知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-11
(45)【発行日】2025-06-19
(54)【発明の名称】シクロアストラゲノール含有組成物を生産する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 17/04 20060101AFI20250612BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20250612BHJP
【ＦＩ】
C12P17/04
A23L33/10
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020102552
(22)【出願日】2020-06-12
(65)【公開番号】P2021193933
(43)【公開日】2021-12-27
【審査請求日】2023-05-24
(73)【特許権者】
【識別番号】000186588
【氏名又は名称】小林製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100124431
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 順也
(74)【代理人】
【識別番号】100174160
【弁理士】
【氏名又は名称】水谷 馨也
(74)【代理人】
【識別番号】100175651
【弁理士】
【氏名又は名称】迫田 恭子
(72)【発明者】
【氏名】小川 順
(72)【発明者】
【氏名】岸野 重信
(72)【発明者】
【氏名】深見 裕之
(72)【発明者】
【氏名】尾▲関▼ 佑樹
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０８３８４７６９（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１２－００１５１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５２１４７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３６０９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特許第７３２７９３７（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】Applied Biochemistry and Biotechnology，2017年06月07日，Vol. 183, Vol. 4，p. 1488-1502，doi: 10.1007/s12010-017-2517-1
【文献】Journal of Microbiology and Biotechnology，2019年12月28日，Vol. 29, No. 12，p. 1882-1893，doi:10.4014/jmb.1807.07020
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ １７／００
Ａ２３Ｌ ５／００－３５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記第１工程及び第２工程を含む、シクロアストラゲノールの製造方法：アストラガロシドIVに、アストラガロシドIVのグルコース残基を遊離させる作用を有する乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第１工程、及び
前記第１工程で得られた生成物に、アストラガロシドIVのキシロース残基を遊離させる作用を有するビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第２工程。
【請求項2】
前記乳酸菌が、ワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、及びロイコノストック属よりなる群から選択される少なくもと１種の乳酸菌である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記乳酸菌が、ワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・シバリア、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバシラス・サケイ、及びロイコノストック・カーノサムよりなる群から選択される少なくもと１種の乳酸菌である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、及び／又はビフィドバクテリウム・アングラータムである、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項5】
更に、前記第２工程で得られたシクロアストラゲノール含有物からシクロアストラゲノールを単離する工程を含む、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項6】
下記第１工程及び第２工程を経て得られるシクロアストラゲノール含有物：アストラガロシドIVに、アストラガロシドIVのグルコース残基を遊離させる作用を有する乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第１工程、及び
前記第１工程で得られた生成物に、アストラガロシドIVのキシロース残基を遊離させる作用を有するビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させることにより、シクロアストラゲノール含有物を生成させる第２工程。
【請求項7】
請求項６に記載のシクロアストラゲノール含有物、その濃縮物、又はその乾燥物を含む、食品。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物を利用してアストラガロシドIVからシクロアストラゲノールを効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
オウギ（Astragalus membranaceus Bge.）等に含まれているアストラガロシドIV（Astragaloside IV）は、糖尿性腎症の治療や、パーキンソン病等の神経変性疾患の治療等に有効であることが報告されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。但し、アストラガロシドIVを経口摂取すると、バイオアベイラビリティーが低いという欠点がある。
【0003】
一方、アストラガロシドIVの代謝産物（アグリコン）の一つであるシクロアストラゲノールは、アストラガロシドIVに比べてバイオアベイラビリティーが10倍程度高いことが知られており、アストラガロシドIVの代謝産物であるシクロアストラゲノールを直接経口摂取することが、生体内でアストラガロシドIVと同薬効を効率的に発揮させ得ると考えられている。
【0004】
従来、バシルス属のLG-502株をアストラガロシドIVに作用させることにより、シクロアストラゲノールを製造できることが報告されている（非特許文献３参照）。しかしながら、非特許文献３のように１種の微生物を用いて単回培養するだけでは、シクロアストラゲノールを効率的に製造できない。このような従来技術を背景として、アストラガロシドIVからシクロアストラゲノールを効率的に製造する方法の確立が切望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Lei Xiao et al., "Astragaloside suppresses apoptosis of the podocytes in rats with diabetic nephropathy via miR-378/TRAF5 signaling pathway", Life Sci. 2018 Aug 1; 206:77-83.
【文献】Xia ML. et a., "Astragaloside IV inhibits astrocyte senescence: implication in Parkinson's disease", J Neuroinflammation. 2020 Apr 6;17(1):105. doi: 10.1186/s12974-020-01791-8.
【文献】Wang L. et al.,"Efficient Biotransformation of Astragaloside IV to Cycloastragenol by Bacillus sp. LG-502", Appl Biochem Biotechnol. 2017 Dec; 183(4):1488-1502.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、微生物を利用してアストラガロシドIVからシクロアストラゲノールを効率的に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、アストラガロシドIVに乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第１工程、及び前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第２工程を経ることにより、アストラガロシドIVが効率的にシクロアストラゲノールに変換されることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【0008】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記第１工程及び第２工程を含む、シクロアストラゲノールの製造方法：
アストラガロシドIVに、乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第１工程、及び
前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第２工程。
項２． 前記乳酸菌が、ワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、及びロイコノストック属よりなる群から選択される少なくもと１種の乳酸菌である、項１に記載の製造方法。
項３． 前記乳酸菌が、ワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・シバリア、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバシラス・サケイ、及びロイコノストック・カーノサムよりなる群から選択される少なくもと１種の乳酸菌である、項１又は２に記載の製造方法。
項４． 前記ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、及び／又はビフィドバクテリウム・アングラータムである、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
項５． 更に、前記第２工程で得られたシクロアストラゲノール含有物からシクロアストラゲノールを単離する工程を含む、項１～４のいずれかに記載の製造方法。
項６． 項１～４のいずれかに記載の製造方法で得られる、シクロアストラゲノール含有物。
項７． 項６に記載のシクロアストラゲノール含有物、その抽出物、その濃縮物、又はその乾燥物を含む、食品。
項１． 下記第１工程及び第２工程を含む、シクロアストラゲノールの製造方法：
アストラガロシドIVに、乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第１工程、及び
前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第２工程。
項２． 前記乳酸菌が、ワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、及びロイコノストック属よりなる群から選択される少なくもと１種の乳酸菌である、項１に記載の製造方法。
項３． 前記乳酸菌が、ワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・シバリア、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバシラス・サケイ、及びロイコノストック・カーノサムよりなる群から選択される少なくもと１種の乳酸菌である、項１又は２に記載の製造方法。
項４． 前記ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、及び／又はビフィドバクテリウム・アングラータムである、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
項５． 更に、前記第２工程で得られたシクロアストラゲノール含有物からシクロアストラゲノールを単離する工程を含む、項１～４のいずれかに記載の製造方法。
項６． 項１～４のいずれかに記載の製造方法で得られる、シクロアストラゲノール含有物。
項７． 項６に記載のシクロアストラゲノール含有物、その抽出物、その濃縮物、又はその乾燥物を含む、食品。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、微生物を利用してアストラガロシドIVからシクロアストラゲノールを効率的に製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】アストラガロシドIVに乳酸菌を作用させた後にビフィズス菌を作用させることにより得られた生成物に含まれるアストラガロシドIV、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体、シクロアストラゲノールのグルコース配糖体、及びシクロアストラゲノールを測定した結果を示す図である。
【図2】アストラガロシドIVに乳酸菌又はビフィズス菌を単独で作用させることにより得られた生成物に含まれるアストラガロシドIV、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体、シクロアストラゲノールのグルコース配糖体、及びシクロアストラゲノールを測定した結果を示す図である。
【図3】アストラガロシドIVに乳酸菌及びビフィズス菌を同時に作用させることにより得られた生成物に含まれるアストラガロシドIV、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体、シクロアストラゲノールのグルコース配糖体、及びシクロアストラゲノールを測定した結果を示す図である。
【図4】アストラガロシドIVにビフィズス菌を作用させた後に乳酸菌を作用させることにより得られた生成物に含まれるアストラガロシドIV、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体、シクロアストラゲノールのグルコース配糖体、及びシクロアストラゲノールを測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
１．シクロアストラゲノールの製造方法
本発明の製造方法は、シクロアストラゲノールの製造方法であって、アストラガロシドIVに乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第１工程、及び前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第２工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の製造方法について、詳述する。
本発明の製造方法は、シクロアストラゲノールの製造方法であって、アストラガロシドIVに乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第１工程、及び前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる第２工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の製造方法について、詳述する。
【0012】
[シクロアストラゲノール]
本発明の製造方法において、製造目的物であるシクロアストラゲノールは、下記一般式（１）で表される化合物である。シクロアストラゲノールは、アストラガロシドIVのアグリコンであり、アストラガロシドIVに比べて経口摂取時のバイオアベイラビリティーが顕著に高いことが知られている化合物である。
本発明の製造方法において、製造目的物であるシクロアストラゲノールは、下記一般式（１）で表される化合物である。シクロアストラゲノールは、アストラガロシドIVのアグリコンであり、アストラガロシドIVに比べて経口摂取時のバイオアベイラビリティーが顕著に高いことが知られている化合物である。
【化1】
【0013】
［第１工程］
第１工程は、アストラガロシドIVに乳酸菌を作用させる工程である。
第１工程は、アストラガロシドIVに乳酸菌を作用させる工程である。
【0014】
・アストラガロシドIV
第１工程では、基質としてアストラガロシドIVを使用する。アストラガロシドIVは、ラノスタン四環トリテルペノイドサポニンの一種であり、下記一般式（２）で表される化合物である。
第１工程では、基質としてアストラガロシドIVを使用する。アストラガロシドIVは、ラノスタン四環トリテルペノイドサポニンの一種であり、下記一般式（２）で表される化合物である。
【化2】
【0015】
第1工程では、アストラガロシドIVの精製品又は粗精製品を使用してもよく、また、アストラガロシドIVを含む植物エキスや、アストラガロシドIVを含む植物原料自体を使用してもよい。
【0016】
アストラガロシドIVはオウギに含まれているので、オウギを溶媒抽出することにより得られたアストラガロシドIV含有エキス、オウギの粉砕物等を基質として使用することができる。
【0017】
・乳酸菌及び／又はその菌体処理物
第1工程で使用される乳酸菌の種類については、特に制限されないが、例えば、ワイセラ属（Weissella）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ルミノコッカス属（Ruminococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）等に属する乳酸菌が挙げられる。
第1工程で使用される乳酸菌の種類については、特に制限されないが、例えば、ワイセラ属（Weissella）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ルミノコッカス属（Ruminococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）等に属する乳酸菌が挙げられる。
【0018】
ワイセラ属乳酸菌として、具体的には、ワイセラ・コンフューサ（W. confusa）、ワイセラ・シバリア（W. cibaria）、ワイセラ・パラメセンテロイデス（W. paramesenteroides）等が挙げられる。
【0019】
ラクトバシラス属乳酸菌として、具体的には、ラクトバシラス・カゼイ（L. casei）、ラクトバシラス・アシドフィラス（L. acidophilus）、ラクトバシラス・アリメンタリウス（L. alimentarius）、ラクトバシラス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバシラス・サケイ（L. sakei）、ラクトバシラス・ラピ（L. rapi）、ラクトバシラス・パラリメンタリウス（L. paralimentarius）、ラクトバシラス・パラカゼイ（L. paracasei）ラクトバシラス・デルブルエッキイー（L. delbrueckii）、ラクトバシラス・プランタラム（L. plantarum）、ラクトバシラス・ポブジヒイ（L. pobuzihii）、ラクトバシラス・マリ（L. mali）、ラクトバシラス・ハムネシイ（L. hammesii）、ラクトバシラス・ヴェルスモリデニス（L. versmoldensis）、ラクトバシラス・パラプランタラム（L. paraplantarum）、ラクトバシラス・パラブフネリ（L. parabuchneri）、ラクトバシラス・ファーメンタム（L. fermentum）、ラクトバシラス・コリニフォルミス（L. coryniformis）、ラクトバシラス・ジョンソニー（L. johnsonii）、ラクトバシラス・ヘルヴェティクス（L. helveticus）、ラクトバシラス・クラストラム（L. crustorum）、ラクトバシラス・ペントーサス（L. pentosus）、ラクトバシラス・ブチネリ（L. buchneri）、ラクトバシラス・ラクティス（L. lactis）、ラクトバシラス・ラムノサス（L. rhamnosus）、ラクトバシラス・ブルガリカス（L. bulgaricus）、ラクトバシラス・ビフィダス（L. bifidus）等が挙げられる。
【0020】
テトラジェノコッカス属乳酸菌として、具体的には、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（T. halophilus）、テトラジェノコッカス・コレエンシス（T. koreensis）等が挙げられる。
【0021】
ロイコノストック属乳酸菌として、具体的には、ロイコノストック・シトレウム（L. citreum）、ロイコノストック・メゼンテロイデス（L. mesenteroides）、ロイコノストック・ラクティス（L. lactis）、ロイコノストック・カーノサム（L. carnosum）、ロイコノストック・デキストラニカム（L. dextranicum）等が挙げられる。
【0022】
ペディオコッカス属乳酸菌として、具体的には、ペディオコッカス・アルジェンチニクス（P. argentinicus）、ペディオコッカス・ペントサセウス（P. pentosaceus）、ペディオコッカス・エタノーリデュランス（P. ethanolidurans）、ペディオコッカス・パルブルス（P. parvulus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（P. acidilactici）等が挙げられる。
【0023】
ルミノコッカス属乳酸菌として、具体的には、ルミノコッカス・プロダクタス（R. productus）等が挙げられる。
【0024】
ストレプトコッカス属乳酸菌として、具体的には、ストレプトコッカス・ファエカリスR（S. faecalis R）、ストレプトコッカス・シトロボラム（S. citrovorum）、ストレプトコッカス・グリセリナセアス（S. glycerinaceus）、ストレプトコッカス・サリバリウス（S. salivarius）等が挙げられる。
【0025】
ラクトコッカス属乳酸菌として、具体的には、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）等が挙げられる。
【0026】
エンテロコッカス属乳酸菌として、具体的には、エンテロコッカス・タイランディカス（E. thailandicus）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）等が挙げられる。
【0027】
より一層効率的にシクロアストラゲノールを製造するという観点から、第1工程で使用される乳酸菌としては、アストラガロシドIVのグルコース残基を遊離させる作用（以下、Ｍ２代謝作用）を有するものが好適に使用でき、とりわけ、Ｍ２代謝作用が、アストラガロシドIVのキシロース残基を遊離させる作用（以下、Ｍ１代謝作用）よりも高いものが特に好適である。
【0028】
Ｍ１代謝作用とＭ２代謝作用は、アストラガロシドIVと乳酸菌とを共存させてインキュベートし、得られた生成物中に、下記一般式（３）で表される化合物と下記一般式（４）で表される化合物の生成量を測定することにより求めることができる。下記一般式（３）で表される化合物はアストラガロシドIVからグルコース残基が脱離したシクロアストラゲノールのキシロース配糖体であり、下記一般式（４）で表される化合物はアストラガロシドIVからキシロース残基が脱離したシクロアストラゲノールのグルコース配糖体である。即ち、アストラガロシドIVと乳酸菌とを共存させてインキュベートし、得られた生成物中に下記一般式（３）で表される化合物の存在が認められる場合には、当該乳酸菌にはＭ２代謝作用があると判定され、また得られた生成物において下記一般式（３）で表される化合物の量が、下記一般式（４）で表される化合物の量よりも多い場合には、Ｍ２代謝作用がＭ１代謝作用よりも高いと判定される。
【化3】
【0029】
本明細書の開示内容に基づけば、当業者であれば、公知のビフィズス菌又は単離された乳酸菌について、Ｍ１代謝作用とＭ２代謝作用を測定し、Ｍ２代謝作用がある乳酸菌、及びＭ２代謝作用がＭ１代謝作用よりも高い乳酸菌を適宜選択することができる。
【0030】
Ｍ２代謝作用がＭ１代謝作用よりも高い乳酸菌の菌株としては、具体的には、ワイセラ・コンフューサ（RD012161、JCM1093、RD012604等）、ワイセラ・シバリア（RD012578、RD011819等）、ワイセラ・パラメセンテロイデス（RD012576等）等のワイセラ属乳酸菌；ラクトバシラス・カゼイ（NBRC 15883等）、ラクトバシラス・アシドフィラス（NBRC13951、NBRC102164等）、ラクトバシラス・アリメンタリウス（RD055252、DSM20249、RD055258等）、ラクトバシラス・ブレビス（RD012087、ATCC14869、RD055271、RD011723、RD055257、RD012582、NBRC3345等）、ラクトバシラス・サケイ（NBRC15893、RD011715、RD011713、RD012596、DSM20017、RD012090等）、ラクトバシラス・ラピ（RD012520等）、ラクトバシラス・パラリメンタリウス（NBRC 107152等）、ラクトバシラス・パラカゼイ（RD055262、JCM8130、RD055272、RD011733、RD011743、RD055282、RD011746、RD055276、NBRC15889等）、ラクトバシラス・デルブルエッキイー（NBRC102622等）、ラクトバシラス・プランタラム（NBRC101973、NBRC106468、NBRC15891等）、ラクトバシラス・ポブジヒイ（RD011765、NBRC103219、RD012653等）、ラクトバシラス・マリ（NBRC102159等）、ラクトバシラス・ハムネシイ（RD011266等）、ラクトバシラス・ヴェルスモリデニス（RD011768等）、ラクトバシラス・パラプランタラム（RD055275、RD055269等）、ラクトバシラス・パラブフネリ（NBRC110708等）、ラクトバシラス・ファーメンタム（NBRC15885等）、ラクトバシラス・コリニフォルミス（RD011738等）、ラクトバシラス・クラストラム（RD055318、RD011724等）、ラクトバシラス・ペントーサス（RD011734、JCM1558、RD055278、RD011825、RD011748、RD055274、RD011741等）、ラクトバシラス・ブチネリ（NBRC107764等）、ラクトバシラス・ラクティス（NBRC107866等）等のラクトバシラス属乳酸菌；テトラジェノコッカス・ハロフィラス（RD012572、IAM1676、NBRC12172、RD011830等）、テトラジェノコッカス・コレエンシス（RD012590等）のテトラジェノコッカス属乳酸菌；ロイコノストック・シトレウム（RD012577、ATCC49370、NBRC102476等）、ロイコノストック・メゼンテロイデス（RD011712、NBRC 3349、RD011716、NBRC100496、RD011740、ATCC8293、RD011798、RD012107等）、ロイコノストック・ラクティス（RD012583、JCM6123等）、ロイコノストック・カーノサム（RD012174等）のロイコノストック属乳酸菌；ペディオコッカス・アルジェンチニクス（NBRC 107827等）、ペディオコッカス・ペントサセウス（NBRC3182、RD012175、DSM20336、RD012523、RD012594等）、ペディオコッカス・エタノーリデュランス（RD011265等）、ペディオコッカス・パルブルス（RD011824、JCM5889等）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（NBRC109619等）のペディオコッカス属乳酸菌；ストレプトコッカス・サリバリウス（RD012113、ATCC7073等）のストレプトコッカス属乳酸菌；ラクトコッカス・ラクティス（RD012601等）のラクトコッカス属乳酸菌；エンテロコッカス・タイランディカス（RD012568、RD012543等）、エンテロコッカス・カセリフラブス（NBRC100478等）のエンテロコッカス属乳酸菌等が挙げられる。本明細書において、菌株番号の前に「RD」及び「NBRC」が付されている菌株は、NBRC（NITE Biological Resource Center）で保管され分譲可能な菌株であり、菌株番号の前に「ATCC」が付されている菌株は、ATCC（American Type Culture Collection）で保管され分譲可能な菌株であり、菌株番号の前に「JCM」が付されている菌株は、JCM（Japan Collection of Microorganism）で保管され分譲可能な菌株である。
【0031】
第１工程で使用される乳酸菌の好適な例として、ワイセラ属乳酸菌、ペディオコッカス属乳酸菌、ラクトバシラス属乳酸菌、ロイコノストック属乳酸菌；より好ましくはワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・シバリア、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバシラス・サケイ、ロイコノストック・カーノサム；更に好ましくはワイセラ・コンフューサ（RD012161）、ワイセラ・シバリア（RD012578）、ペディオコッカス・ペントサセウス（NBRC3182）、ラクトバシラス・サケイ（RD011715）が挙げられる。
【0032】
第１工程では、１種の乳酸菌を単独で使用してもよく、また２種以上の乳酸菌を組み合わせて使用してもよい。
【0033】
第1工程では、乳酸菌は生菌体のまま使用してもよいが、乳酸菌に含まれる酵素が活性を維持していることを限度として、乳酸菌の菌体処理物を使用することもできる。乳酸菌の菌体処理物としては、例えば、乳酸菌の菌体破砕物、乳酸菌の乾燥物（凍結乾燥物、噴霧乾燥物等）等が挙げられる。
【0034】
・アストラガロシドIVに乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させる条件
アストラガロシドIVに乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させるには、媒質中でアストラガロシドIVと乳酸菌及び／又はその菌体処理物を共存させてインキュベートすればよい。
アストラガロシドIVに乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させるには、媒質中でアストラガロシドIVと乳酸菌及び／又はその菌体処理物を共存させてインキュベートすればよい。
【0035】
アストラガロシドIVと乳酸菌及び／又はその菌体処理物を共存させる媒質としては、例えば、緩衝液、培地等が挙げられる。
【0036】
緩衝液としては、具体的には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。また、緩衝液には、必要に応じて、乳酸菌やビフィズス菌の生育に必要な成分が含まれていてもよい。このような成分としては、例えば、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス等の窒素源；グルコース、シュクロース等の炭素源；リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩等の無機塩；ビタミン類；アミノ酸等が挙げられる。
【0037】
培地としては、固体培地又は液体培地のいずれであってもよい。
【0038】
前記媒質のｐＨとしては、例えば、ｐＨ２～９、好ましくはｐＨ３～８、より好ましくは４～７．５が挙げられる。
【0039】
前記媒質におけるアストラガロシドIVの含有量としては、例えば、０．０１重量％以上、好ましくは０．０５～２０重量％、より好ましくは０．１～１重量％が挙げられる。
【0040】
前記媒質１ｇ当たりに添加される乳酸菌及び／又はその菌体処理物の量としては、例えば、乳酸菌の菌数換算で１×１０4ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは１×１０6ｃｆｕ／ｇ以上、より好ましくは１×１０7～１×１０9ｃｆｕ／ｇ、更に好ましくは５×１０7～１×１０8ｃｆｕ／ｇが挙げられる。
【0041】
前記媒質中でアストラガロシドIVと乳酸菌及び／又はその菌体処理物を共存させた状態でインキュベートする際の温度条件としては、例えば、２０～４０℃、好ましくは２５～３７℃が挙げられる。
【0042】
前記媒質中でアストラガロシドIVと乳酸菌及び／又はその菌体処理物を共存させた状態でインキュベートする時間としては、例えば、１２～２００時間、好ましくは２４～９６時間、より好ましくは６０～８５時間が挙げられる。
【0043】
前記媒質中でアストラガロシドIVと乳酸菌及び／又はその菌体処理物を共存させた状態でインキュベートする雰囲気は、好気的条件又は嫌気的条件のいずれであってもよいが、例えば、乳酸菌の生菌を使用する場合であれば、好気的条件が好ましい。
【0044】
斯くしてアストラガロシドIVに乳酸菌及び／又はその菌体処理物を作用させることにより得られた生成物は、後述する第２工程に供される。
【0045】
［第２工程］
第２工程は、前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる工程である。第２工程によって得られる生成物には、シクロアストラゲノールが含まれている。
第２工程は、前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる工程である。第２工程によって得られる生成物には、シクロアストラゲノールが含まれている。
【0046】
・ビフィズス菌及び／又はその菌体処理物
第２工程で使用されるビフィズス菌（Bifidobacterium）の種類については、特に制限されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・ブレーブ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ユニフォルミス（B. uniformis）等が挙げられる。
第２工程で使用されるビフィズス菌（Bifidobacterium）の種類については、特に制限されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・ブレーブ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ユニフォルミス（B. uniformis）等が挙げられる。
【0047】
より一層効率的にシクロアストラゲノールを製造するという観点から、第２工程で使用されるビフィズス菌としては、Ｍ１代謝作用（アストラガロシドIVのキシロース残基を遊離させる作用）を有するものが好適に使用でき、とりわけ、Ｍ１代謝作用が、Ｍ２代謝作用（アストラガロシドIVのグルコース残基を遊離させる作用）よりも高いものが特に好適である。
【0048】
Ｍ１代謝作用とＭ２代謝作用は、アストラガロシドIVとビフィズス菌とを共存させてインキュベートし、得られた生成物中に、前記一般式（３）で表される化合物と前記一般式（４）で表される化合物の生成量を測定することにより求めることができる。即ち、アストラガロシドIVとビフィズス菌とを共存させてインキュベートし、得られた生成物中に下記一般式（４）で表される化合物の存在が認められる場合には、当該ビフィズス菌にはＭ１代謝作用があると判定され、また得られた生成物中において下記一般式（４）で表される化合物の量が、下記一般式（３）で表される化合物の量よりも多い場合には、Ｍ１代謝作用がＭ２代謝作用よりも高いと判定される。
【0049】
本明細書の開示内容に基づけば、当業者であれば、公知のビフィズス菌又は単離されたビフィズス菌について、Ｍ１代謝作用とＭ２代謝作用を測定し、Ｍ１代謝作用があるビフィズス菌、及びＭ１代謝作用がＭ２代謝作用よりも高いビフィズス菌を適宜選択することができる。
【0050】
Ｍ１代謝作用がＭ２代謝作用よりも高いビフィズス菌の菌株としては、具体的には、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（JCM1200、JCM7041等）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（JCM7096等）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（JCM7046等）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（JCM7004等）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（JCM1194等）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（JCM1222等）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（JCM1195等）、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ（JCM12489等）、ビフィドバクテリウム・ブレーブ（JCM7020、JCM1273、JCM1192等）、ビフィドバクテリウム・ユニフォルミス（JCM7020等）が挙げられる。
【0051】
第２工程で使用されるビフィズス菌の好適な例として、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・アングラータム；より好ましくはビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（JCM1200、JCM7041）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（JCM7096）が挙げられる。
【0052】
第２工程では、１種のビフィズス菌を単独で使用してもよく、また２種以上のビフィズス菌を組み合わせて使用してもよい。
【0053】
第２工程では、ビフィズス菌は生菌体のまま使用してもよいが、ビフィズス菌に含まれる酵素が活性を維持していることを限度として、ビフィズス菌の菌体処理物を使用することもできる。ビフィズス菌の菌体処理物としては、例えば、ビフィズス菌の菌体破砕物、乳酸菌の乾燥物（凍結乾燥物、噴霧乾燥物等）等が挙げられる。
【0054】
・第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させる条件
前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させるには、当該生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を添加してインキュベートすればよい。
前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を作用させるには、当該生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を添加してインキュベートすればよい。
【0055】
前記第１工程で得られた生成物には、そのままビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を添加してもよいが、ビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を添加する前に、必要に応じて、加熱殺菌、濃縮、希釈、ｐＨ調整、栄養成分の添加等を行ってもよい。
【0056】
前記第１工程で得られた生成物に添加されるビフィズス菌及び／又はその菌体処理物の量としては、例えば、ビフィズス菌の菌数換算で１×１０4ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは１×１０6ｃｆｕ／ｇ以上、より好ましくは１×１０7～１×１０9ｃｆｕ／ｇ、更に好ましくは５×１０7～１×１０8ｃｆｕ／ｇが挙げられる。
【0057】
前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を添加してインキュベートする際の温度条件としては、例えば、２０～４０℃、好ましくは２５～３７℃が挙げられる。
【0058】
前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を添加してインキュベートする時間としては、例えば、１２～１００時間、好ましくは２４～９６時間、より好ましくは６０～８５時間が挙げられる。
【0059】
前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌及び／又はその菌体処理物を添加してインキュベートする際の雰囲気は、好気的条件又は嫌気的条件のいずれであってもよい。
【0060】
前記第１工程で得られた生成物にビフィズス菌を作用させることにより、シクロアストラゲノールが効率的に生成して蓄積しているシクロアストラゲノール含有物が得られる。
【0061】
２．シクロアストラゲノール含有物
前記製造方法で得られたシクロアストラゲノール含有物は、そのまま、又は必要に応じて、濃縮、抽出、乾燥等の処理に供して、食品や医薬品等に使用することができる。
前記製造方法で得られたシクロアストラゲノール含有物は、そのまま、又は必要に応じて、濃縮、抽出、乾燥等の処理に供して、食品や医薬品等に使用することができる。
【0062】
また、前記製造方法で得られたシクロアストラゲノール含有物からシクロアストラゲノールを単離することにより、シクロアストラゲノールの精製品又は粗精製品を得て、食品、医薬品、試薬等に使用することもできる。
【実施例】
【0063】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0064】
１．菌体ペレットの調製
表１に示す乳酸菌１～４及びビフィズス菌ａ～ｃの各菌体ペレットを以下に示す手法で準備した。なお、各菌体ペレットは、使用直前に調整した。
表１に示す乳酸菌１～４及びビフィズス菌ａ～ｃの各菌体ペレットを以下に示す手法で準備した。なお、各菌体ペレットは、使用直前に調整した。
【0065】
【表1】
【0066】
各菌体のグリセロールストック５０μＬを、既定の濃度より２倍希釈したGAM培地１５ｍＬ中で、３７℃、２４時間、嫌気性条件下で、振とう速度１３０ｒｐｍで培養した。
【0067】
培養液を１５００gで２０分間遠心分離を行い、上澄みをデカントし、菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを、０．８５％の塩化ナトリウム溶液１ｍＬで洗浄し、洗浄液を遠心分離管に移して、更に２００００gで２０分間遠心分離をして、再度、菌体ペレットを得た。
【0068】
２．シクロアストラゲノールの製造
２－１．実施例１～６（乳酸菌、ビフィズス菌の順で作用）
＜第１工程＞
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に表２に示す各乳酸菌ペレットを添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVと乳酸菌とを３７℃、７２時間、振とう速度１３００ｒｐｍにて、好気的条件下でインキュベートし、生成物を得た。
２－１．実施例１～６（乳酸菌、ビフィズス菌の順で作用）
＜第１工程＞
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に表２に示す各乳酸菌ペレットを添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVと乳酸菌とを３７℃、７２時間、振とう速度１３００ｒｐｍにて、好気的条件下でインキュベートし、生成物を得た。
【0069】
＜第２工程＞
得られた生成物に対して、表２に示す各ビフィズス菌ペレットを添加して、３７℃で、７２時間、非通気条件下で静置してインキュベートし、生成物を得た。
得られた生成物に対して、表２に示す各ビフィズス菌ペレットを添加して、３７℃で、７２時間、非通気条件下で静置してインキュベートし、生成物を得た。
【0070】
【表2】
【0071】
２－２．比較例１～７（乳酸菌又はビフィズス菌を単独で作用）
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に表３に示す各乳酸菌又はビフィズス菌ペレットを添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVと乳酸菌又はビフィズス菌とを、振とう速度１３００ｒｐｍにて好気的条件下で、３７℃で７２時間インキュベートし、生成物を得た。
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に表３に示す各乳酸菌又はビフィズス菌ペレットを添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVと乳酸菌又はビフィズス菌とを、振とう速度１３００ｒｐｍにて好気的条件下で、３７℃で７２時間インキュベートし、生成物を得た。
【0072】
【表3】
【0073】
２－３．比較例８～１３（乳酸菌及びビフィズス菌を同時に作用）
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に表４に示す乳酸菌ペレット及びビフィズス菌ペレットを組み合わせて添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVと乳酸菌とビフィズス菌を、振とう速度１３００ｒｐｍにて好気的条件下で、３７℃で７２時間インキュベートし、生成物を得た。
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に表４に示す乳酸菌ペレット及びビフィズス菌ペレットを組み合わせて添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVと乳酸菌とビフィズス菌を、振とう速度１３００ｒｐｍにて好気的条件下で、３７℃で７２時間インキュベートし、生成物を得た。
【0074】
【表4】
【0075】
２－４．比較例１４～２４（ビフィズス菌、乳酸菌の順で作用）
＜第１工程＞
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に表５に示す各ビフィズス菌ペレットを添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVとビフィズス菌とを、振とう速度１３００ｒｐｍにて好気的条件下で、３７℃で７２時間インキュベートし、生成物を得た。
＜第１工程＞
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に表５に示す各ビフィズス菌ペレットを添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVとビフィズス菌とを、振とう速度１３００ｒｐｍにて好気的条件下で、３７℃で７２時間インキュベートし、生成物を得た。
【0076】
＜第２工程＞
得られた生成物に対して、表４に示す各乳酸菌ペレットを添加して、３７℃、７２時間、振とう速度１３００ｒｐｍにて、好気的条件下でインキュベートし、生成物を得た。
得られた生成物に対して、表４に示す各乳酸菌ペレットを添加して、３７℃、７２時間、振とう速度１３００ｒｐｍにて、好気的条件下でインキュベートし、生成物を得た。
【0077】
【表5】
【0078】
３．生成物の組成分析
実施例１～６及び比較例１４～２４の第２工程後に得られた生成物、並びに比較例１～１３で得られた生成物を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物全量に１ｍＬのメタノールを加えてよく混合した後に、固液分離により液体画分を回収した。液体画分をHPLCに供し、アストラガロシドIV（一般式（１））、シクロアストラゲノール（一般式（２））、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体（一般式（３））、及びシクロアストラゲノールのグルコース配糖体（一般式（４））の含量を測定した。なお、ＨＰＬＣの測定条件は次の通りである。
実施例１～６及び比較例１４～２４の第２工程後に得られた生成物、並びに比較例１～１３で得られた生成物を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物全量に１ｍＬのメタノールを加えてよく混合した後に、固液分離により液体画分を回収した。液体画分をHPLCに供し、アストラガロシドIV（一般式（１））、シクロアストラゲノール（一般式（２））、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体（一般式（３））、及びシクロアストラゲノールのグルコース配糖体（一般式（４））の含量を測定した。なお、ＨＰＬＣの測定条件は次の通りである。
【0079】
＜ＨＰＬＣ測定条件＞
機器構成：
インジェクター；株式会社島津製作所 オートサンプラ SIL-10AF
ポンプ等；株式会社島津製作所 オンラインデガッサ DGU-12A
株式会社島津製作所 ポンプ LC-10ADVP
株式会社島津製作所 カラムオーブン CTO-10AVP
株式会社島津製作所 コントローラ SCL-10AVP
検出器；株式会社島津製作所 紫外線検出器 SPD-10AVP
データ処理装置；株式会社島津製作所 LCsolution
カラム：５Ｃ１８－ＡＲ－２（ナカライテスク；4.6 ID x 150 mm）
カラム温度：３５℃
測定波長：２０３ｎｍ
流速：１.５m L／分
移動相：
Ａ；精製水
Ｂ；アセトニトリル
分析条件：
０分～１.５分；Ａ ７０％、Ｂ ３０％
１.５分～８分；Ａ ７０％、Ｂ ３０％～Ａ ２０％、Ｂ ８０％
８分～８．０１分；Ａ ２０％、Ｂ ８０％～Ａ ０％、Ｂ １００％
８．０１分～１２.５分；Ａ ０％、Ｂ １００％
１２.５分～１２.５１分；Ａ ０％、Ｂ １００％～Ａ ２０％、Ｂ ８０％
１２.５１分～１３.０１分；Ａ ２０％、Ｂ ８０％～Ａ ７０％、Ｂ ３０％
１３.０１分～１８分；Ａ ７０％、Ｂ ３０％
機器構成：
インジェクター；株式会社島津製作所 オートサンプラ SIL-10AF
ポンプ等；株式会社島津製作所 オンラインデガッサ DGU-12A
株式会社島津製作所 ポンプ LC-10ADVP
株式会社島津製作所 カラムオーブン CTO-10AVP
株式会社島津製作所 コントローラ SCL-10AVP
検出器；株式会社島津製作所 紫外線検出器 SPD-10AVP
データ処理装置；株式会社島津製作所 LCsolution
カラム：５Ｃ１８－ＡＲ－２（ナカライテスク；4.6 ID x 150 mm）
カラム温度：３５℃
測定波長：２０３ｎｍ
流速：１.５m L／分
移動相：
Ａ；精製水
Ｂ；アセトニトリル
分析条件：
０分～１.５分；Ａ ７０％、Ｂ ３０％
１.５分～８分；Ａ ７０％、Ｂ ３０％～Ａ ２０％、Ｂ ８０％
８分～８．０１分；Ａ ２０％、Ｂ ８０％～Ａ ０％、Ｂ １００％
８．０１分～１２.５分；Ａ ０％、Ｂ １００％
１２.５分～１２.５１分；Ａ ０％、Ｂ １００％～Ａ ２０％、Ｂ ８０％
１２.５１分～１３.０１分；Ａ ２０％、Ｂ ８０％～Ａ ７０％、Ｂ ３０％
１３.０１分～１８分；Ａ ７０％、Ｂ ３０％
【0080】
４．結果
得られた結果を図１～４に示す。アストラガロシドIVに対して、乳酸菌を作用させた後にビフィズス菌を作用させた場合には、格段に多いシクロアストラゲノールの生成量が認められた（実施例１～６）。これに対して、アストラガロシドIVに対して、乳酸菌又はビフィズス菌を単独で作用させた場合では、微量にしかシクロアストラゲノールの生成が認められなかった（比較例１～７）。また、アストラガロシドIVに対して、乳酸菌とビフィズス菌を同時に作用させた場合では、シクロアストラゲノールの生成が殆ど認められなかった（比較例８～１３）。更に、アストラガロシドIVに対して、ビフィズス菌を作用させた後に乳酸菌を作用させた場合でも、シクロアストラゲノールの生成量は少なかった（比較例１４～２４）。
得られた結果を図１～４に示す。アストラガロシドIVに対して、乳酸菌を作用させた後にビフィズス菌を作用させた場合には、格段に多いシクロアストラゲノールの生成量が認められた（実施例１～６）。これに対して、アストラガロシドIVに対して、乳酸菌又はビフィズス菌を単独で作用させた場合では、微量にしかシクロアストラゲノールの生成が認められなかった（比較例１～７）。また、アストラガロシドIVに対して、乳酸菌とビフィズス菌を同時に作用させた場合では、シクロアストラゲノールの生成が殆ど認められなかった（比較例８～１３）。更に、アストラガロシドIVに対して、ビフィズス菌を作用させた後に乳酸菌を作用させた場合でも、シクロアストラゲノールの生成量は少なかった（比較例１４～２４）。
【0081】
以上の結果から、アストラガロシドIVからシクロアストラゲノールを効率的に製造するには、アストラガロシドIVに対して、乳酸菌及びビフィズス菌の順で２段階で微生物を作用させることが有効であることが明らかとなった。
【0082】
参考試験例１
前記試験例１の欄の「１．菌体ペレットの調製」に記載の条件で以下に示す各乳酸菌ペレットを調製した。
＜使用した乳酸菌のリスト＞
ワイセラ・コンフューサ：JCM1093株、RD012604株
ワイセラ・シバリア：RD011819株
ワイセラ・パラメセンテロイデス：RD012576株
ラクトバシラス・カゼイ：NBRC 15883株
ラクトバシラス・アシドフィラス：NBRC13951株、NBRC102164株
ラクトバシラス・アリメンタリウス：RD055252株、DSM20249株、RD055258株
ラクトバシラス・ブレビス：RD012087株、ATCC14869株、RD055271株、RD011723、RD055257株、RD012582株、NBRC3345株
ラクトバシラス・サケイ：NBRC15893株、RD011713株、RD012596株、DSM20017株、RD012090株
ラクトバシラス・ラピ：RD012520株
ラクトバシラス・パラリメンタリウス：NBRC107152株
ラクトバシラス・パラカゼイ：RD055262株、JCM8130株、RD055272株、RD011733株、RD011743株、RD055282株、RD011746株、RD055276株、NBRC1588株
ラクトバシラス・デルブルエッキイー：NBRC102622株
ラクトバシラス・プランタラム：NBRC101973株、NBRC106468株、NBRC15891株
ラクトバシラス・ポブジヒイ：RD011765株、NBRC103219株、RD012653株
ラクトバシラス・マリ：NBRC102159株
ラクトバシラス・ハムネシイ：RD011266株
ラクトバシラス・ヴェルスモリデニス：RD011768株
ラクトバシラス・パラプランタラム：RD055275株、RD055269株
ラクトバシラス・パラブフネリ：NBRC110708株
ラクトバシラス・ファーメンタム：NBRC15885株
ラクトバシラス・コリニフォルミス：RD011738株
ラクトバシラス・クラストラム：RD055318株、RD011724株
ラクトバシラス・ペントーサス：RD011734株、JCM1558株、RD055278株、RD011825株、RD011748株、RD055274株、RD011741株
ラクトバシラス・ブチネリ：NBRC107764株
ラクトバシラス・ラクティス：NBRC107866株
テトラジェノコッカス・ハロフィラス：RD012572株、IAM1676株、NBRC12172株、RD011830株
テトラジェノコッカス・コレエンシス：RD012590株
ロイコノストック・シトレウム：RD012577株、ATCC49370株、NBRC102476株
ロイコノストック・メゼンテロイデス：RD011712株、NBRC3349株、RD011716株、NBRC100496株、RD011740株、ATCC8293株、RD011798株、RD012107株
ロイコノストック・ラクティス：RD012583株、JCM6123株
ロイコノストック・カーノサム：RD012174株
ペディオコッカス・アルジェンチニクス：NBRC107827株
ペディオコッカス・ペントサセウス：RD012175株、DSM20336株、RD012523株、RD012594株
ペディオコッカス・エタノーリデュランス：RD011265株
ペディオコッカス・パルブルス：RD011824株、JCM5889株
ペディオコッカス・アシディラクティシ：NBRC109619株
ストレプトコッカス・サリバリウス：RD012113株、ATCC7073株
ラクトコッカス・ラクティス：RD012601株
エンテロコッカス・タイランディカス：RD012568株、RD012543株
エンテロコッカス・カセリフラブス：NBRC100478株
前記試験例１の欄の「１．菌体ペレットの調製」に記載の条件で以下に示す各乳酸菌ペレットを調製した。
＜使用した乳酸菌のリスト＞
ワイセラ・コンフューサ：JCM1093株、RD012604株
ワイセラ・シバリア：RD011819株
ワイセラ・パラメセンテロイデス：RD012576株
ラクトバシラス・カゼイ：NBRC 15883株
ラクトバシラス・アシドフィラス：NBRC13951株、NBRC102164株
ラクトバシラス・アリメンタリウス：RD055252株、DSM20249株、RD055258株
ラクトバシラス・ブレビス：RD012087株、ATCC14869株、RD055271株、RD011723、RD055257株、RD012582株、NBRC3345株
ラクトバシラス・サケイ：NBRC15893株、RD011713株、RD012596株、DSM20017株、RD012090株
ラクトバシラス・ラピ：RD012520株
ラクトバシラス・パラリメンタリウス：NBRC107152株
ラクトバシラス・パラカゼイ：RD055262株、JCM8130株、RD055272株、RD011733株、RD011743株、RD055282株、RD011746株、RD055276株、NBRC1588株
ラクトバシラス・デルブルエッキイー：NBRC102622株
ラクトバシラス・プランタラム：NBRC101973株、NBRC106468株、NBRC15891株
ラクトバシラス・ポブジヒイ：RD011765株、NBRC103219株、RD012653株
ラクトバシラス・マリ：NBRC102159株
ラクトバシラス・ハムネシイ：RD011266株
ラクトバシラス・ヴェルスモリデニス：RD011768株
ラクトバシラス・パラプランタラム：RD055275株、RD055269株
ラクトバシラス・パラブフネリ：NBRC110708株
ラクトバシラス・ファーメンタム：NBRC15885株
ラクトバシラス・コリニフォルミス：RD011738株
ラクトバシラス・クラストラム：RD055318株、RD011724株
ラクトバシラス・ペントーサス：RD011734株、JCM1558株、RD055278株、RD011825株、RD011748株、RD055274株、RD011741株
ラクトバシラス・ブチネリ：NBRC107764株
ラクトバシラス・ラクティス：NBRC107866株
テトラジェノコッカス・ハロフィラス：RD012572株、IAM1676株、NBRC12172株、RD011830株
テトラジェノコッカス・コレエンシス：RD012590株
ロイコノストック・シトレウム：RD012577株、ATCC49370株、NBRC102476株
ロイコノストック・メゼンテロイデス：RD011712株、NBRC3349株、RD011716株、NBRC100496株、RD011740株、ATCC8293株、RD011798株、RD012107株
ロイコノストック・ラクティス：RD012583株、JCM6123株
ロイコノストック・カーノサム：RD012174株
ペディオコッカス・アルジェンチニクス：NBRC107827株
ペディオコッカス・ペントサセウス：RD012175株、DSM20336株、RD012523株、RD012594株
ペディオコッカス・エタノーリデュランス：RD011265株
ペディオコッカス・パルブルス：RD011824株、JCM5889株
ペディオコッカス・アシディラクティシ：NBRC109619株
ストレプトコッカス・サリバリウス：RD012113株、ATCC7073株
ラクトコッカス・ラクティス：RD012601株
エンテロコッカス・タイランディカス：RD012568株、RD012543株
エンテロコッカス・カセリフラブス：NBRC100478株
【0083】
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に各乳酸菌ペレットを添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVと乳酸菌を３７℃、振とう速度１３００ｒｐｍにて好気的条件下で７２時間インキュベートし、生成物を得た。得られた生成物について、前記試験例１の欄の「３．生成物の組成分析」に記載の条件でアストラガロシドIV、シクロアストラゲノール、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体、及びシクロアストラゲノールのグルコース配糖体の含量を測定した。
【0084】
その結果、前記各乳酸菌は、いずれも、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体の含量が、シクロアストラゲノールのグルコース配糖体の含量よりも多く、Ｍ２代謝作用がＭ１代謝作用よりも高いことが確認された。
【0085】
参考試験例２
前記試験例１の欄の「１．菌体ペレットの調製」に記載の条件で以下に示す各ビフィズス菌ペレットを調製した。
＜使用した各ビフィズス菌のリスト＞
ビフィドバクテリウム・アドレセンティス：JCM7046株
ビフィドバクテリウム・ビフィダム：JCM7004株
ビフィドバクテリウム・カテヌラツム：JCM1194株
ビフィドバクテリウム・ロンガム：JCM1222株
ビフィドバクテリウム・デンティウム：JCM1195株
ビフィドバクテリウム・スカルドビイ：JCM12489株
ビフィドバクテリウム・ブレーブ：JCM7020株、JCM1273株、JCM119株
ビフィドバクテリウム・ユニフォルミス：JCM7020株
前記試験例１の欄の「１．菌体ペレットの調製」に記載の条件で以下に示す各ビフィズス菌ペレットを調製した。
＜使用した各ビフィズス菌のリスト＞
ビフィドバクテリウム・アドレセンティス：JCM7046株
ビフィドバクテリウム・ビフィダム：JCM7004株
ビフィドバクテリウム・カテヌラツム：JCM1194株
ビフィドバクテリウム・ロンガム：JCM1222株
ビフィドバクテリウム・デンティウム：JCM1195株
ビフィドバクテリウム・スカルドビイ：JCM12489株
ビフィドバクテリウム・ブレーブ：JCM7020株、JCM1273株、JCM119株
ビフィドバクテリウム・ユニフォルミス：JCM7020株
【0086】
ｐＨ６．５、濃度０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液０．７mＬと、アストラガロシドIVを１５ｍｇ／ｍＬ含むDMSO溶液１３.３μＬとを混合し、混合液に各ビフィズス菌ペレットを添加して、緩衝液中にてアストラガロシドIVとビフィズス菌とを３７℃で、７２時間、非通気条件下で静置してインキュベートし、生成物を得た。得られた生成物について、前記試験例１の欄の「３．生成物の組成分析」に記載の条件でアストラガロシドIV、シクロアストラゲノール、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体、及びシクロアストラゲノールのグルコース配糖体の含量を測定した。
【0087】
その結果、前記各ビフィズス菌は、いずれも、シクロアストラゲノールのグルコース配糖体の含量が、シクロアストラゲノールのキシロース配糖体の含量よりも多く、Ｍ１代謝作用がＭ２代謝作用よりも高いことが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
