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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-18
(45)【発行日】2025-06-26
(54)【発明の名称】リステリア感染症の予防又は改善剤
(51)【国際特許分類】
A61K 35/74 20150101AFI20250619BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20250619BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20250619BHJP
【ＦＩ】
A61K35/74 G
A61P31/04
A23L33/135
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021093258
(22)【出願日】2021-06-02
(65)【公開番号】P2022185516
(43)【公開日】2022-12-14
【審査請求日】2024-03-28
(73)【特許権者】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】赤津 友基
(72)【発明者】
【氏名】藤井 明彦
(72)【発明者】
【氏名】河野 早和子
(72)【発明者】
【氏名】峯岸 慶彦
【審査官】新熊 忠信
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－０６９９６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－００００３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１６２４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－１６９１９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Barth KR et al.，Biochemical and genomic analysis of the denitrification pathway within the genus Neisseria，Microbiology，2009年，Vol.155, No.12，pp.4093-4103，DOI:10.1099/mic.0.032961-0
【文献】Backlund,C J et al.，Antibacterial efficacy of exogenous nitric oxide on periodontalpathogens， Journal of dental research，Vol.93, No.11，2014年，pp.1089-94，DOI:10.1177/0022034514529974
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
Ａ６１Ｐ ３１／００
Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤であって、菌体培養物が、ナイセリア・ムコサの培養液に、ポルフィロモナス・ジンジヴァリスの培養上清を添加して培養し、菌体及び培地成分を除去したＥＰＳ含有培養物である、剤。
【請求項2】
ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善剤であって、菌体培養物が、ナイセリア・ムコサの培養液に、ポルフィロモナス・ジンジヴァリスの培養上清を添加して培養し、菌体及び培地成分を除去したＥＰＳ含有培養物である、剤。
【請求項3】
ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制用食品であって、菌体培養物が、ナイセリア・ムコサの培養液に、ポルフィロモナス・ジンジヴァリスの培養上清を添加して培養し、菌体及び培地成分を除去したＥＰＳ含有培養物である、食品。
【請求項4】
ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善用食品であって、菌体培養物が、ナイセリア・ムコサの培養液に、ポルフィロモナス・ジンジヴァリスの培養上清を添加して培養し、菌体及び培地成分を除去したＥＰＳ含有培養物である、食品。
【請求項5】
リステリア菌がリステリア・モノサイトゲネスである、請求項２記載の剤又は請求項４記載の食品。
【請求項6】
リステリア・モノサイトゲネスが薬剤耐性リステリア・モノサイトゲネスである、請求項１若しくは５記載の剤、又は請求項３若しくは５記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リステリア感染症の予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【0002】
リステリア感染症（リステリア症）は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）により引き起こされる感染症で、食中毒の一種である。日本での発生数は少ないが、症状の重篤さと致死率の高さから公衆衛生上の重要な疾患とされる。
ヒトでは、感染動物や汚染された食物の摂取により経口感染するが、細菌性食中毒にある典型的な急性胃腸炎症状は通常示さないことが特徴である。リステリア・モノサイトゲネスは腸管上皮細胞の上皮バリアを突破でき（非特許文献１）、腸から血液に入り全身に拡散する。病型は、ヒトでは髄膜炎が最も多く、次いで敗血症、胎児敗血症性肉芽腫症、髄膜脳炎が挙げられ、妊婦では子宮などへの感染もみられる。
ヒトでは、感染動物や汚染された食物の摂取により経口感染するが、細菌性食中毒にある典型的な急性胃腸炎症状は通常示さないことが特徴である。リステリア・モノサイトゲネスは腸管上皮細胞の上皮バリアを突破でき（非特許文献１）、腸から血液に入り全身に拡散する。病型は、ヒトでは髄膜炎が最も多く、次いで敗血症、胎児敗血症性肉芽腫症、髄膜脳炎が挙げられ、妊婦では子宮などへの感染もみられる。
【0003】
ヒトにおけるリステリア感染の初期ではペニシリン系抗生物質、特にアンピシリンが有効とされている。テトラサイクリン系抗生物質、ゲンタマイシンなども有効であるが、セフェム系抗生物質は効果が無い。
【0004】
一方、ナイセリア・ムコサ、ナイセリア・シッカ、ナイセリア・フラバ、ナイセリア・サブフラバ、ナイセリア・フラべセンス、ナイセリア・エロンガータ等のナイセリア属細菌は、口腔内における非病原性の常在菌としてその存在が知られているが、それらの機能については明らかとなっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Drolia R, Tenguria S, Durkes AC, Turner JR, Bhunia AK. Listeria Adhesion Protein Induces Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction for Bacterial Translocation. Cell Host Microbe. 2018 Apr 11;23(4):470-484.e7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、リステリア・モノサイトゲネスによる感染を抑制し、リステリア感染症の予防又は改善に有用な素材を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、非病原性の口腔常在菌として知られるナイセリア・ムコサの菌体培養物が、リステリア・モノサイトゲネスによる細胞感染を抑制し、リステリア感染症の予防又は治療剤として有用であることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は、以下の１）～４）に係るものである。
１）ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤。
２）ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善剤。
３）ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制用食品。
４）ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善用食品。
１）ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤。
２）ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善剤。
３）ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制用食品。
４）ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善用食品。
【発明の効果】
【0009】
本発明のナイセリア・ムコサは、非病原性の口腔常在菌であることから、健常者はもとより、老齢者、病後の人でも長期間に亘って摂取可能な、リステリア感染症の予防又は改善剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ナイセリア・ムコサ菌体培養物のリステリア・モノサイトゲネスに対する感染阻害効果。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明において用いられるナイセリア・ムコサ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｕｃｏｓａ）は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）科ナイセリア属に属するグラム陰性球菌であり、非病原性の口腔常在菌である。
ナイセリア・ムコサは、ヒトの唾液や歯垢等から単離することができる。また、ＪＣＭより入手（ナイセリア・ムコサ ＪＣＭ１２９９２株（ＡＴＣＣ１９６９６株））することができる。
ナイセリア・ムコサは、ヒトの唾液や歯垢等から単離することができる。また、ＪＣＭより入手（ナイセリア・ムコサ ＪＣＭ１２９９２株（ＡＴＣＣ１９６９６株））することができる。
【0012】
本発明において、ナイセリア・ムコサの「菌体培養物」としては、培地成分、菌体及び菌体外高分子物質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ；ＥＰＳ）等を含む培養物の他、培養物から培地成分を除去した菌体及びＥＰＳを含む培養物、培養物から菌体を除去した培地成分及びＥＰＳを含む培養物、又は培養物から培地成分と菌体を除去したＥＰＳを含む培養物等が挙げられる。
ナイセリア・ムコサの菌体培養物に含まれる「菌体」としては、ナイセリア・ムコサの生菌体、湿潤菌体、乾燥菌体のいずれでもよい。また、生菌体のみならず死菌体であってもよい。また、菌体には、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分等の菌体成分も包含される。 本発明の菌体培養物は、所望により凍結乾燥粉末、噴霧乾燥粉末、液体への懸濁等、使用目的に応じて任意の形態に調製することができる。
ナイセリア・ムコサの菌体培養物に含まれる「菌体」としては、ナイセリア・ムコサの生菌体、湿潤菌体、乾燥菌体のいずれでもよい。また、生菌体のみならず死菌体であってもよい。また、菌体には、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分等の菌体成分も包含される。 本発明の菌体培養物は、所望により凍結乾燥粉末、噴霧乾燥粉末、液体への懸濁等、使用目的に応じて任意の形態に調製することができる。
【0013】
本発明のナイセリア・ムコサを培養する培地には、栄養源として、ペプトン等を含んでいるものであれば特に限定されず、例えば、ＢＨＩ培地（日本ＢＤ社製）等を例示することができる。
培養方法は、ナイセリア・ムコサの菌体が良好に生育する条件であれば、特に制限はないが、例えば２０～４０℃、好ましくは３５～３８℃で、好気条件下、より好ましくはＣＯ２濃度５％下若しくは微好気条件下で１６～７２時間、培養することが挙げられる。
培養方法は、ナイセリア・ムコサの菌体が良好に生育する条件であれば、特に制限はないが、例えば２０～４０℃、好ましくは３５～３８℃で、好気条件下、より好ましくはＣＯ２濃度５％下若しくは微好気条件下で１６～７２時間、培養することが挙げられる。
【0014】
なお、本発明において、ナイセリア・ムコサの菌体培養物を用いる場合、ナイセリア・ムコサの培養は、歯周病原菌（例えば、ポルフィロモナス・ジンジヴァリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、タネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ）、セレノモナス・スプチゲナ（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ）等）の培養上清、好ましくはポルフィロモナス・ジンジヴァリスを嫌気存在下で培養し、得られた培養液から遠心分離等により菌体を除去して得られる培養上清を添加した。添加後の培養方法は、ＥＰＳが十分量産生される条件であれば、特に制限はないが、ＥＰＳ産生の観点から２０～４０℃が好ましく、さらに３５～３８℃がより好ましく、好気条件下、より好ましくはＣＯ２濃度５％下若しくは微好気条件下で２４時間以上行われるのが好ましい。
また、ＥＰＳ中にポルフィロモナス・ジンジヴァリス菌体及び菌体破砕物の混入を防ぐという観点から、培養上清をフィルター滅菌等で滅菌した後に添加し、３５～３８℃、ＣＯ２濃度５％下若しくは微好気条件下で２４時間以上行われるのがより好ましい。
歯周病原菌の培養上清の添加量は、ＥＰＳ産生誘導効果の観点から０．０５ｖ／ｖ％以上、更に０．５ｖ／ｖ％以上、更に５ｖ／ｖ％以上であるのが好ましく、また、ＥＰＳ回収量の観点から、５０ｖ／ｖ％以下、更に３０ｖ／ｖ％以下、更に１０ｖ／ｖ％以下であるのが好ましい。
また、ＥＰＳ中にポルフィロモナス・ジンジヴァリス菌体及び菌体破砕物の混入を防ぐという観点から、培養上清をフィルター滅菌等で滅菌した後に添加し、３５～３８℃、ＣＯ２濃度５％下若しくは微好気条件下で２４時間以上行われるのがより好ましい。
歯周病原菌の培養上清の添加量は、ＥＰＳ産生誘導効果の観点から０．０５ｖ／ｖ％以上、更に０．５ｖ／ｖ％以上、更に５ｖ／ｖ％以上であるのが好ましく、また、ＥＰＳ回収量の観点から、５０ｖ／ｖ％以下、更に３０ｖ／ｖ％以下、更に１０ｖ／ｖ％以下であるのが好ましい。
【0015】
後記実施例に示すように、ナイセリア・ムコサの菌体培養物は、リステリア・モノサイトゲネスのＨｅＬａ細胞への感染阻害効果を有する。
従って、ナイセリア・ムコサの菌体培養物はリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤、リステリア感染症の予防又は改善剤となり得、ナイセリア・ムコサの菌体培養物はリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤、リステリア感染症の予防又は改善剤を製造するために使用できる。
また、ナイセリア・ムコサの菌体培養物は、リステリア・モノサイトゲネス感染を抑制するため、リステリア感染症を予防又は改善するために使用できる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物、両生類、及び軟骨魚類が挙げられ、非ヒト哺乳動物としては、例えば類人猿、その他霊長類、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ハムスター、及びコンパニオン動物等が挙げられる。
従って、ナイセリア・ムコサの菌体培養物はリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤、リステリア感染症の予防又は改善剤となり得、ナイセリア・ムコサの菌体培養物はリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤、リステリア感染症の予防又は改善剤を製造するために使用できる。
また、ナイセリア・ムコサの菌体培養物は、リステリア・モノサイトゲネス感染を抑制するため、リステリア感染症を予防又は改善するために使用できる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物、両生類、及び軟骨魚類が挙げられ、非ヒト哺乳動物としては、例えば類人猿、その他霊長類、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ハムスター、及びコンパニオン動物等が挙げられる。
【0016】
本発明において、「リステリア感染症」とは、主としてリステリア・モノサイトゲネスによってひき起こされる感染症を意味する。その病態は感染部位によって様々である。感染の初期は、消化器系の症状よりも風邪症候群に類似した症状を起こすことが多く、倦怠感、発熱、頭痛、悪寒、嘔吐などの症状がおきる。重症になると、髄膜炎、髄膜脳炎、敗血症を起こす。
本発明において、リステリア・モノサイトゲネスとは、グラム陽性桿菌であるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを意味し、薬剤耐性のリステリア・モノサイトゲネスを包含する。
また、「リステリア・モノサイトゲネス感染抑制」とは、リステリア・モノサイトゲネスの動物細胞への感染を抑制することを意味し、感染阻害を包含する。
本発明において、リステリア・モノサイトゲネスとは、グラム陽性桿菌であるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを意味し、薬剤耐性のリステリア・モノサイトゲネスを包含する。
また、「リステリア・モノサイトゲネス感染抑制」とは、リステリア・モノサイトゲネスの動物細胞への感染を抑制することを意味し、感染阻害を包含する。
【0017】
本発明において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延を意味し、所謂「治療」の概念が包含される。
また、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延を意味し、所謂「治療」の概念が包含される。
【0018】
本発明のリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤、リステリア感染症の予防又は改善剤は、それ自体で、リステリア・モノサイトゲネス感染抑制のため、リステリア感染症の予防又は改善のための医薬品、医薬部外品、食品となり、また当該医薬品、医薬部外品、食品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。
なお、食品には、リステリア感染症の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが包含される。
なお、食品には、リステリア感染症の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが包含される。
【0019】
医薬品（医薬部外品を含む）として用いる場合の形態としては経口投与及び非経口投与の何れであってもよいが、経口投与の形態が好ましく、その剤型は、例えば、液剤；錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレット等の固形剤；或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤、口腔用スプレー、トローチ等の様々な形態が挙げられる。非経口投与のための剤型としては、外用、経皮、経粘膜、貼付、経鼻、経腸、坐剤、注射、吸入等の各製剤が挙げられる。このような種々の剤型の医薬製剤は、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の作用を妨げない範囲で、他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
【0020】
食品として用いる場合の形態としては、果汁又は野菜汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、発酵乳、発酵果汁、発酵野菜汁、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料や、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ジャム、パン、ガム、飴、スープ類、漬物、佃煮等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）のサプリメント等が挙げられる。当該食品は、ナイセリア・ムコサの菌体培養物を、任意の食品材料、若しくは他の有効成分、又は食品に許容される添加物（例えば溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、酸味料、甘味料、苦味料、ｐＨ調整剤、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、固着剤、分散剤、流動性改善剤、湿潤剤、香科、調味料、風味調整剤等）等と適宜組み合わせて、定法に従って調製することができる。
【0021】
上記医薬品（医薬部外品を含む）又は食品へのナイセリア・ムコサの菌体培養物の含有量は、特に限定されないが、一日投与量等に合わせて適宜調節すれば良い。
【0022】
上記医薬品（医薬部外品を含む）又は食品において、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができるが、例えば、成人一人、一日当たり、凍結乾燥させた場合の乾燥重量として好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは５００ｍｇ以上、且つ、好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは２５００ｍｇ以下、さらに好ましくは１０００ｍｇ以下が挙げられる。
【0023】
本発明のリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤、リステリア・モノサイトゲネス感染抑制用食品、リステリア感染症の予防又は改善剤、リステリア感染症の予防又は改善用食品の投与又は摂取対象としては、好ましくはリステリア感染症を発症しているヒト、リステリア感染症の発症予防を望むヒト等が挙げられる。
【0024】
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤。
＜２＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善剤。
＜３＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制用食品。
＜４＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善用食品。
＜１＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤。
＜２＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善剤。
＜３＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア・モノサイトゲネス感染抑制用食品。
＜４＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を有効成分とするリステリア感染症の予防又は改善用食品。
【0025】
＜５＞リステリア・モノサイトゲネス感染抑制剤を製造するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の使用。
＜６＞リステリア感染症の予防又は改善剤を製造するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の使用。
＜７＞リステリア・モノサイトゲネス感染抑制用食品を製造するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の使用。
＜８＞リステリア感染症の予防又は改善用食品を製造するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の使用。
＜６＞リステリア感染症の予防又は改善剤を製造するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の使用。
＜７＞リステリア・モノサイトゲネス感染抑制用食品を製造するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の使用。
＜８＞リステリア感染症の予防又は改善用食品を製造するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の使用。
【0026】
＜９＞リステリア・モノサイトゲネス感染抑制に使用するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物。
＜１０＞リステリア感染症の予防又は改善に使用するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物。
＜１０＞リステリア感染症の予防又は改善に使用するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物。
【0027】
＜１１＞リステリア・モノサイトゲネス感染を抑制するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の非治療的使用。
＜１２＞リステリア感染症を予防又は改善するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の非治療的使用。
＜１２＞リステリア感染症を予防又は改善するための、ナイセリア・ムコサの菌体培養物の非治療的使用。
【0028】
＜１３＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するリステリア・モノサイトゲネス感染抑制方法。
＜１４＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するリステリア感染症の予防又は改善方法。
＜１４＞ナイセリア・ムコサの菌体培養物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するリステリア感染症の予防又は改善方法。
【0029】
＜１５＞＜２＞、＜４＞、＜６＞、＜８＞、＜１０＞、＜１２＞及び＜１４＞において、リステリア感染はリステリア・モノサイトゲネスによる感染である。
＜１６＞＜１＞、＜３＞、＜５＞、＜７＞、＜９＞、＜１１＞、＜１３＞及び＜１５＞において、リステリア・モノサイトゲネスは薬剤耐性リステリア・モノサイトゲネスである。
＜１７＞＜１＞～＜１４＞において、菌体培養物は、好ましくは、ナイセリア・ムコサの培養液に、ポルフィロモナス・ジンジヴァリスの培養上清を添加して培養した培養物であるか、又はナイセリア・ムコサの培養液に、ポルフィロモナス・ジンジヴァリスの培養上清を添加して培養し、菌体及び培地成分を除去したＥＰＳ含有培養物である。
＜１６＞＜１＞、＜３＞、＜５＞、＜７＞、＜９＞、＜１１＞、＜１３＞及び＜１５＞において、リステリア・モノサイトゲネスは薬剤耐性リステリア・モノサイトゲネスである。
＜１７＞＜１＞～＜１４＞において、菌体培養物は、好ましくは、ナイセリア・ムコサの培養液に、ポルフィロモナス・ジンジヴァリスの培養上清を添加して培養した培養物であるか、又はナイセリア・ムコサの培養液に、ポルフィロモナス・ジンジヴァリスの培養上清を添加して培養し、菌体及び培地成分を除去したＥＰＳ含有培養物である。
【実施例】
【0030】
実施例１ ナイセリア・ムコサの菌体培養物のリステリア・モノサイトゲネス感染に対する阻害効果
（１）細胞培養条件
ＨｅＬａ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０ｖ／ｖ％ＦＢＳ，１ｖ／ｖ％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％にてＨｅＬａ細胞を培養した。
（１）細胞培養条件
ＨｅＬａ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０ｖ／ｖ％ＦＢＳ，１ｖ／ｖ％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％にてＨｅＬａ細胞を培養した。
【0031】
（２）細菌培養条件
使用したリステリア・モノサイトゲネス及びナイセリア・ムコサは国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソース研究センターより入手した（表１）。いずれの細菌もコロニー培養はＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）Ａｇａｒ培地（日本ベクトンディッキンソン（以下、日本ＢＤ））を用い、液体培養はＢＨＩ培地（日本ＢＤ）を用いて培養を行った。リステリア・モノサイトゲネスは温度３７℃で好気培養し、ナイセリア・ムコサは温度３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で培養した。
リステリア・モノサイトゲネスは２４時間液体培養した後に、１，０００倍希釈でさらに２４時間液体培養した菌体を使用し、ナイセリア・ムコサは２４時間液体培養した後に、１００倍希釈でさらに４８時間液体培養した菌体を使用した。
使用したリステリア・モノサイトゲネス及びナイセリア・ムコサは国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソース研究センターより入手した（表１）。いずれの細菌もコロニー培養はＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）Ａｇａｒ培地（日本ベクトンディッキンソン（以下、日本ＢＤ））を用い、液体培養はＢＨＩ培地（日本ＢＤ）を用いて培養を行った。リステリア・モノサイトゲネスは温度３７℃で好気培養し、ナイセリア・ムコサは温度３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で培養した。
リステリア・モノサイトゲネスは２４時間液体培養した後に、１，０００倍希釈でさらに２４時間液体培養した菌体を使用し、ナイセリア・ムコサは２４時間液体培養した後に、１００倍希釈でさらに４８時間液体培養した菌体を使用した。
【0032】
【表1】
【0033】
（３）ナイセリア・ムコサ菌体培養物の調製
ナイセリア・ムコサはＢＨＩ培地３００ｍＬを用いて温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で４８時間培養することで、培養液を準備した。
ナイセリア・ムコサ培養液に、終濃度５ｖ／ｖ％となるように調製したポルフィロモナス・ジンジヴァリス培養上清を添加し、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で４８時間培養した後に、培養液２０ｍＬを５０ｍＬ ｔｕｂｅに回収した。
なお、ポルフィロモナス・ジンジヴァリス培養上清は、ＡＴＣＣより入手したポルフィロモナス・ジンジヴァリス（ＡＴＣＣ ３３２７７株）をアネロコロンビア寒天培地（日本ＢＤ）上で３７℃、嫌気条件で２４時間以上培養することで生えてきたコロニーを、ＧＡＭブイヨン培地（日水製薬，５．０μｇ／ｍＬ Ｈｅｍｉｎ，１７．４μｇ／ｍＬ Ｋ２ＨＰＯ４，１．０μｇ／ｍＬ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ含有）に懸濁し、同様に３７℃、嫌気条件で２４時間培養することで得られた液体培養液を、新しいＧＡＭブイヨン培地に終濃度１ｖ／ｖ％で添加し、嫌気条件下、３７℃、２４時間の培養後に得られた培養液を１３，０００ｇ、４℃、１５分間の遠心分離して菌体を除去し、上清画分を０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌することにより調製した。
ポルフィロモナス・ジンジヴァリス培養上清を添加して培養したナイセリア・ムコサの培養液から培地成分を除去するために１６，０００ｇ、４℃、３０分間の遠心分離の後に上清を捨て、超純水を２０ｍＬ添加、ボルテックスで激しく懸濁して洗浄した。この洗浄を６回繰り返した。洗浄後、同様に遠心分離を行い、沈殿した菌体・ＥＰＳを含む菌体培養物を超純水に分散させ、超音波処理を行った。超音波処理は、ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ １５０を使用し、パワー４、破砕２０秒→冷却２０秒を５セットの条件で超音波処理後、１６，０００ｇ、４℃、３０分間にて菌体を沈殿させ、上清を新しい５０ｍＬ ｔｕｂｅへ回収した。
菌体を完全に除去するため、回収した上清を再度１６，０００ｇ、４℃、３０分の遠心分離を行い、上清を回収した。
回収した上清を凍結乾燥することで、菌体及び培地成分を除去し、ＥＰＳを含むナイセリア・ムコサの菌体培養物を得た。
ナイセリア・ムコサはＢＨＩ培地３００ｍＬを用いて温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で４８時間培養することで、培養液を準備した。
ナイセリア・ムコサ培養液に、終濃度５ｖ／ｖ％となるように調製したポルフィロモナス・ジンジヴァリス培養上清を添加し、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で４８時間培養した後に、培養液２０ｍＬを５０ｍＬ ｔｕｂｅに回収した。
なお、ポルフィロモナス・ジンジヴァリス培養上清は、ＡＴＣＣより入手したポルフィロモナス・ジンジヴァリス（ＡＴＣＣ ３３２７７株）をアネロコロンビア寒天培地（日本ＢＤ）上で３７℃、嫌気条件で２４時間以上培養することで生えてきたコロニーを、ＧＡＭブイヨン培地（日水製薬，５．０μｇ／ｍＬ Ｈｅｍｉｎ，１７．４μｇ／ｍＬ Ｋ２ＨＰＯ４，１．０μｇ／ｍＬ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ含有）に懸濁し、同様に３７℃、嫌気条件で２４時間培養することで得られた液体培養液を、新しいＧＡＭブイヨン培地に終濃度１ｖ／ｖ％で添加し、嫌気条件下、３７℃、２４時間の培養後に得られた培養液を１３，０００ｇ、４℃、１５分間の遠心分離して菌体を除去し、上清画分を０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌することにより調製した。
ポルフィロモナス・ジンジヴァリス培養上清を添加して培養したナイセリア・ムコサの培養液から培地成分を除去するために１６，０００ｇ、４℃、３０分間の遠心分離の後に上清を捨て、超純水を２０ｍＬ添加、ボルテックスで激しく懸濁して洗浄した。この洗浄を６回繰り返した。洗浄後、同様に遠心分離を行い、沈殿した菌体・ＥＰＳを含む菌体培養物を超純水に分散させ、超音波処理を行った。超音波処理は、ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ １５０を使用し、パワー４、破砕２０秒→冷却２０秒を５セットの条件で超音波処理後、１６，０００ｇ、４℃、３０分間にて菌体を沈殿させ、上清を新しい５０ｍＬ ｔｕｂｅへ回収した。
菌体を完全に除去するため、回収した上清を再度１６，０００ｇ、４℃、３０分の遠心分離を行い、上清を回収した。
回収した上清を凍結乾燥することで、菌体及び培地成分を除去し、ＥＰＳを含むナイセリア・ムコサの菌体培養物を得た。
【0034】
（４）試薬
標識試薬であるＣａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）は同仁化学より購入しＤＭＳＯに溶解後、終濃度１０μＭで用いた。
標識試薬であるＣａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）は同仁化学より購入しＤＭＳＯに溶解後、終濃度１０μＭで用いた。
【0035】
（５）菌体の蛍光標識方法
リステリア・モノサイトゲネス培養液を２２℃、４，５００ｇ、１０分間の遠心を行い沈殿した菌体を回収した。回収した菌体は、ＰＢＳ（－）、続いてＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）を用いて２２℃、４，５００ｇ、５分間の遠心で洗浄後、ＯＤ６００＝２．０に調整し、１０μＭ ＣＦＳＥ溶液（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で３７℃、暗所下で３０分間インキュベートし、蛍光標識を行った。蛍光標識した菌体をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）を用いて２２℃、４，５００ｇ、５分間の遠心で２回洗浄後、菌体懸濁液の濁度を調整することでＣＦＳＥ標識された菌体溶液を作製した。
リステリア・モノサイトゲネス培養液を２２℃、４，５００ｇ、１０分間の遠心を行い沈殿した菌体を回収した。回収した菌体は、ＰＢＳ（－）、続いてＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）を用いて２２℃、４，５００ｇ、５分間の遠心で洗浄後、ＯＤ６００＝２．０に調整し、１０μＭ ＣＦＳＥ溶液（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で３７℃、暗所下で３０分間インキュベートし、蛍光標識を行った。蛍光標識した菌体をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）を用いて２２℃、４，５００ｇ、５分間の遠心で２回洗浄後、菌体懸濁液の濁度を調整することでＣＦＳＥ標識された菌体溶液を作製した。
【0036】
（６）感染方法
１２ウェルプレートにコンフルエントとなったＨｅＬａ細胞から培地を除去後、ＰＢＳ（－）を用いて洗浄した。（３）で調製したナイセリア・ムコサの菌体培養物は、評価時に終濃度０．００６２５ｗ／ｖ％、０．０２５ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％となるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）に溶解して評価培地とした。ＣＦＳＥ標識菌体はＭｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）＝５００で細胞に感染されるようＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、各濃度のナイセリア・ムコサ菌体培養物含有培地で２時間共培養することにより細胞へと感染させた。
ナイセリア・ムコサ菌体培養物のリステリア・モノサイトゲネスに対する感染阻害効果を図１に示す。
１２ウェルプレートにコンフルエントとなったＨｅＬａ細胞から培地を除去後、ＰＢＳ（－）を用いて洗浄した。（３）で調製したナイセリア・ムコサの菌体培養物は、評価時に終濃度０．００６２５ｗ／ｖ％、０．０２５ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％となるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）に溶解して評価培地とした。ＣＦＳＥ標識菌体はＭｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）＝５００で細胞に感染されるようＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、各濃度のナイセリア・ムコサ菌体培養物含有培地で２時間共培養することにより細胞へと感染させた。
ナイセリア・ムコサ菌体培養物のリステリア・モノサイトゲネスに対する感染阻害効果を図１に示す。
【0037】
（７）感染細胞の解析方法
ＣＦＳＥ標識されたリステリア・モノサイトゲネスを感染させたＨｅＬａ細胞から培地を除去し、ＰＢＳ（－）を用いて２回洗浄した後に、４００μＬ ０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて感染細胞を剥離した。７５０μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０ｖ／ｖ％ＦＢＳ）を添加し、溶液全量を１．５ｍＬ ｔｕｂｅに回収後、４℃、４００ｇ、５分間の遠心を行うことで感染細胞を回収した。上清を捨て、４００μＬの４％ パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（Ｗａｋｏ）を加えてピペッティングし、４℃にて１０分間固定処理を行った。８００μＬ ＰＢＳ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２ｖ／ｖ％ＦＢＳ）を加えてピペッティング後、４℃、６００ｇ、５分間の遠心を行い、２００μＬ ＰＢＳ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２ｖ／ｖ％ＦＢＳ）に懸濁することで、解析サンプルとした。
解析には、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＢＤ，ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ）を使用した。ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ），ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳＣ）に基づいてｇａｔｉｎｇした細胞２０，０００個のＦＩＴＣ ｃｈａｎｎｅｌで得られる蛍光強度からＭｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）を算出し、蛍光標識したリステリア・モノサイトゲネスが付着・感染した細胞を検出することで細胞感染能を評価した。結果を図１に示す。
ＣＦＳＥ標識されたリステリア・モノサイトゲネスを感染させたＨｅＬａ細胞から培地を除去し、ＰＢＳ（－）を用いて２回洗浄した後に、４００μＬ ０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて感染細胞を剥離した。７５０μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０ｖ／ｖ％ＦＢＳ）を添加し、溶液全量を１．５ｍＬ ｔｕｂｅに回収後、４℃、４００ｇ、５分間の遠心を行うことで感染細胞を回収した。上清を捨て、４００μＬの４％ パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（Ｗａｋｏ）を加えてピペッティングし、４℃にて１０分間固定処理を行った。８００μＬ ＰＢＳ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２ｖ／ｖ％ＦＢＳ）を加えてピペッティング後、４℃、６００ｇ、５分間の遠心を行い、２００μＬ ＰＢＳ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２ｖ／ｖ％ＦＢＳ）に懸濁することで、解析サンプルとした。
解析には、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＢＤ，ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ）を使用した。ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ），ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳＣ）に基づいてｇａｔｉｎｇした細胞２０，０００個のＦＩＴＣ ｃｈａｎｎｅｌで得られる蛍光強度からＭｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）を算出し、蛍光標識したリステリア・モノサイトゲネスが付着・感染した細胞を検出することで細胞感染能を評価した。結果を図１に示す。
【0038】
（８）統計解析
得られた結果は、各サンプルのＭＦＩをドットで示すとともに、各群の平均値±標準偏差（Ｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ （ＳＤ））を棒グラフで表した。平均値の差の検定は、統計解析ソフトＳＰＳＳ（ＩＢＭ）を用いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを行い、Ｐ値が０．０５未満（＊ｐ＜０．０５）の場合は、統計学的有意な差とした。
得られた結果は、各サンプルのＭＦＩをドットで示すとともに、各群の平均値±標準偏差（Ｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ （ＳＤ））を棒グラフで表した。平均値の差の検定は、統計解析ソフトＳＰＳＳ（ＩＢＭ）を用いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを行い、Ｐ値が０．０５未満（＊ｐ＜０．０５）の場合は、統計学的有意な差とした。
【0039】
（９）結果
細胞感染能の評価において、ナイセリア・ムコサの菌体培養物を溶解していない対照（０）と比較して、ナイセリア・ムコサの菌体培養物を溶解させた群（終濃度０．００６２５ｗ／ｖ％（０．００６２５％）、０．０２５ｗ／ｖ％（０．０２５％）、及び０．１ｗ／ｖ％（０．１％））でＭｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（細胞感染能）の低下が認められた（図１）。
細胞感染能の評価において、ナイセリア・ムコサの菌体培養物を溶解していない対照（０）と比較して、ナイセリア・ムコサの菌体培養物を溶解させた群（終濃度０．００６２５ｗ／ｖ％（０．００６２５％）、０．０２５ｗ／ｖ％（０．０２５％）、及び０．１ｗ／ｖ％（０．１％））でＭｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（細胞感染能）の低下が認められた（図１）。
【図1】
