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特許7723405菌株、その使用方法、菌株を含む食品または飲料、および菌株を選抜する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-08-05
(45)【発行日】2025-08-14
(54)【発明の名称】菌株、その使用方法、菌株を含む食品または飲料、および菌株を選抜する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20250806BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20250806BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20250806BHJP
C12Q 1/04 20060101ALN20250806BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
A23L33/135
C12Q1/02
C12Q1/04
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021140313
(22)【出願日】2021-08-30
(65)【公開番号】P2023034197
(43)【公開日】2023-03-13
【審査請求日】2024-03-22
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03490
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03491
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03492
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03493
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03494
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】須志田 浩稔
(72)【発明者】
【氏名】木元 広実
【審査官】手島 理
(56)【参考文献】
【文献】特開２００７－２３６３４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－２３６６０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Systematic and Applied Microbiology，2016年，Vol. 39，p. 562-570
【文献】Journal of Dairy Research，2009年，Vol. 76，p. 418-425
【文献】Aquaculture，2020年08月28日，Vol. 531，735878，p. 1-10
【文献】Milk Science，2012年，Vol. 61, No. 3，p. 217-228
【文献】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2020年，Vol. 70，p. 2782,2815,2816,2827
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ２３Ｌ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ａ６０株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９０）、もしくは４－４４株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９４）、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｄ０２株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９１）、またはＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ４－３６株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９２）、もしくは４－４３（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９３）である菌株。
【請求項2】
３℃以上４０℃以下の温度において抗菌活性およびムチン付着性を有する、請求項１に記載の菌株。
【請求項3】
３℃以上３０℃以下の温度において抗菌活性を有する、請求項１または２に記載の菌株。
【請求項4】
３℃以上、１０℃以下の温度において抗菌活性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項5】
耐塩性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項6】
胆汁耐酸性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項7】
低ｐＨ耐性を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項8】
食品に由来する、請求項１～７のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の菌株のプロバイオティクス用途への使用方法。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか１項に記載の菌株を含む食品または飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は菌株、その使用方法、菌株を含む食品または飲料、および菌株を選抜する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
乳酸菌はヨーグルトなどの乳製品または漬物などの製造において重要な役割を果たしているが、バクテリオシン（抗菌性を示すペプチド）などを産生する乳酸菌については、食品保存のためのバイオオプリザベーションにも活用されている。さらに、乳酸菌は、近年では代表的なプロバイオティクス（適量摂取で宿主に有益な働きをもたらす生きた微生物）としても知られている。プロバイオティクスによる整腸作用は、プロバイオティクスから産生される抗菌物質により腸内の病原菌の増殖を抑制することがそのメカニズムの一つである。抗菌作用を有する乳酸菌株については数多くの報告があり、例えば特許文献１には抗菌物質を産生する乳酸菌株が開示されている。
【0003】
また、消化管への付着性も乳酸菌がプロバイオティクスとして利用する上で重要な性質とされ、プロバイオティクス選抜の際の指標の一つとなっている。例えば、消化管粘膜に付着することにより乳酸菌の消化管への定着力が向上する。また、ピロリ菌やサルモネラ菌の感染は大きな問題であるが、消化管上皮細胞へのこれら病原菌の付着が、消化管付着性をもつ乳酸菌との競合により阻害される可能性がある。これまでに乳酸菌の消化管ムチン（粘性糖タンパク質）への付着性についても多くの報告があり、例えば特許文献２にはムチンへの付着性をもつ乳酸菌が開示されている。
【0004】
しかし、これまでの報告の多くは、抗菌性および消化管付着性のどちらかの機能を有する乳酸菌の選抜が主であった。このため、プロバイオティクスとして用いる場合に効果を得るためには複数の菌株を混合して使用することが必要となる場合があった。複数の乳酸菌を混合して使用する場合、それぞれの菌株の増殖の速さ、および代謝産物などの影響により、どちらか一方の菌株の増殖が阻害される場合があり、混合培養の条件検討が必要になる。このような条件下、混合培養の労力を軽減し、効率よく乳酸菌を利用するため、２つの機能を兼ね備えた乳酸菌株が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２００５－１９２５５３号公報
【文献】国際公開２００８／００１６７６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の一態様は、抗菌作用および消化管付着性の両方を有する菌株を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る菌株は、３℃以上４０℃以下の温度において抗菌活性およびムチン付着性を有する、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのいずれかの種に属する菌株である。
【0008】
また、上記課題を解決するために、本発明の一態様に係る菌株の選抜方法は、食品に由来する菌株から、抗菌活性、ムチン付着性、耐塩性、消化管ストレス耐性を有する、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのいずれかの種に属する菌株を選抜する方法である。
【発明の効果】
【0009】
本発明の一態様によれば、抗菌作用および消化管への付着性の両方を有する菌株を実現することをできる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
〔菌株〕
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。本実施形態に係る菌株は、抗菌活性およびムチン付着性を有する菌株である。また、本実施形態に係る菌株は、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ（以下、Ｌ． ｓａｋｅｉ）、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ（以下、Ｌ． ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ（以下、Ｌ. ｃｕｒｖａｔｕｓ）のいずれかの種に属する菌株である。
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。本実施形態に係る菌株は、抗菌活性およびムチン付着性を有する菌株である。また、本実施形態に係る菌株は、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ（以下、Ｌ． ｓａｋｅｉ）、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ（以下、Ｌ． ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ（以下、Ｌ. ｃｕｒｖａｔｕｓ）のいずれかの種に属する菌株である。
【0012】
本発明者は鋭意研究の結果、Ｌ. ｓａｋｅｉ、Ｌ． ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬ. ｃｕｒｖａｔｕｓのいずれかの種に属する菌株の中に、抗菌活性およびムチン付着性を有する菌株が存在することを発見した。これらの菌種は、プロバイオティクスとしての利用例が少ない菌種であった。
【0013】
これまで、プロバイオティクスの多くは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉなどのヒトの腸管由来の乳酸菌、または、プロバイオティクスを含む食品として主流であるヨーグルトおよびチーズなどの製造に用いられるたね菌（スターター）を対象に、研究開発が進められてきた。このため、ヒトの腸管から分離されることが稀であり、かつ、乳の発酵性が弱く乳製品のスターターへの利用性が乏しいＬ． ｓａｋｅｉなどの菌株は、プロバイオティクスとして評価が進んでいなかった。さらに、Ｌ． ｓａｋｅｉなどの菌種の主な分離源は、発酵ソーセージおよび漬物などであるが、これらの食品はスターターを使わず自然発生的な発酵で作られることが多く、これらの食品に係るスターターの菌株の開発は遅れていた。このため、Ｌ． ｓａｋｅｉなどの本実施形態に係る菌種は、プロバイオティクスとしての利用可能性についての知見は乏しかった。
【0014】
例えば、特表２００７－５０２８５８には、抗菌活性およびムチンへの付着性を保有する乳酸菌種が示されているが、Ｌ． ｓａｋｅｉ、Ｌ． ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬ． ｃｕｒｖａｔｕｓはいずれも一切開示されていない。
【0015】
また、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．７６：４１８－４２５においては、Ｌ． ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ ＣＲＢ７株の抗菌スペクトルが調べられているが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などに対する抗菌活性は調べられていない。さらに、ＣＲＢ７株は動物由来の乳酸菌であり、至適温度３７℃の培養温度のみで抗菌活性およびムチン付着性が調べられている。このため、培養温度が異なる場合においても抗菌活性を有するかは不明であり、乳酸菌が利用される際の条件または環境（漬物や発酵肉製品などの製造および保存；低温環境、塩濃度が高い環境など）を想定したこれらの機能性が最適化される培養条件の検討もなされていない。このため、ＣＲＢ７株は食品製造分野で抗菌活性を発揮し、かつ、動物の体内でプロバイオティクスとして用いるには課題のある菌株であった。
【0016】
本実施形態に係る菌株は、３℃以上４０℃以下の幅広い温度において、抗菌活性を示すため、培養温度が限定されない。さらに、後述する通り、本実施形態に係る菌株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などに対する抗菌活性を有するため、食品製造および保存の際の有用微生物として、かつ、対象の腸内で効果を発揮するプロバイオティクスとして好適に用いることができる。なお、本明細書において「対象」とは、特に限定がなければ、菌株またはその抽出物を投与された対象、または摂取した対象を指す。
【0017】
本実施形態において、「抗菌活性」とは、食中毒を引き起こす有害な菌（以下、「食中毒菌」と称する）、食品変敗菌、および／または病原菌に対する増殖阻害作用を指す。このため、菌株が抗菌活性を有することで、対象の腸内環境の改善および食品変敗、食中毒の防止が可能となる。
【0018】
食中毒菌および／または食品変敗菌は、特に限定されないが、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｉｓ、およびＳｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどが挙げられる。
【0019】
病原菌は特に限定されないが、例えば、サルモネラ属菌、および日和見感染に関係する腸球菌などがあげられる。
【0020】
抗菌活性は従来公知の方法に従って評価してもよい。例えば、菌株の培養液を２倍ごと段階希釈に供し、食中毒菌の培養において阻止円が形成される最大の希釈濃度２ｎを求めて、上清１ｍＬあたりの抗菌活性値を（ｎ＋１）＊１００／ｍＬと定義して評価してもよい。この場合、抗菌活性値は、少なくとも一種の食中毒菌に対して、１００以上であることが好ましく、６００以上であることがより好ましく、１２００以上であることがさらに好ましい。菌株の抗菌活性値が当該範囲内であることで、菌株を食品の製造時に用いた場合に抗菌活性を発揮して、食中毒または食品の変敗を予防する効果が期待できる。また、対象が菌株を経口摂取した場合、腸内において抗菌活性を発揮して、病原菌の生育を阻害するため整腸作用を奏することが期待できる。
【0021】
本実施形態に係る菌株は、３℃以上４０℃以下の幅広い温度において、ムチン付着性を有する。これにより、本実施形態に係る菌株が対象に摂取された後の様々な段階において、そのムチン付着性を発揮できる。具体的には、３０℃以下の温度において、本実施形態に係る菌株がムチン付着性を有することで、食品製造の場で培養した菌株が、対象に経口摂取された直後から対象の消化管内でムチン付着性を示すことが期待できる。さらに、３７℃以上の温度においてムチン付着性を有することで、対象の腸管内で増殖した菌株が腸管に付着することが可能となる。
【0022】
本実施形態において、「ムチン付着性」とは、菌株のムチンに対して付着する性質を示す。菌株がムチン付着性を有することで、当該菌株の消化管への定着および病原菌の定着の阻害が期待できる。ムチン付着性は従来公知の方法に従って評価してもよい。
【0023】
例えば、ムチン付着性は、ムチンに付着した菌株を任意の染色液によって染色して、定量評価することができる。例えばクリスタルバイオレット溶液によってブタ胃ムチンに付着した菌株を染色して、波長５９５ｎｍにおける吸光度で定量してもよい。任意の陽性対照株と比較して、同等またはそれ以上のムチン付着性を有していることが認められれば、ムチン付着性を有していると判断できる。菌株が当該範囲内にあることで、対象が菌株を経口摂取した際においても、菌株が消化管に定着することが期待できる。
【0024】
ここで、本実施形態において、「同等」とは、本実施形態の菌株の機能に係る任意の値が、任意の基準値と比較した場合に、有意な差がないことを指す。本実施形態の菌株および陽性対照株の任意の機能に係る値を、統計的に検定して有意差がないと判断できる場合に、「同等である」と評価してもよい。例えば、ｔ検定を用いて有意差の有無を判断する場合、ｐ≧０．０５であれば有意差がなく「同等である」と判断できる。
【0025】
抗菌活性およびムチン付着性を有する菌株は、単一の菌株を用いた場合であっても、プロバイオティクス用途に用いた際に、食中毒の発生防止作用、食品変敗防止作用ならびに対象の腸内での抗菌活性および競合による腸内病原菌の増殖の抑制による整腸作用を発揮することができる。
また、混合培養を行う場合においても、本実施形態の抗菌活性およびムチン付着性を有する菌株を用いることで、混合培養の際に追加して用いる菌株の数を減らすことができるため、条件検討が容易になる。
また、混合培養を行う場合においても、本実施形態の抗菌活性およびムチン付着性を有する菌株を用いることで、混合培養の際に追加して用いる菌株の数を減らすことができるため、条件検討が容易になる。
【0026】
〔様々な培養条件に対する菌株の耐性〕
従来、有効なプロバイオティクスとして分離源が動物由来のラクトバチルス属の乳酸菌やビフィズス菌が広く使われている。これらの細菌は、概して培養条件が厳しいため、通常は一律の培養条件（培養温度３７℃および乳酸菌培養用のＭＲＳ培地の使用など）において培養して用いられている。一方で、プロバイオティクスを経口摂取する際には、ヨーグルトなどの乳製品のほか、漬物または発酵肉製品のような発酵食品も利用される。これらの製造条件において、製造温度が常温または低温の場合、および／または、食塩濃度が高い場合がある。このため、とりわけ発酵食品に菌株を利用する場合においては、製造時の条件に近い培養条件が菌株の機能性に与える影響を調べ、機能性を検討してから実施する必要がある。すなわち、前述の抗菌活性およびムチン付着性の２つの機能性を有しており、さらに、幅広い生育温度域および高い耐塩性を有する乳酸菌が特に好ましい。
従来、有効なプロバイオティクスとして分離源が動物由来のラクトバチルス属の乳酸菌やビフィズス菌が広く使われている。これらの細菌は、概して培養条件が厳しいため、通常は一律の培養条件（培養温度３７℃および乳酸菌培養用のＭＲＳ培地の使用など）において培養して用いられている。一方で、プロバイオティクスを経口摂取する際には、ヨーグルトなどの乳製品のほか、漬物または発酵肉製品のような発酵食品も利用される。これらの製造条件において、製造温度が常温または低温の場合、および／または、食塩濃度が高い場合がある。このため、とりわけ発酵食品に菌株を利用する場合においては、製造時の条件に近い培養条件が菌株の機能性に与える影響を調べ、機能性を検討してから実施する必要がある。すなわち、前述の抗菌活性およびムチン付着性の２つの機能性を有しており、さらに、幅広い生育温度域および高い耐塩性を有する乳酸菌が特に好ましい。
【0027】
（生育温度領域）
本発明の一実施形態において、菌株は３℃以上３０℃以下の温度で培養した場合であっても抗菌活性を示す菌株であってもよい。本発明者は一般的な培養温度の３７℃よりも低い温度であっても、本実施形態の菌株は生育し、さらに抗菌活性を示すことを見出した。幅広い生育温度領域を有しており、かつ抗菌活性およびムチン付着性の２つの機能性を有している菌株は、食品製造および／または保存の段階で、抗菌活性の発揮によって食中毒または食品変敗を予防することができ、加えて、経口摂取によって生体内でムチンへの付着性および抗菌活性を発揮して整腸作用を発揮することができる。
本発明の一実施形態において、菌株は３℃以上３０℃以下の温度で培養した場合であっても抗菌活性を示す菌株であってもよい。本発明者は一般的な培養温度の３７℃よりも低い温度であっても、本実施形態の菌株は生育し、さらに抗菌活性を示すことを見出した。幅広い生育温度領域を有しており、かつ抗菌活性およびムチン付着性の２つの機能性を有している菌株は、食品製造および／または保存の段階で、抗菌活性の発揮によって食中毒または食品変敗を予防することができ、加えて、経口摂取によって生体内でムチンへの付着性および抗菌活性を発揮して整腸作用を発揮することができる。
【0028】
さらに本発明者らは、本実施形態に係る菌株の生育の至適条件が３０℃付近の温度であり、抗菌活性の至適温度が２５℃付近の温度であり、菌株の生育と抗菌活性との至適温度が異なることを見出した。このため、菌株に由来する抗菌物質を抽出して用いる場合には、抗菌物質の抽出効率を向上するために、本実施形態の菌株を２０℃以上３０℃以下の温度で培養してもよい。
【0029】
また、本実施形態の菌株の生育至適温度および抗菌活性産生至適温度が異なることが明らかとなったことで、効率的な発酵または微生物汚染の防止などの製造過程の要求に応じて行う条件検討を、温度条件によって行うことが可能となった。
本発明の一実施形態において、菌株は３℃以上、１０℃以下の温度で培養した場合であっても抗菌活性を示す菌株であってもよい。当該温度においても抗菌活性を示す乳酸菌株は、冷蔵保存する際にも抗菌活性を発揮するため、食品の冷蔵保存時においても食中毒菌または食品変敗菌の増殖を抑えるという効果が得られる。
本発明の一実施形態において、菌株は３℃以上、１０℃以下の温度で培養した場合であっても抗菌活性を示す菌株であってもよい。当該温度においても抗菌活性を示す乳酸菌株は、冷蔵保存する際にも抗菌活性を発揮するため、食品の冷蔵保存時においても食中毒菌または食品変敗菌の増殖を抑えるという効果が得られる。
【0030】
本発明の一実施形態において、菌株は３０℃以上、４０℃以下の温度で培養した場合において抗菌活性およびムチンへの付着性を有していてもよい。当該温度において抗菌活性およびムチン付着性を有する菌株は、腸内での抗菌物質産生および競合による病原菌の腸上皮への付着阻害によって、病原菌の増殖抑制を期待できる。
【0031】
（菌株の耐塩性）
本発明の一実施形態において、菌株は耐塩性を有する菌株であってもよい。本実施形態において、「耐塩性」とは、食塩を含む培地においても生育できる特性のことを指す。食塩を含む培地とは、食塩を含んでいればその濃度は特に限定されないが、例えば、３％（ｗ／ｖ）以上の食塩を含んでいる培地であってもよい。
本発明の一実施形態において、菌株は耐塩性を有する菌株であってもよい。本実施形態において、「耐塩性」とは、食塩を含む培地においても生育できる特性のことを指す。食塩を含む培地とは、食塩を含んでいればその濃度は特に限定されないが、例えば、３％（ｗ／ｖ）以上の食塩を含んでいる培地であってもよい。
【0032】
菌株の耐塩性は、菌株の生育に影響を与えない培地の食塩濃度によって評価してもよい。例えば、菌株は、３％（ｗ／ｖ）以上の食塩濃度に対して耐性を有していてもよく、６％（ｗ／ｖ）以上の食塩濃度に対して耐性を有していることが好ましい。ここで、耐性を「有する」とは、生育が可能であることを指す。耐塩性を有する菌株は、塩分の高い食品などにも好適に使用できる。特に、食塩濃度が６％（ｗ／ｖ）の環境下で菌株が生育する性質は、発酵ソーセージなどの発酵食品のスターターに必須な性質である。
【0033】
さらに、本実施形態の菌株は、高い食塩濃度の培地で培養しても、ムチン付着性を損なわないことが好ましい。本発明者らは、一部の菌株においては塩濃度の高い培地において培養した場合により高いムチン付着性を有することがあることを見出した。このような菌株は特に好ましく発酵食品のスターターとして用いることができる。
【0034】
耐塩性を有する菌株は、塩分の高い食品に含ませて用いることができる。塩分の高い食品とは、例えば、ソーセージ、漬物などの発酵食品、および味噌、魚醤などである。
【0035】
〔菌株の消化管ストレス耐性〕
【0036】
本発明の一実施形態において、菌株は消化管ストレス耐性を有していてもよい。消化管ストレス耐性とは、消化管から分泌される消化液に対して耐性を有するという特徴を指す。特に胃酸および胆汁酸に対して耐性を有していることが好ましい。
【0037】
本発明の一実施形態において、菌株は低ｐＨ耐性を有してもよい。本実施形態において、低ｐＨ溶液とは、胃酸を模した溶液であり、典型的にはｐＨ１～３の溶液を指す。また、本実施形態において低ｐＨ耐性とは、低ｐＨ溶液に曝した場合においても菌株が死滅せずに生存する菌株の特性を指す。例えば、ｐＨ２．５の低ｐＨ溶液にて、３７℃で１．５時間保温した後に菌株を寒天上に１～２日間培養した場合に、生菌数が７．０（Log cfu/mL）以上であることが好ましいが、菌株が死滅しない範囲であれば生菌数が７．０（Log cfu/mL）以下であってもよい。また、通常の条件で培養した菌株の生菌数と比較した場合に、低ｐＨ溶液に曝露した条件で培養した菌株の生菌数の減少は少ないことが好ましいが、その減少の範囲は特に限定されない。低ｐＨ耐性を有する菌株は、経口摂取した場合においても、胃で生存できるため、生きたまま腸に到達することが期待できる。
【0038】
さらに、低ｐＨ耐性を向上する目的で、ミルクなどの保護剤の使用および腸易溶性のカプセル化などを行ってもよい。これらを行うことで、より高い低ｐＨ耐性が望まれる場合においても、菌株を用いることができる。
【0039】
本発明の一実施形態において、菌株は胆汁耐酸性を有してもよい。ここで、本実施形態において、胆汁耐酸性とは、胆汁に対する耐性のことを指し、その評価方法は特に限定されない。例えば、胆汁酸を含まない培養液（胆汁酸無添加サンプル）および０．３％胆汁酸を含む培養液（胆汁酸添加サンプル）でそれぞれ培養した場合の菌株の生育に基づき、下記式の胆汁耐酸性（％）として評価してもよい。なお、下記式ＯＤ６２０とは、波長６２０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）で菌数を評価した値である。
【0040】
胆汁酸耐性（％）＝ＯＤ６２０（胆汁酸添加サンプル）/ＯＤ６２０（胆汁酸無添加サンプル）×１００
【0041】
本実施形態の菌株の胆汁耐酸性は、広く流通しているプロバイオティクスと比較して同等またはそれ以上の値であることが好ましい。
【0042】
低ｐＨ耐性および胆汁耐酸性を有する菌株、すなわち消化管ストレス耐性を有する菌株は、対象が経口摂取した場合であっても腸管まで生菌で到達し、腸内で生存できるため、腸内においても菌株の機能を発揮することが期待できる。さらに、本実施形態の菌株はムチン付着性を有しているため、生菌が腸内に定着できる。このため、本実施形態に係る菌株は、整腸作用を好適に得ることができる。
【0043】
（菌株の由来）
本発明の一実施形態において、食品に由来する菌株であってもよい。食品に由来する菌株は、食経験があるため、安全性が高い。
本発明の一実施形態において、食品に由来する菌株であってもよい。食品に由来する菌株は、食経験があるため、安全性が高い。
【0044】
菌株は、例えば、ヨーグルト、漬物、味噌、および魚醤などに由来する菌株であってもよい。
【0045】
さらに、菌株は植物系食品に由来することが好ましい。一般に動物由来の菌株は、３７℃付近が生育の至適温度であることが多い。菌株が植物系食品に由来することにより、至適温度がより低温の菌株を選抜できる可能性が高まる。
【0046】
（菌株の具体例）
本実施形態に係る菌株は、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ａ６０株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９０）、もしくは４－４４株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９４）、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｄ０２株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９１）、またはＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ４－３６株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９２）、もしくは４－４３（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９３）であってもよく、または、これらに基づくプラスミドフリー株もしくは変異体であってもよい。これらの菌株はすべて、抗菌活性およびムチン付着性を有していることに基づいて、本発明者らによって選抜された菌株である。さらに、これらの菌株は、低温高温耐性、耐塩性、低ｐＨ耐性、および胆汁酸耐性を有している。以下、選抜された５つの菌株を選抜菌株と称する。
本実施形態に係る菌株は、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ａ６０株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９０）、もしくは４－４４株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９４）、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｄ０２株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９１）、またはＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ４－３６株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９２）、もしくは４－４３（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９３）であってもよく、または、これらに基づくプラスミドフリー株もしくは変異体であってもよい。これらの菌株はすべて、抗菌活性およびムチン付着性を有していることに基づいて、本発明者らによって選抜された菌株である。さらに、これらの菌株は、低温高温耐性、耐塩性、低ｐＨ耐性、および胆汁酸耐性を有している。以下、選抜された５つの菌株を選抜菌株と称する。
【0047】
選抜菌株は全て食品から分離されたものであり、食経験があるため、食品産業分野で利用され得る。選抜株は５℃から４０℃で培養可能で、一部の菌株は、培養温度が５℃でも抗菌活性を示すことから、食品を低温で保存する条件での利用性が高い。また、選抜菌株が耐塩性、とりわけ食塩濃度６％の環境下で十分な生育を示すことは、発酵ソーセージなどの発酵食品のスターターに必須な性質である。一部の選抜菌株では、食塩を含む培地で培養した場合にムチン付着性が高まることから、特にこの分野での利用が期待される。本実施形態の菌株は、消化管ストレス耐性を有しているため、腸管まで生菌のまま到達できることが期待できる。これにより、腸内への定着が期待できる。さらに消化管ストレス耐性を向上するために、ミルクなどの保護剤の使用および腸易溶性のカプセル化などを行ってもよい。
【0048】
本実施形態の菌株は、３７℃でも抗菌活性とムチンへの付着性が認められるため、腸内で抗菌物質産生および病原菌の腸管上皮への付着阻害による抗菌作用が期待できる。
【0049】
上述の通り、本実施形態の菌株は、食品に由来し、耐塩性、および消化管ストレス耐性を有している。このため、幅広い用途に用いることが可能な菌株である。さらに、菌株は多機能であるため、混合培養を行う場合にも好ましく使用できる。
【0050】
選抜菌株に基づく新たな菌株を作製してもよい。例えば、選抜菌株のプラスミドに抗生物質耐性遺伝子がコードされている場合において、任意の方法によって選抜菌株のプラスミドフリー株を作製して利用してもよい。
【0051】
また、選抜菌株に基づく変異体を作製してもよい。変異体は、選抜菌株のいずれかに基づいて作製されたものであってもよい。変異体の作製方法は特に限定されず、従来公知の方法に基づいて作製すればよい。例えば育種、ゲノム編集などによって、変異体を作製してもよい。
【0052】
なお、本実施形態の選抜菌株は、それぞれ特徴が異なる。それぞれの異なる特徴に基づいて、利用方法を検討してもよい。
【0053】
〔菌株の使用方法〕
（プロバイオティクス用途への使用方法）
本発明の一実施形態において、上述のいずれかの実施形態の菌株のプロバイオティクス用途への使用方法であってもよい。プロバイオティクス用途への使用方法とは、特に限定されないが、典型的にはプロバイオティクスとして菌株を摂取して、腸内に定着させて効果を得ることを目的とする使用方法である。
（プロバイオティクス用途への使用方法）
本発明の一実施形態において、上述のいずれかの実施形態の菌株のプロバイオティクス用途への使用方法であってもよい。プロバイオティクス用途への使用方法とは、特に限定されないが、典型的にはプロバイオティクスとして菌株を摂取して、腸内に定着させて効果を得ることを目的とする使用方法である。
【0054】
例えば、菌株を２０℃以上３０℃以下で培養して、プロバイオティクス用途に使用してもよい。当該培養温度であれば、菌株が抗菌物質を特に産生するため、とりわけ抗菌作用が必要な場合に、好ましく使用できる。
【0055】
（食品または飲料）
本発明の一実施形態において、上述のいずれかの実施形態の菌株を含む食品または飲料であってもよい。食品または飲料は特に限定されないが、例えば、発酵食品、乳製品、漬物などであってもよい。
本発明の一実施形態において、上述のいずれかの実施形態の菌株を含む食品または飲料であってもよい。食品または飲料は特に限定されないが、例えば、発酵食品、乳製品、漬物などであってもよい。
【0056】
〔菌株の選抜方法〕
本発明の一実施形態において、菌株を選抜する方法であって、食品に由来する菌株から、抗菌活性、ムチン付着性、耐塩性、および消化管ストレス耐性を有する、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのいずれかの種に属する菌株を選抜する方法であってもよい。選抜の過程における条件および試験などは適宜に変更して選抜を行ってもよい。
本発明の一実施形態において、菌株を選抜する方法であって、食品に由来する菌株から、抗菌活性、ムチン付着性、耐塩性、および消化管ストレス耐性を有する、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのいずれかの種に属する菌株を選抜する方法であってもよい。選抜の過程における条件および試験などは適宜に変更して選抜を行ってもよい。
【0057】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【0058】
（まとめ）
本発明を以下のように表現することもできる。
本発明を以下のように表現することもできる。
【0059】
本態様１に係る菌株は、３℃以上４０℃以下の温度において抗菌活性およびムチン付着性を有する、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのいずれかの種に属する菌株である。このような菌株は、摂取した際に腸管に定着し、かつ、食品の製造から腸内への定着までの任意の段階において、食中毒菌、食品変敗菌、または病原菌の生育を阻害することができる。
【0060】
本態様２に係る菌株は、態様１において、３℃以上３０℃以下の温度において抗菌活性を示す菌株である。このような菌株は、低温または常温での食品の製造において食中毒菌、および食品変敗菌の増殖を抑えることができる。
【0061】
本態様３に係る菌株は、態様１または２において、３℃以上、１０℃以下の温度において抗菌活性を示す菌株である。このような菌株は、低温での保存においても食中毒菌、および食品変敗菌の増殖を抑えることができる。
【0062】
本態様４に係る菌株は、態様１～３のいずれかにおいて、耐塩性を有する菌株である。このような菌株は、食塩を含む食品に菌株を適用する場合において、好適に用いることができる。
【0063】
本態様５に係る菌株は、態様１～４のいずれかにおいて、胆汁耐酸性を有する菌株である。このような菌株は、消化管ストレス耐性が高まる。
【0064】
本態様６に係る菌株は、態様１～５のいずれかにおいて、低ｐＨ耐性を有する菌株である。このような菌株は、経口摂取した場合においても、腸内に生菌のまま到達できる。
【0065】
本態様７に係る菌株は、態様１～６のいずれかにおいて、食品に由来する菌株である。このような菌株は、食経験があるため、安全性が高い。
【0066】
本態様８に係る菌株は、態様１～７のいずれかにおいて、前記菌株がＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ａ６０株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９０）、もしくは４－４４株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９４）、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｄ０２株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９１）、またはＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ４－３６株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９２）、もしくは４－４３（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９３）である、または、これらに基づくプラスミドフリー株もしくは変異体である。このような菌株は、抗菌活性、ムチン付着性、耐塩性、および消化管ストレス耐性を有しており、食品に由来する新規の菌株である。
【0067】
本態様９に係る菌株は、態様１～８のいずれかの菌株のプロバイオティクス用途への使用方法である。この構成により、菌株によって対象の腸内環境を改善する効果を得ることができる。
【0068】
本態様１０に係る菌株は、態様１～８のいずれかの菌株を含む食品または飲料である。この構成により、対象が菌株を好適に摂取することができる。
【0069】
本態様１１に係る方法は、菌株を選抜する方法であって、食品に由来する菌株から、抗菌活性、ムチン付着性、耐塩性、および消化管ストレス耐性を有する、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのいずれかの種に属する菌株を選抜する方法である。
【0070】
〔実施例〕
＜実施例１：菌株の選抜＞
農研機構が保有する乳酸菌ライブラリー中の２２株を実施例２において詳述する抗菌活性試験に供し、優れた抗菌活性を示す乳酸菌を１６株選抜した。ここで、優れた抗菌活性は、菌株の抗菌活性スペクトルの広さ、および菌株の抗菌活性により阻害される菌種などに基づいて評価した。
＜実施例１：菌株の選抜＞
農研機構が保有する乳酸菌ライブラリー中の２２株を実施例２において詳述する抗菌活性試験に供し、優れた抗菌活性を示す乳酸菌を１６株選抜した。ここで、優れた抗菌活性は、菌株の抗菌活性スペクトルの広さ、および菌株の抗菌活性により阻害される菌種などに基づいて評価した。
【0071】
得られた１６株の菌株の内、食品由来の菌株をさらに選抜したところ、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＬａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのいずれかの種に属する５株の菌株、Ａ６０、Ｄ０２、４－３６、４－４３および４－４４が選抜された。選抜された乳酸菌の種、菌株名、および分離源を下記表１に示す。なお、以下選抜された５株の菌株を「選抜乳酸菌株」と称する。
【表1】
【0072】
後述する実施例３の耐塩性試験の結果より、Ａ６０、Ｄ０２、および４－４４は標準株とは異なる新たな菌株であることが明らかであった。さらに、Ｌ． ｃｕｒｖａｔｕｓをＭＲＳ液体培地に１％（ｖ／ｖ）で接種し、４０℃で２４時間培養した結果より、４－３６および４－４３はどちらも標準株とは異なる新たな菌株であることが明らかであった。Ｌ． ｃｕｒｖａｔｕｓを４０℃で培養した結果、得られた培養液の濁度として測定した波長６２０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６２０）を以下の表２に示す。培養液の濁度は後述する実施例２と同様の条件で測定した。なお、表中、ＪＣＭ １０９６Ｔは、Ｌ． ｃｕｒｖａｔｕｓの標準株である。
【表2】
【0073】
＜実施例２：抗菌活性試験＞
抗菌活性試験において、選抜乳酸菌の検定菌に対する抗菌活性を試験した。
抗菌活性試験において、選抜乳酸菌の検定菌に対する抗菌活性を試験した。
【0074】
（供試菌株）
選抜乳酸菌株はＭＲＳ液体培地において、３０℃で一晩培養した。その後、新たなＭＲＳ液体培地に１％（ｖ／ｖ）で接種し、表２に示す各培養温度条件で試験前の培養を行った。試験前の培養の培養温度条件が２５℃、３０℃または３７℃であった場合は２４時間培養し、５℃であった場合は２週間培養した。培養を終えた選抜乳酸菌株の培養液を供試菌株液の原液として、抗菌活性値の測定に供した。なお、供試菌株液の原液の濁度はＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ２０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ （Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）を用いて測定された波長６２０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６２０）によって評価された。
選抜乳酸菌株はＭＲＳ液体培地において、３０℃で一晩培養した。その後、新たなＭＲＳ液体培地に１％（ｖ／ｖ）で接種し、表２に示す各培養温度条件で試験前の培養を行った。試験前の培養の培養温度条件が２５℃、３０℃または３７℃であった場合は２４時間培養し、５℃であった場合は２週間培養した。培養を終えた選抜乳酸菌株の培養液を供試菌株液の原液として、抗菌活性値の測定に供した。なお、供試菌株液の原液の濁度はＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ２０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ （Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）を用いて測定された波長６２０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６２０）によって評価された。
【0075】
抗菌活性試験のための検定菌株として、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ ５８８５（理化学研究所より入手、以下「ＪＣＭ ５８８５」とも称する）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ ６１２４Ｔ（理化学研究所より入手、以下「ＪＣＭ ６１２４Ｔ」とも称する）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ ＪＣＭ ５８８７Ｔ（理化学研究所より入手、以下「ＪＣＭ ５８８７Ｔ」とも称する）、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ ｓａｋｅｉ ＪＣＭ １１５７Ｔ（理化学研究所より入手、以下「ＪＣＭ １１５７Ｔ」とも称する）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＪＣＭ ２２５７Ｔ（理化学研究所より入手、以下「ＪＣＭ ２２５７Ｔ」とも称する）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＪＣＭ １４６５Ｔ（理化学研究所より入手、以下「ＪＣＭ １４６５Ｔ」とも称する）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＪＣＭ ２５０４Ｔ（理化学研究所より入手、以下「ＪＣＭ ２５０４Ｔ」とも称する）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＪＣＭ ３２８１４Ｔ（理化学研究所より入手、以下「ＪＣＭ ３２８１４Ｔ」とも称する）を用いた。各検定菌はそれぞれ、表２に示す液体培地条件および培養温度で一晩培養し、新たな同じ種類の液体培地に１％（ｖ／ｖ）で接種後、表２に示す培養温度で２０時間培養して、抗菌活性試験用プレートに用いた。ここで、各検定菌の培養温度は、各検定菌の培養における至適温度であった。
【0076】
抗菌活性試験用プレートの作製では、滅菌溶解後５５℃で保温した７ｍＬのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ Ａｇａｒ ＡＯＡＣ（ＬＡＡ）培地、またはＴＳＢ－ＹＥ寒天培地（１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に対して、各検定菌の培養液を１％（ｖ／ｖ）で接種し、１０ｍＬのＭＲＳ寒天（１．５％（ｗ/ｖ）寒天）プレート上に重層後、４０℃で４５分乾固した。
【0077】
各選抜乳酸菌株および検定菌株の培養条件、および各検定菌に用いた試験用培地を下記表３に示す。
【0078】
【表3】
【0079】
（抗菌活性試験）
選抜乳酸菌の培養液（試験液の原液）は０．２５μmのフィルターを用いて滅菌後、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０水溶液を用いて２倍ごとの段階希釈に供し、２０(原液)から２１１倍希釈までの希釈液を調製した。試験液を抗菌活性試験用プレートに１０μＬずつ滴下した後、各検定菌の至適培養温度で一晩培養を行い、検定菌の生育阻害の有無を観察した。表３に示す通り、表２に示す選抜乳酸菌株および検定菌株のすべての組み合わせに対して試験を行った。阻止円が形成している場合は生育阻害が起きており、阻止円が形成していない場合は生育阻害が起きていないと評価した。抗菌活性値は上清１ｍＬあたりの抗菌活性値として（ｎ＋１）＊１００/ｍＬと定義し、各検定菌株に対する各選抜乳酸菌株の抗菌活性値を求めた。ここで、ｎは検定菌の生育阻害が観察された最大の希釈倍率を２ｎと表した時のｎの値である。
選抜乳酸菌の培養液（試験液の原液）は０．２５μmのフィルターを用いて滅菌後、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０水溶液を用いて２倍ごとの段階希釈に供し、２０(原液)から２１１倍希釈までの希釈液を調製した。試験液を抗菌活性試験用プレートに１０μＬずつ滴下した後、各検定菌の至適培養温度で一晩培養を行い、検定菌の生育阻害の有無を観察した。表３に示す通り、表２に示す選抜乳酸菌株および検定菌株のすべての組み合わせに対して試験を行った。阻止円が形成している場合は生育阻害が起きており、阻止円が形成していない場合は生育阻害が起きていないと評価した。抗菌活性値は上清１ｍＬあたりの抗菌活性値として（ｎ＋１）＊１００/ｍＬと定義し、各検定菌株に対する各選抜乳酸菌株の抗菌活性値を求めた。ここで、ｎは検定菌の生育阻害が観察された最大の希釈倍率を２ｎと表した時のｎの値である。
【0080】
抗菌活性試験における抗菌スペクトルを表４および５に示す。表４中、「培養温度」は供試菌株の準備において、ＭＲＳ液体培地に１％（ｖ／ｖ）で接種した後に選抜乳酸菌株を培養した際の培養温度条件であり、ＯＤ６２０は試験液の原液の濁度を表す。
【表4】
【表5】
【0081】
（抗菌活性試験の結果）
表４に示す通り、いずれの選抜乳酸菌株も少なくとも一種の検定菌に対して抗菌活性を有していることがわかった。なお、抗菌活性値は６００以上であれば優れていると判断でき、１２００以上であれば特に優れていると判断できる。
表４に示す通り、いずれの選抜乳酸菌株も少なくとも一種の検定菌に対して抗菌活性を有していることがわかった。なお、抗菌活性値は６００以上であれば優れていると判断でき、１２００以上であれば特に優れていると判断できる。
【0082】
さらに、試験前の培養において、２５℃、３０℃、３７℃を培養温度としたところ、３０℃におけるＯＤ６２０の値が概して高く、選抜乳酸菌株の生育の至適条件であった。一方で、選抜乳酸菌株の抗菌活性値は２５℃で高い傾向があった。
【0083】
表５に示す通り、試験前の培養において、５℃での培養条件においてもＡ６０株、４－３６株、４－４３株は複数の検定菌株に対する抗菌作用を示した。
【0084】
＜実施例３：耐塩性試験＞
（供試菌株）
選抜乳酸菌株および各選抜乳酸菌株の標準株を耐塩性試験の供試菌株として用いた。Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉの標準株としてＪＣＭ １１５７Ｔ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍの標準株としてＪＣＭ １２５３３Ｔ、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓの標準株として、ＪＣＭ １０９６Ｔを用いた。当該標準株はすべて理化学研究所より入手した。
（供試菌株）
選抜乳酸菌株および各選抜乳酸菌株の標準株を耐塩性試験の供試菌株として用いた。Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉの標準株としてＪＣＭ １１５７Ｔ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍの標準株としてＪＣＭ １２５３３Ｔ、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓの標準株として、ＪＣＭ １０９６Ｔを用いた。当該標準株はすべて理化学研究所より入手した。
【0085】
（耐塩性試験）
塩化ナトリウムを３、６、９、１２％（ｗ／ｖ）になるように添加したＭＲＳ液体培地に、選抜乳酸菌および各標準株を一晩培養したＭＲＳ培養液を１％（ｖ／ｖ）でそれぞれ接種し、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、目視にて菌体の生育を判定した。判定結果を表６に示す。表６中、＋は菌体が生育している状態、±は菌体がわずかに生育している状態、－は菌体が全く生育していない状態をそれぞれ示す。
塩化ナトリウムを３、６、９、１２％（ｗ／ｖ）になるように添加したＭＲＳ液体培地に、選抜乳酸菌および各標準株を一晩培養したＭＲＳ培養液を１％（ｖ／ｖ）でそれぞれ接種し、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、目視にて菌体の生育を判定した。判定結果を表６に示す。表６中、＋は菌体が生育している状態、±は菌体がわずかに生育している状態、－は菌体が全く生育していない状態をそれぞれ示す。
【表6】
【0086】
（耐塩性試験の結果）
ＪＣＭ １１５７Ｔは、培地中の食塩濃度が６％の場合に生育できなかったが、Ａ６０菌株および４－４４菌株は培地中の食塩濃度が６％の場合であっても生育し、特に４－４４菌株は食塩濃度が９％であっても生育した。ＪＣＭ １２５３３Ｔは、培地中の食塩濃度が９％の場合に生育できなかったが、Ｄ０２菌株は培地中の食塩濃度が９％であっても生育できた。４－３６菌株および４－４３菌株は、どちらもＪＣＭ １０９６Ｔと同程度の耐塩性を有しており、培地中の食塩濃度が９％であっても生育できた。これらの結果より明らかな通り、選抜乳酸菌株は食塩濃度６％以上である培地中であっても生育することができた。
ＪＣＭ １１５７Ｔは、培地中の食塩濃度が６％の場合に生育できなかったが、Ａ６０菌株および４－４４菌株は培地中の食塩濃度が６％の場合であっても生育し、特に４－４４菌株は食塩濃度が９％であっても生育した。ＪＣＭ １２５３３Ｔは、培地中の食塩濃度が９％の場合に生育できなかったが、Ｄ０２菌株は培地中の食塩濃度が９％であっても生育できた。４－３６菌株および４－４３菌株は、どちらもＪＣＭ １０９６Ｔと同程度の耐塩性を有しており、培地中の食塩濃度が９％であっても生育できた。これらの結果より明らかな通り、選抜乳酸菌株は食塩濃度６％以上である培地中であっても生育することができた。
【0087】
＜実施例４：ムチン付着性試験＞
（測定用ウェルの調製）
ブタ胃ムチン（partially purified type III porcin stomach，Sigma-Aldorich）を０．５～１ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭのｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅバッファー（ｐＨ ９．６）にけん濁し、９６ウェルのイムノマイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一昼夜放置してムチンをウェルに固定した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳにて３７℃で１時間、ブロッキングを行った。
（測定用ウェルの調製）
ブタ胃ムチン（partially purified type III porcin stomach，Sigma-Aldorich）を０．５～１ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭのｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅバッファー（ｐＨ ９．６）にけん濁し、９６ウェルのイムノマイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一昼夜放置してムチンをウェルに固定した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳにて３７℃で１時間、ブロッキングを行った。
【0088】
（測定用サンプルの調製）
選抜乳酸菌株として、実施例１および２と同様の菌株を用い、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ株（以下「ＧＧ株」と称する）をブタ胃ムチンへの付着性を有する陽性対照株として用いた。ＧＧ株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） （ＡＴＣＣ ５３１０３， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より購入した。ＭＲＳ液体培地で３０℃で一晩培養した選抜乳酸菌株および３７℃で一晩培養したＧＧ株の菌体を０．８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄し、同液で波長６２０ｎｍにおける光学密度を１．０に調製し、供試菌株液とした。供試菌株液１００μＬをウェルに添加し３７℃で２時間保温してムチンに付着させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ２００μＬにてプレートを３回洗浄し、ムチンに付着していない菌体を取り除いた。その後プレートを５５℃で乾燥させた。１％クリスタルバイオレット溶液（３３％酢酸）２０μＬをウェルに添加し、室温で４５分間放置した。ＰＢＳで２回洗浄後、５０ｍＭクエン酸（ｐＨ４．０）１００μＬをウェルに添加し、室温で４５分間放置して、測定用サンプルを得た。
選抜乳酸菌株として、実施例１および２と同様の菌株を用い、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ株（以下「ＧＧ株」と称する）をブタ胃ムチンへの付着性を有する陽性対照株として用いた。ＧＧ株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） （ＡＴＣＣ ５３１０３， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より購入した。ＭＲＳ液体培地で３０℃で一晩培養した選抜乳酸菌株および３７℃で一晩培養したＧＧ株の菌体を０．８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄し、同液で波長６２０ｎｍにおける光学密度を１．０に調製し、供試菌株液とした。供試菌株液１００μＬをウェルに添加し３７℃で２時間保温してムチンに付着させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ２００μＬにてプレートを３回洗浄し、ムチンに付着していない菌体を取り除いた。その後プレートを５５℃で乾燥させた。１％クリスタルバイオレット溶液（３３％酢酸）２０μＬをウェルに添加し、室温で４５分間放置した。ＰＢＳで２回洗浄後、５０ｍＭクエン酸（ｐＨ４．０）１００μＬをウェルに添加し、室温で４５分間放置して、測定用サンプルを得た。
【0089】
（ムチン付着性の測定）
吸光度計（ｉＭａｒｋ， Ｂｉｏ Ｒａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、測定用サンプルの波長５９５ｎｍでの吸光度を測定した。ブランクは、ムチンを固定していないウェルを用いて行った。複数の菌体を用いて行い、吸光度の平均を吸光度として評価した。
吸光度計（ｉＭａｒｋ， Ｂｉｏ Ｒａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、測定用サンプルの波長５９５ｎｍでの吸光度を測定した。ブランクは、ムチンを固定していないウェルを用いて行った。複数の菌体を用いて行い、吸光度の平均を吸光度として評価した。
【0090】
（ムチン付着性試験の結果）
選抜乳酸菌株はブタ胃ムチンへの付着性の陽性対照株であるＧＧ株と同等またはそれ以上のムチン付着性を有していた。ＧＧ株はプロバイオティクス用途に用いることができる乳酸菌として一般的なものであるため、ＧＧ株と同等以上のムチン付着性を示すことは選抜乳酸菌株がプロバイオティクス用途への応用の可能性が高い乳酸菌株であることを示す。
選抜乳酸菌株はブタ胃ムチンへの付着性の陽性対照株であるＧＧ株と同等またはそれ以上のムチン付着性を有していた。ＧＧ株はプロバイオティクス用途に用いることができる乳酸菌として一般的なものであるため、ＧＧ株と同等以上のムチン付着性を示すことは選抜乳酸菌株がプロバイオティクス用途への応用の可能性が高い乳酸菌株であることを示す。
【0091】
＜実施例５：培養条件によるムチン付着性への影響＞
（供試菌株）
選抜乳酸菌株を培養条件がムチン付着性に及ぼす影響を評価する試験に供した。
（供試菌株）
選抜乳酸菌株を培養条件がムチン付着性に及ぼす影響を評価する試験に供した。
【0092】
（食塩濃度によるムチン付着性への影響の評価）
実施例３と同様にして、食塩濃度が０％および６％であるＭＲＳ液体培地に選抜乳酸菌を接種し、３０℃で培養した菌株を、ムチン付着性試験に用いた。ムチン付着性試験は実施例４と同様にして行った。各菌株の各食塩濃度で培養した菌体での、波長５９５ｎｍにおける吸光度を図１に示す。
実施例３と同様にして、食塩濃度が０％および６％であるＭＲＳ液体培地に選抜乳酸菌を接種し、３０℃で培養した菌株を、ムチン付着性試験に用いた。ムチン付着性試験は実施例４と同様にして行った。各菌株の各食塩濃度で培養した菌体での、波長５９５ｎｍにおける吸光度を図１に示す。
【0093】
（結果）
図１に示す通り、食塩濃度が６％の培地で培養した場合であっても、全ての選抜乳酸菌株においてムチン付着性が認められた。特に、Ａ６０菌株、４－３６菌株においては、食塩濃度が０％の場合よりもムチン付着性が有意に（Ｐ＜０．００１）高くなった。Ｄ０２菌株については、ムチン付着性が高くなる傾向（Ｐ＜０．１）が見られた。
図１に示す通り、食塩濃度が６％の培地で培養した場合であっても、全ての選抜乳酸菌株においてムチン付着性が認められた。特に、Ａ６０菌株、４－３６菌株においては、食塩濃度が０％の場合よりもムチン付着性が有意に（Ｐ＜０．００１）高くなった。Ｄ０２菌株については、ムチン付着性が高くなる傾向（Ｐ＜０．１）が見られた。
【0094】
（培養温度のムチン付着性への影響の評価）
供試菌株の試験前に５℃、２５℃、および３７℃で培養した以外は、実施例５と同様にしてムチン付着性試験を行った。
供試菌株の試験前に５℃、２５℃、および３７℃で培養した以外は、実施例５と同様にしてムチン付着性試験を行った。
【0095】
（結果）
図２に示す通り、選抜乳酸菌株は３７℃の培養条件でもムチンへの付着性を示し、その付着力はＧＧ株と同等か、ＧＧ株よりも有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。
図２に示す通り、選抜乳酸菌株は３７℃の培養条件でもムチンへの付着性を示し、その付着力はＧＧ株と同等か、ＧＧ株よりも有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。
【0096】
図３に示す通り、選抜乳酸菌株は２５℃の培養条件でもムチンへの付着性を示し、その付着力はＧＧ株と同等か、ＧＧ株よりも有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。
【0097】
図４に示す通り、Ｄ０２菌株、４－３６菌株、４－４３菌株、および４－４４菌株は５℃の培養条件でもムチンへの付着性を示し、その付着力はＧＧ株よりも有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。
【0098】
＜実施例６：消化管ストレス耐性試験＞
（供試菌株）
選抜乳酸菌株およびＧＧ株を低ｐＨ耐性試験および胆汁酸耐性試験に供した。
（供試菌株）
選抜乳酸菌株およびＧＧ株を低ｐＨ耐性試験および胆汁酸耐性試験に供した。
【0099】
（低ｐＨ耐性の測定）
選抜乳酸菌株およびＧＧ株は一晩培養したＭＲＳ培養液を０．５％（ｖ／ｖ）で新たなＭＲＳ液体培地に接種し、一晩培養を行った。選抜乳酸菌株は３０℃で培養し、ＧＧ株は３７℃で培養した。
選抜乳酸菌株およびＧＧ株は一晩培養したＭＲＳ培養液を０．５％（ｖ／ｖ）で新たなＭＲＳ液体培地に接種し、一晩培養を行った。選抜乳酸菌株は３０℃で培養し、ＧＧ株は３７℃で培養した。
【0100】
供試菌株の菌体をそれぞれ１３０００ｇ、１０分間の条件で遠心分離を行って集菌し、０．８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した。供試菌体を、１Ｎ塩酸溶液でｐＨ２．５に調整して低ｐＨ溶液として作製した０．８５％塩化ナトリウム溶液に懸濁し、３７℃で１．５時間保温した。低ｐＨ溶液に菌体を曝露する前後に、菌体懸濁液を一部採取し、０．８５％塩化ナトリウム溶液で適宜希釈したものをＭＲＳ寒天培地（１．６％寒天）に塗抹し、各供試菌株の至適培養温度で１～２日間培養し、寒天上に生育したコロニー数を生菌数として計測した。計測した生菌数を対数変換した値を表７に示す。
【表7】
【0101】
（結果）
低ｐＨ溶液への曝露後においても、選抜乳酸菌の生育は認められたため、プロバイオティクス用途に用いるためには十分と判断できた。
低ｐＨ溶液への曝露後においても、選抜乳酸菌の生育は認められたため、プロバイオティクス用途に用いるためには十分と判断できた。
【0102】
（胆汁酸耐性の測定）
胆汁酸添加サンプルを、脱水胆汁（Ｏｘｇａｌｌ、ＢＤ）を０．３％（ｗ／ｖ）になるように添加したＭＲＳ液体培地に、各選抜乳酸菌およびＧＧ株を一晩培養したＭＲＳ培養液を１％（v／v）で接種し、３７℃で２４時間培養して調製した。胆汁酸無添加サンプルを、脱水胆汁を加えない以外は胆汁酸添加サンプルと同様にして調製した。
胆汁酸添加サンプルを、脱水胆汁（Ｏｘｇａｌｌ、ＢＤ）を０．３％（ｗ／ｖ）になるように添加したＭＲＳ液体培地に、各選抜乳酸菌およびＧＧ株を一晩培養したＭＲＳ培養液を１％（v／v）で接種し、３７℃で２４時間培養して調製した。胆汁酸無添加サンプルを、脱水胆汁を加えない以外は胆汁酸添加サンプルと同様にして調製した。
【0103】
培養終了後、胆汁酸添加サンプルおよび胆汁酸無添加サンプルを用いて波長６２０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６２０）を測定し、胆汁酸耐性を下記式によって求めた。
【0104】
胆汁酸耐性（％）＝ＯＤ６２０（胆汁酸添加サンプル）/ＯＤ６２０（胆汁酸無添加サンプル）×１００
【0105】
各胆汁酸サンプルのＯＤ６２０の値および胆汁酸耐性（％）を表８に示す。
【表8】
【0106】
（結果）
表８に示す通り、各選抜乳酸菌株は０．３％含有胆汁酸の条件で培養した場合であっても菌株は生存し、０．３％胆汁酸に対する耐性があることは明らかであった。このため、各選抜乳酸菌株は腸内で生存できることが期待できる。特に、Ａ６０および４－４３はＧＧ株よりも優れた胆汁酸耐性を有していたことから、プロバイオティクスとして特に好ましいことがわかった。
表８に示す通り、各選抜乳酸菌株は０．３％含有胆汁酸の条件で培養した場合であっても菌株は生存し、０．３％胆汁酸に対する耐性があることは明らかであった。このため、各選抜乳酸菌株は腸内で生存できることが期待できる。特に、Ａ６０および４－４３はＧＧ株よりも優れた胆汁酸耐性を有していたことから、プロバイオティクスとして特に好ましいことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【0107】
本発明は、食品産業分野に利用することができる。
【受託番号】
【0108】
Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ａ６０株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９０）、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｄ０２株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９１）、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ４－３６株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９２）、４－４３（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９３）、４－４４株（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３４９４）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】