究においてＩｇＥ代替薬として利用可能であり、ＩｇＥ－媒介過敏反応疾患を抑制できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0009】
本背景技術部分に記載の前記情報は、本発明の背景に対する理解を向上させるためのものに過ぎなく、そのため、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者に既に知られている先行技術を形成する情報を含まない場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、抗体の可変領域がない、重鎖（ＣＨ）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域でのみ構成された抗体断片を提供することにある。
【0011】
本発明の目的は、前記抗体断片をコーディングする核酸を提供することにある。
【0012】
本発明の目的は、前記抗体断片を含むキットを提供することにある。
【0013】
本発明の目的は、前記抗体断片を含む抗体効能評価用組成物を提供することにある。
【0014】
本発明の目的は、前記抗体断片を含む抗体濃度測定用組成物を提供することにある。
【0015】
本発明の目的は、前記抗体断片を含むアレルギー反応抑制用組成物を提供することにある。
【0016】
本発明の目的は、前記抗体断片を含むＩｇＥ－媒介自己免疫反応抑制用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0017】
前記目的を達成するために、本発明は、ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片及びＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片；及び前記重鎖の定常領域断片と連結された軽鎖の定常領域断片；を含む抗体断片を提供する。
【0018】
また、本発明は、前記抗体断片をコーディングする核酸を提供する。
【0019】
また、本発明は、前記抗体断片を含むキットを提供する。
【0020】
また、本発明は、前記抗体断片を含む抗体効能評価用組成物を提供する。
【0021】
また、本発明は、前記抗体断片を含む抗体濃度測定用組成物を提供する。
【0022】
また、本発明は、前記抗体断片を含むアレルギー反応抑制用組成物を提供する。
【0023】
また、本発明は、前記抗体断片を含むＩｇＥ－媒介自己免疫反応抑制用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ＩｇＣｗ－γ１ε２－４／κ（簡単にＩｇＣｗ－γεκ）タンパク質の構造を示す図である。ヒト抗体のＣγ１－ヒンジ領域及びＣε２－Ｃε３－Ｃε４からなる抗体断片（約１３０ｋＤａ）を示す。
【図2】精製した各抗体タンパク質の精製純度及びインテグリティ（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を分析した結果を示す図である。各抗体遺伝子を発現するベクターでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３ｆ細胞の培養液から精製した各抗体タンパク質の精製純度及びインテグリティの分析結果であって、予想どおり、ＩｇＣｗ－γεκが約１３０ｋＤａの分子量を有していることを示す。Ａは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色結果を示し、Ｂは、サイズ排除（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー結果を示す。
【図3】ＩｇＣｗ－γεκとＦｃεＲとの結合分析を示す図である。ＩｇＣｗ－γεκ抗体断片タンパク質が、ＲＢＬ－２Ｈ３－ＦｃεＲＩα細胞の表面に発現された高親和度のヒトＦｃε受容体（ＦｃεＲ１）に対照ＩｇＥと同じ程度によく結合できることを示すフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）結果を示す。
【図4】ＩｇＣｗ－γεκの交差結合（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ）による脱顆粒反応を確認した結果を示す図である。ＲＢＬ－２Ｈ３－ＦｃεＲＩα細胞にＩｇＣｗ－γεκを処理して感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）させた後、抗－Ｃκ抗体を処理したとき（ＦｃεＲ１の交差結合誘導）、ＩｇＣｗ－γεκが、対照であるフルサイズ（ｆｕｌｌ－ｓｉｚｅ）ＩｇＥと類似するレベルでβ－ヘキソサミニダーゼ放出（脱顆粒反応）を誘導できることを示す実験結果である。Ａは実験デザインを示し、Ｂは実験結果を示す。
【図5】ＩｇＥ－感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ）細胞において、ＩｇＣｗ－γεκによる脱顆粒反応を抑制した結果を示す図である。ＩｇＣｗ－γεκが、ＲＢＬ－２Ｈ３－ＦｃεＲＩα細胞において６Ｃ４０７ ＩｇＥ＋タンパク質－Ｌ－ビオチン＋ストレプトアビジンによるβ－ヘキソサミニダーゼ放出（脱顆粒反応）を抑制できることを示す実験結果である。Ａは実験デザインを示し、Ｂは、６Ｃ４０７ ＩｇＥとＩｇＣｗ－γεκとの混合物を処理したＲＢＬ－２Ｈ３－ＦｃεＲＩα細胞におけるβ－ヘキソサミニダーゼ放出程度を測定した結果を示し、Ｃは、６Ｃ４０７ ＩｇＥをＲＢＬ－２Ｈ３－ＦｃεＲＩ細胞に前処理した後でＩｇＣｗ－γεκを処理し、細胞におけるβ－ヘキソサミニダーゼ放出程度を測定した結果を示す。
【図6】ヒトＩｇＥ抗体の定量のためのレファレンス分子としてのＩｇＣｗ－γεκの結果を示す図である。ＩｇＣｗ－γεκタンパク質をＩｇＥ抗体の定量のためのレファランスとして使用できることを示すＥＬＩＳＡ結果である。Ａは、６Ｃ４０７ ＩｇＥを用いて生成した標準曲線を示し、Ｂは、ＩｇＣｗ－γεκを用いて生成した標準曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
【0026】
ヒトＩｇＥ抗体で定常領域のみからなるＩｇＣｗ－εκ抗体断片を製作しようとしたが、イプシロン重鎖及びカッパ軽鎖の定常領域でのみ構成されたＩｇＣｗ－εκには重鎖と軽鎖の定常領域間の二硫化結合が形成されておらず、ヒトカッパ定常領域に結合するカッパＸＰ－アガロース（Ｋａｐｐａ ＸＰ－Ａｇａｒｏｓｅ）で精製したとき、重鎖の定常領域とは結合できず、カッパ軽鎖の定常領域のみを精製することができた。
【0027】
最終的に、ガンマ定常領域（Ｃγ１）－ヒンジとイプシロン定常領域（Ｃε２－４）とが融合された重鎖及び軽鎖の定常領域からなる抗体断片ＩｇＣｗ－γεκには、定常領域間の二硫化結合が正常に形成されており、発現レベル及び精製収率もコントロール６Ｃ４０７ ＩｇＥに類似していた。このように、ガンマ定常領域（Ｃγ１）とイプシロン定常領域（Ｃε２－４）との融合は、ＩｇＣｗ－γεκタンパク質の構造的安定性及び高い精製収率を付与する。
【0028】
また、本発明では、既存に知られているＩｇＥレファレンス抗体の各短所を避けながらもＩｇＥレファレンス抗体に取り替えられる、新しい形態の抗体断片（ＩｇＣｗ－γ１ε２－４／κと命名し、ＩｇＣｗ－γεκと略称する。）を開発した。ＩｇＣｗ－γεκは、二つのＣγ１－ヒンジ－Ｃε２－４のハイブリッド重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）及び二つのＣκ軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）からなる抗体断片であって、定常領域のみからなっており、可変領域は有していない分子である。
【0029】
これに基づいて、一観点において、本発明は、ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片及びＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片；及び前記重鎖の定常領域断片と連結された軽鎖の定常領域断片；を含む抗体断片に関する。
【0030】
本発明において、「抗体断片」は、新規の抗体フォーマットとして、抗体の可変領域がないＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片及びＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片；及び前記重鎖の定常領域断片と連結された軽鎖の定常領域断片；を含む抗体断片を開発し、このような新しい構造を有するＩｇＣｗ－γεκが、多様な長所を有しており、抗体効能評価などの臨床分野で幅広く使用可能であることを究明した。
【0031】
断片化されていない抗体は、二硫化結合によって連結された２個の重鎖及び２個の軽鎖を含む。それぞれの単一軽鎖は、二硫化結合によって重鎖のうち一つに連結される。抗体の重鎖部分は、Ｎ－末端部に、可変ドメイン（ＶＨ）と、次の多数の不変ドメイン（抗体のタイプによって、３個又は４個の不変ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）とを有する。それぞれの軽鎖部分は、Ｎ－末端部に可変領域（ＶＬ）を、その他の末端（Ｃ－末端）に定常領域（ＣＬ）を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）と整列され、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は重鎖の可変領域（ＶＨ）と整列される。
【0032】
定常領域は、可変領域以外の抗体のドメインの総合を意味する。定常領域は、抗体とその標的抗原との結合に直接関与しないが、これらは、生体内で多様なエフェクター機能に関与する。重鎖及び軽鎖の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのみならず、ＩｇＹ、ＩｇＷ及びＩｇＮＡＲから由来したものを全て含む意味で使用される。
【0033】
一つの実施例において、前記ＩｇＧは、サブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むことができる。
【0034】
一つの実施例において、前記ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片はＣγ１を含むことができる。前記ＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片は、Ｃε２、Ｃε３及びＣε４で構成された群から選ばれる一つ以上を含むことができる。
【0035】
具体的な実施例において、本発明に係る抗体断片は、ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片Ｃγ１、ＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片Ｃε２、Ｃε３及びＣε４を含み、ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片及びＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片は、Ｎ末端からＣ末端方向にＣγ１－Ｃε２－Ｃε３－Ｃε４の形態で連結され得る。
【0036】
前記ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域断片及びＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域断片は、ヒンジを介して連結され得る。
【0037】
一つの実施例において、前記軽鎖の定常領域はＣκ又はＣλを含むことができる。前記重鎖の定常領域断片と連結された軽鎖の定常領域断片は、例えば、二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）によって結合されたり、又はペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で結合され得る。
【0038】
組換え抗体フォーマットは、有用性及び費用性に影響を与え得る低い精製収率により、頻繁に困難に直面してきた。抗体の生産収率は、重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の特性（アミノ酸配列）に依存する。よって、組換え抗体の生産収率は、よく確立された製造工程でも可変ドメイン（Ｖ ｄｏｍａｉｎ）のアミノ酸配列に依存するので、相当可変的であり得る。本発明の一実施例において、本発明に係る抗体の定常領域でのみ構成された抗体断片が、高い収率で生産可能であることを確認した。
【0039】
本発明は、他の観点において、前記抗体断片をコーディングする核酸に関する。前記核酸を分離し、抗体断片を組換え形態で生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入した後で追加的にクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）、又は追加的に発現させる。これに基づいて、本発明は、更に他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。
【0040】
「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドのみならず、糖又は塩基部位が変形した類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖の可変領域をコーディングする核酸の配列は変形可能である。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、非保存的置換又は保存的置換を含む。
【0041】
前記抗体断片を暗号化するＤＮＡは、通常的な過程を使用することによって（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には、一般に、次のうち一つ以上が含まれるが、これに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終決配列。
【0042】
本明細書で使われる用語である「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段として、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて、抗体断片をコーディングする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。
【0043】
「作動的に連結」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
【0044】
原核細胞を宿主とする場合は、転写を進行できる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終決配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘログロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用可能であり、転写終決配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【0045】
場合によって、ベクターは、それから発現される抗体断片の精製を容易にするために他の配列と融合される場合もある。融合される配列としては、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。
【0046】
前記ベクターは、選択標識として当業界で通常的に用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【0047】
本発明は、更に他の観点において、前記言及したベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使用された細胞は、原核生物、酵母又は高等真核細胞であり得るが、これに制限されることはない。
【0048】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス及びバチルス・チューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））などの原核宿主細胞を用いることができる。
【0049】
ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されることはない。
【0050】
本発明は、更に他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体断片を回収する段階；を含む前記抗体断片の製造方法に関する。
【0051】
前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地は、いずれも制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知となっているその他の全ての必須補充物が適当な濃度で含まれる場合もある。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが、発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者にとって明白であろう。
【0052】
前記抗体断片の回収は、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果物を、例えば、親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加的な他の精製技術として、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが使用され得る。
【0053】
本発明は、他の観点において、抗体断片を含むキットに関する。前記キットは、抗体断片を含む容器、その他の試薬又はサンプルを含む容器を含むことができる。
【0054】
前記キットは、瓶、チューブなどの一つ以上の容器を含有するのに適しており、各容器は、本発明の方法に使用される独立的な各構成要素を含有する。本発明の明細書において、当該分野で通常の知識を有する者は、容器中の必要な製剤を容易に分配することができる。
【0055】
本発明は、他の観点において、前記抗体断片を含む抗体効能評価用組成物に関する。
【0056】
抗原－特異的抗体によるいずれかの影響を立証する実験においては、抗原－特異的抗体信号から非特異的な背景信号を区別するために、レファレンス（又は関係のないアイソタイプコントロール）抗体が陰性対照群として一般的に使用される。しかし、既存のレファレンス抗体は、未だによく知られていない交差反応性のために依然として所望でない雑音信号を与え得る。
【0057】
本発明に係る抗体断片は、抗原結合能力がなく、予想できない交差反応性の可能性を排除できるので、関係のないＩｇＥコントロールと比較して、多くの実験的な環境及び状況でさらに良いレファレンス抗体になり得る。
【0058】
本発明は、他の観点において、前記抗体断片を含む抗体濃度測定用組成物に関する。本発明に係る抗体断片は、生物学的標本で免疫グロブリンの濃度を測定するためのレファレンスとして使用され得る。
【0059】
本発明は、他の観点において、抗体断片を含むアレルギー反応抑制用組成物に関する。
【0060】
ほとんどのアレルギー疾患は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の過剰免疫反応によって誘発される。ＩｇＥは、正常状態では血清中に非常に低い濃度で存在する抗体である。ＩｇＥは、一般に、無害な抗原によって生成されることもあり、特別な刺激がなくてもＩｇＥが増加する場合があるが、この場合にアレルギー疾患がもたらされ得る。非正常的に増加したＩｇＥは、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）及び好塩基性顆粒球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）などの表面に発現される高親和性ＩｇＥ Ｆｃ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合することができる。ＦｃεＲＩにＩｇＥ分子が結合されている状態で抗原（主に無害な抗原）が同時に多くのＩｇＥ分子に結合すると、各ＦｃεＲＩ受容体間の交差結合が起こり、肥満細胞及び好塩基性顆粒球内への信号伝逹によって活性化される。このような細胞の活性化結果として、肥満細胞や好塩基性顆粒球は、ヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジン、ブラジキニン及び血小板－活性化因子などの化学媒介子を放出するようになる。このような化学媒介子の放出によってアレルギー症状が発生する。本発明に係る抗体断片は、アレルギー反応を抑制するためのＦｃε受容体（ＦｃεＲＩ）のブロッカーとして使用され得る。
【0061】
本発明は、他の観点において、抗体断片を含む自己免疫反応抑制用組成物に関する。
【0062】
全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、ＳＬＥ）などの自己免疫疾患の病因メカニズムのうち一つは、形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ｐＤＣ）による大量の炎症性サイトカイン（ＩＦＮ－α、ＴＮＦ、ＩＬ－６）分泌である。肥満細胞と同様に、ｐＤＣ細胞は、表面にＦｃεＲＩを発現しており、活性化時に他の細胞類型よりも１，０００倍多いＩＦＮ－αを分泌することができる。ｐＤＣ表面のＦｃεＲＩにＩｇＥアイソタイプの自己抗体とＤＮＡ抗原の複合体（免疫複合体）が結合すると、ＦｃεＲＩを介して免疫複合体が細胞内に入るようになる。細胞内に入った免疫複合体は、トル様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）－７及び－９などの細胞内受容体を刺激し、ｐＤＣ細胞が活性化された結果、多量の炎症性サイトカインが分泌され、疾患を悪化させることが知られている。本発明に係る抗体断片は、ＩｇＥ自己抗体によって媒介される自己免疫反応を抑制するためのＦｃイプシロン受容体（ＦｃεＲＩ）のブロッカーとして使用され得る。
【0063】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0064】
実施例１：試料の準備
実施例１－１：プラスミドベクター
２個のＣＭＶプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）がそれぞれ遺伝子を調節し、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するヒト（ｈｕｍａｎ）Ｃγ１／ε２－４とヒトＣκを同時に発現するＫＶ１０－ＩｇＣｗ－γεκベクターを作るために、ＫＶ１０－ＩｇＣＷγκベクターのＮｃｏＩとＢａｍＨＩ制限部位間にヒト重鎖の定常領域Ｃγ１とε２－４がハイブリッドされて暗号化されたＤＮＡ断片をクローニングした。
実施例１－１：プラスミドベクター
２個のＣＭＶプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）がそれぞれ遺伝子を調節し、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するヒト（ｈｕｍａｎ）Ｃγ１／ε２－４とヒトＣκを同時に発現するＫＶ１０－ＩｇＣｗ－γεκベクターを作るために、ＫＶ１０－ＩｇＣＷγκベクターのＮｃｏＩとＢａｍＨＩ制限部位間にヒト重鎖の定常領域Ｃγ１とε２－４がハイブリッドされて暗号化されたＤＮＡ断片をクローニングした。
【0065】
【0066】
【0067】
【0068】
キメリックＩｇＥ（６Ｃ４０７、３Ｄ８）を発現するためのプラスミドベクターを作るために、ＫＶ１２－ＨＬベクターのＭｌｕＩとＮｈＥＩ制限部位間と、ＤｒａＩＩＩとＢｓｔＷＩ制限部位間にそれぞれＶＨとＶＫドメイン（Ｄｏｍａｉｎ）が暗号化されたＤＮＡ断片をクローニングした。
【0069】
２個のＣＭＶプロモーターがそれぞれ遺伝子を調節し、リーダー配列を有するヒトＣε１－４とヒトＣκを同時に発現するＫＶ１０－ＩｇＣｗ－εκベクターを作るために、ＫＶ１０－ＩｇＣＷγκベクターのＮｃｏＩとＢａｍＨＩ制限部位間にヒト重鎖の定常領域（Ｃε１－４）が暗号化されたＤＮＡ断片をクローニングした。
【0070】
ヒトＦｃεＲＩαを発現するレンチウイルスベクターを作るために、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ＰｕｒｏベクターのＥｃｏＩとＢａｍＨＩ制限部位間にヒトＦｃεＲＩαが暗号化されたＤＮＡ断片をクローニングした。
【0071】
実施例１－２：ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いた免疫グロブリンタンパク質の準備
血清のない条件で浮遊培養によって育つように適応されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３－Ｆ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、抗体の生産のために使用した。
血清のない条件で浮遊培養によって育つように適応されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３－Ｆ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、抗体の生産のために使用した。
【0072】
トランスフェクション時に２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度を有するように、トランスフェクションする２４時間前に５００ｍｌのフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ＃ ４３１１４５）にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで１００ｍｌ入れて培養した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞は、血清のないＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃ １２３３８）で８％のＣＯ２及び３７℃の培養器で１３０ｒｐｍで振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）培養した。６Ｃ４０７ ＩｇＥ、ＩｇＣｗ－εκ、ＩｇＣｗ－γεκタンパク質を発現させるために、各遺伝子が暗号化されたＫＶプラスミド２００μｇ、及びポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ＃ ２３９６６－２）４００μｇをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地５ｍｌにそれぞれ入れた後、室温で１０分間据え置いた。そして、ＤＮＡが含まれた培地５ｍｌを０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ＃ ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）でろ過した後、ポリエチレンイミンが含まれた培地５ｍｌと混ぜ、室温で１０分間据え置いた。最終的に、ポリエチレンイミンの濃度が４μｇ／ｍｌになるように、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞の１００ｍｌに一過性トランスフェクションを行った。７日後に培養液を４℃及び４００ｇで２０分間遠心分離することによって上澄み液を獲得し、０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ ｆｉｌｔｅｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃａｔ＃ １１１０６－４７－Ｎ）でろ過した後、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ ＫａｐｐａＸＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃ ２９４３２１２００５）カラム又はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ ＩｇＧ－ＣＨ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃ １９４３２０００５）カラムに通過させた。カラムをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）で洗浄した後、０．１Ｍのグリシン溶液（ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ、ｐＨ３．０）でタンパク質を溶出させた。溶出されたタンパク質は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｕｔ－ｏｆｆ ５０，０００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃａｔ＃ ＶＳ２０３２）を用いて濃縮した（４℃、１５００ｇ）。
【0073】
精製されたタンパク質の濃度は、２８０ｎｍでの吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）及び吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を用いて決定した。２８０ｎｍでのモル吸光係数は、６Ｃ４０７ ＩｇＥの場合は１．４９、ＩｇＣｗ－εκの場合は１．３４、ＩｇＣｗ－γεκの場合は１．１７であり、各アミノ酸配列からｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ウェブページを通じて計算した。
【0074】
実施例１－３：細胞培養
ラット（ｒａｔ）の好塩基球性白血病細胞から由来したＲＢＬ－２Ｈ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ－２２５６ＴＭ）細胞株及びヒト胚性腎臓２９３細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ－３２１６ＴＭ）は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）培地で培養した。ＤＭＥＭ培地に、１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）を添加して使用した。全ての細胞は、５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で培養した。
ラット（ｒａｔ）の好塩基球性白血病細胞から由来したＲＢＬ－２Ｈ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ－２２５６ＴＭ）細胞株及びヒト胚性腎臓２９３細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ－３２１６ＴＭ）は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）培地で培養した。ＤＭＥＭ培地に、１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）を添加して使用した。全ての細胞は、５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で培養した。
【0075】
実施例１－４：細胞構築
ヒト胚性腎臓２９３細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを、ＦｃεＲＩαを発現するレンチウイルスが含まれた上澄み液の生産のために使用した。
ヒト胚性腎臓２９３細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを、ＦｃεＲＩαを発現するレンチウイルスが含まれた上澄み液の生産のために使用した。
【0076】
トランスフェクション時に３×１０６ｃｅｌｌｓの細胞数を有するように、トランスフェクションする２４時間前に、６０ｍｍ２の培養皿（ＳＰＬ；Ｃａｔ＃ １１０６０）に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＤＭＥＭ培地を４ｍｌ入れて培養した。２４時間後に培地を捨てた後、ＤＭＥＭ培地３．８ｍｌに、ＦｃεＲＩαを発現させるために遺伝子が暗号化されたｐＣＤＨプラスミド４μｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ（ａｄｄｇｅｎｅ ｃａｔ＃ １４８８７）３μｇ、ＶＳＶ－Ｇ（ａｄｄｇｅｎｅ ｃａｔ＃ １４８８８）１μｇ、及びポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ＃ ２３９６６－２）１６μｇをそれぞれ入れたＯｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃ ３１９８５０７０）２００μｌを混合した。５％のＣＯ２及び３７℃で１６時間培養した後で培地を捨て、ＤＭＥＭ４ｍｌを入れた後で再び２４時間培養した。２４時間後に培地を集め、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによって上澄み液を獲得し、０．４５μｍのシリンジフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ＃ ＳＬＨＶ0３３ＲＳ）でろ過した後、レンチウイルスが含まれた上澄み液を得た。
【0077】
ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に、ヒトＩｇＥを認識する受容体の発現のためのレンチウイルスが含まれた上澄み液を準備した。
【0078】
インフェクション時に２×１０６ｃｅｌｌｓの細胞数を有するように、インフェクションする２４時間前に、６０ｍｍ２の培養皿に、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＤＭＥＭ培地を４ｍｌ入れて培養した。２４時間後に培地を除去し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）で細胞を１回洗浄した後、ＤＭＥＭ ３ｍｌとレンチウイルスが含まれた上澄み液１ｍｌとを混ぜ、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ＃ Ｈ９２６８）を１０μｇ／ｍｌの濃度になるように入れた。２４時間培養した後で培地を捨て、ＤＭＥＭ培地を４ｍｌ入れた後で再び１２時間培養した。その後、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ＃ ５４０４１１）を５μｇ／ｍｌの濃度で入れながら細胞を培養した。
【0079】
実施例２：分析方法
実施例２－１：フローサイトメトリー
ヒトＦｃε受容体を発現させたＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞への受容体の発現有無を確認するために、細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を冷たいＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに希釈した４％のパラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を室温で２０分間細胞に処理して固定させた。検出抗体であるＡＰＣ－コンジュゲートマウス抗ヒトＦｃイプシロンＲＩＡｂ（ＡＰＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ ｅｐｓｉｌｏｎ ＲＩＡｂ）（Ａｂｃａｍ；Ｃａｔ＃ １５５３６９）を、バッファーＳ（ＰＢＳに希釈した０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に希釈して使用した。結果物を４℃で１時間据え置いた後、冷たいＰＢＳを用いて３回ずつ洗浄した。各試料は、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ分析機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通じて分析した。
実施例２－１：フローサイトメトリー
ヒトＦｃε受容体を発現させたＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞への受容体の発現有無を確認するために、細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を冷たいＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに希釈した４％のパラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を室温で２０分間細胞に処理して固定させた。検出抗体であるＡＰＣ－コンジュゲートマウス抗ヒトＦｃイプシロンＲＩＡｂ（ＡＰＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ ｅｐｓｉｌｏｎ ＲＩＡｂ）（Ａｂｃａｍ；Ｃａｔ＃ １５５３６９）を、バッファーＳ（ＰＢＳに希釈した０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に希釈して使用した。結果物を４℃で１時間据え置いた後、冷たいＰＢＳを用いて３回ずつ洗浄した。各試料は、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ分析機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通じて分析した。
【0080】
細胞の表面に発現されるＦｃε受容体にＩｇＣｗ－γεκが結合するかどうかを確認するために、ＦｃεＲ－ＲＢＬ－２Ｈ３、ＦｃεＲ＋ＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）に免疫グロブリンタンパク質を最終濃度１μＭ及び３７℃で３時間処理した。冷たいＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＢＳに希釈した４％のパラホルムアルデヒドを室温で２０分間細胞に処理して固定させた。ＲＢＬ－２Ｈ３とＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞は、一次抗体としてヤギ抗ヒトＩｇＥ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＥ）（ε－ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ＃ Ｉ６２８４）を、二次抗体としてＰＥ－コンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ抗体 （ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ＩｇＧ）抗体（Ａｂｃａｍ；Ｃａｔ＃ Ａｂ７００４）をバッファーＳに希釈して使用した。そして、各据え置き段階（４℃、１時間）ごとに冷たいＰＢＳを用いて３回ずつ洗浄した。各試料は、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ分析機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通じて分析した。
【0081】
実施例２－２：ＩｇＥの濃度を測定するための酵素免疫分析法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）
ヒトのＩｇＥを定量するためのヒト（Ｈｕｍａｎ）ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ＃ ８８－５０６１０）キットを用いてキットに含まれたフルサイズＩｇＥとＩｇＣｗ－γεκの標準曲線を作るための酵素免疫分析法を行った。実験方法は、キットの手順に従った。
ヒトのＩｇＥを定量するためのヒト（Ｈｕｍａｎ）ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ＃ ８８－５０６１０）キットを用いてキットに含まれたフルサイズＩｇＥとＩｇＣｗ－γεκの標準曲線を作るための酵素免疫分析法を行った。実験方法は、キットの手順に従った。
【0082】
９６－ウェルポリスチレンプレート（９６－ｗｅｌｌ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｐｌａｔｅ）のウェルにコーティング抗体を処理した後、４℃で１６時間にわたってコーティングした。その後、据え置き段階（室温）ごとに０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０が含まれているＴＢＳ（ＴＲＩＳ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；５０ｍＭのＴＲＩＳ－Ｃｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて４回ずつ洗浄した。非特異的な抗体の結合を遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために、３％のＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を室温で２時間処理した。ヒト多クローンＩｇＥとＩｇＣｗ－γεκをそれぞれ２５０ｎｇ／ｍｌの開始濃度で２倍ずつ階段希釈した後、ウェルに室温で２時間処理し、検出抗体を室温で１時間処理した。最後に、反応基質溶液を各ウェルに添加し、４５０ｎｍでマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて吸光度を測定した。
【0083】
濃度を知らない抗体の濃度を測定するために、９６－ウェルポリスチレンプレートのウェルにコーティング抗体を４℃で１６時間にわたってコーティングした。単クローン６Ｃ４０７ ＩｇＥ又は３Ｄ８ ＩｇＥを処理した後、検出抗体を処理した（いずれも室温で１時間処理）。濃度を知っているヒトＩｇＥとＩｇＣｗ－γεκをそれぞれ用いて作った２つの異なる標準曲線において、Ｙ軸値の補間法（ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）を通じてＩｇＥ試料の濃度を決定した。
【0084】
実施例２－３：β－ヘキソサミニダーゼ放出測定（Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ：ｂｅｔａ ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ）
ＩｇＥとＦｃε収容体とが結合された複合体が脱顆粒現象を示すかどうかを確認するために、β－ヘキソサミニダーゼ放出を測定した。ＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞の数を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに調節するために、２４時間前に２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを培地ＤＭＥＭ ４００μｌで２４－ウェルプレート（ＳＰＬ；Ｃａｔ＃ ３００２４）に培養した。２４時間後にＩｇＥを感作させるために、ウシ胎児血清、ペニシリン、及びストレプトマイシンが入っていないＤＭＥＭ培地４００μｌにＩｇＥを１０ｎＭの濃度で入れた後で３時間培養した。ＩｇＥを除去した後、シラガニアンバッファー（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１１９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５．６ｍＭのグルコース、０．４ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＰＩＰＥＳ、４０ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．２）５００μｌで細胞を２回洗浄した。結果物をシラガニアンバッファー１６０μｌで１０分間５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で据え置いた。最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ＃ ３１１２９）をシラガニアンバッファーに混ぜた後、ウェルに２０μｌずつ入れて２０分間据え置いた。コントロールとして使用した０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、１時間にわたって５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で据え置いた。結果物を５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で２０分間据え置いた後、９６－ウェルポリスチレンプレート（９６－ｗｅｌｌ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｐｌａｔｅ）のウェルに５０μｌずつ入れた後、１ｍＭのｐ－ＮＡＧ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｉｎ ０．１Ｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ４．５）を５０μｌずつ入れた。３７℃で１時間にわたって処理した後、２００μｌの停止液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．１ＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ１０．０）を各ウェルに添加し、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて吸光度を測定した。
ＩｇＥとＦｃε収容体とが結合された複合体が脱顆粒現象を示すかどうかを確認するために、β－ヘキソサミニダーゼ放出を測定した。ＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞の数を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに調節するために、２４時間前に２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを培地ＤＭＥＭ ４００μｌで２４－ウェルプレート（ＳＰＬ；Ｃａｔ＃ ３００２４）に培養した。２４時間後にＩｇＥを感作させるために、ウシ胎児血清、ペニシリン、及びストレプトマイシンが入っていないＤＭＥＭ培地４００μｌにＩｇＥを１０ｎＭの濃度で入れた後で３時間培養した。ＩｇＥを除去した後、シラガニアンバッファー（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１１９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５．６ｍＭのグルコース、０．４ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＰＩＰＥＳ、４０ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．２）５００μｌで細胞を２回洗浄した。結果物をシラガニアンバッファー１６０μｌで１０分間５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で据え置いた。最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ＃ ３１１２９）をシラガニアンバッファーに混ぜた後、ウェルに２０μｌずつ入れて２０分間据え置いた。コントロールとして使用した０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、１時間にわたって５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で据え置いた。結果物を５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で２０分間据え置いた後、９６－ウェルポリスチレンプレート（９６－ｗｅｌｌ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｐｌａｔｅ）のウェルに５０μｌずつ入れた後、１ｍＭのｐ－ＮＡＧ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｉｎ ０．１Ｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ４．５）を５０μｌずつ入れた。３７℃で１時間にわたって処理した後、２００μｌの停止液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．１ＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ１０．０）を各ウェルに添加し、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて吸光度を測定した。
【0085】
実施例２－４：Ｆｃε受容体のブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）としての役割を確認するためのβ－ヘキソサミニダーゼ放出測定
ＩｇＥとＦｃε収容体とが結合された複合体が、他のＩｇＥによる脱顆粒現象を防止する役割をするＦｃε受容体のブロッカーとしての役割をするかどうかを確認するために、β－ヘキソサミニダーゼ放出を測定した。ＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに作るために、２４時間前に２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを培地ＤＭＥＭ ４００μｌで２４－ウェルプレートに入れて培養した。２４時間後にＩｇＥを感作させるために、ウシ胎児血清、ペニシリン、及びストレプトマイシンが入っていないＤＭＥＭ培地４００μｌにＩｇＥ １０ｎＭとブロッカーＩｇＥを２０ｎＭの開始濃度から２倍ずつ階段希釈して入れた後で３時間培養した。その後、シラガニアンバッファー５００μｌで細胞を２回洗浄し、シラガニアンバッファー１６０μｌで１０分間５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で据え置いた。最終濃度が１４０ｎＭの組換えビオチン化タンパク質Ｌ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃ ２９９９７）、及び７０ｎＭのストレプトアビジン－フルオレセイン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｃａｔ＃ ＳＡ－５００１）をシラガニアンバッファーに混ぜた後、各ウェルに２０μｌずつ入れて２０分間据え置いた。コントロールとして使用した０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、１時間にわたって５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で据え置きた。結果物を５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で２０分間据え置き、９６－ウェルポリスチレンプレート（９６－ｗｅｌｌ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｐｌａｔｅ）のウェルに５０μｌずつ入れた後、１ｍＭのｐ－ＮＡＧ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｉｎ ０．１Ｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ４．５）を５０μｌずつ入れた。結果物を３７℃で１時間にわたって処理した後、２００μｌの停止液（０．１ＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ１０．０）を各ウェルに添加し、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて吸光度を測定した。
ＩｇＥとＦｃε収容体とが結合された複合体が、他のＩｇＥによる脱顆粒現象を防止する役割をするＦｃε受容体のブロッカーとしての役割をするかどうかを確認するために、β－ヘキソサミニダーゼ放出を測定した。ＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに作るために、２４時間前に２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを培地ＤＭＥＭ ４００μｌで２４－ウェルプレートに入れて培養した。２４時間後にＩｇＥを感作させるために、ウシ胎児血清、ペニシリン、及びストレプトマイシンが入っていないＤＭＥＭ培地４００μｌにＩｇＥ １０ｎＭとブロッカーＩｇＥを２０ｎＭの開始濃度から２倍ずつ階段希釈して入れた後で３時間培養した。その後、シラガニアンバッファー５００μｌで細胞を２回洗浄し、シラガニアンバッファー１６０μｌで１０分間５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で据え置いた。最終濃度が１４０ｎＭの組換えビオチン化タンパク質Ｌ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃ ２９９９７）、及び７０ｎＭのストレプトアビジン－フルオレセイン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｃａｔ＃ ＳＡ－５００１）をシラガニアンバッファーに混ぜた後、各ウェルに２０μｌずつ入れて２０分間据え置いた。コントロールとして使用した０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、１時間にわたって５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で据え置きた。結果物を５％のＣＯ２及び３７℃の培養器で２０分間据え置き、９６－ウェルポリスチレンプレート（９６－ｗｅｌｌ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｐｌａｔｅ）のウェルに５０μｌずつ入れた後、１ｍＭのｐ－ＮＡＧ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｉｎ ０．１Ｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ４．５）を５０μｌずつ入れた。結果物を３７℃で１時間にわたって処理した後、２００μｌの停止液（０．１ＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ１０．０）を各ウェルに添加し、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて吸光度を測定した。
【0086】
実施例３：ＩｇＣｗ－γεκの精製収率確認
ＫＶ１０－ＩｇＣｗ－γεκ、ＫＶ１２－６Ｃ４０７ ＩｇＥ、ＫＶ１０－ＩｇＣｗ－εκ、及びプラスミドをそれぞれＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性トランスフェクションした浮遊培養によって生産された各免疫グロブリン分子の収率を比較した（表１）。発現されたタンパク質の予想される構造を図１に示した。全てのタンパク質は、トランスフェクションしてから７日後に、ヒトカッパ定常領域に結合するカッパＸＰ－アガロース（Ｋａｐｐａ ＸＰ－Ａｇａｒｏｓｅ）を用いて精製した。イプシロン重鎖及びカッパ軽鎖の定常領域でのみ構成されたＩｇＣｗ－εκは、重鎖と軽鎖の定常領域間に二硫化結合が形成されないので、カッパ定常領域のみを精製することができた（図２）。その一方で、ガンマ定常領域（Ｃγ１）とイプシロン定常領域（Ｃε２－４）とが融合された重鎖及び軽鎖の定常領域からなる抗体断片ＩｇＣｗ－γεκは、定常領域間の二硫化結合が正常に形成されており、発現レベルもコントロール６Ｃ４０７ ＩｇＥと類似し（図２）、平均収率は、ＫａｐｐａＸＰ－アガロースで精製したときに６Ｃ４０７ ＩｇＥと同一の～１７ｍｇ／Ｌで、ＩｇＧ－ＣＨ１－アガロースで精製したときに～２７ｍｇ／Ｌである（表１）。これは、ＩｇＣｗ－γεκタンパク質が、ＩｇＣｗ－εκタンパク質より構造的に安定しており、精製収率にも優れることを示す。
ＫＶ１０－ＩｇＣｗ－γεκ、ＫＶ１２－６Ｃ４０７ ＩｇＥ、ＫＶ１０－ＩｇＣｗ－εκ、及びプラスミドをそれぞれＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性トランスフェクションした浮遊培養によって生産された各免疫グロブリン分子の収率を比較した（表１）。発現されたタンパク質の予想される構造を図１に示した。全てのタンパク質は、トランスフェクションしてから７日後に、ヒトカッパ定常領域に結合するカッパＸＰ－アガロース（Ｋａｐｐａ ＸＰ－Ａｇａｒｏｓｅ）を用いて精製した。イプシロン重鎖及びカッパ軽鎖の定常領域でのみ構成されたＩｇＣｗ－εκは、重鎖と軽鎖の定常領域間に二硫化結合が形成されないので、カッパ定常領域のみを精製することができた（図２）。その一方で、ガンマ定常領域（Ｃγ１）とイプシロン定常領域（Ｃε２－４）とが融合された重鎖及び軽鎖の定常領域からなる抗体断片ＩｇＣｗ－γεκは、定常領域間の二硫化結合が正常に形成されており、発現レベルもコントロール６Ｃ４０７ ＩｇＥと類似し（図２）、平均収率は、ＫａｐｐａＸＰ－アガロースで精製したときに６Ｃ４０７ ＩｇＥと同一の～１７ｍｇ／Ｌで、ＩｇＧ－ＣＨ１－アガロースで精製したときに～２７ｍｇ／Ｌである（表１）。これは、ＩｇＣｗ－γεκタンパク質が、ＩｇＣｗ－εκタンパク質より構造的に安定しており、精製収率にも優れることを示す。
【0087】
【表1】
【0088】
精製方法によって、ＩｇＣｗ－γεκタンパク質の精製収率がＩｇＥと類似したり、又はそれより高いことを示している。
【0089】
実施例４：ＲＢＬ－２Ｈ３細胞のヒトのＦｃε受容体に対する発現有無を確認
ヒトのＦｃε受容体を発現させたＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞において、ｈＦｃεＲの発現を確認するためにフローサイトメトリーを行った。
ヒトのＦｃε受容体を発現させたＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞において、ｈＦｃεＲの発現を確認するためにフローサイトメトリーを行った。
【0090】
抗－Ｆｃε抗体は、野生型ＲＢＬ－２Ｈ３細胞には結合しないが、Ｆｃε受容体を発現させたＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞には結合した（図３）。これは、ヒトのＦｃε受容体が、野生型のＲＢＬ－２Ｈ３細胞には発現しなく、ヒトのＦｃε受容体を発現させたＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞にのみ存在することを意味する。
【0091】
実施例５：ＩｇＣｗ－γεκのＦｃε受容体に対する結合確認及び背景信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ）確認
ヒトのＦｃε受容体を表面に発現する細胞の各Ｆｃε受容体にＩｇＣｗ－γεκが結合するかどうかを確認するために、フローサイトメトリーを行った。
ヒトのＦｃε受容体を表面に発現する細胞の各Ｆｃε受容体にＩｇＣｗ－γεκが結合するかどうかを確認するために、フローサイトメトリーを行った。
【0092】
ＩｇＣｗ－γεκは、フルサイズＩｇＥと同様にｈＦｃεＲＩαが発現するように作ったＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞に結合するが、何らｈＦｃεＲＩαもないＲＢＬ－２Ｈ３細胞には結合しない（図３）。これは、ＩｇＣｗ－γεκがフルサイズＩｇＥのようにＦｃε受容体を認識できることを意味する。
【0093】
実施例６：ＩｇＥを用いた脱顆粒性実験のレファレンスとしてのＩｇＣｗ－γεκの使用
脱顆粒性分析実験のようにＩｇＥが使用される実験において、フルサイズのＩｇＥの代わりにＩｇＣｗ－γεκが使用されるかどうかを、β－ヘキソサミニダーゼ放出実験で確認した。
脱顆粒性分析実験のようにＩｇＥが使用される実験において、フルサイズのＩｇＥの代わりにＩｇＣｗ－γεκが使用されるかどうかを、β－ヘキソサミニダーゼ放出実験で確認した。
【0094】
多クローンＩｇＥ及び６Ｃ４０７ ＩｇＥと共に、コントロールとして使用した６Ｃ４０７ ＩｇＧ及びＰＢＳに対しても実験を行った。ＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞からのβ－ヘキソサミニダーゼ放出は、ネガチブコントロールである６Ｃ４０７ ＩｇＧとＰＢＳでは現れておらず、ＩｇＥを処理したサンプルでのみβ－ヘキソサミニダーゼ放出が観察された（図４）。フルサイズＩｇＥと類似したり、又はそれより高い分泌パーセントをＩｇＣｗ－γεκが示したので、ＩｇＣｗ－γεκの機能がフルサイズと類似していることを示す。これは、ＩｇＣｗ－γεκが、ヒトＩｇＥの代わりに、脱顆粒実験でレファレンス分子として使用され得ることを示す。
【0095】
実施例７：Ｆｃε受容体のブロッカーとしてのＩｇＣｗ－γεκの使用
Ｆｃε受容体のブロッカーとしてＩｇＣｗ－γεκが使用されるかどうかを確認した。
Ｆｃε受容体のブロッカーとしてＩｇＣｗ－γεκが使用されるかどうかを確認した。
【0096】
ＩｇＣｗ－γεκは、可変領域がないので、タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｌに付くことができない。そのため、ＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞の活性化信号は、フルサイズＩｇＥがＦｃεに結合した場合にのみ観察することができる。６Ｃ４０７ ＩｇＥとＩｇＣｗ－γεκとの混合物をＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞に処理した場合（図５Ｂ）のみならず、６Ｃ４０７ ＩｇＥをＲＢＬ－２Ｈ３－ｈＦｃεＲＩα細胞に前処理した後でＩｇＣｗ－γεκを処理した場合（図５Ｃ）にも、ＩｇＣｗ－γεκの濃度が増加するほど６Ｃ４０７ ＩｇＥに対する信号が減少した（図５）。これは、ＩｇＣｗ－γεκが、フルサイズＩｇＥとＦｃε受容体との結合を妨害したことを意味するので、ＩｇＣｗ－γεκがＦｃε受容体のブロッカーとして使用され得ることを示す。
【0097】
実施例８：ＩｇＧの濃度定量のためのレファレンスとしてのＩｇＣｗ－γεκの使用
ＩｇＧの濃度を決定するために使用されるレファレンスであるフルサイズＩｇＥに対する代替薬として、ＩｇＣｗ－γεκが使用されるかどうかを確認した。
ＩｇＧの濃度を決定するために使用されるレファレンスであるフルサイズＩｇＥに対する代替薬として、ＩｇＣｗ－γεκが使用されるかどうかを確認した。
【0098】
二つのログ標準曲線は、それぞれヒト多クローンＩｇＥ（図６Ａ）とＩｇＣｗ－γεκ（図６Ｂ）の知られている濃度値を用いた酵素免疫分析法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）によって作った。濃度を知らない二つの単クローンＩｇＥ標本（６Ｃ４０７と３Ｄ８）を用いて同一の実験を行った。ＩｇＥの濃度は、それぞれのカーブで補間法によって決定され（表２）、使用した線形補間公式（ｈｔｔｐｓ：／／ｆｏｒｍｕｌａｓ．ｔｕｔｏｒｖｉｓｔａ．ｃｏｍ／ｍａｔｈ／ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ－ｆｏｒｍｕｌａ．ｈｔｍｌ）は、ｘ＝ｘ１＋（ｘ２－ｘ１）×（ｙ－ｙ１）／（ｙ２－ｙ１）である。
【0099】
【表2】
【0100】
正規化された６Ｃ４０７ ＩｇＥと３Ｄ８ ＩｇＥの濃度は、それぞれ７５．３６６ｎｇ／ｍｌと２４．７３７ｎｇ／ｍｌで、これは、ヒト多クローン抗体を用いた標準曲線によって決定された濃度（６Ｃ４０７ ＩｇＥ：７０．４２ｎｇ／ｍｌ、３Ｄ８ ＩｇＥ：２５．０１ｎｇ／ｍｌ）と非常に類似している。これは、ＩｇＣｗ－γεκが、ヒトＩｇＥの濃度を決定するためのレファレンス分子として使用され得ることを示す。
【産業上の利用可能性】
【0101】
本発明に係る抗体断片は、多様な免疫学研究で使用されているＩｇＥレファレンス抗体の代替薬として広範囲に使用可能であり、試料内のＩｇＥ抗体の濃度の測定のためのレファレンス分子として使用することができ、第１型アレルギー反応を抑制するためのＦｃイプシロン受容体（ＦｃεＲＩ）のブロッカーとして使用することができる。
【0102】
また、本発明に係る抗体断片は、ＩｇＥアイソタイプの自己抗体と関連した自己免疫反応を抑制するためのブロッカーとして使用することができる。
【0103】
また、本発明に係る抗体断片は、可変領域を含まないので、既存に使用されている全長アイソタイプ対照抗体の短所である非特異的交差反応、すなわち、他の抗原との反応によるオフターゲット効果を完全に排除できることによって、ＩｇＥの定量及び定性的実験でさらに適切に使用することができ、実験用／治療用抗体の活性に対する有効性評価でアイソタイプ対照抗体として使用することができる。
【0104】
以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の各請求項とそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
【配列表フリーテキスト】
【0105】
電子ファイルを添付した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】