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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-05
(45)【発行日】2025-02-14
(54)【発明の名称】治療用ナノ粒子を合成するための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 47/59 20170101AFI20250206BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20250206BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20250206BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20250206BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250206BHJP
C08G 65/48 20060101ALI20250206BHJP
C07D 491/22 20060101ALI20250206BHJP
【ＦＩ】
A61K47/59
A61K47/60
A61K31/4745
A61K9/14
A61P35/00
C08G65/48
C07D491/22
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2022529467
(86)(22)【出願日】2020-12-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-20
(86)【国際出願番号】 US2020063321
(87)【国際公開番号】W WO2021113643
(87)【国際公開日】2021-06-10
【審査請求日】2022-10-18
(31)【優先権主張番号】62/943,594
(32)【優先日】2019-12-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/110,182
(32)【優先日】2020-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522197408
【氏名又は名称】ダンタリ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＴＡＲＩ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】エミリー エイ ワイアット
(72)【発明者】
【氏名】カール エム ブルーメンフェルト
(72)【発明者】
【氏名】ロバート ジェイ ラム
【審査官】田澤 俊樹
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１９５０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２１－５２８３６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Bioconjugate Chemistry，2013年，Vol.24，p.669-677
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
９／００－９／７２
３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ０８Ｇ ６５／４８
Ｃ０７Ｄ ４９１／２２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の構造【化1】
（式中、Ｒは、－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ｉ－Ｐｒ）－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ（ＣＨ ２ ｉ－Ｐｒ）－であり、
ｘは２０～２００であり；
ｙは５～２００である）を有する、粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）－ＳＮ３８コンジュゲート。
【請求項2】
請求項１に記載のＭＡＰ－ＳＮ３８コンジュゲートを含むナノ粒子。
【請求項3】
以下の構造【化2】
（式中、Ｒは、－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ｉ－Ｐｒ）－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ（ＣＨ ２ Ｐｈ）－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ －であり、
ｘは２０～２００であり；
ｙは５～２００である）を有する、粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項4】
ｘが、１１４である、請求項３に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項5】
ｘが、８０である、請求項３に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項6】
ｘが、４６である、請求項３に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項7】
ｙが、１６である、請求項３に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項8】
トランスフェリンがコンジュゲートしている、請求項３に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項9】
抗体がコンジュゲートしている、請求項３に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項10】
前記抗体がトラスツズマブである、請求項９に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項11】
（ａ）トランスフェリン、および（ｂ）抗体
がコンジュゲートしている、請求項３に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項12】
前記抗体が、トラスツズマブである、請求項１１に記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲート。
【請求項13】
請求項３～１２のいずれかに記載のＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲートを含む、ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）（１）に基づき、２０１９年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９４３，５９４号及び２０２０年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１０，１８２号の利益を主張し、これらの両開示は、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（連邦政府の支援に関する陳述）
該当なし。
該当なし。
【技術分野】
【0003】
本開示は、様々ながんを治療するためのナノ粒子の分野におけるものであり、前記ナノ粒子は、ポリマーコアを含み、１つ若しくは複数のホーミング分子（すなわち、標的化分子）及び／又は１つ若しくは複数の治療用分子をさらに含む。そのようなナノ粒子を合成するための改良方法が本明細書において提供される。
【背景技術】
【0004】
脳腫瘍及び脳転移など、多くの脳疾患の治療には、治療用分子を脳に送達する必要がある。脳への治療薬の直接送達は、被験体に深刻なリスク（例えば、頭蓋骨の破損）をもたらし、ほとんどの化学療法治療に必要とされるような継続的実施は現実的ではない。しかしながら、血液脳関門（ＢＢＢ）（脳の血管を裏打ちする内皮細胞が緊密に結合した層）が存在するため、全身送達（例えば、血流を介して）では、分子を効率よく脳に届けることはできない。血液腫瘍関門（ＢＴＢ）として知られる同様の透過関門が、特定の固形腫瘍に存在する。
【0005】
乳がんは脳に転移することが多く、これらの脳転移を乳がん治療に使用される化学療法分子により治療することは、該治療薬を十分な濃度で脳に送達できれば可能となる。そのような化学療法薬のひとつが、ＤＮＡトポイソメラーゼＩを阻害し、それによって細胞分裂を防ぐアルカロイドのカンプトテシンである。カンプトテシンは、細胞質などの水性環境での溶解性に問題があるため、溶解性の高いカンプトテシンの誘導体が開発されてきた。そのような誘導体の１つが７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン（ＳＮ３８）であり、これはもともとカンプトテシン類似体であるイリノテカンの代謝物として発見されたものである。
【0006】
ＢＢＢ及びＢＴＢを越えて治療薬を送達する問題に対処するために、化学療法分子とホーミング（すなわち、標的化）分子とを含むナノ粒子であって、ホーミング分子が脳内皮細胞（及び腫瘍血管系の内皮細胞）の表面に存在するトランスフェリン受容体に結合し、これによりナノ粒子がトランスサイトーシスによって内皮細胞を通過することができるようなナノ粒子が開発されている。例えば、米国特許第９，４６８，６８１号、米国特許第１０，１６６，２９１号及び米国特許第１０，１８２，９８６号を参照。これらの特許の各々は、あらゆる目的のために、又は少なくともナノ粒子の性質、それらの製造方法及び使用方法並びにそれらの操作形態に関する教示について、参照により本明細書に組み込まれる。
【0007】
そのようなナノ粒子の合成における特定の工程には、（１）粘液酸を重合可能な反応性誘導体（すなわち、「粘液酸モノマー」つまりＭＡＭ）に変換する工程、（２）粘液酸モノマーを重合して粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）を形成する工程、（３）治療用分子を選択的反応性誘導体に変換する工程及び（４）誘導体化された治療用分子の１つ又は複数をＭＡＰに結合させる工程、がある。
【0008】
血液脳関門及び血液腫瘍関門を通過することができる、カンプトテシン（ＣＰＴ）を含むナノ粒子が説明されてきた。例えば、米国特許第９，４４６，１４９号；第９，４６８，６８１号；第１０，１６６，２９１号及び米国特許出願公開第２０１９／０３８１１８８号（２０１９年１２月１９日）を参照（これらの各々は、あらゆる目的のために、又は少なくともナノ粒子の説明のために、参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、そのようなナノ粒子を調製するための既存の方法は、試薬及び時間を消費し、高温を必要とし、収率が低い。さらに、上述のように、水性条件下でより溶解性が高いＣＰＴの誘導体が好ましいと考えられる。したがって、ＣＰＴ及びＳＮ３８などのその誘導体などの化学療法薬を含むナノ粒子を合成するための改良方法であって、迅速で、反応物に関して経済的であり、収率が高い方法が必要とされている。
【0009】
さらに、非ＣＮＳ腫瘍などの非ＣＮＳ悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍の治療には、化学療法薬の送達のために改良されたビヒクルが有益であろう。
【発明の概要】
【0010】
本明細書で提供されるのは、粘液酸－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーと、カンプトテシン（ＣＰＴ）及びその誘導体並びに代謝物、例えば７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）などの化学療法薬とを含む治療用ナノ粒子を合成するための改良方法である。この改良には、特に、新規中間体と、より安定した反応物の使用と、より安定した中間体の形成と、より迅速な反応時間と、中間体及び生成物のより高い収率と、標的化（ホーミング）分子及び治療用分子（例えば、高分子治療薬、例えば、抗体）をナノ粒子にコンジュゲートさせるための新規リンカーとが含まれる。本明細書に記載の方法で使用するための誘導体化ナノ粒子（例えば、コンジュゲートされたＣＰＴ又はＳＮ３８分子を含む）も提供され、治療用ナノ粒子の組み立てに使用するための粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）コンジュゲート（例えば、ＣＰＴ、ＳＮ３８、トランスフェリン及び／又はトラスツズマブとコンジュゲートしたＭＡＰ）も提供される。
【0011】
したがって、本明細書で提供されるのは、特に、以下の実施形態である。
【0012】
１．粘液酸ジアミノクロリドから粘液酸ジ（アスパルチルアミン）ジトリフルオロアセテートを合成するための方法であって、
（ａ）以下の構造
を有する粘液酸ジアミノクロリドを、以下の構造
を有する粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）に変換する工程と、
（ｂ）粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）を、以下の構造
を有する粘液酸ジ（アスパルチルアミン）ジ－トリフルオロアセテートに変換する工程と
を含む、方法。
（ａ）以下の構造
【化1】
【化2】
（ｂ）粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）を、以下の構造
【化3】
を含む、方法。
【0013】
２．実施形態１に記載の方法であって、工程（ｂ）において、
（ａ）粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）が、以下の構造
を有する粘液酸ジ（アスパルチルアミン）中性種に変換され、
（ｂ）粘液酸ジ（アスパルチルアミン）中性種が粘液酸ジ（アスパルチルアミン）ジトリフルオロ酢酸に変換される、方法。
（ａ）粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）が、以下の構造
【化4】
（ｂ）粘液酸ジ（アスパルチルアミン）中性種が粘液酸ジ（アスパルチルアミン）ジトリフルオロ酢酸に変換される、方法。
【0014】
３．粘液酸ジ（アスパルチルアミン）ジトリフルオロアセテートを合成するための方法であって、以下の構造
を有する粘液酸ジ（アスパルチルアミン）中性種を、
以下の構造
を有する粘液酸ジ（アスパルチルアミン）ジトリフルオロアセテートへ変換する工程を含む、方法。
【化5】
以下の構造
【化6】
【0015】
４．以下の構造
を有する粘液酸ジ（アスパルチルアミン）中性種。
【化7】
【0016】
５．ＳＮ３８の１０－ＴＢＤＰＳ誘導体を合成するための方法であって、塩基（例えば、アミン塩基、例えば、トリアルキルアミン、例えば、トリエチルアミン）及び溶媒（例えば、ジクロロメタン（ＤＣＭ））中のＳＮ３８とｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ）との混合液を加熱する工程を含み、その生成物が以下の構造
を有する、方法。
【化8】
【0017】
特定の実施形態では、混合液を、１５℃～９０℃の範囲にある温度で５分～４８時間の範囲にある時間加熱する。さらなる実施形態では、反応の終了時に、反応混合液を、希酸（例えば、０．２ＮのＨＣｌ）、弱塩基（例えば、飽和ＮａＨＣＯ３）及びブラインで順次洗浄する。さらなる実施形態では、中和した溶液を（例えば、ＭｇＳＯ４で）乾燥させる。さらなる実施形態では、乾燥した溶液を真空蒸発させ、固体を与える。さらなる実施形態では、固体を再結晶化させる（例えば、残留物を（例えば、ＤＣＭに）溶解させ、生成物を（例えば、ヘキサンで）沈殿させることにより）。
【0018】
追加の実施形態では、２０－ＯＨ基及び／若しくは１０－ＯＨ基を有するＳＮ３８又はＣＰＴの誘導体又は類似体を、ＳＮ３８の代わりに出発物質として使用する。
【0019】
上記実施形態の組み合わせも、本明細書に開示される発明の追加的な実施形態として企図される。
【0020】
６．ＳＮ３８の２０－Ｂｏｃ－アミノアシル、１０－ＴＢＤＰＳ誘導体を合成するための方法であって、溶媒、塩基及びカップリング剤の存在下で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８とＢｏｃ－アミノ酸－ＯＨとを混合させる工程を含む、方法。特定の実施形態では、反応物を、溶媒（例えば、ＤＣＭ）及び／又はカップリング剤（例えば、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ））及び／又は塩基（例えば、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ））中で混合させる。特定の実施形態では、該反応を、０℃～２０℃又はその間の任意の整数値若しくは小数値の温度で行う。
【0021】
７．前記アミノ酸が、グリシン（Ｇｌｙ）、バリン（Ｖａｌ）、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及びヘキサン酸（Ｈｅｘ）からなる群より選択される、実施形態６に記載の方法。
【0022】
８．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８。
【化9】
【0023】
９．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８。
【化10】
【0024】
１０．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８。
【化11】
【0025】
１１．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８。
【化12】
【0026】
１２．ＳＮ３８の１０－ＯＢｏｃ誘導体（１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８）を合成するための方法であって、塩基（例えば、ピリジン）及び溶媒（例えば、ＤＣＭ）の存在下でＳＮ３８をジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネートと混合させる工程を含み、１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８が以下の構造
を有する、方法。
【化13】
【0027】
１３．ＳＮ３８の２０－（Ｂｏｃ－アミノアシル）、１０－ＯＢｏｃ誘導体を合成するための方法であって、溶媒（例えば、ＤＣＭ）、塩基（例えば、ＤＭＡＰ）及びカップリング剤（例えば、ＥＤＣ．ＨＣｌ）の存在下において、低温で、１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８をＢｏｃ－アミノ酸－ＯＨと混合させる工程を含み、２０－（Ｂｏｃ－アミノアシル）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８が以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、方法。特定の実施形態では、該反応を、０℃～２０℃又はその間の任意の整数値若しくは小数値の温度で行う。
【化14】
【0028】
１４．前記アミノ酸官能基が、グリシン（Ｇｌｙ ）、アラニン（Ａｌａ）、β－アラニン（β－Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）及びロイシン（Ｌｅｕ ）の官能基から選択される、実施形態１２に記載の方法。
【0029】
１５．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８。
【化15】
【0030】
１６．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ａｌａ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８。
【化16】
【0031】
１７．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－β－Ａｌａ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８。
【化17】
【0032】
１８．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８。
【化18】
【0033】
１９．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｌｅｕ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８。
【化19】
【0034】
２０．以下の構造
を有する、２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８。
【化20】
【0035】
２１．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８。
【化21】
【0036】
２２．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８。
【化22】
【0037】
２３．以下の構造
を有する、２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８。
【化23】
【0038】
２４．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８。
【化24】
【0039】
２５．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ａｌａ）－ＳＮ３８。
【化25】
【0040】
２６．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．β－Ａｌａ）－ＳＮ３８。
【化26】
【0041】
２７．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８。
【化27】
【0042】
２８．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ｌｅｕ）－ＳＮ３８。
【化28】
【0043】
２９．以下の構造
を有する、粘液酸ポリマー－ＳＮ３８コンジュゲート（ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８）。
【化29】
【0044】
特定の実施形態では、化合物１６におけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0045】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0046】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0047】
３０．以下の構造
を有する、粘液酸ポリマー－ＳＮ３８コンジュゲート（ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８）。
【化30】
【0048】
特定の実施形態では、化合物１７におけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0049】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0050】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0051】
３１．以下の構造
を有する、粘液酸ポリマー－ＳＮ３８コンジュゲート（ＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８）。
【化31】
【0052】
特定の実施形態では、化合物１８におけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0053】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0054】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0055】
３２．以下の構造
を有する粘液酸ポリマー－ＳＮ３８コンジュゲート（ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８）。
【化32】
【0056】
特定の実施形態では、化合物１９におけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0057】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0058】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0059】
３３．以下の構造
を有する粘液酸ポリマー－ＳＮ３８コンジュゲート（ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８）。
【化33】
【0060】
特定の実施形態では、化合物３７におけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0061】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0062】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0063】
３４．以下の構造
を有する、粘液酸ポリマー－ＳＮ３８コンジュゲート（ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８）。
【化34】
【0064】
特定の実施形態では、化合物３８におけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0065】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0066】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0067】
３５．以下の構造
を有する、粘液酸ポリマー－ＳＮ３８コンジュゲート（ＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８）。
【化35】
【0068】
特定の実施形態では、化合物３９におけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0069】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0070】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0071】
３６．実施形態２９～３５のいずれかに記載のＭＡＰ－ＳＮ３８コンジュゲートを含むナノ粒子。
【0072】
３７．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ。
【化36】
【0073】
３８．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－ＣＰＴ。
【化37】
【0074】
３９．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ａｌａ）－ＣＰＴ。
【化38】
【0075】
４０．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－β－Ａｌａ）－ＣＰＴ。
【化39】
【0076】
４１．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－ＣＰＴ。
【化40】
【0077】
４２．以下の構造
を有する、２０－（Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ。
【化41】
【0078】
４３．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ。
【化42】
【0079】
４４．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ａｌａ）－ＣＰＴ。
【化43】
【0080】
４５．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．β－Ａｌａ）－ＣＰＴ。
【化44】
【0081】
４６．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ｖａｌ）－ＣＰＴ。
【化45】
【0082】
４７．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＣＰＴ。
【化46】
【0083】
４８．以下の構造
を有する、２０－（ＴＦＡ．Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ。
【化47】
【0084】
４９．以下構造
を有するニトロフェニルボロン酸－ポリエチレングリコールコンジュゲート（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡ）を合成するための方法であって、
（ａ）塩基（例えば、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ）及び溶媒（例えば、ＤＣＭ）中にＮＨ２－ＰＥＧ－酢酸（ＡＡ）を懸濁させる工程と、
（ｂ）３－カルボキシ－５－ニトロフェニルボロン酸を溶媒混合液（例えば、ＤＣＭ及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））に溶解させる工程と、
（ｃ）（ｂ）の溶液にカップリング剤（例えば、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン、ＥＥＤＱ）を添加する工程と、
（ｄ）（ａ）及び（ｃ）の溶液を混合させる工程と、
（ｅ）該混合液を酸性化する工程と
を含み、
ｎが、２～２，０００又はその間の任意の整数値、例えば、１００～３００、２０～３００、１２０～１８０及び／若しくは１４０～１６０の範囲にある数である、方法。
【化48】
（ａ）塩基（例えば、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ）及び溶媒（例えば、ＤＣＭ）中にＮＨ２－ＰＥＧ－酢酸（ＡＡ）を懸濁させる工程と、
（ｂ）３－カルボキシ－５－ニトロフェニルボロン酸を溶媒混合液（例えば、ＤＣＭ及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））に溶解させる工程と、
（ｃ）（ｂ）の溶液にカップリング剤（例えば、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン、ＥＥＤＱ）を添加する工程と、
（ｄ）（ａ）及び（ｃ）の溶液を混合させる工程と、
（ｅ）該混合液を酸性化する工程と
を含み、
ｎが、２～２，０００又はその間の任意の整数値、例えば、１００～３００、２０～３００、１２０～１８０及び／若しくは１４０～１６０の範囲にある数である、方法。
【0085】
特定の実施形態では、該反応を、低温、例えば、０℃～２０℃の範囲にある又はその間の任意の整数若しくは小数値の温度で行い、その後、周囲温度まで温めてから酸性化及び精製を行う。特定の実施形態では、混合液を、ｐＨが約４になるまで酸性化させる。追加の実施形態では、生成物を、溶媒（例えば、酢酸イソプロピル、ｉＰｒＯＡｃ）での抽出によって精製する。
【0086】
特定の実施形態では、ｎの値は、化合物のＰＥＧ（すなわち、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）部位の重量平均分子量が約２～約１５ｋＤａの範囲にある、例えば、約２ｋＤａ、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ又は約１５ｋＤａとなるようなものである。
【0087】
５０．以下の構造
を有する、化合物（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡ－ＰＦＰ）。
【化49】
【0088】
特定の実施形態では、ｎは、２～２，０００又はその間の任意の整数値、例えば、１００～３００、２０～３００、１２０～１８０及び／若しくは１４０～１６０の範囲にある数である。
【0089】
特定の実施形態では、ｎの値は、化合物のＰＥＧ（すなわち、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）部位の重量平均分子量が約２～約１５ｋＤａの範囲にある、例えば、約２ｋＤａ、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ又は約１５ｋＤａとなるようなものである。
【0090】
５１．実施形態５０の化合物を製造するための方法であって、
実施形態４９のＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡを、ビス（ペンタフルオロフェニル）カーボネート及び塩基触媒（例えば、Ｎ－メチルモルホリン）と混合させる工程
を含む、方法。
実施形態４９のＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡを、ビス（ペンタフルオロフェニル）カーボネート及び塩基触媒（例えば、Ｎ－メチルモルホリン）と混合させる工程
を含む、方法。
【0091】
５２．ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－トランスフェリンコンジュゲートを合成するための方法であって、
実施形態５０のＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡ－ＰＦＰをホロトランスフェリン（すなわち、鉄結合トランスフェリン）と混合させる工程
を含む、方法。
実施形態５０のＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡ－ＰＦＰをホロトランスフェリン（すなわち、鉄結合トランスフェリン）と混合させる工程
を含む、方法。
【0092】
５３．ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－トラスツズマブコンジュゲートを合成するための方法であって、
実施形態５０のＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡ－ＰＦＰをトラスツズマブと混合させる工程
を含む、方法。
実施形態５０のＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡ－ＰＦＰをトラスツズマブと混合させる工程
を含む、方法。
【0093】
５４．ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－治療用ポリペプチドコンジュゲートを合成するための方法であって、
実施形態５０のＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡ－ＰＦＰを治療用ポリペプチドと混合させる工程
を含む、方法。
実施形態５０のＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡ－ＰＦＰを治療用ポリペプチドと混合させる工程
を含む、方法。
【0094】
５５．以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、ＳＮ３８の２０－Ｂｏｃ－アミノアシル、１０－ＴＢＤＰＳ誘導体（２０－（Ｂｏｃ－アミノアシル）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８）。「Ｒは１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である」という用語は、上記構造における－ＮＨ－Ｒ－ＣＯ２－（すなわち、該構造のＳＮ３８部位とＭＡＰ／ＰＥＧ部位との間のリンカー）がアミノ酸を表すという事実を反映している。「１つ又は複数」は、リンカーが複数のアミノ酸を含み得る、すなわち、リンカーがジペプチド、トリペプチド又はオリゴペプチドであり得るという事実を反映している。
【化50】
【0095】
５６．アミノ酸官能基が、グリシン、バリン、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及びヘキサン酸の官能基から選択される、実施形態５５に記載の２０－Ｂｏｃ－アミノアシル、１０－ＴＢＤＰＳのＳＮ３８誘導体。
【0096】
５７．以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、ＳＮ３８の２０－Ｂｏｃ－アミノアシル、１０－ＯＢｏｃ誘導体（２０－（Ｂｏｃ－アミノアシル）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８）。「Ｒは１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である」という用語は、上記構造における－ＮＨ－Ｒ－ＣＯ２－（すなわち、該構造のＳＮ３８部位とＭＡＰ／ＰＥＧ部位との間のリンカー）がアミノ酸を表すという事実を反映している。「１つ又は複数」は、リンカーが複数のアミノ酸を含み得る、すなわち、リンカーがジペプチド、トリペプチド又はオリゴペプチドであり得るという事実を反映している。
【化51】
【0097】
５８．アミノ酸官能基が、グリシン、アラニン、β－アラニン、バリン及びロイシンの官能基から選択される、実施形態５７に記載の２０－Ｂｏｃ－アミノアシル、１０－ＯＢｏｃのＳＮ３８誘導体。
【0098】
５９．以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、ＳＮ３８の２０－アミノアシル誘導体のＨＣｌ塩（２０－（ＨＣｌ．アミノアシル）－ＳＮ３８）。「Ｒは１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である」という用語は、上記構造における－ＮＨ－Ｒ－ＣＯ２－（すなわち、該構造のＳＮ３８部位とＭＡＰ／ＰＥＧ部位との間のリンカー）がアミノ酸を表すという事実を反映している。「１つ又は複数」は、リンカーが複数のアミノ酸を含み得る、すなわち、リンカーがジペプチド、トリペプチド又はオリゴペプチドであり得るという事実を反映している。
【化52】
【0099】
６０．アミノ酸官能基がグリシン及びバリンの官能基から選択される、実施形態５９に記載のＨＣｌ塩。
【0100】
６１．以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、ＳＮ３８の２０－アミノアシル誘導体のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩（２０－（ＴＦＡ．アミノアシル）－ＳＮ３８）。「Ｒは１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である」という用語は、上記構造における－ＮＨ－Ｒ－ＣＯ２－（すなわち、該構造のＳＮ３８部位とＭＡＰ／ＰＥＧ部位との間のリンカー）がアミノ酸を表すという事実を反映している。「１つ又は複数」は、リンカーが複数のアミノ酸を含み得る、すなわち、リンカーがジペプチド、トリペプチド又はオリゴペプチドであり得るという事実を反映している。
【化53】
【0101】
６２．アミノ酸官能基が、グリシン、アラニン、β－アラニン、バリン、ＧＡＢＡ、ヘキサン酸及びロイシンの官能基から選択される、実施形態６１に記載のＴＦＡ塩。
【0102】
６３．以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）－アミノ酸－ＳＮ３８コンジュゲート。「Ｒは１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である」という用語は、上記構造における－ＮＨ－Ｒ－ＣＯ２－（すなわち、該構造のＳＮ３８部位とＭＡＰ／ＰＥＧ部位との間のリンカー）がアミノ酸を表すという事実を反映している。「１つ又は複数」は、リンカーが複数のアミノ酸を含み得る、すなわち、リンカーがジペプチド、トリペプチド又はオリゴペプチドであり得るという事実を反映している。
【化54】
【0103】
特定の実施形態では、ＭＡＰ－アミノ酸－ＳＮ３８コンジュゲートにおけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0104】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0105】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0106】
６４．アミノ酸官能基が、グリシン、アラニン、β－アラニン、バリン、ＧＡＢＡ、ヘキサン酸及びロイシンの官能基から選択される、実施形態６３に記載のＭＡＰ－アミノ酸－ＳＮ３８コンジュゲート。
【0107】
６５．実施形態６３又は６４のいずれかに記載のＭＡＰ－アミノ酸－ＳＮ３８コンジュゲートを含むナノ粒子。
【0108】
６６．以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、カンプトテシンの２０－Ｂｏｃ－アミノアシル誘導体（２０－（Ｂｏｃ－アミノアシル）－ＣＰＴ）。「Ｒは１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である」という用語は、上記構造における－ＮＨ－Ｒ－ＣＯ２－（すなわち、該構造のＳＮ３８部位とＭＡＰ／ＰＥＧ部位との間のリンカー）がアミノ酸を表すという事実を反映している。「１つ又は複数」は、リンカーが複数のアミノ酸を含み得る、すなわち、リンカーがジペプチド、トリペプチド又はオリゴペプチドであり得るという事実を反映している。
【化55】
【0109】
６７．アミノ酸官能基が、グリシン、バリン、アラニン、β－アラニン、ＧＡＢＡ及びジペプチドフェニルアラニン－グリシンの官能基から選択される、実施形態６６に記載の２０－（Ｂｏｃ－アミノアシル）ＣＰＴ誘導体。
【0110】
６８．以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、ＣＰＴの２０－アミノアシル誘導体のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩（２０－（ＴＦＡ．アミノアシル）－ＣＰＴ）。「Ｒは１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である」という用語は、上記構造における－ＮＨ－Ｒ－ＣＯ２－（すなわち、該構造のＳＮ３８部位とＭＡＰ／ＰＥＧ部位との間のリンカー）がアミノ酸を表すという事実を反映している。「１つ又は複数」は、リンカーが複数のアミノ酸を含み得る、すなわち、リンカーがジペプチド、トリペプチド又はオリゴペプチドであり得るという事実を反映している。
【化56】
【0111】
６９．アミノ酸官能基が、グリシン、アラニン、β－アラニン、バリン、ＧＡＢＡ及びジペプチドフェニルアラニン－グリシンの官能基から選択される、実施形態６８に記載のＴＦＡ塩。
【0112】
７０．以下の構造
（式中、Ｒは、任意選択でアミノ酸官能基に結合した１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である）を有する、粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）－アミノ酸－ＣＰＴコンジュゲート。「Ｒは１つ又は複数のアミノ酸のα－炭素原子である」という用語は、上記構造における－ＮＨ－Ｒ－ＣＯ２－（すなわち、該構造のＳＮ３８部位とＭＡＰ／ＰＥＧ部位との間のリンカー）がアミノ酸を表すという事実を反映している。「１つ又は複数」は、リンカーが複数のアミノ酸を含み得る、すなわち、リンカーがジペプチド、トリペプチド又はオリゴペプチドであり得るという事実を反映している。特定の実施形態では、アミノ酸官能基は、アラニン、β－アラニン、バリン、ＧＡＢＡ及びジペプチドフェニルアラニン－グリシンの官能基から選択される。
【化57】
【0113】
特定の実施形態では、ＭＡＰ－アミノ酸－ＣＰＴコンジュゲートにおけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５の範囲にある数である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0114】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0115】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0116】
７１．実施形態７０に記載のＭＡＰ－アミノ酸－ＣＰＴコンジュゲートを含むナノ粒子。
【発明を実施するための形態】
【0117】
本開示は、付随する実施例に関連してなされる以下の説明を参照することによってより容易に理解され得、これらのすべては本開示の一部を形成するものである。本開示は、本明細書に記載され、又は示される特定の生成物、方法、条件又はパラメータに限定されないこと、及び本明細書に使用される用語は、例示としてのみ特定の実施形態を説明することを目的としており、クレームされた発明を限定するものでもないことが理解されよう。同様に、特に別段の記載がない限り、可能性のある機構若しくは作用様式又は改善理由に関するいかなる説明も、例示することのみを意図しており、本明細書の開示は、そのような示唆された機構若しくは作用様式又は改善理由の正否によって拘束されないものとする。この文章を通して、説明は、組成物及び前記組成物の製造方法及び使用方法に言及することが認識される。すなわち、本開示が、組成物又は組成物を製造若しくは使用する方法に関連する特徴又は実施形態を説明し、又はクレームする場合、そのような説明又はクレームは、これらの特徴又は実施形態を、これらの文脈（すなわち、組成物、製造方法及び使用方法）の各々における実施形態に拡張することが意図されていることが理解される。
【0118】
本開示において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数形への言及を含み、特定の数値への言及は、文脈が明らかに別段のことを示さない限り、少なくともその特定の数値を含む。したがって、例えば、「ある材料」への言及は、当業者に知られているそのような材料及びその同等物等の少なくとも１つへの言及である。
【0119】
値が「約」という記述語を使用して近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。一般に、「約」という用語の使用は、開示された主題によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値であって、その機能に基づいて、使用される特定の文脈で解釈されるものを示す。当業者であれば、これを通常のこととして解釈することができるであろう。場合によっては、特定の値に使用される有効数字の数は、「約」という単語の範囲を決定する１つの非限定的な方法であり得る。その他の場合では、一連の値で使用される漸次的変化を使用して、各値について「約」という用語に利用可能な意図された範囲を決定することができる。存在する場合、すべての範囲は包括的であり、組み合わせが可能である。すなわち、範囲内に記載の値への言及は、その範囲内のすべての値を含む。
【0120】
明確にするために、本明細書において別個の実施形態の文脈で説明されている本開示の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解されよう。すなわち、明らかに相容れないか、又は明確に除外されない限り、個々の実施形態は、他の任意の実施形態（複数可）と組み合わせ可能であるとみなされ、そのような組み合わせは、別の実施形態であるとみなされる。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明されている本開示の様々な特徴も、別個に又は任意のサブコンビネーションで提供され得る。最後に、実施形態は、一連の工程の一部又はより一般的な構造の一部として記載される場合があるが、各前記工程はまた、それ自体が独立した実施形態であり、他のものと組み合わせ可能であると考えることができる。
【0121】
「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行句は、特許用語で一般的に受け入れられている意味でそれらを含意することを意図している。すなわち、（ｉ）「含む」は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的な又は制限がないものであり、追加の、引用されていない要素又は方法工程を除外することはない。（ｉｉ）「からなる」は、クレームで指定されていない要素、工程又は成分を除外する。（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、クレームの範囲を、クレームに係る発明の「基本的及び新規な特性（複数可）に実質的に影響を与えない」指定の材料又は工程に限定する。また、「含む」（又はその同等物）という句の観点から説明される実施形態は、実施形態として、「からなる」及び「から本質的になる」の観点から独立して説明されるものも提供する。「から本質的になる」の観点から規定される実施形態については、基本的かつ新規な特性（複数可）は、本発明の材料を調製し、及び使用する方法（及びそのような方法で使用されるシステム及びそこから得られる組成物）並びに材料自体の容易な操作性であり、該方法及び材料は、クレームに規定される要素のみを使用して強調される特性を実現することが可能である。すなわち、他の材料も本発明の組成物中に存在し得るが、これらの追加の材料の存在は、それらの組成物の記載された利点を提供するために必要ではなく（すなわち、効果は相加的であってもよい）、及び／又はこれらの追加の材料は生成物組成の性能を損なうことはない。同様に、追加の工程も該方法に採用され得る場合、それらの存在は、記載の効果又は利点を達成するために必要ではなく、及び／又はそれらは、記載の効果又は利点を損なうことはない。
【0122】
リストが提示される場合、特に別段の記載がない限り、そのリストの個々の要素及びそのリストのすべての組み合わせは、別個の実施形態であると理解される。例えば、「Ａ、Ｂ又はＣ」として提示された実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ若しくはＢ」、「Ａ若しくはＣ」、「Ｂ若しくはＣ」又は「Ａ、Ｂ若しくはＣ」を含むものと解釈される。同様に、Ｃ１－３アルキルなどの用語は、別の実施形態として、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ１－２アルキル及びＣ２－３アルキルも含む。
【0123】
本明細書を通して、単語は、関連する技術分野の当業者に理解されるような通常の意味を持つものとする。ただし、誤解を避けるために、特定の用語の意味が具体的に定義され、又は明確化される。
【0124】
アルコール、アルデヒド、アミン、カルボン酸、ケトン又は他の同様に反応性のある官能基への言及は、それらの保護された類似体も含む。例えば、ヒドロキシ又はアルコールへの言及は、ヒドロキシが、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ、Ｂｎｌ）、β－メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル、［ビス－（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル，ＭＭＴ）、ｐ－メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）、シリルエーテル（最も一般的なものには、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ－イソ－プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）及びトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテルが含まれる）、エトキシエチルエーテル（ＥＥ）により保護されている置換基も含む。アミンへの言及は、アミンが、ＢＯＣグリシン、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ－メトキシベンジルカルボニル（Ｍｏｚ又はＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、カルバメート、ｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３，４－ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ－メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トシル（Ｔｓ）基又はスルホンアミド（Ｎｏｓｙｌ及びＮｐｓ）基により保護されている置換基も含む。カルボニル基を含む置換基には、カルボニルが、アセタール若しくはケタール、アシラール又はジアタン基で保護されている置換基も含まれる。カルボン酸又はカルボキシレート基を含む置換基の言及は、カルボン酸又はカルボキシレート基が、そのメチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル、２，６－二置換フェノールのエステル（例えば、２，６－ジメチルフェノール、２，６－ジイソプロピルフェノール、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール）、シリルエステル、オルトエステル又はオキサゾリンにより保護されている置換基も含む。
【0125】
（略語）
ＡＡ：酢酸
ＡＣＮ：アセトニトリル
Ａｌａ：アラニン、アラニル
ＡＲＳ：アリザリンレッドＳ
Ａｓｐ：アスパラギン酸塩、アスパラギン酸
β－Ａｌａ：β－アラニン、β－アラニル
ＢＢＢ：血液脳関門
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＢＴＢ：血液腫瘍関門
ＣＰＭＥ：シクロペンチルメチルエーテル
ＣＰＴ：カンプトテシン
ＣＶ：カラム容量
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチアミン
ジＳＰＡ－ＰＥＧ：ジ（スクシンイミジルプロピオネート）－ＰＥＧ
ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ．ＨＣｌ：１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩
ＥＥＤＱ：Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＧＡＢＡ：γ－アミノ酪酸、γ－アミノブチリル
Ｇｌｙ：グリシン、グリシル
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＨＢＳＳ：ハンクス平衡塩溶液
ＨＣｌ：塩酸
Ｈｅｘ：６－アミノヘキサン酸
ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＯＰＯ：ヒドロキシピリジンＮ－オキシド
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ｉＰｒＯＡｃ：酢酸イソプロピル
ＭＡＭ：重合性粘液酸モノマー
ＭＡＰ：粘液酸ポリマー
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
ＮＰ（又はＰ）：ナノ粒子
ＮＰＢＡ：３－カルボキシ－５－ニトロフェニルボロン酸
モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－Ｔｆ：トランスフェリンのモノＰＥＧ化画分
モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－Ｔｒａｓ：トラスツズマブのモノＰＥＧ化画分
ＰＥＯ：ポリエチレンオキシド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
ＰＦＰ：ペンタフルオロフェニル
ＰｙＡＯＰ：（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＳＮ３８：７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン
ＳｐＰ：粒子あたりのストランド
ＴＢＤＰＳ：ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシラン；ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル
ＴＢＤＰＳＣｌ：ｔｅｒｔ－ブトリル（クロロ）ジフェニルシラン
ＴＥＡ：トリエチルアミン
Ｔｆ：ホロ－トランスフェリン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｔｒａｓ：トラスツズマブ
ＵＦ／ＤＦ：限外濾過及び透析濾過
Ｖａｌ：バリン、バリル
ＡＡ：酢酸
ＡＣＮ：アセトニトリル
Ａｌａ：アラニン、アラニル
ＡＲＳ：アリザリンレッドＳ
Ａｓｐ：アスパラギン酸塩、アスパラギン酸
β－Ａｌａ：β－アラニン、β－アラニル
ＢＢＢ：血液脳関門
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＢＴＢ：血液腫瘍関門
ＣＰＭＥ：シクロペンチルメチルエーテル
ＣＰＴ：カンプトテシン
ＣＶ：カラム容量
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチアミン
ジＳＰＡ－ＰＥＧ：ジ（スクシンイミジルプロピオネート）－ＰＥＧ
ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ．ＨＣｌ：１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩
ＥＥＤＱ：Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＧＡＢＡ：γ－アミノ酪酸、γ－アミノブチリル
Ｇｌｙ：グリシン、グリシル
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＨＢＳＳ：ハンクス平衡塩溶液
ＨＣｌ：塩酸
Ｈｅｘ：６－アミノヘキサン酸
ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＯＰＯ：ヒドロキシピリジンＮ－オキシド
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ｉＰｒＯＡｃ：酢酸イソプロピル
ＭＡＭ：重合性粘液酸モノマー
ＭＡＰ：粘液酸ポリマー
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
ＮＰ（又はＰ）：ナノ粒子
ＮＰＢＡ：３－カルボキシ－５－ニトロフェニルボロン酸
モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－Ｔｆ：トランスフェリンのモノＰＥＧ化画分
モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－Ｔｒａｓ：トラスツズマブのモノＰＥＧ化画分
ＰＥＯ：ポリエチレンオキシド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
ＰＦＰ：ペンタフルオロフェニル
ＰｙＡＯＰ：（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＳＮ３８：７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン
ＳｐＰ：粒子あたりのストランド
ＴＢＤＰＳ：ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシラン；ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル
ＴＢＤＰＳＣｌ：ｔｅｒｔ－ブトリル（クロロ）ジフェニルシラン
ＴＥＡ：トリエチルアミン
Ｔｆ：ホロ－トランスフェリン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｔｒａｓ：トラスツズマブ
ＵＦ／ＤＦ：限外濾過及び透析濾過
Ｖａｌ：バリン、バリル
【0126】
（反応成分）
本明細書に記載の手順には、当該技術分野で知られている標準的な溶媒及び触媒が含まれる。特定の化合物（例えば、酸、塩基、カップリング剤）が本開示に記載されているが、異なる試薬を使用できることは当業者には明らかである。
本明細書に記載の手順には、当該技術分野で知られている標準的な溶媒及び触媒が含まれる。特定の化合物（例えば、酸、塩基、カップリング剤）が本開示に記載されているが、異なる試薬を使用できることは当業者には明らかである。
【0127】
そのため、例示的な溶媒には、塩素系溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン）、エーテル（例えば、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ジグライム、１，４－ジオキサン、２－メチルテトラヒドロフラン）、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノール）、アルカン（例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン）、グリコール（例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール）、極性非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン）及び極性プロトン性溶媒（例えば、水、エタノール、酢酸、プロピオン酸）が含まれるが、これらに限定されない。
【0128】
例示的な酸には、鉱酸（例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸）及び有機酸（例えば、酢酸、マロン酸、メタンスルホン酸、プロピオン酸、チオ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリブロモ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸）が含まれるが、これらに限定されない。
【0129】
例示的な塩基には、アミノ塩基（例えば、１，４－ジアザビシクロ［２．２］オクタン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、リチウムアミド、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、モルホリン、ピペリジン）、アルコキシド（例えば、バリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、リチウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ナトリウムメトキシド）、水酸化物（例えば、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、有機金属塩基（例えば、ｎ－ブチリチウム、ｔｅｒｔ－ブチリチウム、ブチルマグネシウムクロリド）、ピリジン（例えば、４－ジメチルアミノピリジン、２，６－ルチジン、ピリジン）、炭酸塩（例えば、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カリウム）及び水素化物（例えば、水素化ナトリウム、水素化カルシウム、水素化カリウム）が含まれるが、これらに限定されない。
【0130】
例示的なカップリング剤には、カルボジイミド試薬（例えば、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ’－ジシクロペンチルカルボジイミド）、カルボジイミド試薬用添加剤（例えば、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール、６－クロロ－１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、１－ヒドロキシ－２－ピリジノン、６－クロロ－Ｎ－ヒドロキシ－２－フェニルベンズイミダゾール、エチル２－シアノ－２－（ヒドロキシイミノ）酢酸塩）、無水物系又は形成試薬（例えば、ジタートブチルカーボネート、無水酢酸、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン、クロロギ酸エチル）、アシルアゾール（例えば、カルボニルジイミダゾール）、酸ハロゲン化物生成試薬（例えば、塩化チオニル、ホスゲン、塩化シアヌル、三フッ化二水素ベンジルトリフェニルホスホニウム）、ホスホニウム塩カップリング試薬（例えば、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、テトラメチルアミニウム試薬（例えば、２－（２－オキソ－１（２Ｈ）－ピリジル－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、アミニウム試薬（例えば、２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート）、オキシマウラン塩（例えば、１－（（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）（モルホリノ）メチレン）ピロリジニウムヘキサフルオロホスフェート）、アンチモン酸ウラン塩（例えば、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－メタンイミニウムヘキサクロロアンチモン酸）、有機リン試薬（例えば、シアノホスホン酸ジエチル、１－オキソ－クロロホスホラン、２－プロパンホスホン酸無水物）、トリアジン系試薬（例えば、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）、有機硫黄試薬（例えば、ペンタフルオロフェニル－４－ニトロベンゼンスルホネート）、ピリジニウム試薬（例えば、２－クロロ－１－メチルピリジニウムヨウ化物）、ポリマー結合試薬（例えば、ポリマー担持Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン）が含まれるが、これらに限定されない。
【0131】
（重合性粘液酸モノマー（ＭＡＭ）の合成）
本明細書では、とりわけ、粘液酸の重合性誘導体（「粘液酸モノマー」すなわちＭＡＭ）を合成するための方法を提供する。第一段階では、硫酸の存在下で粘液酸をメタノール（ＭｅＯＨ）と反応させ、粘液酸の１，６－ジメチルジエステル（化合物１）を形成する。次に、このジエステルをトリエチルアミン（ＴＥＡ）及びＭｅＯＨの存在下でＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミンと反応させ、Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸エチレンジアミン（化合物２）を形成する。
本明細書では、とりわけ、粘液酸の重合性誘導体（「粘液酸モノマー」すなわちＭＡＭ）を合成するための方法を提供する。第一段階では、硫酸の存在下で粘液酸をメタノール（ＭｅＯＨ）と反応させ、粘液酸の１，６－ジメチルジエステル（化合物１）を形成する。次に、このジエステルをトリエチルアミン（ＴＥＡ）及びＭｅＯＨの存在下でＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミンと反応させ、Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸エチレンジアミン（化合物２）を形成する。
【0132】
Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸エチレンジアミンの分取スケールの代替方法では、硫酸の存在下で粘液酸をＭｅＯＨと反応させてメトキシル化粘液酸誘導体を生成し、次にＴＥＡ及びＭｅＯＨ中でメトキシル化粘液酸をＮ－（２－アミノエチル）（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボキサミドと反応させてＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミンを生成する。実施例２４を参照。
【0133】
従来の方法では、この第一段階（すなわち、粘液酸のＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸エチレンジアミンへの変換）を２つの別々の反応で行っていた。まず、ジエステルを形成し、ジエステルを精製し、次に単離したジエステルをＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸エチレンジアミンに変換していた。例えば、米国特許第１０，１６６，２９１号及び米国特許出願公開第２０１９／０３８１１８８号（２０１９年１２月１９日）を参照。本明細書に記載の方法において、粘液酸のＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸エチレンジアミンへの変換は、単一の反応で達成される。実施例１を参照。
【0134】
また、前述の実施形態のうちの２つ以上の任意のすべての組み合わせも、本明細書に開示される発明の追加の実施形態として企図される。
【0135】
次の段階では、Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸エチレンジアミンから、ＭｅＯＨ及びＨＣｌと反応させてＢｏｃ保護基を除去する。これにより、Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸エチレンジアミンは、粘液酸エチレンジアミンクロリド（化合物３）に変換される。実施例２を参照。ＭｅＯＨ及びＨＣｌとの反応による粘液酸エチレンジアミン塩化物（粘液酸ジアミノクロリド）を調製するための代替の分取スケールの方法を、実施例２５に提供する。
【0136】
次の段階では、ヒドロキシピリジンＮ－オキシド（ＨＯＰＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びアセトニトリル（ＡＣＮ）の存在下で、粘液酸ジアミノクロリドをＢｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸４－ｔｅｒｔ－ブチルエステルと反応させて、粘液酸エチレンジアミンクロリドを粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）（化合物４）に変換させる。実施例３を参照。反応時間は、１５℃～９０℃の範囲にある温度で、５分～４８時間の範囲とすることができる。従来の方法では、粘液酸エチレンジアミンをＡＣＮ及びピリジンの存在下でジ（アスパルチル（Ｏ－ベンジル）－Ｂｏｃ）と反応させると、本明細書に開示の方法で使用されるジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）保護基ではなくジ（アスパルチル（Ｏ－ベンジル）－Ｂｏｃ）保護基（例えば、米国特許出願公開第２０１９／０３８１１８８（２０１９年１２月１９日））を付加する結果となった。したがって、本明細書に記載の方法は、新たな試薬（ピリジンの代わりにＨＯＰＯ及びＤＩＣ）並びに異なる保護基（Ｏ－ベンジルの代わりにＯ－ｔ－ブチル）を利用する。従来の方法で使用していたベンジル基と比較して、本方法で使用するｔ－ブチル保護基の利点は、ｔ－ブチル保護基をＨＣｌ又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去できることである。したがって、次の合成段階で、１つの試薬（例えば、ＴＦＡ又はＨＣｌ）で両方の保護基（ｔ－ブチル及びＢｏｃ）を除去することができる。
【0137】
粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）を分取スケールで合成するための代替方法は、Ｂｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸４－ｔｅｒｔ－ブチルエステルとシアノヒドロキシイミノ酢酸エチル（オキシマ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）中で反応させて、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）を添加しながら進める方法である。この混合液を、炭酸ナトリウムの水溶液中で粘液酸ジアミノクロリド（化合物３）と混合させる。水相を蒸留除去しながらＡＣＮを加えて、クルード生成物を濃縮し、結晶化させる。実施例２６を参照。
【0138】
また、前述の実施形態のうちの２つ以上の任意のすべての組み合わせも、本明細書に開示される発明の追加の実施形態として企図される。
【0139】
粘液酸重合性モノマーの合成の最終段階では、ＤＣＭの存在下で粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）をＴＦＡと反応させることにより、粘液酸ジ（アスパルチルアミン）（化合物５）に変換する。実施例４を参照。反応時間は、１５℃～９０℃の範囲にある温度で５分～９６時間の範囲とすることができる。従来の方法（例えば、米国特許出願公開第２０１９／０３８１１８８号（２０１９年１２月１９日）を参照）は、この変換に２つの工程を必要としており、最初に粘液酸ジ（Ａｓｐ（Ｏ－ベンジル）－Ｂｏｃ）を粘液酸ジ（Ａｓｐ（Ｏ－ベンジル）－アミンに変換し、次に粘液酸ジ（Ａｓｐ（Ｏ－ベンジル）－アミンを粘液酸ジ（Ａｓｐ－アミン）に変換していた。本明細書に記載の方法におけるｔ－ブチル及びＢｏｃ保護基の使用（前述のＯ－ベンジル及びＢｏｃ保護基の代わりに）は、水溶液又は有機溶液中で１工程で２つの保護基の除去を可能にし、均一系又は不均一系水素化の必要性を回避することができる。
【0140】
分取スケールの用途では、粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）を粘液酸ジ（アスパルチルアミン）中性種（化合物２０）に変換し、これを粘液酸ジ（アスパルチルアミン）のジＴＦＡ塩（化合物５）に変換する。これらの実施形態では、粘液酸ジ（アスパルチル（Ｏ－ｔ－ブチル）－Ｂｏｃ）をＤＣＭ及び水中でＴＦＡ及びトリイソプロピルシランと反応させ、任意選択でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を使用してさらに再結晶して、粘液酸モノマー中性種（２０）を形成することができる。実施例２７を参照。次に、中性粘液酸モノマーをＤＣＭ及び水中でＴＦＡと反応させ、エーテル中の化合物５の種結晶の溶液と合わせて、ＭＡＭ－ジＴＦＡ塩（５）を沈殿させることができる。実施例２８を参照。
【0141】
また、前述の実施形態のうちの２つ以上の任意のすべての組み合わせも、本明細書に開示される発明の追加の実施形態として企図される。
【0142】
（粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）の合成）
本明細書で提供されるのは、特に、粘液酸のポリマー（「粘液酸ポリマー」すなわちＭＡＰ）を合成するための方法である。特定の実施形態では、ジＴＦＡ－粘液酸ジ（アスパルチルアミン）（ＭＡＭ、化合物５）を、溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）中でジ（スクシンイミジルプロピオン酸）－ＰＥＧ（ジＳＰＡ－ＰＥＧ）（例えば、ジＳＰＡ－ＰＥＧ３．５ｋ）と混合し、塩基（例えば、Ｎ、Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ）を加え、１５℃～７０℃の範囲にある温度（例えば、３５℃）で、１時間～９６時間（例えば、６６時間）の範囲にある時間で反応を行う。所望のポリマー長（一般に１０ｋＤａ～１２０ｋＤａの範囲）が得られた後、反応混合液をＤＭＳＯで透析し、水で透析し、濾過して、ＭＡＰ（化合物６）を得る。
本明細書で提供されるのは、特に、粘液酸のポリマー（「粘液酸ポリマー」すなわちＭＡＰ）を合成するための方法である。特定の実施形態では、ジＴＦＡ－粘液酸ジ（アスパルチルアミン）（ＭＡＭ、化合物５）を、溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）中でジ（スクシンイミジルプロピオン酸）－ＰＥＧ（ジＳＰＡ－ＰＥＧ）（例えば、ジＳＰＡ－ＰＥＧ３．５ｋ）と混合し、塩基（例えば、Ｎ、Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ）を加え、１５℃～７０℃の範囲にある温度（例えば、３５℃）で、１時間～９６時間（例えば、６６時間）の範囲にある時間で反応を行う。所望のポリマー長（一般に１０ｋＤａ～１２０ｋＤａの範囲）が得られた後、反応混合液をＤＭＳＯで透析し、水で透析し、濾過して、ＭＡＰ（化合物６）を得る。
【化58】
【0143】
ポリマーの分子量は、ＭＡＭとジＳＰＡ－ＰＥＧのモル比を調整することによって制御され、反応物のモル比が１：１のときに最も高い分子量が得られる。ＭＡＭとジＳＰＡ－ＰＥＧのモル比が１より大きくても小さくても、得られるポリマーの分子量は減少する。本発明者らの実施例では、分子量のさらなる減少は、ＭＡＭとジＳＰＡ－ＰＥＧの比率の上昇と相関する。実施例２９を参照。
【0144】
特定の実施形態では、化合物６におけるｘは、２０～２００の範囲にある数であり、ｙは、５～２００の範囲にある数（又はその間の任意の整数値、例えば、１０～１５０、２０～１２０、５０～１００若しくは１０～２５）である。特定の実施形態では、ｘは、ポリマーのＰＥＧ部位（すなわち、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）の数平均分子量が約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にあるように選択される。
【0145】
特定の実施形態では、ＭＡＰの重量平均分子量は、５～１５０ｋＤａ又はその間の任意の整数値、例えば、２０～１２０ｋＤａの範囲にあり、ｘ及びｙの値は、それに応じて選択される。
【0146】
追加の実施形態では、ｘ及びｙの値は、ＭＡＰ又は薬物コンジュゲートＭＡＰをナノ粒子に組み立てた後、ナノ粒子のサイズが１０～９００ｎｍ又はその間の任意の整数値、例えば、１００～８００ｎｍ、２００～５００ｎｍ、４００～７００ｎｍ若しくは２０～１００ｎｍの範囲にあるように選択される。
【0147】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の標的化剤のいずれか１つ、及び本明細書に記載の化学療法薬のいずれか１つにコンジュゲートした本明細書に記載のナノ粒子コアを含む標的ナノ粒子を用いて実施され、標的ナノ粒子の合計サイズは約２０ｎｍ～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍ～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍ～約９０ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍ～約８０ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍ～約７０ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍ～約６０ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約４０ｎｍ～約５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約５０ｎｍ～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約５０ｎｍ～約９０ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約６０ｎｍ～約８０ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約５０ｎｍ～約７０ｎｍである。いくつかの実施形態では、標的ナノ粒子のサイズは、約７０ｎｍ～約１００ｎｍである。
【0148】
特定の実施形態では、溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）である。
【0149】
特定の実施形態では、高温は、２０℃～４０℃の範囲にある任意の温度、すなわち、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃又は４０℃である。
【0150】
透析は様々な多孔度の膜で行うことができ、例えば、分画分子量が１ｋＤａ、３ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、３０ｋＤａ又は５０ｋＤａの膜を使用することができる。
【0151】
また、前述の実施形態のうちの２つ以上の任意のすべての組み合わせも、本明細書に開示される発明の追加の実施形態として企図される。
【0152】
（ポリマー分子量の測定）
ＭＡＰの分子量測定は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）標準を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ ＯＭＮＩＳＥＣゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システム）により行われる。クロマトグラフィー装置は、例えば、溶媒供給ポンプ、脱気装置、自動サンプリングインジェクター、カラムコンパートメント、屈折率検出器及び光散乱検出器を含み得る。
ＭＡＰの分子量測定は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）標準を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ ＯＭＮＩＳＥＣゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システム）により行われる。クロマトグラフィー装置は、例えば、溶媒供給ポンプ、脱気装置、自動サンプリングインジェクター、カラムコンパートメント、屈折率検出器及び光散乱検出器を含み得る。
【0153】
サンプルは、例えば、０．０２％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にＭＡＰを１～５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度に溶解し、その後サンプルを、例えば、０．４５ミクロン（孔径０．４５μｍ）フィルターで濾過することにより調製する。ＰＥＯ分子量標準と共に、濾過したサンプル１００μＬの注入を、ゲル濾過又はゲル浸透カラム（例えば、２×Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬ Ａｑｕａｇｅｌ－ＯＨ ４０カラム、長さ３００ｍｍ×直径７．５ｍｍ、粒子径８μｍ）に、ＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウムの移動相で、流量を、例えば０．７ｍＬ／分で、カラム温度を、例えば３０℃で行う。ピーク画分は、示差屈折率及び／又は光散乱によって検出し、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ ＯＭＮＩＳＥＣソフトウェアを使用して分析する。
【0154】
（カンプトテシン（ＣＰＴ）及びその誘導体、代謝物並びに類似体）
本開示は、特に、ＣＰＴ及びその誘導体、代謝物並びに類似体の選択的反応性誘導体を調製するための方法及び組成物を提供する。一般に、これらの分子は、ＣＰＴの構造を示す下の図に示すように、５つの縮合芳香族環を含み、そのうちの１つ又は複数の環はヘテロ芳香族であり、１つ又は複数のペンダントヒドロキシル基を含む。
本開示は、特に、ＣＰＴ及びその誘導体、代謝物並びに類似体の選択的反応性誘導体を調製するための方法及び組成物を提供する。一般に、これらの分子は、ＣＰＴの構造を示す下の図に示すように、５つの縮合芳香族環を含み、そのうちの１つ又は複数の環はヘテロ芳香族であり、１つ又は複数のペンダントヒドロキシル基を含む。
【化59】
【0155】
これらのカテゴリーの例示的な分子には、トポテカン、イリノテカン、シラタカン、コシテカン、エキサテカン、ラルトテカン、ギマテカン、ベロテカン、ルビテカン、ＳＮ３８、ジフロモテカン、カレニテカン、ナミテカン、エロモテカン、デリモテカン、キミテカン、ＺＢＨ－１２０５、ＤＲＦ－１０４２及びＦＬ１１８が含まれる。
【0156】
（誘導体化７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン（ＳＮ３８）のＭＡＰへの結合）
脳腫瘍及び脳転移の治療に用いるナノ粒子は、治療用分子としてＣＰＴを利用することが従来から説明されている。しかしながら、上述のように、例えばＳＮ３８などのＣＰＴのより溶解性の高い誘導体は、より高い治療指数及びより低い毒性をもたらす。したがって、本開示は、特に、複数のＳＮ３８分子が結合しているポリマー粘液酸骨格を有するナノ粒子を合成するための方法を提供する。この目的のために、本開示は、上記のＭＡＰに共有結合することができるＳＮ３８の多数の誘導体化された変種を合成するための方法及び組成物を提供する。
脳腫瘍及び脳転移の治療に用いるナノ粒子は、治療用分子としてＣＰＴを利用することが従来から説明されている。しかしながら、上述のように、例えばＳＮ３８などのＣＰＴのより溶解性の高い誘導体は、より高い治療指数及びより低い毒性をもたらす。したがって、本開示は、特に、複数のＳＮ３８分子が結合しているポリマー粘液酸骨格を有するナノ粒子を合成するための方法を提供する。この目的のために、本開示は、上記のＭＡＰに共有結合することができるＳＮ３８の多数の誘導体化された変種を合成するための方法及び組成物を提供する。
【0157】
したがって、本明細書で提供されるのは、特に、化学療法分子ＳＮ３８の反応性誘導体を合成するための方法である。この方法は、ＳＮ３８ヒドロキシル基を介して、多数の様々なアミノ酸ベースのリンカー分子をＳＮ３８分子に結合させることを含む。ＳＮ３８その他のＣＰＴ誘導体は、１０ヒドロキシルと２０ヒドロキシルの２つのヒドロキシル基を持つ。２０ヒドロキシルでのコンジュゲーションは、これらの分子の活性ラクトン型を安定化させ、被験体に投与した後に活性の低いカルボン酸塩型に変換することを低減し、又は防止する。しかしながら、１０ヒドロキシルも反応性である。
【0158】
本明細書に記載の方法では、最初にＳＮ３８の１０－ヒドロキシルの反応性を遮断し（すなわち、保護し）、次にリンカーを２０－ヒドロキシに付加する。例示的なアミノ酸リンカーには、グリシン、アラニン、β－アラニン、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、バリン、ロイシン、イソロイシン、ペンタン酸、ヘキサン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジンアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン並びにジペプチド（例えば、フェニルアラニン－グリシン）、トリペプチド及びオリゴペプチドが含まれる。
【0159】
多数の様々なリンカーをＳＮ３８の２０－ヒドロキシル基に結合させるための方法が、本明細書において提供される。本明細書で例示される様々なリンカーの各々（例えばは、グリシン、アラニン、β－アラニン、ロイシンバリン、γ－アミノ酪酸及び６－アミノヘキサン酸並びにその他のジペプチドフェニルアラニン－グリシンなど）は、ＳＮ３８の２０－ヒドロキシでコンジュゲートした後、ＭＡＰのカルボキシル基と反応して（リンカーのアミン基とポリマーのカルボキシル基間のアミド化反応を介して）、ＳＮ３８分子をＭＡＰに共有結合することが可能である。異なるリンカーはそれぞれ異なる安定性を有し、得られるナノ粒子の特性（例えば、サイズ、密度）に影響し、これは特に、血液脳関門（ＢＢＢ）又は血液腫瘍関門（ＢＴＢ）を通過した後にナノ粒子からＳＮ３８が放出される速度に影響する。
【0160】
（１０－ヒドロキシ保護ＳＮ３８（１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８）の合成）
誘導体化ＳＮ３８の合成の最初の工程では、ＳＮ３８とｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ）をＤＣＭ及びトリエチルアミン中で混合させることにより、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）保護基をＳＮ３８の１０－ヒドロキシル基に付加する（その部位での反応性を遮断するため）。混合液を撹拌しながら約１６時間還流（例えば、４５℃）させ、ＨＣｌ（例えば、０．２Ｎ）、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄し、最後にＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させる。生成物（１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８、化合物７）をＤＣＭに溶解し、ヘキサンで沈殿させ、固体を乾燥させる。
誘導体化ＳＮ３８の合成の最初の工程では、ＳＮ３８とｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ）をＤＣＭ及びトリエチルアミン中で混合させることにより、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）保護基をＳＮ３８の１０－ヒドロキシル基に付加する（その部位での反応性を遮断するため）。混合液を撹拌しながら約１６時間還流（例えば、４５℃）させ、ＨＣｌ（例えば、０．２Ｎ）、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄し、最後にＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させる。生成物（１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８、化合物７）をＤＣＭに溶解し、ヘキサンで沈殿させ、固体を乾燥させる。
【0161】
ＴＢＤＰＳ保護基は、ＳＮ３８の１０－ヒドロキシ基に対して選択的であり（２０－ＯＨ基はその後の工程で自由に反応する）、得られた化合物は保存中に保護基が自然に失われることが少なく、より安定した中間体を提供する。
【0162】
ＳＮ３８の１０－ＯＨ基を保護するためのＴＢＤＰＳの使用のさらなる利点は、２０－ＯＨ基に結合したリンカーからのＢｏｃ保護基の除去に使用したのと同じ条件（１Ｍ～１２ＭのＨＣｌ又は１：１～１：４ｖ／ｖの水：ＴＦＡ）で除去できる点である。
【0163】
（保護された２０－ヒドロキシグリシンリンカーを有する１０－ヒドロキシ保護ＳＮ３８の合成）
ＤＣＭ中０℃で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８をＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと混合させることにより、保護されたグリシン（Ｇｌｙ）リンカーを１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の２０－ヒドロキシ位に付加する。ＥＤＣ．ＨＣｌ及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加し、混合液を０℃で撹拌する。撹拌は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間又はその間の任意の間隔で行うことができる。撹拌後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、０．１ＮのＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄する。この溶液を乾燥させ（例えば、ＭｇＳＯ４で）、真空蒸発させて、２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物８）を得る。
ＤＣＭ中０℃で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８をＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと混合させることにより、保護されたグリシン（Ｇｌｙ）リンカーを１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の２０－ヒドロキシ位に付加する。ＥＤＣ．ＨＣｌ及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加し、混合液を０℃で撹拌する。撹拌は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間又はその間の任意の間隔で行うことができる。撹拌後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、０．１ＮのＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄する。この溶液を乾燥させ（例えば、ＭｇＳＯ４で）、真空蒸発させて、２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物８）を得る。
【0164】
（２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８の合成）
２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８を、室温のヘキサン層においてＨＣｌ（１Ｎ～１２Ｎの範囲にある濃度）で処理することにより、１０－ヒドロキシ基と２０－ヒドロキシ基の両方で脱保護する。これにより、１０－ヒドロキシ基が復元され、グリシンリンカーが２０－ヒドロキシ基に共有結合しているＳＮ３８誘導体（２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８、化合物１２）が生成される。
２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８を、室温のヘキサン層においてＨＣｌ（１Ｎ～１２Ｎの範囲にある濃度）で処理することにより、１０－ヒドロキシ基と２０－ヒドロキシ基の両方で脱保護する。これにより、１０－ヒドロキシ基が復元され、グリシンリンカーが２０－ヒドロキシ基に共有結合しているＳＮ３８誘導体（２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８、化合物１２）が生成される。
【0165】
（保護された２０－ヒドロキシＧＡＢＡリンカーを有する１０－ヒドロキシ保護ＳＮ３８の合成）
ＤＣＭ中０℃で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８をＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨと混合させることにより、保護されたγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）リンカーを１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の２０－ヒドロキシ位置に付加する。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＤＭＡＰを添加し、混合液を０℃で撹拌する。撹拌は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間又はその間の任意の間隔で行うことができる。撹拌後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、０．１ＮのＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄する。この溶液を乾燥させ（例えば、ＭｇＳＯ４で）、真空蒸発させて、２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物９）を得る。
ＤＣＭ中０℃で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８をＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨと混合させることにより、保護されたγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）リンカーを１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の２０－ヒドロキシ位置に付加する。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＤＭＡＰを添加し、混合液を０℃で撹拌する。撹拌は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間又はその間の任意の間隔で行うことができる。撹拌後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、０．１ＮのＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄する。この溶液を乾燥させ（例えば、ＭｇＳＯ４で）、真空蒸発させて、２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物９）を得る。
【0166】
（２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８の合成）
２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８を、室温のヘキサン層において、水中で１：１～４：１ｖ／ｖの範囲にある濃度のＴＦＡで処理することにより、１０－ヒドロキシ基と２０－ヒドロキシ基の両方で脱保護する。これにより、１０－ヒドロキシ基が復元され、ＧＡＢＡリンカーが２０－ヒドロキシ基に共有結合しているＳＮ３８誘導体（２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８、化合物１３）が生成される。
２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８を、室温のヘキサン層において、水中で１：１～４：１ｖ／ｖの範囲にある濃度のＴＦＡで処理することにより、１０－ヒドロキシ基と２０－ヒドロキシ基の両方で脱保護する。これにより、１０－ヒドロキシ基が復元され、ＧＡＢＡリンカーが２０－ヒドロキシ基に共有結合しているＳＮ３８誘導体（２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８、化合物１３）が生成される。
【0167】
（保護された２０－ヒドロキシヘキサン酸リンカーを有する１０－ヒドロキシ保護ＳＮ３８の合成）
ＤＣＭ中０℃で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８をＢｏｃ－Ｈｅｘ－ＯＨと混合させることにより、保護された６－アミノヘキサン酸（Ｈｅｘ）リンカーを１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の２０－ヒドロキシ位置に付加する。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＤＭＡＰを添加し、混合液を０℃で撹拌する。撹拌は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間又はその間の任意の間隔で行うことができる。撹拌後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、０．１ＮのＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄する。この溶液を乾燥させ（例えば、ＭｇＳＯ４で）、真空蒸発させて、２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物１０）を得る。
ＤＣＭ中０℃で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８をＢｏｃ－Ｈｅｘ－ＯＨと混合させることにより、保護された６－アミノヘキサン酸（Ｈｅｘ）リンカーを１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の２０－ヒドロキシ位置に付加する。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＤＭＡＰを添加し、混合液を０℃で撹拌する。撹拌は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間又はその間の任意の間隔で行うことができる。撹拌後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、０．１ＮのＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄する。この溶液を乾燥させ（例えば、ＭｇＳＯ４で）、真空蒸発させて、２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物１０）を得る。
【0168】
（２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８の合成）
２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８を、室温のヘキサン層において、水中で１：１～４：１ｖ／ｖの範囲にある濃度のＴＦＡで処理することにより、１０－ヒドロキシ基と２０－ヒドロキシ基の両方で脱保護する。これにより、１０－ヒドロキシ基が復元され、Ｈｅｘリンカーが２０－ヒドロキシ基に共有結合しているＳＮ３８誘導体（２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８、化合物１４）が生成される。
２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８を、室温のヘキサン層において、水中で１：１～４：１ｖ／ｖの範囲にある濃度のＴＦＡで処理することにより、１０－ヒドロキシ基と２０－ヒドロキシ基の両方で脱保護する。これにより、１０－ヒドロキシ基が復元され、Ｈｅｘリンカーが２０－ヒドロキシ基に共有結合しているＳＮ３８誘導体（２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８、化合物１４）が生成される。
【0169】
（保護された２０－ヒドロキシバリンリンカーを有する１０－ヒドロキシ保護ＳＮ３８の合成）
ＤＣＭ中０℃で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８をＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨと混合させることにより、保護されたバリン（Ｖａｌ）リンカーを１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の２０－ヒドロキシ位置に付加させる。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＤＭＡＰを添加し、混合液を０℃で撹拌する。撹拌は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間又はその間の任意の間隔で行うことができる。撹拌後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、０．１ＮのＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄する。この溶液を乾燥させ（例えば、ＭｇＳＯ４で）、真空蒸発させて、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物１１）を得ることができる。
ＤＣＭ中０℃で１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８をＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨと混合させることにより、保護されたバリン（Ｖａｌ）リンカーを１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の２０－ヒドロキシ位置に付加させる。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＤＭＡＰを添加し、混合液を０℃で撹拌する。撹拌は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間又はその間の任意の間隔で行うことができる。撹拌後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、０．１ＮのＨＣｌで２回、ブラインで１回洗浄する。この溶液を乾燥させ（例えば、ＭｇＳＯ４で）、真空蒸発させて、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物１１）を得ることができる。
【0170】
（２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８の合成）
２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８を、室温のヘキサン層においてＨＣｌ（１Ｎ～１２Ｎの範囲にある濃度）で処理することにより、１０－ヒドロキシ基と２０－ヒドロキシ基の両方で脱保護する。これにより、１０－ヒドロキシ基が復元され、バリンリンカーが２０－ヒドロキシ基に共有結合しているＳＮ３８誘導体（２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８、化合物１５）が生成される。
２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８を、室温のヘキサン層においてＨＣｌ（１Ｎ～１２Ｎの範囲にある濃度）で処理することにより、１０－ヒドロキシ基と２０－ヒドロキシ基の両方で脱保護する。これにより、１０－ヒドロキシ基が復元され、バリンリンカーが２０－ヒドロキシ基に共有結合しているＳＮ３８誘導体（２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８、化合物１５）が生成される。
【0171】
（ＳＮ３８の１０－及び２０－ＯＨ基の両方での同じ保護基の使用）
アミノ酸リンカーを有するＳＮ３８の反応性誘導体を合成するための代替経路は、１０－ＯＨ基にＢｏｃ－Ｏ保護基を、２０－ＯＨ上にＢｏｃ－アミノ酸保護基を配置することである。この化合物（２０－（Ｂｏｃ－アミノアシル）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８）をＴＦＡと反応させると、１０－ＯＨ基が復元され、アミノ酸リンカーのＴＦＡ塩が２０－ＯＨに付加される。この方法を用いて、ＳＮ３８の２０－Ｂｏｃ－グリシル、－アラニル、－β－アラニル、－ロイシル及び－バリル誘導体が合成されている。以下、実施例３３～３５を参照。この方法で使用できる他のアミノ酸には、ＧＡＢＡ、イソロイシン及びヘキサン酸並びにジペプチド、例えば、フェニルアラニン－グリシンが含まれる。
アミノ酸リンカーを有するＳＮ３８の反応性誘導体を合成するための代替経路は、１０－ＯＨ基にＢｏｃ－Ｏ保護基を、２０－ＯＨ上にＢｏｃ－アミノ酸保護基を配置することである。この化合物（２０－（Ｂｏｃ－アミノアシル）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８）をＴＦＡと反応させると、１０－ＯＨ基が復元され、アミノ酸リンカーのＴＦＡ塩が２０－ＯＨに付加される。この方法を用いて、ＳＮ３８の２０－Ｂｏｃ－グリシル、－アラニル、－β－アラニル、－ロイシル及び－バリル誘導体が合成されている。以下、実施例３３～３５を参照。この方法で使用できる他のアミノ酸には、ＧＡＢＡ、イソロイシン及びヘキサン酸並びにジペプチド、例えば、フェニルアラニン－グリシンが含まれる。
【化60】
【0172】
（ポリマー－薬物コンジュゲートの合成）
本明細書では、特に、誘導体化ＳＮ３８をＭＡＰに共有結合させることにより、ポリマー－薬物コンジュゲート（すなわち、ＭＡＰ－リンカー－ＳＮ３８ナノ粒子）を形成するための方法が提供される。ポリマーと薬物の間のリンカーの性質（すなわち、サイズ及び化学的性質）が異なる、多くの異なるコンジュゲートが提供される。様々なタイプのリンカーで誘導体化されたＳＮ３８を使用して、様々なコンジュゲートが作製される。一実施形態では、リンカーはグリシル（Ｇｌｙ）部位である。一実施形態では、リンカーはバリル（Ｖａｌ）部位である。一実施形態では、リンカーはγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）部位である。一実施形態では、リンカーは６－アミノヘキサン酸（Ｈｅｘ）部位である。一実施形態では、リンカーはアラニル（Ａｌａ）部位である。一実施形態では、リンカーはβ－アラニル（β－Ａｌａ）部位である。一実施形態では、リンカーはロイシル（Ｌｅｕ）部位である。
本明細書では、特に、誘導体化ＳＮ３８をＭＡＰに共有結合させることにより、ポリマー－薬物コンジュゲート（すなわち、ＭＡＰ－リンカー－ＳＮ３８ナノ粒子）を形成するための方法が提供される。ポリマーと薬物の間のリンカーの性質（すなわち、サイズ及び化学的性質）が異なる、多くの異なるコンジュゲートが提供される。様々なタイプのリンカーで誘導体化されたＳＮ３８を使用して、様々なコンジュゲートが作製される。一実施形態では、リンカーはグリシル（Ｇｌｙ）部位である。一実施形態では、リンカーはバリル（Ｖａｌ）部位である。一実施形態では、リンカーはγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）部位である。一実施形態では、リンカーは６－アミノヘキサン酸（Ｈｅｘ）部位である。一実施形態では、リンカーはアラニル（Ａｌａ）部位である。一実施形態では、リンカーはβ－アラニル（β－Ａｌａ）部位である。一実施形態では、リンカーはロイシル（Ｌｅｕ）部位である。
【0173】
ポリマー－薬物コンジュゲートを形成するために、ＭＡＰをＤＭＳＯに溶解し、次にＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加する。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加後、誘導体化ＳＮ３８及びＤＩＰＥＡを添加し、混合液を室温で約１８時間撹拌する。誘導体化ＳＮ３８は、例えば、２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８、２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８、２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８、２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８、２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８、２０－（ＴＦＡ．Ａｌａ）－ＳＮ３８、２０－（ＴＦＡ．β－Ａｌａ）－ＳＮ３８、２０－（ＴＦＡ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８又は２０－（ＴＦＡ．Ｌｅｕ）－ＳＮ３８であり得る。次に、反応混合液をＤＭＳＯで、その後ｐＨ４の水で、１０ｋＤａの膜を使用して透析する。透析した生成物を濾過し（例えば、０．２２μｍフィルターを通して）、凍結し、凍結乾燥する。使用する誘導体化ＳＮ３８に応じて、生成物は、ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８（化合物１６）、ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８（化合物１７）、ＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８（化合物１８）、ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８（化合物１９）、ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８（化合物３７）、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８（化合物３８）又はＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８（化合物３９）となる。
【0174】
（ナノ粒子の形成）
ポリマー－薬物コンジュゲート（すなわち、化合物１６、１７、１８又は１９、３７、３８又は３９のいずれか１つ）をナノ粒子に変換するには、凍結乾燥ポリマー－薬物コンジュゲートをｐＨ４の水に１～１０ｍｇ／ｍＬ（例えば、４ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶解する。
ポリマー－薬物コンジュゲート（すなわち、化合物１６、１７、１８又は１９、３７、３８又は３９のいずれか１つ）をナノ粒子に変換するには、凍結乾燥ポリマー－薬物コンジュゲートをｐＨ４の水に１～１０ｍｇ／ｍＬ（例えば、４ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶解する。
【0175】
ナノ粒子のサイズは、直径が約２０ｎｍ～約６０ｎｍの範囲にある。例示的なナノ粒子の直径は、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、２１ｎｍ、２２ｎｍ、２３ｎｍ、２４ｎｍ、２５ｎｍ、２６ｎｍ、２７ｎｍ、２８ｎｍ、２９ｎｍ、３０ｎｍ、３１ｎｍ、３２ｎｍ、３３ｎｍ、３４ｎｍ、３５ｎｍ、３６ｎｍ、３７ｎｍ、３８ｎｍ、３９ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ又はそれ以上である。
【0176】
（Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのナノ粒子からのＳＮ３８の放出量）
ＳＮ３８／ｍＬの濃度のナノ粒子０．１ｍｇを、３７℃の加湿オーブンで、ｐＨ６．５、７．０又は７．４のＰＢＳ中でインキュベートすると、ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８及びＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８ナノ粒子からのＳＮ３８の放出はすべて一次速度則を示した。放出速度はｐＨに強く依存することが観察された。ｐＨが６．５～７．４に上昇すると、すべてのナノ粒子製剤で放出半減期が減少し、加水分解がＳＮ３８の放出に重要な役割を果たしていることが示唆された。より疎水性で立体障害性の高いリンカーを有するナノ粒子では、より長い半減期が観察された。
ＳＮ３８／ｍＬの濃度のナノ粒子０．１ｍｇを、３７℃の加湿オーブンで、ｐＨ６．５、７．０又は７．４のＰＢＳ中でインキュベートすると、ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８及びＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８ナノ粒子からのＳＮ３８の放出はすべて一次速度則を示した。放出速度はｐＨに強く依存することが観察された。ｐＨが６．５～７．４に上昇すると、すべてのナノ粒子製剤で放出半減期が減少し、加水分解がＳＮ３８の放出に重要な役割を果たしていることが示唆された。より疎水性で立体障害性の高いリンカーを有するナノ粒子では、より長い半減期が観察された。
【0177】
（ＭＡＰへの連結ための誘導体化ＣＰＴ）
特定の実施形態では、本開示は、治療薬としてＣＰＴを含むナノ粒子を提供する。アミノ酸にコンジュゲートしたＣＰＴの誘導体（例えば、２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ）を、前記ナノ粒子の合成に使用する。例示的なアミノ酸リンカーには、グリシン、アラニン、β－アラニン、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、バリン、ロイシン、イソロイシン、ペンタン酸、ヘキサン酸並びにジペプチド（例えば、フェニルアラニン－グリシン）、トリペプチド及びオリゴペプチドが含まれる。
特定の実施形態では、本開示は、治療薬としてＣＰＴを含むナノ粒子を提供する。アミノ酸にコンジュゲートしたＣＰＴの誘導体（例えば、２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ）を、前記ナノ粒子の合成に使用する。例示的なアミノ酸リンカーには、グリシン、アラニン、β－アラニン、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、バリン、ロイシン、イソロイシン、ペンタン酸、ヘキサン酸並びにジペプチド（例えば、フェニルアラニン－グリシン）、トリペプチド及びオリゴペプチドが含まれる。
【0178】
２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴを、２つの工程で合成する。第一工程では、不活性雰囲気下（例えば、アルゴン下）において、ＤＭＡＰ中でＣＰＴをＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと混合し、ＤＣＭを加えて反応液をスラリーにする。次に、ＤＩＣを数分かけて反応混合液に滴下し、その後、混合液を室温で数時間（例えば、３時間）撹拌する。その後、溶媒の約半分を真空除去し、冷ＭｅＯＨを加えて生成物（２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ、化合物２１）を沈殿させ、これを濾過することによって得る。固体を、冷ＭｅＯＨ及び冷メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で洗浄し、真空乾燥させる。実施例３０を参照。
【0179】
第２工程では、ＤＣＭ中の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴの撹拌懸濁液にＴＦＡを徐々に加え、混合液を数時間（例えば、２時間）撹拌する。次いで、生成物（２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ、化合物２２）をＭＴＢＥで沈殿させ、濾過し、洗浄し、真空乾燥させる。実施例３１を参照。
【0180】
Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨの代わりに、他のＢｏｃ保護アミノ酸（又はペプチド）を使用することにより、追加のＣＰＴ誘導体を製造することができる。例えば、Ｂｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを出発物質として用いると、２０－（Ｂｏｃ－Ａｌａ）－ＣＰＴ（化合物４１）及び２０－（ＴＦＡ．Ａｌａ）－ＣＰＴ（化合物４５）が得られる。Ｂｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨを出発物質として使用すると、２０－（Ｂｏｃ－β－Ａｌａ）－ＣＰＴ（化合物４２）及び２０－（ＴＦＡ．β－Ａｌａ）－ＣＰＴ（化合物４６）が得られる。Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨを出発物質として使用すると、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－ＣＰＴ（化合物４０）及び２０－（ＴＦＡ．Ｖａｌ）－ＣＰＴ（化合物４７）が得られる。Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨを出発物質として使用すると、２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－ＣＰＴ（化合物４３）及び２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＣＰＴ（化合物４８）が得られる。Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨを出発物質として使用すると、２０－（Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（化合物４４）及び２０－（ＴＦＡ．Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（化合物４９）が得られる。
【0181】
（ＣＰＴ－ポリマーコンジュゲートの合成）
ＣＰＴ及びＭＡＰのコンジュゲートは、特定の実施形態において提供される。これらのコンジュゲートを合成するために、ＭＡＰ及び２０－（ＴＦＡ．アミノアシル）－ＣＰＴ（ＣＰＴの例示的なアミノ酸及びペプチド誘導体については前のセクションを参照）を不活性雰囲気（例えば、アルゴン下）においてＤＭＳＯに溶解させる。別の容器で、（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）をＤＭＳＯに溶解させる。次に、ＰｙＡＯＰ溶液をＭＡＰ／２０－（ＴＦＡ．アミノアシル）－ＣＰＴ溶液に加え、数分間（例えば、２分間）撹拌した後、ＤＩＰＥＡを加え、反応混合液を暗所で室温で１２～２４時間（例えば、１８時間）撹拌する。生成物を冷（０～４℃）酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で沈殿させ（任意選択でいくつかのバッチで）、冷ＥｔＯＡｃで洗浄する。生成物は、凍結乾燥によってさらに単離することができる。実施例３２を参照。
ＣＰＴ及びＭＡＰのコンジュゲートは、特定の実施形態において提供される。これらのコンジュゲートを合成するために、ＭＡＰ及び２０－（ＴＦＡ．アミノアシル）－ＣＰＴ（ＣＰＴの例示的なアミノ酸及びペプチド誘導体については前のセクションを参照）を不活性雰囲気（例えば、アルゴン下）においてＤＭＳＯに溶解させる。別の容器で、（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）をＤＭＳＯに溶解させる。次に、ＰｙＡＯＰ溶液をＭＡＰ／２０－（ＴＦＡ．アミノアシル）－ＣＰＴ溶液に加え、数分間（例えば、２分間）撹拌した後、ＤＩＰＥＡを加え、反応混合液を暗所で室温で１２～２４時間（例えば、１８時間）撹拌する。生成物を冷（０～４℃）酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で沈殿させ（任意選択でいくつかのバッチで）、冷ＥｔＯＡｃで洗浄する。生成物は、凍結乾燥によってさらに単離することができる。実施例３２を参照。
【0182】
（ニトロフェニルボロン酸（ＮＰＢＡ）－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート）
特定の実施形態では、標的化（ホーミング）分子又は高分子治療薬（例えば、抗体）などの高分子を、ニトロフェニルボロン酸－ポリエチレングリコール（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ）リンカーを介してＭＡＰに連結させる。そのようなＮＰＢＡ－ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧのアミン誘導体（例えば、ＰＥＧ３．５ｋ、ＰＥＧ５ｋ）とＮＰＢＡのカルボキシル誘導体を組み合わせて、アミド結合で結合したＮＰＢＡ－ＰＥＧ－酢酸（ＡＡ）コンジュゲートを形成することによって合成することができる。特定の実施形態では、ＰＥＧ誘導体は、一方の末端にアミノ基（ＮＰＢＡとの反応のために）、反対側の末端にカルボキシル基（その後の反応において活性化され、ポリペプチドなどの高分子と反応することができる）を含む。実施例３６を参照。
特定の実施形態では、標的化（ホーミング）分子又は高分子治療薬（例えば、抗体）などの高分子を、ニトロフェニルボロン酸－ポリエチレングリコール（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ）リンカーを介してＭＡＰに連結させる。そのようなＮＰＢＡ－ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧのアミン誘導体（例えば、ＰＥＧ３．５ｋ、ＰＥＧ５ｋ）とＮＰＢＡのカルボキシル誘導体を組み合わせて、アミド結合で結合したＮＰＢＡ－ＰＥＧ－酢酸（ＡＡ）コンジュゲートを形成することによって合成することができる。特定の実施形態では、ＰＥＧ誘導体は、一方の末端にアミノ基（ＮＰＢＡとの反応のために）、反対側の末端にカルボキシル基（その後の反応において活性化され、ポリペプチドなどの高分子と反応することができる）を含む。実施例３６を参照。
【化61】
【0183】
特定の実施形態では、ｎは、２～２，０００又はその間の任意の整数値、例えば、１００～３００、２０～３００、１２０～１８０若しくは１４０～１６０の範囲にある数である。
【0184】
特定の実施形態では、ｎの値は、化合物のＰＥＧ（すなわち、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）部位の重量平均分子量が約２～約１５ｋＤａの範囲にある、例えば、約２ｋＤａ、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ又は約１５ｋＤａとなるようなものである。
【0185】
ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡコンジュゲートを、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）誘導体を形成することによって、ポリペプチド（例えば、トランスフェリンなど）との反応のために活性化する。これらの実施形態では、ビス（ペンタフルオロフェニル）カーボネートをＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ＡＡコンジュゲートと組み合わせて、ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ペンタフルオロフェニルエステル（例えば、ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ－ＰＦＰ）を形成する。実施例３７を参照。
【化62】
【0186】
特定の実施形態では、ｎは、２～２，０００又はその間の任意の整数値、例えば、１００～３００、２０～３００、１２０～１８０及び／若しくは１４０～１６０の範囲にある数である。
【0187】
特定の実施形態では、ｎの値は、化合物のＰＥＧ（すなわち、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）部位の重量平均分子量が約２～約１５ｋＤａの範囲にある、例えば、約２ｋＤａ、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ又は約１５ｋＤａとなるようなものである。
【0188】
（ホーミング（標的化）分子を含むポリマーコンジュゲート）
特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＡＰは、ＣＰＴ若しくはＳＮ３８などの低分子治療薬の代わりに、又はそれに加えて、ホーミング（若しくは標的化）分子を含む。標的化分子は当該技術分野で知られており、例えば、低分子（例えば、ビタミン、例えば、葉酸）、糖類（例えば、マンノース、アロース、アルトローズ、グルコース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、二糖類、三糖類、オリゴ糖）、ペプチド（例えば、ＲＧＤ）、ポリペプチド（例えば、抗体、トランスフェリンなどの細胞表面受容体と結合するタンパク質）、核酸、ペプトイド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＡＰは、ＣＰＴ若しくはＳＮ３８などの低分子治療薬の代わりに、又はそれに加えて、ホーミング（若しくは標的化）分子を含む。標的化分子は当該技術分野で知られており、例えば、低分子（例えば、ビタミン、例えば、葉酸）、糖類（例えば、マンノース、アロース、アルトローズ、グルコース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、二糖類、三糖類、オリゴ糖）、ペプチド（例えば、ＲＧＤ）、ポリペプチド（例えば、抗体、トランスフェリンなどの細胞表面受容体と結合するタンパク質）、核酸、ペプトイド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。
【0189】
例えば、ＭＡＰ（及びＭＡＰから作られたナノ粒子）は、ポリマー（又はポリマーから形成されたナノ粒子）を血液脳関門又は血液腫瘍関門の内皮細胞へ標的化するホーミング分子であるトランスフェリンを含むことができる。これらの実施形態では、ホーミング分子は、上述したＰＦＰ活性エステルとの反応によってＮＰＢＡ－ＰＥＧポリマーに結合する。タンパク質の一級アミン基がＰＦＰ活性エステルと反応することから、ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ペンタフルオロフェニルエステルにホロトランスフェリンを結合させることで、エステルとホロトランスフェリンの結合が実現される。反応の進行をＨＰＬＣによってモニターし、モノＰＥＧ化トランスフェリン生成物（例えば、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆ）を、ＰＥＧ化の程度がより高い画分（例えば、ジ－及びトリ－ＰＥＧ化画分）と比較したモノＰＥＧ化トランスフェリンの結合の差に基づいて、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製する。実施例３８及び３９を参照。この方法は、従来の方法を使用すると発生したような精製中のトランスフェリンからの鉄の喪失を防ぎ、それによってホロトランスフェリン構造を維持することができる。
【0190】
（高分子治療薬を含むポリマーコンジュゲート）
特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＡＰは、ＣＰＴ又はＳＮ３８などの低分子治療薬の代わりに、又はそれに加えて、高分子治療薬を含む。高分子治療薬は当該技術分野で知られており、例えば、治療用ポリペプチド（例えば、抗体、酵素及び生物活性タンパク質）並びに核酸が含まれる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＡＰは、ＣＰＴ又はＳＮ３８などの低分子治療薬の代わりに、又はそれに加えて、高分子治療薬を含む。高分子治療薬は当該技術分野で知られており、例えば、治療用ポリペプチド（例えば、抗体、酵素及び生物活性タンパク質）並びに核酸が含まれる。
【0191】
例示的な治療用ポリペプチドには、トラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）、抗Ｈｅｒ３、抗Ｔｒｏｐ２、抗ＰＳＭＡ、抗ＬＩＶ－１、抗ＦＯＬＲ１、抗ＤＬＬ３、抗ＰＤＧＦ、抗ＦＲα、抗ＰＴＫ７、抗メソセリン、抗ｃ－ＭＥＴ、抗ＭＵＣ１、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＦＬＴ３、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ１９などの抗体が含まれるが、これに限定されない。
【0192】
前段落で例示したような腫瘍マーカーを指向する抗体などの特定のポリペプチド治療薬も、標的（ホーミング）分子で使用される。
【0193】
例えば、ＭＡＰ（及びＭＡＰから作られたナノ粒子）は、抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブを含むことができる。これらの実施形態では、抗体は、上述したＰＦＰ活性エステルとの反応によってＮＰＢＡ－ＰＥＧポリマーに結合する。
【0194】
タンパク質の第一級アミン基はＰＦＰ活性エステルと反応することから、ＮＰＢＡ－ＰＥＧ－ペンタフルオロフェニルエステルにトラスツズマブを結合させることで、エステルとトラスツズマブの結合が実現される。反応の進行をＨＰＬＣによってモニターし、モノＰＥＧ化トラスツズマブ生成物（例えば、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓ）を、ＰＥＧ化の程度がより高い画分（例えば、ジ－及びトリ－ＰＥＧ化画分）と比較したモノＰＥＧ化トラスツズマブの結合の差に基づいて、ＨＩＣにより精製する。実施例４１及び４２を参照。
【0195】
（ナノ粒子あたりのポリマーストランド数の測定）
ナノ粒子あたりのポリマーストランド数を測定するために、ナノ粒子の平均分子量を対応するポリマー－薬物（すなわち、ＭＡＰ－ＳＮ３８）コンジュゲートの分子量で割る。
ナノ粒子あたりのポリマーストランド数を測定するために、ナノ粒子の平均分子量を対応するポリマー－薬物（すなわち、ＭＡＰ－ＳＮ３８）コンジュゲートの分子量で割る。
【0196】
ナノ粒子の分子量は、公称分子量１００ｋＤａ及び２００ｋＤａのＰＥＯ標準を用いたゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定する。ポリマー－薬物コンジュゲートの分子量を、コンジュゲートの合成に使用したポリマー（すなわち、ＭＡＰ）の分子量から計算し、以下のように薬物負荷に対して調整する。
ＭＷコンジュゲート＝ＭＷポリマー／（１－Ｔ）
（式中、ＭＷポリマーはコンジュゲートの合成に使用したＭＡＰの分子量であり、Ｔは治療薬の負荷の割合であり、小数で表される。）
ＭＷコンジュゲート＝ＭＷポリマー／（１－Ｔ）
（式中、ＭＷポリマーはコンジュゲートの合成に使用したＭＡＰの分子量であり、Ｔは治療薬の負荷の割合であり、小数で表される。）
【0197】
本明細書で使用する粒子あたりのストランド（ＳｐＰ）は、粒子又はナノ粒子に存在する粘液酸ポリマー（「ＭＡＰ」）治療薬コンジュゲート分子の数である。ＳｐＰの測定において、粒子又はナノ粒子は、ヒトへの投与に適した濃度で、任意の水溶液、例えば中性ｐＨの水、ｐＨ７．４のＰＢＳ又は患者に投与される任意の製剤中で単一ユニットとして挙動する少なくとも１つのＭＡＰ－治療薬－タンパク質コンジュゲート分子を有する実体をいう。粒子あたりのストランドの計算において、ＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子は、共有結合した治療薬を有する単一のＭＡＰポリマーである。
【0198】
本明細書に開示される方法は、前記粒子が１つ又は複数のＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子を含む粒子の評価を提供する。一般に、本方法は、複数の前記粒子を含むサンプルを提供し、サンプル中の粒子あたりのＭＡＰ－治療薬コンジュゲートの数の値を測定し、それによって粒子の調製物を評価することを必要とする。粒子サンプルの値は、複数の粒子について得られた値の関数となる。
【0199】
上述のように、ＳｐＰは粒子又はナノ粒子に自己組織化するＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子の数として定義され、したがって
ＳｐＰ＝［ＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子］／Ｐ（又はＮＰ）
（式中、［ＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子］はＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子の数であり、Ｐ（又はＮＰ）は単一粒子（又はナノ粒子）である。）である。
ＳｐＰ＝［ＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子］／Ｐ（又はＮＰ）
（式中、［ＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子］はＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子の数であり、Ｐ（又はＮＰ）は単一粒子（又はナノ粒子）である。）である。
【0200】
特定の実施形態では、本方法は、測定された値を基準値と比較することをさらに含む。比較は、多くの方法で使用することができる。一例として、本方法で行われた比較又は測定に応じて、決定又は工程が取られ、例えば、粒子を作るためのプロセスにおける製造パラメータが変更され、サンプルが分類され、選択され、受け入れ又は廃棄され、放出又は保留され、医薬品に加工され、出荷され、別の場所に移され、別の物質と配合され、例えば、賦形剤と配合され、標識され、包装され、商業的に売り出され、又は販売若しくは販売のために提供される。例えば、測定の結果に基づいて、又は参照標準との比較に基づいて、サンプルが採取されたバッチを、例えば、前述のように処理することができる。
【0201】
粒子あたりのストランド数を計算するために、粒子のサイズ、例えば自己組織化粒子の光散乱による分子量、個々のポリマーのサイズ、例えば個々のポリマーの光散乱による分子量、及び治療薬の負荷量、例えば質量％を決定する。これらの値を用いて、ＳｐＰは以下のように計算される。
ＳｐＰ＝ＭＷ粒子／（ＭＷコンジュゲート）
（式中、ＭＷ粒子は粒子の分子量であり、ＭＷコンジュゲートはＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子の分子量であり、次のように計算される。
ＭＷコンジュゲート＝ＭＷポリマー／（１－Ｔ％）
（式中、ＭＷポリマーはＭＡＰの分子量であり、Ｔ％は小数で表した治療薬の負荷率、例えば、１０％負荷でＴ％＝０．１となる。））
ＳｐＰ＝ＭＷ粒子／（ＭＷコンジュゲート）
（式中、ＭＷ粒子は粒子の分子量であり、ＭＷコンジュゲートはＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子の分子量であり、次のように計算される。
ＭＷコンジュゲート＝ＭＷポリマー／（１－Ｔ％）
（式中、ＭＷポリマーはＭＡＰの分子量であり、Ｔ％は小数で表した治療薬の負荷率、例えば、１０％負荷でＴ％＝０．１となる。））
【0202】
ＳｐＰの測定は、様々なリンカーと薬剤を有するＭＡＰで実証されている。ＣＰＴとＳＮ３８を有する同じ分子量のＭＡＰは、粒子あたり約１．５～２．５本のストランドになる。リンカーが異なると、粒子あたりのストランドが変化し、粒子の密度が変化することが、ＳＮ３８で実証された。グリシン、γ－アミノ酪酸、ヘキサン酸、アラニン、β－アラニン、ロイシン及びバリンのリンカーによって、粒子あたりのストランドは約１．３～約４．６と変化する。
【0203】
ポリマー分子量分布及び粒子分散度：ＭＡＰは様々な分子量を持つように合成される。分子量が異なると、粒子径及び粒子あたりのストランド数も異なる。粒子は、平均より小さい又は大きいＭＡＰ（本明細書ではストランドとする）で形成される場合がある。ストランドはまた、せん断によって制限され得る最大サイズに結合する場合もある。
【0204】
粒子形状：粒子形状はほぼ球形と想定される。自己組織化は、ＭＡＰ－治療薬コンジュゲート分子の治療薬によって作られる疎水性領域によって駆動されると想定される。
【0205】
（製剤、キット及び投与経路）
本明細書に開示されるようなナノ粒子を含む治療用組成物も提供される。そのような組成物は、典型的には、ナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む。補助的な活性化合物も、ナノ粒子組成物に組み込むことができる。
本明細書に開示されるようなナノ粒子を含む治療用組成物も提供される。そのような組成物は、典型的には、ナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む。補助的な活性化合物も、ナノ粒子組成物に組み込むことができる。
【0206】
本明細書に開示される治療用組成物は、特に、がん、がん転移並びに脳及び中枢神経系の他の障害を治療するのに有用である。したがって、ナノ粒子を含む組成物の「治療有効量」は、症状を軽減し、又は、例えば、腫瘍の退縮を刺激する任意の量である。例えば、ナノ粒子の投与量は、約０．１～１．０ｍｇ／ｋｇ体重又は約０．５～２．０ｍｇ／ｋｇ体重又は約１～５ｍｇ／ｋｇ体重又は約１ｍｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重以上（又はその間の任意の整数値）であり、投与頻度は、例えば、体重、投与経路、疾患の重症度などに応じて、例えば、１時間ごと、１日２回、１日１回、週２回、週１回、月２回、月１回である。したがって、治療有効量は、同量の又は異なる量のナノ粒子の複数回投与から構成され得る。特定の実施形態では、ナノ粒子の１回の投与が、治療有効量である。
【0207】
特定の実施形態では、ナノ粒子の投与を、化学療法薬の投与量として典型的であるように、被験体の身体の表面積１平方メートルあたり１～２０ｍｇのナノ粒子（又はその間の任意の整数値若しくは小数値）の投与量で行う。
【0208】
様々な医薬組成物並びにそれらを調製し、及び使用するための技法は、本開示に照らせば、当業者に知られている。好適な医薬組成物及びそれらの投与の技法の詳細なリストについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ． １９８５； Ｂｒｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，” ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， ２００５； Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （ｅｄｓ．）， “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，” Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００５； ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （ｅｄｓ．）， “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，” Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００８などのテキストを参照することができる。
【0209】
本明細書に記載のナノ粒子は、投与のために、生理学的に適合性のある担体中に懸濁させることができる。本明細書で使用する場合、「生理学的に適合性のある担体」という用語は、ナノ粒子と、製剤の他の任意の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害ではない担体を指す。当業者であれば、生理学的に適合性のある担体に精通している。適切な担体の例には、水（例えば、ｐＨ４の水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液＋／－グルコース（ＨＢＳＳ）及び、例えば、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）などの複数の電解質溶液が含まれる。
【0210】
被験体に投与されるナノ粒子懸濁液の量は、投与部位、治療目標及び溶液中のナノ粒子の数によって異なる。典型的には、投与されるナノ粒子の量は、治療有効量になる。本明細書で使用する場合、「治療有効量」又は「有効量」は、特定の障害の治療を効果的に行うために；すなわち、その障害に関連する症状の量の減少及び／又は重症度の改善をもたらすために必要な投与されるナノ粒子の数を意味する。例えば、脳へのがん転移の場合、治療有効量のナノ粒子の投与は、転移の症状の軽減及び／又は逆転；例えば、転移性腫瘍の退縮をもたらす。治療有効量は、脳損傷の種類及び程度によって異なり、また、被験体の全体的な状態によっても異なる場合がある。
【0211】
開示された治療用組成物は、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材料、すなわち担体などの薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクルを含むこともできる。これらの担体は、例えば、ナノ粒子を安定化させ、及び／又はナノ粒子の体内保持を促進することができる。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、被験体に害を与えないという意味で、「許容可能」である。薬学的に許容される担体として機能することができる材料のいくつかの例には、以下が含まれる：ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；コーンスターチ及びジャガイモでんぷんなどのでんぷん；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐薬用ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油類；プロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール及びマンニトールなどのポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；その他の医薬製剤で用いられる無毒適合性物質。ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香料及び香味料、保存剤及び酸化防止剤も組成物中に存在し得る。
【0212】
ナノ粒子は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体（その割合は、化合物の溶解度及び化学的性質、選択した投与経路及び標準的な実施によって決定される）を含むビヒクルにおいて、吸入、局所、経鼻、経口、非経口（例えば、静脈内、腹腔内、膀胱内若しくは髄腔内）又は経直腸などが含まれるが、これらに限定されない任意の適切な経路によって被験体に投与することができる。本明細書に記載の化合物の投与は、当該技術分野において知られている任意の方法を用いて行うことができる。例えば、投与は、経皮、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、嚢内、脊髄内、大槽内、腹腔内、脳室内、髄腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐薬による、又は経口投与によるものであり得る。本明細書に記載のナノ粒子の医薬組成物は、注射による投与のため、又は経口、経肺、経鼻、経皮若しくは眼球投与のためのものであり得る。
【0213】
例示的な製剤には、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：非経口投与、例えば、肺内、静脈内、動脈内、眼内、頭蓋内、髄膜下又は皮下投与に適したものであって、ミセル、リポソーム又は薬剤放出カプセル（徐放用に設計された生体適合性コーティング内に組み込まれた活性薬剤）にカプセル化された製剤が含まれる；摂取可能な製剤；点眼薬、クリーム、軟膏及びゲルなどの局所使用のための製剤；並びに吸入薬、エアゾール及び噴霧などのその他の製剤。本開示の組成物の投与量は、治療の必要性の程度及び重症度、投与される組成物の活性、被験体の一般的な健康並びに当業者によく知られているその他の考慮事項に応じて異なる。
【0214】
追加の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、脳損傷又は転移の部位又はその近傍で頭蓋内に送達される。そのような局所送達は、組成物の非全身的送達を可能にし、それによって、全身送達と比較して組成物の身体的負担を軽減する。局所送達は、例えば、頭蓋内注射によって、又はステント及びカテーテルを含むがこれらに限定されない様々な医療移植されるデバイスの使用によって実現することができ、又は吸入、瀉血若しくは手術によって実現することができる。ステント及びカテーテルなどの医療用デバイスに所望の薬剤をコーティング、移植、埋め込み及びその他の方法で結合させる方法は、当該技術分野で確立されており、本明細書で企図されている。
【0215】
本開示の別の態様は、ナノ粒子の投与を、任意選択で別の治療薬と組み合わせて、被験体に対して行うためのキットに関する。一実施形態では、キットは、例えば、注射による投与に適した、医薬担体中に配合されたナノ粒子の組成物を含む。
【実施例】
【0216】
以下の実施例は、本開示内に記載される概念のいくつかを説明するために提供される。各実施例は、組成物、調製方法及び使用方法の特定の個々の実施形態を提供すると考えられるが、実施例のいずれも、本明細書に記載されるより一般的な実施形態を制限すると考えられるべきではない。
【0217】
以下の実施例では、使用した数値（例えば、量、温度など）に関して正確を期すよう努めたが、多少の実験誤差及び偏差は考慮する必要がある。特に別段の記載がない限り、温度は摂氏で、圧力は大気圧又はその近辺のものである。分子量についての言及は、特に別段の記載がない限り、数平均分子量を指すものとする。
【0218】
実施例１～４は、粘液酸の重合可能な粘液酸モノマー（ＭＡＭ）への変換を記載している。実施例５及び６は、ＭＡＭを重合して粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）を形成することを記載している。実施例７～１５は、７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン（ＳＮ３８）を、４つの異なるアミノ酸ベースのリンカーにより、ＭＡＰと反応可能な形態に誘導体化し、共有結合したＭＡＰ－ＳＮ３８コンジュゲートを形成することを記載している。実施例１６～２０は、アミノ酸ベースのリンカーによって結合したＭＡＰ－ＳＮ３８コンジュゲートを合成するために使用される反応を記載している。実施例２１は、ＭＡＰ－ＳＮ３８コンジュゲートをナノ粒子に変換するための方法を記載している。実施例２２及び２３は、ＭＡＰ－ＳＮ３８ナノ粒子の特性評価を記載している。実施例２４～２９は、ＭＡＰの分取スケール合成の経路を記載している。実施例３０～３２は、カンプトテシン（ＣＰＴ）の誘導体化及びＭＡＰへのその結合について記載している。実施例３３～３５は、ＭＡＰに結合させるためのＳＮ３８の誘導体化を記載している。実施例３６及び３７は、タンパク質コンジュゲートに適した反応性末端を有するニトロフェニルボロン酸－ポリエチレングリコール（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ）ポリマーの合成を記載している。実施例３８～４０は、標的化（ホーミング）分子のＮＰＢＡ－ＰＥＧポリマーへのコンジュゲーション及び生成物の特性評価を記載している。実施例４１～４３は、ＮＰＢＡ－ＰＥＧポリマーへの高分子治療薬のコンジュゲーション及び生成物の特性評価を記載している。
【0219】
（実施例１．Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（化合物２）の合成）
１８ｇ（８６ｍｍｏｌ）の粘液酸及び磁気撹拌子を入れた１Ｌ丸底フラスコに、４００ｍＬのメタノール（ＭｅＯＨ）及び１．４ｍＬの濃硫酸を入れた。この混合液を絶えず撹拌しながら一晩（約１８時間）加熱還流（８５℃）した。約１８時間後、３２ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ）をフラスコに加え、その混合液を還流（８５℃）で６０分間撹拌した。次に、反応混合液に、５０ｍＬのＭｅＯＨに溶解した３０ｇ（１８７ｍｍｏｌ）のＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミンを加えた。反応液を還流（８５℃）で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を室温まで冷却し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。次に、収集した固体を４５０ｍＬのＭｅＯＨに取り、絶えず撹拌しながら１時間還流した。反応混合液を室温まで冷却し、真空濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。収集した固体を一晩真空乾燥させ、２６．１ｇ（５２．８ｍｍｏｌ、６２％収率）のＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（２）を得た。
１８ｇ（８６ｍｍｏｌ）の粘液酸及び磁気撹拌子を入れた１Ｌ丸底フラスコに、４００ｍＬのメタノール（ＭｅＯＨ）及び１．４ｍＬの濃硫酸を入れた。この混合液を絶えず撹拌しながら一晩（約１８時間）加熱還流（８５℃）した。約１８時間後、３２ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ）をフラスコに加え、その混合液を還流（８５℃）で６０分間撹拌した。次に、反応混合液に、５０ｍＬのＭｅＯＨに溶解した３０ｇ（１８７ｍｍｏｌ）のＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミンを加えた。反応液を還流（８５℃）で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を室温まで冷却し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。次に、収集した固体を４５０ｍＬのＭｅＯＨに取り、絶えず撹拌しながら１時間還流した。反応混合液を室温まで冷却し、真空濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。収集した固体を一晩真空乾燥させ、２６．１ｇ（５２．８ｍｍｏｌ、６２％収率）のＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（２）を得た。
【化63】
【0220】
（実施例２．粘液酸ジアミノクロリド（化合物３）の合成）
２５．９ｇ（５２ｍｍｏｌ）のＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（２）及び磁気撹拌子を入れた５００ｍＬ丸底フラスコに、ＭｅＯＨ中の３Ｍ塩酸（ＨＣｌ）４６６ｍＬを絶えず撹拌しながらゆっくりと添加した。ＨＣｌをゆっくりと加えた後、反応フラスコをオービタルシェーカーに移し、室温で一晩振盪した。反応スラリーを濾過し、固体をＭｅＯＨで３回（１５０ｍＬ）洗浄した。収集した固体を３５℃で一晩、数時間真空乾燥させ、１８．０ｇ（４９ｍｍｏｌ、９４％収率）の粘液酸ジアミノクロリド（３）を得た。
２５．９ｇ（５２ｍｍｏｌ）のＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（２）及び磁気撹拌子を入れた５００ｍＬ丸底フラスコに、ＭｅＯＨ中の３Ｍ塩酸（ＨＣｌ）４６６ｍＬを絶えず撹拌しながらゆっくりと添加した。ＨＣｌをゆっくりと加えた後、反応フラスコをオービタルシェーカーに移し、室温で一晩振盪した。反応スラリーを濾過し、固体をＭｅＯＨで３回（１５０ｍＬ）洗浄した。収集した固体を３５℃で一晩、数時間真空乾燥させ、１８．０ｇ（４９ｍｍｏｌ、９４％収率）の粘液酸ジアミノクロリド（３）を得た。
【化64】
【0221】
（実施例３．粘液酸ジ（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｂｏｃ）（化合物４）の合成）
１４．９ｇ（５１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸４－ｔｅｒｔ－ブチルエステル、６ｇ（５４ｍｍｏｌ）のヒドロキシピリジンＮ－オキシド（ＨＯＰＯ）及び磁気撹拌子を入れた２５０ｍＬ丸底フラスコに、１４０ｍＬのアセトニトリル（ＡＣＮ）及び８．５ｍＬ（５４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加した。この反応混合液を１０分間撹拌した。次に、この反応フラスコに、水（５５ｍＬ）及びＴＥＡ（５．４ｍＬ）の混合液に溶解した６．３ｇ（１７ｍｍｏｌ）の粘液酸ジアミノクロリド（３）の懸濁液を添加した。反応混合液を絶えず磁気撹拌しながら約２４時間加熱した（８０℃）。加熱後、真空を利用して反応混合液からＡＣＮを除去した。濃縮した反応液にさらに水（１５０ｍＬ）を加え、混合液を１時間加熱した（８５℃）。冷却後、反応混合液を真空濾過により収集し、水で３回（１００ｍＬ）洗浄した。洗浄した固体をＡＣＮ（１５０ｍＬ）と共に丸底フラスコに戻した。反応混合液を絶えず撹拌しながら溶解するまで加熱還流した。冷却後、反応混合液を濾過により収集し、冷ＡＣＮ（１００ｍＬ）で３回洗浄した。収集した固体をＡＣＮ（１５０ｍＬ）と共に再び丸底フラスコに戻し、反応混合液を絶えず撹拌しながら約１時間加熱還流した。冷却後、反応混合液を濾過により収集し、冷ＡＣＮ（１００ｍＬ）で３回洗浄した。収集した固体を一晩真空乾燥させ、５．９ｇ（７ｍｍｏｌ、４１％収率）の粘液酸ジ（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｂｏｃ）（４）を得た。
１４．９ｇ（５１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸４－ｔｅｒｔ－ブチルエステル、６ｇ（５４ｍｍｏｌ）のヒドロキシピリジンＮ－オキシド（ＨＯＰＯ）及び磁気撹拌子を入れた２５０ｍＬ丸底フラスコに、１４０ｍＬのアセトニトリル（ＡＣＮ）及び８．５ｍＬ（５４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加した。この反応混合液を１０分間撹拌した。次に、この反応フラスコに、水（５５ｍＬ）及びＴＥＡ（５．４ｍＬ）の混合液に溶解した６．３ｇ（１７ｍｍｏｌ）の粘液酸ジアミノクロリド（３）の懸濁液を添加した。反応混合液を絶えず磁気撹拌しながら約２４時間加熱した（８０℃）。加熱後、真空を利用して反応混合液からＡＣＮを除去した。濃縮した反応液にさらに水（１５０ｍＬ）を加え、混合液を１時間加熱した（８５℃）。冷却後、反応混合液を真空濾過により収集し、水で３回（１００ｍＬ）洗浄した。洗浄した固体をＡＣＮ（１５０ｍＬ）と共に丸底フラスコに戻した。反応混合液を絶えず撹拌しながら溶解するまで加熱還流した。冷却後、反応混合液を濾過により収集し、冷ＡＣＮ（１００ｍＬ）で３回洗浄した。収集した固体をＡＣＮ（１５０ｍＬ）と共に再び丸底フラスコに戻し、反応混合液を絶えず撹拌しながら約１時間加熱還流した。冷却後、反応混合液を濾過により収集し、冷ＡＣＮ（１００ｍＬ）で３回洗浄した。収集した固体を一晩真空乾燥させ、５．９ｇ（７ｍｍｏｌ、４１％収率）の粘液酸ジ（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｂｏｃ）（４）を得た。
【化65】
【0222】
（実施例４．粘液酸モノマー（ＭＡＭ）（化合物５）の合成）
１ｇ（１ｍｍｏｌ）の粘液酸ジ（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｂｏｃ）（４）及び磁気撹拌子を入れた４０ｍＬバイアルに、ジクロロメタン（ＤＣＭ、７．５ｍＬ）を加えた。絶えず撹拌しながらこの反応混合液に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、７．５ｍＬ、９８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。室温で１時間撹拌した後、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、１００ｍＬ）をゆっくり加え、反応混合物を沈殿させた。沈殿した混合物を遠心分離し、続いてＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で１回洗浄した。収集した固体を真空乾燥させ、次いで水（３０ｍＬ）に溶解させた。溶解した生成物を０．２２μｍフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて０．２７６７ｇ（０．３８４ｍｍｏｌ、３２％収率）のＭＡＭ（５）を得た。
１ｇ（１ｍｍｏｌ）の粘液酸ジ（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｂｏｃ）（４）及び磁気撹拌子を入れた４０ｍＬバイアルに、ジクロロメタン（ＤＣＭ、７．５ｍＬ）を加えた。絶えず撹拌しながらこの反応混合液に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、７．５ｍＬ、９８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。室温で１時間撹拌した後、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、１００ｍＬ）をゆっくり加え、反応混合物を沈殿させた。沈殿した混合物を遠心分離し、続いてＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で１回洗浄した。収集した固体を真空乾燥させ、次いで水（３０ｍＬ）に溶解させた。溶解した生成物を０．２２μｍフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて０．２７６７ｇ（０．３８４ｍｍｏｌ、３２％収率）のＭＡＭ（５）を得た。
【化66】
【0223】
（実施例５．粘液酸ポリマー（ＭＡＰ）（化合物６）の合成）
２２４ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のＭＡＭ（５）、１ｇのジ（スクシンイミジルプロピオネート）－ＰＥＧ（ジＳＰＡ－ＰＥＧ３．５ｋ）（０．２７ｍｍｏｌ）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコを密閉し、２つの固体を室温で４時間真空乾燥させた。次に、この反応フラスコに４．１ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、混合液を加熱した（３５℃）。可溶化後、２０８μＬの無水Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．１９ｍｍｏｌ）を反応混合液に添加した。反応混合液を絶えず磁気撹拌しながら６６時間加熱した（３５℃）。反応混合液をＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用して水で透析した。その後透析した生成物を０．２２μｍフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて１．０３ｇ（定量的収率）のＭＡＰ（６）を得た。
２２４ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のＭＡＭ（５）、１ｇのジ（スクシンイミジルプロピオネート）－ＰＥＧ（ジＳＰＡ－ＰＥＧ３．５ｋ）（０．２７ｍｍｏｌ）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコを密閉し、２つの固体を室温で４時間真空乾燥させた。次に、この反応フラスコに４．１ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、混合液を加熱した（３５℃）。可溶化後、２０８μＬの無水Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．１９ｍｍｏｌ）を反応混合液に添加した。反応混合液を絶えず磁気撹拌しながら６６時間加熱した（３５℃）。反応混合液をＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用して水で透析した。その後透析した生成物を０．２２μｍフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて１．０３ｇ（定量的収率）のＭＡＰ（６）を得た。
【化67】
【0224】
この方法で合成した化合物６について、ｘは約８０であり、ｙは約１６であった。したがって、化合物６の平均分子量は、数平均分子量と重量平均分子量の算術平均値として決定すると、約６５ｋＤａであった。これらの値は、異なる出発材料（例えば、ジＳＰＡ－ＰＥＧ２ｋ）を使用した場合に変化する（例えば、２ｋＤａのＰＥＧではｘは約４６である）。
【0225】
（実施例６．ＭＡＰの分子量の測定）
ＭＡＰ（６）の分子量は、溶媒供給ポンプ、脱気装置、自動サンプリングインジェクター、カラムコンパートメント、屈折率検出器及び光散乱検出器を含むＭａｌｖｅｒｎ Ｏｍｎｉｓｅｃゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムで測定した。サンプルは、１～５ｍｇ／ｍＬの範囲にある既知濃度のＭＡＰ（６）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．０２％アジ化ナトリウムに溶解することにより、分析用に調製した。完全に溶解した後、サンプルを０．４５μｍフィルターに通した。濾過したサンプル１００μＬを２×ＰＬ Ａｑｕａｇｅｌ－ＯＨ ４０カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）に０．７ｍＬ／分の流量で注入し、絶対分子量を測定した。分析は、３０℃で行った。得られたポリマーピークは、Ｍａｌｖｅｒｎ ＯＭＮＩＳＥＣソフトウェアを使用して分析した。
ＭＡＰ（６）の分子量は、溶媒供給ポンプ、脱気装置、自動サンプリングインジェクター、カラムコンパートメント、屈折率検出器及び光散乱検出器を含むＭａｌｖｅｒｎ Ｏｍｎｉｓｅｃゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムで測定した。サンプルは、１～５ｍｇ／ｍＬの範囲にある既知濃度のＭＡＰ（６）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．０２％アジ化ナトリウムに溶解することにより、分析用に調製した。完全に溶解した後、サンプルを０．４５μｍフィルターに通した。濾過したサンプル１００μＬを２×ＰＬ Ａｑｕａｇｅｌ－ＯＨ ４０カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）に０．７ｍＬ／分の流量で注入し、絶対分子量を測定した。分析は、３０℃で行った。得られたポリマーピークは、Ｍａｌｖｅｒｎ ＯＭＮＩＳＥＣソフトウェアを使用して分析した。
【0226】
（実施例７．１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物７）の合成）
２ｇ（５．１０ｍｍｏｌ）のＳＮ３８及び磁気撹拌子を入れた２５０ｍＬ丸底フラスコに、１００ｍＬの無水ＤＣＭ及び４．２ｍＬ（３０．５８ｍｍｏｌ）のＴＥＡを入れた。次に、この反応混合液に、ｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ）７．９ｍＬ（３０．５８ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を絶えず撹拌しながら一晩（約１６時間）加熱還流（５０℃）し、次いで０．２ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させた。残渣を無水ＤＣＭに溶解し、ヘキサンで沈殿させた。この沈殿を繰り返して、過剰のＴＢＤＰＳＣｌをさらに除去した。固体を真空乾燥させ、１．２ｇ（１．９ｍｍｏｌ、３７％収率）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を得た。
２ｇ（５．１０ｍｍｏｌ）のＳＮ３８及び磁気撹拌子を入れた２５０ｍＬ丸底フラスコに、１００ｍＬの無水ＤＣＭ及び４．２ｍＬ（３０．５８ｍｍｏｌ）のＴＥＡを入れた。次に、この反応混合液に、ｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ）７．９ｍＬ（３０．５８ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を絶えず撹拌しながら一晩（約１６時間）加熱還流（５０℃）し、次いで０．２ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させた。残渣を無水ＤＣＭに溶解し、ヘキサンで沈殿させた。この沈殿を繰り返して、過剰のＴＢＤＰＳＣｌをさらに除去した。固体を真空乾燥させ、１．２ｇ（１．９ｍｍｏｌ、３７％収率）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を得た。
【化68】
【0227】
（実施例８．２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物８）の合成）
０．５ｇ（０．８ｍｍｏｌ）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を入れた４０ｍＬバイアルに、８．９ｍＬの無水ＤＣＭ及び磁気撹拌子を加えた。溶媒添加後、反応液を０℃に冷却した。別のバイアルに０．３５ｇのＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（２．０ｍｍｏｌ）、０．３９ｇ（２．０ｍｍｏｌ）の１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、０．１ｇ（０．８ｍｍｏｌ）の４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及び３．８ｍＬの無水ＤＣＭを添加した。次に、第２バイアルの内容物を、７を含むフラスコに移した。０℃で３時間撹拌した後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させ、０．５４ｇのクルード２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（８）（０．７ｍｍｏｌ、８６％収率）を得た。
０．５ｇ（０．８ｍｍｏｌ）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を入れた４０ｍＬバイアルに、８．９ｍＬの無水ＤＣＭ及び磁気撹拌子を加えた。溶媒添加後、反応液を０℃に冷却した。別のバイアルに０．３５ｇのＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（２．０ｍｍｏｌ）、０．３９ｇ（２．０ｍｍｏｌ）の１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、０．１ｇ（０．８ｍｍｏｌ）の４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及び３．８ｍＬの無水ＤＣＭを添加した。次に、第２バイアルの内容物を、７を含むフラスコに移した。０℃で３時間撹拌した後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させ、０．５４ｇのクルード２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（８）（０．７ｍｍｏｌ、８６％収率）を得た。
【化69】
【0228】
（実施例９．２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物９）の合成）
１ｇ（１．６ｍｍｏｌ）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を入れた４０ｍＬバイアルに、１７．７ｍＬの無水ＤＣＭ及び磁気撹拌子を加えた。溶媒添加後、反応液を０℃に冷却した。別のバイアルに０．８２ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ、０．７７ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ、０．２０ｇ（１．６ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰ及び７．６ｍＬの無水ＤＣＭを添加した。次に、第２バイアルの内容物を、７を含むフラスコに移した。０℃で３時間撹拌した後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させて、１．０５ｇのクルード２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（９）（１．２８ｍｍｏｌ、定量的収率）を得た。
１ｇ（１．６ｍｍｏｌ）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を入れた４０ｍＬバイアルに、１７．７ｍＬの無水ＤＣＭ及び磁気撹拌子を加えた。溶媒添加後、反応液を０℃に冷却した。別のバイアルに０．８２ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ、０．７７ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ、０．２０ｇ（１．６ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰ及び７．６ｍＬの無水ＤＣＭを添加した。次に、第２バイアルの内容物を、７を含むフラスコに移した。０℃で３時間撹拌した後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させて、１．０５ｇのクルード２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（９）（１．２８ｍｍｏｌ、定量的収率）を得た。
【化70】
【0229】
（実施例１０．２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（化合物１０）の合成）
０．６ｇ（０．９５ｍｍｏｌ）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を入れた４０ｍＬバイアルに、１０．４ｍＬの無水ＤＣＭ及び磁気撹拌子を加えた。溶媒添加後、反応液を０℃に冷却した。別のバイアルに０．５５ｇのＢｏｃ－Ｈｅｘ－ＯＨ（２．４ｍｍｏｌ）、０．４５ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ、０．１２ｇ（０．９８ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰ及び４．５ｍＬの無水ＤＣＭを添加した。次に、第２バイアルの内容物を、７を含むフラスコに移した。０℃で３時間撹拌した後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させて、０．８８ｇのクルード２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（１０）（１．０ｍｍｏｌ、１１１％収率）を得た。
０．６ｇ（０．９５ｍｍｏｌ）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を入れた４０ｍＬバイアルに、１０．４ｍＬの無水ＤＣＭ及び磁気撹拌子を加えた。溶媒添加後、反応液を０℃に冷却した。別のバイアルに０．５５ｇのＢｏｃ－Ｈｅｘ－ＯＨ（２．４ｍｍｏｌ）、０．４５ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ、０．１２ｇ（０．９８ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰ及び４．５ｍＬの無水ＤＣＭを添加した。次に、第２バイアルの内容物を、７を含むフラスコに移した。０℃で３時間撹拌した後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させて、０．８８ｇのクルード２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（１０）（１．０ｍｍｏｌ、１１１％収率）を得た。
【化71】
【0230】
（実施例１１．２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８の合成（化合物１１））
１．０ｇ（１．６ｍｍｏｌ）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を入れた１００ｍＬ丸底フラスコに、１７．７ｍＬの無水ＤＣＭ及び磁気撹拌子を加えた。溶媒添加後、反応液を０℃に冷却した。別のバイアルに０．８７ｇのＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ（４．０ｍｍｏｌ）、０．７７ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ、０．２０ｇ（１．６ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰ及び７．６ｍＬの無水ＤＣＭを添加した。次に、第２バイアルの内容物を、７を含むフラスコに移した。０℃で３時間撹拌した後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させて、１．２４ｇのクルード２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（１１）（１．５ｍｍｏｌ、９３％収率）を得た。
１．０ｇ（１．６ｍｍｏｌ）の１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（７）を入れた１００ｍＬ丸底フラスコに、１７．７ｍＬの無水ＤＣＭ及び磁気撹拌子を加えた。溶媒添加後、反応液を０℃に冷却した。別のバイアルに０．８７ｇのＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ（４．０ｍｍｏｌ）、０．７７ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ、０．２０ｇ（１．６ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰ及び７．６ｍＬの無水ＤＣＭを添加した。次に、第２バイアルの内容物を、７を含むフラスコに移した。０℃で３時間撹拌した後、混合液を０．５％ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させて、１．２４ｇのクルード２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（１１）（１．５ｍｍｏｌ、９３％収率）を得た。
【化72】
【0231】
（実施例１２．２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８（化合物１２）の合成）
１．２ｇ（１．５ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（８）及び磁気撹拌子を入れた１００ｍＬ丸底フラスコに、７５ｍＬの１２ＮのＨＣｌを絶えず撹拌しながらゆっくりと加えた。ＨＣｌ溶液の上からヘキサン（２０ｍＬ）を添加した。室温で一晩（約１６時間）撹拌した後、ヘキサン層を反応液から除去した。次に、反応液をヘキサンで３回洗浄した（３×２０ｍＬ）。その後、真空を利用して、反応混合液からＨＣｌを除去した。残渣をＭｅＯＨに溶解し、ＭＴＢＥで沈殿させた。固体を真空乾燥させ、０．４４ｇ（０．９１ｍｍｏｌ、６０％）の２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８（１２）を得た。
１．２ｇ（１．５ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（８）及び磁気撹拌子を入れた１００ｍＬ丸底フラスコに、７５ｍＬの１２ＮのＨＣｌを絶えず撹拌しながらゆっくりと加えた。ＨＣｌ溶液の上からヘキサン（２０ｍＬ）を添加した。室温で一晩（約１６時間）撹拌した後、ヘキサン層を反応液から除去した。次に、反応液をヘキサンで３回洗浄した（３×２０ｍＬ）。その後、真空を利用して、反応混合液からＨＣｌを除去した。残渣をＭｅＯＨに溶解し、ＭＴＢＥで沈殿させた。固体を真空乾燥させ、０．４４ｇ（０．９１ｍｍｏｌ、６０％）の２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８（１２）を得た。
【化73】
【0232】
（実施例１３．２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８（化合物１３）の合成）
０．３７ｇ（０．４５ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（９）、８．６ｍＬ水及び磁気撹拌子を入れた５０ｍＬ丸底フラスコに、絶えず撹拌しながら８．６ｍＬのＴＦＡをゆっくりと添加した。ＴＦＡ溶液の上からヘキサン（２０ｍＬ）を添加した。室温で一晩（約１６時間）撹拌した後、ヘキサン層を反応液から除去した。次に、反応液をヘキサンで３回洗浄した（３×２０ｍＬ）。次に、真空を利用して、反応混合液を濃縮した。残渣をＭｅＯＨに溶解し、ＭＴＢＥで沈殿させた。固体を真空乾燥させて、０．１６ｇ（０．２７ｍｍｏｌ、６０％）の２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８（１３）を得た。
０．３７ｇ（０．４５ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（９）、８．６ｍＬ水及び磁気撹拌子を入れた５０ｍＬ丸底フラスコに、絶えず撹拌しながら８．６ｍＬのＴＦＡをゆっくりと添加した。ＴＦＡ溶液の上からヘキサン（２０ｍＬ）を添加した。室温で一晩（約１６時間）撹拌した後、ヘキサン層を反応液から除去した。次に、反応液をヘキサンで３回洗浄した（３×２０ｍＬ）。次に、真空を利用して、反応混合液を濃縮した。残渣をＭｅＯＨに溶解し、ＭＴＢＥで沈殿させた。固体を真空乾燥させて、０．１６ｇ（０．２７ｍｍｏｌ、６０％）の２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８（１３）を得た。
【化74】
【0233】
（実施例１４．２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８（化合物１４）の合成）
０．３７ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（１０）、８．３ｍＬ水及び磁気撹拌子を入れた５０ｍＬ丸底フラスコに、絶えず撹拌しながら８．３ｍＬのＴＦＡをゆっくりと添加した。ＴＦＡ溶液の上からヘキサン（２０ｍＬ）を添加した。室温で一晩（約１６時間）撹拌した後、ヘキサン層を反応液から除去した。次に、反応液をヘキサンで３回洗浄した（３×２０ｍＬ）。次に、真空を利用して、反応混合液を濃縮した。残渣をＭｅＯＨに溶解し、ＭＴＢＥで沈殿させた。固体を真空乾燥させ、０．１６ｇ（０．２６ｍｍｏｌ、６０％）の２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８（１４）を得た。
０．３７ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｈｅｘ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（１０）、８．３ｍＬ水及び磁気撹拌子を入れた５０ｍＬ丸底フラスコに、絶えず撹拌しながら８．３ｍＬのＴＦＡをゆっくりと添加した。ＴＦＡ溶液の上からヘキサン（２０ｍＬ）を添加した。室温で一晩（約１６時間）撹拌した後、ヘキサン層を反応液から除去した。次に、反応液をヘキサンで３回洗浄した（３×２０ｍＬ）。次に、真空を利用して、反応混合液を濃縮した。残渣をＭｅＯＨに溶解し、ＭＴＢＥで沈殿させた。固体を真空乾燥させ、０．１６ｇ（０．２６ｍｍｏｌ、６０％）の２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８（１４）を得た。
【化75】
【0234】
（実施例１５．２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８（化合物１５）の合成）
１．２ｇ（１．４ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（１１）及び磁気撹拌子を入れた１００ｍＬ丸底フラスコに、７５ｍＬの１２ＮのＨＣｌを絶えず撹拌しながらゆっくりと加えた。ＨＣｌ溶液の上からヘキサン（２０ｍＬ）を添加した。室温で一晩（約１６時間）撹拌した後、ヘキサン層を反応液から除去した。次に、反応液をヘキサンで３回洗浄した（３×２０ｍＬ）。その後、真空を利用して、反応混合液からＨＣｌを除去した。残渣をＭｅＯＨに溶解し、ＭＴＢＥで沈殿させた。固体を真空乾燥させ、０．４６ｇ（０．８６ｍｍｏｌ、６０％収率）の２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８（１５）を得た。
１．２ｇ（１．４ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＴＢＤＰＳ－ＳＮ３８（１１）及び磁気撹拌子を入れた１００ｍＬ丸底フラスコに、７５ｍＬの１２ＮのＨＣｌを絶えず撹拌しながらゆっくりと加えた。ＨＣｌ溶液の上からヘキサン（２０ｍＬ）を添加した。室温で一晩（約１６時間）撹拌した後、ヘキサン層を反応液から除去した。次に、反応液をヘキサンで３回洗浄した（３×２０ｍＬ）。その後、真空を利用して、反応混合液からＨＣｌを除去した。残渣をＭｅＯＨに溶解し、ＭＴＢＥで沈殿させた。固体を真空乾燥させ、０．４６ｇ（０．８６ｍｍｏｌ、６０％収率）の２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８（１５）を得た。
【化76】
【0235】
（実施例１６．ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８（化合物１６）の合成）
１００ｍｇのＭＡＰ（６）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコに、８ｍＬの無水ＤＭＳＯを入れた。次に、この反応混合液に、５１．９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び２４．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加した。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加に続いて、反応混合液に１０５．２ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８（１２）及び無水ＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を、ＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用してｐＨ４の水で透析した。透析した生成物を０．２２μｍのフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて、９８ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８（１６）を得た。
１００ｍｇのＭＡＰ（６）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコに、８ｍＬの無水ＤＭＳＯを入れた。次に、この反応混合液に、５１．９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び２４．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加した。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加に続いて、反応混合液に１０５．２ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の２０－（ＨＣｌ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８（１２）及び無水ＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を、ＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用してｐＨ４の水で透析した。透析した生成物を０．２２μｍのフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて、９８ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８（１６）を得た。
【化77】
【0236】
実施例５で述べたように、化合物６及び１６について、ｘは約８０であり、ｙは約１６であった。
【0237】
（実施例１７．ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８（化合物１７）の合成）
１００ｍｇのＭＡＰ（６）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコに、８ｍＬの無水ＤＭＳＯを加えた。次に、この反応混合液に、５１．９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び２４．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮＨＳを添加した。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加に続いて、反応混合液に１２８．３ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８（１３）及び無水ＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を、ＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用してｐＨ４の水で透析した。透析した生成物を０．２２μｍのフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて、９１ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８（１７）を得た。
１００ｍｇのＭＡＰ（６）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコに、８ｍＬの無水ＤＭＳＯを加えた。次に、この反応混合液に、５１．９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び２４．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮＨＳを添加した。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加に続いて、反応混合液に１２８．３ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＳＮ３８（１３）及び無水ＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を、ＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用してｐＨ４の水で透析した。透析した生成物を０．２２μｍのフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて、９１ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８（１７）を得た。
【化78】
【0238】
実施例５で述べたように、化合物６及び１７について、ｘは約８０であり、ｙは約１６であった。
【0239】
（実施例１８．ＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８（化合物１８）の合成）
１００ｍｇのＭＡＰ（６）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコに、８ｍＬの無水ＤＭＳＯを加えた。次に、この反応混合液に、５１．９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び２４．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮＨＳを添加した。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加に続いて、反応混合液に、１３４．４ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８（１４）及び無水ＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を、ＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用してｐＨ４の水で透析した。透析した生成物を０．２２μｍのフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて、９７ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８（１８）を得た。
１００ｍｇのＭＡＰ（６）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコに、８ｍＬの無水ＤＭＳＯを加えた。次に、この反応混合液に、５１．９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び２４．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮＨＳを添加した。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加に続いて、反応混合液に、１３４．４ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の２０－（ＴＦＡ．Ｈｅｘ）－ＳＮ３８（１４）及び無水ＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を、ＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用してｐＨ４の水で透析した。透析した生成物を０．２２μｍのフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて、９７ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８（１８）を得た。
【化79】
【0240】
実施例５で述べたように、化合物６及び１８について、ｘは約８０であり、ｙは約１６であった。
【0241】
（実施例１９．ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８（化合物１９）の合成）
１００ｍｇのＭＡＰ（６）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコに、８ｍＬの無水ＤＭＳＯを加えた。次に、この反応混合液に、５１．９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び２４．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮＨＳを添加した。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加に続いて、反応混合液に、１１４．３ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８（１５）及び無水ＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を、ＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用してｐＨ４の水で透析した。透析した生成物を０．２２μｍのフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて、９６ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８（１９）を得た。
１００ｍｇのＭＡＰ（６）及び磁気撹拌子を入れた１０ｍＬ丸底フラスコに、８ｍＬの無水ＤＭＳＯを加えた。次に、この反応混合液に、５１．９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び２４．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮＨＳを添加した。ＥＤＣ．ＨＣｌ及びＮＨＳの添加に続いて、反応混合液に、１１４．３ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の２０－（ＨＣｌ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８（１５）及び無水ＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合液を、ＤＭＳＯで透析し、次いで１０ｋＤａ膜を使用してｐＨ４の水で透析した。透析した生成物を０．２２μｍのフィルターに通し、凍結させ、凍結乾燥させて、９６ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８（１９）を得た。
【化80】
【0242】
実施例５で述べたように、化合物６及び１９について、ｘは約８０であり、ｙは約１６であった。
【0243】
（実施例２０．薬物負荷の特性評価）
ＳＮ３８のＭＡＰへの負荷は、逆相カラム（Ｓｙｎｅｒｇｉ ４μｍのＨｙｄｒｏ－ＲＰ８０Å、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を３７５／５３６ｎｍ（ｅｘ／ｅｍ）に設定した蛍光検出器に接続したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステムで測定した。ＡＣＮ／１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ４（１：１ｖ／ｖ）を溶離液として、流速０．５ｍＬ／分で使用した。
ＳＮ３８のＭＡＰへの負荷は、逆相カラム（Ｓｙｎｅｒｇｉ ４μｍのＨｙｄｒｏ－ＲＰ８０Å、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を３７５／５３６ｎｍ（ｅｘ／ｅｍ）に設定した蛍光検出器に接続したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステムで測定した。ＡＣＮ／１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ４（１：１ｖ／ｖ）を溶離液として、流速０．５ｍＬ／分で使用した。
【0244】
分析用に、ポリマー薬物コンジュゲート（化合物１６～１９）をｐＨ７．４のＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。最初に１０μＬのサンプルを１０μＬの０．１ＮのＨＣｌと混合し、室温で３０分間インキュベートすることにより、非コンジュゲートＳＮ３８の量を測定した。６．７μＬの水、続いて７３．３μＬのＡＣＮを加え、室温で３時間インキュベートした。この混合液を１，４０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を０．４５μｍのフィルターに通した。濾過したサンプルを１０μＬ注入し、ＳＮ３８濃度を測定した。得られた溶出ＳＮ３８のピーク面積を、既知濃度のＳＮ３８のピーク面積と比較した。
【0245】
ＳＮ３８の総量を測定するために、１０μＬのサンプルを６．７μＬの０．１ＮのＮａＯＨと混合した。この溶液を室温で３．５時間インキュベートし、ＳＮ３８を親ポリマーから放出させた。その後、１０μＬの０．１ＮのＨＣｌを加え（カルボキシレートＳＮ３８型をラクトン型に変換するため）、この混合液を４５分間インキュベートした。続いて７３．３μＬのＡＣＮを加え、混合液を室温で３時間インキュベートした。その後、サンプルを遠心分離し、上記のように処理した。ポリマー結合ＳＮ３８は、ＳＮ３８総濃度と非コンジュゲートＳＮ３８濃度との差から決定した。
【0246】
（実施例２１．ＭＡＰ－リンカー－ＳＮ３８ナノ粒子の形成）
ポリマー薬物コンジュゲート（化合物１６～１９）をｐＨ４の水に４ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ＭＡＰ－リンカー－ＳＮ３８ナノ粒子を形成した。この溶液を０．２２μｍのフィルターに通し、その後の分析用に凍結した。ナノ粒子をｐＨ４の水で２ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）装置を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）により流体力学直径を測定した。ナノ粒子について、それぞれ１分間で５回実行した。すべてのナノ粒子の直径はほぼ２５ｎｍであり、１９～３２ｎｍの幅があった。
ポリマー薬物コンジュゲート（化合物１６～１９）をｐＨ４の水に４ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ＭＡＰ－リンカー－ＳＮ３８ナノ粒子を形成した。この溶液を０．２２μｍのフィルターに通し、その後の分析用に凍結した。ナノ粒子をｐＨ４の水で２ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）装置を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）により流体力学直径を測定した。ナノ粒子について、それぞれ１分間で５回実行した。すべてのナノ粒子の直径はほぼ２５ｎｍであり、１９～３２ｎｍの幅があった。
【0247】
（実施例２２．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ放出試験）
ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８及びＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８ナノ粒子からのＳＮ３８の放出を評価するための実験を行った。ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８及びＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８ナノ粒子の合成については、以下の実施例３３～３５を参照。これらの研究は、ＰＢＳ中０．１ｍｇのＳＮ３８／ｍＬで、ｐＨ値６．５、７．０又は７．４で行った。
ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８及びＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８ナノ粒子からのＳＮ３８の放出を評価するための実験を行った。ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８及びＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８ナノ粒子の合成については、以下の実施例３３～３５を参照。これらの研究は、ＰＢＳ中０．１ｍｇのＳＮ３８／ｍＬで、ｐＨ値６．５、７．０又は７．４で行った。
【0248】
ＰＢＳ培地をピペットでキュベットに注入し、加湿オーブン内で３７℃で２時間インキュベートして平衡化した。ナノ粒子製剤を関連する培地に混合し、オーブンに戻した。サンプルは所定の時点で取り出し、分析の時間まで－８０℃で瞬間凍結した。非コンジュゲートＳＮ３８の量及びＳＮ３８の総量を、実施例２０において上述したように測定した。ポリマー結合ＳＮ３８濃度は、ＳＮ３８総濃度と非コンジュゲートＳＮ３８濃度との差から決定した。
【0249】
その結果、７種類すべてのナノ粒子：ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｈｅｘ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－Ａｌａ－ＳＮ３８、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＳＮ３８及びＭＡＰ－Ｌｅｕ－ＳＮ３８からのＳＮ３８の放出は一次速度則を示した。放出速度はｐＨに強く依存していることが観察された。ｐＨが６．５～７．４に上昇すると、すべてのナノ粒子製剤で放出半減期が減少し、加水分解がＳＮ３８の放出に重要な役割を果たしていることが示唆された。リンカーの疎水性及び立体障害性が高いほど、ナノ粒子の半減期は長く、約３０時間～１６８時間超の幅があった。
【0250】
（実施例２３．粒子あたりのストランド数の決定）
ナノ粒子あたりのストランド数（ＳｐＰ）は、粒子の分子量とＭＡＰの分子量との比率を計算することで求めた。公称分子量１００ｋＤａ及び２００ｋＤａのポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）標準並びに目的のサンプルを、ｐＨ３の水又はＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウムに１～５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解してＧＰＣ分析（Ｏｍｎｉｓｅｃ ＧＰＣ、Ｍａｌｖｅｒｎ）用に調製した。濃度は、粒子形成後に予想される濃度に近いものを選択した。溶解後、サンプルを０．４５μｍフィルターに通し、Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ３００又はＺｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ、３μｍ）を用いて０．３５ｍＬ／分、３０℃で分析した。光散乱及び示差屈折率の情報を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＯＭＮＩＳＥＣソフトウェア又は同様の分子量解析ソフトウェアで使用し、粒子の分子量を決定した。
ナノ粒子あたりのストランド数（ＳｐＰ）は、粒子の分子量とＭＡＰの分子量との比率を計算することで求めた。公称分子量１００ｋＤａ及び２００ｋＤａのポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）標準並びに目的のサンプルを、ｐＨ３の水又はＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウムに１～５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解してＧＰＣ分析（Ｏｍｎｉｓｅｃ ＧＰＣ、Ｍａｌｖｅｒｎ）用に調製した。濃度は、粒子形成後に予想される濃度に近いものを選択した。溶解後、サンプルを０．４５μｍフィルターに通し、Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ３００又はＺｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ、３μｍ）を用いて０．３５ｍＬ／分、３０℃で分析した。光散乱及び示差屈折率の情報を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＯＭＮＩＳＥＣソフトウェア又は同様の分子量解析ソフトウェアで使用し、粒子の分子量を決定した。
【0251】
粒子の分子量をＭＡＰ－ＳＮ３８コンジュゲート分子の分子量で割って、粒子あたりのストランドを決定した。ＭＡＰ－ＳＮ３８コンジュゲート分子の分子量は、薬剤負荷率で調整したポリマーの分子量から、以下の式に従って算出した。
ＭＷコンジュゲート＝ＭＷポリマー／（１－Ｔ％）
（式中、ＭＷポリマーはＭＡＰの分子量であり、Ｔ％は小数で表した治療薬の負荷率、例えば、１０％負荷でＴ％＝０．１となる。））
ＭＷコンジュゲート＝ＭＷポリマー／（１－Ｔ％）
（式中、ＭＷポリマーはＭＡＰの分子量であり、Ｔ％は小数で表した治療薬の負荷率、例えば、１０％負荷でＴ％＝０．１となる。））
【0252】
ＳｐＰの測定は、様々なリンカーと薬剤を有するＭＡＰで実証した。ＣＰＴ又はＳＮ３８とコンジュゲートした同じ分子量のＭＡＰは、粒子あたり約１．５～２．５本のストランドを持つナノ粒子を生成する。誘導体化されたＳＮ３８に異なるリンカーを使用すると、粒子あたりのストランド数が変化し、その結果、粒子の密度が変化する。粒子あたりのストランドの数は、リンカー（グリシン、γ－アミノ酪酸、ヘキサン酸、アラニン、β－アラニン、ロイシン又はバリン）によって、約１．３～約４．６と変化した。
【0253】
（実施例２４．Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（化合物２）の分取スケール合成）
窒素下で機械的に撹拌した１５リットルの反応容器に、４５０ｇ（２．１ｍｏｌ）の粘液酸及びＭｅＯＨ（５．７５Ｌ）を加えた。この反応容器に、ＭｅＯＨ（１Ｌ）及び濃硫酸（３４．２ｍＬ、０．６４ｍｏｌ）からなる溶液を加えた。この混合液を、６５℃の内部温度に４８時間加熱した。反応容器の内容物を２２℃に冷却し、その時点で０．８１Ｌ（５．７８ｍｏｌ）のＴＥＡを２０分かけて添加した。反応液を１時間撹拌し、その時点で０．９ＬのＭｅＯＨ中０．７６ｋｇ（４．７１ｍｏｌ）のＮ－（２－アミノエチル）（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボキサミドの溶液を２０分かけて添加した。反応液を６３℃の内部温度に加熱し、６０分後に１．８ＬのＭｅＯＨを加えて撹拌を促進した。６３℃で合計２時間後、反応容器を毎分１℃で冷却し、２０℃で一晩保持した。反応スラリーを濾過し、ケーキをＭｅＯＨ（３×０．５Ｌ）で洗浄した。固体を真空フィルター上で一晩乾燥させ、液体を完全に除去した。単離した固体をＭｅＯＨ（９．０Ｌ）と共に反応容器に戻し、６３℃で１時間撹拌した。反応容器を毎分１℃の割合で冷却するように設定し、２０℃で約６０時間保持した。スラリーを濾過し、ＭｅＯＨ（２×１．０Ｌ）で洗浄し、固体を４５℃の真空オーブンで一晩乾燥し、Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（２）９６３ｇ（ＭｅＯＨとの溶媒和物として９１％収率、無水物として８２％収率）を得た。
窒素下で機械的に撹拌した１５リットルの反応容器に、４５０ｇ（２．１ｍｏｌ）の粘液酸及びＭｅＯＨ（５．７５Ｌ）を加えた。この反応容器に、ＭｅＯＨ（１Ｌ）及び濃硫酸（３４．２ｍＬ、０．６４ｍｏｌ）からなる溶液を加えた。この混合液を、６５℃の内部温度に４８時間加熱した。反応容器の内容物を２２℃に冷却し、その時点で０．８１Ｌ（５．７８ｍｏｌ）のＴＥＡを２０分かけて添加した。反応液を１時間撹拌し、その時点で０．９ＬのＭｅＯＨ中０．７６ｋｇ（４．７１ｍｏｌ）のＮ－（２－アミノエチル）（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボキサミドの溶液を２０分かけて添加した。反応液を６３℃の内部温度に加熱し、６０分後に１．８ＬのＭｅＯＨを加えて撹拌を促進した。６３℃で合計２時間後、反応容器を毎分１℃で冷却し、２０℃で一晩保持した。反応スラリーを濾過し、ケーキをＭｅＯＨ（３×０．５Ｌ）で洗浄した。固体を真空フィルター上で一晩乾燥させ、液体を完全に除去した。単離した固体をＭｅＯＨ（９．０Ｌ）と共に反応容器に戻し、６３℃で１時間撹拌した。反応容器を毎分１℃の割合で冷却するように設定し、２０℃で約６０時間保持した。スラリーを濾過し、ＭｅＯＨ（２×１．０Ｌ）で洗浄し、固体を４５℃の真空オーブンで一晩乾燥し、Ｎ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（２）９６３ｇ（ＭｅＯＨとの溶媒和物として９１％収率、無水物として８２％収率）を得た。
【化81】
【0254】
（実施例２５．粘液酸ジアミノクロリド（化合物３）の分取スケール合成）
機械的に撹拌した１５Ｌの反応容器に、８９０ｇのＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（２）（１．８０ｍｍｏｌ）、３．６Ｌの水及び７．１ＬのＭｅＯＨを添加した。このスラリーに、温度を２０℃～３０℃の範囲に維持しながら、２時間かけて１２ＭのＨＣｌ（３．６Ｌ）を加えた。この反応液液を一晩撹拌し、その時点でスラリーを濾過し、１．８ＬのＭｅＯＨで洗浄した。単離した固体をトレイに入れ、真空オーブン内で４５℃で乾燥させた。単離した固体を水（５．５Ｌ）と共に窒素下で１５Ｌ反応容器に充填し、４５℃で撹拌した。５．５ＬのＭｅＯＨを３０分かけて添加すると、結果として結晶化した。反応容器を冷却し、反応内容物を室温まで冷却した。固体を濾過により単離し、ＭｅＯＨ（２×１．０Ｌ）で洗浄した。固体を収集し、４０℃の真空オーブンで一晩乾燥し、５０４ｇ（１．３７ｍｏｌ、７６％収率）の粘液酸ジアミノクロリド（３）を得た。
機械的に撹拌した１５Ｌの反応容器に、８９０ｇのＮ－Ｂｏｃ保護粘液酸ジアミン（２）（１．８０ｍｍｏｌ）、３．６Ｌの水及び７．１ＬのＭｅＯＨを添加した。このスラリーに、温度を２０℃～３０℃の範囲に維持しながら、２時間かけて１２ＭのＨＣｌ（３．６Ｌ）を加えた。この反応液液を一晩撹拌し、その時点でスラリーを濾過し、１．８ＬのＭｅＯＨで洗浄した。単離した固体をトレイに入れ、真空オーブン内で４５℃で乾燥させた。単離した固体を水（５．５Ｌ）と共に窒素下で１５Ｌ反応容器に充填し、４５℃で撹拌した。５．５ＬのＭｅＯＨを３０分かけて添加すると、結果として結晶化した。反応容器を冷却し、反応内容物を室温まで冷却した。固体を濾過により単離し、ＭｅＯＨ（２×１．０Ｌ）で洗浄した。固体を収集し、４０℃の真空オーブンで一晩乾燥し、５０４ｇ（１．３７ｍｏｌ、７６％収率）の粘液酸ジアミノクロリド（３）を得た。
【化82】
【0255】
（実施例２６．粘液酸ジ（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｂｏｃ）（化合物４）の分取スケール合成）
機械的に撹拌した１５Ｌの反応器に、１．２７ｋｇのＢｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸４－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（４．３９ｍｏｌ）、０．６２ｋｇのオキシマ（シアノヒドロキシイミノ酢酸エチル）（４．３９ｍｏｌ）及び３．５ＬのＤＣＭを添加した。反応混合液を５℃に冷却し、３０分間撹拌した。反応混合液に、固体として０．８４ｋｇのＥＤＣ．ＨＣｌ（４．４０ｍｏｌ）を１０分かけて加えた。ＥＤＣ．ＨＣｌを追加の０．５ＬのＤＣＭで反応液にすすぎ入れ、反応液を約３０分間撹拌させ、その後１０℃に冷却した。別の１２Ｌフラスコに、１．０２ｋｇの炭酸ナトリウム（９．６１ｍｏｌ）及び５．０Ｌの水を入れた。成分を溶解させた後、室温まで冷却した。１０分かけて、５０４ｇ（１．３７ｍｏｌ）の３を炭酸ナトリウム溶液に添加した。この混合液を１５分間撹拌させ、その時点で１５Ｌ反応フラスコ中のＢｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸４－ｔｅｒｔ－ブチルエステルに約３分かけて添加した。混合反応は発熱したが、冷却ジャケットを１０℃で３０分、その後１５℃でさらに４５分に設定した。その後、反応ジャケットを３３℃に設定し、１時間後、水８．０６Ｌを加え、５分間撹拌した。その後、撹拌を中止し、１５分後に反応相を分離した。ＤＣＭ（下層）を除去し、反応器に１．０ＬのＤＣＭを追加した。この混合液を１０分間撹拌し、その後沈殿させた。ＤＣＭ層を回収し、最初に回収した有機層と合わせ、総容量が約３Ｌになるように濃縮した。１Ｌの水を有機混合液に加え、ＤＣＭのさらなる蒸留除去を促した。次に、有機反応混合液を、４０℃に加熱した１１．１Ｌの水を含む１５Ｌの反応器に加えた。撹拌混合液を２０℃に戻し、スラリーを形成した。水を除去し、反応器内に固体を残した。湿った固体に１０．１Ｌの水を加えた。反応混合液を３７℃に加熱し、撹拌を促進した。その後、反応液を一晩３℃に冷却し、撹拌した。固体を濾過し、次いで追加の１０Ｌの水と共に反応器に再び戻した。このスラリーを室温で３時間撹拌した。固体を再び濾過し、１．０Ｌの水で洗浄し、乾燥させて、８１５ｇの材料を得ることができた。７９０ｇのクルード４を２．４ＬのＡＣＮと共に５Ｌ丸底フラスコに加え、６０℃に加熱した。部分真空下での共沸蒸留及びＡＣＮの継続的添加により水を約１．６Ｌの容量まで連続的に留去した。これに３．１ＬのＡＣＮを添加して結晶化を誘発した。スラリーを短時間加熱還流した後、５℃まで冷却し、３０分間そのままにした。冷却後、スラリーを濾過し、ＡＣＮ（４×０．５Ｌ、５℃）で洗浄した。固体を５０℃に真空加熱し、溶媒を除去した。６．３ＬのＤＣＭを反応混合液に２回に分けて加え、その時点でスラリーを濃縮し、ＡＣＮを蒸留除去した。次に、固体を８０℃に真空加熱してＤＣＭを除去し、自由流動性粉末を得た。次に、固体を真空オーブンに入れ、減圧下で８０℃で乾燥させ、３１０ｇ（０．３５ｍｏｌ、２６％）の粘液酸ジ（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｂｏｃ）（４）をＡＣＮとの１：１モル溶媒和物として得た。
機械的に撹拌した１５Ｌの反応器に、１．２７ｋｇのＢｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸４－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（４．３９ｍｏｌ）、０．６２ｋｇのオキシマ（シアノヒドロキシイミノ酢酸エチル）（４．３９ｍｏｌ）及び３．５ＬのＤＣＭを添加した。反応混合液を５℃に冷却し、３０分間撹拌した。反応混合液に、固体として０．８４ｋｇのＥＤＣ．ＨＣｌ（４．４０ｍｏｌ）を１０分かけて加えた。ＥＤＣ．ＨＣｌを追加の０．５ＬのＤＣＭで反応液にすすぎ入れ、反応液を約３０分間撹拌させ、その後１０℃に冷却した。別の１２Ｌフラスコに、１．０２ｋｇの炭酸ナトリウム（９．６１ｍｏｌ）及び５．０Ｌの水を入れた。成分を溶解させた後、室温まで冷却した。１０分かけて、５０４ｇ（１．３７ｍｏｌ）の３を炭酸ナトリウム溶液に添加した。この混合液を１５分間撹拌させ、その時点で１５Ｌ反応フラスコ中のＢｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸４－ｔｅｒｔ－ブチルエステルに約３分かけて添加した。混合反応は発熱したが、冷却ジャケットを１０℃で３０分、その後１５℃でさらに４５分に設定した。その後、反応ジャケットを３３℃に設定し、１時間後、水８．０６Ｌを加え、５分間撹拌した。その後、撹拌を中止し、１５分後に反応相を分離した。ＤＣＭ（下層）を除去し、反応器に１．０ＬのＤＣＭを追加した。この混合液を１０分間撹拌し、その後沈殿させた。ＤＣＭ層を回収し、最初に回収した有機層と合わせ、総容量が約３Ｌになるように濃縮した。１Ｌの水を有機混合液に加え、ＤＣＭのさらなる蒸留除去を促した。次に、有機反応混合液を、４０℃に加熱した１１．１Ｌの水を含む１５Ｌの反応器に加えた。撹拌混合液を２０℃に戻し、スラリーを形成した。水を除去し、反応器内に固体を残した。湿った固体に１０．１Ｌの水を加えた。反応混合液を３７℃に加熱し、撹拌を促進した。その後、反応液を一晩３℃に冷却し、撹拌した。固体を濾過し、次いで追加の１０Ｌの水と共に反応器に再び戻した。このスラリーを室温で３時間撹拌した。固体を再び濾過し、１．０Ｌの水で洗浄し、乾燥させて、８１５ｇの材料を得ることができた。７９０ｇのクルード４を２．４ＬのＡＣＮと共に５Ｌ丸底フラスコに加え、６０℃に加熱した。部分真空下での共沸蒸留及びＡＣＮの継続的添加により水を約１．６Ｌの容量まで連続的に留去した。これに３．１ＬのＡＣＮを添加して結晶化を誘発した。スラリーを短時間加熱還流した後、５℃まで冷却し、３０分間そのままにした。冷却後、スラリーを濾過し、ＡＣＮ（４×０．５Ｌ、５℃）で洗浄した。固体を５０℃に真空加熱し、溶媒を除去した。６．３ＬのＤＣＭを反応混合液に２回に分けて加え、その時点でスラリーを濃縮し、ＡＣＮを蒸留除去した。次に、固体を８０℃に真空加熱してＤＣＭを除去し、自由流動性粉末を得た。次に、固体を真空オーブンに入れ、減圧下で８０℃で乾燥させ、３１０ｇ（０．３５ｍｏｌ、２６％）の粘液酸ジ（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｂｏｃ）（４）をＡＣＮとの１：１モル溶媒和物として得た。
【化83】
【0256】
（実施例２７．粘液酸モノマー中性種（化合物２０）の分取スケール合成）
機械的撹拌装置を備えた５Ｌジャケット付き丸底フラスコに、３００ｇの４（０．３４ｍｏｌ）、１．２ＬのＤＣＭ、０．１１Ｌの水（６．１３ｍｏｌ）及び０．２７９Ｌのトリイソプロピルシラン（１．３６ｍｏｌ）を入れた。反応混合液を５℃に冷却し、その後スラリーを形成した。あらかじめ氷浴で１時間かけて冷却した１．２ＬのＴＦＡを、この撹拌したスラリーに添加した。この反応を内部温度４℃で一晩保持した。さらに０．３０ＬのＴＦＡを加え、４℃で一晩撹拌を継続した。０．９０Ｌのヘキサンを加えた時点で、反応液を５℃で１０分間撹拌した。次に、反応混合液を分液漏斗に注ぎ、下相を５Ｌ丸底漏斗に分離した。反応材料を追加のＤＣＭ（３００ｍＬ）で洗浄し、これを最初に集めた画分と合わせた。合わせた回収画分をロータリーエバポレーターで３０℃未満で濃縮した。追加の０．９０ＬのＤＣＭをフラスコに加え、その後ロータリーエバポレーターを使用して２５℃で除去した。次に０．６０Ｌのトルエンを加え、ロータリーエバポレーターで濃縮し、水とＴＦＡを共沸除去し、油状物を得た。この油状物をセライトのプラグに通して濾過し、ＤＣＭ（０．４０Ｌ）で４回洗浄した。ＤＣＭをロータリーエバポレーターで３５℃で除去した。得られた二相混合液を清潔な５Ｌ反応容器に加え、２３℃に加熱した。３．０Ｌのシクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）を２０分かけて加えると、油状固体が形成された。容器を２２℃に冷却し、一晩撹拌して、粘着性のある結晶を得た。短経路蒸留カラムを使用し、３５℃で１．５ＬのＤＣＭを蒸留除去した。得られたスラリーを濾過し、ＣＰＭＥ（２×０．４５Ｌ）で洗浄した。次に固体を丸底フラスコ内でロータリーエバポレーターで乾燥し、室温で一晩真空乾燥し、２６１ｇの粘液酸モノマー中性種（２０８．８ｇ、力価を考慮して８２％の収率）を得た。
機械的撹拌装置を備えた５Ｌジャケット付き丸底フラスコに、３００ｇの４（０．３４ｍｏｌ）、１．２ＬのＤＣＭ、０．１１Ｌの水（６．１３ｍｏｌ）及び０．２７９Ｌのトリイソプロピルシラン（１．３６ｍｏｌ）を入れた。反応混合液を５℃に冷却し、その後スラリーを形成した。あらかじめ氷浴で１時間かけて冷却した１．２ＬのＴＦＡを、この撹拌したスラリーに添加した。この反応を内部温度４℃で一晩保持した。さらに０．３０ＬのＴＦＡを加え、４℃で一晩撹拌を継続した。０．９０Ｌのヘキサンを加えた時点で、反応液を５℃で１０分間撹拌した。次に、反応混合液を分液漏斗に注ぎ、下相を５Ｌ丸底漏斗に分離した。反応材料を追加のＤＣＭ（３００ｍＬ）で洗浄し、これを最初に集めた画分と合わせた。合わせた回収画分をロータリーエバポレーターで３０℃未満で濃縮した。追加の０．９０ＬのＤＣＭをフラスコに加え、その後ロータリーエバポレーターを使用して２５℃で除去した。次に０．６０Ｌのトルエンを加え、ロータリーエバポレーターで濃縮し、水とＴＦＡを共沸除去し、油状物を得た。この油状物をセライトのプラグに通して濾過し、ＤＣＭ（０．４０Ｌ）で４回洗浄した。ＤＣＭをロータリーエバポレーターで３５℃で除去した。得られた二相混合液を清潔な５Ｌ反応容器に加え、２３℃に加熱した。３．０Ｌのシクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）を２０分かけて加えると、油状固体が形成された。容器を２２℃に冷却し、一晩撹拌して、粘着性のある結晶を得た。短経路蒸留カラムを使用し、３５℃で１．５ＬのＤＣＭを蒸留除去した。得られたスラリーを濾過し、ＣＰＭＥ（２×０．４５Ｌ）で洗浄した。次に固体を丸底フラスコ内でロータリーエバポレーターで乾燥し、室温で一晩真空乾燥し、２６１ｇの粘液酸モノマー中性種（２０８．８ｇ、力価を考慮して８２％の収率）を得た。
【0257】
さらに再結晶するために、粘液酸モノマー中性種０．２４ｋｇを水（０．２０Ｌ）と共に１Ｌの三角フラスコに加えた。この混合液を室温で１時間撹拌し、溶液を得た。この溶液を、追加の水（５０ｍＬ）を用いてフィルター漏斗に通して濾過し、５Ｌ丸底フラスコに移した。２．２Ｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を撹拌しながら、３０分かけて該フラスコに加えた。混合液を合計６０分間撹拌し、その時点でロータリーエバポレーターで３５℃で濃縮し、１Ｌの留出液を除去した。１０分以上かけて追加のＴＨＦ（０．９８Ｌ）を添加した。スラリーを室温まで冷却し、２０分間撹拌した。冷却したスラリーを濾過し、ＴＨＦ（２×０．２５Ｌ）で洗浄し、続いて真空オーブンで室温で２．５日間乾燥し、１１９ｇ（０．２３ｍｏｌ、６６％収率）の中性形態の粘液酸モノマー（２０）を得た。
【化84】
【0258】
（実施例２８．ＭＡＭ（化合物５）の分取スケール合成）
１２０ｇ（０．２３ｍｏｌ）の２０及びＤＣＭ（１．２Ｌ）を入れた３Ｌ丸底フラスコを１０分間撹拌し、その時点で水（０．０６Ｌ）を添加した。撹拌を１５分間続け、その時点でＴＦＡ（６６．０ｍＬ、０．８６ｍｏｌ）を５分かけて加えた。固体を溶解させ、混合液を室温で１時間撹拌した。この混合液をロータリーエバポレーターで３０℃で濃縮した。機械的撹拌を備えた５Ｌ丸底フラスコに、エーテル（４．０Ｌ）及びＭＡＭ種結晶（５、１２ｇ）を添加した。２０／ＴＦＡ／水溶液を撹拌しながらエーテルにゆっくりと加えた。１時間後、エーテルをデカントして除去し、新たに追加のエーテルを追加した（３．６Ｌ）。ＭＡＭ－ジＴＦＡ塩が析出するまで混合液を室温で撹拌した。固体を濾過し、エーテル（０．２Ｌ）で１回洗浄した。固体を室温で真空乾燥させ、３０℃で１時間加熱して、１２２ｇ（７５％収率）のＭＡＭ（５）を得た。
１２０ｇ（０．２３ｍｏｌ）の２０及びＤＣＭ（１．２Ｌ）を入れた３Ｌ丸底フラスコを１０分間撹拌し、その時点で水（０．０６Ｌ）を添加した。撹拌を１５分間続け、その時点でＴＦＡ（６６．０ｍＬ、０．８６ｍｏｌ）を５分かけて加えた。固体を溶解させ、混合液を室温で１時間撹拌した。この混合液をロータリーエバポレーターで３０℃で濃縮した。機械的撹拌を備えた５Ｌ丸底フラスコに、エーテル（４．０Ｌ）及びＭＡＭ種結晶（５、１２ｇ）を添加した。２０／ＴＦＡ／水溶液を撹拌しながらエーテルにゆっくりと加えた。１時間後、エーテルをデカントして除去し、新たに追加のエーテルを追加した（３．６Ｌ）。ＭＡＭ－ジＴＦＡ塩が析出するまで混合液を室温で撹拌した。固体を濾過し、エーテル（０．２Ｌ）で１回洗浄した。固体を室温で真空乾燥させ、３０℃で１時間加熱して、１２２ｇ（７５％収率）のＭＡＭ（５）を得た。
【化85】
【0259】
（実施例２９．粘液酸ポリマー（化合物６）の分取スケール合成）
ＭＡＰ（６）を、粘液酸モノマー（ＭＡＭ）（５）とジＳＰＡ－ＰＥＧ３．５ｋとの逐次重合によって合成した。
ＭＡＰ（６）を、粘液酸モノマー（ＭＡＭ）（５）とジＳＰＡ－ＰＥＧ３．５ｋとの逐次重合によって合成した。
【0260】
約１．５当量のＴＦＡを含む１０８．５２ｍｇ（０．１５８ｍｍｏｌ）のＭＡＭ（５）、５７９．５４ｍｇのジＳＰＡ－ＰＥＧ３．５ｋ（０．１５７ｍｍｏｌ）及び磁気撹拌子が入った２０ｍＬガラスバイアルを密閉し、２つの固体を室温で１時間、真空乾燥させた。反応フラスコに、アルゴン下で３．４３ｍＬの無水ＤＭＳＯを加えた。反応物は室温で可溶化した。可溶化後、反応混合液にアルゴン下で１２６μＬの無水ＤＩＰＥＡ（０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で絶えず磁気撹拌しながら３時間撹拌した。
【0261】
反応混合液を冷イソプロピルアルコール（ＩＰＡ、×１０容量、０～４℃）中で沈殿させた。反応器をＤＭＳＯ（３×１ｍＬ）で洗浄し、次いで冷ＩＰＡ中で沈殿させた。得られた白色懸濁液を０～４℃で３０分間撹拌し、４℃で１２分間遠心分離した。底に沈殿した白い綿毛状のポリマーをＩＰＡをデカントすることによって単離した。このポリマーを冷ＩＰＡ（×５容量）で２回洗浄し、この手順を繰り返した。生成物を室温でシュレンクラインで一晩真空乾燥させてＩＰＡを除去し、次いでミリＱ水（８ｍＬ）に溶解した。水中の溶液を凍結し、凍結乾燥して、６１２．５ｍｇ（定量的収率）のＭＡＰ（６）を得た。
【0262】
ポリマーの分子量を、２つのモノマー間に化学量論的歪みを組み込むことによって制御した。１：１では、ＭＡＰ（６）の分子量が最大となり、モル比が１：１から離れると分子量は減少した。ＧＰＣによって得られた例示的な化学量論的歪み及び実験的分子量を表１に示す。
【表1】
【0263】
（実施例３０．２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（化合物２１）の合成）
２００．４ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）のＣＰＴ、３０２．７ｍｇ（１．７３ｍｍｏｌ）のＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ及び１４０．６ｍｇ（１．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを、磁気撹拌子及びゴム製セプタムを備えた１０ｍＬ丸底フラスコに添加した。容器及びその内容物をアルゴンで１０分間パージし、その時点で無水ＤＣＭ（１ｍＬ）を加えて材料をスラリー状にした。２８０μＬ（１．８１ｍｍｏｌ）のＤＩＣを、シリンジで約３分かけて反応混合液に滴下した。この反応液を室温で３時間撹拌し、その時点で溶媒の約５０％を真空除去した。濃縮したスラリーに４ｍＬの冷ＭｅＯＨを加えた。この反応液を数分間撹拌してさらなる沈殿を促進し、その後ブフナー漏斗に濾過した。固体をさらに冷ＭｅＯＨで洗浄し、次に冷ＭＴＢＥで洗浄した。単離した固体を高真空乾燥させ、１１０．８ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ、３８％）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（２１）を得た。
２００．４ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）のＣＰＴ、３０２．７ｍｇ（１．７３ｍｍｏｌ）のＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ及び１４０．６ｍｇ（１．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを、磁気撹拌子及びゴム製セプタムを備えた１０ｍＬ丸底フラスコに添加した。容器及びその内容物をアルゴンで１０分間パージし、その時点で無水ＤＣＭ（１ｍＬ）を加えて材料をスラリー状にした。２８０μＬ（１．８１ｍｍｏｌ）のＤＩＣを、シリンジで約３分かけて反応混合液に滴下した。この反応液を室温で３時間撹拌し、その時点で溶媒の約５０％を真空除去した。濃縮したスラリーに４ｍＬの冷ＭｅＯＨを加えた。この反応液を数分間撹拌してさらなる沈殿を促進し、その後ブフナー漏斗に濾過した。固体をさらに冷ＭｅＯＨで洗浄し、次に冷ＭＴＢＥで洗浄した。単離した固体を高真空乾燥させ、１１０．８ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ、３８％）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（２１）を得た。
【0264】
上記の手順において、Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを他のＢｏｃ保護アミノ酸及びジペプチドに置き換えることができる。Ｂｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｂｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ及びＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨを置き換えることにより、同様の手順で２０－（Ｂｏｃ－Ａｌａ）－ＣＰＴ（化合物４１）、２０－（Ｂｏｃ－β－Ａｌａ）－ＣＰＴ（化合物４２）、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－ＣＰＴ（化合物４０）、２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－ＣＰＴ（化合物４３）及び２０－（Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（化合物４４）がそれぞれ得られた。
【化86】
【0265】
（実施例３１．２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（化合物２２）の合成）
磁気撹拌子及び通気針を備えたシンチレーションバイアルに、９７．１ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（２１）を添加した。ＤＣＭ（０．２ｍＬ）の添加により撹拌懸濁液を生成した。撹拌しながら、ＴＦＡ（０．２ｍＬ）を徐々に添加した。反応混合液を２時間撹拌した。２時間後、生成物をＭＴＢＥで沈殿させ、濾過し、洗浄した。単離したサンプルを高真空乾燥させ、８２．５ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ、８３％収率）の２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（２２）を得た。
磁気撹拌子及び通気針を備えたシンチレーションバイアルに、９７．１ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（２１）を添加した。ＤＣＭ（０．２ｍＬ）の添加により撹拌懸濁液を生成した。撹拌しながら、ＴＦＡ（０．２ｍＬ）を徐々に添加した。反応混合液を２時間撹拌した。２時間後、生成物をＭＴＢＥで沈殿させ、濾過し、洗浄した。単離したサンプルを高真空乾燥させ、８２．５ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ、８３％収率）の２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（２２）を得た。
【化87】
【0266】
上記の方法で、２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴを２０－（Ｂｏｃ－Ａｌａ）－ＣＰＴ、２０－（Ｂｏｃ－β－Ａｌａ）－ＣＰＴ、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－ＣＰＴ、２０－（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ）－ＣＰＴ及び２０－（Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴに置き換えると、２０－（ＴＦＡ．Ａｌａ）－ＣＰＴ（化合物４５）、２０－（ＴＦＡ．β－Ａｌａ）－ＣＰＴ（化合物４６）、２０－（ＴＦＡ．Ｖａｌ）－ＣＰＴ（化合物４７）、２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＣＰＴ（化合物４８）及び２０－（ＴＦＡ．Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（化合物４９）がそれぞれ得られる。
【0267】
（実施例３２．ＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＣＰＴ（化合物２３）の合成）
１４９．２ｍｇ（ＣＯ２Ｈベースで０．０７ｍｍｏｌ）のＭＡＰ（６）及び２１．５ｍｇの２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（２２）（０．０４ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌子を入れた２０ｍＬシンチレーションバイアルに添加した。容器のヘッドスペースをアルゴン雰囲気で約３０分間通気した後、アルゴン下で密閉した。無水ＤＭＳＯ（約９ｍＬ、総反応容量の約８５％）を加えた後、バイアル内容物を撹拌しながら溶解させた。１６６．３ｍｇの（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ、０．３２ｍｍｏｌ、４．４当量）及び磁気撹拌子を入れた８ｍＬシンチレーションバイアルをアルゴン雰囲気下でパージした。この容器の内容物を、撹拌しながら無水ＤＭＳＯ（約３．２ｍＬ）に溶解させた。両容器の固体がすべて溶解したら、１．６ｍＬのＰｙＡＯＰ溶液（８３．２ｍｇのＰｙＡＯＰ、０．１６ｍｍｏｌのＰｙＡＯＰ、総反応容量の約１５％）をポリマー含有容器に移し替えた。この反応液を約２分間撹拌し、その時点で約４５μＬ（０．２６ｍｍｏｌ）の無水ＤＩＰＥＡ（標的３１．３μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器を暗所で、室温で約１８時間撹拌した。１８時間後、反応容器をアルゴン雰囲気から取り出し、反応内容物の約１／３を５０ｍＬガラス遠心分離管に移した。冷酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）をゆっくりと加えて反応物を沈殿させた（０～４℃）。この懸濁液を０～４℃で約３０分間撹拌し、その後遠心分離した。ＥｔＯＡｃ層をデカントして除去し、反応媒体の次の１／３を同じ容器に添加した。この手順を、すべての反応媒体が同じ管に沈殿するまで繰り返した。沈殿した固体をボルテックスで撹拌しながら、冷ＥｔＯＡｃ（×５容量）で合計３回洗浄し、固体を再懸濁させた。最後の洗浄サイクルの後、最後のＥｔＯＡｃをデカントして除去し、固体を液体窒素を使用して遠心分離管内で凍結した。凍結した遠心分離管を約３時間、高真空にさらして固体を乾燥させ、１１５．２ｍｇ（定量収率）のＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＣＰＴ（２３）を得た。
１４９．２ｍｇ（ＣＯ２Ｈベースで０．０７ｍｍｏｌ）のＭＡＰ（６）及び２１．５ｍｇの２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴ（２２）（０．０４ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌子を入れた２０ｍＬシンチレーションバイアルに添加した。容器のヘッドスペースをアルゴン雰囲気で約３０分間通気した後、アルゴン下で密閉した。無水ＤＭＳＯ（約９ｍＬ、総反応容量の約８５％）を加えた後、バイアル内容物を撹拌しながら溶解させた。１６６．３ｍｇの（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ、０．３２ｍｍｏｌ、４．４当量）及び磁気撹拌子を入れた８ｍＬシンチレーションバイアルをアルゴン雰囲気下でパージした。この容器の内容物を、撹拌しながら無水ＤＭＳＯ（約３．２ｍＬ）に溶解させた。両容器の固体がすべて溶解したら、１．６ｍＬのＰｙＡＯＰ溶液（８３．２ｍｇのＰｙＡＯＰ、０．１６ｍｍｏｌのＰｙＡＯＰ、総反応容量の約１５％）をポリマー含有容器に移し替えた。この反応液を約２分間撹拌し、その時点で約４５μＬ（０．２６ｍｍｏｌ）の無水ＤＩＰＥＡ（標的３１．３μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器を暗所で、室温で約１８時間撹拌した。１８時間後、反応容器をアルゴン雰囲気から取り出し、反応内容物の約１／３を５０ｍＬガラス遠心分離管に移した。冷酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）をゆっくりと加えて反応物を沈殿させた（０～４℃）。この懸濁液を０～４℃で約３０分間撹拌し、その後遠心分離した。ＥｔＯＡｃ層をデカントして除去し、反応媒体の次の１／３を同じ容器に添加した。この手順を、すべての反応媒体が同じ管に沈殿するまで繰り返した。沈殿した固体をボルテックスで撹拌しながら、冷ＥｔＯＡｃ（×５容量）で合計３回洗浄し、固体を再懸濁させた。最後の洗浄サイクルの後、最後のＥｔＯＡｃをデカントして除去し、固体を液体窒素を使用して遠心分離管内で凍結した。凍結した遠心分離管を約３時間、高真空にさらして固体を乾燥させ、１１５．２ｍｇ（定量収率）のＭＡＰ－Ｇｌｙ－ＣＰＴ（２３）を得た。
【化88】
【0268】
また、同じ方法により、２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＣＰＴの代わりに、２０－（ＴＦＡ．Ａｌａ）－ＣＰＴ、２０－（ＴＦＡ．β－Ａｌａ）－ＣＰＴ、２０－（ＴＦＡ．Ｖａｌ）－ＣＰＴ、２０－（ＴＦＡ．ＧＡＢＡ）－ＣＰＴ又は２０－（ＴＦＡ．Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）－ＣＰＴを出発物質として使用してＭＡＰ－ＣＰＴコンジュゲートを生成し、ＭＡＰ－Ａｌａ－ＣＰＴ（化合物５０）、ＭＡＰ－β－Ａｌａ－ＣＰＴ（化合物５１）、ＭＡＰ－Ｖａｌ－ＣＰＴ（化合物５２）、ＭＡＰ－ＧＡＢＡ－ＣＰＴ（化合物５３）及びＭＡＰ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－ＣＰＴ（化合物５４）が生成される。
【化89-1】
【化89-2】
【化89-3】
【0269】
実施例５で述べたように、化合物６、２３及び５０～５４について、ｘは約８０であり、ｙは約１６であった。
【0270】
（実施例３３．１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（化合物２４）の合成）
アルゴン雰囲気下で、反応容器に２．０ｇ（５．１０ｍｍｏｌ）のＳＮ３８を入れた。２０４ｍＬの無水ＤＣＭを反応容器に加え、続いて１２．２ｍＬ（１５１ｍｍｏｌ）の無水ピリジン及び１．５ｍＬ（６．５３ｍｍｏｌ）の二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチルを加えた。反応液を室温で約１６時間撹拌し、その時点で反応液をセライト５４５（濾過助剤）で濾過し、０．５ＮのＨＣｌ及び飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮した。反応混合液をＤＣＭに希釈し、その後ヘキサン中に沈殿させた。固体を濾過し、真空乾燥させて、２．２ｇ（４．４７ｍｍｏｌ、８８％収率）の１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（２４）を得た。
アルゴン雰囲気下で、反応容器に２．０ｇ（５．１０ｍｍｏｌ）のＳＮ３８を入れた。２０４ｍＬの無水ＤＣＭを反応容器に加え、続いて１２．２ｍＬ（１５１ｍｍｏｌ）の無水ピリジン及び１．５ｍＬ（６．５３ｍｍｏｌ）の二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチルを加えた。反応液を室温で約１６時間撹拌し、その時点で反応液をセライト５４５（濾過助剤）で濾過し、０．５ＮのＨＣｌ及び飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮した。反応混合液をＤＣＭに希釈し、その後ヘキサン中に沈殿させた。固体を濾過し、真空乾燥させて、２．２ｇ（４．４７ｍｍｏｌ、８８％収率）の１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（２４）を得た。
【化90】
【0271】
（実施例３４．２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（化合物２５）の合成）
アルゴン雰囲気下、０℃に冷却した反応容器に、５０２ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）の１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（２４）を入れ、８．８ｍＬのＤＣＭを加えた。この反応容器に、３．８ｍＬのＤＣＭ、４４７ｍｇ（２．５５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、４８９ｍｇ（２．５５ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び１２５ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを含む冷却溶液を加えた。反応液を０℃で３時間撹拌した。反応液を０．５％重炭酸ナトリウム水溶液、水、０．１ＮのＨＣｌ及びブラインで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空蒸発させて、６３９ｍｇ（０．９８ｍｍｏｌ、９７％収率）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（２５）を得た。
アルゴン雰囲気下、０℃に冷却した反応容器に、５０２ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）の１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（２４）を入れ、８．８ｍＬのＤＣＭを加えた。この反応容器に、３．８ｍＬのＤＣＭ、４４７ｍｇ（２．５５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、４８９ｍｇ（２．５５ｍｍｏｌ）のＥＤＣ．ＨＣｌ及び１２５ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを含む冷却溶液を加えた。反応液を０℃で３時間撹拌した。反応液を０．５％重炭酸ナトリウム水溶液、水、０．１ＮのＨＣｌ及びブラインで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空蒸発させて、６３９ｍｇ（０．９８ｍｍｏｌ、９７％収率）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（２５）を得た。
【0272】
上記の手順において、Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを他のＢｏｃ保護アミノ酸に置き換えることができる。Ｂｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｂｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＢｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨを出発材料として置き換えることにより、同様の手順で２０－（Ｂｏｃ－Ａｌａ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（化合物２９）、２０－（Ｂｏｃ－β－Ａｌａ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（化合物３０）、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（化合物３１）及び２０－（Ｂｏｃ－Ｌｅｕ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（化合物３５）がそれぞれ得られた。
【化91】
【0273】
（実施例３５．２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８（化合物２６）の合成）
２５０ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（２５）及び１．８８ｍＬのＤＣＭを入れた反応容器に、０．４７ｍＬ（６．１４ｍｍｏｌ）のＴＦＡを加えた。反応液を室温で２．５時間撹拌した。反応混合液を冷（４℃）ＭＴＢＥ中に沈殿させ、遠心分離により単離し、ＭＴＢＥで再度洗浄し、真空乾燥させて１３３ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ、６１％収率）の２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８（２６）を得た。
２５０ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）の２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８（２５）及び１．８８ｍＬのＤＣＭを入れた反応容器に、０．４７ｍＬ（６．１４ｍｍｏｌ）のＴＦＡを加えた。反応液を室温で２．５時間撹拌した。反応混合液を冷（４℃）ＭＴＢＥ中に沈殿させ、遠心分離により単離し、ＭＴＢＥで再度洗浄し、真空乾燥させて１３３ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ、６１％収率）の２０－（ＴＦＡ．Ｇｌｙ）－ＳＮ３８（２６）を得た。
【化92】
【0274】
２０－（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８を、出発材料として、２０－（Ｂｏｃ－Ａｌａ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８、２０－（Ｂｏｃ－β－Ａｌａ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８、２０－（Ｂｏｃ－Ｖａｌ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８及び２０－（Ｂｏｃ－Ｌｅｕ）－１０－ＯＢｏｃ－ＳＮ３８に置き換えて、２０－（ＴＦＡ．Ａｌａ）－ＳＮ３８（化合物３２）、２０－（ＴＦＡ．β－Ａｌａ）－ＳＮ３８（化合物３３）、２０－（ＴＦＡ．Ｖａｌ）－ＳＮ３８（化合物３４）及び２０－（ＴＦＡ．Ｌｅｕ）－ＳＮ３８（化合物３６）をそれぞれ得た。
【0275】
前述のアミノ酸結合ＳＮ３８誘導体のＴＦＡ塩を使用して、実施例１７及び１８に記載されているようにＭＡＰ－ＳＮ３８コンジュゲートを形成することができる。
【0276】
（実施例３６．ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（化合物２７）の合成）
２０ｇ（４ｍｍｏｌ）のＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－酢酸（ＡＡ）塩酸塩、ＤＩＰＥＡ（２．１ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を入れた２５０ｍＬ丸底フラスコに、無水ＤＣＭ（４０ｍＬ）を入れ、アルゴンでフラッシュした。この溶液を氷／水浴で冷却した。磁気撹拌子を入れた２０ｍＬバイアルに、９３４ｍｇ（５．５ｍｍｏｌ）の３－カルボキシ－５－ニトロフェニルボロン酸（ＮＰＢＡ）を無水ＤＣＭ／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（８ｍＬ、４：１ｖ／ｖ）に溶解させた。１０３８ｍｇ（５．２５ｍｍｏｌ）のＮ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を、ＮＰＢＡの溶液に添加した。活性化された酸を１５分間撹拌し、次にＤＣＭ中のＰＥＧ－アミンの予め冷却した溶液に滴加した。反応混合液を０℃で２０分間撹拌した。脱イオン水（１００ｍＬ）を反応混合液に加え、激しく撹拌し、室温に温めた。この段階で、反応混合液のｐＨは９であった。その後、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｇ）を加えてｐＨを７にした。１ＭのＨＣｌ（１２ｍＬ）を加えて反応混合液のｐＨをさらに４に下げた。反応混合液を分液漏斗に移し、酢酸イソプロピル（ｉＰｒＯＡｃ、１００ｍＬ）を加えた。混合液をよく振盪し、沈殿させ、分離相を得た。有機相を廃棄し、ｉＰｒＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出を繰り返した。水相を２５０ｍＬ丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレーターで室温、２０トルで３０分濃縮した。水溶液を凍結乾燥し、粉末を得た。凍結乾燥粉末をＤＭＳＯ／水（４０ｍＬ、３：１ｖ／ｖ）に溶解させた。この溶液を、９５％移動相Ａ（水＋０．０５％ＴＦＡ）及び５％移動相Ｂ（ＡＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ）の１２～１５ｍＬ注入により予め平衡化したＣ１８Ａｑ Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯカラム（４７５ｇ）で、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製した。５％Ｂ～４０％Ｂへのグラジエントを実行してからカラムを洗浄し、その後の注入を行った。残りの生成物溶液について精製を繰り返した。生成物を含有する画分をＨＰＬＣで分析した。純度が９９．５％を超える画分を合わせ、凍結乾燥し、１４．２ｇ（２．７１ｍｍｏｌ、６８％収率）のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（２７）を得た。
２０ｇ（４ｍｍｏｌ）のＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－酢酸（ＡＡ）塩酸塩、ＤＩＰＥＡ（２．１ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を入れた２５０ｍＬ丸底フラスコに、無水ＤＣＭ（４０ｍＬ）を入れ、アルゴンでフラッシュした。この溶液を氷／水浴で冷却した。磁気撹拌子を入れた２０ｍＬバイアルに、９３４ｍｇ（５．５ｍｍｏｌ）の３－カルボキシ－５－ニトロフェニルボロン酸（ＮＰＢＡ）を無水ＤＣＭ／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（８ｍＬ、４：１ｖ／ｖ）に溶解させた。１０３８ｍｇ（５．２５ｍｍｏｌ）のＮ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を、ＮＰＢＡの溶液に添加した。活性化された酸を１５分間撹拌し、次にＤＣＭ中のＰＥＧ－アミンの予め冷却した溶液に滴加した。反応混合液を０℃で２０分間撹拌した。脱イオン水（１００ｍＬ）を反応混合液に加え、激しく撹拌し、室温に温めた。この段階で、反応混合液のｐＨは９であった。その後、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｇ）を加えてｐＨを７にした。１ＭのＨＣｌ（１２ｍＬ）を加えて反応混合液のｐＨをさらに４に下げた。反応混合液を分液漏斗に移し、酢酸イソプロピル（ｉＰｒＯＡｃ、１００ｍＬ）を加えた。混合液をよく振盪し、沈殿させ、分離相を得た。有機相を廃棄し、ｉＰｒＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出を繰り返した。水相を２５０ｍＬ丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレーターで室温、２０トルで３０分濃縮した。水溶液を凍結乾燥し、粉末を得た。凍結乾燥粉末をＤＭＳＯ／水（４０ｍＬ、３：１ｖ／ｖ）に溶解させた。この溶液を、９５％移動相Ａ（水＋０．０５％ＴＦＡ）及び５％移動相Ｂ（ＡＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ）の１２～１５ｍＬ注入により予め平衡化したＣ１８Ａｑ Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯカラム（４７５ｇ）で、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製した。５％Ｂ～４０％Ｂへのグラジエントを実行してからカラムを洗浄し、その後の注入を行った。残りの生成物溶液について精製を繰り返した。生成物を含有する画分をＨＰＬＣで分析した。純度が９９．５％を超える画分を合わせ、凍結乾燥し、１４．２ｇ（２．７１ｍｍｏｌ、６８％収率）のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（２７）を得た。
【化93】
【0277】
この方法で合成した化合物２７では、ｎは約１１４であった。これらの値は、異なる出発材料（例えば、ＮＨ２－ＰＥＧ３．５ｋ－ＡＡ）を使用すると、変化する（例えば、３．５ｋＤａのＰＥＧでは、ｎは約８０である）。
【0278】
（実施例３７．ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ－ＰＦＰ（化合物２８）の合成）
８ｍＬの反応容器に、３０１．８ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（２７）を磁気撹拌子と共に加えた。反応容器は、真空及びアルゴンサイクルで３連でパージした。固体を無水ＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解し、その後３５μＬの無水Ｎ－メチルモルホリン（０．３５ｍｍｏｌ）をシリンジで加えた。反応容器を短時間開栓し、４５．３ｍｇの炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）（０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応ヘッドスペースをアルゴンでパージし、反応液を室温で約２時間撹拌した。撹拌した容量のＭＴＢＥ（２５ｍＬ）に反応溶液を滴下し、沈殿を促進させた。この混合液をアルゴン雰囲気下で３０分間撹拌した後、２６００ｇで遠心分離した。液層をデカントし、その時点でヘプタン（２０ｍＬ）を遠心分離管に加えた。サンプルを機械的に撹拌してから、２６００ｇで２回目の遠心分離を行った（８分間）。液体を容器からデカントし、残りの湿潤固体を残した。容器を液体窒素で短時間冷却し、次にシュレンクラインを使用してポンプで溶媒を除去し、３００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ、９６％収率）のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ－ＰＦＰ（２８）を得た。
８ｍＬの反応容器に、３０１．８ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（２７）を磁気撹拌子と共に加えた。反応容器は、真空及びアルゴンサイクルで３連でパージした。固体を無水ＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解し、その後３５μＬの無水Ｎ－メチルモルホリン（０．３５ｍｍｏｌ）をシリンジで加えた。反応容器を短時間開栓し、４５．３ｍｇの炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）（０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応ヘッドスペースをアルゴンでパージし、反応液を室温で約２時間撹拌した。撹拌した容量のＭＴＢＥ（２５ｍＬ）に反応溶液を滴下し、沈殿を促進させた。この混合液をアルゴン雰囲気下で３０分間撹拌した後、２６００ｇで遠心分離した。液層をデカントし、その時点でヘプタン（２０ｍＬ）を遠心分離管に加えた。サンプルを機械的に撹拌してから、２６００ｇで２回目の遠心分離を行った（８分間）。液体を容器からデカントし、残りの湿潤固体を残した。容器を液体窒素で短時間冷却し、次にシュレンクラインを使用してポンプで溶媒を除去し、３００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ、９６％収率）のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ－ＰＦＰ（２８）を得た。
【化94】
【0279】
実施例３６に記載したように、化合物２７及び２８では、ｎは約１１４であった。
【0280】
（実施例３８．ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆクルード混合液の合成）
反応容器に３５ｇ（０．４４０ｍｍｏｌ）のホロトランスフェリン（Ｔｆ）を入れ、１．７５Ｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）をゆっくりと加え、Ｔｆを２０ｇ／Ｌの濃度で溶解させた。可溶化後、４４ｍＬのＤＭＳＯ中４．７７ｇ（０．８８１ｍｍｏｌ）のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ－ＰＦＰ（２８）を反応混合液にゆっくりと加え、よく混合した。反応混合液を室温で２時間インキュベートした。クルード反応混合液を、逆相（ＲＰ）カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－ＣＮ ４．６ｍｍ ＩＤｘ１５０ｃｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステムで、移動相Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ）及び移動相Ｂ（ＡＣＮ／ＩＰＡ（４：１ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡ）にて、流速０．７ｍＬ／分で分析した。カラムは、波長２８０ｎｍ、参照波長３６０ｎｍに設定した吸光光度検出器に接続した。さらに、クルード反応混合液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム（ＴＳＫゲルブチル－ＮＰＲ ４．６ｍｍ ＩＤｘ３．５ｃｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステムで、移動相Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）及び移動相Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０／ＩＰＡ（４：１ｖ／ｖ））にて、流速０．８ｍＬ／分で分析した。カラムは、２８０ｎｍの波長シグナル及び参照３６０ｎｍに設定した吸光検出器に接続した。２時間インキュベートした後、クルード反応混合液をＨＩＣ精製する準備ができた。
反応容器に３５ｇ（０．４４０ｍｍｏｌ）のホロトランスフェリン（Ｔｆ）を入れ、１．７５Ｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）をゆっくりと加え、Ｔｆを２０ｇ／Ｌの濃度で溶解させた。可溶化後、４４ｍＬのＤＭＳＯ中４．７７ｇ（０．８８１ｍｍｏｌ）のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ－ＰＦＰ（２８）を反応混合液にゆっくりと加え、よく混合した。反応混合液を室温で２時間インキュベートした。クルード反応混合液を、逆相（ＲＰ）カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－ＣＮ ４．６ｍｍ ＩＤｘ１５０ｃｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステムで、移動相Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ）及び移動相Ｂ（ＡＣＮ／ＩＰＡ（４：１ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡ）にて、流速０．７ｍＬ／分で分析した。カラムは、波長２８０ｎｍ、参照波長３６０ｎｍに設定した吸光光度検出器に接続した。さらに、クルード反応混合液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム（ＴＳＫゲルブチル－ＮＰＲ ４．６ｍｍ ＩＤｘ３．５ｃｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステムで、移動相Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）及び移動相Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０／ＩＰＡ（４：１ｖ／ｖ））にて、流速０．８ｍＬ／分で分析した。カラムは、２８０ｎｍの波長シグナル及び参照３６０ｎｍに設定した吸光検出器に接続した。２時間インキュベートした後、クルード反応混合液をＨＩＣ精製する準備ができた。
【0281】
（実施例３９．モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆの単離）
ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆクルード混合液（２０ｇ／Ｌ）１．７５Ｌを反応容器に添加した。７Ｌの移動相Ａ（１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）をクルード混合液に加え、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、１６ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４の濃度にした。混合後、サンプル混合液を、ＧＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＨＩＣ樹脂を充填したＡｘｉｏＣｈｒｏｍ １４０カラム（１．７Ｌ）に、ポンプ流速２００ｍＬ／分でロードした。サンプル混合液をＨＩＣカラムにロードするために、約１０分の滞留時間を設けた。ＩＰＡ／１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（１：４ｖ／ｖ、移動相Ｂ）を溶離液として使用した。溶出工程の前に、２０％の移動相Ｂで２カラム容量（ＣＶ）分を洗浄し、未結合種を除去した。精製したＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆを、２０～１００％の移動相Ｂのグラジエントで１５ＣＶかけて溶出させた。モノＰＥＧ化Ｔｆ（モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆ）の画分を集め、限外濾過及び透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）用に合わせた。Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ膜をモノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆのＵＦ／ＤＦに使用した。モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆコンジュゲートは、７容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた透析濾過により５０ｇ／Ｌまで濃縮した。その後、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆを０．２２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で無菌濾過した。
ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆクルード混合液（２０ｇ／Ｌ）１．７５Ｌを反応容器に添加した。７Ｌの移動相Ａ（１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）をクルード混合液に加え、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、１６ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４の濃度にした。混合後、サンプル混合液を、ＧＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＨＩＣ樹脂を充填したＡｘｉｏＣｈｒｏｍ １４０カラム（１．７Ｌ）に、ポンプ流速２００ｍＬ／分でロードした。サンプル混合液をＨＩＣカラムにロードするために、約１０分の滞留時間を設けた。ＩＰＡ／１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（１：４ｖ／ｖ、移動相Ｂ）を溶離液として使用した。溶出工程の前に、２０％の移動相Ｂで２カラム容量（ＣＶ）分を洗浄し、未結合種を除去した。精製したＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆを、２０～１００％の移動相Ｂのグラジエントで１５ＣＶかけて溶出させた。モノＰＥＧ化Ｔｆ（モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆ）の画分を集め、限外濾過及び透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）用に合わせた。Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ膜をモノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆのＵＦ／ＤＦに使用した。モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆコンジュゲートは、７容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた透析濾過により５０ｇ／Ｌまで濃縮した。その後、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆを０．２２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で無菌濾過した。
【0282】
（実施例４０．ＴｆあたりのＮＰＢＡの数の決定）
モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ５ｋ－ＴｆのＴｆあたりのＮＰＢＡの数は、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆのＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋのモル濃度とＴｆのモル濃度の比をＮＰＢＡのアリザリンレッドＳ（ＡＲＳ）検出アッセイを用いて算出することにより求めた。標準曲線を作成するために、ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（２７）のサンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解した様々な濃度（０～０．００９８ｍＭ）で調製した。ＡＲＳは０．０４９ｍＭで水に溶解して調製した。次に、サンプルをＡＲＳと混合し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＳｋａｎＩｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又は同様の蛍光解析ソフトウェアを用いて蛍光を測定した（励起波長：４６８ｎｍ、蛍光波長：５７２ｎｍ）。これらのデータ（蛍光対濃度）の線形回帰により、目的のサンプル中のＮＰＢＡを決定するための検量線を得た。
モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ５ｋ－ＴｆのＴｆあたりのＮＰＢＡの数は、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆのＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋのモル濃度とＴｆのモル濃度の比をＮＰＢＡのアリザリンレッドＳ（ＡＲＳ）検出アッセイを用いて算出することにより求めた。標準曲線を作成するために、ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（２７）のサンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解した様々な濃度（０～０．００９８ｍＭ）で調製した。ＡＲＳは０．０４９ｍＭで水に溶解して調製した。次に、サンプルをＡＲＳと混合し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＳｋａｎＩｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又は同様の蛍光解析ソフトウェアを用いて蛍光を測定した（励起波長：４６８ｎｍ、蛍光波長：５７２ｎｍ）。これらのデータ（蛍光対濃度）の線形回帰により、目的のサンプル中のＮＰＢＡを決定するための検量線を得た。
【0283】
目的のサンプル（例えば、Ｔｆ及びモノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆ）は、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に０．００７ｍＭで溶解して調製した。モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆのＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋのモル濃度は、モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｆサンプルの平均蛍光値と、様々な既知濃度のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ標準（０～０．００９８ｍＭ）の蛍光値の検量線から以下の式を使用して算出した。
蛍光＝ε＊ＣＮ＋ｂ
（式中、ε＝検量線の線形回帰の傾き、ｂ＝検量線の線形回帰の切片、ＣＮ＝ＮＢＰＡ－ＰＥＧの濃度（ｍＭ）である。したがって、ＣＮ（ｍＭ）＝（蛍光－ｂ）／εである。）
蛍光＝ε＊ＣＮ＋ｂ
（式中、ε＝検量線の線形回帰の傾き、ｂ＝検量線の線形回帰の切片、ＣＮ＝ＮＢＰＡ－ＰＥＧの濃度（ｍＭ）である。したがって、ＣＮ（ｍＭ）＝（蛍光－ｂ）／εである。）
【0284】
次に、以下の式に従って、ＣＮを既知のＴｆ濃度で割り、ＴｆあたりのＮＰＢＡの数（ＮＴｆ）を算出した。
ＮＴｆ＝（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ ｍｍｏｌ／Ｌ）／（Ｔｆ ｍｍｏｌ／Ｌ）
ＮＴｆ＝（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ ｍｍｏｌ／Ｌ）／（Ｔｆ ｍｍｏｌ／Ｌ）
【0285】
ＮＰＢＡのＡＲＳ検出アッセイを用いたモノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆのＮＰＢＡの決定数は、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆのＴｆあたり約１ＮＰＢＡであった。ＡＲＳとの反応、ひいては蛍光シグナルは、反応に利用可能なＮＰＢＡ官能基を必要とする。一部の分子（例えばクエン酸塩）はＮＰＢＡと複合体を形成し、蛍光シグナルを減少させ、モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆあたりのＮＰＢＡの測定数を変化させる。他の場合では、過剰な未反応のＮＰＢＡ－ＰＥＧコンジュゲートがクルードサンプル中に存在し、蛍光シグナルが増加し、モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｆあたりのＮＰＢＡの決定数が変化することがある。例示的な実験結果を表２に示す。
【表2】
【0286】
（実施例４１．ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓクルード混合液の合成）
５．５ｇ（０．０３８ｍｍｏｌ）のトラスツズマブを５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）で緩衝液交換し、最終タンパク質濃度を１０ｇ／Ｌに調整した。可溶化後、ＤＭＳＯ中３．７８ｍＬ中のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ－ＰＦＰ（２８）４０９．０７ｍｇ（０．０７６ｍｍｏｌ）を反応混合液にゆっくりと加え、よく混合した。反応混合液を室温で２時間インキュベートした。クルード反応混合液を、逆相（ＲＰ）カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－ＣＮ ４．６ｍｍ ＩＤｘ１５０ｃｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステムで、移動相Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ）及び移動相Ｂ（ＡＣＮ／ＩＰＡ（４：１ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡ）にて、流速０．７ｍＬ／分で分析した。カラムは、２８０ｎｍのシグナル及び参照３６０ｎｍに設定した吸光検出器に接続した。２時間インキュベートした後、クルード反応混合液をＨＩＣ精製する準備ができた。
５．５ｇ（０．０３８ｍｍｏｌ）のトラスツズマブを５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）で緩衝液交換し、最終タンパク質濃度を１０ｇ／Ｌに調整した。可溶化後、ＤＭＳＯ中３．７８ｍＬ中のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ－ＰＦＰ（２８）４０９．０７ｍｇ（０．０７６ｍｍｏｌ）を反応混合液にゆっくりと加え、よく混合した。反応混合液を室温で２時間インキュベートした。クルード反応混合液を、逆相（ＲＰ）カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－ＣＮ ４．６ｍｍ ＩＤｘ１５０ｃｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステムで、移動相Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ）及び移動相Ｂ（ＡＣＮ／ＩＰＡ（４：１ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡ）にて、流速０．７ｍＬ／分で分析した。カラムは、２８０ｎｍのシグナル及び参照３６０ｎｍに設定した吸光検出器に接続した。２時間インキュベートした後、クルード反応混合液をＨＩＣ精製する準備ができた。
【0287】
（実施例４２．モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓの単離）
０．５５ＬのＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓクルード混合液（１０ｇ／Ｌ）を反応容器に添加した。１．１Ｌの移動相Ａ（１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）をクルード混合液に加え、１Ｍ硫酸アンモニウム、１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４の濃度にした。混合後、サンプル混合液を、ＧＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＨＩＣ樹脂を充填したＡｘｉｏＣｈｒｏｍ １４０カラム（１．７Ｌ）に、流速２００ｍＬ／分でロードした。サンプル混合液をＨＩＣカラムにロードするために、約１０分の滞留時間を設けた。ＩＰＡ／１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（１：４ｖ／ｖ、移動相Ｂ）を溶離液として使用した。溶出工程の前に、４０％の移動相Ｂで２ＣＶ分を洗浄し、未結合種を除去した。精製したＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓを、４０～１００％の移動相Ｂのグラジエントで１５ＣＶかけて溶出させた。モノＰＥＧ化Ｔｒａｓ（モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓ）の画分を集め、ＵＦ／ＤＦ用に合わせた。Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ膜をモノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｒａｓのＵＦ／ＤＦに使用した。モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓコンジュゲートは、７容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた透析濾過により５０ｇ／Ｌまで濃縮した。透析濾過後、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓを０．２２μｍＰＥＳ膜で無菌濾過した。
０．５５ＬのＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓクルード混合液（１０ｇ／Ｌ）を反応容器に添加した。１．１Ｌの移動相Ａ（１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）をクルード混合液に加え、１Ｍ硫酸アンモニウム、１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４の濃度にした。混合後、サンプル混合液を、ＧＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＨＩＣ樹脂を充填したＡｘｉｏＣｈｒｏｍ １４０カラム（１．７Ｌ）に、流速２００ｍＬ／分でロードした。サンプル混合液をＨＩＣカラムにロードするために、約１０分の滞留時間を設けた。ＩＰＡ／１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（１：４ｖ／ｖ、移動相Ｂ）を溶離液として使用した。溶出工程の前に、４０％の移動相Ｂで２ＣＶ分を洗浄し、未結合種を除去した。精製したＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓを、４０～１００％の移動相Ｂのグラジエントで１５ＣＶかけて溶出させた。モノＰＥＧ化Ｔｒａｓ（モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓ）の画分を集め、ＵＦ／ＤＦ用に合わせた。Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ膜をモノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｒａｓのＵＦ／ＤＦに使用した。モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓコンジュゲートは、７容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた透析濾過により５０ｇ／Ｌまで濃縮した。透析濾過後、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓを０．２２μｍＰＥＳ膜で無菌濾過した。
【0288】
（実施例４３．ＴｒａｓあたりのＮＰＢＡの数の決定）
モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ５ｋ－ＴｒａｓのＴｒａｓあたりのＮＰＢＡの数は、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｒａｓのＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋのモル濃度とＴｒａｓのモル濃度の比をＮＰＢＡのＡＲＳ検出アッセイを用いて算出することにより求めた。標準曲線を作成するために、ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（２７）のサンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解した様々な濃度（０～０．００９８ｍＭ）で調製した。ＡＲＳは０．０４９ｍＭで水に溶解して調製した。次に、サンプルとＡＲＳを混合し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とＳｋａｎＩｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又は同様の蛍光解析ソフトウェアを用いて蛍光を測定した（励起波長：４６８ｎｍ、蛍光波長：５７２ｎｍ）。これらのデータ（蛍光対濃度）の線形回帰により、目的のサンプル中のＮＰＢＡを決定するための検量線を得た。
モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ５ｋ－ＴｒａｓのＴｒａｓあたりのＮＰＢＡの数は、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｒａｓのＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋのモル濃度とＴｒａｓのモル濃度の比をＮＰＢＡのＡＲＳ検出アッセイを用いて算出することにより求めた。標準曲線を作成するために、ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ（２７）のサンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解した様々な濃度（０～０．００９８ｍＭ）で調製した。ＡＲＳは０．０４９ｍＭで水に溶解して調製した。次に、サンプルとＡＲＳを混合し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とＳｋａｎＩｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又は同様の蛍光解析ソフトウェアを用いて蛍光を測定した（励起波長：４６８ｎｍ、蛍光波長：５７２ｎｍ）。これらのデータ（蛍光対濃度）の線形回帰により、目的のサンプル中のＮＰＢＡを決定するための検量線を得た。
【0289】
目的のサンプル（例えば、Ｔｒａｓ及びモノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓ）は、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に０．００７ｍＭで溶解して調製した。モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｒａｓのＮＰＢＡ－ＰＥＧのモル濃度は、モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－Ｔｒａｓサンプルの平均蛍光値と、様々な既知濃度のＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＡＡ標準（０～０．００９８ｍＭ）の蛍光値の検量線から以下の式を使用して算出した。
蛍光＝ε＊ＣＮ＋ｂ
（式中、ε＝検量線の線形回帰の傾き、ｂ＝検量線の線形回帰の切片、ＣＮ＝ＮＢＰＡ－ＰＥＧの濃度（ｍＭ）である。したがって、ＣＮ（ｍＭ）＝（蛍光－ｂ）／εである。）
蛍光＝ε＊ＣＮ＋ｂ
（式中、ε＝検量線の線形回帰の傾き、ｂ＝検量線の線形回帰の切片、ＣＮ＝ＮＢＰＡ－ＰＥＧの濃度（ｍＭ）である。したがって、ＣＮ（ｍＭ）＝（蛍光－ｂ）／εである。）
【0290】
次に、以下の式に従って、ＣＮを既知のＴｒａｓ濃度で割り、ＴｒａｓあたりのＮＰＢＡの数（ＮＴｒａｓ）を算出した。
ＮＴｒａｓ＝（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ ｍｍｏｌ／Ｌ）／（Ｔｒａｓ ｍｍｏｌ／Ｌ）
ＮＴｒａｓ＝（ＮＰＢＡ－ＰＥＧ ｍｍｏｌ／Ｌ）／（Ｔｒａｓ ｍｍｏｌ／Ｌ）
【0291】
ＮＰＢＡのＡＲＳ検出アッセイを用いたモノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｒａｓのＮＰＢＡの決定数は、モノＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｒａｓのＴｒａｓあたり約１ＮＰＢＡであった。実施例４０に記載したように、モノ－ＮＰＢＡ－ＰＥＧ５ｋ－ＴｒａｓあたりのＮＰＢＡの数は、蛍光シグナルを減少させるＮＰＢＡとの分子の望ましくない複合化、又は蛍光シグナルを増加させるクルードサンプル中の過剰な未反応ＮＰＢＡ－ＰＥＧコンジュゲートの存在によって変化する可能性がある。例示的な実験結果を表３に示す。
【表3】
【0292】
当業者であれば理解するように、これらの教示に照らして、本開示の多数の修正及び変形が可能であり、そのすべてが本明細書において企図されている。例えば、本明細書に記載の実施形態に加えて、本開示は、本明細書に引用された開示の特徴と、本開示の特徴を補完する引用された従来技術文献の特徴との組み合わせから生じる発明を企図し、クレームするものである。同様に、任意の記載の材料、特徴又は物品が、任意の他の材料、特徴又は物品と組み合わせて使用され得ること、及びそのような組み合わせが本開示の範囲内にあると見なされることが理解されよう。
【0293】
本書で引用し、又は記載した各特許、特許出願及び刊行物の開示は、あらゆる目的のために、又は少なくともそれが引用された文脈に関連する内容について、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。既に言及した文献に加えて、本開示は、２００９年８月１２日に出願された米国特許出願第１２／５４０，３１９号、現米国特許第８，５５７，２９２号、２０１３年３月１日に出願された米国特許出願第１３／７８２，４５８号、２０１３年３月１日に出願された米国特許出願第１３／７８２，４８６号、２０１３年３月２８日に出願された米国特許出願第１３／８５２，３０３号、２０１６年６月１３日に出願された米国特許出願第１５／１８０，２０１号、現米国特許第１０，２８７，４０１号及び２００９年８月１２日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３６２０に関連する主題を含有し、これらの内容は、あらゆる目的のために、参照により組み込まれる。