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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-21
(45)【発行日】2025-04-30
(54)【発明の名称】プトレシン生産性乳酸菌
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20250422BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20250422BHJP
A23L 2/84 20060101ALI20250422BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20250422BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20250422BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A ZNA
A23L33/135
A23L2/84
C12P13/00
C12N15/09 Z
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021084514
(22)【出願日】2021-05-19
(65)【公開番号】P2022178026
(43)【公開日】2022-12-02
【審査請求日】2024-03-12
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03449
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03450
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100202430
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 千香子
(74)【代理人】
【氏名又は名称】中西 祐子
(72)【発明者】
【氏名】守谷 直子
(72)【発明者】
【氏名】木元 広実
【審査官】藤井 美穂
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／２１４８４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１４６９１６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／０９１９８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－７３２６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－２４５６６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】日本醸造協会誌，2021年02月16日，Vol.116, No.2，p.89-93
【文献】International Journal of Food Microbiology，2001年，Vol.68，p.211-216
【文献】J. Microbiol. Biotechnol.，2015年，Vol.25, No.4，p.464-468
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００ － ７／０８
Ｃ１２Ｐ １／００ － ４１／００
Ａ２３Ｌ ３１／００ － ３３／２９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
レビラクトバチルス・パウシボランスＮ３６株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４４９）又はＮ５０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４５０）である、乳酸菌。
【請求項2】
請求項１記載の乳酸菌を含有する、飲食品。
【請求項3】
請求項１記載の乳酸菌を培養するスキムミルク培地中に、グルコースを添加することを特徴とする、プトレシン生産量の増加方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プトレシン生産性乳酸菌、当該乳酸菌を含有する飲食品及び、プトレシン生産量の増加方法に関する。
【背景技術】
【0002】
プトレシンは、生体においてアミノ酸であるオルニチンから生成されるポリアミンの１種であり、化学名「１，４－ジアミノブタン」の物質である。その機能として、核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化、核酸合成系の促進作用、タンパク質合成系の活性化、ヒストンのアセチル化、非ヒストンクロマチン蛋白質のリン酸化の促進、細胞膜の安定化及び物質の透過性の強化、及び二価金属に影響を受ける酵素の活性化などの生理的作用、並びに油脂に対する抗酸化作用などが知られている。
ヒトの体細胞内や腸内細菌においてもプトレシンは生成されるものの、その生成量は加齢とともに減少することが報告されている。
こうした状況から、近年、プトレシンは健康食品として利用されつつある。
プトレシンは、化学合成により合成することも可能であるが、猛毒性のシアン化水素を使用することから、環境負荷のみならず安全性の面でも問題があった。
この他のプトレシンの製造方法として、ポリアミンを多く含む魚類の白子、乳素材、酵母、または植物等からプトレシンを抽出し精製する方法や、微生物を用いてプトレシンを生産する方法（例えば、特許文献１、２等）も報告されているものの、その生産量やヒトへの安全性などの観点から、新たなプトレシンの製造方法が望まれている。
ヒトの体細胞内や腸内細菌においてもプトレシンは生成されるものの、その生成量は加齢とともに減少することが報告されている。
こうした状況から、近年、プトレシンは健康食品として利用されつつある。
プトレシンは、化学合成により合成することも可能であるが、猛毒性のシアン化水素を使用することから、環境負荷のみならず安全性の面でも問題があった。
この他のプトレシンの製造方法として、ポリアミンを多く含む魚類の白子、乳素材、酵母、または植物等からプトレシンを抽出し精製する方法や、微生物を用いてプトレシンを生産する方法（例えば、特許文献１、２等）も報告されているものの、その生産量やヒトへの安全性などの観点から、新たなプトレシンの製造方法が望まれている。
【0003】
一方、乳酸菌はヨーグルトやチーズなどの乳製品や、漬物、味噌、醤油などの発酵食品の製造に用いられており、近年はプロバイオティクスとして消化管内の細菌叢の改善による整腸効果、免疫力向上効果、抗腫瘍効果などの種々の健康保持効果を有することから、人類にとって健康に深く関わる有用な微生物資源として知られている。しかしながら、食品として摂取された乳酸菌は、胃酸や胆汁酸などの様々なストレスに曝されることで、腸内での生存率や乳酸菌が本来有する有用な効果が低減してしまうといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２００６－１９１８０８号公報
【文献】特開２０１０－０５７３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、プトレシンの生産能が高く、かつ、プロバイオティクスとして活用可能な新規な乳酸菌の提供と、当該乳酸菌を用いたプトレシン生産量の増加方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、レビラクトバチルス・パウシボランスに属する特定の菌株が、プトレシンを生産する能力を有し、かつ、胆汁酸に対する耐性を有することも見出し、上記課題を解決するに至ったものである。
【0007】
本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
１．レビラクトバチルス・パウシボランスＮ３６株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４４９）又はＮ５０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４５０）である、乳酸菌。
２．１．記載の乳酸菌を含有する、飲食品。
３．１．記載の乳酸菌を培養するスキムミルク培地中に、グルコースを添加することを特徴とする、プトレシン生産量の増加方法。
１．レビラクトバチルス・パウシボランスＮ３６株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４４９）又はＮ５０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４５０）である、乳酸菌。
２．１．記載の乳酸菌を含有する、飲食品。
３．１．記載の乳酸菌を培養するスキムミルク培地中に、グルコースを添加することを特徴とする、プトレシン生産量の増加方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明のレビラクトバチルスに属する特定の乳酸菌は、プトレシンを生産する能力を有し、かつ、胆汁酸に対する耐性を有するため、プロバイオティクスとして活用可能である。
本発明の乳酸菌は、スキムミルクなどの乳中で培養し、生産したプトレシンと共に安全性の高い飲食品として利用することもでき非常に有用である。
さらに、当該乳酸菌をスキムミルク培地中で培養する際に、グルコースを添加することによりプトレシン生産量を増加させることが出来る。
本発明の乳酸菌は、スキムミルクなどの乳中で培養し、生産したプトレシンと共に安全性の高い飲食品として利用することもでき非常に有用である。
さらに、当該乳酸菌をスキムミルク培地中で培養する際に、グルコースを添加することによりプトレシン生産量を増加させることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本発明の乳酸菌Ｎ３６株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を示す図である。
【図2】本発明の乳酸菌Ｎ５０株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を示す図である。
【図3】実施例２のプトレシン生産確認試験における、高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を示すチャートである。
【図4】実施例３のプロバイオティクス適性試験における、ＧＧ株、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株の胆汁酸耐性（％）を示すグラフである。
【図5】実施例４のスキムミルク培養中でのプトレシン生産量の確認試験１における、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株の無糖時と加糖時のプトレシン生産量を示すグラフである。
【図6】実施例５のスキムミルク培養中でのプトレシン生産量の確認試験２における、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株とスターター乳酸菌との共培養時のプトレシン生産量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は、レビラクトバチルス・パウシボランスＮ３６株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４４９）又はＮ５０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４５０）の乳酸菌に関する。
本発明におけるレビラクトバチルス属は、２０２０年、それまでにラクトバチルス属に分類されていた全ての菌種（２６１菌種、２０１９年８月１９日時点）の基準株のゲノムデータを用いゲノムレベルで属分類の再評価を行った結果、合計２５属に再分類された内の１つの属である。レビラクトバチルス属には、再分類を実施した全ての菌種に対して約９．２％（２４菌種）が含まれていた。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明におけるレビラクトバチルス属は、２０２０年、それまでにラクトバチルス属に分類されていた全ての菌種（２６１菌種、２０１９年８月１９日時点）の基準株のゲノムデータを用いゲノムレベルで属分類の再評価を行った結果、合計２５属に再分類された内の１つの属である。レビラクトバチルス属には、再分類を実施した全ての菌種に対して約９．２％（２４菌種）が含まれていた。
以下、本発明について詳細に説明する。
【0011】
＜レビラクトバチルス・パウシボランスＮ３６株、Ｎ５０株＞
レビラクトバチルス・パウシボランス（Levilactobacillus paucivorans）Ｎ３６株、Ｎ５０株は、「ぬか漬け」より分離された乳酸菌であり、国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 畜産研究部門内 畜産物研究領域 畜産物機能ユニットが有する乳酸菌ライブラリーに保存されていた菌株である。１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列による相同性検索の結果により、レビラクトバチルス・パウシボランス（Levilactobacillus paucivorans）と同定された。米国において一般的に安全と認められる食品として「ＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）」認証を取得している乳酸菌ラクトバチルス属に属する菌種であることからも、ヒトへの安全性は極めて高いものである。
本発明のＮ３６株、Ｎ５０株ともに、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、Ｎ３６株がＮＩＴＥ Ｐ－０３４４９（受託日：２０２１年 ３月１９日）、Ｎ５０株がＮＩＴＥ Ｐ－０３４５０（受託日：２０２１年 ３月１９日）である。
レビラクトバチルス・パウシボランスＮ３６株、Ｎ５０株それぞれの、菌株特性は以下のとおりである。
（Ｎ３６株）
細胞形状：桿菌
グラム染色性：陽性
生育温度：２０～３５℃で増殖する。４０℃で増殖しない。
運動性：なし
糖資化性：リボース、グルコース、フルクトース、マルトース
グルコースを炭素源としたガス産生：＋
耐塩性：６％
胆汁酸耐性：０．６％
（Ｎ５０株）
細胞形状：桿菌
グラム染色性：陽性
生育温度：２０～３５℃で増殖する。４０℃で増殖しない。
運動性：なし
糖資化性：リボース、グルコース、フルクトース、マルトース
グルコースを炭素源としたガス産生：＋
耐塩性：６％
胆汁酸耐性：０．６％
レビラクトバチルス・パウシボランス（Levilactobacillus paucivorans）Ｎ３６株、Ｎ５０株は、「ぬか漬け」より分離された乳酸菌であり、国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 畜産研究部門内 畜産物研究領域 畜産物機能ユニットが有する乳酸菌ライブラリーに保存されていた菌株である。１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列による相同性検索の結果により、レビラクトバチルス・パウシボランス（Levilactobacillus paucivorans）と同定された。米国において一般的に安全と認められる食品として「ＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）」認証を取得している乳酸菌ラクトバチルス属に属する菌種であることからも、ヒトへの安全性は極めて高いものである。
本発明のＮ３６株、Ｎ５０株ともに、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、Ｎ３６株がＮＩＴＥ Ｐ－０３４４９（受託日：２０２１年 ３月１９日）、Ｎ５０株がＮＩＴＥ Ｐ－０３４５０（受託日：２０２１年 ３月１９日）である。
レビラクトバチルス・パウシボランスＮ３６株、Ｎ５０株それぞれの、菌株特性は以下のとおりである。
（Ｎ３６株）
細胞形状：桿菌
グラム染色性：陽性
生育温度：２０～３５℃で増殖する。４０℃で増殖しない。
運動性：なし
糖資化性：リボース、グルコース、フルクトース、マルトース
グルコースを炭素源としたガス産生：＋
耐塩性：６％
胆汁酸耐性：０．６％
（Ｎ５０株）
細胞形状：桿菌
グラム染色性：陽性
生育温度：２０～３５℃で増殖する。４０℃で増殖しない。
運動性：なし
糖資化性：リボース、グルコース、フルクトース、マルトース
グルコースを炭素源としたガス産生：＋
耐塩性：６％
胆汁酸耐性：０．６％
【0012】
＜プトレシンの製造方法＞
本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株を用いて、プトレシンを製造することができる。このプトレシン製造方法は、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株を、プトレシン生産性基質含有培地で培養する方法に関する。
本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株を用いて、プトレシンを製造することができる。このプトレシン製造方法は、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株を、プトレシン生産性基質含有培地で培養する方法に関する。
【0013】
（培養工程）
本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株を用いて、プトレシンを製造するための培養培地としては、レビラクトバチルス属に属する乳酸菌が資化可能な炭素源、窒素源又は無機塩類などの必要な栄養源に加えて、プトレシン生産性基質を含有する培地を挙げることができる。ここでプトレシン生産性基質としては、好ましくはオルニチンを挙げることができる。
培地に含まれるプトレシン生産性基質の濃度としては、特に制限されないものの、通常０．０１～２重量／容量％、好ましくは０.１～１重量／容量％程度を挙げることができる。
乳酸菌が生育できる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。炭素源としてはグルコース、フルクトースなどを使用することができ、窒素源としては肉エキス、ペプトン、イーストエキストラクト、カゼイン加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物などを使用することができる。また無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどを用いることができる。乳酸菌の培養に適した培地としては、例えばＭ１７培地（上記の炭素源添加）、ＭＲＳ液体培地などが挙げられる。
なお、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株は、スキムミルク培地にグルコースを添加することにより、プトレシン生産量が増加することが後述する実験例により確認されている。
本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株を用いて、プトレシンを製造するための培養培地としては、レビラクトバチルス属に属する乳酸菌が資化可能な炭素源、窒素源又は無機塩類などの必要な栄養源に加えて、プトレシン生産性基質を含有する培地を挙げることができる。ここでプトレシン生産性基質としては、好ましくはオルニチンを挙げることができる。
培地に含まれるプトレシン生産性基質の濃度としては、特に制限されないものの、通常０．０１～２重量／容量％、好ましくは０.１～１重量／容量％程度を挙げることができる。
乳酸菌が生育できる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。炭素源としてはグルコース、フルクトースなどを使用することができ、窒素源としては肉エキス、ペプトン、イーストエキストラクト、カゼイン加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物などを使用することができる。また無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどを用いることができる。乳酸菌の培養に適した培地としては、例えばＭ１７培地（上記の炭素源添加）、ＭＲＳ液体培地などが挙げられる。
なお、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株は、スキムミルク培地にグルコースを添加することにより、プトレシン生産量が増加することが後述する実験例により確認されている。
【0014】
培養条件は、乳酸菌が生育し得る条件であれば特に制限はない。
培地のｐＨは特に制限されないものの、通常ｐＨ５～８、好ましくはｐＨ６～７の範囲を挙げることができる。なお、培地や培養装置は１０５～１２１℃、１５分間殺菌して利用することができる。
培養温度は、乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定すればよく、例えば２０℃～３５℃の範囲を挙げることができ、好ましくは２５℃～３０℃程度である。培養時間は、制限はされないものの、例えば１～６日程度を挙げることができる。
培養に際して、酸素は特に遮断する必要も供給する必要もない。このため、培養器を簡易の蓋で覆うことによって、プトレシンの生産が可能である。培養の形式は、静置培養、振とう培養、タンク培養などが挙げられる。
培地のｐＨは特に制限されないものの、通常ｐＨ５～８、好ましくはｐＨ６～７の範囲を挙げることができる。なお、培地や培養装置は１０５～１２１℃、１５分間殺菌して利用することができる。
培養温度は、乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定すればよく、例えば２０℃～３５℃の範囲を挙げることができ、好ましくは２５℃～３０℃程度である。培養時間は、制限はされないものの、例えば１～６日程度を挙げることができる。
培養に際して、酸素は特に遮断する必要も供給する必要もない。このため、培養器を簡易の蓋で覆うことによって、プトレシンの生産が可能である。培養の形式は、静置培養、振とう培養、タンク培養などが挙げられる。
【0015】
＜飲食品＞
本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株は、そのプトレシン生産能を利用してプロバイオティクスとして活用することができ、その１つの態様として飲食品としての利用が挙げられる。
本発明における飲食品としては、例えば、乳飲料など飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）、加工乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、チーズ等の乳製品、キムチやぬか漬け等の乳酸菌発酵食品などが挙げられる。
また、医薬品又は医薬部外品（サプリメント）とすることもでき、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、液剤、乳剤、注射液等の製剤として使用することができる。
本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株は、そのプトレシン生産能を利用してプロバイオティクスとして活用することができ、その１つの態様として飲食品としての利用が挙げられる。
本発明における飲食品としては、例えば、乳飲料など飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）、加工乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、チーズ等の乳製品、キムチやぬか漬け等の乳酸菌発酵食品などが挙げられる。
また、医薬品又は医薬部外品（サプリメント）とすることもでき、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、液剤、乳剤、注射液等の製剤として使用することができる。
【実施例】
【0016】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の技術範囲はこれらにより限定されるものではない。
＜実施例１：乳酸菌株選抜試験＞
（１）試験検体
国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 畜産研究部門内 畜産物研究領域 畜産物機能ユニットが有する食品由来の乳酸菌ライブラリー４４菌種、３６０株を使用して、プトレシン生産能を有する乳酸菌を選抜する試験として、まず、アミンを生産するか否かの確認試験を行った。
（２）試験方法
乳酸菌生育液体培地（ＭＲＳ培地）を用いて、３０℃、２４時間培養した後、遠心分離して培養上清を廃棄し、得られた菌体を生理食塩水にて洗浄した。洗浄後、プトレシン生産性基質としてオルニチンを添加した下記アミン生産試験培地を加えて、３０℃、２４時間培養した。
［アミン生産試験培地、ｐＨ５．０］
トリプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム０．１ｇ／Ｌ、ブロモクレゾールパープル０．０６ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水和物０．０５ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物０．０４ｇ／Ｌ、オルニチン１０ｇ／Ｌを精製水に溶解させ、１規定の塩酸でｐＨを５．０に調製した後、１２１℃、１５分加熱殺菌した。
（３）アミン生産能有無の判断
ブロモクレゾールパープルの存在により、アミンを生産する場合は培地の色が紫色に、酸のみを生産する場合は培地の色が黄色に変色することで、確認される。
（４）結果
上記試験の結果より、試験検体３６０株の乳酸菌のなか、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株の２株がアミンを生産することが確認された。
＜実施例１：乳酸菌株選抜試験＞
（１）試験検体
国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 畜産研究部門内 畜産物研究領域 畜産物機能ユニットが有する食品由来の乳酸菌ライブラリー４４菌種、３６０株を使用して、プトレシン生産能を有する乳酸菌を選抜する試験として、まず、アミンを生産するか否かの確認試験を行った。
（２）試験方法
乳酸菌生育液体培地（ＭＲＳ培地）を用いて、３０℃、２４時間培養した後、遠心分離して培養上清を廃棄し、得られた菌体を生理食塩水にて洗浄した。洗浄後、プトレシン生産性基質としてオルニチンを添加した下記アミン生産試験培地を加えて、３０℃、２４時間培養した。
［アミン生産試験培地、ｐＨ５．０］
トリプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム０．１ｇ／Ｌ、ブロモクレゾールパープル０．０６ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水和物０．０５ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物０．０４ｇ／Ｌ、オルニチン１０ｇ／Ｌを精製水に溶解させ、１規定の塩酸でｐＨを５．０に調製した後、１２１℃、１５分加熱殺菌した。
（３）アミン生産能有無の判断
ブロモクレゾールパープルの存在により、アミンを生産する場合は培地の色が紫色に、酸のみを生産する場合は培地の色が黄色に変色することで、確認される。
（４）結果
上記試験の結果より、試験検体３６０株の乳酸菌のなか、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株の２株がアミンを生産することが確認された。
【0017】
＜実施例２：プトレシン生産確認試験＞
（１）試験検体
上記「実施例１：乳酸菌株選抜試験」で、培地が紫色に変色した乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株のアミン生産培地を使用した。
（２）試験方法
上記（１）の試験検体を０．１Ｎ塩酸で希釈した後、内部標準物質として１，７－ジアミノヘプタンを使用し、次いで、５－（ジメチルアミノ）ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ダンシルクロリド）を添加してアミノ基をダンシル化した。これをエーテルにより抽出し、抽出液をアセトニトリルに溶解して、下記分析装置と条件に基づいて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った。
（分析装置と条件）
装置：株式会社島津製作所製 高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＶＰシリーズ）
ポンプ：ＬＣ－１０ＡＤｖｐ
カラムオーブン：ＣＴＯ－１０ＡＳｖｐ
検出器：ＳＰＤ－Ｍ１０ｖｐ
カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
オーブン温度：３０℃
流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトニトリル
試料注入量：１０μＬ
（３）結果
下記図３に示すとおり、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株のアミン生産培地ではプトレシンのピークが検出され、プトレシンを産生することが確認された。
（１）試験検体
上記「実施例１：乳酸菌株選抜試験」で、培地が紫色に変色した乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株のアミン生産培地を使用した。
（２）試験方法
上記（１）の試験検体を０．１Ｎ塩酸で希釈した後、内部標準物質として１，７－ジアミノヘプタンを使用し、次いで、５－（ジメチルアミノ）ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ダンシルクロリド）を添加してアミノ基をダンシル化した。これをエーテルにより抽出し、抽出液をアセトニトリルに溶解して、下記分析装置と条件に基づいて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った。
（分析装置と条件）
装置：株式会社島津製作所製 高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＶＰシリーズ）
ポンプ：ＬＣ－１０ＡＤｖｐ
カラムオーブン：ＣＴＯ－１０ＡＳｖｐ
検出器：ＳＰＤ－Ｍ１０ｖｐ
カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
オーブン温度：３０℃
流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトニトリル
試料注入量：１０μＬ
（３）結果
下記図３に示すとおり、本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株のアミン生産培地ではプトレシンのピークが検出され、プトレシンを産生することが確認された。
【0018】
＜実施例３：プロバイオティクス適性試験＞
プトレシン生産能を有することが確認された本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株について、プロバイオティクス適性を明らかにするために胆汁酸に対する耐性を確認する試験を行った。対照となる乳酸菌にはプロバイオティクス乳酸菌として広く用いられているラクチカゼイバチルス・ラムノーサス ＧＧ株を用いた。ＧＧ株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ＵＳＡ）に、アクセッション番号ＡＴＣＣ ５３１０３として登録されているものを用いた。各菌株をＭＲＳ培地で生育至適温度にて一晩前培養した後、胆汁無添加のＭＲＳ培地および０．３および０．６％胆汁を添加したＭＲＳ培地（各４ｍＬ）に２０μＬずつ接種し、ＧＧ株は生育至適温度の３７℃で、Ｎ３６株、Ｎ５０株は３０℃で、４８時間培養した。培養後のＯＤ６２０を測定し、胆汁無添加のＭＲＳ培地のＯＤ６２０の値を１００として、胆汁を添加したＭＲＳ培地の培養後の値を図４に示した。
Ｎ３６株、Ｎ５０株ともに、ＧＧ株と比較して、胆汁添加培地での生育が良好であることから、胆汁酸耐性を有しており、プロバイオティクスとしての効果が期待できることが確認された。
プトレシン生産能を有することが確認された本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株について、プロバイオティクス適性を明らかにするために胆汁酸に対する耐性を確認する試験を行った。対照となる乳酸菌にはプロバイオティクス乳酸菌として広く用いられているラクチカゼイバチルス・ラムノーサス ＧＧ株を用いた。ＧＧ株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ＵＳＡ）に、アクセッション番号ＡＴＣＣ ５３１０３として登録されているものを用いた。各菌株をＭＲＳ培地で生育至適温度にて一晩前培養した後、胆汁無添加のＭＲＳ培地および０．３および０．６％胆汁を添加したＭＲＳ培地（各４ｍＬ）に２０μＬずつ接種し、ＧＧ株は生育至適温度の３７℃で、Ｎ３６株、Ｎ５０株は３０℃で、４８時間培養した。培養後のＯＤ６２０を測定し、胆汁無添加のＭＲＳ培地のＯＤ６２０の値を１００として、胆汁を添加したＭＲＳ培地の培養後の値を図４に示した。
Ｎ３６株、Ｎ５０株ともに、ＧＧ株と比較して、胆汁添加培地での生育が良好であることから、胆汁酸耐性を有しており、プロバイオティクスとしての効果が期待できることが確認された。
【0019】
＜実施例４：スキムミルク培養中でのプトレシン生産量の確認試験１＞
プトレシン生産能を有することが確認された本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株について、スキムミルク培養中でのプトレシン生産量を確認するための試験を行った。また、スキムミルク培養時に加糖することによる、プトレシン生産量の確認も行った。
各菌株をＭＲＳ培地で一晩前培養（３０℃）して、菌体を洗浄した後、この菌体洗浄液を１０×１０９ｃｆｕ／ｍＬとなるように、１０％スキムミルク培地（無糖）またはグルコースを０．５％加えた１０％スキムミルク培地（加糖）に再懸濁した。ｃｆｕはコロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）の意味である。各乳酸菌を接種したスキムミルク培地は３０、３５、４０℃で２４～４８時間培養した。この培養液をボルテックスでよく撹拌し、１Ｎ塩酸で希釈した後、内部標準物質として１，７－ジアミノヘプタンを使用し、次いで、５－（ジメチルアミノ）ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ダンシルクロリド）を添加してアミノ基をダンシル化した。これをエーテルにより抽出し、抽出液をアセトニトリルに溶解して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った結果を図５に示した。
Ｎ３６株、Ｎ５０株ともに、３０～４０℃の培養温度で１０％スキムミルク培地中にプトレシンを生産することが示された。また０．５％グルコースの添加により培地中のプトレシン濃度が１．５倍増加した。
プトレシン生産能を有することが確認された本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株について、スキムミルク培養中でのプトレシン生産量を確認するための試験を行った。また、スキムミルク培養時に加糖することによる、プトレシン生産量の確認も行った。
各菌株をＭＲＳ培地で一晩前培養（３０℃）して、菌体を洗浄した後、この菌体洗浄液を１０×１０９ｃｆｕ／ｍＬとなるように、１０％スキムミルク培地（無糖）またはグルコースを０．５％加えた１０％スキムミルク培地（加糖）に再懸濁した。ｃｆｕはコロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）の意味である。各乳酸菌を接種したスキムミルク培地は３０、３５、４０℃で２４～４８時間培養した。この培養液をボルテックスでよく撹拌し、１Ｎ塩酸で希釈した後、内部標準物質として１，７－ジアミノヘプタンを使用し、次いで、５－（ジメチルアミノ）ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ダンシルクロリド）を添加してアミノ基をダンシル化した。これをエーテルにより抽出し、抽出液をアセトニトリルに溶解して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った結果を図５に示した。
Ｎ３６株、Ｎ５０株ともに、３０～４０℃の培養温度で１０％スキムミルク培地中にプトレシンを生産することが示された。また０．５％グルコースの添加により培地中のプトレシン濃度が１．５倍増加した。
【0020】
＜実施例５：スキムミルク培養中でのプトレシン生産量の確認試験２＞
本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株について、市販のヨーグルトスターター菌存在下におけるスキムミルク培養中でのプトレシン生産量を確認する試験を行った。
各菌株をＭＲＳ培地で一晩前培養（３０℃）して、菌体を洗浄した後、この菌体洗浄液を１０×１０７ｃｆｕ／ｍＬとなるように、１０％スキムミルク培地に再懸濁した。市販のヨーグルトスターター菌は１０％スキムミルク培地に接種し、３７℃で１６時間培養しておいたものを、１％添加した。各乳酸菌とヨーグルトスターター菌を接種したスキムミルク培地は３７℃で６～１６８時間培養した。この培養液をボルテックスでよく撹拌し、１Ｎ塩酸で希釈した後、内部標準物質として１，７－ジアミノヘプタンを使用し、次いで、５－（ジメチルアミノ）ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ダンシルクロリド）を添加してアミノ基をダンシル化した。これをエーテルにより抽出し、抽出液をアセトニトリルに溶解して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った結果を図６に示した。
市販のヨーグルトスターターはスキムミルク培地中にプトレシンを生産しなかった。Ｎ３６株、Ｎ５０株ともに、ヨーグルトスターター菌存在下においてもプトレシンを生産することが示された。
本発明の乳酸菌Ｎ３６株、Ｎ５０株について、市販のヨーグルトスターター菌存在下におけるスキムミルク培養中でのプトレシン生産量を確認する試験を行った。
各菌株をＭＲＳ培地で一晩前培養（３０℃）して、菌体を洗浄した後、この菌体洗浄液を１０×１０７ｃｆｕ／ｍＬとなるように、１０％スキムミルク培地に再懸濁した。市販のヨーグルトスターター菌は１０％スキムミルク培地に接種し、３７℃で１６時間培養しておいたものを、１％添加した。各乳酸菌とヨーグルトスターター菌を接種したスキムミルク培地は３７℃で６～１６８時間培養した。この培養液をボルテックスでよく撹拌し、１Ｎ塩酸で希釈した後、内部標準物質として１，７－ジアミノヘプタンを使用し、次いで、５－（ジメチルアミノ）ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ダンシルクロリド）を添加してアミノ基をダンシル化した。これをエーテルにより抽出し、抽出液をアセトニトリルに溶解して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った結果を図６に示した。
市販のヨーグルトスターターはスキムミルク培地中にプトレシンを生産しなかった。Ｎ３６株、Ｎ５０株ともに、ヨーグルトスターター菌存在下においてもプトレシンを生産することが示された。
【産業上の利用可能性】
【0021】
本発明のレビラクトバチルスに属する特定の乳酸菌は、プトレシンを生産する能力を有し、かつ、胆汁酸に対する耐性を有するため、プロバイオティクスとして活用可能である。また、当該乳酸菌をスキムミルク培地中で培養する際に、グルコースを添加することによりプトレシン生産量を増加させることが出来る。
さらに、本発明の乳酸菌は、スキムミルクなどの乳中で培養し、生産したプトレシンと共に安全性の高い飲食品として利用することもでき非常に有用である。
さらに、本発明の乳酸菌は、スキムミルクなどの乳中で培養し、生産したプトレシンと共に安全性の高い飲食品として利用することもでき非常に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】