特許 7667747 アルギン酸塩を使用した対象の処置のための組合せ及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-04-15

(45)【発行日】2025-04-23

(54)【発明の名称】アルギン酸塩を使用した対象の処置のための組合せ及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/20 20060101AFI20250416BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20250416BHJP

   A61K 31/734 20060101ALI20250416BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20250416BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20250416BHJP

   A61L 27/52 20060101ALI20250416BHJP

【ＦＩ】

A61L27/20

A61P19/04

A61K31/734

A61K47/20

A61K9/08

A61L27/52

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021571198

(86)(22)【出願日】2021-01-13

(86)【国際出願番号】 JP2021000754

(87)【国際公開番号】W WO2021145325

(87)【国際公開日】2021-07-22

【審査請求日】2023-11-15

(31)【優先権主張番号】P 2020003614

(32)【優先日】2020-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２６年度 国立研究開発法人科学技術振興機構、産学共同実用化開発事業「（Ｊ１３－１３）硬化性ゲルを用いた関節軟骨損傷の治療」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000181147

【氏名又は名称】持田製薬株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】デロイトトーマツ弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼井 伴和

(72)【発明者】

【氏名】水野 均

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼橋 彬

(72)【発明者】

【氏名】遠藤 俊弥

(72)【発明者】

【氏名】阪上 真一

(72)【発明者】

【氏名】岩崎 倫政

(72)【発明者】

【氏名】小野寺 智洋

(72)【発明者】

【氏名】岩崎 浩司

【審査官】星 浩臣

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１６３６０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特許第４７４０３６９（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】特表２０１７－５３７１３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－２４６７１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１４１５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／０８４３０６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｌ

Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルギン酸１価金属塩を含有する第１材組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２材組成物とを含み、前記第１材組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、前記第２材組成物を、前記対象に施与した該第１材組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いるための、該組成物の組合せ物であって、前記第１材組成物が、更に着色成分として０．０００５質量％～０．０５質量％の青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）を含有することにより、前記対象に施与した該第１材組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにしたこと、及び前記第１材組成物が、保存時に、溶液状態であることを特徴とする、該組合せ物。

【請求項2】

前記ゲル膜の形成状態の評価が、前記対象に施与した該第１材組成物のうちの流動性がある状態の組成物の流出の有無の評価である、請求項１記載の組合せ物。

【請求項3】

前記ゲル膜の形成状態の評価が、（１）前記対象に施与した該第１材組成物のゲル膜表面の洗浄後、及び／又は、（２）前記対象に施与した該第１材組成物のゲル膜表面への加圧後に行われる、請求項１又は２記載の組合せ物。

【請求項4】

前記ゲル膜表面への加圧が、該ゲル膜表面に器具を接触させることにより行われる、請求項３記載の組合せ物。

【請求項5】

前記対象は、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組合せ物。

【請求項6】

前記第１材組成物の、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値が、Ｌ＊＝４０～８０、ａ＊＝－４０～０、ｂ＊＝－６０～－２０である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組合せ物。

【請求項7】

前記第１材組成物の、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間保存後と保存前とを比べたときの、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ値が３５以下である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組合せ物。

【請求項8】

前記第１材組成物が、２℃～８℃の条件下で保存可能である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組合せ物。

【請求項9】

前記第１材組成物が、更に他の１価金属塩を含有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の組合せ物。

【請求項10】

前記第１材組成物が、塩化ナトリウムを含有し、２℃～８℃の条件下で保存可能な組成物である、請求項１～９のいずれか１項に記載の組合せ物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、軟骨再生等に有用な、アルギン酸１価金属塩を使用した対象の処置技術に関する。

【背景技術】

【0002】

膝などの関節軟骨には血管や神経のネットワークが存在しないため、自己修復能がほとんどなく、そのため、軟骨欠損が放置されると、関節痛や関節機能の喪失がもたらされ、しばしば変形性関節症へと発展することがある。また、加齢や関節の酷使によって関節軟骨の表面の磨耗が始まった変形性関節症の初期段階から、病状が進行した結果として、広範な領域での軟骨欠損に至ることもある。

【0003】

軟骨損傷に対する治療法としては、自家骨軟骨柱移植術（mosaicplasty）、ピックで穿孔する方法（microfracture法）、ドリリング（drilling）、バーで軟骨下骨を削る方法（abrasion法）、損傷軟骨切除（debridement）などの外科的処置が知られている。これらのうち、microfracture法、drilling、abrasion法は、骨髄刺激法（Marrow stimulation technique）と呼ばれ、骨髄から出血を促し、骨髄由来の軟骨前駆細胞を誘導し、軟骨への分化を期待するものである。しかしながら、骨髄刺激法では、本来の硝子軟骨とは力学的特性の異なる線維軟骨が形成されてしまうという問題があった。

【0004】

一方、アルギン酸１価金属塩を溶解して流動性がある状態にした材を軟骨組織の欠損部に施与し、固定のため架橋剤を添加してゲル化して、所定期間留置することにより、硝子軟骨の形成が促され、軟骨再生用組成物等として有用であることが知られている（特許文献１）。また、椎間板組織については、椎間板髄核摘出（切除）術後の空洞にアルギン酸１価金属塩を髄核補填材として充填することで、椎間板髄核の再生が促されることが示されている（特許文献２）。更に、止血作用を有する成分と人体に適用可能な色素を含有する局所止血用組成物が開示され、止血作用を有する成分として、トロンビン、アルギン酸ナトリウム、血管収縮剤が挙げられ、色素の一つに青色１号が挙げられている。しかし、アルギン酸ナトリウムを実際に用いた具体例は開示されていない（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特許第４７４０３６９号公報

【文献】特許第６４８７１１０号公報

【文献】特開２００２－１０４９９６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者らは、アルギン酸１価金属塩の使用の際、所望する箇所に施与されたかどうかや、架橋剤によるゲル化が十分かどうか、一旦ゲル化した部分に破損が生じていないかどうかなど、確認することが難しいという側面があることを認識した。すなわち、例えば関節鏡下における施術などではことさらに、使用者としては、固定の不確実さのため、アルギン酸１価金属塩を含む材やそのゲル化のための材を過剰量に用いたり、それらの施与後には生理食塩水等を十分量用いて洗浄したりすることなどして対処しなければならなかった。しかしながらそのように適用される材は、目的の箇所以外の周辺にはできるだけ拡がらないようにすることが望まれる。また、洗浄作業の省力化も望まれる。

【0007】

本発明の目的は、上記のような課題に鑑み、アルギン酸１価金属塩を含有する流動性がある状態の材を対象に施与する際、その確実な固定を実現することにある。
また本発明の別の目的は、着色成分とアルギン酸１価金属塩を含有し、約２～８℃の低温で、一定期間（例えば１か月間等）の保存によっても着色成分の析出が生じない、すなわち、安定に保存可能な組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。

【0009】

［０］ アルギン酸１価金属塩を含有する第１剤（材）組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物とを含み、前記第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、前記第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いる、該組成物の組合せであって、前記第１剤（材）組成物が、更に着色成分を含有することにより、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにしたことを特徴とする、該組合せ。
［１］ アルギン酸１価金属塩を含有する第１剤（材）組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物とを含み、前記第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、前記第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いるための、該組成物の組合せ物であって、前記第１剤（材）組成物が、更に着色成分を含有することにより、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにしたことを特徴とする、該組合せ物。
［２］ 前記ゲル膜の形成状態の評価が、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のうちの流動性がある状態の組成物の流出の有無の評価である、上記［１］に記載の組合せ物。
［３］ 前記ゲル膜の形成状態の評価が、（１）前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のゲル膜表面の洗浄後、及び／又は、（２）前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のゲル膜表面への加圧後に行われる、上記［１］又は［２］に記載の組合せ物。
［４］ 前記ゲル膜表面への加圧が、該ゲル膜表面に器具を接触させることにより行われる、上記［３］に記載の組合せ物。
［５］ 前記対象は、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［６］ 前記第１材組成物が、前記着色成分として生体に施与可能な青色～緑色の色素を含有する、上記［１］～［５］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［７］ 前記第１材組成物の、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値が、Ｌ＊＝４０～８０、ａ＊＝－４０～０、ｂ＊＝－６０～－２０である、上記［１］～［６］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［８］ 前記着色成分が、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間の保存後に析出が生じない濃度で含有されている、上記［１］～［７］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［９］ 前記第１材組成物の、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間保存後と保存前とを比べたときの、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ値が３５以下である、上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［１０］ 前記第１材組成物が、２℃～８℃の条件下で保存可能である、上記［１］～［９］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［１１］ 前記第１材組成物が、更に他の１価金属塩を含有する、上記［１］～［１０］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［１２］ 前記第１材組成物が、保存時に、溶液状態又は乾燥状態である、上記［１］～［１１］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［１３］ 前記第１材組成物が、アルギン酸１価金属塩、生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムを含有し、２℃～８℃の条件下で保存可能な組成物であって、該組成物は保存時に溶液状態又は乾燥状態である、上記［１］～［１２］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［１４］ 前記着色成分は、０．０００５質量％～０．０５質量％の青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である、上記［１］～［１３］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［１５］ 前記着色成分は、該成分の媒体環境に応じた色調変化をもたらすものである、上記［１］～［１３］のいずれか１項に記載の組合せ物。
［１６］ 前記媒体環境はｐＨ環境である、上記［１５］に記載の組合せ物。
［１７］ 前記第１材組成物はｐＨ６以上ｐＨ８以下のゾル又は液体であり、前記第２材組成物はｐＨ４以上ｐＨ６未満、又はｐＨ８超ｐＨ１２以下の液体である、上記［１５］又は［１６］に記載の組合せ物。
［１８］ 前記着色成分は、ｐＨ感受性色素、又は溶解遅延用素材で被覆されたｐＨ感受性色素である、上記［１５］～［１７］のいずれか１項に記載の組合せ物。

【0010】

本発明では、以下の対象の処置方法を提供し、例えば、下記の構成を採用してもよい。
［２－１］ アルギン酸１価金属塩及び着色成分を含有する第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与する工程と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させる工程と、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価する工程とを含む、該対象の処置方法。
［２－２］ 前記ゲル膜の形成状態の評価が、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のうちの流動性がある状態の組成物の流出の有無の評価である、上記［２－１］に記載の方法。
［２－３］ 前記ゲル膜の形成状態の評価が、（１）前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のゲル膜表面の洗浄後、及び／又は、（２）前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のゲル膜表面への加圧後に行われる、上記［２－１］又は［２－２］に記載の方法。
［２－４］ 前記ゲル膜表面への加圧が、該ゲル膜表面に器具を接触させることにより行われる、上記［２－３］に記載の方法。
［２－５］ 前記対象は、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［２－１］～［２－４］のいずれか１項に記載の方法。
［２－６］ 前記第１材組成物が、前記着色成分として生体に施与可能な青色～緑色の色素を含有する、上記［２－１］～［２－５］のいずれか１項に記載の方法。
［２－７］ 前記第１材組成物の、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値が、Ｌ＊＝４０～８０、ａ＊＝－４０～０、ｂ＊＝－６０～－２０である、上記［２－１］～［２－６］のいずれか１項に記載の方法。
［２－８］ 前記着色成分が、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間の保存後に析出が生じない濃度で含有されている、上記［２－１］～［２－７］のいずれか１項に記載の方法。
［２－９］ 前記第１材組成物の、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間保存後と保存前とを比べたときの、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ値が３５以下である、上記［２－１］～［２－８］のいずれか１項に記載の方法。
［２－１０］ 前記第１材組成物が、２℃～８℃の条件下で保存可能である、上記［２－１］～［２－９］のいずれか１項に記載の方法。
［２－１１］ 前記第１材組成物が、更に他の１価金属塩を含有する、上記［２－１］～［２－１０］のいずれか１項に記載の方法。
［２－１２］ 前記第１材組成物が、保存時に、溶液状態又は乾燥状態である、上記［２－１］～［２－１１］のいずれか１項に記載の方法。
［２－１３］ 前記第１材組成物が、アルギン酸１価金属塩、生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムを含有し、２℃～８℃の条件下で保存可能な組成物であって、該組成物は保存時に溶液状態又は乾燥状態である、上記［２－１］～［２－１２］のいずれか１項に記載の方法。
［２－１４］ 前記着色成分は、０．０００５質量％～０．０５質量％の青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である、上記［２－１］～［２－１３］のいずれか１項に記載の方法。

【0011】

本発明では、以下の対象の処置に用いるためのアルギン酸１価金属塩を提供し、例えば、下記の構成を採用してもよい。
［３－１］ アルギン酸１価金属塩及び着色成分を含有する第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与する工程と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させる工程と、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価する工程とを含む、該対象の処置に用いるための該第１剤（材）及び第２剤（材）組成物の組合せ。

【0012】

本発明では、以下の生体適用組成物を提供し、例えば、下記の構成を採用してもよい。
［４－１］ アルギン酸１価金属塩を含有し、流動性がある状態で対象に施与されるための生体適用組成物であって、着色成分として、生体に施与可能な青色～緑色の色素を含有することを特徴とする、該生体適用組成物。
［４－２］ 前記対象は、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯からなる群から選択される少なくとも１種である、［４－１］に記載の生体適用組成物。
［４－３］ 前記生体適用組成物の、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値が、Ｌ＊＝４０～８０、ａ＊＝－４０～０、ｂ＊＝－６０～－２０である、上記［４－１］又は［４－２］に記載の生体適用組成物。
［４－４］ 前記着色成分が、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間の保存後に析出が生じない濃度で含有されている、上記［４－１］～［４－３］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－５］ 前記生体適用組成物の、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間保存後と保存前の組成物とを比べたときの、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ値が３５以下である、上記［４－１］～［４－４］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－６］ 前記生体適用組成物が、２℃～８℃の条件下で保存可能である、［４－１］～［４－５］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－７］ 前記アルギン酸１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が１万～１００万である、上記［４－１］～［４－６］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－８］ 前記アルギン酸１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、上記［４－１］～［４－７］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－９］ 前記生体適用組成物が、更に他の１価金属塩を含有する、［４－１］～［４－８］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－１０］ 前記生体適用組成物が、保存時に、溶液状態又は乾燥状態である、［４－１］～［４－９］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－１１］ 前記生体適用組成物が、アルギン酸１価金属塩、生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムを含有し、２℃～８℃の条件下で保存可能な組成物であって、該組成物は保存時に溶液状態又は乾燥状態である、［４－１］～［４－１０］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－１２］ 前記生体適用組成物は、対象に施与したときに少なくとも一部分がゲル化するようにして用いるための組成物である、［４－１］～［４－１１］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
［４－１３］ 前記着色成分は、０．０００５質量％～０．０５質量％の青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である、上記［４－１］～［４－１２］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、アルギン酸１価金属塩を溶解して流動性がある状態にした材を対象に施与する際、着色成分を含有することにより、その後にアルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤でゲル化して固定するための処理が十分かどうか、簡便に確認することができる。これにより、その確実な固定を実現することができる。
また、視認性を与える着色成分として国等の規制により生体への使用が許可されている色素、すなわち生体へ施与可能な色素を用いることにより、ヒト等に対して安全に使用することができる。
更に、約２℃～８℃の低温条件下で一定期間安定に保存可能な、着色成分及びアルギン酸１価金属塩を含有する組成物が提供されるため、安全性も高く、使い勝手がよい。
本発明の組合せ物、処置方法、及び、生体適用組成物は、上記のうちいずれか一つ以上の効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の一実施形態を表わす概略説明図であり、アルギン酸１価金属塩を含有する第１剤（材）組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物とを、対象に施与する操作を説明する概略説明図である。

【図2】試験例２において、アルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）に生体へ施与可能な色素である青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）を所定濃度で添加して、着色し、５℃に設定した冷蔵庫で保存したときの色調と外観の経時変化を調べた結果を示す図表である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、アルギン酸１価金属塩の利用に関する。具体的には、例えば、アルギン酸１価金属塩を軟骨の損傷部もしくは欠損部に施与することで、その部位における軟骨組織の再生が促されることが報告されている（特許第４７４０３６９号公報）。また、例えば、アルギン酸１価金属塩を椎間板髄核摘出（切除）術後の空洞に髄核補填材として施与することで、椎間板髄核の再生が促され、椎間板組織全体の変性も抑制されることが報告されている（特許第６４８７１１０号公報）。これらのように、アルギン酸１価金属塩は、損傷もしくは欠損した組織を再生・修復したり、保護したりする用途に有用である。本発明の組合せ物、方法又は生体適用組成物は、例えば、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯などの損傷部や欠損部に好ましく用いられる。本明細書において「損傷」とは、「欠損」「断裂」「病変」等も含む。なお、生物の範囲はヒトに限定されるものではない。ヒト以外の生物、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、トリ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなども挙げられる。

【0016】

本発明においては、アルギン酸１価金属塩の利用のため、第１剤（材）として、アルギン酸１価金属塩を含有する組成物を用いる。また、第２剤（材）として、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する組成物を用いる。そして、上記第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、上記第２剤（材）組成物を対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させる。これにより、対象に施与した上記第１剤（材）組成物を固定し、適用した位置からズレたり、漏出したりするのを防ぐことができる。

【0017】

本発明においては、上記構成に加えて、上記第１材組成物が、更に着色成分を含有する。そして、その着色成分を指標にして観察することにより、対象に施与した上記第１材組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにしている。ここで「ゲル膜」とは、架橋剤を含有する第２材組成物を、第１材組成物に接触させて、第１材組成物の表面に形成されたゲルである。「評価することができる」とは、上記第１材組成物の表面のゲル膜の形成状態を目視により確認できることを包含する意味であり、更に、直接の目視による場合だけでなく、顕微鏡や内視鏡（特に関節適用の場合は関節鏡）を介した確認をすることができることを包含する意味である。

【0018】

上記ゲル膜の形成状態の評価は、対象に施与した上記第１材組成物のうちの流動性がある状態の組成物が流出してくるかどうかを、上記第１材組成物に含有された着色成分を指標にして、観察することにより行うことができる。例えば、限定されないいくつかの典型的な態様においては、生理食塩水等によってゲル膜表面を洗浄した後に、対象に施与した上記第１材組成物のうちの流動性がある状態の組成物が流出してくるかどうかを観察することにより評価を行うことができる。あるいは、例えば、上記ゲル膜表面に、ゾンデ（消息子）、鉗子、鑷子、シリンジ等の注入器の先端部等の器具を接触させることにより加圧した後に、対象に施与した上記第１材組成物のうちの流動性がある状態の組成物が流出してくるかどうかを観察してもよい。

【0019】

本発明に用いられる着色成分としては、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯などへ第１材組成物を施与したときに、ゲル膜の形成状態を評価しやすいものであることが好ましい。例えば、中間色系（例えば緑色）、寒色系（例えば青色）等の色調を呈する色素であれば、施術等において、視野に周辺組織、血液（赤・黄色系統の色調）、軟骨（白色系統の色調）、影（黒色系統の色調）などが含まれる環境下においても、それらからより判別しやすくなるので好ましい。このような色素としては、例えば、緑色３号（ファストグリーンＦＣＦ）、銅クロロフィル、銅クロロフィルナトリウム、スルホブロモフタレインナトリウム、インドシアニングリーン、フルオロレインナトリウム、メチレンブルー、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）、青色２号（インジゴカルミン）、トルイジンブルー、ピオクタニンブルー、リン酸マンガンアンモニウムなどが挙げられる。
また、いくつかの態様では、本発明に用いる着色成分は、国等の規制により生体への使用が許可されている色素、すなわち生体に施与可能な色素が好ましく、これについては後述する。
また、別の態様では、本発明に用いる着色成分は、本明細書の記載に準じて第１材組成物又は生体適用組成物を調製したときに、約２～８℃の低温条件下で、一定期間安定に保存可能な着色成分であることが好ましい。

【0020】

本発明の限定されないいくつかの態様においては、上記着色成分は、媒体環境に応じた色調変化をもたらすものであってもよい。これによれば、対象に施与した上記第１材組成物が流出してくる場合には、その着色成分は媒体環境の変化に曝されることになり、それにともなって色調も変化するので、流出しているかどうかをより確実に把握し易くなる。また、上記ゲル膜の形成は、架橋剤を含有する第２材組成物が、対象に施与した第１材組成物の表面付近を拡散するにつれ、第１材組成物との接触により起こる。よって、着色成分が色調変化を起こす状況を把握することにより、その色調変化は対象に施与した上記第１材組成物の表面付近のゲル化の状況を反映しており、ひいてはこれにより、ゲル膜の形成状態が更に把握し易くなる。

【0021】

上記したような態様に使用するための、媒体環境に応じた色調変化をもたらす着色成分としては、ｐＨ環境に応じた色調変化をもたらすｐＨ感受性色素が好ましい。一般に、ｐＨ感受性色素には酸性側に変色域を有する色素と、塩基性側に変色域を有する色素があるので、所望に応じて、適宜に適切な変色域を有する色素を用いることができる。表１，２には、代表的なｐＨ感受性色素を示す。

【0022】

【表1】

【0023】

【表2】

【0024】

例えば、限定されないいくつかの典型的な態様においては、第２材組成物のｐＨがｐＨ４以上ｐＨ６未満の場合は、第１材組成物のｐＨをｐＨ６以上ｐＨ８以下としたうえメチルレッド等のジアゾ系色素を用いることにより、上記したようなゲル膜の視認化の効果を奏し得る。また、ブロモクレゾールグリーン等のサルトン系の色素を用いてもよい。上記第２材組成物のｐＨがｐＨ８超ｐＨ１２以下の場合は、上記第１材組成物のｐＨをｐＨ６以上ｐＨ８以下としたうえフェノールフタレイン等のラクトン系色素を用いることにより、上記したようなゲル膜の視認化の効果を奏し得る。また、アントシアニジン等のアントシアニン系の色素を用いてもよい。

【0025】

着色成分の含有量としては、必要に応じて適宜に適切な含有量を設定することができるが、典型的に例示するとすれば、第１材組成物全体の０．０００５ｗ／ｖ％～１．０ｗ／ｖ％であることが好ましく、より好ましくは０．００１ｗ／ｖ％～１．０ｗ／ｖ％であり、更に好ましくは０．０１ｗ／ｖ％～１．０ｗ／ｖ％である。また、別の態様では、着色成分の含有量は、第１材組成物全体の０．０００５ｗ／ｗ％～１．０ｗ／ｗ％であってよく、好ましくは、０．０００５ｗ／ｗ％～０．１ｗ／ｗ％である。なお、本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。

【0026】

上記ｐＨ感受性色素は、溶解遅延用素材で被覆してもよい。これによれば、一定時間経過後にその素材が溶解するまで、着色成分による色調変化が起こらないので、上記第１材組成物に上記第２材組成物が接触してから、一定の時間が経過したことに関する情報を、あわせて可視化することができる。そのような態様に使用し得る溶解遅延用素材でとしては、ＣＭＥＣ（カルボキシメチルエチルセルロース）、メタクリル酸コポリマーＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、又はこれらを適切な比率で混合することによって溶解するｐＨ域をｐＨ８～１２の範囲内で適切に調節したものなどが挙げられる。また、色素を被覆する方法としては、溶解遅延用素材を用いてマイクロカプセル化する方法、溶解遅延用素材と練合した後に粉砕や押出し造粒によって顆粒化する方法、スプレードライ法による微粒子を形成する方法等、このような周知の方法で調製することができる。

【0027】

図１には、本発明の一実施形態として、上記２剤（材）を軟骨欠損部に適用する場合を例として、その操作を更に詳細に説明する。

【0028】

まず、アルギン酸１価金属塩を含有する第１剤（材）組成物１を、流動性があるゾル又は液体の状態の組成物に調製して、図示しないシリンジ等の注入器で軟骨欠損部２に充填する（図１ａ）。軟骨欠損部２には、例えば、骨髄から出血を促し、骨髄由来の軟骨前駆細胞を誘導し、軟骨への分化を期待する骨髄刺激法（Marrow stimulation technique）の施術がなされてもよい。骨髄刺激法では、具体的には、ピック、パワードリル等を用いて、直径１．５ｍｍ程度で軟骨下骨に達する１又は複数個の穴が形成されてもよい。また、軟骨損傷部に骨髄由来の軟骨前駆細胞が残存している場合には、同様に直径１．５ｍｍ程度であって、軟骨下骨まで達しない１又は複数個の穴を形成してもよい。

【0029】

次に、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物３をシリンジ等の注入器から、軟骨欠損部２に充填した第１剤（材）組成物１の表面に滴下する（図１ｂ）。第２剤（材）組成物３に含まれる架橋剤が、第２剤（材）組成物３の拡散とともに、第１剤（材）組成物１の表面付近全体に拡散し（図１中、「１ａ」の符号で指し示す部分）、アルギン酸１価金属塩に対する架橋作用が発揮されて、それにより軟骨欠損部２の開口部に蓋がされるように軟骨欠損部２に充填した第１剤（材）組成物１の表面にゲル膜が形成する（図１ｃ）。このようにして、軟骨欠損部２への充填の際には流動性がある状態であった第１剤（材）組成物１が、軟骨欠損部２に固定され、その適用位置がズレたり、軟骨欠損部２から漏出したりすることが防がれる。なお、第１剤（材）組成物１の表面付近以外の内部（図１中、「１ｂ」の符号で指し示す部分）については、必ずしもゲル化していなくてもよい。むしろゲル化していないほうが、組織の基となる前駆細胞の移動や組織化に有利に働く場合がある。

【0030】

本発明において、アルギン酸１価金属塩を含有する上記第１材組成物を対象に施与したり、その後、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する上記第２材組成物を作用させたりする方式としては、特に制限はないが、例えば生体に対する典型的な術式としては、患部を切開により直視下においてする施術などが挙げられる。また、経皮的術式（約５ｍｍの切開）でもよい。あるいは、より侵襲性の低い術式の選択としては、顕微鏡下（約３～４ｃｍの切開）もしくは内視鏡（特に関節適用の場合は関節鏡）下（約１～２ｃｍの切開）に施術してもよい。本発明によれば、上記第１材組成物の適用時の視認性が向上しているので、顕微鏡下や内視鏡（特に関節適用の場合は関節鏡）下での施術のように、視野が限られる術式を採用した場合に特にメリットが大きい。例えば、関節鏡視下の狭い関節空間において、第１材組成物１を軟骨欠損部２に周辺組織と同じ高さになるまで注入する際、組成物が透明だと適切に充填できているかが分からず施術が難しい。組成物を着色することにより、充填の様子が見えるため適切に充填できる。

【0031】

本発明の限定されないいくつかの態様においては、上記第１材組成物の上記第２材組成物に対する作用性を、予めインビトロ試験により評価しておくこともできる。すなわち、実際の使用時と同様の使用比率を用いて、例えば、直径６ｍｍの試験管に上記第１材組成物５００μＬを入れ、及び、所定の使用比率に架橋剤を調製した上記第２材組成物をその上から充填して１時間静置後に、試験管内の組成物の表面部分がゲル化している一方、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割はゲル化しておらず、ゲル化していない部分は、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割が２１Ｇの注射針をつけたシリンジで吸引できることなどで、予め評価されてもよい。

【0032】

以下、本発明を更に詳細に説明する。

【0033】

１．アルギン酸１価金属塩
アルギン酸は、生分解性の高分子多糖類であって、Ｄ‐マンヌロン酸（Ｍ）とＬ‐グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ‐マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ‐グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、及びＤ‐マンヌロン酸とＬ‐グルロン酸がランダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸のＤ‐マンヌロン酸とＬ‐グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．４の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。

【0034】

アルギン酸は天然由来のものでもよく、合成物であってもよいが、例えば、褐藻類等に由来する天然由来のものを用いてもよい。アルギン酸を含有する褐藻類は世界中の沿岸域に繁茂しているが、実際上、原料として使用できる褐藻類は限られており、南米のレッソニア、北米のマクロシスティス、欧州のラミナリアやアスコフィラム、豪のダービリアなどが代表的なものである。例えば、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）属、マクロシスティス（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、ラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）属（コンブ属）、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌｅａ）属、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ）属、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）属などが挙げられる。

【0035】

本発明においては、アルギン酸１価金属塩を用いる。これによれば、アルギン酸１価金属塩は、溶解性や溶解安定性が良好であり、水等の溶媒に溶解させて流動性がある状態で生体組織等の対象に施与することに適した形態である。アルギン酸１価金属塩は、上記した褐藻類を用いて、酸法、カルシウム法等の公知の方法又はそれに準じる方法により調製することができる。具体的には、例えば、褐藻類から炭酸ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液を用いて抽出し、酸（例えば、塩酸、硫酸など）で中和した後、イオン交換処理することなどにより得ることができる。アルギン酸１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特には、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが好ましい。

【0036】

本発明に用いるアルギン酸１価金属塩のような高分子多糖類は、通常、その分子量を正確に定めることは困難であるが、分子量が低すぎると水等に溶解したときの見掛け粘度が低くなり、適用した生体組織等の対象への密着性が弱くなる虞があり、また、分子量が高すぎるものは調製が困難であるとともに、溶解性が低下する、水等に溶解したときに見掛け粘度が高すぎて取扱いが悪くなる、長期間の保存で物性を維持しにくい等の問題を生じるため、一般的に重量平均分子量で１万～１０００万、好ましくは２万～８００万、より好ましくは５万～５００万の範囲である。

【0037】

本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の分子量は、常法に従い測定することができる。一例として、例えば、分子量測定にゲル浸透クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件においては、カラムとして、例えば、ＧＭＰＷ‐ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ‐ＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ）を用いることができ、溶離液として、例えば、２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液を用いることができ、分子量標準として、例えば、プルランを用いることができる。また、他の一例として、分子量測定にＧＰＣ‐ＭＡＬＳを用いる場合の代表的な条件においては、検出器として、例えば、ＲＩ検出器と光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用いることができる。

【0038】

一般に、天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。よって、本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の分子量について、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定した重量平均分子量は、好ましくは１０万以上、より好ましくは５０万以上であり、また好ましくは、５００万以下、より好ましくは３００万以下である。その好ましい範囲は、１０万～５００万であり、より好ましくは５０万～３５０万である。

【0039】

また、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と多角度光散乱検出器（Multi Angle Light Scattering：ＭＡＬＳ）とを組み合わせたＧＰＣ‐ＭＡＬＳ法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の分子量について、このようなＧＰＣ‐ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量（絶対分子量）は、好ましくは１万以上、より好ましくは８万以上、更に好ましくは９万以上であり、また好ましくは、１００万以下、より好ましくは８０万以下、更に好ましくは７０万以下、とりわけ好ましくは５０万以下である。その好ましい範囲は、１万～１００万であり、より好ましくは８万～８０万であり、より更に好ましくは９万～７０万、とりわけ好ましくは９万～５０万である。

【0040】

なお、通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０～２０％以上の測定誤差を生じうる。例えば、４０万であれば３２～４８万、５０万であれば４０～６０万、１００万であれば８０～１２０万程度の範囲で値の変動が生じうる。

【0041】

アルギン酸１価金属塩は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、見掛け粘度が高い傾向にあり、熱による乾燥、精製などの過程を経ることで、分子量が小さくなり、見掛け粘度が低くなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸１価金属塩を製造することができる。更に、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸１価金属塩と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸１価金属塩とすることも可能である。

【0042】

よって、本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の品質は、上記した分子量とともに、粘度の特性によっても検定することができる。この点、例えば、ミリＱ水に溶解して１ｗ／ｗ％濃度の溶液とし、コーンプレート型粘度計を用いて２０℃の条件で粘度測定を行ったときの粘度が、４０ｍＰａ・ｓ～８００ｍＰａ・ｓであることが好ましく、５０ｍＰａ・ｓ～６００ｍＰａ・ｓであることがより好ましい。

【0043】

本発明に用いるアルギン酸１価金属塩は、低エンドトキシン処理されていることが好ましい。これによれば、発熱等を惹起することなく、生体組織等の対象に適用する場合により安全に施与することができる。エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エントスペシー（登録商標）ＥＳ‐２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。

【0044】

低エンドトキシン処理は、天然物由来高分子素材について知られた公知の方法又はそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する菅らの方法（例えば、特開平９‐３２４００１号公報など参照）、β－１，３‐グルカンを精製する吉田らの方法（例えば、特開平８‐２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の高分子塩を精製するウィリアムらの方法（例えば、特表２００２‐５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製するジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）又はルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製するハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９４）４０：６３８‐６４３など参照）等又はこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂又は活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５‐０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸１価金属塩の種類などに合わせて適宜選択するのが望ましい。

【0045】

低エンドトキシン処理の方法は、特に限定されないが、その結果としてエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、１００ＥＵ／ｇ以下であることがより好ましく、５０ＥＵ／ｇ以下であることが更により好ましく、３０ＥＵ／ｇ以下であることが特に好ましい。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭＵＰ ＬＶＧ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。

【0046】

２．架橋剤
本発明においては、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を用いる。具体的には、例えば、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｂａ²⁺、Ｓｒ²⁺などの２価以上の金属イオン化合物などが挙げられる。より具体的には、２価以上の金属イオン化合物として、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂、ＣａＳＯ₄、ＢａＣｌ₂等を挙げることができるが、入手しやすいこと、ゲルの強度等の理由から、特に、ＣａＣｌ₂溶液が好ましい。

【0047】

３．第１剤（材）組成物
本発明における第１剤（材）組成物は、上記したアルギン酸１価金属塩及び本明細書に記載の着色成分を含有するものであればよく、特にその製剤的形態に制限はない。例えば、一旦溶液として調製したものを凍結乾燥等して乾燥状態で提供してもよい。ただし、生体組織等の対象への施与の際には一定の流動性と粘度の特性を備えている必要がある。よって、適用時にはゾル又は液体の状態（本明細書ではこれらを併せて「溶液状態」という）であるのが好ましい。そのための溶媒は特に制限されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリＱ水をろ過滅菌して用いることができる。すなわち、第１材組成物は、その保存時（又は提供時）に、溶液状態又は乾燥状態であることが好ましい。

【0048】

また、後述するように、本発明における第１材組成物には、上記したアルギン酸１価金属塩以外の成分が含有されていてもよく、その混合操作等、上記第１材組成物を得るための操作は、エンドトキシンレベル及び細菌レベルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよい。

【0049】

本発明における第１材組成物は、生体組織等の対象に施与する際の性状として、例えば、組成物を２０℃で１時間静置した後に２１Ｇの注射針で注入できる流動性を有することが望ましい。このとき粘度が低すぎると適用した部位の周辺組織への密着性が弱くなる虞があるため、見掛け粘度は、特に限定されないが、好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１００ｍＰａ・ｓ以上、更に好ましくは２００ｍＰａ・ｓ以上、とりわけ好ましくは５００ｍＰａ・ｓ以上である。見掛け粘度が高すぎると取扱性が悪くなる虞があるため、好ましくは５００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下、更に好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下である。見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以下のときシリンジ等での適用がより容易に行える。しかし、見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以上であっても加圧型や電動型の充填器具やその他の手段を用いて適用可能である。本発明の組成物の好ましい範囲は、１０ｍＰａ・ｓ～５００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、１００ｍＰａ・ｓ～３００００ｍＰａ・ｓ、更に好ましくは２００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓ、更により好ましくは５００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓ、とりわけ好ましくは７００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓである。別の好ましい態様では、５００ｍＰａ・ｓ～１００００ｍＰａ・ｓ、あるいは２０００ｍＰａ・ｓ～１００００ｍＰａ・ｓであってもよい。本発明の限定されないいくつかの態様の組成物は、シリンジ等で対象に適用することもできる粘度である。

【0050】

上記第１材組成物の見掛け粘度の測定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法による、共軸二重円筒形回転粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい‐平板形回転粘度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。粘度測定は２０℃の条件で行うことが望ましい。なお、後述のように本発明における第１材組成物が細胞など溶媒に溶解しないものを含有する場合には、粘度測定を正確に行うため、細胞などを含有しない状態の見掛け粘度とすることが好ましい。

【0051】

上記第１材組成物の見掛け粘度の測定は、特に、コーンプレート型粘度計、センサー３５／１（コーンの径３５ｍｍ、１°）を用いて測定することがより好ましい。例えば、以下のような測定条件で測定することが望ましい。試料溶液の調製は、ミリＱ水を用いて行う。測定温度は２０℃とする。コーンプレート型粘度計の回転数は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定時は１ｒｐｍ、２％溶液測定時は０．５ｒｐｍとし、これを目安にして決定する。読み取り時間は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定の場合は２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とする。２％溶液測定の場合は２．５分間測定し、開始０．５分から２．５分までの平均値とする。試験値は３回の測定の平均値とする。

【0052】

上記第１材組成物の見掛け粘度の調整は、例えば、組成物中のアルギン酸１価金属塩の濃度、用いるアルギン酸１価金属塩の分子量又はＭ／Ｇ比等により行うことができる。あるいは、異なる分子量あるいは粘度の性状を有する別ロットのアルギン酸１価金属塩の２種以上を併用することによっても調整することができる。

【0053】

上記第１材組成物の見掛け粘度の調整においては、組成物中のアルギン酸１価金属塩の濃度が高い場合に見掛け粘度が高くなる傾向があり、濃度が低い場合に見掛け粘度が低くなる傾向がある。また、アルギン酸１価金属塩の分子量が大きい場合に見掛け粘度が高くなる傾向があり、分子量が小さい場合に見掛け粘度が低くなる傾向がある。また、用いるアルギン酸１価金属塩のＭ／Ｇ比によって、見掛け粘度が影響を受ける。この点、本発明に用いるアルギン酸１価金属塩のＭ／Ｇ比としては、０．１～５．０であることが好ましく、０．１～４．０であることがより好ましく、０．２～３．５であることが更により好ましい。

【0054】

一般に、Ｍ／Ｇ比が主に海藻の種類によって決まることなどから、原料として用いられる褐藻類の種類が、得られるアルギン酸１価金属塩の粘度の特性に影響を及ぼす。この点、本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の由来としては、好ましくは、レッソニア属、マクロシスティス属、ラミナリア属、アスコフィラム属、ダービリア属等に属する褐藻類由来であることが好ましく、レッソニア属に属する褐藻類由来であることがより好ましく、レッソニア・ニグレッセンズ（Ｌｅｓｓｏｎｉａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）由来であることが特に好ましい。

【0055】

アルギン酸１価金属塩の含有量としては、一定の粘度の性状を備えるためには、分子量の影響を受けるので、一概にはいえないが、本発明における第１材組成物全体の０．１ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％以上、更に好ましくは１ｗ／ｖ％以上である。更に具体的に、アルギン酸１価金属塩の濃度は、好ましくは０．５ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％、より好ましくは１ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％、更に好ましくは１ｗ／ｖ％～３ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｖ％～２．５ｗ／ｖ％である。また、別の態様では、アルギン酸１価金属塩の濃度は、好ましくは０．５ｗ／ｗ％～５ｗ／ｗ％、より好ましくは１ｗ／ｗ％～５ｗ／ｗ％、更に好ましくは１ｗ／ｗ％～３ｗ／ｗ％、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｗ％～２．５ｗ／ｗ％であってもよい。

【0056】

本発明における第１材組成物は、発熱等を惹起することなく、生体組織等の対象に適用する場合により安全に施与する観点から、上記したような低エンドトキシン処理を施したアルギン酸１価金属塩を用いて、組成物のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、３００ＥＵ／ｇ以下であることがより好ましく、１５０ＥＵ／ｇ以下であることが更により好ましく、１００ＥＵ／ｇ以下であることが特に好ましい。

【0057】

本発明において、上記第１材組成物は、組織再生等の目的で細胞を含有せしめることは、必ずしも必要ではない。ただし、そのような細胞の使用をまったく排除するものではない。すなわち、本発明の限定されないいくつかの態様においては、上記第１材組成物に細胞を含有せしめてもよい。細胞としては、例えば、髄核細胞、幹細胞、間質細胞、間葉系幹細胞、骨髄間質細胞などが挙げられ、由来は特に限定されないが、椎間板髄核、骨髄、脂肪組織、臍帯血などを挙げることができる。また、細胞として、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を挙げることもできる。

【0058】

具体的には、用いる細胞は、必要に応じて、椎間板髄核、骨髄、脂肪組織、臍帯血などから回収し、目的とする細胞を濃縮する処理や培養して細胞数を増やす処理を行い、調製した細胞を用いることができる。そして、細胞の種類によっても異なるが、上記第１材組成物中に、典型的に、例えば、１×１０⁴個／ｍｌ以上、もしくは１×１０⁵個／ｍｌ以上、好ましくは１×１０⁴個／ｍｌ～１×１０⁷個／ｍｌの細胞を含有せしめることができる。細胞は市販品を入手して用いてもよい。

【0059】

本発明の限定されないいくつかの態様では、上記第１材組成物には、細胞の成長を促進する因子を含有せしめてもよい。そのような因子としては、例えば、ＢＭＰ（Bone morphogenetic protein）、ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）、ＶＥＧＦ（Vascular endothelial growth factor）、ＨＧＦ（Hepatocyte growth factor）、ＴＧＦ‐β（Transforming growth factor-β）、ＩＧＦ‐１（Insulin-like growth factor-1）、ＰＤＧＦ（Platelet-derived growth factor)、ＣＤＭＰ（Cartilage-derived-morphogenetic protein）、ＣＳＦ（Colony stimulating factor）、ＥＰＯ（Erythropoietin）、ＩＬ（Interleukin）、ＰＲＰ（Platelet rich plasma）、ＳＯＸ（転写因子）、ＩＦ（Interferon）などが挙げられる。これらの因子は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。なお、本発明の限定されない別の態様においては、上記第１材組成物は、これらの因子を含まない。成長因子を含まない場合でも、アルギン酸１価金属塩による軟骨組織の再生等の作用効果は十分に良好であるし、積極的に細胞死を抑制する場合と比較してより安全性も高い。

【0060】

本発明の限定されないいくつかの態様では、上記第１材組成物には、細胞死を抑制する因子を含有せしめてもよい。細胞死を引き起こす因子としては、例えば、Ｃａｓｐａｓｅ、ＴＮＦα等が挙げられ、これらを抑制する因子としては、抗体やｓｉＲＮＡ等が挙げられる。これらの細胞死を抑制する因子は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。なお、本発明の限定されない別の態様においては、上記第１材組成物は、これらの因子を含まない。細胞死を抑制する因子を含まない場合でも、アルギン酸１価金属塩による軟骨組織の再生等の作用効果は十分に良好であるし、積極的に細胞死を抑制する場合と比較してより安全性も高い。

【0061】

本発明の限定されないいくつかの態様では、上記第１材組成物には、必要に応じて、更に、他の医薬活性成分や、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等の慣用成分など、通常医薬に用いられる成分を含有せしめてもよい。具体的には、例えば、第１材組成物は、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの１価金属塩、あるいは、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩などを含有してもよく、好ましくは１価金属塩であり、より好ましくは塩化ナトリウムである。

【0062】

本発明において、上記第１材組成物には、基本的には、組成物をゲル化させる架橋剤を、必ずしも必要としていない。ただし、本発明の限定されないいくつかの態様では、上記第１材組成物には、一定時間経過後に初めて組成物がゲル化される程度の量の架橋剤が含まれていてもよい。ここでの一定時間とは、特に限定されないが、好ましくは３０分～１２時間程度である。組成物をゲル化させる量の架橋剤を含有しないことは、例えば、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針をつけたシリンジで注入できることで示されてもよい。一方、本発明の限定されない別のいくつかの態様では、上記第１材組成物には、架橋剤が含まれていない。

【0063】

４．第２剤（材）組成物
本発明における第２剤（材）組成物は、上記した架橋剤を含有するものであればよく、特にその製剤的形態に制限はない。例えば、一旦溶液として調製したものを凍結乾燥等して乾燥状態で提供してもよい。ただし、使用時にはシリンジ等の注入器を用いることが、操作性がよく、便利である。よって、適用時には液体の状態にして用いることが好ましい。そのための溶媒は特に制限されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリＱ水をろ過滅菌して用いることができる。

【0064】

また、本発明における第２材組成物には、上記した架橋剤以外の成分が含有されていてもよく、その混合操作等、上記第２材組成物を得るための操作は、上記した第１材組成物と同様に、エンドトキシンレベル及び細菌レベルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよい。

【0065】

上記第２材組成物中の架橋剤の濃度等は、用いる架橋剤の種類等に応じて適宜設定すればよい。本発明の限定されないいくつかの態様において、例えば、架橋剤としてＣａＣｌ₂を用いる場合、その濃度は、適用する上記第１材組成物のアルギン酸１価金属塩の濃度や分子量等によっても異なり、一概にはいえないが、好ましくは１０ｍＭ～１０００ｍＭ、より好ましくは２５ｍＭ～２００ｍＭ、とりわけ好ましくは５０ｍＭ～１５０ｍＭであってもよい。

【0066】

５．生体適用組成物
本発明の別の観点においては、本発明は、更に、生体適用組成物を提供する。本明細書において「生体適用組成物」とは、上記に説明した組成物の組合せ物又は処置方法における第１材組成物のうち着色成分として、国等の規制により生体への使用が許可されている色素、すなわち生体に施与可能な色素を用いるものをいう。したがって「生体適用組成物」は「第１材組成物」の一形態であって、「第１材組成物」の語は「生体適用組成物」を含む意味で用いられ、特に断らない限り、「第１材組成物」は「生体適用組成物」に読み替えて用いることができる。すなわち、この生体適用組成物は、着色成分及びアルギン酸１価金属塩を含有し、流動性がある状態で対象に施与され、好ましくは、対象に施与したときに少なくとも一部分がゲル化するようにして用いられるものである。そして、着色成分を含有することにより、対象に施与したときのゲル化の様子を確実に視認することができるようにしており、更に、着色成分として国等の規制により生体への使用が許可されている色素、すなわち、生体へ施与可能な色素を用いることにより、ヒト等に対して安全に使用することができるようにしている。国等の規制により生体への施与が可能な色素としては、例えば、日本において、厚生労働省により、医薬品、医薬部外品、化粧品への使用が認められている色素、また、米国においてＦＤＡにより、医薬品、医療機器、化粧品などへの使用が認められている色素等が挙げられる。また、着色成分は、生体適用組成物を、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯などに施与したときにゲル膜の形成状態を評価しやすいものであることが好ましく、識別性の観点から、青色～緑色の色素が好ましい。このような着色成分としては、例えば、緑色３号（ファストグリーンＦＣＦ）、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）、青色２号（インジゴカルミン）、緑色２０１号（アリザシンシアニングリーンＦ）、緑色２０２号（キニザリングリーンＳＳ）、青色２０１号（インジゴ）、青色２０２号（パテントブルーＮＡ）、青色２０３号（パテントブルーＣＡ）などが挙げられ、より好ましくは、緑色３号（ファストグリーンＦＣＦ）、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である。

【0067】

本発明により提供される第１材組成物又は生体適用組成物においては、上記色素が、その色素による視認性を与える濃度であって、且つ、冷蔵保存時に析出が生じない濃度で含有されていることが好ましい。これによれば、視認性を与える着色成分として組成物中に含有されている色素が、対象に施与する前に冷蔵保存するような場合でも、その分散性もしくは均一性が安定に保たれて、対象に施与したときのゲル化の様子をより確実に視認することができる。

【0068】

上記組成物中の色素の濃度が視認性を与える濃度であるかどうかについては、視認により確認してもよいが、色の測定により評価してもよい。例えば、物体の色を表すのに使用されているＬ＊ａ＊ｂ＊色空間は、１９７６年に国際照明委員会（ＣＩＥ）で規格化され、日本でも日本工業規格（ＪＩＳ Ｚ ８７８１－４）において採用されている表色系である。Ｌ＊は、色の明度を表し、Ｌ＊＝０は黒、Ｌ＊＝１００は白の拡散色であり、０～１００の数値で表される。色度（色相と彩度）は、ａ＊、ｂ＊の数値で表される。ａ＊、ｂ＊は、色の方向を示し、a＊は赤方向、－ａ＊は緑方向、ｂ＊は黄方向、－ｂ＊は青方向を示し、数値が大きくなるに従って色あざやかになり、数値が小さくなるに従ってくすんだ色になる。

【0069】

本明細書の試験例１において、青色１号を濃度０．００１～０．０１ｗ／ｗ％で含む２ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液のＬ＊ａ＊ｂ＊表色系の範囲は、光源をＤ６５／２、測定モードを透過測定とした分光色差計（ＳＥ－６０００）（日本電色工業株式会社製）を用いて常温（１５～２５℃）環境下で測定したとき、Ｌ＊（明度）は４０～８０、ａ＊は－４０～－５（緑方向）、ｂ＊は－６０～－２０（青方向）であった。この範囲の色であれば、軟骨や周辺組織との識別もしやすく、ゲル膜の形成状態の評価が容易である。特に、Ｌ＊（明度）の数値が低すぎると（０に近くなると）組成物の黒色傾向が強くなり、施与時の影により識別しにくい。また、Ｌ＊が高すぎると（１００に近くなると）組成物の白色傾向が強くなり、白色の軟骨等と識別しにくくなる。実際に、青色１号を濃度０．１ｗ／ｗ％で含む２ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液は黒色傾向が強く、本発明への使用に適さないことが確認された。従って、本発明の第１材組成物又は生体適用組成物の好ましいＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値の範囲は、Ｌ＊（明度）は４０～８０、ａ＊は－４０～０、ｂ＊は－６０～－２０である。

【0070】

このようなＬ＊ａ＊ｂ＊色空間において、下記式（１）で表される色差ΔＥの値などを指標にすることで、より客観的に評価することができる。ここで、人間が明確に別の色名のイメージを持つ色差は、下記式（１）で表される色差ΔＥの値として１３～２５程度であると言われている。軟骨組織、椎間板組織、それらの周辺組織等のほとんどの部分は、白色、赤色（ａ＊はプラスの数値）～黄色（ｂ＊はプラスの数値）の色調であり、ａ＊、ｂ＊値は、それぞれプラスの値であることが多い。本発明の第１材組成物又は生体適用組成物のａ＊は－４０～０、ｂ＊は－６０～－２０であり、十分な色調の差が得られることが分かる。

【0071】

【数1】

（式（１）中、Ｌ１＊、ａ１＊、ｂ１＊は、比較対照のＬ＊ａ＊ｂ＊色空間の各値であり、Ｌ２＊、ａ２＊、ｂ２＊は、対象サンプルを測定したときのＬ＊ａ＊ｂ＊色空間の各値である。）

【0072】

Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊値は、例えば、分光色差計（「ＳＥ－６０００」、日本電色工業株式会社製）等を用いて測定することができる。なお、分光色差計は、分光色彩計などとも呼ばれる場合がある。

【0073】

一方、上記組成物中の色素の濃度が冷蔵保存時に析出が生じない濃度であるかどうかについては、例えば、上記組成物を一定期間（例えば、１日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヶ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、１年間、２年間、３年間など）、冷蔵庫（例えば、設定温度：２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、又は８℃など）に保存したうえ、目視により析出の有無を観察したり、あるいはフィルター（０．４５μｍ孔）等による濾過後に、その濾過前後の色差を測定したりして、判断することができる。本発明において、特に断りのない限り、組成物を設定温度５℃の冷蔵庫に１か月間保存し評価を行う。この場合、色調が視認し得なくなる状態を上記式（１）で表される色差の値の低下として検出し得る。すなわち、色素の析出が生じると、溶解している色素量が減少し、ひいては、色調の度合いが低下するからである。あるいは、ａ＊値、ｂ＊値など特定の色度の値に着目して評価してもよい。よって、上記組成物中の着色成分の濃度としては、例えば、着色成分が青色であれば、ｂ＊値に着目し、５℃に設定された冷蔵庫で１か月保存後のｂ＊値と保存前のｂ＊値との差異が２５以下の範囲に保たれるような濃度が好ましい。

【0074】

また、本発明の第１材組成物又は生体適用組成物は、前述のような一定期間の保存によっても色が安定していることが好ましい。本発明のいくつかの態様では、設定温度５℃の冷蔵庫に１か月間保存した後の組成物と、保存前の組成物との色差ΔＥの値は３５以下であることが好ましく、より好ましくは３０以下である。

【0075】

また、本発明の第１材組成物又は生体適用組成物は、例えば、約２℃～８℃の低温条件下で（例えば、５℃に設定された冷蔵庫で）、前述のような一定期間（例えば１か月間）の保存によっても着色成分の析出が生じない、すなわち、安定に保存可能な組成物であることが好ましい。

【0076】

本発明に用いる生体に施与可能な色素としては、典型的に、例えば、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）、青色２号（インジゴカルミン）、緑色３号（ファストグリーンＦＣＦ）などが挙げられる。特に、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）を用いることが好ましく、その濃度範囲としては、０．０００５質量％以上０．０５質量％以下であってよく、０．００１質量％以上０．０１質量％以下であってよい。

【0077】

６．組合せ物
本明細書において「組合せ物」とは、対象に施与するときに、前記の第１剤（材）組成物及び第２剤（材）組成物が本発明に用いられるために存在していればよく、第１剤（材）組成物と第２剤（材）組成物の提供方法は特に限定されない。例えば、第１材組成物と第２材組成物はキットとして提供されてもいいし、あるいは、第１材組成物のみ提供され、第２材組成物は別途市販品から調製して用いられてもよい。

【0078】

第１材組成物は、保存時（又は提供時）には、溶液状態又は乾燥状態であってよく、乾燥状態の場合には、アルギン酸１価金属塩の凍結乾燥体を含むことが好ましい。第１材組成物は、バイアル、あるいは、プレフィルドシリンジに封入されてもよい。

【0079】

第１材組成物と第２材組成物とをキットとする場合、例えば、（１）第１材組成物としてアルギン酸ナトリウム、青色１号などの生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムなどの１価金属塩を含む溶液を封入したプレフィルドシリンジ、（２）第２材組成物として塩化カルシウム溶液など２価以上の金属イオン化合物の溶液を封入したアンプル、（３）シリンジ、（４）注射針等を一つのパッケージに入れたキットとすることができる。また例えば、２種の溶液を別々に封入可能なダブルシリンジに（１）第１材組成物の溶液と（２）第２材組成物の溶液をそれぞれ封入して提供されてもよい。

【0080】

７．組合せ物の使用方法
本発明の組合せ物は、第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いられる。第１材組成物の対象への施与、第１材組成物のゲル化、ゲル膜の形成状態の評価などの詳細は、前記発明を実施するための形態等に記載のとおりである。

【0081】

８．対象の処置方法
本発明において、アルギン酸１価金属塩及び着色成分を含有する第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与する工程と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させる工程と、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価する工程とを含む、該対象の処置方法が提供される。第１材組成物、その対象への施与、第２材組成物、第１材組成物のゲル化、ゲル膜の形成状態の評価等の詳細は、前記に記載のとおりである。

【0082】

（実施例１）
関節鏡視下、着色したアルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）を関節軟骨欠損部に充填した。充填したアルギン酸ナトリウム溶液の液面を含む周辺に１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を接触させて、その表面をゲル化させた（ゲル膜の形成）。約５分後に、ゲル膜表面を含む軟骨欠損部周辺を生理食塩水で洗浄した。洗浄後、ゲル膜の形成が不十分なときは、ゾル状の着色したアルギン酸塩の流出が観察される。

【0083】

（実施例２）
関節鏡視下、着色したアルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）を関節軟骨欠損部に充填した。充填したアルギン酸ナトリウム溶液の液面を含む周辺に１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を接触させて、その表面をゲル化させた（ゲル膜の形成）。約４分後に、注射器の先端でゲル膜表面に触れて、ゲル膜の形成を確認した。ゾンデ（消息子）でゲル膜表面に触れてもよい。ゲル膜の形成が不十分なときは、ゾル状の着色したアルギン酸塩の流出が観察される。

【0084】

（実施例３）
関節鏡視下、ｐＨ感受性色素アントシアニンで着色し、ｐＨ６．５、紫色のアルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）を関節軟骨欠損部に充填した。充填したアルギン酸ナトリウム溶液の液面を含む周辺に、ｐＨ９．０に調整した１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を接触させて、その表面をゲル化させた（ゲル膜の形成）。塩化カルシウム水溶液が接触したゲル膜表面は、紫色から青色に変化し、ゲル膜の形成状態を評価することができる。

【0085】

（実施例４）
下記表に示す処方に基づいて、第１材組成物（生体適用組成物）を調製し得る。表中の数値は質量％を意味する。調製方法は試験例１に準じて行うことができる。また、一般的に医薬品や医療機器で用いられる方法で調製し得る。第２材組成物は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム溶液であり得る。

【0086】

【表3】

【0087】

【表4】

【0088】

【表5】

【0089】

[試験例１]
アルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）に、生体に施与可能な色素である青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）を濃度０．００１ｗ／ｗ％、０．００４ｗ／ｗ％、０．００７ｗ／ｗ％、又は０．０１ｗ／ｗ％となるように添加して、着色し、ガラスバイアル３本に５gずつ分注した。これを５℃に設定した冷蔵庫で保存して、１週間、２週間、及び１ヵ月間経過後にサンプリングし、その試料を観察して色素析出の有無を確認した。また、分光色差計（「ＳＥ－６０００」、日本電色工業株式会社製）を用いて各試料のＬ＊、ａ＊、ｂ＊値を測定した。測定は常温（１５～２５℃）の室内で行った。光源はＤ６５／２とし、測定モードは透過測定とした。分光色差計は、サンプル測定前に、標品としての標準白色板（型番ＳＥ－３８７２４，日本電色株式会社製）の測定値を、Ｌ＊＝１００、ａ＊＝０，ｂ＊＝０に調整した。

【0090】

その結果、図２に示されるように、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）は濃度０．００１ｗ／ｗ％～０．０１ｗ／ｗ％の範囲で鮮やかな青色を呈し、調製時から冷蔵保存１ヶ月後までにわたり色素の析出が認められずに、安定してその色調を維持していた。また、青色１号を含むアルギン酸ナトリウム溶液の表色系における色彩値の範囲は、Ｌ＊（明度）は約４０～８０、ａ＊は約－４０～－５（緑方向）、ｂ＊は約－６０～－２０（青方向）であることが分かった。

【0091】

[試験例２]
アルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）に、生体に施与可能な色素である青色２号（インジゴカルミン）を濃度０．００４ｗ／ｗ％となるように添加して、着色し、シリンジに２gずつ分注した。この充填済みシリンジをネスト（シリンジ固定用グリッド付き容器）に入れ固定して、そのネストごと５℃に設定した冷蔵庫に保存し、一晩及び１９日後経過後に、シリンジ内の試料を観察して色素析出の有無を確認した。

【0092】

その結果、青色２号（インジゴカルミン）は濃度０．００４ｗ／ｗ％で鮮やかな青色を呈し、一晩の冷蔵保存後に色素の析出は認められなかった。ただし、１９日経過後の観察では色素の析出がみられ、その析出は室温に放置すると解消した。

【0093】

試験例１及び試験例２の結果から、生体に施与可能な色素である青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）及び青色２号（インジゴカルミン）は、アルギン酸ナトリウム溶液に対していずれも鮮やかな青色の色調を付与することができることが明らかとなった。また、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）のほうが、青色２号（インジゴカルミン）に比べて、より安定に青色の色調を付与できることが明らかとなった。

【符号の説明】

【0094】

１ 第１剤（材）組成物
１ａ 第１剤（材）組成物の表面付近
１ｂ 第１剤（材）組成物の表面付近以外の内部
２ 軟骨欠損部
３ 第２剤（材）組成物

【図1】

【図2】