特表 2022-504078 単一の生物学的サンプル由来のタンパク質、ヌクレオソームおよび無細胞核酸のシーケンシングベースの同時分析

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-13

(54)【発明の名称】単一の生物学的サンプル由来のタンパク質、ヌクレオソームおよび無細胞核酸のシーケンシングベースの同時分析

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6804 20180101AFI20220105BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20220105BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20220105BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20220105BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220105BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20220105BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6804 Z ZNA

C12Q1/6813 Z

C12Q1/686 Z

C12N15/10 100Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6876 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021518090

(86)(22)【出願日】2019-10-03

(85)【翻訳文提出日】2021-05-18

(86)【国際出願番号】 US2019054582

(87)【国際公開番号】W WO2020072829

(87)【国際公開日】2020-04-09

(31)【優先権主張番号】62/741,473

(32)【優先日】2018-10-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520306875

【氏名又は名称】ブルースター ジェノミクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アレンスドルフ， パトリック エー．

(72)【発明者】

【氏名】スペイセック， ダメク

(72)【発明者】

【氏名】エリソン， クリストファー イー．

(72)【発明者】

【氏名】レヴィ， サミュエル

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ79

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR48

4B063QS24

4B063QS33

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、合理化された組み合わせワークフローでサンプルを分析し、得られた複数種類の情報を決定する方法を提供し、あらゆる情報がシーケンシングベースの分析で得られる。情報は、血液サンプル中の特定の血漿タンパク質の存在および濃度；同サンプルから得られた無細胞ＤＮＡと会合したヒストン修飾の数、位置およびタイプ；無細胞ＤＮＡサンプル中のｃｆＲＮＡ／ｃｆＤＮＡの配列；無細胞ＤＮＡに関するエピジェネティック情報、例えば、ヒドロキシメチル化およびメチル化のプロファイル、即ち、それぞれ５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）／５－メチルシトシン（５ｍＣ）残基の分布を含む。本発明はさらに、生物学的サンプルを分析してそのサンプルの１以上の非古典的な配列特徴を決定する古典的なシーケンシングベースの方法に関する。切断型シーケンシングアダプターをバーコード化ＰＣＲプライマーと併せて用いる実施形態も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の近接プローブおよび第２の近接プローブをそれぞれが含む複数のプローブ対を提供することであって、ここで、各プローブ対は、特定のタンパク質分析物を標的にすること、および対応するタンパク質分析物の存在下において各プローブ対の前記プローブ間で二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）セグメントを生成することによって、生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための改善された近接伸長アッセイであって、前記改善された近接伸長アッセイは、
（ａ）タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列を前記ｄｓＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程；
（ｂ）前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において生成された配列リードにおいて観察される前記タンパク質識別子バーコードから前記生物学的サンプル中の前記タンパク質分析物を識別する工程
を含む、改善された近接伸長アッセイ。

【請求項2】

各タンパク質特異的核酸配列が、アダプター内に含められ、工程（ａ）が、前記アダプターを前記ｄｓＤＮＡセグメントに末端結合することを含む、請求項１に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項3】

工程（ａ）が、５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を前記ｄｓＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、前記キャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程をさらに含む、請求項１に記載の改善された近接アッセイ。

【請求項4】

前記キャプチャー配列および前記タンパク質識別子バーコードが、前記ｄｓＤＮＡセグメントに末端結合された少なくとも１つのアダプター内に含められている、請求項３に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項5】

分子バーコードとして供されるために、ランダムな核酸配列を各ｄｓＤＮＡテンプレート分子に組み込む工程を工程（ｂ）の前にさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項6】

少なくとも１つのタンパク質濃度コントロール組成物を前記ｄｓＤＮＡテンプレート分子と合わせる工程を工程（ｂ）の前にさらに含む、請求項５に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項7】

各タンパク質分析物が、前記生物学的サンプル中に元の濃度で存在し、前記アッセイが、（ｄ）特定のタンパク質分析物を示唆する配列リードを、前記タンパク質濃度コントロール組成物によって生成された配列リードと比較することによって、前記サンプル中の少なくとも１つのタンパク質分析物の元の濃度を決定する工程をさらに含む、請求項６に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項8】

複数の生物学的サンプルの各々における前記複数のタンパク質分析物を並行して検出する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれかに記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項9】

複数の生物学的サンプルの各々における前記複数のタンパク質分析物を並行して検出する工程をさらに含む、請求項７に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項10】

前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも３００個の生物学的サンプルを含む、請求項９に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項11】

前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも５００個の生物学的サンプルを含む、請求項１０に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項12】

前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも１０００個の生物学的サンプルを含む、請求項１１に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項13】

前記複数の生物学的サンプルが、３８４または１５３６個の生物学的サンプルを含み、前記アッセイが、マイクロプレートの個々のウェルにおける各生物学的サンプルを用いて実施される、請求項９に記載の改善された近接伸長アッセイ。

【請求項14】

ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための方法であって、前記方法は、
（ａ）それぞれが、特定のタンパク質分析物を標的にし、第１の末端にタンパク質結合ドメイン、反対側の第２の末端に核酸結合ドメインおよびそれらの間に非ハイブリダイズ核酸領域を含む、複数のプローブ対を提供する工程であって、ここで、（ｉ）前記第１および第２の近接プローブの前記タンパク質結合ドメインは、同じタンパク質分析物上の異なる結合部位に同時に結合することができ、（ｉｉ）前記第１および第２の近接プローブが、両方とも前記タンパク質に結合しており、ハイブリダイゼーションが生じるのに十分近接しているとき、前記プローブの前記核酸結合ドメインは、互いに相補的であり、ハイブリダイズして、ｄｓＤＮＡセグメントを形成する、工程；
（ｂ）（ｉ）プローブ対内の各近接プローブの前記タンパク質結合ドメインが対応するタンパク質分析物に結合すること、および（ｉｉ）前記核酸結合ドメインが互いにハイブリダイゼーションして、前記第１の近接プローブを起源とする５’末端および前記第２の近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記生物学的サンプルまたはその一部を前記プローブ対とインキュベートする工程；
（ｃ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記第１の近接プローブの５’末端を前記第２の近接プローブに沿って伸長して、タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列および５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を組み込むｄｓＤＮＡセグメントを前記プローブの間に生成する工程であって、ここで、（ｉ）前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、または前記第１のプローブと第２のプローブの両方の前記核酸結合領域が、前記キャプチャー配列、前記タンパク質識別子バーコード、または前記キャプチャー配列と前記タンパク質識別子バーコードの両方を含み；（ｉｉ）前記ｄＮＴＰ混合物は、少なくとも１つの５ｈｍＣ残基を含み；かつ／または（ｉｉｉ）ポリメラーゼ伸長後に前記ｄｓＤＮＡセグメントの末端にアダプターがライゲートされ、ここで、少なくとも１つのアダプターが、前記キャプチャー配列、前記タンパク質識別子バーコードまたは前記キャプチャー配列と前記タンパク質識別子バーコードの両方を含み、それによって、それぞれがキャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が形成される、工程；
（ｄ）キャプチャー配列を含む前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および
（ｅ）工程（ｂ）において生成された配列リードにおいて観察される前記タンパク質識別子バーコードから前記生物学的サンプル中の前記タンパク質分析物を識別する工程
を含む、方法。

【請求項15】

各タンパク質結合ドメインが、抗原を含み、各結合部位が、エピトープを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記生物学的サンプルが、血液サンプルを含み、工程（ｂ）が、前記血液サンプルの一部に対して実施される、請求項１４または請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

工程（ｂ）が、前記血液サンプルから得られた血漿に対して実施される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記生物学的サンプルから得られた無細胞核酸サンプルに関する情報を取得する工程をさらに含む、請求項１～１７のいずれか１つの請求項に記載の方法。

【請求項19】

前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のヌクレオソーム内の１またはそれを超えるヒストン修飾の存在、同一性または量を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、共有結合による翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ＰＴＭが、遺伝子発現に影響を与えるヒストン構造の変化を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記少なくとも１つのＰＴＭが、アセチル化、メチル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化、２－ヒドロキシイソブチリル化、マロニル化、スクシニル化、ホルミル化、ユビキチン化、シトルリン化、リン酸化、ヒドロキシル化、ＳＵＭＯ化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化、ＡＤＰリボシル化またはそれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の少なくとも１つの配列を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項25】

前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＤＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中の無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の少なくとも１つの配列を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項27】

前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項30】

前記情報が、エピジェネティックデータを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項31】

前記情報が、ＤＮＡヒドロキシメチル化に関する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記情報が、ＤＮＡメチル化に関する、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

前記情報が、さらにＤＮＡメチル化に関する、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

無細胞核酸サンプルを調製して、ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて、前記無細胞核酸サンプルに含まれているヌクレオソームにおける少なくとも１つのヒストン修飾の識別を可能にするための方法であって、前記方法は、
（ａ）ヒストンコアの周囲に巻き付いたｃｆＤＮＡ分子をそれぞれが含む複数のヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｂ）末端ハイブリダイズ領域を含むアダプターを前記ｃｆＤＮＡ分子の末端にライゲートし、それによって、それぞれがヒストンコアの周囲に巻き付いたアダプター結合ｃｆＤＮＡ分子を含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｃ）第１の末端に、目的のヒストン修飾に特異的に結合するヒストン修飾結合ドメイン；第２の末端に、末端ハイブリダイズ領域に相補的な核酸結合ドメイン；およびそれらの間に、前記目的のヒストン修飾に対応し、それによって、ヒストン修飾バーコードとして供される、核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域、を含む近接プローブを提供する工程であって、ここで、前記近接プローブは、前記ヒストン修飾結合ドメインが前記目的のヒストン修飾に結合することと、前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；
（ｄ）（ｉ）前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、前記無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および前記近接プローブを起源とする３’末端を有し、かつ前記ヒストン修飾バーコードを含むｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記修飾された無細胞核酸サンプルを前記近接プローブとインキュベートする工程；および
（ｅ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記ｄｓＤＮＡセグメントの５’末端を前記近接プローブの前記非ハイブリダイズ領域および前記ヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、増幅用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程
を含む、方法。

【請求項35】

工程（ｃ）が、それぞれが異なるヒストン修飾を標的にする複数の近接プローブを提供することを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記増幅されたヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子をシーケンシングする工程、および生成された配列リードにおいて観察されるヒストン修飾バーコードからヒストン修飾のタイプおよび位置に関する情報を決定する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

無細胞核酸サンプルから抽出するためにｃｆＤＮＡを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を含むＤＮＡアダプターを前記無細胞核酸サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；および
（ｂ）タグ付けされたｃｆＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記５ｈｍＣ残基を官能化する工程
を含む、方法。

【請求項39】

前記アフィニティータグが、ビオチンから構成され、工程（ｂ）が、前記少なくとも１つの５ｈｍＣ残基をビオチン化して、ビオチン化されたアダプター結合ｃｆＤＮＡを形成することを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記５ｈｍＣ残基が、化学選択的基を前記５ｈｍＣ残基に共有結合させ、次いで前記化学選択的基を官能化ビオチン部分と反応させることによってビオチン化される、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記化学選択的基がクリックケミストリー反応において前記官能化ビオチンと反応するように、前記化学選択的基が、ＵＤＰグルコース－６－アジドであり、前記官能化ビオチン部分が、アルキン官能化ビオチンである、請求項３７に記載の方法。

【請求項42】

前記アダプターが、固有特性識別子（ＵＦＩ）配列をさらに含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項43】

前記アダプターが、少なくとも２つのＵＦＩ配列を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記少なくとも２つのＵＦＩ配列が、ソース識別子バーコード、ならびに分子バーコード、鎖識別子バーコードおよびヒストン修飾バーコードから選択される少なくとも１つの追加のＵＦＩ配列を含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

シーケンシングベースの同時識別のために単一の無細胞核酸サンプル中のＤＮＡおよびＲＮＡを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記無細胞サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；
（ｂ）前記アダプター結合ＤＮＡおよびＲＮＡを精製して、アダプター結合ＤＮＡおよびＲＮＡの無細胞混和物を提供する工程；
（ｃ）前記ＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；
（ｄ）前記第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および
（ｅ）前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む第２のアダプター配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下において前記ｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、前記アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程
を含む、方法。

【請求項46】

前記少なくとも１つのＵＦＩ配列が、分子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコードまたはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、前記アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡを前記無細胞サンプルから取り出す工程；
（ｅ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｆ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。

【請求項48】

前記少なくとも１つのＵＦＩ配列が、分子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコードまたはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

工程（ｅ）において提供された前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡが、増幅の前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、請求項４７または請求項４８に記載のプロセス。

【請求項50】

単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていない５ｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされていない未修飾のＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；
（ｅ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｆ）前記残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；
（ｇ）前記サンプルから前記官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで前記酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；
（ｈ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；
（ｉ）前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｊ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。

【請求項51】

前記少なくとも１つの分子バーコードが、フラグメント識別子配列、鎖識別子配列、またはフラグメント識別子配列と鎖識別子配列との両方をさらに含む、請求項５０に記載のプロセス。

【請求項52】

前記前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、請求項５０または請求項５１に記載のプロセス。

【請求項53】

単一の無細胞核酸サンプルから少なくとも２種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つの分子バーコードを含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、５ｈｍＣ残基、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを前記無細胞サンプルから取り出す工程；および
（ｅ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡのプールされた混和物を増幅し、かつシーケンシングして、ＤＮＡヒドロキシメチル化および同じサンプル中のｃｆＲＮＡに関するデータを提供する工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。

【請求項54】

単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、
（ａ）ハイブリダイズ核酸領域を含むアダプターをヌクレオソーム会合ＤＮＡの各末端にライゲートし、それによって、アダプター結合ＤＮＡと会合したヌクレオソームを含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｂ）第１の末端に、ヒストン修飾結合ドメイン、反対側の第２の末端に、前記ハイブリダイズ核酸領域に相補的な核酸結合ドメイン、およびそれらの間に、特定のヒストン修飾に対応し、それによってヒストン修飾バーコードとして供されるように選択された核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域を含む、近接プローブを提供する工程であって、ここで、前記近接プローブは、前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合することと、前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；
（ｃ）（ｉ）前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、前記無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および前記近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記修飾された無細胞核酸サンプルを前記近接プローブとインキュベートする工程；および
（ｄ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記セグメントの５’末端を前記近接プローブの前記非ハイブリダイズ領域および前記ヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、さらなる処理用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程；
（ｅ）前記サンプル中の核酸を精製して、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡおよびＤＮＡを含む組成物を提供する工程；
（ｆ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；
（ｇ）前記第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および
（ｈ）ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下において前記ｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む核酸組成物を提供する工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。

【請求項55】

（ｉ）前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子および前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、請求項５４に記載のプロセス。

【請求項56】

工程（ｄ）の後に、追加のバーコードを含むアダプターを、前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡにライゲートする、請求項５５に記載のプロセス。

【請求項57】

前記追加のバーコードが、ソース識別子配列を含む、請求項５６に記載のプロセス。

【請求項58】

前記追加のバーコードが、フラグメント識別子配列、鎖識別子配列、またはフラグメント識別子配列と鎖識別子配列との両方をさらに含む、請求項５７に記載のプロセス。

【請求項59】

（ｉ）５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで、前記核酸組成物中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｊ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡを前記組成物から取り出す工程；および
（ｋ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程
をさらに含む、請求項５４、５６、５７および５８のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項60】

（ｌ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、請求項５９に記載のプロセス。

【請求項61】

工程（ｋ）において提供された前記バーコード化５ｈｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、請求項６０に記載のプロセス。

【請求項62】

（ｌ）前記残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；
（ｍ）前記サンプルから前記官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで前記酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；
（ｎ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；および
（ｏ）前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程
をさらに含む、請求項５９に記載のプロセス。

【請求項63】

（ｐ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、請求項６２に記載のプロセス。

【請求項64】

前記前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、請求項６３に記載のプロセス。

【請求項65】

前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、請求項５４に記載のプロセス。

【請求項66】

前記血液サンプルの一部に対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、請求項６５に記載のプロセス。

【請求項67】

血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、請求項６６に記載のプロセス。

【請求項68】

前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、前記アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、請求項６７に記載のプロセス。

【請求項69】

前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、前記アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が、シーケンシングの前にプールされる、請求項６８に記載のプロセス。

【請求項70】

前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、請求項５９に記載のプロセス。

【請求項71】

前記血液サンプルの一部に対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、請求項７０に記載のプロセス。

【請求項72】

血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、請求項７１に記載のプロセス。

【請求項73】

前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、請求項７２に記載のプロセス。

【請求項74】

前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡが、シーケンシングの前にプールされる、請求項７３に記載のプロセス。

【請求項75】

前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、請求項６２に記載のプロセス。

【請求項76】

前記血液サンプルに対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、請求項７５に記載のプロセス。

【請求項77】

血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、請求項７６に記載のプロセス。

【請求項78】

前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、請求項７７に記載のプロセス。

【請求項79】

前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡが、シーケンシングの前にプールされる、請求項７８に記載のプロセス。

【請求項80】

核酸テンプレート分子の非古典的な配列特徴を決定するためのシーケンシングベースの方法であって、
前記テンプレート分子の特定の非配列特徴を指定する固有特性識別子配列を前記核酸テンプレート分子に付加する工程；
前記核酸テンプレート分子および前記付加された識別子配列を増幅して、前記付加された識別子配列をそれぞれが含む複数のアンプリコンを得る工程；および
前記アンプリコンをシーケンシングし、得られた配列リードから前記非配列特徴を決定する工程
を含む、シーケンシングベースの方法。

【請求項81】

前記核酸テンプレート分子が、複数の異なる核酸テンプレート分子を含む組成物に含まれており、各テンプレート分子の特定の非古典的な配列特徴を指定する少なくとも１つの識別子配列が、前記核酸テンプレート分子に付加されている、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子と会合したタンパク質の一態様を含む、請求項８０または請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記タンパク質が、ヒストンである、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記態様が、ヒストン修飾を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記ヒストン修飾が、共有結合による翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記ＰＴＭが、遺伝子発現に影響を与えるヒストン構造の変化を含む、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記少なくとも１つのＰＴＣ修飾が、アセチル化、メチル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化、２－ヒドロキシイソブチリル化、マロニル化、スクシニル化、ホルミル化、ユビキチン化、シトルリン化、リン酸化、ヒドロキシル化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化、ＡＤＰリボシル化またはそれらの組み合わせを含む、請求項８５に記載の方法。

【請求項88】

前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーを含む、請求項８５に記載の方法。

【請求項89】

前記非古典的な配列特徴が、近接伸長法において前記核酸テンプレートが由来したタンパク質分析物を含む、請求項８０または請求項８１に記載の方法。

【請求項90】

前記非古典的な配列特徴が、エピジェネティック修飾を含む、請求項８０または請求項８１に記載の方法。

【請求項91】

前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子をゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとして識別することを含む、請求項８０または請求項８１に記載の方法。

【請求項92】

前記組成物が、無細胞核酸サンプルを含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項93】

前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子を無細胞ＤＮＡフラグメントまたは無細胞ＲＮＡに由来するｃＤＮＡとして識別することを含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

近接伸長法における既知のタンパク質分析物に由来する核酸配列を含み、それによって、タンパク質識別子バーコードとして供される、二本鎖ＤＮＡテンプレート分子。

【請求項95】

前記分子の末端にライゲートされたアダプターをさらに含む、請求項９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。

【請求項96】

それぞれが前記分子の末端にライゲートされた２つのアダプターを含む、請求項９５に記載のＤＮＡテンプレート分子。

【請求項97】

５ｈｍＣ残基をさらに含む、請求項９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。

【請求項98】

５ｈｍＣ残基をさらに含む、請求項９５に記載のＤＮＡテンプレート分子。

【請求項99】

前記５ｈｍＣ残基が、前記アダプター内に含まれている、請求項９８に記載のＤＮＡテンプレート分子。

【請求項100】

５ｈｍＣ残基をさらに含む、請求項９６に記載のＤＮＡテンプレート分子。

【請求項101】

前記アダプターのうちの少なくとも１つが、５ｈｍＣ残基を含む、請求項１００に記載のＤＮＡテンプレート分子。

【請求項102】

前記近接プローブが、同じタンパク質分析物に結合されたとき、タンパク質分析物に由来する前記核酸配列が、２つの近接プローブの間に形成するハイブリダイズした核酸領域内に核酸配列を含む、請求項９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。

【請求項103】

無細胞ＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、およびそれに付加された５ｈｍＣ残基を含む核酸配列を含む、無細胞核酸組成物。

【請求項104】

前記核酸配列が、アダプターを含む、請求項１０３に記載の組成物。

【請求項105】

前記核酸配列が、ソース識別子バーコードをさらに含む、請求項１０３または１０４に記載の組成物。

【請求項106】

前記核酸配列が、ＲＮＡインジケーターバーコードをさらに含む、請求項１０２～１０４のいずれかに記載の組成物。

【請求項107】

前記核酸配列が、ＲＮＡインジケーターバーコードをさらに含む、請求項１０５に記載の組成物。

【請求項108】

単一の血液サンプルに由来するアダプター結合バーコード化二本鎖ＤＮＡテンプレート分子をそれぞれが含む、サンプル画分の組み合わせであって、前記組み合わせは、
（ａ）少なくとも１つのタンパク質関連ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む血漿由来サンプル画分であって、前記タンパク質関連ｄｓＤＮＡテンプレート分子のそれぞれが、特定のタンパク質分析物に対応するタンパク質特異的核酸配列を含み、それによって、タンパク質識別子バーコードとして供される、血漿由来サンプル画分；および
（ｂ）前記血液サンプルから抽出された無細胞核酸サンプルから得られた二本鎖ｃｆＤＮＡテンプレート分子を含む少なくとも１つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分であって、ここで、前記ｃｆＤＮＡテンプレート分子は、ソース識別子バーコード、フラグメント識別子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコード、ランダムバーコードおよびそれらの組み合わせから選択される固有特性識別子を含むアダプターのセットに末端結合されている、少なくとも１つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分
を含む、組み合わせ。

【請求項109】

前記タンパク質関連ｄｓＤＮＡセグメントが、５ｈｍＣ残基を含む、請求項１０８に記載の組み合わせ。

【請求項110】

前記アダプターの第１のセットにおける少なくとも１つのアダプターが、５ｈｍＣ残基を含む、請求項１０９に記載の組み合わせ。

【請求項111】

前記５ｈｍＣ残基が、結合対の第１のメンバーに共有結合されている、請求項１０９または１１０に記載の組み合わせ。

【請求項112】

前記結合対の第１のメンバーが、前記結合対の第２のメンバーに結合されている、請求項１１１に記載の組み合わせ。

【請求項113】

前記結合対の第２のメンバーが、固体支持体表面に付着されている、請求項１１２に記載の組み合わせ。

【請求項114】

前記結合対の第１のメンバーが、ビオチンであり、前記結合対の第２のメンバーが、アビジンまたはストレプトアビジンである、請求項１１２または請求項１１３に記載の組み合わせ。

【請求項115】

（ａ）において、ｃｆＤＮＡテンプレートのセグメントが、５ｈｍＣ残基を含む、請求項１０８～１１４のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項116】

少なくとも２つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分を含み、各画分は、アダプター結合バーコード化二本鎖ｃｆＤＮＡテンプレート分子を含み、少なくとも１つの画分は、５ｍＣ、５ｈｍＣおよびそれらの組み合わせから選択される修飾されたシトシン残基を含む、請求項１０８～１１５のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項117】

（ａ）第１のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、アフィニティータグ付けされた５ｈｍＣ残基を含む第１のｃｆＤＮＡテンプレートセグメントを含み；
（ｂ）第２のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、アフィニティータグ付けされた５ｍＣ残基を含むが５ｈｍＣ残基を実質的に含まない第２のｃｆＤＮＡテンプレートセグメントを含み；必要に応じて、
（ｃ）第３のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、修飾されたシトシン残基を実質的に含まない第３のｃｆＤＮＡテンプレートを含む、
請求項１１６に記載の組み合わせ。

【請求項118】

各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ソース識別子バーコード、ならびにフラグメント識別子バーコード、鎖識別子バーコードおよびヌクレオソーム位置識別子バーコードから選択される少なくとも１つの追加の識別子バーコードを含む、請求項１０８～１１７のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項119】

各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ソース識別子バーコード、フラグメント識別子バーコードおよび鎖識別子バーコードを含む、請求項１１８に記載の組み合わせ。

【請求項120】

各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ヒストン修飾バーコードをさらに含む、請求項１１９に記載の組み合わせ。

【請求項121】

前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡに由来するアダプター結合ｃＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１０８に記載の組み合わせ。

【請求項122】

請求項１０８～１２１のいずれかに記載の組み合わせを合わせ、増幅し、かつシーケンシングすることによって調製された、ＤＮＡシーケンシングの準備が整っている、プールされた混合物。

【請求項123】

識別子バーコードをｄｓＤＮＡ分子に付加するための方法であって、
（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプターを提供する工程；
（ｂ）前記シーケンシングアダプターをＡテール化平滑末端ｄｓＤＮＡテンプレート分子にライゲートする工程；
（ｃ）少なくとも１つのバーコード化プライマーを用いるＰＣＲプロセスにおいて前記アダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程であって、ここで、前記バーコード化プライマーは、（ｉ）前記アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）前記アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする第２の領域を含み、その結果、ポリメラーゼの存在下における前記バーコード化プライマーの伸長によって、前記プライマーの第２の領域と前記アダプターの一本鎖セグメントとの二本鎖複合体が生じ、ここで、前記識別子バーコードを含む前記第１の領域は、前記二本鎖複合体の末端を超えて一本鎖オリゴヌクレオチドテールとして伸長する、工程
を含む、方法。

【請求項124】

前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

前記ＤＮＡアダプターが、２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態である、請求項３８、４５、４７、５０および５３に記載の方法。

【請求項127】

前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、請求項１２６に記載の方法。

【請求項128】

前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングするためのキットであって、
（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプター；
（ｂ）（ｉ）前記アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）前記アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする、第２の領域を含む、バーコード化プライマー；および
（ｃ）ポリメラーゼ
を備える、キット。

【請求項130】

前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、請求項１２９に記載のキット。

【請求項131】

前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

標的化配列に対してシーケンスベースの富化工程を実施する工程をさらに含む、請求項３８、４５、４７、５０および５３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、一般に、エピジェネティック分析に関し、より具体的には、単一の生物学的サンプルから複数の種類の情報を取得するための組み合わされたワークフロー方法に関する。本発明は、ゲノミクス、医学、診断およびエピジェネティック研究の分野において有用性を見出す。

【背景技術】

【0002】

背景
微量の分析物を含む比較的少ない生物学的サンプルからかなりの量の情報を取得することは、他に類を見ない難題である。例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）サンプルは、血漿１ｍＬあたりほんの数ナノグラムのＤＮＡしか含まないのが通常である。結果的に、無細胞ＤＮＡサンプルの１つより多い特徴または２つの特徴、例えば、ＤＮＡ配列情報および／またはメチル化データを評価することは難しく、多くの場合、各々に対して別個のワークフローが使用され、すでに量の少ないＤＮＡサンプルがインプットとして分割され、同じ出発分子に関して知ることができる情報量が制限される（例えば、単一の出発ｃｆＤＮＡフラグメントテンプレートが、メチル化されたサイトカインとヒドロキシメチル化されたサイトカインとの両方を含む場合）。それにもかかわらず、１つのｃｆＤＮＡサンプルから様々な種類の情報を取得するための方法が提案されてきた。例えば、ＤＮＡフラグメントにおける５－メチルシトシン（５ｍＣ）および５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）残基の存在および位置をはじめとした、無細胞ＤＮＡの単一サンプルにおける種々のエピジェネティック特徴を検出するための方法であって、異なって処理されたＤＮＡフラグメントを最終的にプールし、一緒にシーケンシングして、所望の情報を取得する方法を記載している、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ，Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ”（Ｂｌｕｅｓｔａｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）という２０１８年２月１４日出願のＡｒｅｎｓｄｏｒｆらの米国特許仮出願第６２／６３０，７９８号；および無細胞ＤＮＡ中の５ｍＣおよび５ｈｍＣに異なる標識を結合させた後、それらの標識から生成されるシグナルを検出および分析することを記載している、“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ”（Ｔｈｅ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｌａｎｄ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｊｕｎｉｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）というＳｏｎｇらの米国特許出願公開第２０１７／０２９８４２２Ａ１号を参照のこと。単一の生物学的サンプルからＲＮＡとＤＮＡの両方を増幅し、かつシーケンシングするための方法に関する、“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓａｍｅ Ｓａｍｐｌｅ”というＲｅｕｔｅｒらの米国特許出願公開第２０１８／００８００２１号も参照のこと。
単一の少量の生物学的サンプルから、ＤＮＡ配列、ＤＮＡエピジェネティック修飾、ＲＮＡ配列、ヌクレオソームの構造およびポジショニング、ヒストン修飾、ならびに核酸に会合した血漿タンパク質と核酸を含まない血漿タンパク質の両方に関する情報を含むがこれらに限定されないはるかに多い情報を取得することができるならば、極めて有用であるだろう。さらに、そのような包括的なデータセットが、並列処理、追加のサンプル材料または複数の情報生成方法を必要とせずに、単一の少量の生物学的サンプルから、本質的に同じ様式で、かつ組み合わせワークフローの状況の中で生成できるならば、理想的であるだろう。最後に、そのような非配列情報が、同じテンプレート核酸内に一緒にコードされ得（例えば、配列内ではあるが、標準的な未修飾の核塩基を使用して）、元の親テンプレート配列とともに、後の工程で処理にかけることができるならば、既存の研究ワークフローおよび次世代シーケンシングライブラリー調製法との適合性が高まるだろう。特に、そのような非配列情報を弱め得るかまたは関連配列から分離し得る抽出、増幅および検出の技術の使用が可能になるだろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１７／０２９８４２２号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１８／００８００２１号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

発明の要旨
本発明は、当該分野における上述のニーズに応えるものであり、１つの実施形態において、多くの独立した分析工程、複数のデータ生成様式または大量のサンプルを必要とすることなく、生物学的サンプルを分析して、それらから得た複数の種類の情報を決定するための組み合わせワークフロー方法を提供する。患者の血液サンプルから取得され得る情報の種類としては、例えば、特定の血漿タンパク質の存在および濃度；ｃｆＤＮＡ（例えば、血液サンプルの無細胞画分由来のＤＮＡ）と会合したヒストン修飾の数、位置およびタイプ；その画分中のｃｆＲＮＡおよびｃｆＤＮＡの配列；ならびに無細胞ＤＮＡに関するエピジェネティック情報、例えば、ヒドロキシメチル化およびメチル化のプロファイル、すなわち、それぞれ５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）および５－メチルシトシン（５ｍＣ）残基の分布が挙げられる。

【0005】

本発明はさらに、生物学的サンプルを分析して、そのサンプルの１またはそれを超える非古典的な配列特徴を決定するための古典的なシーケンシングベースの方法に関し、ここで、「非古典的な配列特徴」は、サンプル中の核酸分子の４種の基本塩基（すなわち、ＤＮＡの場合はアデニン、シトシン、グアニンおよびチミン、ＲＮＡの場合は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシル）の同一性および順序以外の特徴を指す。すなわち、本方法は、目的の非古典的な配列特徴を導き出すことができる古典的な核酸配列情報の解明を含む。その非古典的な配列特徴は、核酸の組成に関する情報、例えば、修飾されたシトシン残基、例えば、５ｈｍＣまたは５ｍＣの分布であってもよいし、核酸の組成と無関係であってもよく、その代わりに、血液サンプル中の血漿タンパク質の存在および濃度、血液サンプルの無細胞ヌクレオソーム画分において観察されるヒストン修飾などに関する。本方法は、生物学的サンプルの単一の非古典的な配列特徴、生物学的サンプルの１つより多い非古典的な配列特徴、または古典的な配列情報と１またはそれを超える非古典的な配列特徴との組み合わせを決定するために実行され得る。その分析は、目的の非古典的な配列特徴（例えば、血漿タンパク質の同一性、血漿タンパク質の濃度、ヒストン修飾の数、位置および種類、核酸のヒドロキシメチル化プロファイル（例えば、生物学的サンプルの無細胞核酸画分中の無細胞ＤＮＡの５ｈｍＣプロファイル）、または核酸のメチル化プロファイル（例えば、生物学的サンプルの無細胞核酸画分中の無細胞ＤＮＡの５ｍＣプロファイル））から古典的な配列データへの変換を含む。得られた古典的な配列データは、固有特性識別子（ＵＦＩ）配列として供される、約４～約３６塩基対長の範囲の少なくとも１つの特定の核酸配列を含み、ここで、そのＵＦＩは、生物学的サンプル中の目的の分析物に由来する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子に組み込まれる。その古典的な配列データは、ｃＤＮＡ配列も含むので、生物学的サンプルの無細胞核酸画分中の無細胞ＲＮＡなどのＲＮＡテンプレート分子の対応する配列に関する情報も提供され得る。

【0006】

第１の実施形態において、本発明は、第１の近接プローブおよび第２の近接プローブをそれぞれが含む複数のプローブ対を提供すること（ここで、各プローブ対は、特定のタンパク質分析物を標的にする）および対応するタンパク質分析物の存在下において各プローブ対のプローブ間で二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）セグメントを生成することによって、生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための改善された近接伸長アッセイを提供し、その改善は、以下を含む。

【0007】

（ａ）タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列を二本鎖ＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程；

【0008】

（ｂ）タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および

【0009】

（ｃ）生成された配列リードにおいて観察されるタンパク質識別子バーコードから生物学的サンプル中のタンパク質分析物を識別する工程。

【0010】

いくつかの実施形態において、各タンパク質特異的核酸配列は、アダプター内に含められ、工程（ａ）は、アダプターをｄｓＤＮＡセグメントに末端結合することによって実施される。

【0011】

関連の実施形態において、第１の近接プローブおよび第２の近接プローブをそれぞれが含む複数のプローブ対を提供すること（ここで、各プローブ対は、特定のタンパク質分析物を標的にする）および対応するタンパク質分析物の存在下において各プローブ対のプローブ間でｄｓＤＮＡセグメントを生成することによって、生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための改善された近接伸長アッセイが提供され、その改善は、以下を含む。

【0012】

（ａ）（ｉ）タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列、および（ｉｉ）５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を二本鎖ＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、そのキャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程；

【0013】

（ｂ）タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および

【0014】

（ｃ）生成された配列リードにおいて観察されるタンパク質識別子バーコードから生物学的サンプル中のタンパク質分析物を識別する工程。

【0015】

いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、タンパク質特異的核酸配列およびキャプチャー配列をそれぞれが含むアダプターとｄｓＤＮＡセグメントを末端結合することによって実施される。

【0016】

実際には、キャプチャー配列における１またはそれを超える５ｈｍＣ残基を官能化することにより、サンプル、サンプルの一部、または複数の生体分子を含む混和物からｄｓＤＮＡテンプレート分子を取り出すことを促進することができる。これは、複数の種類の情報が抽出される単一の生物学的サンプルの組み合わせワークフロー分析の状況において特に有用である。

【0017】

別の実施形態において、第１の近接プローブおよび第２の近接プローブをそれぞれが含む複数のプローブ対を提供すること（ここで、各プローブ対は、特定のタンパク質分析物を標的にする）および対応するタンパク質分析物の存在下において各プローブ対のプローブ間でｄｓＤＮＡセグメントを生成することによって、生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための改善された近接伸長アッセイが提供され、その改善は、以下を含む。

【0018】

（ａ）（ｉ）タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列、（ｉｉ）分子バーコードとして供されるランダム核酸配列、および必要に応じて（ｉｉｉ）５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を二本鎖ＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、そのキャプチャー配列を必要に応じて含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程；

【0019】

（ｂ）タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および

【0020】

（ｃ）生成された配列リードにおいて観察されるタンパク質識別子バーコードから生物学的サンプル中のタンパク質分析物を識別する工程。

【0021】

関連の実施形態において、上記近接伸長アッセイは、工程（ｂ）の前に、少なくとも１つのタンパク質濃度コントロール組成物をｄｓＤＮＡテンプレート分子と合わせる工程をさらに含む。そのコントロール組成物は分子バーコードと一緒になって、特定のタンパク質分析物を示唆する配列リードの数を、タンパク質濃度コントロール組成物によって生成された配列リードと比較することによって、サンプル中の少なくとも１つのタンパク質分析物の元の濃度を測定することを可能にする。

【0022】

別の実施形態において、複数の生物学的サンプルの各々における複数のタンパク質分析物を識別するための改善された近接伸長アッセイが提供され、ここで、各生物学的サンプルに対して、このアッセイは、第１の近接プローブおよび第２の近接プローブをそれぞれが含む複数のプローブ対を提供する工程（ここで、各プローブ対は、特定のタンパク質分析物を標的にする）および対応するタンパク質分析物の存在下において各プローブ対のプローブ間でｄｓＤＮＡセグメントを生成する工程を含み、この改善は、以下を含む。

【0023】

（ａ）（ｉ）タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列、必要に応じて（ｉｉ）分子バーコードとして供されるランダム核酸配列、および必要に応じて（ｉｉｉ）５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を二本鎖ＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、必要に応じてキャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程；

【0024】

（ｂ）タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；

【0025】

（ｃ）生成された配列リードにおいて観察されるタンパク質識別子バーコードから生物学的サンプル中のタンパク質分析物を識別する工程；および

【0026】

（ｄ）少なくとも１００個の生物学的サンプルに対して工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を並行して実施する工程。

【0027】

例えば、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、少なくとも３００個の生物学的サンプル、少なくとも５００個の生物学的サンプルまたは少なくとも１５００個の生物学的サンプルに対して同時に実施され得る。

【0028】

関連の実施形態において、本発明は、ＤＮＡシーケンスベースの技術を用いて生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための方法を提供し、その方法は、以下を含む。

【0029】

（ａ）それぞれが、特定のタンパク質分析物を標的にし、第１の末端にタンパク質結合ドメイン、反対側の第２の末端に核酸結合ドメインおよびそれらの間に非ハイブリダイズ核酸領域を含む、複数のプローブ対を提供する工程であって、ここで、（ｉ）プローブ対の第１および第２の近接プローブのタンパク質結合ドメインは、同じタンパク質分析物上の異なる結合部位に同時に結合することができ、（ｉｉ）第１および第２の近接プローブが、両方ともそのタンパク質に結合しており、ハイブリダイゼーションが生じるのに十分近接しているとき、それらのプローブの核酸結合ドメインは、互いに相補的であり、ハイブリダイズして、ｄｓＤＮＡセグメントを形成する、工程；

【0030】

（ｂ）（ｉ）プローブ対内の各近接プローブのタンパク質結合ドメインが対応するタンパク質分析物に結合すること、および（ｉｉ）核酸結合ドメインが互いにハイブリダイゼーションして、第１の近接プローブを起源とする５’末端および第２の近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において生物学的サンプルまたはその一部をプローブ対とインキュベートする工程；

【0031】

（ｃ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、第１の近接プローブの３’末端を第２の近接プローブに沿って伸長して、タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列および５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を組み込むｄｓＤＮＡセグメントをプローブの間に生成する工程であって、ここで、（ｉ）第１のプローブ、第２のプローブ、または第１のプローブと第２のプローブの両方の核酸結合領域が、キャプチャー配列、タンパク質識別子バーコード、またはキャプチャー配列とタンパク質識別子バーコードの両方を含み；（ｉｉ）ｄＮＴＰ混合物は、少なくとも１つの５ｈｍＣ残基を含み；かつ／または（ｉｉｉ）ポリメラーゼ伸長後にｄｓＤＮＡセグメントの末端にアダプターがライゲートされ、ここで、少なくとも１つのアダプターが、キャプチャー配列、タンパク質識別子バーコードまたはキャプチャー配列とタンパク質識別子バーコードの両方を含み、それによって、それぞれがキャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が形成される、工程；

【0032】

（ｄ）キャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および

【0033】

（ｅ）工程（ｂ）において生成された配列リードにおいて観察されるタンパク質識別子バーコードから生物学的サンプル中のタンパク質分析物を識別する工程。

【0034】

上述の実施形態の１つの態様において、上記方法は、生物学的サンプルの一部、典型的には、血液サンプルから得られる血漿に対して実施される。

【0035】

追加の実施形態では、１またはそれを超える生物学的サンプル中のタンパク質分析物を、上記の実施形態のいずれかに関して示されたように分析し、同じ生物学的サンプル由来の無細胞核酸サンプルも同様に分析する、組み合わせワークフロー方法が提供される。

【0036】

本明細書に提供される組み合わせワークフロー方法の第１の実施形態において、無細胞核酸サンプルに対して得られる情報は、その無細胞核酸サンプル中のヌクレオソーム内の１またはそれを超えるヒストン修飾の存在または量に関する。そのヒストン修飾は、共有結合による翻訳後修飾（ＰＴＭ）、遺伝子発現に影響を与えるヒストン構造の変化であり得る。この実施形態の１つの態様において、目的の特定のヒストン修飾は、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーであり、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーも含み得る。

【0037】

本明細書に提供される組み合わせワークフロー方法の別の実施形態において、無細胞核酸サンプルに対して得られる情報は、その無細胞核酸サンプル中のｃｆＤＮＡの少なくとも１つの配列を含む。

【0038】

本明細書に提供される組み合わせワークフロー方法の別の実施形態において、無細胞核酸サンプルに対して得られる情報は、無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列を含む。

【0039】

本明細書に提供される組み合わせワークフロー方法の別の実施形態において、無細胞核酸サンプルに対して得られる情報は、ｃｆＤＮＡヒドロキシメチル化に関するエピジェネティックデータを含む。

【0040】

本明細書に提供される組み合わせワークフロー方法の別の実施形態において、無細胞核酸サンプルに対して得られる情報は、ｃｆＤＮＡメチル化に関するエピジェネティックデータを含む。

【0041】

さらなる実施形態では、１またはそれを超える生物学的サンプル中のタンパク質分析物を、上に記載されたように分析し、同じ生物学的サンプル由来の無細胞核酸サンプルを、ヒストン修飾；ｃｆＤＮＡ配列；ｃｆＲＮＡ配列；ｃｆＤＮＡヒドロキシメチル化；およびｃｆＤＮＡメチル化のうちの少なくとも２つに関して分析する、組み合わせワークフロー方法が提供される。

【0042】

別の実施形態において、本発明は、無細胞核酸サンプルを調製して、ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて、無細胞核酸サンプルに含まれているヌクレオソームにおける少なくとも１つのヒストン修飾の識別を可能にするための方法を提供する。その方法は、以下を含む。

【0043】

（ａ）ヒストンコアの周囲に巻き付いたｃｆＤＮＡ分子をそれぞれが含む複数のヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプルを提供する工程；

【0044】

（ｂ）末端ハイブリダイズ領域を含むアダプターをｃｆＤＮＡ分子の末端にライゲートし、それによって、それぞれがヒストンコアの周囲に巻き付いたアダプター結合ｃｆＤＮＡ分子を含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；

【0045】

（ｃ）第１の末端に、目的のヒストン修飾に特異的に結合するヒストン修飾結合ドメイン；第２の末端に、末端ハイブリダイズ領域に相補的な核酸結合ドメイン；およびそれらの間に、目的のヒストン修飾に対応し、それによって、ヒストン修飾バーコードとして供される、核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域、を含む近接プローブを提供する工程であって、ここで、その近接プローブは、ヒストン修飾結合ドメインが目的のヒストン修飾に結合することと、相補的な核酸結合ドメインがハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；

【0046】

（ｄ）（ｉ）ヒストン修飾結合ドメインがヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）相補的な核酸結合ドメインがハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および近接プローブを起源とする３’末端を有し、かつヒストン修飾バーコードを含むｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において、修飾された無細胞核酸サンプルを近接プローブとインキュベートする工程；および

【0047】

（ｅ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、ｄｓＤＮＡセグメントの５’末端を近接プローブの非ハイブリダイズ領域およびヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、増幅用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程。

【0048】

関連の実施形態において、工程（ｃ）は、それぞれが異なるヒストン修飾を標的にする複数の近接プローブを提供する工程を含む。

【0049】

別の関連の実施形態において、上記方法は、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程をさらに含む。

【0050】

追加の関連の実施形態において、上記方法は、増幅されたヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子をシーケンシングする工程、および生成された配列リードにおいて観察されるヒストン修飾バーコードからヒストン修飾のタイプおよび位置に関する情報を決定する工程も含む。

【0051】

本発明の別の実施形態は、無細胞核酸サンプルから抽出するためのｃｆＤＮＡの調製において少なくとも１つの５ｈｍＣ残基を含むアダプターを使用するための方法に関する。その方法は、（ａ）５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を含むＤＮＡアダプターを無細胞核酸サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；および（ｂ）タグ付けされたｃｆＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで５ｈｍＣ残基を官能化する工程を含む。そのアフィニティータグは、ビオチン自体などのビオチン部分、またはより典型的には、反応性部位を含むように共有結合的に修飾されたビオチンであり得る。その後、ビオチン化５ｈｍＣ部位を用いることにより、アビジンでコーティングされたまたはストレプトアビジンでコーティングされた支持体との反応によるサンプルからの抽出が可能になる。

【0052】

上述の実施形態の１つの態様において、アダプターは、ＵＦＩ配列、通常、無細胞核酸配列におけるｃｆＤＮＡの非配列特徴、すなわち特性をそれぞれが示す少なくとも２つのＵＦＩ配列をさらに含む。増幅およびシーケンシングの後、目的の非配列特徴が、配列リードにおいて観察されるＵＦＩ配列から明らかにされ得る。

【0053】

別の実施形態において、本発明は、シーケンシングベースの同時分析のために単一の無細胞核酸サンプル中の無細胞ＤＮＡおよび無細胞ＲＮＡを調製するための方法を提供する。その方法は、（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを無細胞サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、その少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；（ｂ）アダプター結合ＤＮＡおよびＲＮＡを精製して、アダプター結合ＤＮＡおよびＲＮＡの無細胞混和物を提供する工程；（ｃ）ＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；（ｄ）第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および（ｅ）ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む第２のアダプター配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下においてｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程を含む。

【0054】

本発明のさらなる実施形態では、シーケンシングベースの分析を用いて単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスが提供され、ここで、そのデータは、サンプル中のｃｆＤＮＡのヒドロキシメチル化プロファイル、ならびにｃｆＲＮＡに対する配列情報を含む。そのデータは、ＤＮＡ配列情報も含み得る。そのプロセスは、（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを無細胞核酸サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、その少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；（ｂ）サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターをｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞組成物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；（ｃ）その無細胞組成物から５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで無細胞組成物中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；（ｄ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、５ｈｍＣ含有ＤＮＡを無細胞組成物から取り出す工程；（ｅ）５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および（ｆ）バーコード化５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡをプールし、増幅し、かつシーケンシングする工程を含む。

【0055】

上述の実施形態の１つの態様において、工程（ｅ）は、５ｈｍＣプロセスバーコードをＤＮＡアダプターに組み込むことによって実施される。

【0056】

本発明の関連の実施形態では、シーケンシングベースの分析を用いて単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスが提供され、ここで、そのデータは、上記のように、サンプル中のｃｆＤＮＡのヒドロキシメチル化プロファイル、ｃｆＲＮＡ配列情報、および必要に応じてＤＮＡ配列情報を含み、サンプル中のｃｆＤＮＡのメチル化プロファイルをさらに含む。そのプロセスは、（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを無細胞核酸サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、その少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；（ｂ）サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターをｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞組成物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；（ｃ）その無細胞組成物から５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで無細胞組成物中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；（ｄ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、無細胞組成物から５ｈｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；（ｅ）５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；（ｆ）残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；（ｇ）サンプルから官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで、酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；（ｈ）サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；（ｉ）タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および（ｊ）タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程を含む。

【0057】

本発明の別の関連の実施形態では、シーケンシングベースの分析を用いて単一の無細胞核酸サンプルから少なくとも２種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスが提供され、ここで、そのデータは、サンプル中のｃｆＤＮＡのヒドロキシメチル化プロファイル、ｃｆＲＮＡ配列情報、および必要に応じてＤＮＡ配列情報を含む。このプロセスは、（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つの分子バーコードを含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターをサンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；（ｂ）サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、５ｈｍＣ残基、ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターをｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；（ｃ）無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグでサンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；（ｄ）５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよびバーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを無細胞サンプルから取り出す工程；および（ｅ）５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよびバーコード化アダプター結合ｃＤＮＡのプールされた混和物を増幅し、かつシーケンシングして、ＤＮＡヒドロキシメチル化および同じサンプル中のｃｆＲＮＡに関するデータを提供する工程を含む。

【0058】

本発明の追加の関連の実施形態では、シーケンシングベースの分析を用いて単一の無細胞核酸サンプルから少なくとも２種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスが提供され、ここで、そのデータは、無細胞核酸サンプル中のヌクレオソーム内の１またはそれを超えるヒストン修飾の存在または量、およびサンプル中のｃｆＲＮＡに対する配列情報を含む。このプロセスは、単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスを含み、このプロセスは、（ａ）ハイブリダイズ核酸領域を含むアダプターをヌクレオソーム会合ＤＮＡの各末端にライゲートし、それによって、アダプター結合ＤＮＡと会合したヌクレオソームを含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；（ｂ）第１の末端に、ヒストン修飾結合ドメイン、反対側の第２の末端に、ハイブリダイズ核酸領域に相補的な核酸結合ドメイン、およびそれらの間に、特定のヒストン修飾に対応し、それによってヒストン修飾バーコードとして供されるように選択された核酸配列を含む非ハイブリダイズ核酸領域を含む、近接プローブを提供する工程であって、ここで、その近接プローブは、ヒストン修飾結合ドメインがヒストン修飾に結合することと、相補的な核酸結合ドメインがハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；（ｃ）（ｉ）ヒストン修飾結合ドメインがヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）相補的な核酸結合ドメインがハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において、修飾された無細胞核酸サンプルを近接プローブとインキュベートする工程；および（ｄ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、セグメントの５’末端を近接プローブの非ハイブリダイズ領域およびヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、さらなる処理用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程；（ｅ）サンプル中の核酸を精製して、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡおよびＤＮＡを含む組成物を提供する工程；（ｆ）サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；（ｇ）その第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および（ｈ）ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下においてｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡおよびヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む核酸組成物を提供する工程を含む。この実施形態において、このプロセスは、（ｉ）ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子およびアダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含み、ここで、そのヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子およびアダプター結合ｃＤＮＡは、通常、プールされた混和物中で一緒に増幅され、シーケンシングされる（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。

【0059】

上述の実施形態の１つの態様において、上記プロセスは、サンプル中のｃｆＤＮＡの分析を組み込んで、そのヒドロキシメチル化プロファイルを決定する工程をさらに含む。このプロセスは、上述の実施形態の工程（ａ）～（ｈ）を実施する工程、次いで、（ｉ）５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで核酸組成物中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；（ｊ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡをその組成物から取り出す工程；（ｋ）タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および（ｌ）５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされていないＤＮＡ（工程（ｄ）において生成されたヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む）およびアダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程であって、ここで、増幅およびシーケンシングは、通常、様々な種のプールされた混和物を用いて実施される、工程を含む。

【0060】

上記実施形態の別の態様では、上記プロセスは、サンプル中のｃｆＤＮＡのメチル化プロファイルを決定することをさらに含む。そのプロセスは、上で説明した工程（ａ）～（ｋ）を実施する工程、次いで、（ｌ）残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；（ｍ）サンプルからの官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで、酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；（ｎ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；（ｏ）タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および（ｐ）タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされていないＤＮＡ（前述同様に、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む）およびアダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程であって、ここで、増幅およびシーケンシングは、再度、典型的には、様々な種のプールされた混和物を用いて実施される、工程を含む。

【0061】

本発明のさらなる実施形態では、血液サンプルに対する血漿タンパク質分析と、その血液サンプルの無細胞核酸画分の分析との両方を実施するための組み合わせワークフロープロセスが提供される。その血漿タンパク質分析は、近接伸長アッセイ用いたタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子の生成、ならびに最終的には、そのｄｓＤＮＡテンプレート分子を、無細胞核酸サンプルの分析において生成された１またはそれを超える様々なＤＮＡテンプレート分子、すなわち、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート、タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールすることを含む。

【0062】

別の実施形態において、本発明は、核酸テンプレート分子の非古典的な配列特徴を決定するためのシーケンシングベースの方法を提供し、その方法は、テンプレート分子の特定の非配列特徴を指定する識別子配列を核酸テンプレート分子に付加する工程；核酸テンプレート分子および付加された識別子配列を増幅して、付加された識別子配列をそれぞれが含む複数のアンプリコンを得る工程；およびそれらのアンプリコンをシーケンシングし、得られた配列リードから非配列特徴を決定する工程を含む。

【0063】

本発明のさらなる実施形態は、近接伸長アッセイにおける既知のタンパク質分析物から導き出されたタンパク質特異的核酸配列を含み、それによって、タンパク質識別子バーコードとして供される、二本鎖ＤＮＡテンプレート分子に関する。

【0064】

本発明のなおも別の実施形態は、単一の血液サンプルに由来するアダプター結合バーコード化二本鎖ＤＮＡテンプレート分子をそれぞれが含む、サンプル画分の組み合わせを提供し、その組み合わせは、（ａ）少なくとも１つのタンパク質関連ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む血漿由来サンプル画分であって、そのタンパク質関連ｄｓＤＮＡテンプレート分子のそれぞれが、特定のタンパク質分析物に対応するタンパク質特異的核酸配列を含み、それによって、タンパク質識別子バーコードとして供される、血漿由来サンプル画分；および（ｂ）血液サンプルから得られた無細胞核酸サンプルから得られた二本鎖ｃｆＤＮＡテンプレート分子を含む少なくとも１つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分であって、ここで、そのｃｆＤＮＡテンプレート分子は、ソース識別子バーコード、フラグメント識別子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコード、ランダムバーコードおよびそれらの組み合わせから選択されるＵＦＩ配列を含むアダプターのセットに末端結合されている、ｃｆＤＮＡ由来サンプル画分を含む。

【0065】

本発明のなおもさらなる実施形態において、サンプル画分の上述の組み合わせは、サンプル画分のプールされた混和物を含み、ここで、その混和物中のＤＮＡテンプレート分子は、同時に増幅され、シーケンシングされ得る。

【0066】

本発明の別の実施形態では、アダプターのライゲーション効率を改善し、ひいてはＤＮＡをシーケンシングするためのプロセスを改善するための方法および組成物が提供される。無細胞サンプル中のＤＮＡ濃度がすでに非常に低ければ、本発明の上述の方法および組成物は、ｃｆＤＮＡの分析において特に有用であることが理解されるであろう。さらに、それらの方法および組成物は、５ｍＣ含有ＤＮＡおよび５ｈｍＣ含有ＤＮＡのシーケンシングおよび定量化において特に有用である。なぜなら、これらの修飾されたシトシン残基は、比較的まれにしか存在せず、それぞれ全ＤＮＡ塩基の約１％および０．１％しか占めないからである。ゆえに、５ｍＣおよび５ｈｍＣ、特に５ｈｍＣを検出するためのいずれの方法も、特定される全５ｈｍＣ残基の割合に関して高効率を示す必要があり、また、高選択性を示す必要もある。この高選択性は、５ｍＣと特定される実質的にすべての残基が、実際に５ｍＣ残基であるはずであることを意味し、同様に、５ｈｍＣと特定される実質的にすべての残基が、５ｈｍＣ残基であるはずであることを意味する。

【0067】

さらなる実施形態において、本発明は、ｃｆＤＮＡ、例えば、５ｍＣ残基、５ｈｍＣ残基または５ｍＣ残基と５ｈｍＣ残基の両方を含むｃｆＤＮＡをシーケンシングするための改善された方法および組成物を提供し、ここで、その改善は、アダプター結合ｃｆＤＮＡが、増幅、例えば、ＰＣＲ増幅したときだけ、サンプル別にインデックスが付されるような、単一のテンプレートライゲーション反応を促進する切断型シーケンシングアダプターの使用を含む。

【0068】

別の実施形態では、識別子バーコードをｄｓＤＮＡ分子に付加するための方法が提供され、その方法は、以下を含む。

【0069】

（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプターを提供する工程；

【0070】

（ｂ）そのシーケンシングアダプターをＡテール化平滑末端ｄｓＤＮＡテンプレート分子にライゲートする工程；

【0071】

（ｃ）少なくとも１つのバーコード化プライマーを用いるＰＣＲプロセスにおいてアダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程であって、ここで、そのバーコード化プライマーは、（ｉ）アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする第２の領域を含み、その結果、ポリメラーゼの存在下におけるバーコード化プライマーの伸長によって、プライマーの第２の領域とアダプターの一本鎖セグメントとの二本鎖複合体が生じ、ここで、識別子バーコードを含む第１の領域は、その二本鎖複合体の末端を超えて一本鎖オリゴヌクレオチドテールとして伸長する、工程。

【0072】

関連の実施形態において、本発明は、ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングするためのキットを提供し、そのキットは、以下を備える。

【0073】

（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプター；

【0074】

（ｂ）（ｉ）アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする、第２の領域を含むバーコード化プライマー；および

【0075】

（ｃ）ポリメラーゼ。

【図面の簡単な説明】

【0076】

【図1】図１は、近接伸長アッセイおよびタンパク質ＵＦＩ配列を用いて生物学的サンプル中のタンパク質分析物に関する情報を古典的な配列情報に変換する流れを概略的に示している。

【0077】

【図2】図２は、近接プローブおよびヒストン修飾ＵＦＩ配列を用いてヌクレオソームにおけるヒストン修飾に関する情報を古典的な配列情報に変換するために無細胞ＣｈＩＰ（ｃｆＣｈＩＰ）法を用いる流れを概略的に示している。

【0078】

【図3】図３は、本発明の包括的な組み合わせワークフロープロセスを概略的に示している。

【0079】

【図4】図４は、ｃｆＲＮＡ分析を省略した本発明の別の組み合わせワークフロープロセスを概略的に示している。

【0080】

【図5】図５は、血漿プロテオミクスを含まない本発明の追加の組み合わせワークフロープロセスを概略的に示している。

【0081】

【図6】図６は、識別子配列（この図における「［インデックス］」）の付加において用いられる先行技術のテンプレート／アダプター／プライマー構築物を示している。

【0082】

【図7】図７は、本発明の切断型アダプターをバーコード化プライマーと組み合わせて用いている対応する構築物を示している。

【0083】

【図8】図８は、ＰＣＲプロセスにおいてインデックス付きプライマーおよび切断型アダプターを用いる流れを概略的に示している。

【0084】

【図9】図９は、実施例２のパート（ａ）に記載されるようなＤＮＡ断片化の後に得られたサイズ分布プロファイルを示している。

【0085】

【図10】図１０は、投入アダプターの濃度に対するライブラリー濃度（ｎｇ／μＬ）のプロット、およびＭＴ群のホールゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）である。

【0086】

【図11】図１１は、推定ＰＣＲ効率に対するサンプリングされたテンプレートの割合のプロットとして、アダプターの直接比較の結果を示している。

【0087】

【図12】図１２は、実施例３に記載されるような、切断型アダプターの効率と標準的なアダプターの効率とを横に並べた比較を提供している。

【発明を実施するための形態】

【0088】

１．用語および概要：

【0089】

別段の定めがないかぎり、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味を有する。本発明を説明するために特に重要な特定の用語は、以下に定義する。その他の関連用語は、国際特許出願公開ＷＯ２０１７／１７６６３０（Ｑｕａｋｅら、発明の名称「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｂｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ５－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」）に定義されている。本明細書で参照されている上記の特許公報ならびに他の全ての特許文献および刊行物は、参照により明示的に援用される。

【0090】

本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の意味を指示しなければ、複数表記を含む。したがって、例えば、「アダプター（ａｎ ａｄａｐｔｅｒ）」は、単一のアダプターだけでなく、同じであってもまたは異なってもよい２つまたはそれを超えるアダプターも指し、「テンプレート分子（ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、単一のテンプレート分子のみならず、複数のテンプレート分子を指すなど。

【0091】

数値範囲には、その範囲を規定している数値が含まれる。別段の定めがないかぎり、それぞれ、核酸は、５’から３’の方向に、左から右に記述され；アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、左から右に記述される。

【0092】

本明細書に示される見出しは、本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではない。したがって、このすぐ後に定義されている用語は、明細書を全体として参照することによって、より完全に定義される。

【0093】

別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９４）およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，１９９１）は、本明細書において使用される用語の多くの一般的な意味を当業者に提供している。それにもかかわらず、明確にするためおよび参照しやすくするために、特定の用語を下記に定義する。

【0094】

本明細書において使用される用語「サンプル」は、１またはそれを超える目的の分析物を含む、典型的には液状であるが必ずしもそうではない、材料または材料の混合物に関する。

【0095】

本明細書において使用される用語「生物学的サンプル」は、タンパク質、ペプチド、脂質、核酸などをはじめとした生体分子の混合物を含む、ヒト被験体の生体液、細胞、組織または臓器に由来するサンプルに関する。一般に、サンプルは、必ずではないが、全血サンプル、血清サンプルまたは血漿サンプルなどの血液サンプルである。

【0096】

用語「核酸サンプル」は、本明細書で用いられる場合、核酸を含有する生物学的サンプルを指す。核酸サンプルは、ヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプルであってもよく、その場合、核酸サンプルは、本明細書において、「ヌクレオソームサンプル」と呼ばれることがある。核酸サンプルは、サンプル中にヒストンおよび他のタンパク質を実質的に含まない無細胞ＤＮＡから構成されていてもよく、例えば無細胞ＤＮＡ精製後の場合があてはまるであろう。核酸サンプルは、本明細書において、無細胞ＲＮＡも含んでいてもよい。

【0097】

「サンプルフラクション」は、元の生物学的サンプルのサブセットを指し、血液サンプルを複数の等しいフラクションに分けた場合のように、その生物学的サンプルの組成的に等しい部分であってもよい。あるいは、サンプルフラクションは、組成的に異なっていてもよく、例えば、生物学的サンプルのある特定の成分を除去した場合（無細胞核酸の抽出がその一例である）があてはまるであろう。

【0098】

本明細書で用いられる場合、用語「無細胞核酸」は、無細胞ＤＮＡと無細胞ＲＮＡの両方を包含し、この無細胞ＤＮＡおよび無細胞ＲＮＡは、体液を含む生物学的サンプルの無細胞フラクション中に存在していてもよい。前記体液は、全血、血清、もしくは血漿を含む血液であってもよく、または尿、嚢胞液、もしくは別の体液であってもよい。多くの例において、生物学的サンプルは血液サンプルであり、無細胞核酸サンプルは、それらのサンプルから、当業者に知られている、および／または関連する書籍および文献に説明されている、現在普通に用いられている手段で抽出され、無細胞核酸抽出を行うためのキットは市販されている（例えば、ＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ ＭｉｎｉキットおよびＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキット（両方ともＱｉａｇｅｎ社から入手できる）、またはＭａｇＭＡＸ無細胞全核酸キット（Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｋｉｔ）およびＭａｇＭＡＸ ＤＮＡ単離キット（ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手できる））。例えば、Ｈｕｉら、Ｆｏｎｇら（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５５（３）：５８７－５９８も参照のこと。

【0099】

用語「ヌクレオチド」は、知られているプリンおよびピリミジン塩基だけではなく、他の修飾された複素環塩基も含有するような部分を含むことを意図している。このような修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボース、または他のアルキル化複素環を含む。また、用語「ヌクレオチド」は、ハプテンまたは蛍光標識を含有し、通常のリボース糖およびデオキシリボース糖だけではなく、他の糖も含有するような部分を含む。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドには、糖部位の修飾も含まれ、糖部位の修飾においては、例えば、１またはそれを超えるヒドロキシル基が、ハロゲン原子または脂肪族基で置換されているか、エーテル、アミンなどとして官能基化されている。本明細書において特に重要なものは、５－メチルシトシンおよびその酸化形態（例えば、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、および５－カルボキシメチルシトシン）を含む、修飾シトシン残基である。

【0100】

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる、任意の長さ、例えば、約２塩基超、約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１０００塩基超、および最長で約１０，０００またはそれを超える塩基数のポリマーを記述するために、互換的に用いられる。核酸は、酵素的に生成されたものでもよく、化学的に合成したものでもよく、天然に生じたものでもよい。

【0101】

用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、長さが約２～２００ヌクレオチド、最長で５００ヌクレオチドの、ヌクレオチドの一本鎖マルチマーを表す。

【0102】

オリゴヌクレオチドは、合成でも、酵素的に合成してもよく、いくつかの実施形態において、長さは３０～１５０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマーを含んでいてもよく（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってもよい）、および／またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、長さが１０～２０、２１～３０、３１～４０、４１～５０、５１～６０、６１～７０、７１～８０、８０～１００、１００～１５０、または１５０～２００ヌクレオチドである。

【0103】

用語「ハイブリダイゼーション」は、当該技術分野で知られているように、塩基対形成によって核酸鎖を相補鎖と接合させるプロセスを指す。ある核酸と参照核酸配列が、中程度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件において、互いに特異的にハイブリダイズする場合、その核酸は、前記参照核酸配列と「選択的にハイブリダイズできる」ものとみなされる。中程度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９５、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。

【0104】

用語「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」および「二重化した（ｄｕｐｌｅｘｅｄ）」は、本明細書において、塩基対を形成した、すなわち互いにハイブリダイズした２つの相補的ポリヌクレオチドを記述するために、互換的に用いられる。ＤＮＡ二本鎖は、本明細書において、「二本鎖ＤＮＡ」または「ｄｓＤＮＡ」と呼ばれ、インタクトな分子または分子のセグメントでありうる。例えば、本明細書において、バーコード化およびアダプター結合と呼ばれるｄｓＤＮＡは、インタクトな分子であるのに対し、近接伸長アッセイにおける各近接プローブの核酸末端配列間に形成されるｄｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡセグメントである。

【0105】

用語「鎖（ｓｔｒａｎｄ）」は、本明細書で用いる場合、共有結合、例えばホスホジエステル結合によって互いに共有結合したヌクレオチドからなる核酸の１本の鎖を指す。細胞において、ＤＮＡは、たいてい二本鎖形態で存在し、それ自体は、本明細書において「トップ」および「ボトム」鎖と呼ばれる２つの相補鎖を有する。ある特定のケースにおいて、染色体領域の相補鎖は、「プラス」および「マイナス」鎖、「ポジティブ」および「ネガティブ」鎖、「第１」および「第２」鎖、「コード」および「非コード」鎖、「ワトソン」および「クリック」鎖、または「センス」および「アンチセンス」鎖と呼ばれることがある。ある鎖をトップまたはボトム鎖のどちらと定めるかは任意であり、何らかの特定の向き、機能、または構造を意味するものではない。いくつかの例示的な哺乳類の染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリー、染色体など）の第１鎖のヌクレオチド配列が知られており、例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベース中に存在することがある。

【0106】

用語「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成したとき、核酸合成の開始点として作用することができ、その３’末端からテンプレートに沿って伸長されて、伸長された二重鎖を形成することができる、合成オリゴヌクレオチドを指す。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決まる。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、一般に、プライマー伸長産物の合成におけるそれらの使用に適合する長さであり、通常、８～１００ヌクレオチド長、例えば、１０～７５、１５～６０、１５～４０、１８～３０、２０～４０、２１～５０、２２～４５、２５～４０などの範囲である。典型的なプライマーは、１０～５０ヌクレオチド長、例えば、１５～４５、１８～４０、２０～３０、２１～２５などの範囲であり得、述べた範囲の間の任意の長さであり得る。いくつかの実施形態において、プライマーは、通常、長くとも約１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０ヌクレオチド長である。

【0107】

ＤＮＡ複製反応を引き起こすために用いられる「プライマー」のように、「アダプター」も、生物学的分析において特定の目的を果たす短い合成オリゴヌクレオチドである。アダプターは、一本鎖または二本鎖であり得るが、本明細書における好ましいアダプターは、二本鎖である。１つの実施形態において、アダプターは、ヘアピンアダプター（すなわち、それ自体と塩基対形成して、二本鎖ステムおよびループを有する構造を形成する１つの分子であって、ここで、その分子の３’および５’末端は、それぞれ二本鎖ＤＮＡ分子の５’および３’末端にライゲートする）であり得る。別の実施形態において、アダプターは、Ｙアダプターであり得る。別の実施形態において、アダプターはそれ自体が、互いと塩基対形成した２つの異なるオリゴヌクレオチド分子から構成され得る。明らかであるように、アダプターのライゲート可能な末端は、制限酵素による切断によって生成されるオーバーハングと適合性であるようにデザインされてもよいし、平滑末端または５’Ｔオーバーハングを有してもよい。用語「アダプター」は、二本鎖分子ならびに一本鎖分子を指す。アダプターは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれら２つの混合物であり得る。ＲＮＡを含むアダプターは、ＲＮａｓｅ処理またはアルカリ加水分解によって切断可能であり得る。アダプターは、１５～１００塩基、例えば、５０～７０塩基であり得るが、この範囲外のアダプターも想定される。

【0108】

用語「アダプター結合」は、本明細書で用いられる場合、アダプターに結合した核酸を指す。アダプターは、核酸分子の５’末端および／または３’末端に結合しうる。本明細書で用いられる場合、用語「アダプター配列付加」は、アダプターを、サンプル中のフラグメントの末端に付加する行為を指す。これは、ポリメラーゼを用いてフラグメントの末端を充填すること、末端Ａ配列を付加すること、次いでこの末端Ａ配列を有するフラグメントにＴ突出を含むアダプターを結合させることによって行われうる。アダプターは、通常、リガーゼを用いてＤＮＡ二本鎖に結合されるが、ＲＮＡでは、ｃＤＮＡ二本鎖の少なくとも１つの末端に、好ましくはリガーゼ不存在下で、共有結合または他の形で結合される。

【0109】

用語「非対称アダプター」は、本明細書で用いられる場合、二本鎖核酸フラグメントの両末端に結合された場合に、３’末端のタグ配列と同じではない、または相補的ではない５’タグ配列を含むトップ鎖を生じさせるであろうアダプターを指す。非対称アダプターの例は、米国特許第５，７１２，１２６号および第６，３７２，４３４号（Ｗｅｉｓｓｍａｎら）、および国際特許出願公開ＷＯ２００９／０３２１６７（Ｂｉｇｎｅｌｌら）に記載されている。非対称にタグがつけられたフラグメントは、２つのプライマー、すなわち鎖の３’末端に付加された第１のタグ配列とハイブリダイズする第１のプライマー；およびもう一方の、鎖の５’末端に付加された第２のタグ配列の相補鎖とハイブリダイズする第２のプライマーによって増幅されうる。Ｙ字アダプターおよびヘアピンアダプター（ヘアピンアダプターは、ライゲーション後に切断することによって、「Ｙ字アダプター」を生じうる）は、非対称アダプターの例である。

【0110】

用語「Ｙ字アダプター」は、二本鎖領域と、対向する配列が相補的ではない一本鎖領域とを含むアダプターを指す。二本鎖領域の末端は、例えばライゲーションまたはトランスポザーゼ触媒反応によって、ゲノムＤＮＡの二本鎖フラグメントなどの標的分子に結合できる。Ｙ字アダプターに結合した、アダプタータグがついた二本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖は、一方の末端にＹ字アダプターの一方の鎖の配列を有し、他方の末端にＹ字アダプターの他方の鎖の配列を有するという点で、非対称にタグがつけられている。両方の末端がＹ字アダプターに結合した核酸分子を増幅することによって、非対称にタグがつけられた核酸、すなわち、あるタグ配列を含む５’末端と、別のタグ配列を含む３’末端とを有する核酸が生じる。

【0111】

用語「ヘアピンアダプター」は、ヘアピン形状のアダプターを指す。一実施形態において、ライゲーション後に、ヘアピンループを切断し、各末端に非相補タグを有する鎖を生じさせることができる。いくつかのケースにおいて、ヘアピンアダプターのループは、ウラシル残基を含んでいてもよく、そのようなループは、他の方法も知られているが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩによって切断することができる。

【0112】

本明細書において使用される用語「アダプター連結サンプル」は、アダプターに結合しているサンプルを指す。上記の定義を考慮すれば理解されるであろうが、非対称アダプターに結合したサンプルは、５’および３’末端に非相補配列を有する鎖を含む。

【0113】

本明細書において使用される用語「増幅する」は、任意の適切な核酸増幅技術、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅（ネステッドＰＣＲおよびマルチプレックスＰＣＲを含む）、ＲＣＡ（ローリングサークル増幅）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、ＴＭＡ（転写物媒介増幅）およびＳＤＡ（鎖置換増幅）などの技術を用いて実施され得るような、テンプレート核酸の１またはそれを超えるコピー、つまり「アンプリコン」を生成することを指す。特定の状況においては、例えば、マルチプレックスＰＣＲとＲＣＡとの併用（例えば、Ｇｏｎｇら、（２０１８）ＲＳＣ Ａｄｖ．８：２７３７５を参照のこと）、ＲＣＡと定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）との併用（例えば、Ｌｉｕら、（２０１６）Ａｎａｌ Ｓｃｉ．３２：９６３－９６８を参照のこと）など、増幅技術の組み合わせが有益に使用され得ることが理解されるであろう。

【0114】

用語「富化する」および「富化」は、ある特定の特徴を有するテンプレート分子（例えば、５－ヒドロキシメチルシトシンを含む核酸）を、そのような特徴を持たない分析対象物（例えば、ヒドロキシメチルシトシンを含まない核酸）から部分精製することを指す。富化は、典型的には、前記の特徴を有する分析対象物の濃度を、前記特徴を持たない分析対象物に対して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍高める。富化後、サンプル中の分析対象物の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、富化に用いた特徴を有しうる。例えば、富化した組成物中の核酸分子の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、キャプチャータグを含むように修飾された１またはそれを超えるヒドロキシメチルシトシンを有する鎖を含んでいてもよい。

【0115】

用語「シーケンシング」は、本明細書で用いられる場合、その方法によって、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが識別される（例えば、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、もしくは少なくとも２００、またはそれを超える連続したヌクレオチドが識別される）ような方法を指す。

【0116】

用語「次世代シーケンシング（ＮＧＳ、ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」または「ハイスループットシーケンシング」は、本明細書で用いられる場合、現在Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｈｅ社などによって採用されている、いわゆるパラレルＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）またはＳＢＬ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）プラットフォームを指す。次世代シーケンシング法としては、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって商業化された方法などのナノポアシーケンシング法、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって商業化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術などの電子的検出方法、およびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社によって商業化された方法などの単分子蛍光に基づく方法などもあげられうる。

【0117】

用語「読み取りデータ（ｒｅａｄ）」は、本明細書で用いられる場合、シーケンシングシステム（例えば、超並列シーケンシングなど）の生の出力または加工された出力を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法の出力は、読み取りデータである。いくつかの実施形態において、それらの読み取りデータは、トリミング、フィルター、およびアライメントが必要であることがあり、結果として、生の読み取りデータ、トリミングされた読み取りデータ、アライメントされた読み取りデータが得られる。

【0118】

「ＵＦＩ」は、核酸分子群を特徴付ける固有特性識別子である。ＵＦＩは、時折、「バーコード」と呼ばれる（本明細書において時折、「ＵＦＩ配列」または「ＵＦＩバーコード」と呼ばれる）ものにおける特定の核酸配列であり得るか、またはグリコシル化、ビオチン化などによって生じ得るような化学タグであり得る。ＵＦＩは、特定の特徴、例えば、付加された部分または組み込まれた部分が存在しないことでもあり得る。例えば、ＵＦＩは、特定のバーコードが存在しないこと、またはグリコシル化部分もしくはビオチン化部分が存在しないことなどであり得る。ＵＦＩ配列は、典型的には、核酸分子の特徴を識別するように働く比較的短い核酸配列である。ＵＦＩを含む核酸テンプレート分子およびそのアンプリコンは時折、「バーコード化」テンプレート分子またはアンプリコンと本明細書において呼ばれる。ＵＦＩ配列のタイプの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。

【0119】

「分子ＵＦＩ配列」（または「分子バーコード」）は、そのＵＦＩ配列が十分な長さである場合に、各核酸テンプレート分子が、ユニークなＵＦＩ配列に付着されるように、サンプル中の各核酸テンプレート分子に付加される短い核酸配列である。分子ＵＦＩ配列は、通常、一続きのランダムヌクレオチドとしてデザインされるか、部分的に縮重のヌクレオチドとしてデザインされるか、またはいくつかの場合、すなわち、限定された数のテンプレート分子の場合は、定義されたヌクレオチドとしてデザインされる。当該分野で公知であるように、分子ＵＦＩ配列を用いることにより、増幅エラーおよび配列分析装置エラーを説明および相殺することができ、ユーザーが複製物を追跡することおよびそれらを下流の分析から除去することを可能にでき、分子の計数、ひいては分析物の濃度測定を可能にできる。例えば、Ｃａｓｂｏｎら、（２０１１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１２）：１－８を参照のこと。

【0120】

「サンプルＵＦＩ配列」（または「サンプルバーコード」または「インデックス付きＵＦＩ」）は、複数のサンプルが組み合わされ、処理され、一緒にシーケンシングされ得るように、サンプル中の各核酸テンプレート分子に付加される核酸配列であり、ここで、そのサンプルＵＦＩ配列は、読み取りデータをサンプル別にソーティングおよびグルーピングすること（すなわち、脱多重化（ｄｅ－ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ））を可能にする。サンプルＵＦＩ配列は、サンプルを得た個体を識別する。

【0121】

「ソース識別子配列」（または「ソースＵＦＩ」または「ソースバーコード」）は、ソース起源を識別する。ソースＵＦＩは、通常、サンプルＵＦＩであり得る。しかしながら、特定の場合において、例えば、様々な種類のサンプルが、同じ個体から得られるとき（例えば、血液サンプル、嚢胞液など）、ソースＵＦＩは、サンプルを得た患者ではなく、そのサンプルの生理学的起源を指摘し得る。単一の個体から得られた２またはそれを超えるサンプルタイプを含む複数のサンプルが組み合わされるときは、サンプルバーコードとソースバーコードの両方を用いるべきである。

【0122】

「フラグメント識別子配列」（または「フラグメントＵＦＩ」または「フラグメントバーコード」）：核酸が、多くのフラグメントの集団（無細胞ＤＮＡに天然に存在するような）を含むか、または複数の公知の断片化技術（例えば、物理的、超音波処理、酵素的など）によって操作され得る、核酸サンプルにおいては、サンプル中の各フラグメントに、対応するフラグメント識別子配列でバーコードが付けられる。非重複フラグメント識別子配列を有する配列リードは、さまざまな元の核酸テンプレート分子に相当し、同じフラグメント識別子配列または実質的に重複するフラグメント識別子配列を有する読み取りデータは、同じテンプレート分子のフラグメントに相当する可能性がある。ここで特定されるユニークな特徴は、フラグメントが由来するテンプレート核酸分子である。

【0123】

「鎖識別子配列」（または「鎖ＵＦＩ」もしくは「鎖バーコード」）によって、ＤＮＡ二本鎖の２つの鎖がそれぞれ独立してタグづけされ、それによって読み取りデータの起源である鎖が判定できる（すなわち、ＷストランドまたはＣストランドとして判定できる）。

【0124】

「タンパク質識別子配列」（または「タンパク質ＵＦＩ」または「タンパク質バーコード」）は、近接プローブが特異的に結合する対応するタンパク質の存在下において近接プローブ対の核酸テールの間で形成されたハイブリダイズ領域内に、ハイブリダイズ領域に隣接して、またはハイブリダイズ領域の近くに、含められる。ゆえに、タンパク質識別子配列は、読み出されたとき、近接プローブ対によって標的化にれたタンパク質分析物の存在を識別する。

【0125】

「ヒストン修飾識別子配列」（または「ヒストン修飾ＵＦＩ」または「ヒストン修飾バーコード」）は、ヌクレオソームにおいて特定されたヒストン修飾を識別するために、本明細書に記載されている無細胞クロマチン免疫沈降（ｃｆＣｈＩＰ）技術において用いられる。ヒストン修飾識別子配列は、プローブの核酸テール、すなわち、プローブの第１の末端と、ヒストンの周囲に巻き付いたＤＮＡの末端との間で形成されたハイブリダイズ領域内に、ハイブリダイズ領域に隣接して、またはハイブリダイズ領域の近くに、含められる。プローブの他方の末端は、目的のヒストン修飾に結合する。したがって、ヒストン修飾識別子配列は、読み出されたとき、ヒストン修飾の存在を識別する。

【0126】

「５ｈｍＣ識別子配列」（または「５ｈｍＣバーコード」）によって、サンプル中の５ｈｍＣ含有無細胞ＤＮＡテンプレート分子を起源とするＤＮＡフラグメント、すなわち「ヒドロキシメチル化」ＤＮＡが識別される。

【0127】

「５ｍＣ識別子配列」（または「５ｍＣバーコード」）によって、５ｈｍＣを含まない５ｍＣ含有無細胞ＤＮＡテンプレート分子を起源とするＤＮＡフラグメントが識別される。

【0128】

「無細胞ＲＮＡ識別子配列」（または「ｃｆＲＮＡ ＵＦＩ」）は、ｃＤＮＡフラグメントがｃｆＲＮＡテンプレート分子を起源とすると識別する。

【0129】

これらのおよび他のＵＦＩは、非古典的な配列特徴（例えば、血漿タンパク質の存在および濃度、ヒストン修飾の位置および種類、ヒドロキシメチル化プロファイル、メチル化プロファイルなど）を、その非古典的な配列特徴を導き出すことができる古典的な配列データに変換するための根拠を提供する。その適用は、上述のタイプのＵＦＩに限定されず、他のタイプのＵＦＩも想定される。例えば、多くの種類の「プロセス識別子配列」または「プロセスＵＦＩ」が、増幅されていないテンプレートＤＮＡフラグメントの初期プールを非配列特徴に基づいて分割するために用いられるいくつかのプロセスのいずれか１つを識別するために使用され得る。ヒストン修飾ＵＦＩ、タンパク質ＵＦＩおよびエピジェネティックＵＦＩ（５ｈｍＣ ＵＦＩおよび５ｍＣ ＵＦＩを含む）（これらのすべてがプロセスＵＦＩとして特徴付けられ得る）に加えて、テンプレート分子の配列の外側の隣接するゲノム領域（例えば、ゲノム全長にわたるＣＴＣＦ結合部位）の存在または同一性を指摘するＵＦＩをはじめ、本発明とともに有益に用いることができる他のタイプのＵＦＩもある。

【0130】

いくつかの実施形態において、ＵＦＩは、１～約３５ヌクレオチド、例えば、２～３０ヌクレオチド、４～３０ヌクレオチド、４～２４ヌクレオチド、４～１６ヌクレオチド、４～１２ヌクレオチド、６～２０ヌクレオチド、６～１６ヌクレオチド、６～１２ヌクレオチドなどの範囲の長さを有し得る。特定の場合では、上で述べたように、ＵＦＩは、エラー検出性および／またはエラー訂正性であり得、これは、たとえエラーがあったとしても（例えば、分子バーコード配列の決定に至るまでの様々な処理工程のいずれかの間に、分子バーコードの配列が、誤って合成されるか、誤って読まれるか、または歪められた場合でも）、そのコードを正しく解釈できることを意味する。エラー訂正性配列の使用は、文献（例えば、Ｈａｍａｔｉらの米国特許出願公開第２０１０／０３２３３４８号およびＢｒａｖｅｒｍａｎらの同第２００９／０１０５９５９号（これらの両方が参照により本明細書に援用される））に記載されている。

【0131】

本明細書におけるＵＦＩ配列として働くオリゴヌクレオチドは、任意の有効な方法によってＤＮＡ分子中に組み込まれてもよく、「～の中に組み込まれる（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ）」は、本明細書において、前記ＵＦＩがＤＮＡ分子の末端、ＤＮＡ分子の末端付近、またはＤＮＡ分子内に設けられるかぎり、「～に付加される（ａｄｄｅｄ ｔｏ）」および「～に追加される（ａｐｐｅｎｄｅｄ ｔｏ）」と互換的に用いられる。例えば、複数のＵＦＩが、選ばれたリガーゼを用いてＤＮＡの末端に結合されてもよく、この場合、最後に結合されたＵＦＩだけが分子の「末端」に存在する。さらに、以下で詳述されている近接伸長アッセイおよびヒストン修飾法において、ＵＦＩは、近接プローブの核酸テール内に、近接プローブの核酸テールの末端に、またはタンパク質標的にプローブが結合すると生成されるハイブリダイズした領域内に含まれ得る。

【0132】

本明細書において使用される用語「タンパク質分析物」は、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をはじめとした複数のペプチド種を包含し、ここで、分析物として、目的の種は、特定のサンプル中に存在してもよいし、存在しなくてもよい。したがって、本明細書におけるサンプル中の分析物の「検出」は、分析物の有無の検出、分析物が存在する可能性の確認、検出された分析物の濃度の確認などを含み得る。

【0133】

より一般的には、用語「検出」は、任意の形態の測定を指し、あるエレメントが存在するか否かを判定することを含む、用語「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」および「分析する」と交換可能に使用される。これらの用語は、定量的および／または定性的な決定の両方を含む。評価は、相対的であっても絶対的であってもよい。ゆえに、「存在の評価」には、存在する部分の量の決定、ならびに存在するかまたは存在しないかの判定が含まれる。

【0134】

「ヒドロキシメチル化レベル」または「ヒドロキシメチル化状態」は、目的の遺伝子座内におけるヒドロキシメチル化の程度である。ヒドロキシメチル化の程度は、通常、ヒドロキシメチル化密度、例えば、ある核酸領域内の全シトシン（修飾されたものと未修飾のものの両方）に対する５ｈｍＣ残基の比として測定される。他のヒドロキシメチル化密度の尺度も考えられ、例えば、ある核酸領域における全ヌクレオチドに対する５ｈｍＣ残基の比である。

【0135】

「ヒドロキシメチル化プロファイル」または「ヒドロキシメチル化シグネチャ」は、複数のヒドロキシメチル化遺伝子座の各々におけるヒドロキシメチル化レベルを含むデータセットを指す。

【0136】

２．タンパク質分析物の検出：

【0137】

第１の実施形態において、生物学的サンプル中のタンパク質分析物を検出するための方法が提供され、その方法は、タンパク質分析物の存在の検出、ならびに定量化、すなわち、分析物の量または濃度の決定を含み得る。本明細書に記載されている他の方法と同様に、得ようとするおよび得られる情報は、適切にバーコードが付けられた核酸テンプレート分子によって生成される配列リードに由来する。その方法は、下記に記載されるように、サンプル中の複数のタンパク質分析物の各々の検出にまで及ぶことが理解されるであろう。

【0138】

近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）および近接伸長アッセイ（ＰＥＡ）は、複雑な生物学的サンプル中のタンパク質の検出および定量化のために用いられる確立された方法である。ＰＬＡは、ＤＮＡ鎖と結合した抗体である２つの「近接プローブ」にタンパク質分析物を結合することを含む。それらの鎖が十分に近接するとき（この近接は、プローブが標的分析物に結合しているときに生じる）、それらは、ＤＮＡリガーゼ酵素によって一体化される。次いで、そのライゲーション産物は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対するテンプレートとしての役割を果たし、存在するタンパク質分析物の量を反映する。タンパク質分析物の検出および定量化においては、ＰＥＡ法も知られており、特に、複雑な生物学的サンプルにおいて、ＰＬＡが著しい回収損失をもたらす限り、ＰＥＡ法は、ＰＬＡに対する有意な改善点を提供する。例えば、Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、（２０１１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３９（１５）：１－８を参照のこと。ＰＬＡのように、ＰＥＡも、それぞれが本質的にＤＮＡ鎖に結合した抗体である、２つの近接プローブを使用することに頼っている。ＰＥＡでは、プローブ対の一方のプローブのＤＮＡ「テール」が、その対の他方のプローブのＤＮＡテールにハイブリダイズし、その結果、それらのプローブの間で二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）セグメントが形成され、ここで、５’末端は、その対の第１の近接プローブを起源とする。次いで、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を用いて、そのｄｓＤＮＡセグメントの５’末端を第２の近接プローブに沿って伸長する。次いで、ＰＬＡアッセイと同様に、近接伸長産物を従来のタンパク質アッセイにおいてｑＰＣＲのテンプレートとして使用して、目的の分析物を定量化する。

【0139】

本発明は、定量的ＰＣＲの必要を無くし、その代わりにシーケンシング、典型的にはＮＧＳを用いて、生物学的サンプル中の少なくとも１つのタンパク質分析物を検出し、定量化する。本発明の改善された近接伸長アッセイを用いて生成されたシーケンシングされる核酸産物は、増幅されたタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、すなわち、タンパク質特異的ＵＦＩ配列を含むｄｓＤＮＡアンプリコン（またはＰＣＲ産物）である。そのタンパク質バーコード化アンプリコンをシーケンシングし、配列リードをデコンボリューションして、配列リードにおいて観察されるタンパク質ＵＦＩ配列からタンパク質分析物の存在および量を決定する。

【0140】

１つの態様において、本発明は、第１の近接プローブおよび第２の近接プローブをそれぞれが含む複数のプローブ対を提供すること（ここで、各プローブ対は、特定のタンパク質分析物を標的にする）および対応するタンパク質分析物の存在下において各プローブ対のプローブ間でｄｓＤＮＡセグメントを生成することによって生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための改善された近接伸長アッセイを提供し、ここで、その改善は、以下を含む：タンパク質特異的ＵＦＩ配列をプローブ対のプローブ間で生成されたｄｓＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程；タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および生成された配列リードにおいて観察されるタンパク質特異的ＵＦＩから生物学的サンプル中のタンパク質分析物を識別する工程。典型的には、タンパク質特異的ＵＦＩは、セグメントの少なくとも１つの末端へのＵＦＩ含有アダプターの末端結合によってｄｓＤＮＡセグメントに組み込まれる。この方法は、図１に概略的に示されている。

【0141】

最適には、上述のプロセスにおいて生成されたタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子は、５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列とともに提供される。そのキャプチャー配列は、単一の５ｈｍＣ残基であり得るか、または単一の５ｈｍＣ残基を含む短いオリゴヌクレオチド配列、または２もしくはそれを超える５ｈｍＣ残基を含む短いオリゴヌクレオチド配列配列であり得る。５ｈｍＣ残基が存在することにより、その５ｈｍＣをビオチンなどのアフィニティータグで官能化することによる捕捉が可能になり、そしてアビジンまたはストレプトアビジン表面を用いて、サンプルまたはその一部からビオチン化種を取り出すことが可能になる。

【0142】

異なるプローブ対によって生成された各ｄｓＤＮＡテンプレート分子は、そのプローブ対によって標的化されるタンパク質分析物に対応するユニークなタンパク質ＵＦＩ配列を有するが、タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子はすべて、同じキャプチャー配列を有し得ることが理解されるであろう。タンパク質特異的ＵＦＩ配列およびキャプチャー配列は、単一のオリゴヌクレオチド配列またはアダプターとして、プローブ間で生成されたｄｓＤＮＡテンプレートに同時に付加され得る。あるいは、タンパク質特異的ＵＦＩ配列がまず付加された後、キャプチャー配列が付加され得る。複製物を追跡するため、分子の計数を可能にするため、ならびに増幅エラーおよび配列分析装置エラーを相殺するために、近接伸長アッセイによって生成された各ｄｓＤＮＡテンプレート分子に、タンパク質特異的ＵＦＩおよび自由選択の５ｈｍＣ含有キャプチャー配列とともに分子ＵＦＩ配列も付加され得る。

【0143】

生物学的サンプル中のタンパク質分析物の濃度を決定するために、上で説明した改善された近接伸長アッセイは、タンパク質濃度コントロール組成物の使用をさらに含む。特定のタンパク質分析物を示唆する配列リードを、最初に生物学的サンプルに組み込まれていたタンパク質濃度コントロール組成物によって生成された配列リードと比較する。タンパク質濃度コントロール組成物は、当該分野で公知であり、それらとしては、既知濃度のタンパク質を処理の前にサンプルに添加するスパイクイン（ｓｐｉｋｅ－ｉｎ）コントロールが例として挙げられる。いくつかの実施形態において、そのスパイクインコントロールを、ある濃度範囲全体にわたってさまざまな濃度を有するコントロール組成物を含む濃度ラダーと併せて用いる。

【0144】

タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレートの配列リードからタンパク質分析物を決定する本方法の利点は、多数の生物学的サンプル、例えば、血液サンプルまたはその一部（例えば、血漿サンプルまたは血清サンプル）を同時に処理できる点である。少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個または少なくとも１５００個またはそれを超える生物学的サンプルを容易に同時に処理できる。９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルプレートなどの市販のマイクロウェルプレートの個々のウェルにおいて処理されるように各サンプルを提供することが好都合であり得る。別の利点は、同じサンプルに対して他のタイプの分析を実施できる点、および下記で詳細に説明されるような、シーケンシングを介してさらなる情報を取得することもできる点である。

【0145】

上記の実施形態のバリエーションでは、ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための関連方法が提供され、その方法は、以下を含む。

【0146】

（ａ）それぞれが、特定のタンパク質分析物を標的にし、第１の末端にタンパク質結合ドメイン、反対側の第２の末端に核酸結合ドメインおよびそれらの間に非ハイブリダイズ核酸領域を含む、複数のプローブ対を提供する工程であって、ここで、（ｉ）第１および第２の近接プローブのタンパク質結合ドメインは、同じタンパク質分析物上の異なる結合部位に同時に結合することができ、（ｉｉ）第１および第２の近接プローブが、両方ともそのタンパク質に結合しており、ハイブリダイゼーションが生じるのに十分近接しているとき、プローブの核酸結合ドメインは、互いに相補的であり、ハイブリダイズして、ｄｓＤＮＡセグメントを形成する、工程；

【0147】

（ｂ）（ｉ）プローブ対内の各近接プローブのタンパク質結合ドメインが対応するタンパク質分析物に結合すること、および（ｉｉ）核酸結合ドメインが互いにハイブリダイゼーションして、第１の近接プローブを起源とする５’末端および第２の近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において生物学的サンプルまたはその一部をプローブ対とインキュベートする工程；

【0148】

（ｃ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、第１の近接プローブの５’末端を第２の近接プローブに沿って伸長して、タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列および５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を組み込むｄｓＤＮＡセグメントをプローブの間に生成する工程であって、ここで、（ｉ）第１のプローブ、第２のプローブ、または第１のプローブと第２のプローブの両方の核酸結合領域が、キャプチャー配列、タンパク質識別子バーコード、またはキャプチャー配列とタンパク質識別子バーコードの両方を含み；（ｉｉ）ｄＮＴＰ混合物は、少なくとも１つの５ｈｍＣ残基を含み；かつ／または（ｉｉｉ）ポリメラーゼ伸長後にｄｓＤＮＡセグメントの末端にアダプターがライゲートされ、ここで、少なくとも１つのアダプターが、キャプチャー配列、タンパク質識別子バーコードまたはキャプチャー配列とタンパク質識別子バーコードの両方を含み、それによって、それぞれがキャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が形成される、工程；

【0149】

（ｄ）キャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および

【0150】

（ｅ）工程（ｂ）において生成された配列リードにおいて観察されるタンパク質識別子バーコードから生物学的サンプル中のタンパク質分析物を識別する工程。

【0151】

言及される種類の近接プローブにおいて、各タンパク質結合ドメインが抗原を含み、各結合部位がエピトープを含むことを当業者は理解するだろう。

【0152】

上述の方法の好ましいバージョンでは、前述同様に、生物学的サンプルは通常、血液サンプルであり、タンパク質分析は、血液サンプルの一部（例えば、サンプル由来の血清または血漿、典型的には血漿）に対して行われることにも留意すべきである。

【0153】

３．タンパク質アッセイと無細胞サンプル分析との組み合わせ：

【0154】

１つの実施形態において、生物学的サンプルは、血液サンプルであり、タンパク質分析物の検出は、そのサンプルの一部、典型的には、血漿画分に対して実施され、所望であれば、他のタイプの分析が、同じサンプルの無細胞画分に対して実施される。これは、図１に概略的に示されている。このような場合、増幅されたタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子は、無細胞サンプル画分の分析によって生成された他のタイプの増幅されたバーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子とともに、単一のプールにおいてシーケンシングされ得る。無細胞サンプル画分の処理に由来するこれらの他のｄｓＤＮＡテンプレート分子には、例えば、ヒストン修飾ＵＦＩ、５ｈｍＣ関連ＵＦＩ、５ｍＣ関連ＵＦＩ、無細胞ＲＮＡに由来するｃＤＮＡとしてＤＮＡ二重鎖を指摘するＵＦＩなどを有するテンプレート分子が含まれ得る。様々な種類のバーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が、増幅の前にプールされ、単一のランで一緒に増幅され得るか、またはそれらのバーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子は、シーケンシングの前に増幅され得る。後者の方法は、珍しい特徴を有するがゆえに他のテンプレート分子よりも有意に低い濃度で存在するテンプレート分子の場合など、１種類のテンプレート分子を別のテンプレート分子よりも大きい程度にまで増幅するとき、有用である。例えば、５ｈｍＣ含有ｄｓＤＮＡテンプレート分子は、他のテンプレート分子よりも有意に低い濃度で存在する。テンプレート分子群の事前増幅の後、プールし、すべてのテンプレート分子を単一のランで増幅することは、同じ状況において適切なもう１つの方法である。事前増幅は、バーコードが付けられた特徴を共有するテンプレート分子群を生物学的サンプルまたはテンプレート分子の混和物から分離した後、残りのテンプレート分子と再度合わせ、同時に増幅することを含む。

【0155】

前述のセクションに記載されたような近接伸長法と組み合わせて、タンパク質分析物を含む同じ生物学的サンプルから抽出された無細胞核酸サンプルから得られる情報には、無細胞核酸サンプル中のヌクレオソーム内の１またはそれを超えるヒストン修飾の存在、同一性、位置または量（またはそれらの組み合わせ）の検出が含まれ得る。ヒストン修飾には、翻訳後修飾（ＰＴＭ）が含まれ、その多くは、クロマチン構造を変化させるかまたは他の手段によって遺伝子発現を制御すると証明されている。本明細書における特定の目的のヒストン修飾は、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーを含むヒストン修飾である。本発明のこの実施形態および他の実施形態に従ってヒストン修飾を検出するための方法は、次のセクションに記載される。

【0156】

無細胞サンプルから得られる他の情報としては、無細胞ＤＮＡの少なくとも１つの配列；無細胞ＲＮＡの少なくとも１つの配列；ＤＮＡメチル化データ；ＤＮＡヒドロキシメチル化データ；および前述のもののうちのいずれかに関係してもよいし関係しなくてもよい他の情報が挙げられ得る。前述の情報を取得するための適切な方法および好ましい方法に関する詳細な情報は、下記に含まれる。

【0157】

４．無細胞ＣｈＩＰ（ｃｆＣｈＩＰ）を用いたヒストン修飾の検出：

【0158】

本発明の別の実施形態において、（１）無細胞核酸サンプルを調製して、シーケンシングベースの技術を用いて、無細胞核酸サンプルに含まれているヌクレオソームにおける少なくとも１つのヒストン修飾の識別を可能にするための方法、および（２）インタクトなヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプル中のヒストン修飾を検出するための方法が提供され、ここで、そのヒストン修飾の存在、同一性、位置もしくは量またはそれらの組み合わせが検出される。両方の方法が、血液サンプルなどの生物学的サンプルから抽出された無細胞核酸サンプルの分析を含み、ここで、その無細胞核酸サンプルは、インタクトなヌクレオソームを含む。

【0159】

ヌクレオソームは、クロマチン構造の基本単位であり、コアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を２コピーずつ含む、高度に保存された８つのコアヒストンのタンパク質複合体から構成される。およそ１４６塩基対のＤＮＡが、このヒストン八量体の周囲に巻き付いて、ヌクレオソーム「コア」を形成する。それらのコア粒子は、最大約８０塩基対長の一続きのリンカーＤＮＡによって接続され、これは、Ｈ１、Ｈ５またはそれらのアイソフォームなどのリンカーヒストンとともに密集してクロマチンを形成するまで、「ひもでつながったビーズ」のように見える（Ｋｏｌｌｅｒら、（１９７９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８３（２ Ｐｔ １）：４０３－４２７）。

【0160】

ヌクレオソームの位置およびヌクレオソームの構造（構成ヒストンタンパク質バリアントと翻訳後修飾すなわちＰＴＭとの両方に関して）も、エピジェネティックなシグナル伝達を媒介すると知られている。ヒストンＰＴＭは、転写、ＤＮＡ複製およびＤＮＡ損傷をはじめとした種々のプロセスと関連がある。ＰＴＭは、典型的には、コアヒストンのテールに位置し、ＰＴＭとしては、アセチル化、メチル化、ジメチル化、トリメチル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化、２－ヒドロキシ－イソブチリル化、マロニル化、スクシニル化、ホルミル化、ユビキチン化、シトルリン化、リン酸化、ヒドロキシル化、ＳＵＭＯ化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化およびＡＤＰリボシル化が挙げられ、より一般的な修飾としては、リジン残基のアセチル化、メチル化またはユビキチン化、ならびにアルギニン残基のメチル化およびセリン残基のリン酸化が挙げられる。機能が相当十分に証明されたＰＴＭの包括的なリストは、Ｚｈａｏら、（２０１５），“Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２－Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；７（９）：ａ０２５０６４（この開示は本明細書において参照により援用される）に示されており；すぐ参照できるようなヒストン修飾マップを提供している、Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐから入手可能なＨｉｓｔｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｏｓｔｅｒ［２０１８年８月５日にｗｗｗ．ｒｅａｃｔｉｏｎｂｉｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｓｉｔｅ／から読み出された］も参照のこと。

【0161】

モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームは、Ｓａｌｇａｍｅら、（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５（３）：６８０－１およびｖａｎ Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｊｚｅら、（２００３）Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６２（１）：１０－１４に報告されているように、ＥＬＩＳＡによって検出された。そのようなアッセイは、典型的には、抗ヒストン抗体（例えば、抗Ｈ２Ｂ、抗Ｈ３または抗Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）を捕捉抗体として、および抗ＤＮＡまたは抗Ｈ２Ａ－Ｈ２Ｂ－ＤＮＡ複合抗体を検出抗体として用いる。しかしながら、これらの方法および開発されてきた他の方法は、信頼性が限定的である傾向がある。

【0162】

「無細胞クロマチン免疫沈降」（ｃｆＣｈＩＰ）アッセイである本方法は、現在の従来型ＣｈＩＰ方法とは異なり、その従来型ＣｈＩＰ方法は、生細胞または生組織におけるＤＮＡとクロマチンにおける関連タンパク質とを架橋し、架橋された複合体を超音波処理または消化によって剪断し、生じる架橋されたタンパク質－ＤＮＡフラグメントを免疫沈降し、それらのフラグメントを精製し、シーケンシングし、配列リードから、その細胞におけるタンパク質とＤＮＡとの相互作用に関する情報を決定することによって、タンパク質とＤＮＡとの細胞内相互作用を分析する。この基本的な手順に対するいくつかの変法が、様々な用途を念頭に置いて開発され、それらとしては、とりわけ、ネイティブＣｈＩＰ（ＮＣｈＩＰ）、ビーズフリーＣｈＩＰ、キャリアＣｈＩＰ（ＣＣｈＩＰ）、高速ＣｈＩＰ（ｑＣｈＩＰ）、迅速かつ定量的ＣｈＩＰ（Ｑ^２ＣｈＩＰ）、マイクロＣｈＩＰ（μＣｈＩＰ）、マトリックスＣｈＩＰ、病理学－ＣｈＩＰ（ＰＡＴ－ＣｈＩＰ）が挙げられる。

【0163】

１つの実施形態において、本発明は、無細胞核酸サンプルを調製して、ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて、無細胞核酸サンプルに含まれているヌクレオソームにおける少なくとも１つのヒストン修飾の識別を可能にするための方法を提供し、ここで、その方法は、ヒストンコア、すなわち、４つのコアヒストンの各対から構成されるヒストン八量体の周囲に巻き付いたｃｆＤＮＡ分子をそれぞれが含む複数のヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプルから開始する工程を含む。末端ハイブリダイズ領域を含むアダプター（例えば、Ｙアダプター）が、各ヒストン会合ｃｆＤＮＡ分子の末端にライゲートされる。それらのアダプターは、本明細書で前述したようなサンプルＵＦＩ配列および分子ＵＦＩ配列を含み得る。アダプターのライゲーションは、図２の上部に示されており、それぞれがヒストンコアの周囲に巻き付いたアダプター結合ｃｆＤＮＡ分子を含む修飾された無細胞核酸サンプルをもたらす。

【0164】

上記方法の次の工程では、図２にも示されているように、第１の末端に、目的のヒストン修飾に特異的に結合するヒストン修飾結合ドメイン；および第２の末端に、アダプターによって提供される末端ハイブリダイズ領域の１つに相補的な核酸結合ドメインを含む近接プローブを用いる。ヒストン修飾結合ドメインと核酸結合ドメインとの間の非ハイブリダイズ領域は、目的のヒストン修飾に対応するように選択された核酸配列を含み、この核酸配列は、ヒストン修飾ＵＦＩ（またはヒストン修飾「バーコード」）として供される。この近接プローブは、プローブのヒストン修飾結合ドメインが目的のヒストン修飾に結合することと、プローブの相補的な核酸結合ドメインがハイブリダイズ核酸領域にハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である。同時の結合をもたらすために、（ｉ）プローブのヒストン修飾結合ドメインがヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）プローブの相補的な核酸結合ドメインがハイブリダイズ核酸領域にハイブリダイゼーションすることを促進するのに効果的な条件下において、修飾された無細胞核酸サンプルを近接プローブとインキュベートする。これにより、無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および近接プローブを起源とする３’末端を有し、かつヒストン修飾バーコードを含む、ｄｓＤＮＡセグメントが形成される。

【0165】

ｄｓＤＮＡセグメントが形成された後、そのｄｓＤＮＡセグメントの５’末端は、このセクションのパート（２）において近接伸長アッセイについて記載した様式と類似の様式で、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって近接プローブの非ハイブリダイズ領域およびヒストン修飾ＵＦＩに沿って伸長される。ポリメラーゼ伸長によって、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、典型的には、上で述べたように、サンプルＵＦＩ配列および分子ＵＦＩ配列でもバーコード化されたｄｓＤＮＡテンプレート分子が提供され、次いでこれは、増幅およびシーケンシングに供され得る。

【0166】

通常、上述のｃｆＣｈＩＰプロセスは、異なるヒストン修飾をそれぞれが標的にする複数の近接プローブの使用を含み、その結果、最後の工程において取得される配列リードをデコンボリューションすることにより、ヒストンＰＴＭなどの複数のヒストン修飾に関する情報を推定することができる。

【0167】

別の関連の実施形態では、インタクトなヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプル中のヒストン修飾を検出するためのシーケンシングベースの方法が提供され、ここで、ヒストン修飾の存在、同一性、位置もしくは量またはそれらの組み合わせが検出される。その方法は、無細胞核酸サンプルを調製して、ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて少なくとも１つのヒストン修飾の識別を可能にするための上記方法を実施した後、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、得られたアンプリコンをシーケンシングし、配列リードにおいて観察されるヒストン修飾ＵＦＩからヒストン修飾の種類および位置に関する情報を決定する工程を含む。

【0168】

５．５ｈｍＣ含有キャプチャー配列を有するアダプター：

【0169】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を含むアダプターの使用について言及する。これは、本明細書における実施形態の多くの自由選択の特徴であり、特定のアダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子をサンプルまたはｄｓＤＮＡテンプレート分子の混合物から捕獲し、次いで、残りの構成成分を、取り出されたｄｓＤＮＡテンプレートの非存在下において処理する、組み合わせワークフロー方法において特に有用である。捕獲されたテンプレート分子は、残りのサンプルを化学的処理に供している間に、別々に増幅され得るか、または単に取りおかれ得、最終的には、単一のサンプルから生成されたすべてのｄｓＤＮＡテンプレート分子が、プールされ、一緒にシーケンシングされる。アダプターによってｄｓＤＮＡテンプレート分子に組み込まれたキャプチャー配列は、サンプルからのｄｓＤＮＡテンプレート分子の捕獲または取り出しを促進する。

【0170】

キャプチャー配列は、５ｈｍＣ残基を含み、その配列は、単一の５ｈｍＣ残基、単一の５ｈｍＣ残基を含む短い核酸配列、または２もしくはそれを超える５ｈｍＣ残基を含む短い核酸配列であり得る。

【0171】

１つの実施形態において、５ｈｍＣ含有キャプチャー配列を含むアダプターは、ｄｓＤＮＡテンプレート分子の少なくとも１つの末端にライゲートされるか、またはｃｆＲＮＡ、分析では、リガーゼフリーの化学作用を介して、ｃＤＮＡ分子の少なくとも１つの末端に付着される。アダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子が捕獲されるとき、それらのアダプターにおける５ｈｍＣ残基は、アフィニティータグ付けされたテンプレートを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで官能化される。１つの実施形態において、そのアフィニティータグは、ビオチン、デスチオビオチン、オキシビオチン、２－イミノビオチン、ジアミノビオチン、ビオチンスルホキシド、ビオシチンなどのビオチン部分から構成される。ビオチン部分をアフィニティータグとして使用することにより、アビジンまたはストレプトアビジン表面、例えば、ストレプトアビジンビーズ、ストレプトアビジン磁気ビーズなどを用いた手軽な取り出しが可能になる。

【0172】

５ｈｍＣ残基をビオチン部分または他のアフィニティータグでタグ付けすることは、アダプターにおける５ｈｍＣ残基への化学選択的基の共有結合によって達成され、ここで、その化学選択的基は、アフィニティータグを５ｈｍＣ残基に連結するように、官能化されたアフィニティータグと反応を起こすことができる。１つの実施形態において、化学選択的基は、ＵＤＰグルコース－６－アジドであり、これは、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４１１（１）：４０－３、Ｈｅらの米国特許第８，７４１，５６７号およびＱｕａｋｅらのＷＯ２０１７／１７６６３０に記載されているように、アルキン官能化ビオチン部分と自発的な１，３－付加環化反応を起こす。ゆえに、アルキン官能化ビオチン部分の付加によって、各５ｈｍＣ残基にビオチン部分が共有結合する。このような反応の例は、本明細書で参照により援用されるＨｅらの米国特許第８，７４１，５６７号の図５Ｂに示されている。

【0173】

次いで、アフィニティータグ付けされたｄｓＤＮＡテンプレート分子は、上で述べたように、アビジンまたはストレプトアビジン表面を用いて捕獲され、後の処理および分析のために取りおかれ得る。アフィニティータグ付けされたフラグメントを取り出した後に残った上清は、その内部配列または付加されたアダプターに５ｈｍＣを含まないｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む。その残りのｄｓＤＮＡテンプレート分子は、引き続き化学的処理に供され得、最後にシーケンシングに向けて、捕獲されたテンプレート分子とともに再度プールされ得る。

【0174】

本発明は、５ｈｍＣ含有アダプターに結合したｃｆＤＮＡテンプレート分子を新規組成物として包含し、ここで、それらのアダプターは、少なくとも１つの５ｈｍＣ残基に加えて、本明細書で前述したような、ソースＵＦＩ配列、分子ＵＦＩ配列、鎖識別子ＵＦＩ配列またはヒストン修飾ＵＦＩ配列などのＵＦＩ配列を含み得る。

【0175】

６．無細胞ＲＮＡの分析：

【0176】

主にアポトーシス小体およびエキソソームに由来する無細胞ＲＮＡは、一般に、高度に分解されており、半減期が非常に短く、非常に低い濃度で無細胞サンプル中に存在する。ゆえに、ｃｆＲＮＡの完全性が低いせいで、標準的なＲＮＡ－Ｓｅｑ法をｃＤＮＡライブラリーの調製に用いる可能性が無くなる限り、ｃｆＲＮＡからｃＤＮＡシーケンシングライブラリーを調製することは、難易度が高い。本明細書における使用に適応できる方法は、増幅に必要なアダプターがリガーゼの必要なくｃＤＮＡに共有結合される、ライゲーションフリーのｃＤＮＡ合成およびライブラリー調製法を用いる方法である。

【0177】

そのような方法の１つでは、ＲＮａｓｅを用いて調製され得るｃｆＲＮＡ、好ましくはｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、ランダムプライマーを用いる。Ｓｏｏｋｎａｎａｎの米国特許第９，７４５，５７０号（この開示は、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。増幅およびバーコード付与（すなわち、ｃＤＮＡへのｃｆＲＮＡ ＵＦＩ配列の付加）のための５’および３’リンカータグが、任意の効果的な末端タグ化手順、例えば、Ｓｏｏｋｎａｎａｎの米国特許第８，３０４，１８３号（これもまた参照により援用される）に記載されている手順を用いて導入され得る。このプロセスは、市販のキット、例えば、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）から入手可能なＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）ｖ２ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて実施され得る。ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ ｃＤＮＡライブラリー調製とともに使用される材料、試薬およびプロセスのさらなる説明は、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）ｖ２ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ［２０１８年８月１６日にｓｕｐｐｏｒｔ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍから読み出された］に見出すことができる。

【0178】

アダプターライゲーションなしにｃｆＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製する別の方法では、アダプター配列を含むｄＴプライマーを用いた３’－ポリアデニル化ＲＮＡの第１鎖ｃＤＮＡ合成において、選択された逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性を利用するテンプレートスイッチ法を用いる。ＲＮＡの５’末端に到達したら、非テンプレートヌクレオチドの短い配列（例えば、ＣＣＣ）が、ｃＤＮＡの第１鎖を伸長させ、その付加された配列に相補的な短い配列（例えば、ＧＧＧ）およびフォワードＰＣＲプライマーとして供される第２のアダプター配列を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが、第１鎖伸長物にハイブリダイズし、ＰＣＲを介した第２鎖の合成および増幅を可能にする。Ｂｅｔｔｓらの米国特許出願公開第２０１７／０１９８２８５Ａ１号；Ｚｈｕら、（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０（４）：８９２－８９７；および“Ｔｅｃｈ Ｎｏｔｅ：Ａ ＳＭＡＲＴｅｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”ウェブ文書リプリント［２０１８年８月１６日にｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａｂｉｏ．ｃｏｍ／ｌｅａｒｎｉｎｇ－ｃｅｎｔｅｒｓ／ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｎｏｔｅｓ／ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ－ｓｍａｌｌ－ｒｎａ－ｌｉｂｒａｒｉｅｓから読み出された］（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。

【0179】

本発明の状況において、上に記載された技術のうちの１つなどのリガーゼフリーの方法を用いることにより、生物学的サンプル中のｃｆＲＮＡからアダプター結合ｃＤＮＡが合成され、ここで、そ（れら）のアダプターは、ｄｓＤＮＡテンプレート分子をｃｆＲＮＡ由来ｃＤＮＡと識別するためのｃｆＲＮＡ ＵＦＩ配列を含む。それらのアダプターは、本明細書で前述したような、ソースＵＦＩ配列、分子ＵＦＩ配列、鎖識別子ＵＦＩ配列またはヒストン修飾ＵＦＩ配列などの少なくとも１つの追加のＵＦＩ配列も含む。次いで、アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングすることができ、配列リードのデコンボリューションによって、生物学的サンプル中のｃｆＲＮＡに関する情報を取得することができる。

【0180】

ｃｆＲＮＡは、ｍＲＮＡ、またはタンパク質に翻訳されないＲＮＡ、すなわち、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、ｔＲＮＡ；ｒＲＮＡ；低分子ＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡおよびｓｃａＲＮＡ；ならびに長鎖ｎＲＮＡ、例えば、ＸｉｓｔおよびＨＯＴＡＩＲであり得る。このセクションの前のほうに要約したＳｃｒｉｐｔＳｅｑ法は、ｒＲＮＡが除去された無細胞ＲＮＡサンプルとともに使用するために最適であり、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴアプローチは、低分子ｎｃＲＮＡとともに使用する際に特に有用である。

【0181】

アダプター結合ｃＤＮＡは、この時点において増幅し、かつシーケンシングしてもよいし、拡大された組み合わせワークフロープロセスの状況においてさらなる分析を実施してもよい。特に興味深いのは、セクション８に説明されるようなｄｓＤＮＡのヒドロキシメチル化分析および／またはメチル化分析である。

【0182】

７．組み合わせワークフローにおける無細胞ＲＮＡおよび無細胞ＤＮＡの分析：

【0183】

１つの実施形態において、シーケンシングベースで同時に識別するために単一の無細胞核酸サンプルにおいてｃｆＤＮＡおよびｃｆＲＮＡを調製するための組み合わせワークフロープロセスが提供される。ここでの最初の工程は、生物学的サンプルから無細胞核酸サンプルを抽出した後、選択されたアダプターをｃｆＤＮＡにライゲーションすることである。それらのアダプターは、無細胞核酸サンプル中のｃｆＤＮＡフラグメントの末端にライゲートされて、アダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子が形成され得る。標準的なライゲーション条件および市販のリガーゼを用いることができる。

【0184】

ｃｆＤＮＡフラグメントへのライゲーションのために選択されるアダプターは、サンプルＵＦＩ配列、および好ましくは、少なくとも１つの追加のＵＦＩ配列（例えば、分子ＵＦＩ配列および鎖識別子ＵＦＩ配列）を含む。次いで、アダプター結合ｃｆＤＮＡを、従来の核酸精製技術を用いてｃｆＲＮＡとともに精製して、ｃｆＲＮＡとアダプター結合ＤＮＡテンプレート分子との無細胞混和物を提供する。

【0185】

本方法は、ｃＤＮＡ合成前またはｃＤＮＡ合成中にアダプター結合ｃｆＤＮＡを取り出す必要を無くすので、組み合わせワークフローにおける次の工程では、アダプター結合ｃｆＤＮＡをなおも含む無細胞混和物中のｃｆＲＮＡを処理する。当該分野で公知であるように、ｃｆＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成した後、その第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を形成する。ｃＤＮＡの合成は、リガーゼを必要とすることなくｃＤＮＡにアダプターを付着するように、前述のセクションに記載されたように実施される。前述同様に、ｃＤＮＡアダプターは、ソース識別子ＵＦＩおよびおよびＲＮＡインジケーターＵＦＩを含み、それによって、アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡが提供される。

【0186】

この時点において、アダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子およびｃＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングすることもできるし、以下のセクションで説明されるような、ｄｓＤＮＡのヒドロキシメチル化分析および／またはメチル化分析を含む拡大された組み合わせワークフロープロセスの状況では、さらなる分析を実施してもよい。

【0187】

８．ヒドロキシメチル化分析および／またはメチル化分析を伴う組み合わせワークフロー：

【0188】

細胞における遺伝子発現のエピジェネティック制御は、ＤＮＡのシトシンメチル化状態およびシトシンヒドロキシメチル化状態をはじめとした、ＤＮＡヌクレオチドに対する修飾によって部分的に媒介される。しばらくの間、ＤＮＡは、シトシンヌクレオチドの５位においてメチル化されて、５－メチルシトシンを形成し得ることが、当該分野で公知であった。５－メチルシトシンの形態のメチル化ＤＮＡは、そのＤＮＡ配列内の、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドの隣に出現する位置に出現すると報告されている。これらの位置は、省略形として「ＣｐＧ」と呼ばれており、高比率のＣｐＧ部位を含むゲノム領域は、「ＣｐＧアイランド」と呼ばれることが多く、ヒトの遺伝子プロモーター配列の大部分が、このようなＣｐＧアイランドを伴っている。活発な遺伝子では、これらのＣｐＧアイランドは、通常、低メチル化されている。遺伝子プロモーター配列のメチル化は、安定的な遺伝子不活性化に関連する。

【0189】

癌細胞において観察されるＤＮＡメチル化パターンは、健康な細胞のそれとは異なる。反復性エレメント、特に動原体周囲の領域辺りの反復性エレメントは、健康な細胞と比べて癌では低メチル化されていると報告されているが、特定の遺伝子のプロモーターは、癌では高メチル化されていると報告されている。癌細胞では、これらの２つの作用のバランスが、全体的なＤＮＡ低メチル化をもたらすと報告されている。全体的なＤＮＡメチル化は、免疫組織化学（ＩＨＣ）法ならびに他のいくつかの方法を用いて細胞において研究されているが、これらの方法の多くが、労働集約的であり、かつ／または品質の良い大量の抽出ＤＮＡを必要とするので、都合が悪い。

【0190】

全体的なＤＮＡメチル化を検出するための現行の方法は、そのＤＮＡの抽出または精製を必要とし、迅速かつハイスループットであり、低コストかつ侵襲性が最小の診断方法に適していない。同様に、他の修飾塩基または稀な塩基（例えば、ウラシル、イノシン、キサンチンおよびヒポキサンチン）についてのＤＮＡの分析も、実質的に純粋なまたは抽出されたＤＮＡの分析によってしか調査できない。そのような分析は、組織溶解産物、血液、血漿または血清などの複雑な生物学的媒質中では直接実施できない。

【0191】

エピジェネティクス分野が発展するにつれて、５位においてヒドロキシメチル化されたシトシン（５ｈｍＣ）という別のＤＮＡ修飾の検出が、５ｍＣの検出と同程度に重要である可能性があることが判明してきた。５ｍＣ修飾は、一般にＣｐＧジヌクレオチド内に存在するが、天然の５ｈｍＣ残基は、他の位置に出現する傾向がある。５ｈｍＣの出現頻度は、５ｍＣのそれよりもかなり低く、組織タイプにもよるが典型的には１０：１と近似される比であり（Ｎｅｓｔｏｒら、（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：Ｒ８４を参照のこと）、５ｍＣが、全ＤＮＡ塩基の約１％を占め、５ｈｍＣが、全塩基の約０．０１％を占める。５ｈｍＣの分子機能は、理解され始めたばかりであるが、５ｈｍＣは、転写、ＤＮＡ脱メチル化、および異常な５ｈｍＣパターンの場合は腫瘍形成をはじめとした種々のプロセスに関与していることが証明されている。Ｔａｈｉｌｉａｎｉら、（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４（５９２９）：９３０－０３５（２００９）；Ｇｕｏら、（２０１１）Ｃｅｌｌ １４５：４２３－４３４；Ｗｕら、（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２５：６７９－６８４；Ｋｏら、（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６８：８３９－８４３；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４１１（１）：４０－３を参照のこと。また、５ｈｍＣは、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）酵素、例えば、ＴＥＴ１による５ｍＣの触媒的酸化から形成される安定性のＤＮＡ修飾であることも知られている。

【0192】

バイサルファイトシークエンスは、５ｍＣと５ｈｍＣとを区別しないので、５ｍＣ残基と５ｈｍＣ残基とを個別に検出するための他の方法が必要である。上で述べたように、５ｈｍＣの出現頻度は、５ｍＣよりもはるかに低いため、特定されたすべての５ｈｍＣ残基の画分に関して高効率を示すために、ならびに５ｈｍＣと特定された実質的にすべての残基が実際に５ｈｍＣ残基であるはずであることを意味する高選択性を示すためには、５ｈｍＣを検出するための何らかの方法が必要である。β－グルコシルトランスフェラーゼ（β－ＧＴ）であるＴ４バクテリオファージ酵素は、５ｍＣを修飾せずに５ｈｍＣを選択的にグルコシル化するので、この酵素によるグルコシル化を含む、ＤＮＡにおける５ｈｍＣを検出するための方法がいくつか報告されている。

【0193】

本発明の背景において、組み合わせワークフロー方法は、好ましくは、無細胞ＤＮＡにおける修飾されたシトシン残基、すなわち、５ｍＣ、５ｈｍＣ、または５ｍＣと５ｈｍＣとの両方を検出するためのシーケンシングベースのプロセスを含む。ヒドロキシメチル化分析が、メチル化分析とともに実施される場合、以下のプロセスフローの説明から理解されるように、ヒドロキシメチル化が最初の焦点であるべきであり、その後、メチル化が続く。

【0194】

無細胞核酸サンプルがすでに生物学的サンプルから抽出されており、ｃｆＤＮＡがアダプター結合に続いて、ｃｆＲＮＡ処理を受けることにより、アダプター結合ｃＤＮＡを得ていると仮定すると（セクション７に記載されたように）、組み合わせワークフロープロセスは、ｃｆＤＮＡのヒドロキシメチル化プロファイルに関する情報を提供するように続けられる。この「ヒドロキシメチル化プロファイル」は、ヒドロキシメチル化密度、例えば、ある核酸領域内の修飾シトシンと未修飾シトシンとの両方である全シトシンに対する５ｈｍＣ残基の比であり得る。他の５ｈｍＣ密度の尺度、例えば、ある遺伝子座における全ヌクレオチドに対する５ｈｍＣ残基の比も想定される。

【0195】

ヒドロキシメチル化プロファイルは、５ｈｍＣ密度に加えて、ヒドロキシメチル化パターン、ある核酸領域内の全５ｈｍＣ残基、ある核酸領域内の５ｈｍＣ残基の位置、ある核酸領域内の５ｈｍＣ残基の相対的な位置、および／またはヘミヒドロキシメチル化部位または完全ヒドロキシメチル化部位としてのヒドロキシメチル化部位の特定などのヒドロキシメチル化情報も含み得る。

【0196】

核酸のヒドロキシメチル化プロファイルを検出するための１つの好ましい方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０１７／１７６６３０（Ｑｕａｋｅら）に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。この方法は、シーケンシングスキームの過程のうちで、無細胞ＤＮＡ中の５－ヒドロキシメチルシトシンパターンの検出に関わる。アフィニティータグは、無細胞ＤＮＡのサンプル中の５ｈｍＣ残基に付加され、このタグがつけられたＤＮＡ分子は、次いで富化およびシーケンシングされ、５ｈｍＣの位置が識別される。この方法の例は、Ｑｕａｋｅらの文献に記載されているように、まず無細胞サンプル中の末端が平滑で、アダプターが結合した二本鎖ＤＮＡフラグメントを修飾して、アフィニティータグとしてビオチンを５ｈｍＣ残基に共有結合で結合することを含む。これは、６位においてアジド部分で官能化されたウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グルコースで５ｈｍＣ残基を選択的にグルコシル化することによって実行され得、この工程の後に、アダプター中の５ｈｍＣ含有キャプチャー配列に関して、セクション５で前述したように、「クリックケミストリー」反応によるアルキン官能化ビオチンとの自発的な１，３－環化付加反応が起こる。これらのビオチン化５ｈｍＣ残基を含むＤＮＡフラグメントは、次いで「富化」工程においてストレプトアビジンビーズによって捕獲することができるアダプター連結ｄｓＤＮＡテンプレート分子である。

【0197】

本組み合わせワークフロープロセスでは、５ｈｍＣ ＵＦＩ配列が、捕獲されたアダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子の末端に付加されるため、増幅、プールおよびシーケンシングの後、得られた配列リードから、ヒドロキシメチル化プロファイルに関する情報を推定することができる。すなわち、配列リードを分析して、ｃｆＤＮＡの中のいずれの配列がヒドロキシメチル化されているかを定量的に判断する。これは、例えば、配列リードをカウントすること、あるいは、断片化の切断点に基づいて、および／または同じ分子ＵＦＩを含むか否かに基づいて元の出発分子の数を増幅前にカウントすることによって、行われ得る。

【0198】

無細胞核酸サンプル（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ｓａｍｐｌｅ）中のＤＮＡのヒドロキシメチル化プロファイルを確認する他の方法は、２０１８年２月１４日出願の“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ，ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ”というＡｒｅｎｓｄｏｒｆらの米国特許仮出願第６２／６３０，７９８号およびＳｏｎｇらの米国特許出願公開第２０１７／０２９８４２２号に記載されており、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。これらの参考文献は、本組み合わせワークフロープロセスがｃｆＤＮＡヒドロキシメチル化プロファイルに加えてｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの検出をさらに含む本発明の実施形態と併用しても有用である。

【0199】

Ａｒｅｎｓｄｏｒｆの方法は、本組み合わせワークフロープロセスの状況では、以下のように実行され得る。

【0200】

デュアルビオチン技術：無細胞核酸サンプルが生物学的サンプルから抽出され、ｃｆＤＮＡがアダプター結合に続いて、ｃｆＲＮＡ処理を受けることにより、アダプター結合ｃＤＮＡを得た後（セクション７に記載されたように）、ｃｆＤＮＡ中の５ｈｍＣ残基は、アフィニティータグ、例えば、本明細書で前述したようなビオチン部分で選択的に標識される。ビオチン化は、前述のように、βＧＴによって触媒されるウリジンジホスホグルコース－６－アジドでのグルコシル化、これに続く、アルキン官能化ビオチン部分を共有結合させるためのクリックケミストリー反応による５ｈｍＣ残基の選択的官能化によって実施することができる。次に、アビジンまたはストレプトアビジン表面（例えば、ストレプトアビジンビーズの形態の）を使用して、５ｈｍＣ位置でビオチン化されたすべてのｄｓＤＮＡテンプレート分子を取り出し、次いで、増幅中にＵＦＩ配列を付着させるために別の容器に入れる。上清中の残存するｄｓＤＮＡテンプレート分子は、５ｍＣ残基を有するまたは修飾を有さないフラグメントである（後者のグループにはｃｆＲＮＡから生成されたｃＤＮＡが含まれる）。次に、ＴＥＴタンパク質を使用して、上清中の５ｍＣ残基を５ｈｍＣに酸化し、この場合には、５ｍＣの酸化がヒドロキシル化を超えて進行しないようにするために、ＴＥＴ変異体タンパク質が使用される。この目的に適したＴＥＴ変異体タンパク質は、参照により本明細書に援用されるＬｉｕら、（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．１３：１８１－１９１に記載されている。次いで、βＧＴによって触媒されるグルコシル化とそれに続くビオチン官能化が繰り返される。このようにマークされた（元の５ｍＣ位置のそれぞれにおいてビオチン化された）フラグメントは、ストレプトアビジンビーズで捕獲される。次に、ビーズに結合したＤＮＡフラグメントは、増幅中に、第１の工程において使用されたもの、すなわち５ｍＣ ＵＦＩ配列ではなくＵＦＩ配列でバーコードが付けられる。未修飾のＤＮＡフラグメント、つまり修飾されたシトシン残基を含有しないフラグメントは、この時点で、上清中に残存する。所望であれば、メチル化されていないＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせるために、配列特異的プローブを使用することができる。その結果生じるハイブリダイズした複合体は、前述のように、増幅の間に取り出され、さらなるＵＦＩ配列でタグ付けすることができる。

【0201】

Ｐｉｃ－Ｂｏｒａｎｅ法：これはデュアルビオチン技術の代替手段であり、同じくアダプター連結ＤＮＡフラグメント中の５ｈｍＣ残基のビオチン化から始まり、アビジンまたはストレプトアビジン捕獲が続く。しかしながら、この技術では、上清中に残存する未修飾の５ｍＣ残基を含有するＤＮＡは、５ｈｍＣを超えて５ｃａＣおよび／または５ｆＣ残基まで酸化される。酸化は、触媒的に活性なＴＥＴファミリー酵素を使用して酵素的に実施し得る。本明細書で使用される「ＴＥＴファミリー酵素」または「ＴＥＴ酵素」という用語は、米国特許第９，１１５，３８６号において定義されているとおりの触媒的に活性な「ＴＥＴファミリータンパク質」または「ＴＥＴ触媒活性フラグメント」を指し、その開示は、参照により本明細書に援用される。この文脈において好ましいＴＥＴ酵素はＴＥＴ２であり、Ｉｔｏら、（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３（６０４７）：１３００－１３０３を参照されたい。酸化は、化学的酸化剤を使用して、化学的に実施することもできる。適切な酸化剤の例としては、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ_４）などの過ルテニウム酸金属塩、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム（ＴＰＡＰ）および過ルテニウム酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＰ）などの過ルテニウム酸テトラアルキルアンモニウム塩、およびポリマー支持過ルテニウム酸塩（ＰＳＰ）を含む、無機または有機過ルテニウム酸塩の形態の過ルテニウム酸陰イオン；ならびにペルオキソタングスタートまたは過塩素酸銅（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯの組み合わせなどの無機ペルオキソ化合物および組成物が挙げられるが、これらに限定されない。この過程の次の工程において、５ｆＣ残基と５ｃａＣ残基の両方がジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換される限り、この時点で５ｆＣ含有フラグメントを５ｃａＣ含有フラグメントから分離することは必要でない。

【0202】

すなわち、５ｍＣ残基を５ｆＣおよび５ｃａＣに酸化した後、酸化された５ｍＣ残基を還元し、脱アミノ化し、脱炭酸または脱ホルミル化するために有機ボランが添加される。得られたｄｓＤＮＡテンプレート分子は、元の５ｍＣ残基の代わりにＤＨＵを含有し、同じサンプルに由来する他のｄｓＤＮＡテンプレート分子とともに、増幅し、プールし、配列決定することができる。

【0203】

有機ボランは、ボランと、窒素複素環および第三級アミンから選択される窒素含有化合物との複合体として特徴付けることができる。窒素複素環は、単環式、二環式または多環式であり得るが、典型的には、窒素ヘテロ原子と、必要に応じてＮ、ＯおよびＳから選択される１またはそれを超える追加のヘテロ原子とを含有する５員または６員環の形態の単環式である。窒素複素環は、芳香族または脂環式であり得る。本明細書における好ましい窒素複素環には、２－ピロリン、２Ｈ－ピロール、１Ｈ－ピロール、ピラゾリジン、イミダゾリジン、２－ピラゾリン、２－イミダゾリン、ピラゾール、イミダゾール、１，２，４－トリアゾール、１，２，４－トリアゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、１，２，４－トリアジンおよび１，３，５－トリアジンが含まれ、これらのいずれもが、非置換であり得るか、または１もしくはそれを超える非水素置換基で置換され得る。典型的な非水素置換基は、アルキル基、特にメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチルなどの低級アルキル基である。例示的な化合物には、ピリジンボラン、２－メチルピリジンボラン（２－ピコリンボランとも呼ばれる）および５－エチル－２－ピリジンが含まれる。これらの有機ボランおよび酸化された５ｍＣ残基をＤＨＵに変換するためのそれらの反応に関するさらなる情報は、上記で引用されたＡｒｅｎｓｄｏｒｆの特許出願、米国特許仮出願第６２／６３０，７９８号（すでに参照により本明細書に援用されている）に見出すことができる。

【0204】

ビオチン／ネイティブ５ｍＣ富化法：これはデュアルビオチン技術の代替手段であり、アダプター連結ＤＮＡフラグメント中の５ｈｍＣ残基のビオチン化から始まり、アビジンまたはストレプトアビジン捕獲が続く。ただし、ここでは、ネイティブ５ｍＣ含有フラグメントを捕捉および捕獲するために、上清中に残存するメチル化ＤＮＡを修飾することに代えて、抗５ｍＣ抗体またはＭＢＤタンパク質を使用する。この技術は、同じサンプルに由来する他のｄｓＤＮＡテンプレート分子とともに増幅、プールおよび配列決定することができるｄｓＤＮＡテンプレート分子の生成をもたらさない限り、本明細書ではあまり好ましくない。

【0205】

ゆえに、生成されたバーコード化アダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子は、５ｈｍＣを含むｄｓＤＮＡ、および５ｍＣを含むが５ｈｍＣは含まず、必要に応じて、修飾されたシトシン残基を含まないｄｓＤＮＡをさらに含む、ｄｓＤＮＡである。これらのテンプレート分子は、以下のうちの少なくとも１つとともに増幅され、プールされ、シーケンシングされる。

【0206】

セクション２におけるプロセスによって生成されるヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子；

【0207】

セクション６に記載されたようなｃｆＲＮＡ処理に由来するアダプター結合ｃＤＮＡ；および

【0208】

セクション２に記載されたプロセスによって同じ生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）から生成されるタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子。

【0209】

ゆえに、上述の混和物を単一のランでシーケンシングすることにより、ヌクレオソームに関する情報、特に、ヒストン修飾；ｃｆＲＮＡ配列；タンパク質分析物の同一性および濃度；ｃｆＤＮＡヒドロキシメチル化プロファイル；およびｃｆＤＮＡメチル化プロファイルが提供され得る。

【0210】

一本鎖ｃｆＤＮＡ：

【0211】

上記および本明細書の他の箇所に記載された方法は、一本鎖ｃｆＤＮＡ分析において実施されるように、例えば、メチル化プロファイル、ヒドロキシメチル化プロファイルなどを決定するようにも適応され得る。選択されたＵＦＩ配列、例えば、分子ＵＦＩ配列、サンプルＵＦＩ配列、プロセスＵＦＩ配列（上記で説明したような、５ｈｍＣ ＵＦＩ配列および５ｍＣ ＵＦＩ配列を含む）が、当業者に公知の、かつ／または関連文書および文献に記載されているＲＣＡ法の状況において、ＲＣＡプライマーを用いて一本鎖ｃｆＤＮＡに組み込まれ得る。あるいは、一本鎖ｃｆＤＮＡの場合、相補鎖を生成し、次いで、本明細書中の他の箇所に記載されているようにｄｓＤＮＡ分子に対して本プロセスを実施することができる。

【0212】

９．包括的な組み合わせワークフロー方法：

【0213】

ゆえに、本発明は、単一の生物学的サンプルの様々な特徴を指定するようにタグ付けされたｄｓＤＮＡテンプレート分子のアンプリコンをプールし、単一のランでシーケンシングすることによってその生物学的サンプルから複数の種類の情報を取得する、組み合わせワークフロー方法を提供する。このプロセスの最も包括的なバージョンが、図３に概略的に示されており、それは、以下の工程を含む。

【0214】

（１）セクション２に記載されたような近接伸長アッセイを用いて、複数のタンパク質分析物を含む、被験体から得られた生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）の一部からタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成する工程であって、ここで、特定のタンパク質ＵＦＩ配列を有する各ｄｓＤＮＡテンプレート分子が、そのサンプル中のその特定のタンパク質の存在に対応する、工程；

【0215】

（２）生物学的サンプルの残りの中のヌクレオソームをインタクトな状態で維持する様式で、その生物学的サンプルの残りから無細胞核酸サンプルを抽出する工程；

【0216】

（３）核酸サンプル中の無細胞ＤＮＡにアダプターをライゲートする工程であって、ここで、それらのアダプターは、そのＤＮＡの起源またはサンプルを識別するソース識別子ＵＦＩ、各ｃｆＤＮＡフラグメントをサンプル中の元の分子として識別する「ランダム」分子識別子ＵＦＩ、および必要に応じて、各ｃｆＤＮＡフラグメントの鎖をＣまたはＷとして識別する「鎖」識別子ＵＦＩを含む、工程；

【0217】

（４）その核酸サンプルのいかなる構成成分も分離または単離することなく、セクション４に記載された近接伸長ｃｆＣｈＩＰ法を実施して、近接プローブを用いて特定されたヒストン修飾に対応するｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成する工程であって、ここで、そのように提供されたｄｓＤＮＡテンプレート分子は、特定のヒストン修飾に対応するヒストン修飾ＵＦＩ配列を有する、工程；

【0218】

（５）従来の手段を用いて核酸サンプルの核酸構成成分を精製／抽出する工程（その結果、ヌクレオソームのヒストン構成成分および他の任意の非核酸種が失われる）；

【0219】

（６）ｃｆＲＮＡバーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を、セクション６に記載されたように、その中にｃｆＲＮＡ ＵＦＩ配列が組み込まれた少なくとも１つのアダプターに結合したｃＤＮＡ二重鎖の形態で生成する工程；

【0220】

（７）セクション８に記載されたように、５ｈｍＣ残基を含むｃｆＤＮＡ、および別に、５ｍＣ残基を含むが５ｈｍＣを含まないｃｆＤＮＡに対応するｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成する工程；

【0221】

（８）上で生成されたすべてのｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、プールする工程であって、ここで、増幅は、プールする前またはプールした後に実施され得る、工程；

【0222】

（９）得られたアンプリコン混和物をシーケンシングする工程；および

【0223】

（１０）配列リードをデコンボリューションして、（ａ）タンパク質分析物の同一性および濃度、（ｂ）ヒストン修飾の同一性および位置、（ｃ）ｃｆＲＮＡ配列情報、（ｄ）ｃｆＤＮＡのヒドロキシメチル化パターン；および（ｅ）ｃｆＤＮＡのメチル化パターンを含む、元の生物学的サンプルに関する複数の種類の情報を決定する工程。

【0224】

１つまたは２つのより少ない分析を伴う本発明の組み合わせワークフロー方法が、図４および５に概略的に示されている。

【0225】

１０．組み合わせワークフロープロセスにおけるＵＦＩ配列の重要性：

【0226】

本発明の重要な利点は、古典的なシーケンシングベースの技術を使用して、生物学的サンプルの１またはそれを超える非古典的な配列特徴を決定することにあることが理解されるであろう。ここで、「非古典的な配列特徴」は、サンプル中の核酸分子の基本塩基（すなわち、ＤＮＡの場合はアデニン、シトシン、グアニンおよびチミン、ＲＮＡの場合はアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシル）の同一性および順序以外の特徴を指す。最終的な配列リードにおいて得られる古典的な配列情報に「コードされる」、目的の非古典的な配列特徴は、核酸の組成に関係する情報（例えば、修飾されたシトシン残基、例えば、５ｈｍＣまたは５ｍＣの分布）であってもよいし、核酸の組成とは無関係であってもよく、その代わりに、上で詳細に議論したような、血液サンプル中の血漿タンパク質の存在および濃度、血液サンプルの無細胞ヌクレオソーム画分において観察されるヒストン修飾などに関係する。

【0227】

すなわち、上記分析は、目的の非古典的な配列特徴（例えば、血漿タンパク質の同一性、血漿タンパク質の濃度、ヒストン修飾の数、位置および種類、核酸のヒドロキシメチル化プロファイル、または核酸のメチル化プロファイル）から古典的な配列データへの変換を含む。得られる古典的な配列データとしては、少なくとも１つのＵＦＩ、すなわち、約４～約３６塩基対長の範囲の特定の核酸配列が挙げられ、ここで、そのＵＦＩは、ｄｓＤＮＡテンプレート分子内に組み込まれており、生物学的サンプルの特定の特徴、すなわち、上で説明したような目的の非古典的な配列特徴に関する。

【0228】

したがって、さらなる実施形態において、本発明は、核酸テンプレート分子の非古典的な配列特徴を決定するためのシーケンシングベースの方法を提供し、その方法は、以下を含む。

【0229】

テンプレート分子の特定の非配列特徴を指定する固有特性識別子配列を核酸テンプレート分子に付加する工程；

【0230】

その核酸テンプレート分子および付加された識別子配列を増幅して、付加された識別子配列をそれぞれが含む複数のアンプリコンを得る工程；および

【0231】

アンプリコンをシーケンシングし、得られた配列リードから非配列特徴を決定する工程。

【0232】

通常、核酸テンプレート分子は、複数の異なる核酸テンプレート分子を含む組成物内に含まれており、各テンプレート分子の特定の非古典的な配列特徴を指定する少なくとも１つの識別子配列が、その核酸テンプレート分子に付加されている。非古典的な配列特徴は、ある時点において核酸テンプレート分子と会合していたタンパク質の一態様、例えば、ヒストンを含み得る。非古典的な配列特徴は、生物学的サンプル中の特定のタンパク質の存在または濃度でもあり得、その特徴から古典的な配列への変換は、セクション２に記載された近接伸長アッセイを用いて実施される。他の目的の非古典的な配列特徴としては、ｃｆＤＮＡヒドロキシメチル化プロファイルおよびｃｆＤＮＡメチル化プロファイルが例として挙げられる。

【0233】

１１．切断型アダプター：

【0234】

本発明はさらに、切断型シーケンシングアダプター、ならびにそれらをｄｓＤＮＡテンプレート分子の増幅およびシーケンシングにおいて使用することに関する。特定のプライマー構築物と併せて使用されるこの切断型アダプターは、ＰＣＲ増幅中に識別子バーコードをｄｓＤＮＡテンプレート分子に付加する際に有用である。切断型シーケンシングアダプターは、２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態である。典型的には、その二本鎖セグメントは、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、それらの２つの一本鎖セグメントは、それぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲、例えば、それぞれ５塩基対～２５塩基対の範囲および約５塩基～２０塩基の範囲である。

【0235】

識別子バーコードをｄｓＤＮＡテンプレート分子に付加するための方法では、まず、切断型シーケンシングアダプターを、従来の手段を用いてＡテール化平滑末端ｄｓＤＮＡテンプレート分子にライゲートする。次いで、そのように提供されたアダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１つのバーコード化プライマーを用いるＰＣＲプロセスにおいて増幅し、ここで、そのバーコード化プライマーは、（ｉ）アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、１またはそれを超える識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする第２の領域を含み、その結果、ポリメラーゼの存在下におけるバーコード化プライマーの伸長によって、プライマーの第２の領域とアダプターの一本鎖セグメントとの二本鎖複合体が生じ、ここで、識別子バーコードを含む第１の領域は、その二本鎖複合体の末端を超えて一本鎖オリゴヌクレオチドテールとして伸長する。

【0236】

切断型アダプターの使用は、本明細書の実験のセクションに例証されている。アダプターとＤＮＡテンプレート分子との比は、変動し得るが、その比は、一般に、約１：５～約２５０：１（ｗ／ｗ）、例えば、５：１～２００：１、１０：１～１５０：１または２０：１～１００：１の範囲である。

【0237】

本発明は、ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングするためのキットも提供し、このキットは、以下を備える。

【0238】

（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプター；

【0239】

（ｂ）（ｉ）アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする、第２の領域を含む、バーコード化プライマー；および

【0240】

（ｃ）ポリメラーゼ。

【0241】

切断型アダプターを使用するための方法は、本明細書の実施例に詳細に記載されている。代表的な切断型アダプターが図７に示されており、図６に示された標準的な先行技術アダプターと比較されてもよい。ＰＣＲプロセスにおけるインデックス付きプライマーおよび切断型アダプターの使用が、図８に概略的に示されている。

【0242】

切断型アダプターアプローチは、増幅およびシーケンシングの前にｄｓＤＮＡテンプレート分子へのＤＮＡアダプターのライゲーションを含む、本明細書に記載されている本発明のいずれかの方法と組み合わされ得る。

【0243】

１２．他の方法による実行：

【0244】

著しいことに、本明細書に詳細に記載されるような本発明の方法は、生物学的サンプルのシーケンシングを含む従来の技術と組み合わせることができる。例えば、本方法は、例えば、特定の遺伝子または「ホットスポット」を選択的に捕捉する（すなわち、ハイブリッドキャプチャーを用いて）および／または選択的に増幅する（例えば、マルチプレックスＰＣＲアンプリコンまたは複数のＲＣＡプライマーを用いて）とき、配列ベースの富化を含む従来の（または今後、発見または開発される）リキッドバイオプシー法と組み合わせることができる。例えば、ターゲットシーケンシングの状況における、配列ベースの富化工程または配列ベースの複数の富化工程は、組み合わされるシーケンシング工程の前に、バーコード化テンプレート分子またはその増幅産物の１またはそれを超える群を配列に基づいて分離し、その群を分析し、必要に応じて、その群を他の核酸画分と再度組み合わせるかまたはその群を他の核酸画分とともにプールすることによって、本方法のいずれかと併せて実施することができる。

【0245】

すなわち、本方法およびその態様は、より離れた数の標的化にれた遺伝子座の分析において、例えば、マルチプレックスＰＣＲおよびアレイを用いて（ハイブリダイゼーションプローブが、プロセスバーコードおよび／または他のＵＦＩ配列を組み込むことにより、直接的なシーケンシングなしに、特定の遺伝子座におけるマークの区別が可能になる）、非ショットガンシーケンシング法と組み合わせることができる。本方法またはその態様と組み合わされ得るターゲットシーケンシングアプローチの例としては、Ｓｏら、（２０１８）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：２；上で引用したＧｏｎｇら；Ｓｔａｈｌｂｅｒｇら、（２０１６）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４（１１；ｅ１０５）１－７；Ｍａｍａｎｏｖａら、（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（２）：１１１－１１８などに記載されているものが挙げられる。上述の刊行物は、参照により本明細書に援用される。

【0246】

実験：
本発明の５ｈｍＣ富化のワークフローとホールゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）のワークフローとを完全比較する。実施例１～３では、５ｈｍＣ富化またはＷＧＳに等分され、ＰＣＲ増幅の際にのみサンプル別にインデックスが付けられ得る単一のテンプレートライゲーション反応を可能にする従来とは違うシーケンシングアダプター構築物を評価する。これらの従来とは違うアダプターは、修飾されたインデックス付きＰＣＲ配列と対形成する「切断型」アダプター（約６塩基～約３０塩基長の範囲の一本鎖テールを有する）である。実施例１には、アダプター配列のデザインおよびアダプター構築物の生成を含むカスタムアダプターの調製が記載され、実施例２には、実施例１において調製されたアダプターによるライブラリー調製物の最適化が記載され、実施例３には、標準的な市販の「Ｙ」アダプターで見られる富化性能と比べた、カスタムアダプターを用いたときの少なくとも等価な５ｈｍＣ富化性能の検証が提供される。

【0247】

図６（先行技術）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｙアダプター構築物の標準的なアダプターの配置を示しており、この図に見られ得るように、サンプルインデックスバーコード（［インデックス］と示されている）は、Ｙアダプター内に含められている。図７は、増幅プライマー内にサンプルインデックスバーコード（［インデックスＲＣ］と示されている）を有する本発明の切断型アダプターの配置を示している。両方の図において、増幅プライマーが強調されている。本発明に従って切断型アダプターおよびインデックス付きプライマーを用いてインデックス付きライブラリーを生成する流れが、図８に概略的に示されている。

【0248】

５ｈｍＣ富化、ライブラリー生成およびハイスループットシーケンシングのプロトコル：

【0249】

被験体の登録時に、通例の静脈切開によって得られた全血検体から血漿を単離した。製造者のプロトコル（Ｓｔｒｅｃｋ，Ｌａ Ｖｉｓｔａ，ＮＥ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｒｅｃｋ．ｃｏｍ／ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ／ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ－ｄｎａ－ｂｃｔ／）に従って、Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ（登録商標）チューブに全血を収集した。チューブを１５℃～２５℃で維持し、静脈切開の２４時間以内にＲＴでの１０分間の１６００×ｇによる全血の遠心分離によって血漿分離を行った後、血漿層を新しいチューブに移し、１６，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。血漿をその後のｃｆＤＮＡ単離または－８０℃での貯蔵に向けて等分した。

【0250】

核酸を収集する前に、４ｍｌの血漿体積を３０分間溶解し；すべてのｃｆＤＮＡ溶出液を６０μｌ緩衝液の体積に収集した。ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ ＭＤ）を製造者のプロトコルに従って用いて、ｃｆＤＮＡを単離した。全血ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、ｄｓＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて断片化した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）およびＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって、ＤＮＡを定量化した。

【0251】

スパイクインアンプリコンの調製：スパイクインコントロールを生成するために、ラムダＤＮＡをＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）によってＰＣＲ増幅し、ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰのカクテルおよび以下のうちの１つ：ｄＣＴＰ、ｄｍＣＴＰまたは１０％ｄｈｍＣＴＰ（Ｚｙｍｏ）／９０％ｄＣＴＰを用いて、非重複の約１８０ｂｐアンプリコンとして、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって精製した。プライマー配列は、以下のとおりである。ｄＣＴＰ ＦＷ－５’－ＣＧＴＴＴＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣ－３’、ＲＶ－５’－ＴＡＣＴＣＧＣＡＣＣＧＡＡＡＡＴＧＴＣＡ－３’；ｄｍＣＴＰ ＦＷ－５’－ＧＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＡＡＣＴ－３’、ＲＶ－５’－ＣＡＴＡＡＡＡＴＧＣＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣ－３’；１０％ｄｈｍＣＴＰ／９０％ｄＣＴＰ ＦＷ－５’－ＴＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＡＣＧ－３’、ＲＶ－５’－ＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＴＣＧＡＴＡＣ－３’。

【0252】

５－ヒドロキシメチルシトシンアッセイ富化：シーケンシングライブラリーの調製および５ｈｍＣの富化を、以前に記載されているように（Ｓｏｎｇら、（２０１７）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１２３１－１２４２）（参照により本明細書に援用される）、行った。ｃｆＤＮＡを、各アッセイに対する１０ｎｇの総投入量に対して正規化し、シーケンシングアダプターにライゲートした。５ｈｍＣ塩基を、２工程の化学作用を介してビオチン化し、続いて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に結合することによって富化した。すべてのライブラリーをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）およびＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって定量化し、シーケンシングに向けた調製において正規化した。

【0253】

ＤＮＡシーケンシングおよびアラインメント：ＤＮＡシーケンシングを製造者の推奨に従って、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０装置をバージョン２試薬化学（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともに用いる７５塩基対のペアードエンドシーケンシングによって行った。１フローセルあたり２４個のライブラリーをシーケンシングし、生データの処理および脱多重化（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢａｓｅＳｐａｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｕｂを用いて行って、サンプル特異的ＦＡＳＴＱ出力を生成した。シーケンシング読み取りデータを、デフォルトのパラメータを用いるＢＷＡ－ＭＥＭ（Ｌｉ ＆ Ｄｕｒｂｉｎ（２０１０），“Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｌｏｎｇ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：５８９－５９５）を使用してｈｇ１９参照ゲノムとアラインメントした。

【0254】

ピークの検出：ＢＷＡ－ＭＥＭ読み取りデータアラインメントを用いて、ＣｐＧ内容物におけるヒドロキシメチル化されたシトシン残基の位置をマークする、読み取りデータが高密度に蓄積した領域またはピークを特定した。ピークを識別する前に、アラインメントされた読み取りデータの位置を含むＢＡＭファイルを、マッピングが不十分な（ＭＡＰＱ＜３０）読み取りデータおよび適切に対形成されなかった読み取りデータについてフィルタリングした。５ｈｍＣピークのコールを、ｐ値カットオフ＝１．００ｅ－５を用いるＭＡＣＳ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔａｏｌｉｕ／ＭＡＣＳ）を使用して実施した。他の箇所

【0255】

（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ａｎｓｈｕｌｋｕｎｄａｊｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｌａｃｋｌｉｓｔｓ）で定義されるような「ブラックリスト領域」に存在する特定された５ｈｍＣピーク、ならびにＸ染色体、Ｙ染色体およびミトコンドリアゲノム上の読み取りデータ（ｒｅａｄ ｄａｔｅ）も除去した。ゲノム特徴富化重複５ｈｍＣピークの計算を、デフォルトのパラメータを用いるＨＯＭＥＲソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／）を使用して行った。

【実施例】

【0256】

実施例１
アダプター配列のデザインおよびアダプター構築物の作製：

【0257】

表１におけるカスタムオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡから入手した）は、３つのサブセット：（１）ハイブリダイゼーションおよびアダプター構築物作製のための切断型アダプターオリゴヌクレオチド；（２）アダプターライゲート産物の増幅およびサンプルインデクシングの組み込みのためのインデクシングＰＣＲオリゴヌクレオチド；および（３）任意のインデックスモチーフを含むライブラリーを再増幅するためのユニバーサルＰＣＲオリゴヌクレオチドを含んだ。

【0258】

最初の試験に向けて、２４個のユニークなインデックスを作製した。インデックスは、市販のインデックスセットに由来し、インデックス付きＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー（インデックス１＿プライマー＝ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡ

【0259】

ＣＧＡＧＡＴＧＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ＊Ｔ．．．
インデックスＸ＿プライマー＝ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ＊Ｔ；同じ方法を用いて追加のインデックス付きプライマーを調製した）における配列の逆相補鎖として検出された。

【0260】

【表1-1】

【表1-2】

【0261】

再構成された２００μＭのＰ５＿切断型およびＰ７＿切断型アダプターオリゴヌクレオチドを、以下のとおりハイブリダイズした。

【0262】

ＳＴＥ緩衝液中の切断型アダプターオリゴヌクレオチドのマスターミックスを１．５ｍｌエッペンドルフチューブにおいて生成し、３本の肉厚の薄い０．２ｍｌＰＣＲチューブに等分した（各４０μｌ）。

【表2】

【0263】

以下の条件において、加熱蓋（ブロック温度が＞４０℃の場合１０５℃、その他の場合、外界温度）を有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｒｏにおいてオリゴヌクレオチドをハイブリダイズした。

【表3】

【0264】

ハイブリダイズしたアダプターを、単一の１．５ｍｌエッペンドルフチューブにプールし、検証中は、４℃で貯蔵した（長期間の貯蔵は、－２０℃での貯蔵が推奨される）。アダプターを１×ＳＴＥ緩衝液で１：２５０希釈し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップにおいて評価した。アダプターの電気泳動図に、ハイブリダイゼーションの成功を示す単一の大きなピークが見られた。

【0265】

上記の手順は、インデックス配列の作製に広く応用可能であり、当業者に明らかであるように、１またはそれを超える方法で改変され得る。

【0266】

実施例２
ライブラリー調製の最適化：

【0267】

この実施例では、実施例１に記載されたように調製された切断型アダプターを用いたライブラリー調製の最適化を記載する。

【0268】

（ａ）カスタムアダプターを評価するためのテンプレートＤＮＡの調製：

【0269】

テンプレートＤＮＡは、実際には限られたものであるので、切断型アダプターを最適化および検証する目的では、断片化されたゲノムＤＮＡが、重要で均一なＤＮＡテンプレートを入手するための最良の解決法であると考えられた。この目的のためにＫＡＰＡ（登録商標）ＨｙｐｅｒＰｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。このＨｙｐｅｒＰｌｕｓ Ｋｉｔは、典型的には、断片化とライブラリー調製（アダプターライゲーションを含む）との組み合わせを行うために用いられるが、断片化の部分だけをこの実施例に使用した。

【0270】

ストックの脳ゲノムＤＮＡおよび脾臓ゲノムＤＮＡを、緩衝液Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液において３５μｌあたり５００ｎｇに希釈した。組織タイプ１つにつき合計１μｇのゲノムＤＮＡに対して、各組織の２つの反復調製物を調製した。脳ｇＤＮＡと脾臓ｇＤＮＡの両方について、濃度および反応体積は、以下のとおりであった：ストック濃度、２５０ｎｇ／μｌ；最終濃度、１０．７ｎｇ／μｌ；反応体積、１．５μｌ；緩衝液ＥＢ、３３．５μｌ。

【0271】

断片化の緩衝液および酵素を氷上で解凍し、肉厚の薄い０．２ｍｌＰＣＲチューブ内の各ゲノムＤＮＡサンプルに添加した。断片化反応ミックス中の濃度および１×反応体積は、以下のとおりであった：ｄｓＤＮＡのストック濃度、１０．７ｎｇ／μｌ；ｄｓＤＮＡの反応濃度、７．５ｎｇ／μｌ；ｄｓＤＮＡの１×反応体積、３５μｌ；断片化緩衝液のストック濃度、１０×；断片化緩衝液の反応濃度、１×；断片化緩衝液の１×反応体積、５μｌ；断片化酵素のストック濃度、５×；断片化酵素の反応濃度、１×；断片化酵素の１×反応体積、１０μｌ。

【0272】

次いで、上記ゲノムＤＮＡサンプルを、以下の条件下のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ（加熱蓋は外した状態で）において断片化した：４℃で１分間の冷却；３７℃で３５分間の断片化。

【0273】

断片化サンプルを直ちにサーマルサイクラーから取り出し、下記に記載される２×比のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズプロトコルを用いて精製した：

【0274】

精製の前に、少なくとも３０分間、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを室温に加温した。

【0275】

４ｍｌの超高純度エタノールを１ｍｌ分子グレードの水と混合することによって、８０％エタノール溶液を調製した。

【0276】

各断片化サンプルの全体積を、適切にラベルされた１．５ｍｌチューブに移した。

【0277】

各サンプルに１００μｌのＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを添加し、軽くボルテックスして混合した。

【0278】

室温で１０分間、ＤＮＡをビーズに結合させた。

【0279】

＞１分間、チューブを磁気ラックに置いてビーズをペレットにした後、上清を除去し、廃棄した。

【0280】

チューブを磁気ラックに置いたまま、各サンプルに５００μｌの８０％エタノールを添加し、磁気ラックにおいて３０秒間インキュベートした後、上清を除去し、廃棄した。

【0281】

室温で５分間、サンプルチューブの蓋をとってビーズペレットを乾燥させた。

【0282】

各サンプルに５２μｌの緩衝液ＥＢを添加し、上下にピペッティングして、ビーズペレットを完全に溶解させた。

【0283】

時々混合して、室温で５分間、サンプルを溶液に溶出させた。

【0284】

＞１分間、チューブを磁気ラックに置いてビーズをペレットにした。

【0285】

５０μｌの上清を、適切にラベルされた１．５ｍｌチューブに慎重に移した。

【0286】

残りのチューブおよびビーズを廃棄した。

【0287】

Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡアッセイを用いて、断片化されたＤＮＡを定量化した。１μｌの各サンプルを評価した。断片化されたＤＮＡサンプルを、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップにおいてサイズ分布について評価した。得られたサイズ分布プロファイルは、図９に示されている。

【0288】

ゲノムＤＮＡサンプルの断片化は成功し、脳ｇＤＮＡ調製物よりも脾臓ｇＤＮＡ調製物における収率がわずかに高かった。観察されたフラグメントサイズは、標準的なｃｆＤＮＡサイズ分布の範囲内であり、１６７ｂｐに集中していた。断片化されたｇＤＮＡの収率は、（１）ライブラリー調製物に投入されるアダプターの力価、および（２）標準的なアダプターに対する切断型アダプターの直接評価にとって十分であった。

【0289】

（ｂ）アダプターの力価およびライゲーション：

【0290】

アダプターを、ＷＧＳライブラリー調製物に入れて、およそ５倍からおよそ５００倍のアダプター対テンプレートＤＮＡの比（５：１；２０：１；５０：１；１００：１；２５０：１；および５００：１）に及ぶ５０倍の範囲にわたって脳（１０ｎｇの投入量）および脾臓（２０ｎｇの投入量）の断片化ｃｆＤＮＡテンプレートに対して力価測定した。

【0291】

断片化されたＤＮＡを、５０μｌ体積における１０ｎｇ（脳）または２０ｎｇ（脾臓）に対して正規化した。末端修復酵素とＡテール化酵素とのミックスを調製し、断片化されたゲノムＤＮＡを、以下の条件を用いてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ（加熱蓋を付けた状態で）において末端修復し、Ａテール化した：２０℃で３０分間の末端修復；６５℃で３０分間の熱失活；および４℃で保持。

【0292】

９ｎＭ、３６ｎＭ、９１ｎＭ、１８２ｎＭまたは４５５ｎＭの濃度を有する１．５μｌのアダプター希釈物を、末端修復した各サンプルに添加し、ライゲーションマスターミックスを添加する前に混合した。

【0293】

以下の構成成分を有するライゲーションマスターミックスを調製した：

【表4】

【0294】

末端修復された断片化ｇＤＮＡサンプルを、室温で３０分間、アダプターにライゲートし、ライゲート産物を、標準的な１．２×比のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズプロトコルを用いて精製した。

【0295】

（ｃ）増幅および検証：

【0296】

１０：１：１：２：６体積比で以下の構成成分を含むＰＣＲマスターミックスを調製した：２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ；１０μＭユニバーサルプライマー；１０μＭインデックスプライマー（１～１０）；ライゲートしたＤＮＡ；およびＨＰＬＣ水。ＰＣＲサイクリング条件は、以下のとおりであった：最初の変性、９８℃、４５秒；変性、９８℃、１５秒；アニール、６０℃、３０秒。増幅産物を、前述同様に、標準的な１．２×比のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズプロトコルを用いて精製した。

【0297】

ＰＣＲ増幅されたライブラリーを緩衝液ＥＢで２５×希釈し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップにおいてＱｕｂｉｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｓＤＮＡアッセイを用いて評価した。データを下記に示す。

【0298】

切断型アダプター力価ライブラリー濃度：

【表5】

【0299】

ＷＧＳライブラリー濃度（ｎｇ／μＬ）を、投入したアダプターの濃度に対してプロットした。これは、ＭＴ群のＷＧＳとともに、図１０に示されている。

【0300】

このデータは、（１）予想通り、アダプター濃度に伴ってライブラリー濃度が大きく上昇すること、および（２）この実験では、ライゲーション反応において、１８２ｎＭのアダプター濃度のときまたは濃縮アダプターストックの６倍希釈のとき、ライブラリー濃度が最適になることを示している。しかしながら、各データポイントに対して１回しか反復を行わなかったので、分散は不明である。以前は、ＷＧＳのために処理されたサンプルを１０ｎｇのｃｆＤＮＡから調製していた。この実験では、２０ｎｇのｇＤＮＡを準備したが、２０％しかホールゲノム分析に使用されず、つまり標準的なＹアダプターを用いる既存のプロセスのＷＧＳ投入ＤＮＡの４０％に相当する量しか使用されなかった。図１０に示された参照値はすべて、この４０％投入量調整について補正されたＷＧＳライブラリー濃度を反映している。これらのデータの意味は、２０ｎｇの投入ＤＮＡを用いた切断型アダプターライゲーションが、既存の化学よりもテンプレート分子を効率的にサンプリングするということである。これらの分析に基づくと、濃縮アダプターストックの６倍希釈が最適である。

【0301】

実施例３
アダプターの性能の直接比較：

【0302】

（ａ）ライブラリーの定量化：

【0303】

最初の評価に基づいて、切断型アダプター 対 標準的な（Ｂｉｏｏ）アダプターの直接評価を行った。この実験のために、２０ｎｇの断片化された脳ｇＤＮＡおよび２０ｎｇの脾臓ｇＤＮＡをそれぞれ２つ組で、上に記載されたように調製した。しかしながら、アダプターにライゲートしたｇＤＮＡ産物の残りの８０％は、５ｈｍＣ富化プロトコルによって処理した。比較として、ＷＧＳおよび５ｈｍＣ富化のための１０ｎｇの各ＤＮＡタイプを、標準的なプロトコル（Ｂｉｏｏアダプター）を用いて調製した。すべてのサンプルを、比較分析のために同じフローセル上でシーケンシングした。インデックスは、Ｂｉｏｏインデックスおよびカスタムサンプルインデックスにおいて８ｂｐインデクシングによって読んだとき、ハミング距離が＞２になるように選択されなければならなかった。

【0304】

・切断型アダプターを用いて生成されたライブラリーのサイズプロファイルは、脳サンプルおよび脾臓サンプル由来の断片化されたゲノムＤＮＡのサイズプロファイルに基づく予想に非常に近かった。

【0305】

・クリーンアップ中に用いられた他と異なるＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ比におそらく起因して、Ｂｉｏｏアダプター調製物のサイズプロファイルは、切断型アダプターから生成されたサイズプロファイルよりも有意に大きかった（Ｂｉｏｏアダプター調製物に対しては、アダプターのライゲーションとＰＣＲの両方の後に０．８×というＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ比を用い、既存のＢｉｏｏアダプタープロトコルに対する注釈なしの変更では、ライゲーション後に０．８×というビーズ比、およびＰＣＲ後に１×というビーズ比を用いたことに注意されたい）。

【0306】

・ＢｉｏｏアダプタープロトコルにおけるＡＭＰｕｒｅＸＰビーズのクリーンアップ条件に起因して、かなりのライブラリーが失われた可能性が高い。さらに、失われたフラグメントサイズは、おそらく１００～１５０ｂｐの範囲に富化されている可能性があり、シグナルが豊富である可能性がある。

【0307】

ライブラリーの定量化データを下記に要約する。

【表6】

【0308】

（ｂ）シーケンシング：

【0309】

すべてのライブラリーを、平均フラグメントサイズに基づいて２ｎＭ濃度に対して正規化した。ライブラリーを、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０装置において単一の８ｂｐサンプルインデクシングによってペアードエンド（２×７５ｂｐ）でシーケンシングした。高レベルの配列データを下記に要約する。１つのサンプル（Ｓ８）は、操作者のエラーに起因して、このサンプルシートにおけるインデックスによって誤ってタグ付けされ、この実験では正しく脱多重化しなかったことに注意されたい。

【表7】

【0310】

配列データにおいて観察されたフラグメントサイズの分布は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいて観察されたものとほぼ同じであり、ここで、ＷＧＳライブラリーでは、有意なサイズのシフトが観察された（Ｂｉｏｏプロトコルの使用に対して選択された小さいフラグメントを用いたとき）が、プロトコルを実践的なＡＭＰｕｒｅＸＰ ＳＰＲＩビーズ条件に修正した後は、有意差がなくなった。

【0311】

（ｃ）分析：

【0312】

１６個のライブラリーの各々に対する遺伝子の数をＲＰＫＭ値に変換した。ＲＰＫＭ値を、ＷＧＳおよび５ｈｍＣ調製物に対する処置にわたって比較した。比較全体でいくらかのノイズがあったにもかかわらず、概して調製物は、互いに比較的類似していた。注目すべきことに、脳ゲノムＤＮＡからの５ｈｍＣ調製物は、特に複製調製物間で、互いに顕著に類似していた。

【0313】

ＲＰＫＭ値のヒストグラムを各ライブラリーについて構築した。ＷＧＳデータに対するＲＰＫＭ分布は、予想通り、最頻値が１に近づくにつれて分布が狭くなり（読み取りデータのランダム分布）、２次分布は、これらの男性サンプルにおいて５０％量を有するＸ染色体遺伝子本体に対応する０．５に近似した。ＷＧＳライブラリーのＲＰＫＭ分布は、脳ｇＤＮＡからの５ｈｍＣライブラリーのＲＰＫＭ分布と同様に、おおむね一致している。しかしながら、脾臓ｇＤＮＡからの５ｈｍＣライブラリーのＲＫＰＭ分布では、有意なばらつきが観察された。注目すべきことに、２つのライブラリーは、５ｈｍＣ調製物ではなくＷＧＳ調製物に近似するとみられたことから、これらのライブラリーに対する富化プロセスにおけるバックグラウンドノイズの可能性が示唆される。

【0314】

（ｄ）テンプレート分子サンプリング効率の見積もり（ＷＧＳのみ）：

【0315】

この実験において観察されたＷＧＳライブラリー濃度は、切断型アダプターが、試験された条件下でのテンプレートＤＮＡサンプリングのおよそ３倍高い効率を有することを示唆する（平均値２．９９×、中央値３．１９×）。サンプリング効率の見積もりは、投入したテンプレートの濃度、出力されたライブラリー濃度およびＰＣＲ増幅効率に依存しており、前の２つの値だけしか既知でなく、完全な１００％増幅効率の保存的（この目的の場合）な見積もりは、切断型アダプターがテンプレートのおよそ２５％をサンプリングし、Ｂｉｏｏアダプターが、テンプレートのおよそ８．５％をサンプリングすることを示唆していることに注意されたい。アダプターの直接比較の結果は、推定ＰＣＲ効率に対する、サンプリングされたテンプレートの割合のプロットである、図１１に示されている。

【0316】

実施例４
切断型アダプターの機能：

【0317】

切断型アダプターおよびインデックス付きＰＣＲプライマーの相対的な機能は、単一のテンプレートから調製されたホールゲノムライブラリーの収率を、限られたＰＣＲサイクルを用いる代替のアダプターストラテジーと比較することによって見積もることができる。この場合、高いホールゲノムライブラリー濃度は、全体的により効率的なプロセスを示唆する、テンプレート分子のより効率的なサンプリングを反映していると推定される。市販のアダプター（ＫＡＰＡ、ＢＩＯＯ）と比べて、切断型アダプターは、上に記載された条件下におけるテンプレートＤＮＡ分子のサンプリングにおいておよそ１．５×～２×より効率的である。ここで観察された値は、＞１０％（ＢＩＯＯアダプター）に対して＞１８％（切断型アダプター）という、テンプレートＤＮＡからライブラリーへの変換効率の改善を示唆する。アダプターの効率を隣り合わせで比較した結果が、図１２に示されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【手続補正書】

【提出日】2021-06-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022504078000001.app

【国際調査報告】