特表 2022-509515 非ニュートン流体の音響液滴吐出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-20

(54)【発明の名称】非ニュートン流体の音響液滴吐出

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6806 20180101AFI20220113BHJP

   B01L 3/02 20060101ALI20220113BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220113BHJP

   B05B 1/02 20060101ALI20220113BHJP

   B05C 5/00 20060101ALI20220113BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6806 Z

B01L3/02

C12M1/00 A

B05B1/02 102

B05C5/00 101

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021548537

(86)(22)【出願日】2019-10-29

(85)【翻訳文提出日】2021-05-10

(86)【国際出願番号】 US2019058620

(87)【国際公開番号】W WO2020092407

(87)【国際公開日】2020-05-07

(31)【優先権主張番号】62/752,261

(32)【優先日】2018-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507301040

【氏名又は名称】ラブサイト インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ダットワーニ， サミー エス．

(72)【発明者】

【氏名】リシェ， カーソン ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ブラウカンプ， マーシャ エヌ．

(72)【発明者】

【氏名】ブロニガン， ジャスティン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4F033

4F041

4G057

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA09

4B029AA27

4B029BB20

4B029CC01

4B029FA15

4B029GB05

4B029HA09

4B029HA10

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS12

4B063QS25

4B063QS39

4B063QX02

4F033BA03

4F033CA07

4F033LA13

4F041AB01

4F041BA01

4F041BA10

4F041BA12

4F041BA34

4G057AB11

(57)【要約】

音響液滴イジェクタによって非ニュートン流体を含有する液滴を吐出する方法は、トーンバーストパターンに従って液滴吐出をもたらすのに十分な振幅で、非ニュートン流体を含有する流体リザーバに集束音響エネルギーのトーンバーストを適用することを含み得る。トーンバーストパターンは、第１のトーンバーストセグメントが、第２および第３のセグメントよりも長い持続時間を有しており、かつ第３のセグメントが、第２のセグメントよりも長い持続時間を有している、３つの離散トーンバーストセグメントを含み得る。トーンバーストセグメントの正確な持続時間および振幅は、吐出特性に影響を与えるように調整され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

音響液滴イジェクタによって、非ニュートン流体を含有するリザーバから液滴を吐出する方法であって、前記方法が、
前記非ニュートン流体の流体表面に、第１のトーンバーストセグメントを含む第１のパターンで、集束音響エネルギーを適用して、フィラメントを先導突出部または前記流体表面から分離することなく、前記流体表面から前記先導突出部および前記フィラメントを生成することと、
第２のトーンバーストセグメントおよび第３のトーンバーストセグメントを含む第２のパターンで、集束音響エネルギーを前記先導突出部に適用して、前記フィラメントから前記先導突出部を分離することによって、液滴を吐出して、前記液滴を形成することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記第１のトーンバーストセグメントが、前記流体表面から前記先導突出部およびフィラメントを出すのに十分な振幅および持続時間を有し、
前記第２のパターンが、前記フィラメントから前記液滴を分離するように構成された第２のトーンバーストセグメントおよび第３のトーンバーストセグメントを含む、少なくとも２つの別のトーンバーストセグメントを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のトーンバーストセグメントの各々１つよりも長い持続時間を有し、第３のトーンバーストセグメントが、前記第２のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有している、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記フィラメントが、少なくとも１つの流体のビーズを含み、前記集束音響エネルギーの第２のパターンが、前記少なくとも１つの流体のビーズが１つ以上の追加の液滴に分解することを防止する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記液滴が、前記フィラメントの長さの７０％未満、３０％未満、または１０％未満である直径を有し、または前記液滴が、前記フィラメントの残りの部分の総ボリュームの８０％未満、１０％未満、または５％未満である液滴ボリュームを有している、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンが、サテライト液滴を生成することなく、液滴吐出をもたらすように構成されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記集束音響エネルギーの振幅が、ニュートン流体から代替液滴を吐出することに関連付けられた代替振幅を超えている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記集束音響エネルギーの振幅が、前記第１のトーンバーストセグメントと第２のトーンバーストセグメントとの間、または第２のトーンバーストセグメントと第３のトーンバーストセグメントとの間で変化する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記集束音響エネルギーによって前記リザーバから生成された前記非ニュートン流体の前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の０個、１個、２個、または＞２個のビーズを含む鎖を含み、
前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンが、前記鎖からの液滴離脱を誘導する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記鎖上の前記ビーズが、液滴離脱の前または後に、前記リザーバ内で、互いに、または前記非ニュートン流体と合体する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記フィラメントを光学的または電子的に監視して、前記液滴離脱が成功であるか、または失敗であるかどうかを評価することをさらに含む、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記リザーバ内に形成された流体マウンドからの光信号または電気信号に基づいて、液滴離脱を予測することをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記非ニュートン流体が、遺伝物質を含有する溶液を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記流体表面から流体の量を出すように構成された一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面に適用することと、
前記流体表面から出された前記流体の量におけるフィラメントの形成を検出するか、または前記流体表面からのキャリブレーション液滴の吐出を検出することと、
前記フィラメントの前記検出または前記キャリブレーション液滴の前記吐出に基づいて、前記集束音響エネルギーの前記第１のパターン、または前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンの１つ以上のトーンバーストの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、前記システムが、
音響イジェクタであって、
前記非ニュートン流体の流体表面に第１のパターンで、集束音響エネルギーを適用して、フィラメントを先導突出部または前記流体表面から分離することなく、前記流体表面から前記先導突出部および前記フィラメントを生成すること、および
前記フィラメントが前記流体表面に引き込まれるように、サテライト液滴を吐出することなく、前記先導突出部に第２のパターンで集束音響エネルギーを適用して、前記先導突出部を前記フィラメントから分離させること、を行うように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、前記音響イジェクタに、前記非ニュートン流体の流体表面に前記第１のパターンで前記集束音響エネルギーを適用させ、かつ前記前駆葉に前記第２のパターンで集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶する前記プロセッサおよびメモリデバイスと、を含む、液滴吐出システム。

【請求項16】

非ニュートン流体からの液滴吐出のためのトーンバーストパターンのパラメータを設定する方法であって、前記方法が、
前記流体表面から流体の量を出すように構成された一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面に適用することと、
前記一連のキャリブレーショントーンバーストに対応する一連のエコー信号を収集することと、
前記収集された一連のエコー信号に基づいて、前記非ニュートン流体を含有するリザーバから液滴を吐出するように構成されている、集束音響エネルギーのトーンバーストパターンの１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することであって、前記トーンバーストパターンが、少なくとも、
第１の別のトーンバーストセグメント、
第２の別のトーンバーストセグメント、および
第３の別のトーンバーストセグメントを含み、前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有し、第３のトーンバーストセグメントが、前記第２のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有している、設定することと、を含む、方法。

【請求項17】

前記収集された一連のエコー信号に基づいて、液滴吐出に対応する最小トーンバースト電力を決定することと、
前記最小トーンバースト電力に少なくとも部分的に基づいて、前記電力、波長、または持続時間のうちの前記１つを設定することと、をさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記トーンバーストパターンに従って、集束音響エネルギーを前記リザーバに適用することによって、前記リザーバから液滴を吐出することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

光学センサを介して、前記液滴の吐出を検知することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

液滴吐出が検出されるまで、前記第１、第２、または第３のトーンバーストセグメントのうちの１つ以上の前記電力、波長、または持続時間のうちの１つを繰り返し変化させることと、
液滴吐出の前記検出に基づいて、前記電力、波長、または持続時間を設定することと、をさらに含む、請求項１８または請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

既知の特性を有するそれぞれの複数の非ニュートン流体に対応する複数の反射音響信号を含む比較データセットに基づいて訓練された畳み込みニューラルネットワークによって、前記一連のエコー信号を処理することによって、前記吐出された液滴に関連付けられた液滴ボリュームを予測することをさらに含む、請求項１８または請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記吐出された液滴に関連付けられた実際の液滴ボリュームを決定することと、
前記実際の液滴ボリュームを、前記予測された液滴ボリュームと比較することと、
前記比較に基づいて、前記畳み込みニューラルネットワークを修正することと、をさらに含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記吐出された液滴に関連付けられた液滴ボリュームを決定することと、
前記液滴ボリュームを、予測された液滴ボリュームと比較することと、
前記比較に基づいて、前記電力、波長、または持続時間を調整することと、をさらに含む、請求項１８または請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記収集された一連のエコー信号に基づいて、前記非ニュートン流体の特性を決定することをさらに含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記一連のエコー信号と、非ニュートン流体の既知の収集と相関した以前に受信したエコーの収集を含む記憶されたエコーデータと、を比較することと、
前記比較に少なくとも部分的に基づいて、前記電力、波長、または持続時間のうちの前記１つを設定することと、をさらに含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

既知の特性を有するそれぞれの複数の非ニュートン流体に対応する複数の反射音響信号を含む比較データセットに基づいて訓練された畳み込みニューラルネットワークによって、前記１つ以上のエコー信号を処理することによって、前記非ニュートン流体の特性を決定することをさらに含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

流体リザーバから非ニュートン流体を含有する液滴を吐出する方法であって、前記方法が、
集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、非ニュートン流体を含有する流体リザーバに適用することであって、前記トーンバーストパターンの前記流体リザーバへの前記適用が、前記流体リザーバから前記非ニュートン流体の液滴を吐出し、前記トーンバーストパターンが、
第１の別のトーンバーストセグメント、
前記第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
前記第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、適用することを含む、方法。

【請求項28】

前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のセグメントよりも長い持続時間を有し、前記第３のセグメントが、前記第２のセグメントよりも長い持続時間を有している、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記第１の別のトーンバーストによって、前記非ニュートン流体の流体表面から先導突出部およびフィラメントを出すことと、
前記第２および第３の別のトーンバーストによって、前記フィラメントから前記先導突出部を分離することによって液滴吐出をもたらすことと、をさらに含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記フィラメントが、少なくとも１つの流体のビーズを含み、前記トーンバーストパターンが、前記少なくとも１つの流体のビーズが１つ以上の追加の液滴に分解することを防止する、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記非ニュートン流体の前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の１つ以上のビーズを含む鎖を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記トーンバーストパターンが、前記鎖からの液滴離脱を誘導する、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の１個、２個、または＞２個のビーズを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の５個、１０個、または＞１０個のビーズを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

前記非ニュートン流体のビーズが、前記フィラメントの直径の１０％、２０％、５０％、または＜５０％だけ前記フィラメントの前記直径を超える厚さを有している、請求項３１に記載の方法。

【請求項36】

前記非ニュートン流体のビーズが、結果として生じる液滴直径の５０％、７５％、または９０％以下の厚さを有している、請求項３１に記載の方法。

【請求項37】

前記鎖上の前記ビーズが、液滴離脱の前または後に、前記リザーバ内で、互いに、またはの前記非ニュートン流体と合体する、請求項３１に記載の方法。

【請求項38】

前記吐出された液滴の液滴ボリュームが、液滴吐出中の前記フィラメントの残りのボリュームの８０％未満、１０％未満、または５％未満である、請求項３１に記載の方法。

【請求項39】

前記フィラメントが、少なくとも５個の液滴直径、少なくとも１０個の液滴直径、少なくとも２０個の液滴直径、少なくとも５０個の液滴直径、または少なくとも１００個の液滴直径の長さを有するときに、前記液滴の吐出が発生する、請求項３１に記載の方法。

【請求項40】

前記液滴が、前記フィラメントの長さの７０％未満、３０％未満、または１０％未満の直径を有している、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項41】

前記液滴が、液滴吐出中に、前記フィラメントの残りのボリュームの８０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満の液滴ボリュームを有している、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項42】

前記トーンバーストの振幅が、ニュートン流体から代替液滴を吐出することに関連付けられる代替振幅を超えている、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項43】

前記トーンバーストの振幅が、前記第１のトーンバーストセグメントと第２のトーンバーストセグメントとの間、または第２のトーンバーストセグメントと第３のトーンバーストセグメントとの間で変化する、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項44】

前記フィラメントを光学的または電子的に監視して、前記液滴離脱が成功であるか、または失敗であるかどうかを評価することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項45】

前記リザーバ内に形成された流体マウンドからの光信号または電気信号に基づいて、液滴離脱を予測することをさらに含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項46】

前記非ニュートン流体が、遺伝物質を含有する溶液を含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項47】

一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面から流体の量を出すように構成された前記流体表面に適用することと、
前記流体表面から出された前記流体の量におけるフィラメントの形成を検出することと、
前記フィラメントの前記検出に基づいて、前記トーンバーストパターンの１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項48】

リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、前記システムが、
集束音響エネルギーが前記リザーバから前記非ニュートン流体の液滴を吐出するように、前記集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、前記リザーバに適用するように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、前記音響イジェクタに、パターンで前記集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶する前記プロセッサおよびメモリデバイスと、を含み、前記パターンが、
第１の別のトーンバーストセグメント、
前記第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
前記第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、液滴吐出システム。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

多くの生物学的溶液、ポリマー溶液、およびポリマー溶解物は、ケチャップ、デンプン懸濁液、塗料、ハチミツ、血液、カスタード、およびシャンプーなどの多くの一般的に見出される物質と同様に、本質的に非ニュートン流体である。ニュートン流体については、せん断応力と歪み速度との間の関係は、線形であり、比例定数は、粘度係数である。粘度のニュートンの法則（１－Ｄ運動量移送）の例を、方程式［１］で下に示している。

【数1】

【0002】

非ニュートン流体の場合、せん断応力と歪み速度との間の関係は、非線形であり、時間依存性である場合がある。したがって、粘度の定数係数を定義することはできない。したがって、非ニュートン流体は、せん断応力プロファイル（または流体移送の方向に対する速度における導関数）において非線形応答を有する流体として定義される。非ニュートン流体はまた、流体が流体流の方向にせん断されたときに達成されるせん断応力プロファイルに関して、粘性成分および弾性成分の両方を有するため、粘弾性流体と称される。これらの流体は、見かけの粘度が非ニュートン流体に対して一定ではない、以下の方程式［２］で特徴付けられる。

【数2】

【0003】

非ニュートン流体には様々なタイプがあり、例えば、べき乗則流体は、せん断速度が増加するにつれて、η（見かけの粘度）が減少する擬塑性（せん断速度の薄化）、またはせん断速度が増加するにつれて、η（見かけの粘度）が増加するダイラタント（せん断速度の増粘）のいずれかであり得る。非ニュートン流体は、多くの異なる流れ条件（例えば、異なるデバイスまたはレオメータを使用して測定される振動せん断流または伸張流）下で、応力および歪み速度テンソルに関連するいくつかの他のレオロジー特性（粘度を測定することに加えて）を通して最も良く研究される。この特性は、連続体力学の分野で共通するテンソル値構成方程式を使用して、より良好に研究される。

【0004】

ニュートン流体の急速な移送は、例えば、Ｒ．Ｇ．ＳｔｅａｍｓおよびＳ．Ａ．Ｑｕｒｅｓｈｉ，“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ Ｅｊｅｃｔｉｎｇ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ ｆｒｏｍ ａ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｂｙ ａｎ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｌｕｉｄ Ｅｊｅｃｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ”（米国特許第９，９０８，１３３号、２０１８年３月６日）に記載される、音響液滴吐出（ＡＤＥ）による急速な移送を含む、様々な技術を使用して達成され得る。しかしながら、ＡＤＥを利用したポリマー溶液などの非ニュートン流体の移送を試みる際に問題が生じる。例えば、問題は、伸長流においてポリマー溶液の硬化効果を生じさせるポリマー鎖の明白な整列を含む。

【0005】

問題は、溶液中のポリマーの濃度ならびにポリマー自体のサイズ（鎖長）に基づいて、粘弾性パラメータによって定義される「緩和時間」を調査することができる支配レジームに細分化され得る。ポリマー溶液の理論では、これらのレジームは、異なる物理学において発生し、かつ顕在化し得る、異なる優勢な化学相互作用を有し（例えば、高速カメラで見ることができる）、これらのレジームは、希釈ポリマー溶液から濃縮ポリマー溶液、ポリマー溶融物までの範囲によって特徴付けられる。また、溶媒系は、ポリマー鎖と溶媒タイプ（良好、不良、シータ）などとの間の相互作用および溶液化学を支配することになるときに、大きな駆動力を有する。

【0006】

特定の用途では、ＤＮＡ溶液は、非ニュートン流体とみなすことができる。例えば、ＤＮＡを研究する１つの実験室アプローチは、緩衝系（典型的には、ＴＥ、ＰＢＳ、水など）にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を提供することであり、ポリマーを「縮合させる」ことを試みず、これは、非ニュートン性であるポリマー溶媒系を形成する。追加の複雑さを加えると、溶液の濃度に応じて流体の特性が変化する場合がある。溶媒系中の希釈ポリマー溶液（一例として、天然ｇＤＮＡ）については、天然ｇＤＮＡ鎖間の相互作用がほとんどなく、結果として、緩和時間、最大伸長、およびゼロせん断粘度によってモデル化および特徴付けされ得る簡略化されたシステムをもたらす。より高い天然のｇＤＮＡ濃度では、このようなポリマー－溶媒系のモデル化は、より複雑になる。緩和時間は、今では、鎖の長さだけでなく濃度にも依存し、指数関数的に成長する。最大伸長はまた、ｇＤＮＡ濃度と関連しているが、成長は限定的である。
要約すると、ＤＮＡ解析のための追加の処理方法が必要であるが、非ニュートンＤＮＡ含有溶液の流体特性を特徴付ける問題は、これまで複雑すぎて、ＡＤＥにおける公知の技術による一般的なＤＮＡ含有流体移送を可能にすることができなかった。したがって、天然ｇＤＮＡおよび他の粘弾性のある非ニュートン流体を、再現可能、正確、かつ精密に移送することができる新規のＡＤＥプロセスに対するニーズがある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第９，９０８，１３３号明細書

【図面の簡単な説明】

【0008】

本開示による様々な実施形態を、図面を参照して説明する。

【0009】

【図1】電力不足状態および電力が高い状態で吐出を実施する液滴吐出器具の高速画像のセットを示している。

【図2】ニュートンおよび非ニュートントーンバーストの音響波形を示す振幅プロットである。

【図3-1】第１の音響トーンバーストを利用した水を使用した吐出プロセスを示している。

【図3-2】第２のトーンバーストでのヒト天然ｇＤＮＡを含有する溶液の吐出プロセスを示している。

【図4-1】増加するｇＤＮＡ濃度における、水とヒト天然ｇＤＮＡの混合物からの音響信号波形パターンのセットを示している。

【図4-2】増加するｇＤＮＡ濃度における、水とヒト天然ｇＤＮＡの混合物からの音響信号波形パターンのセットを示している。

【図4-3】増加するｇＤＮＡ濃度における、水とヒト天然ｇＤＮＡの混合物からの音響信号波形パターンのセットを示している。

【図4-4】増加するｇＤＮＡ濃度における、水とヒト天然ｇＤＮＡの混合物からの音響信号波形パターンのセットを示している。

【図5】ニュートン吐出電力レジメンおよび増加した電力レジメンにおける、ヒト天然ｇＤＮＡのサンプル移送有効性を示す画像である。

【図6】ニュートン吐出電力レジメンおよび増加した電力レジメンにおける、ヒト天然ｇＤＮＡのサンプル移送有効性を示す画像である。

【図7】吐出電力に基づく様々なヒト天然ＤＮＡ溶液の移送成功率を示すチャートである。

【図8-1】ニュートン吐出電力レジメンを使用したＡＤＥ移送されたｇＤＮＡ溶液から得られたヒト天然ｇＤＮＡ断片サイズおよびｇＤＮＡ濃度を示している。

【図8-2】非ニュートン吐出電力レジメンを使用したＡＤＥ移送されたｇＤＮＡ溶液から得られたヒト天然ｇＤＮＡ断片サイズおよびｇＤＮＡ濃度を示している。

【図9】手動ピペット操作と比較したＡＤＥ（Ｅｃｈｏ）による移送の相対的成功を示す一連のＤＮＡ濃度の交点（Ｃｐ）を示す図解である。

【図10-1】ＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）ｇＤＮＡサンプルの分析トレースである。

【図10-2】ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）ｇＤＮＡサンプルの分析トレースである。

【図11】天然ｇＤＮＡの生物学的および技術的複製のＣｐ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］を示すプロットである。

【図12】図１１に示されたＣｐ曲線のパーセントＣＶを示すプロットである。

【図13】大きな断片サイズを示すヒトｇＤＮＡサンプルの分析トレースを示している。

【図14】一連の生物学的ｇＤＮＡ複製についてのＣｐ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］を示すプロットである。

【図15】図１４に記載された一連の複製についてのＣｐ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］データのパーセントＣＶを示すプロットである。

【図16-1】ＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）ＤＮＡサンプルの分析トレースを示している。

【図16-2】ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）ＤＮＡサンプルの分析トレースを示している。

【図16-3】第１、第２、第３、および第４のヒト天然ｇＤＮＡサンプルについての一連の分析トレースを示している。

【図16-4】第１、第２、第３、および第４のヒト天然ｇＤＮＡサンプルについての一連の分析トレースを示している。

【図16-5】第１、第２、第３、および第４のヒト天然ｇＤＮＡサンプルについての一連の分析トレースを示している。

【図16-6】第１、第２、第３、および第４のヒト天然ｇＤＮＡサンプルについての一連の分析トレースを示している。

【図17】ｑＰＣＲ反応の成功を評価するための増幅曲線およびメルト研究を示す、一連の蛍光および蛍光誘導体プロットである。

【図18】ヒトｇＤＮＡ溶液の液滴形成の時間進化を示している。

【図19】ヒトｇＤＮＡ溶液の異なるサンプルおよび異なるサイズスケールの異なるサンプルに対する、液滴形成の時間進化を示している。

【図20】様々な音響電力レベルでの２つの異なるトーンバースト比で移送された液滴を示している。

【図21】２つの異なるトーンバースト比についての吐出電力を増加させるための吐出量と吐出電力を比較するチャートである。

【図22】様々な吐出電力における大滴および小滴の両方において移送された測定された体積の散布図である。

【図23】非ニュートン流体のせん断薄化についての液滴移送成功を示している。ニュートンパラメータを使用して移送を試行しても、ＡＤＥ移送は発生しないことに留意されたい。

【図24】非ニュートン流体のせん断増粘についての液滴移送成功を示している。ニュートンパラメータを使用して移送を試行しても、ＡＤＥ移送は発生しないことに留意されたい。

【図25】ＡＤＥによるＤＮＡ移送の頑健性を定量的に評価するために使用される試験プレートのレイアウトマップを示す概略である。

【図26】小さな液滴を使用して、図２５の試験プレートから移送されたヒトｇＤＮＡに対するＣｔ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］を示すプロットである。

【図27】大きな液滴を使用して、図２５の試験プレートから移送されたヒトｇＤＮＡに対するＣｔ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］を示すプロットである。

【図28】所与の開始濃度および液滴カウントの各々について、期待勾配で線形性を首尾よく達成した出力レベルを示すチャートである。

【図29】液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための第１の例示的なプロセスを示している。

【図30】液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための第２の例示的なプロセスを示している。

【図31】液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための第３の例示的なプロセスを示している。

【図32】液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための第４の例示的なプロセスを示している。

【図33】非ニュートン流体を特徴付け、流体の同一性を固定するために、動的マウンド分析（ＤＭＡ）を使用するための例示的なプロセスを示している。

【図34】音響液滴吐出を達成し、トーンバーストパラメータを固定するために、動的離脱分析（ＤＢＡ）を使用するための例示的なプロセスを示している。

【図35】音響液滴吐出によって生成される液滴のボリュームを特徴付け、液滴ボリュームを固定するために、動的ボリューム分析を使用するための例示的なプロセスを示している。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下の説明では、様々な実施形態について説明する。説明の目的で、実施形態の完全な理解を提供するために、特定の構成および詳細を明記する。しかしながら、実施形態が他の構成で、または特定の詳細なしに実践され得ることも当業者には明らかであろう。さらに、記載される実施形態を不明瞭にしないために、周知の特徴は省略または簡略化され得る。

【0011】

本明細書に記載される技術は、音響液滴吐出（ＡＤＥ）技術を利用して、非ニュートン流体（溶液中の無傷の天然ゲノムＤＮＡまたは粘弾性ポリマーなど）のサンプルを、高度に再現性があり、高度に正確かつ高度に精密な様式で移送する能力を可能にする。

【0012】

より具体的には、本明細書に記載の技術は、未処置、未断片化、無傷の天然ゲノムＤＮＡ（全体で天然ｇＤＮＡと称される）を、音響的に適格であるマイクロプレートまたは管内のウェルから、音響液滴吐出（ＡＤＥ）技術を使用して移送することを可能にする。現在、多くの生物学的アッセイワークフローは、チップベースのシステムを使用するなど、未処置、未断片化、無傷のｇＤＮＡを移送するより従来的な方法を利用する。この方法論は、研究用途のみまたは臨床診断用途のための将来の実験室設定について、真に混じりけのない、非接触、タッチレスの液体移送プロセスを提供する。

【0013】

本明細書に記載されるＡＤＥ技術に対する特定の改善は、大きな断片（＞２０Ｋｂ）および／または高濃度（＞１００ｎｇ／μＬ）の両方を有する天然ｇＤＮＡサンプルの移送を可能にする。以前のＡＤＥ能力には限界があり、移送プロセスが意図される用途に対して十分正確で精密なものにならない前に、流体がニュートンの挙動から幾らか逸脱する可能性がある。例えば、ナノリットルスケールの液滴を形成する場合、ｇＤＮＡサイズが２０Ｋｂ長を超え、濃度が１００ｎｇ／μＬを超えると、音響液滴形成のプロセスは、流体の非ニュートン性の性質によって妨げられることになる。希釈（例えば、緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ）、水、他の希釈剤）、添加剤（例えば、塩、界面活性剤）、加熱、せん断、断片化（酵素、キット）、縮合試薬（例えば、イオン液体、スペルミジン、スペルミン）、または他の形態などの断片サイズまたは物理的サイズまたは濃度を減少させる操作なしに、天然ｇＤＮＡを移送する能力は、したがって、純粋でリポジトリに保存されている天然ｇＤＮＡサンプルを移送するために非常に望ましい。この能力により、研究者および臨床医は、ライフサイエンスおよび臨床診断用途のために、限定された（かつしばしば貴重な）天然のｇＤＮＡサンプル、または他の問題のある生物学的もしくは高分子材料を、サンプルの取り扱い（ナノリットルスケールを含む）を真に小型化することが可能となる。さらに、この新しい能力により、自動プラットフォームワークフローにおけるステップ数が少なくなり、さらに上流ステップを実施するための複数の異なる自動液体取り扱いプラットフォームまたは装置の利用の必要性も低減される。

【0014】

本明細書に記載される技術によって、ユーザは、抽出された天然ｇＤＮＡの「純粋な」非添加形態から作業し、小容量（数または数十ナノリットル）を音響的に移送することが可能になり、所望の下流生物学的アッセイが可能になる。大量のボリュームはまた、新規な音響液滴移送プロセスが、再現性が高く、精度が高く、精密性の高いものであるすべての複数の多数の小ボリュームサンプル移送に起因して達成されるので、移送されるボリュームの範囲にわたって、再現性が高く、正確で、精密であるという事実を利用して、移送させることができる。この文書では、高速カメラ（ＶＩＳＩＯＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＣ．，ＰＨＡＮＴＯＭ）、吸水性紙（ＳＹＮＧＥＮＴＡ）、ならびに定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（ＲＯＣＨＥおよびＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ）実験結果から得られた実験結果は、本明細書に記載される技術に従って移送される天然ｇＤＮＡの能力、品質および量を示している。移送されるすべてのサンプルの再現性、正確さ、および精密性は高く、ハウスキーピング遺伝子を利用した記載されるｑＰＣＲアッセイのＣｐまたはＣｔの低変動係数（ＣＶ）によって定量的に実証される。ＣｐまたはＣｔは、それによってＤＮＡが増幅される交点閾値を表し、また「膝」が増幅曲線の取り込みにある値を表す。これは、アッセイ中に存在するＤＮＡの量を定量的に調査する分子生物学者にとって関心対象の価値ある指標である。

【0015】

さらに、非ニュートン音響移送プロセスのせん断速度が低いため、ｇＤＮＡは、ｇＤＮＡがＮＧＳなどの下流プロセスにおいてさらに利用されるウェルまたは管などの標的容器に移送された後も無傷のままである。

【0016】

特定の実施形態を、図を参照して以下に詳細に説明する。

【0017】

本発明の少なくとも１つの実施形態によれば、非自明な吐出電力範囲（図２を参照）と協調して動作する新規の吐出トーンバーストが開示されている（表１および図１を参照）。典型的には、ニュートン流体の場合と同様に、（標準的な水性緩衝液ニュートントーンバーストと組み合わせた）正しい吐出電力の決定は、生成され、かつ例えば、参照によりすべての目的のために本明細書に組み込まれる米国特許第９，９０８，１３３号に記載される生成されたマウンド画像信号処理（ヌル空間を決定する）と相関する、シグネチャ（特徴的な音響反射）によって決定される。マウンド画像印刷（ＭＩＰ）は、ニュートン流体について、移送についての吐出閾値に対して定義された、１～３ｄＢの吐出エネルギーでの音響液滴吐出用の極めて再現性が高く、正確で、かつ高精密なサンプル移送の生成をもたらす。このプロセスは、ニュートン流体のウェルまたは管などの流体リザーバから液滴を吐出するための電力要件を決定するために使用される。非ニュートン流体の場合、流体が（ＡＤＥプロセスのように）伸張流に供されるときに、著しく異なる物理化学的特性がある。さらに、信号処理に関連する摂動が低せん断値で起こるため、ＭＩＰ結果はこれらの差異を識別することができない。したがって、ニュートン流体に不十分な差異を呈するため、エネルギーを移送するための正しい吐出を示すための信号処理のこのステップ中のＭＩＰへの依存は、場合によっては、高音響電力によるせん断速度の増加で生じるニュートン挙動からのより強い偏差を補償するために、液滴形成に有効ではない音響液滴吐出に対する１ｄＢの吐出電力を示唆している。非ニュートン流体に対するＡＤＥベースの移送は、新しい吐出エネルギーレジーム（典型的には、吐出閾値を約６～１１ｄＢ上回る）と併せて、新しいトーンバーストを使用して達成され得る。３つのタイプの無傷のｇＤＮＡサンプルについて、新しいトーンバーストと協調して、１ｄＢ（ニュートンＡＤＥの場合）から６～１１ｄＢ（正誤または非ニュートンＡＤＥの場合）までの結果を以下に示している。

【0018】

図１は、ＡＤＥの成功をもたらす、電力不足状態（左－１０２、１０４、１０６）および電力が高い状態（右－１０８、１１０、１１２）における液滴吐出器具の高速画像１００のセットを示している。この図は、非ニュートン流体を、ＡＤＥの目的のためにニュートン流体として処理することの不足を示している。本発明の実施形態によれば、ＡＤＥによって移送される流体が非ニュートン流体であることの検出に応答して、ＡＤＥシステムは、試験リザーバ内の溶液の非ニュートン性の性質を補償するために、増加した電力条件を採用する。図１の場合、非ニュートンのｇＤＮＡ溶液を使用した。画像は、毎秒２０，０００フレーム、４９μｓの露出時間で捕捉された。３つの異なる天然ｇＤＮＡのサンプルを音響管から吐出した。上から下へ、サンプルをＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）（１０２、１０８）およびＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）（１０４、１１０）から商業的に取得したのに対し、ヒトサンプルをＲｏｃｈｅ ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ（登録商標）（１０６、１１２）を使用して抽出した。すべてのサンプルは、＞２０Ｋｂおよび／または高濃度＞１００ｎｇ／μＬであった。

【表1】

【0019】

表１は、成功したＡＤＥに使用されるニュートン流体キャリブレーションと非ニュートン流体キャリブレーションのトーンバーストセグメント長の比較を示している。本明細書に記載されるような非ニュートンサンプル上の成功したＡＤＥは、Ｌａｂｃｙｔｅ（登録商標）Ｅｃｈｏ音響液滴イジェクタを修正することによって実施された。このニュートントーンバーストは、Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ５２５リキッドハンドラー上で、２５ｎＬのニュートン流体（典型的には、緩衝液または水溶液について）を強力に移送する。Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ５５０／５５５上で、濃度＞１００ｎｇ／μＬで、ロング２０Ｋｂ天然ｇＤＮＡを移送するために、非ニュートントーンバーストを使用した。図２は、ニュートン２０１および非ニュートン２０２トーンバーストの音響波形を示す音響振幅プロット２００を示している。

【0020】

無傷の天然ｇＤＮＡまたは粘弾性ポリマー溶液および溶融物を含む生物学的流体は、ひずみ速度の関数としてせん断応力プロファイルに対する非線形応答を一般的に示し、ＡＤＥでの動作に望ましい非ニュートン流体の周知の例である。これらの流体サンプルは、複雑な高分子溶液であり、その特性は、ＭＩＰを用いたプライオリの特徴付けがしばしば困難である。事実、音響的に適格であるマイクロプレートまたは音響的に適格である管などのリザーバ内のニュートン流体および非ニュートン流体の両方は、標準的な音響エコーから情報を得る場合、ＡＤＥプロセスに必要な信号処理および知覚エネルギーにはほとんどまたは全く差異が見られない。粘弾性特性は、吐出エネルギーで現れ、これにより、液滴（好適なエネルギーを有するマウンドから生成される）はピンチオフしない。結果として、液滴はマウンドに戻り、ウェルまたは管内のサンプルのリザーバへと「スナップバック」する。天然のｇＤＮＡの場合、溶液は、場合により、液滴の離脱なしに最大１ｃｍ（またはそれ以上）の長さまで「伸長」することができる。印加されるエネルギーが高いほど、ポリマーｇＤＮＡ鎖のより緊密な整列が生じ、液滴の離脱がさらに困難になる。類推は、ゴムバンドを延ばす際のゴムバンドの伸張であり、ポリマー鎖は、さらに整列し、さらに延ばすことが困難になる。さらに、非ニュートン流体の粘弾性の増加は、液滴離脱中の力のバランスに悪影響を及ぼし、本明細書に記載される新しい方法論は、非ニュートン流体に対して、高度に再現性があり、高度に正確で、かつ高度に精密な音響液滴吐出を可能にすることが示されている。

【0021】

図３Ａは、６５０ｍＶの音響トーンバースト電圧を利用し、トーンバースト後の１４００μｓの時点での光学的にストローブする、水を使用した吐出プロセスを示している。図３Ｂは、トーンバーストセグメント１の長さ＝２７５μｓ、セグメント２の長さ＝１３０μｓ、セグメント３の長さ＝１００μｓ、セグメント１のＣＦ＝５．８５ＭＨｚ、セグメント３のＣＦ＝５．１５ＭＨｚというトーンバースト特性を有する天然ｇＤＮＡの吐出プロセスのストロボスコピック画像である。音響トーンバースト電圧は、同じニュートントーンバーストセグメント長で１１００ｍＶである。トーンバーストを適用した後、画像を約５０００μｓの時点で捕捉した。吐出トーンバーストは、リザーバから離れて延在し、フィラメント３０３によって流体の残りの部分と接続される、先導突出部３０１（図３Ａ、図３Ｂ）を生成する。天然ｇＤＮＡの場合、ＤＮＡポリマー鎖は、伸長の流れがＤＮＡを「延伸」した構成に配置し、より多くの力が印加されると伸長し続けるように整列することに留意することが有用である（図３Ｂを参照）。さらに、より多くのエネルギーが印加されると、より長い天然ｇＤＮＡスレッドが作成され（数ｍｍ）、液滴は分離されない。１４００ｍＶの音響電力（水の吐出よりも約６ｄＢ高い）では、液滴分離は依然として存在しない。また、これらの粘弾性流体では、通常のＭＩＰ測定は、天然のｇＤＮＡ中に粘弾性が存在せず、鎖が、液滴離脱に近くなるまで有意に整列しない場合に、適切な予測される吐出電力をもたらすことに留意されたい。したがって、ＭＩＰベースの結果は、粘弾性現象の完全な影響を捕捉することに失敗する。

【0022】

流体充填されたウェルまたは管の通常の音響検査では、音響変換器は、関心対象のウェルの下に位置付けられる。水、または別のカップリング流体は、変換器と、マイクロプレートウェルの下側または管底部などのリザーバの底部との間のギャップを架橋する。音響信号は、変換器から、カップリング流体を通って、ウェルまたは管のプラスチック底部膜を通って、流体内に、そして最後に上方の空気中に伝搬する。音響信号は、これらのインターフェースの各々で反射され、オリジナルの信号を放射したのと同じ変換器によって収集される。初期波形は、反射信号と重複しない。マウンド画像印刷（ＭＩＰ）と呼ばれるプロセスでは、流体特性についての情報が、反射信号から抽出される。ｇＤＮＡ濃度の増加の場合（図４Ａ～図４Ｄに示すような）、ＭＩＰ結果は、１００ｎｇ／μＬの天然のｇＤＮＡ濃度まで、純粋な緩衝液条件（１ｘＰＢＳ）間に差異を示さない。具体的には、図４Ａは、天然ｇＤＮＡを含まない水からの音響信号波形パターンを示すチャート４００ａを含み、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄはそれぞれ、５０ｎｇ／μＬ（４００ｂ）、１２０ｎｇ／μＬ（４００ｃ）、および１６０ｎｇ／μＬ（４００ｄ）で、天然ｇＤＮＡを含有する水からの音響信号波形パターンを示すチャートを含む。天然ｇＤＮＡ濃度１００ｎｇ／μＬを超えると、表面摂動共鳴で現れる毛細管波の存在があり、これは、液滴の離脱により低いエネルギーが必要であることを実際に示唆するであろう。

【0023】

本開示によると、代替的な吐出トーンバーストまたは音響波形は、ウェルまたは管などのリザーバ内に含まれる天然ｇＤＮＡなどの非ニュートン流体に適用される（図２を参照）。音響変換器は、リザーバの下に位置付けられ、ウェルまたは管内に含まれる流体の表面で集束される。流体の表面に到達し、表面を乱し、液滴を離脱するために必要なトーンバーストの振幅は、ニュートン流体（例えば、水または１ｘＰＢＳ）とは有意に異なるものと決定される。１～３Ｖの範囲の振幅を有する吐出トーンバーストが、水または１ｘＰＢＳで充填されたウェルに適用されると、流体のブレークアップが表面で発生し、液滴が吐出される。これは、ニュートンクラスの流体で作動中のＡＤＥプロセスに期待される通常の挙動である。

【0024】

音響放出の有効性は、図５および図６に示すように、様々な電力でサンプル液滴試験を実施することによって、Ｅｃｈｏ ５５０／５５５液体ハンドラーを使用して実験的に実証され得る。図５は、１００ｎｇ／μＬで１５０Ｋｂの天然ｇＤＮＡの移送について、増加電力、＋０ｄＢ（左）、および公称電力＋２．０ｄＢ（右）を使用して移送するための、視覚的／定性的な単一の２．５ｎＬサンプル液滴試験を示している。図６は、４０Ｋｂの天然ｇＤＮＡのヒトサンプルのＡＤＥ移送に対する視覚的試験を示している。水感応性紙の左半分の電力は、＋０．０ｄＢであり、水感応性紙の右半分の電力は、＋８．０ｄＢであった。３８４箇所の各々で、２．５ｎＬの１回の移送を試みた。ドットの存在または不在は、水性流体が紙と接触したときに、水感応性紙が黄色から青色に変色するにつれて、それぞれ、成功したまたは失敗した液滴離脱イベントを示している。

【0025】

高粘弾性の天然ｇＤＮＡ溶液（図５のヒトサンプルおよび図６の市販の天然ｇＤＮＡサンプル）を、２つのモードで試みた。まず、ニュートントーンバーストおよびエネルギー移送プロファイル（５０２、６０２－図の左側）を使用し、次に非ニュートントーンバーストおよびエネルギープロファイル（５０４、６０４－図の右側）を使用した。明らかにニュートンプロファイルを使用した場合、天然ｇＤＮＡの液滴は移送せず、非ニュートンプロファイルの場合、成功した移送は、青色のドットを呈する水感応性紙によって示される。これは定性尺度であり、移送失敗は、青色のドットが予想される空白領域を有する。図５は、天然ｇＤＮＡのヒトサンプルを示し、図６は、市販のＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）サンプルを示している。

【0026】

次に、電力が増加するにつれて、成功した移送の数も増加し（図７を参照）、「正常な」パラメータ空間が成功または再現可能な成功を（ｑＰＣＲ結果とともに後で実証される）組み込まないことを示している。標準的な吐出閾値を上回る約６～１１ｄＢでの移送の成功率の増加は、新規な非ニュートントーンバーストと協調して非ニュートン粘弾性流体に適した新しい運用体制を強調している。図７で強調表示されているように、ニュートン流体に使用される通常のパラメータは適切ではない。これは、非ニュートン流体の液滴吐出の成功に必要な最小エネルギーを表す設定である。移送成功率は、ＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）サンプル（７０２）、ヒトｇＤＮＡサンプル（７０４）、およびＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）サンプル（７０６）の移送の割合として示されている。

【0027】

図７は、吐出電力に基づいて様々なＤＮＡ溶液の移送成功率を決定するための経験的アプローチを示している。成功した移送は、液滴が音響的に吐出されて、目的のプレート（または図５および図６のように目的のプレートに取り付けられた水感応性紙）に到達したときと定義される。成功した移送は、ＭＩＰ溶液に追加された電力の関数としてプロットされる。ＭＩＰ特徴はオンであり、この実施形態では、サンプル充填高さの変化を説明するために使用される。すべての移送は、固定シグネチャまたは１．４８ＭＲａｙｌのインピーダンス値を使用して実施される。

【0028】

理想的には、生物学的アッセイおよびワークフローにおいて、天然ｇＤＮＡが、開始入力材料として使用される。典型的には、天然ｇＤＮＡはその後、下流用途のために操作または調製される。例えば、天然ｇＤＮＡは、次世代配列決定（ＮＧＳ）用途のために短いセグメントに断片化され得る。最新鋭のＡＤＥ技術は、ニュートンの挙動からの偏差が、予測されたより高い電力が印加されたときにリザーバからの堅牢な液滴離脱をもたらすであろうマウンドを単に形成することから、吐出電力の正確な予測を可能にするのに十分低いため、最大１００ｎｇ／μＬの濃度で２０キロベース（Ｋｂ）以下の天然ｇＤＮＡ断片を再現性よく、正確かつ精密に移送することができる。（天然ｇＤＮＡ断片の平均長さとして測定されるような）サイズおよび天然ｇＤＮＡの濃度の両方が、再現可能なＡＤＥに影響を与える能力を有する既知のパラメータであり、どちらも、個別におよび組み合わせてニュートンの挙動からの偏差に寄与する。様々な天然ｇＤＮＡサンプルに関する研究の結果は、図８に表示されている。図８Ａは、２０Ｋｂ未満の天然ｇＤＮＡを、音響的に再現可能、正確かつ精密に移送することができる（トーンバーストおよび吐出エネルギーに対するニュートンパラメータを利用する）ことを示している。さらに、ニュートンパラメータを用いて、最大１００ｎｇ／μＬまでの低濃度を正常に移送した。図８Ｂは、非ニュートンパラメータを用いて、より大きなサイズ（最大１５０Ｋｂ）の天然ｇＤＮＡ、およびより高い濃度（最大２００ｎｇ／μＬ）の天然ｇＤＮＡの両方を、再現可能、正確、かつ精密に移送することができ、天然ｇＤＮＡサイズおよびｇＤＮＡ濃度の二次元空間のエンベロープを本質的に広げ、ＡＤＥを介して音響的にアクセスすることができることを示している。

【0029】

図８Ａおよび図８Ｂは、ｇＤＮＡ濃度対断片長を示す散布図である。失敗（８０２）、部分的（８０４）、および成功した（８０６）移送を、電力不足状態およびニュートントーンバースト電力で取得した。成功した移送（８０８）を、高電力状態で、非ニュートントーンバーストを使用して均一に取得した。音響移送を、ｑＰＣＲによって測定する（さらなる分析が後に続く）。この図は、断片サイズおよび天然ｇＤＮＡ濃度の二次元空間におけるより大きなエンベロープを示すのに役立つ。

【0030】

本明細書に記載される方法は、２０Ｋｂ超の断片サイズおよび１００ｎｇ／μＬ超のバルク濃度を有する天然ｇＤＮＡの、音響的に適格な管からの高度に再現可能、高度に正確、かつ高度に精密な移送を可能にする（しかしまた、マイクロプレート、リザーバ、または類似のもので音響的に適格なウェルから実施され得る）。このような小さな体積（２．５ｎＬ）で、１つの容器から別の容器への物理的接触なしに、高度に濃縮された天然ｇＤＮＡの長い断片を移送することにより、プロセスを最小化するための臨床用途（診断）のための画期的な能力を可能にし、ユーザは、交差汚染または移送装置への結合または試薬の恐れなく、より少ない量でより多くのことをすることができる。これらの方法は、新しいアッセイの開発および小型化のためのワークフローを容易にし、研究および臨床実験室への機会を開くことができる。音響管および他のリザーバを利用して、ｇＤＮＡを移送することにより、作業範囲を実質的に１５０Ｋｂ以上に、さらに７５０ｎｇ／μＬ以上に増加させることができる。

【0031】

ｇＤＮＡの移送を定量的に評価するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を利用して、その後、ハウスキーピング遺伝子ベータアクチンβアクチンの発現を確認および検出した。ｑＰＣＲアッセイは、以下を使用して実施された。β－アクチンフォワードプライマー：ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＧＴ ＴＧＣ ＴＡＴ ＣＣ；β－アクチンリバースプライマー：ＣＧＴ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＡＡ Ｔ，（ＩＤＴ）。アッセイは、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）システム、またはＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムのいずれかを使用して実施した。Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）システムは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ ３８４（Ｒｏｃｈｅ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＩＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を利用した。ｑＰＣＲプログラムを、以下のように使用した：ステップ１、９５℃で６０秒、ステップ２、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒、単回収集（４５サイクル）、ステップ３、９５℃で１０秒、６０℃で６０秒、および９７℃で連続的。ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムは、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標） ＳＹＢＲ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ３８４－Ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｌａｔｅを利用した。ｑＰＣＲプログラムを以下のように使用した：ステップ１、５０℃で２分間、９５℃で２分間、ステップ２、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、収集（４０サイクル）、ステップ３、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、および９５℃で１５秒間。

【0032】

断片化ｇＤＮＡのＡＤＥに対するニュートンキャリブレーションを使用してデータを制御し、ハンドピペット式断片化ｇＤＮＡと比較する。
ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）から商業的に取得したヒト天然ｇＤＮＡ（５６Ｋｂ）を、超音波発生装置（コーヴァリス超音波発生装置技術）を使用して（８Ｋｂに）せん断することによって断片し、手動で音響的に適格な管にピペッティングした。最も高い濃度として１００ｎｇ／μＬで始まる８Ｋｂ断片を使用して、８点の２倍標準曲線を作成した。各標準曲線点について、３２個の技術的複製を移送し、以下に記載されるようにｑＰＣＲによりアッセイした：

【表2】

【0033】

各標準曲線点について、３２個の複製すべてを移送した。実験結果を表にし、表２に示された値を構成する。ＤＮＡの各濃度について、平均交点（Ｃｐ）値、Ｃｐの標準偏差、Ｃｐの％ＣＶ、最小および最大Ｃｐ、ならびに複製数を決定した。これらの結果は、ニュートンパラメータを有する音響移送プロセスの（小さなサイズの断片化されたｇＤＮＡの）期待変動と、ハンドピペッティングされた対照実験能力との比較を示す、対照実験のセットとしての役割を果たす。

【0034】

図９は、標準的なＡＤＥ技術を利用する移送に対する≧０．９９のＲ^２値および、同じ断片化されたｇＤＮＡサンプルの手動ピペット移送に対する約０．９８のＲ^２値により強調される、高度の線形性を示す、移送を使用して生成された標準曲線のプロットである。具体的には、図９は、せん断された８ＫｂのＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）サンプル（Ｎ＝３２）のすべての技術的複製物に対するＣｐ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］を示している。パーセントＣＶとして示されるＡＤＥ移送精度は、２％未満であった。この実験セットは、「期待される」結果品質のベースラインとしての役割を果たす。ハンドピペッティング制御の結果は、ＡＤＥ結果よりも低い線形性を有するが、それでも許容されることに留意されたい。

【0035】

市販のソースからの未処理であり、未断片化であり、無傷の天然ｇＤＮＡを使用し、非ニュートンキャリブレーションを利用する実験データ。
次のステップは、それぞれ４０Ｋｂおよび５６Ｋｂの断片サイズである、２つの市販のソースであるＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）およびＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）からの天然ｇＤＮＡを利用して、非ニュートン粘弾性流体について新たに決定されたパラメータ空間（トーンバーストおよび吐出エネルギーレジーム）を試験することであった。これらのサンプルを、本明細書に記載の技術に従って、移送のための調製のために音響的に適格な管に手動でピペッティングした。これらのサンプルを分析して、ＡＡＴＩ断片アナライザー（ＡＡＴＩ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）を使用して断片サイズを決定および確認した。実験結果は、図１０に示されており、サンプルが実際に４１Ｋｂおよび５６Ｋｂの長さであることを強調している。次に、非ニュートントーンバーストおよびより高いエネルギーキャリブレーションを、天然ｇＤＮＡ（非添加）上のＥｃｈｏ５５０液体ハンドラーを用いてＡＤＥ移送に適用した。ソース管中の各天然ｇＤＮＡサンプルの濃度は、２００ｎｇ／μＬであった（ＮａｎｏＤｒｏｐ機器（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ）でも確認し、結果は示さず）。移送量は、ｑＰＣＲアッセイのためのソースプレートとしても役立つ目的地プレートに、２．５ｎＬ～３２０ｎＬ（１液滴最大１２８液滴まで）の範囲であった。各生物学的サンプルの再現可能性、正確性、および精密度に対処するために、（統計的有意性を示すために）各実験条件で３２個の技術的複製を移送した。さらに、結果の有効性を確認するために、これらの実験を複数日に繰り返した。表３、図１１、および図１２は、Ｃｐ値を示し、非ニュートン流体に対するこの新しいキャリブレーションを使用した、高い再現可能性、高い正確性、および高い精密度の移送能力の有効性を強調している。すべての移送について、移送された複製数は、移送量は５ｎＬであるＰＲＯＭＥＧＡの１日目および２日目および移送量は２．５ｎＬであるＰＲＯＭＥＧＡの２日目を除いて３２であった。他のすべてのサンプルについては、３２個の複製すべてを移送した。移送すべてを使用して生成された標準曲線の線形性は、≧０．９９のＲ^２値を有する。すべての移送に対するパーセントＣＶは、５％未満であった（およびほとんどの場合＜３％）。

【0036】

図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）（４０Ｋｂ）サンプル（図１０Ａ、チャート１００２）、およびＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）（５６Ｋｂ）ｇＤＮＡサンプル（図１０Ｂ、チャート１００４）のＡＡＴＩ断片アナライザートレースが、サンプルが実際に商業ベンダーによって示されるサイズであったことを強調していることを示す。これらのサンプルのｑＰＣＲ Ｃｐデータを、以下の表３に示している。

【表3-1】

【表3-2】

【0037】

図１１は、天然ｇＤＮＡの生物学的および技術的複製について、Ｃｐ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］によって測定されたものとしてのｑＰＣＲデータを示しており（Ｎ＝２６～３２）、図１２は、表３に記載されるすべての生物学的および技術的複製について、Ｃｐ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］のパーセントＣＶを示している。高線形性は、図１１のＲ^２値＞０．９９によって示される。さらに、高い精密度および再現可能性は、図１２の実験ランの各濃度における複製の低ＣＶ値によって示される。

【0038】

非ニュートンキャリブレーションを使用した、未処理であり、未断片化であり、無傷のヒトサンプル由来の天然ｇＤＮＡを使用した実験データ
すべて１５ｋＫｂ超の断片サイズを有し、約１５０Ｋｂの最大断片集団を有する、全血から抽出された６つのヒトサンプル由来の天然ｇＤＮＡを、次に音響的に適格である管から移送した（図１３）。ソース管中の各天然ｇＤＮＡサンプルの濃度を、１００ｎｇ／μＬ～１７５ｎｇ／μＬであると決定した（ＮａｎｏＤｒｏｐで確認した結果は表示せず）。移送ボリュームは、反応を装填するためのｑＰＣＲソースウェルへの１液滴（２．５ｎＬ）～１２８液滴（３２０ｎＬ）の範囲であった。精密度に対処するために、各生物学的サンプルについて、１０個の技術的複製を各条件ごとに移送した。ｇＤＮＡサンプルの量が制限されていることを考えると、実験は１回のみ実施されたが、違いはないと予想される。表４、図１４、および図１５は、Ｃｐ値を示しており、ヒト天然ｇＤＮＡサンプルの移送の高精密度、高正確性、および高い再現可能性を再び強調している。すべてのサンプルについて、１０個の複製すべてを、脱落なく、１００％の成功率で移送した（脱落率０％）。移送すべてを使用して生成された標準曲線の線形性は、０．９９９のＲ^２値を有する。すべての移送に対するＣｐのパーセントＣＶは、＜２．５％であった。

【表4-1】

【表4-2】

【0039】

図１３は、大きな断片サイズを示すヒトｇＤＮＡサンプルのＡＡＴＩ断片アナライザートレース１３００を示している。ｇＤＮＡサイズを図１３で評価し、サンプルについて大きな断片サイズであることを確認した。図１４は、表４に記載されるようなすべての生物学的および技術的複製について、Ｃｐ対Ｌｏｇ［ＤＮＡ］データ１４００によって測定されたものとしてのｑＰＣＲデータを示している。移送結果は、ヒトｇＤＮＡの６つの異なるサンプルについて、Ｒ^２値＞０．９９で、高度に再現可能性のある移送および高度に線形の移送を示している。図１５は、表４に記載されるように、すべてのヒトサンプルに対する生物学的および技術的複製についてのＣｐ対ｌｏｇ［ＤＮＡ］データ１５００のパーセントＣＶを示している。生物学的および技術的複製のすべての移送に対するＣｐ’ｓのＣＶは、３．２％以下であった。

【0040】

移送前後の分析
ゲノムＤＮＡサンプルの完全性は、多くの生物学的用途、ワークフロー、特にｇＤＮＡストアやリポジトリにとって重要な懸念事項である。セクションで強調されたデータは、ＡＤＥによって新しいトーンバーストおよび音響エネルギー範囲とともに移送された天然ｇＤＮＡ、ならびに移送されたｇＤＮＡが、その後、ｑＰＣＲアッセイで成功裏に増幅され、品質が評価され得ることを確認するものである。移送された天然ｇＤＮＡの特性をさらに評価するために、移送後のサンプルを分析して、ＡＡＴＩ断片アナライザー（ＡＡＴＩ）を使用して断片サイズを決定および確認し、天然ｇＤＮＡは、（最小限のせん断で）その完全性を保持していた。図１６Ａ～図１６Ｆ、および表５はすべて、ＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）およびＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）ならびにヒトサンプルから商業的に取得されたヒト天然ｇＤＮＡサンプルのＡＡＴＩ断片アナライザートレースを示している。

【0041】

これらのサンプルの各々に対するＡＡＴＩトレースは、ｇＤＮＡサイズの小規模な増強（当該手法の実験誤差内）か、または移送後の状態に対する小規模な下方シフトのうちのいずれかを示し、わずかな量のせん断の可能性を示唆している。しかしながら、すべての場合において、これらのサンプルのうちのいずれかにおける移送後のｇＤＮＡは、２０Ｋｂ超であり、これは、ニュートントーンバーストおよび音響エネルギー移送能力の限界であった。ＡＡＴＩ機器はまた、±２５％のＤＮＡ定量正確度および２０％ＣＶのＤＮＡ定量精密度を有する。ここで提示するデータはすべて、これらの仕様によく合致している。ここで生成されたデータは、大きな断片ｇＤＮＡを表しており、以下の表５に示されており、これは、新規の音響非ニュートンパラメータを利用した移送前および移送後と同じサンプルと比較して、いずれかの手動でピペッティングされた（対照）市販およびヒト天然ｇＤＮＡサンプルの断片サイズ（Ｋｂ）を示している。

【表5-1】

【表5-2】

【0042】

断片特性は、選択された各タイプのｇＤＮＡサンプルに対して手動でピペッティングされた（底部－１６０３ａ～１６０３ｆ）トレース、移送前（中央－１６０２ａ～１６０２ｆ）トレース、および移送後（上部－１６０１ａ～１６０１ｆ）トレースについて、ＡＡＴＩ断片アナライザートレース（図１６Ａ～図１６Ｆ）で示されている。図１６Ａは、ＢＩＯＬＩＮＥ ｇＤＮＡサンプルのトレースを示している。図１６Ｂは、ＰＲＯＭＥＧＡ ｇＤＮＡサンプルのトレースを示しており、図１６Ｃ～図１６Ｆは、ヒト天然ｇＤＮＡサンプルのサンプル１（図１６Ｃ）、サンプル２（図１６Ｄ）、サンプル３（図１６Ｅ）、およびサンプル４（図１６Ｆ）の各々のトレースを示している。

【0043】

メルト曲線分析
ｑＰＣＲ反応の成功は、ＤＮＡ増幅だけでなく、メルト曲線分析にも基づいている。ｑＰＣＲ反応中、アンプリコンが生成されると、蛍光ＳＹＢＲ緑色染料が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合し、これらの複合体は、蛍光を発し、蛍光信号および特性増幅曲線を生成する。増幅曲線は、開始フェーズ、指数フェーズ、およびプラトーフェーズの３つのフェーズから構成される。開始フェーズは、ほぼ常に蛍光検出レベルを下回っている。指数フェーズでは、新たに合成されたｄｓＤＮＡのコピーが作製され、したがって、ＳＹＢＲ染料がｄｓＤＮＡに結合するにつれて、蛍光の増加によって表される。最後に、プラトーフェーズは、反応の終了を示し、安定化フェーズとも呼ばれる。

【0044】

各特定のアンプリコンは、特徴的な増幅曲線を有する。増幅が発生すると、ｑＰＣＲサイクルの数が記録され、その結果、指数段階において、サイクル閾値（Ｃｔ）または交点閾値（Ｃｐ）と呼ばれる閾値が利用されて、増幅が発生するレベルが評価される（図１７、プロット１７０２を参照）。増幅曲線は、サイクル閾値（Ｃｔ）またはサイクル数としても知られる、交点（Ｃｐ）の関数としてプロットされる。サイクル数（ＣｔまたはＣｐ）が小さいほど、ＤＮＡの初期量が高くなる。サイクル数（ＣｔまたはＣｐ）が多いほど、初期ＤＮＡの量が少なくなるため、１サイクル当たりのＤＮＡの濃度が増加するにつれて、より多くのサイクルが必要となる。ｑＰＣＲ反応の特異性を確実にするために、メルト曲線分析も行い、アンプリコンがｄｓＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に解離する温度を測定した。増幅後、二本鎖のＳＹＢＲ緑色結合アンプリコンを、温度の漸増的上昇に曝露した（プロット１７０４）。温度がプライマーの融解温度を超えると、アンプリコンが、解離し、ＳＹＢＲ緑色蛍光信号が減少する。次に、この曲線の傾きを温度の関数としてプロットし、当分野のほとんどの研究者が使用した分析であるメルト曲線を生成する（図１７、プロット１７０６）。

【0045】

ここで説明するすべての研究において、β－アクチンアンプリコンは、２６６塩基対（ｂｐ）であり、８８±１℃で融解ピーク温度を有する。１００～０．７８ｎｇ／μＬの範囲のポジティブコントロール８ポイント２倍希釈標準曲線は、それぞれ２０～３２の範囲のアンプリコンＣｐ／Ｃｔを示した。

【0046】

本明細書に記載される技術は、様々なサンプルタイプおよびサンプル移送プロトコルに適用され得る。例えば、多くの研究および臨床ラボでは、ゲノムデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）は、細菌、ウイルス、植物、全血（ＷＢ）および構成要素（血漿、血清）、組織、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、細胞、唾液（－バッカル）、尿、ならびに脳脊髄液（ＣＳＦ）を含むがこれらに限定されない、新鮮なサンプルおよびアーカイブサンプルの両方から抽出される。

【0047】

本明細書に記載される技術は、無傷の天然ｇＤＮＡが下流用途のための液体ハンドラーによって処理されることが望ましい、高いサンプルの完全性（例えば、バイオストアまたはリポジトリからのサンプル）を必要とする任意のＤＮＡ技術用途で有用である。ＤＮＡは生命の基礎をなす構成要素であるため、用途は、広範囲に及び、臨床／診断用途、医学研究、医療療法、医薬品／バイオテクノロジー研究用途、農業用途、および法医学において使用され得る。

【0048】

本発明のいくつかの実施形態は、粘弾性ポリマー溶融物およびＡＤＥが以前にはアクセスできなかったポリマー溶液の、再現可能性が高く、高正確性かつ高精密度の音響液滴吐出を可能にする。過去に、ポリマー溶融物またはポリマー溶液サンプルを溶媒で加熱および希釈するなどの粘度を低減し、弾性を低減する方法論は、わずかなレベルの成功を示し、天然サンプルを変化させ、サンプルを（熱不活性化または溶媒駆動分解を介して）潜在的に損なうことを伴っていた。本発明のいくつかの実施形態は、フォトレジストの堆積またはポリマーサンプルおよびポリマー溶融物の調査を小型化する能力などの半導体用途に対処する能力を有する。さらに、薬物送達アプリケーションはまた、高用量の「時間放出型」薬物をポリマー溶液にドープし、それをレシーバーに移送して、最も効率的に薬剤を送達するために、表面積対体積比が最も高い一分散球の形態の超分散型「装填型」薬物送達剤を作成することができるため有効である。

【0049】

図１８は、せん断薄化挙動を示す非ニュートン液体の液滴形成の時間進化を示している。流体は、ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）由来のｇＤＮＡを含む。同様の粘度を有するニュートン流体と比較して、液滴の放出前に必要とされる長いフィラメント形成および長い時間スケールに留意されたい。本開示は、フィラメントの頭部が、これらの液滴のボリュームが一定であることを意味する頑強な様式で液滴に分解することを可能にし、フィラメントは、さらに分解することなく（鎖上のビーズが再現可能に収縮する状態で）、リザーバに戻る。これは、２．５ｎＬの低下（より高い周波数、より短い波長）を生成する、我々のＥｃｈｏ５５０およびＥｃｈ ５５５機器での変換器を使用して実施された。ここでの液滴サイズは、およそ２．５ｎＬと推定される。これらの方法は、任意の好適な非ニュートン流体、特に、水またはＴＥなどであるがこれに限定されない、標準的な核酸溶出緩衝液に適用され得る。

【0050】

図１８に示すように、流体表面１８０２に音響エネルギーを適用すると、先導突出部１８０６およびフィラメント１８０８へとさらに発達するマウンド１８０４を生成することによって液滴吐出が誘導される。ＡＤＥの既存の方法では、音響エネルギーは、流体表面から流体を強制的に外すスラグの運動量を提供するが、非ニュートン流体については、これらの方法は、流体表面１８０２から容易に分離するか、または再吸収される一過性の突出部を生成する傾向がある。非ニュートン流体の液滴を吐出するための本明細書に記載の実施形態によると、初期トーンバーストは、流体表面１８０２から隆起した流体の大部分を含有する細長いフィラメント１８０８を生成する。一部の非ニュートン流体はまた、細長いフィラメント１８０８に引き込まれたときに、１個、２個、５個、１０個、またはそれ以上のビーズからなり得る、フィラメントに沿った流体の一連の蓄積またはビーズ１８１０を生成し、ここで、ビーズのサイズは、伸張フェーズの間に、得られた液滴の５０％、７５％、または９０％未満のフィラメント直径よりも１０、２０％、または５０％厚くなり得る。従来のＡＤＥ方法が、ニュートン流体に対して低い、または標準的な吐出振幅で非ニュートン流体に適用される場合、フィラメント１８０８の有効弾性は、液滴吐出を防止する傾向にある。逆に、従来のＡＤＥ法が非常に高い振幅で適用される場合、フィラメント１８０８は、ビーズ１８１０の間で破壊する傾向があり、複数のより小さな液滴の予測不可能な吐出を引き起こす。この効果は、液滴吐出ボリュームの制御の喪失のために望ましくないだけでなく、細長いフィラメント１８０８の突然の分離が、ＤＮＡまたは流体の他の内容物をせん断し得るため、望ましくない。対照的に、本明細書に記載の方法は、細長いフィラメント１８１０の液滴１８１２と残りの部分１８１４との間のきれいな分離を提供する。いくつかの実施形態では、液滴１８１２の分離は、フィラメント１８１０が液滴直径と比較して非常に長いときに発生し得る。分離は、いくつかの実施形態では、吐出された液滴の直径の２倍以上のフィラメント長、５倍以上のフィラメント長、または１０倍以上のフィラメント長、または２０倍以上のフィラメント長、または５０倍以上のフィラメント長、１００倍以上のフィラメント長について生じ得る。いくつかの実施形態では、フィラメントの収縮中、ビーズは互いに結合するか、または合体して、退縮する残りの１８１４に入る場合があるため、ビーズの数は減少し、半月板に向かって退縮するにつれて、併合されたビーズのサイズが増大する。いくつかの実施形態では、液滴１８１２のボリュームは、分離時にフィラメント１８１０内に含まれるボリュームよりも著しく小さくてもよく、例えば、流体フィラメント１８１０の長さの１０％未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、吐出された液滴１８１２に含まれるボリュームは、残りの部分１８１４のボリュームの５０％未満、１０％未満、または５％未満であってもよい。

【0051】

図１９は、異なるＤＮＡ溶液および異なるサイズスケールの液滴形成の時間進化を示す概略図１９００である。ここで、流体は、ＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）からのものであり、移送は、公称液滴サイズを２５ｎＬにするＥｃｈｏ５２５機器（Ｅｃｈｏ５５０またはＥｃｈｏ５５５機器よりも低い周波数およびより大きな波長）で実施された。図１９に示すように、流体表面１９０２に音響エネルギーを適用すると、先導突出部１９０６およびフィラメント１９０８へとさらに発達するマウンド１９０４を作成することによって液滴吐出が実行される。初期トーンバーストは、流体表面１９０２から隆起した流体の大部分を含む細長いフィラメント１９０８を生成する。追加のトーンバーストに応答して、細長いフィラメント１９１０の液滴１９１２および残りの部分１９１４は、小さな液滴を放射することなく互いに分離する。いくつかの実施形態では、液滴１９１２は、フィラメント１９１０よりも著しく小さくてもよく、例えば、流体フィラメント１９１０の長さの１０％未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、吐出された液滴１９１２に含まれるボリュームは、残りの部分１９１４のボリュームの５０％未満、１０％未満、または５％未満であってもよい。

【0052】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるようなトーンバーストは、３つのセグメントを含む。１つの実施形態では、非ニュートン流体の２．５ｎＬの液滴を作製するために、セグメント１は、最長かつ高強度であり、その後に、音響エネルギーが生成されない短いセグメント２、次いで中間持続時間（ここでは、１８マイクロ秒）の最終セグメント（３）が続く。様々なセグメントの電力強度および長さの調整を通して、液滴吐出を達成することができることに留意されたい。トーンバーストＡおよびトーンバーストＢの両方の電力レベルは、図２０および図２１に示すように、フィラメントをリザーバに戻す（小型サテライトの生成を回避する）堅牢なボリューム移送および再現可能な収縮を達成するために、ニュートン流体の電力レベルよりもはるかに高い電力レベルを必要とする。トーンバースト特性を、以下の表６に列挙する。

【表6】

【0053】

図２０は、トーンバーストＡ（２００２）およびトーンバーストＢ（２００４）について、（左から右に増加するｄＢで示す）様々な音響電力レベルでこれらのトーンバーストで移送された同じ非ニュートン流体の液滴を示している。低レベルの液滴は、フィラメントから放出しない。高レベルでは、液滴のみが移送し、良好な配置（それぞれ８ｄＢおよび１０ｄＢ）を有する。より高いレベルでは、移送品質は、低下し、フィラメントは、単一の所望の液滴よりも分解する。任意の補助液滴またはサテライトは、望ましくない。トーンバーストおよび電力の好ましい実装形態は、図１８および図１９のアウトラインに示されるように、所望のボリュームの単一の液滴を形成し、フィラメントがリザーバ内に収縮するものの１つである。

【0054】

図２１はまた、吐出ボリュームを吐出出力と比較する、チャート２１００の音響電力の増加とともに移送ボリュームがどのように変化するかを示している。いくつかの実施形態では、ボリューム対電力曲線のより低い勾配が望ましく（例えば、トーンバーストＡ ２１０２対トーンバーストＢ ２１０４のボリューム対電力曲線を参照）、これは、移送液滴ボリュームでの電力に対する感度を減少させる。各セグメントのトーンバーストの相対振幅、持続時間、周波数含量の調整は、液滴ボリューム特性の感度特性を改善するために修正され得る。図２２は、様々な吐出電力および電力感度に相関したそれらの関連するボリュームで、大きな（２２０２）液滴および小さな液滴（２２０４）の両方について、ＢＩＯＬＩＮＥ（登録商標）流体について移送された測定されたボリュームの散布図２２００を示している。

【0055】

図２３～図２４は、非ニュートンの挙動がアニオン性ではなく、ＤＮＡなどのヌクレオチドポリマーによるものではない流体に適用される、本発明の他の特定の実施形態を示している。１つの例は、せん断薄化流体（図２３、画像２３００）と呼ばれる別の非ニュートン流体クラス用であり、他方は、せん断増粘流体用である（図２４、画像２４００）。画像２３００（図２３）は、アミノ酸リジン溶液、水中で２５％のポリ－ｌ－リジン溶液（％ボリューム）からなるカチオン性ホモポリマーに対する成功した液滴を示しており、これはせん断薄化である。画像２４００（図２４）は、せん断増粘性またはコロイド懸濁液からなるダイラタント流体である、水中で５％のトウモロコシデンプン溶液（％ボリューム）に対する液滴移送の成功を示している。各流体タイプに対して機能する電力ウィンドウの存在は、２３０２および２４０２によって明確に示される。しかしながら、多くの他のタイプの流体、溶質のクラスおよび非ニュートン分類は、本明細書に記載される方法に従ってＡＤＥによって処理され得る。例えば、本開示の方法を使用して移送され得る好適な非ニュートン流体としては、限定されるものではないが、カチオン性、アニオン性、ヌクレオシド、およびペプチジン溶液、懸濁液、コロイド、ダイラタント、および他の流体が含まれる。

【0056】

図２５～図２８は、いくつかの異なるウェルから移送され、ｑＰＣＲによって測定されるＤＮＡを定量することによって、方法の頑健性を示す、さらに別のＤＮＡ含有流体のデータを示している。試験プレートのレイアウトマップを図２５に示し、それは、高音響周波数および低音響周波数の両方を使用して、ＤＮＡ溶液の濃度の範囲および各ウェルで収集される液滴の様々な数に対して、それぞれ小液滴および大液滴を作製する。図２６および図２７は、応答が一部の電力レベルに対して非常に反復可能であり、線形であることを示しており、図２６は、小さな液滴に対するＣｔデータ２６００を示しており、図２７は、大きな液滴に対するＣｔデータ２７００を示している。吐出トーンバースト振幅は、０．５ｄＢ刻みで約６ｄＢ（２６０１、２７０１）～約１１ｄＢ（２６０２、２７０２）の範囲であった。Ｙ軸は、Ｃｔであり、それは、ＤＮＡを特定の閾値レベルに増幅するために必要なｑＰＣＲ機器のサイクル数である。したがって、より低いＣｔは、より初期段階での開始ＤＮＡ濃度に相当する。開始濃度および液滴カウントに対する期待勾配で線形性を達成するための電力レベルは、図２８の表で強調表示されている。小さな液滴サイズ２８０２および大きな液滴サイズ２８０４の両方については、反復可能であり、線形的であり、結果は、大きなｇＤＮＡ（６８Ｋｂ）および高いｇＤＮＡ濃度（１０５ｎｇ／Ｌ）であっても、広範囲の電力レベルにわたって達成可能である。

【0057】

図２９～図３１は、液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための例示的なプロセスを示している。プロセス２９００、３０００、３１００、および３２００、ならびに本明細書に記載される任意の他のプロセスは、本明細書に記載されるような任意の好適な音響液滴吐出システムによって実施され得る。

【0058】

図２９は、動的マウンド分析（ＤＭＡ）技術に従って、液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための第１の例示的なプロセス２９００を示しており、それによって、少なくともいくつかの実施形態による、トーンバースト電力が徐々に増加する。最初に、未知の非ニュートン流体を含有するリザーバを、音響放出デバイスに挿入することができる（２９０２）。トーンバースト電力が、増加されて（２９０４）、その後、リザーバ内の流体に適用される（２９０６）。少なくとも１つ、多くの場合、多くのエコー信号が収集され、各トーンバースト電力で分析される（アクト２９０８）。これらのプロセスは、可能な最大電力に達するまで、ｄｏループで繰り返される（２９１０）。最大電力に達すると、システムは、各トーンバースト設定（例えば、トーンバーストパターンおよび各トーンバーストの長さ、トーンバースト振幅、トーンバースト周波数、および周波数パターンなど）についてエコー信号（２９１２）の信号特徴を抽出する。最適な信号シグネチャは、事前訓練された人工知能または機械学習モデルを使用して選択される（２９１４）。このモデルは、収集されたエコー信号に基づいて抽出された信号特徴を、既知のトーンバースト電力設定に相関させる。モデルは、時間とともに変化するエコー信号または光信号のトレンドを探す。信号特徴は、連続する時間遅延の間、増加、減少、または一定に保たれ得る。モデルを訓練するためには、少なくとも１つのエコー信号が必要である。次いで、システムは、上述の方法に従って光学信号シグネチャを選択し（２９１６）、その後、後続する液滴を吐出するための信号特徴および信号シグネチャを選択することができる。

【0059】

図３０は、またＤＭＡに従って、液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための第２の例示的なプロセス３０００を示しており、それによって、トーンバースト電力が徐々に増加する。上述のように、未知の非ニュートン流体を含有するリザーバを、音響放出装置に挿入することができる（３００２）。トーンバースト電力が、増加されて（３００４）、その後、リザーバ内の流体に適用される（３００６）。エコー信号が収集され、連続的な電力ステップで分析されて（３００８）、良好な信号が受信されたときを決定し（３０１０）、ここで、信号品質は、例えば、十分な電力、戻り信号の明瞭さ、または他のパラメータなどの１つ以上の信号パラメータに基づいている。この比較には、信号品質の特徴を所定の閾値と比較することが含まれ得る。良好なエコー信号が受信されると、システムは、上述のように信号特徴を抽出し（３０１２）、次いで、標的／溶媒濃度に対処するために、信号特徴をモデルに供給することができる（３０１４）。モデルは、取得された信号特徴に基づいて、標的／溶媒濃度が低いか、または高いかどうかの決定を出力する（３０１６）。低濃度の場合、システムは、溶液に対して最適な信号シグネチャを選択し（３０２４）、次いで、上述のように、後続の液滴を吐出する（３０２２）ための信号特徴およびシグネチャを選択することができる。高濃度の場合、システムは、最適なセグメント長さ（すなわち、トーンバーストパターンのトーンバースト長さ）を調べ（３０１８）、その後、信号特徴および後続の液滴吐出のための調整されたシグネチャを選択する前に、トーンバースト属性を調整する（３０２０）、追加の介在ステップを取ることができる。

【0060】

図３１は、動的離脱分析（ＤＢＡ）に従って、液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための第３の例示的なプロセス３１００を示している。上述のように、未知の非ニュートン流体を含有するリザーバを、音響放出装置に挿入することができる（３１０２）。トーンバーストは、ＡＤＥシステムによって流体中に放射され（３１０４）、これはエコーをリッスンし（３１０６）、周波数フィルタがエコー信号に適用されて（３１０８）、液滴が脱離されたかどうかを検出する（３１１０）。再生は、各トーンバーストの反復の間に少なくとも１回、多くの場合複数回行われる。液滴が脱離されていない場合、システムは、吐出電力を増加させ（３１１２）、調整された吐出電力で別のトーンバーストを放射することによってプロセスを繰り返す。失敗または成功した液滴離脱は、トーンバーストの各変調の間に光学的に観察することができる。液滴脱離が検出されると、システムは、最後に成功した液滴吐出電力および所望のパラメータの「ロックイン」に基づいて、後続の液滴の吐出パラメータを設定することができる（３１１４）。

【0061】

図３２は、またＤＢＡによる、液滴吐出パラメータを設定し、非ニュートン流体の液滴を吐出するための第４の例示的なプロセス３２００を示している。上述のように、未知の非ニュートン流体を含有するリザーバを、音響放出デバイスに挿入することができる（３２０２）。トーンバーストは、ＡＤＥシステムによって流体中に放射され（３２０４）、これはエコーをリッスンし（３２０６）、周波数フィルタがエコー信号に適用されて（３２０８）、液滴が脱離したかどうかを検出する（３２１０）。再生は、各トーンバーストの反復の間に少なくとも１回、多くの場合複数回行われる。液滴が脱離されていない場合、システムは、例えば、トーンバーストセグメント長のうちの１つ以上を変更することによって、トーンバーストを変調し（３２１２）、変調されたトーンバーストを使用して、別のトーンバーストを放射することによってプロセスを繰り返す。失敗または成功した液滴離脱は、トーンバーストの各変調の間に光学的に観察することができる。液滴剥離が検出されると、システムは、最後に成功した液滴吐出トーンバースト特性および所望のパラメータの「ロックイン」に基づいて、後続の液滴の吐出パラメータを設定することができる（３２１４）。

【0062】

プロセス２９００、３０００、３１００、３２００のうちのいずれかまたはすべては、互いに、または上記で詳細に説明された技術のうちのいずれかと共同して使用され得る。例えば、システムは、ＤＭＡおよびＤＢＡ技術の両方を使用して、最適化された液滴吐出特性（例えば、トーンバーストセグメント長さ、トーンバースト吐出電力）を決定および記憶し得るか、またはこれらの技術の任意の好適な組み合わせを使用して、液滴吐出パラメータをさらに最適化し得る。

【0063】

本明細書に記載のシステムおよび方法の実施形態はまた、機械学習アルゴリズム（ＭＬＡ）を利用して、正しい動的流体パラメータ情報コンテンツを分類、特徴付け、およびその後に決定して、非ニュートン流体の音響液滴吐出（ＡＤＥ）を可能にするために使用されてもよい。これにより、ＡＤＥを使用して非ニュートン流体のサンプルを、高度に再現可能であり、高度に正確で、高度に精密な様式（溶液中の無傷の天然ゲノムＤＮＡまたは粘弾性ポリマーなど）で移送し、ｑＰＣＲ、蛍光ベースのアッセイ、または変動したサンプル入力のためのＮＧＳなどの標準的な実験室技術を使用して定量化する能力が可能になる。上述の動的マウンド解析（ＤＭＡ）により、音響液滴吐出（ＡＤＥ）技術を利用して、非ニュートン流体（無傷の天然ゲノムＤＮＡ、または溶液中の粘弾性ポリマーなど）のサンプル濃度、断片サイズ、および調製を特徴付けおよび分類する能力が可能になる。また上述の動的離脱分析（ＤＢＡ）は、ＡＤＥ技術を利用して、非ニュートン流体（無傷の天然ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、または溶液中の粘弾性ポリマーなど）の液滴離脱のために、トーンバーストの出力量、振幅、周波数、またはその他の属性を特徴付ける能力を可能にする。追加の方法によって、ｑＰＣＲ、蛍光、ＮＧＳおよび他のゲノム用途などの下流用途のためのＡＤＥを使用した、非ニュートン流体のための動的ボリューム分析（ＤＶＡ）を使用した、液滴ボリュームの再現可能な、正確な、かつ精密な予測が可能となる。

【0064】

上述の３つの分析モード（ＤＭＡ、ＤＢＡ、ＤＶＡ）の各々は、訓練データセットに基づく機械学習と協働して、複数の音響反射を使用して、非ニュートン流体の１）前および２）後の音響液滴吐出の流体パラメータ情報を取得するよう設定する。

【0065】

非ニュートン流体（粘弾性特性を示す）のクラスについては、インピーダンスベースのシグネチャ（および関連する電力閾値）の使用は、音響液滴吐出のための特徴付けまたは分類の成功を可能にしない。サンプル濃度、断片サイズ、または調製方法などのよく理解されたパラメータがあっても、インピーダンス変化は、検出するには広すぎる。溶質（例えば、ｇＤＮＡ）をニュートン緩衝溶液に添加しても、流体のインピーダンスは著しく変化せず、それゆえ、シグネチャの読取りに大きく影響しないが、この添加は、ＡＤＥを可能にするために、有意に異なる電力および代替のトーンバーストパラメータを必要とする非ニュートン流体挙動と呼ばれる粘弾性現象を生じさせる。

【0066】

非ニュートン特性は、流体表面を摂動させる１つ以上のサブ吐出エネルギーバーストを使用して評価され、結果として生じるマウンドから反射された１つ以上の音響信号を収集することができる。例えば、動的マウンド解析（ＤＭＡ）により、音響液滴吐出（ＡＤＥ）技術を利用して、非ニュートン流体（無傷の天然ゲノムＤＮＡ、または溶液中の粘弾性ポリマーなど）のサンプル濃度、断片サイズ、および調製を特徴付けおよび分類する能力が可能になる。

【0067】

様々な実施形態によれば、トーンバーストによって摂動された後、流体表面からの音響反射を分析するモデルを生成し、ＡＤＥイベントを成功または失敗として分類するバイナリスキームを使用することができる。結果は、成功した液滴離脱イベントが発生するまで、トーンバーストを繰り返し調節するように解釈され得る。この方法論は、動的離脱分析（ＤＢＡ）と呼ばれ、これは、非自明信号処理アルゴリズムが、容器、ウェルプレート、またはリザーバにおいて非ニュートン流体を調査する際にヌル空間分析に対して好ましいため、マウンド画像プリント（ＭＩＰ）とは異なる。重要な点として、ＭＩＰ結果は、正しく決定されたＤＢＡ結果よりも６～１１ｄＢ低い電力の液滴離脱イベントの成功を予測する。

【0068】

成功したＡＤＥイベントから生じる液滴ボリュームを分析する代替モデルを生成することができる。モデルは、液滴吐出イベントの前、その最中、およびその後に、流体表面からの音響反射について訓練され、処理される。この動的ボリューム解析（ＤＶＡ）は、任意のトーンバーストを使用して作成された、非ニュートン流体（例えば、異なる濃度、断片サイズ、および調製を有するＤＮＡ）の任意の液滴の正確な液滴ボリューム予測を実現する。

【0069】

ヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルは、非ニュートン流体の代用として利用される。ｇＤＮＡサンプルは、濃度、断片サイズ、ならびに調製において異なり得、これらの因子は、パラメータ化が困難である。そのため、機械学習アルゴリズム（ＭＬＡ）に組み込まれた訓練セットを利用して、高度に再現可能性があり、高度に正確であり、かつ高度に精密であるＡＤＥを可能にすることができる。

【0070】

図３３～図３５は、非ニュートン流体を特徴付けし、音響液滴吐出に好適なトーンバーストパラメータを決定し、非ニュートン流体の吐出液滴の液滴ボリュームを特徴付けするための、データ収集および処理のための例示的なプロセスを示している。プロセス３３００、３４００、３５００、および本明細書に記載される任意の他のプロセスは、本明細書に記載されるような任意の好適な音響液滴吐出システムによって実施され得る。

【0071】

動的マウンド分析
図３３は、非ニュートン流体を特徴付け、流体の同一性を固定するために、動的マウンド分析を使用するための例示的なプロセス３３００を示している。様々な実施形態によれば、未知の特性を有する流体は、流体リザーバ内に含まれている（３３０２）。この流体の識別または特徴付けは、動的マウンド解析（ＤＭＡ）を使用して実施される。最初に、一連の音響信号が生成され、流体の表面で集束される（アクト３３０４）。これらの信号は、表面を摂動させるが、バルクからの流体の任意の液滴を離脱することを回避するのに十分なエネルギーを低く保つ。各摂動の後、一連の問い合わせピングまたは問い合わせトーンバーストが放射され、流体の表面に集束され（アクト３３０６）、その後、最大待機時間に達する（３３１０）まで、流体表面から音響反射（またはエコー信号）が収集される（３３０８）。これらの反射の収集が処理されて（３３１２）、流体の非ニュートン挙動が決定される。

【0072】

複数の未知の流体の分析は、相対的であり得、非ニュートン流体パラメータの度合いのランキングである結果を提供することができる。この定性的ランキングは、単純であり、信号収集の検査によって達成される。次に、既知の濃度、断片サイズ、および調製方法のサンプルを使用して訓練および検証される畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を使用して、これらの流体の定量的分類が達成される（３３１４）。これは、ＡＤＥを再現可能性、正確さおよび精密度で実施するために利用される流体分類モデルを生成するための、自明ではない分類に対する一般技術の適用である。データセットは、様々なサブ吐出電力レベルで生成された流体マウンドから収集された反射音響信号からなる。反射された時間ドメイン信号の収集は、フィルタされずに使用して、モデルを訓練することができる。代替的に、モデルを訓練する前に、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を使用して反射の収集を処理してもよい。

【0073】

１５個の固有のサンプルからのＦＦＴ信号に基づいて訓練された１つのＣＮＮモデルによると、９９％のサンプルが正しく特徴付けされ、ＡＤＥによるｇＤＮＡ移送の成功が可能になる。サンプルは、ｇＤＮＡ濃度、断片サイズ、および調製方法の組み合わせに基づいて一意である。これらの固有の特性を以下の表１に要約する。

【表7】

【0074】

動的離脱分析（ＤＢＡ）
図３４は、音響液滴吐出を達成し、トーンバーストパラメータをロックインする、すなわち、非ニュートン流体（ｇＤＮＡなどであるが、これに限定されない）に対するＡＤＥに対して正しいエネルギーレベルを選択するために動的離脱分析（ＤＢＡ）を使用する、例示的なプロセス３４００を示している。様々な実施形態によると、特徴付けされた非ニュートン流体は、流体リザーバ内に含まれている（３４０２）。高エネルギー音響信号、またはトーンバーストは、リザーバ内に含有される流体に集束され、かつ標的とされる（３４０４）。一連の問い合わせトーンバーストを、リザーバ内の流体に適用し（３４０６）、その後、音響反射またはエコー信号が、最大待機時間に達する（３４１０）まで収集される（３４０８）。吐出トーンバーストの成功または失敗は、例えば、液滴の通過のためにリザーバ上の領域を走査するなどの光学的方法、例えば、収集されたエコー信号の分析に基づく音響方法、または他の好適な方法によって確認され得る（３４１０）。

【0075】

各液滴吐出の試みの結果は、成功、失敗、または一貫性がないものとして分類され得る。流体表面の摂動、および液滴離脱または脱離がないことは、失敗した試みとして定義される。一貫性の分類は、断続的に発生する、または一貫性のない液滴ボリュームを生成する液滴離脱イベントを記述しており、これは再現可能性が高くないか、正確度が高いか、精密度が高いものではない。最後に、成功したイベントは、非ニュートン流体の液滴を、再現可能性が高く、正確度が高く、かつ精密度が高いソースリザーバから移送する、液滴離脱イベントとして定義される。トーンバーストエネルギーの反復増加（３４１２）およびＤＢＡ解析は、成功したＡＤＥイベントが発生するまで実施され得る（３４１４）。この時点で、パラメータ（すなわち、トーンバーストパターンおよびエネルギー）は、後続の吐出を実施するために「ロックイン」され得る（３４１６）。トーンバーストイベント後の音響反射が失敗したイベントとして登録される場合、エネルギーレベルを増加させ、後続の音響反射を分析することができる。最適な性能のために、吐出エネルギーは、成功したイベントが「ロックイン」されるまで段階的に増加され得る。

【0076】

動的ボリューム解析（ＤＶＡ）
図３５は、音響液滴吐出によって生成される液滴のボリュームを特徴付け、液滴ボリュームを固定するために、動的ボリューム分析を使用するための例示的なプロセスを示している。様々な実施形態によると、非ニュートン流体は、流体リザーバ内に含まれている（３５０２）。音響液滴吐出は、リザーバ内の流体表面で集束された音響トーンバーストに照準を合わせることによってトリガーされる（３５０４）。動的流体表面は、その後、最大待機時間に達する（３５１０）まで、一連の問い合わせピングを使用してその情報が得られる（３５０６）。次に、音響反射またはエコー信号を分析して、液滴ボリュームを予測し（３５１２）、測定された液滴ボリュームデータと比較して、形成された液滴のボリュームを特徴付けることができる（３５１２）。プロセスは、モデルのパラメータを変化させることによって、液滴ボリュームをロックインする（３５１６）ために反復的に実施され得る。

【0077】

液滴ボリュームを決定する１つの方法は、各音響液滴吐出に対して一連の音響反射を取得することである。未処理の時間ドメイン信号は、Ｈｉｌｂｅｒｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍを介して処理され得、特徴抽出および減衰ノイズを単純化するために、臨界グレースケール値を下回るピクセルの閾値設定およびブランキングによる、必要に応じた、さらなる処理が行われ得る。音響反射画像から抽出され得る主要な特徴としては、例えば、質量の中心（信号振幅の密度および振幅から導出される）、各フィルタリングされた反射の最先端、およびピーク特徴が含まれる。これらの抽出された特徴は、液滴の作成に使用されるトーンバーストの属性と組み合わされ、特徴のセットは、液滴ボリュームを予測するためのモデルを訓練するために使用される。ニューラルネットワークモデルを訓練および検証すると、図９に示すように、高正確度、高精密度、および高再現可能性で液滴ボリュームの特徴付けが生じる。各点には、その特徴的なＤＶＡ信号特徴に関連付けられた既知のまたは予想される液滴ボリュームがある。

【0078】

サンプルの完全性および非バイアス移送を評価するためのゲノム確認
ｇＤＮＡの移送を定量的に評価するための、ｇＤＮＡのＡＤＥに対する非ＤＭＡキャリブレーションおよびＤＭＡを使用した対照実験、ハウスキーピング遺伝子ベータアクチン（～アクチン）の発現を確認および検出するために定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を利用した。ｑＰＣＲアッセイは、以下を使用して実施した。～－アクチンフォワードプライマー：ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＴ Ａ ＣＧＴ ＴＧＣ ＴＡＴ ＣＣ；～－アクチンリバースプライマー：ＣＧＴ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＡＡ Ｔ，（ＩＤＴ）。すべてのプライマーは、１μＭの最終濃度であった。ｑＰＣＲ反応アッセイは、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標） ＳＹＢＲ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘおよびＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ３８４－Ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｌａｔｅを使用したＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムで行った。

【0079】

ｑＰＣＲプログラムを以下のように使用した：ステップ１、５０℃で２分間、９５℃で２分間、ステップ２、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、収集（４０サイクル）、ステップ３、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、および９５℃で１５秒間。ヒト天然ｇＤＮＡを、ＢＩＯＬＩＮＥ（４５Ｋｂ）、ＮＯＶＡＧＥＮ（６８Ｋｂ）、およびＰＲＯＭＥＧＡ（５５Ｋｂ）から取得した。各ベンダーが、異なる調製方法を表し、すべてのサンプルを受け取ったままの状態で使用するか、またはＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液ｐＨ８．０で最終所望の濃度まで希釈して使用した。１、２、４、８、１６、および３２の液滴のｇＤＮＡ溶液を音響的に移送することによって、６点の２倍の標準曲線を作成した。ｇＤＮＡの各濃度について、８回（ｎ＝８）の技術的複製を実施した。

【0080】

比較のために、非ＤＭＡキャリブレーションを使用したｇＤＮＡ溶液の移送に関するｑＰＣＲ結果の対照セットを取得した。非ＤＭＡキャリブレーションのＣＶは、高い分散を示し、多くの点は、５％ＣＶ超を有する。追加的に、１５０ｎｇ／μＬおよび２００ｎｇ／μＬでのＢＩＯＬＩＮＥ、８０および１０５ｎｇ／μＬのＮＯＶＡＧＥＮ、ならびに１００、１５０および２００ｎｇ／μＬのＰＲＯＭＥＧＡについては、Ｒ’２値は、＜０．５１である。これは再現可能性がなく、正確ではなく、精密ではない。追加的に、非ＤＭＡキャリブレーションにより、多くの移送失敗または標的ウェルにおける増幅の不存在が生じた。

【0081】

対照的に、ＤＭＡキャリブレーションを使用して得られた移送は、ｇＤＮＡ溶液を堅牢かつ再現可能に移送した。各調製方法について、ＣＶは、概して＜４％であり、Ｒ／＼２値は、ＢＩＯＬＩＮＥおよびＮＯＶＡＧＥＮについて＞０．９である。１００、１５０、および２００ｎｇ／ｕＬのＰＲＯＭＥＧＡの場合、Ｒ／＼２値は、非ＤＭＡキャリブレーションを使用した＜０．５１と比較して、＞０．８とはるかに高い。

【0082】

蛍光およびｑＰＣＲアッセイを使用した、ＤＶ Ａのボリューム検証
ＤＶＡモデルをまた、ボリュームの正確さおよび精密度の確認のために、蛍光ベースのアッセイを使用して収集された液滴ボリュームデータを使用して訓練した。様々な濃度のｇＤＮＡを有する溶液を、０．０３７５ｍＭのフルオレセインナトリウムで調製した。溶液を、非ニュートンＡＤＥを使用してアッセイプレートに移送した。アッセイプレート（１５３６ＬＤＶ、ＬＡＢＣＹＴＥ）を、クエンチ溶液として１０ｍＭ ＮａＯＨの溶液で予め充填した。０．０３７５ｍＭの溶液のバルク希釈を使用して、アッセイプレートに５μＬをピペッティングして、６点の２倍標準曲線を作製した。これらのプレートを遠心分離（３，０００ｒｐｍ）し、室温で５分間インキュベートし、蛍光読み取り機（ＢＭＧ ＰＨＥＲＡＳＴＡＲ）上で読み取った。

【0083】

ＤＶＡによって予測され、蛍光ベースのアッセイを使用して予測された液滴ボリューム間に相関が生成された。完全な相関は、Ｒ／＼２＝１．０を有する。これらの事例では、様々なトーンバースト周波数を使用して、回帰勾配は、Ｒ＾２値が０．９８を超えて高い相関性を示した。ＤＶＡ性能がまたｑＰＣＲアッセイを使用して首尾よく検証され、Ｒ／＼２値は、０．９５を超えていた。

【0084】

実験データは、未処置であり、未断片化であり、無傷の天然のｇＤＮＡを市販の供給源から使用して取得され、非ニュートンのキャリブレーションを、ＮＧＳ用の機械学習アルゴリズムを用いて利用した。上述の音響パラメータを使用してｇＤＮＡの移送を定量的に評価するために、次に、サンプルの完全性を維持するＤＮＡ配列に対して、優先的な移送（例えば、サイズまたは一本鎖ＤＮＡ対二本鎖ＤＮＡなど）または損傷（例えば、非意図的なｇＤＮＡせん断）が発生していないことを確認するために、次世代ライブラリー調製（ＮＧＰ）および次世代配列決定（ＮＧＳ）を利用した。

【0085】

ＮＧＰにはＮＥＸＴＥＲＡ（商標）ＤＮＡ Ｆｌｅｘ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用し、ＭｉＳｅｑ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ＮＧＳを実施した。ＩｌｌｕｍｉｎａのＢａｓｅＳｐａｃｅ ＦａｓｔＱＣおよびＢＷ Ａ Ａｌｉｇｎｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｏｏｌｓを使用して、データ解析を実施した。ＢＩＯＬＩＮＥおよびＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＳＩＧＭＡ（旧ＮＯＶＡＧＥＮ）から商業的に取得された、高度に濃縮された（＞ｌ００ｎｇ／μＬ）、大きな断片（＞２０Ｋｂ）ｇＤＮＡを、音響的にまたはピペットで、ライブラリー調製のために３８４－目的地プレートに移送した（対照）。合計で１４０ｎｇの各ｇＤＮＡサンプルを、三重の技術的複製で移送した。すべてのライブラリー調製プロトコルを３倍に微細化して、終点ＰＣＲ機器として使用されるように適合されたＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム上で実施された、タグ付け、タグ付け後クリーンアップおよび増幅などのすべてのプロセスを有する３８４ウェルプレートへの音響移送を可能にした。ｇＤＮＡサンプル情報は、以下の表８に示されている。

【表8】

【0086】

ＭＩ ＳＥＱ（登録商標）試薬キットｖ３（１５０サイクル）上でライブラリーを配列決定した。均等な強度が各ヌクレオチドの分析全体にわたって検出され、４つの塩基すべての検出が均一であることを示している。加えて、得られたＱＳｃｏｒｅのヒートマップは、ベース呼び出し正確度が９１．５％を超えることを示し、不正確なベース呼び出しの確率が１，０００分の１であったことを示した。音響移送およびピペット移送のための塩基当たりの配列データ品質は一致し、高品質であり、音響移送およびピペット移送のための塩基当たりの配列含有量が、配列実行の４つの異なる塩基間で差異がないことを示している。

【0087】

以下の表９Ａ～表９Ｄは、複数の技術的複製にわたる両方のｇＤＮＡサンプルの配列決定パラメータを示している。適切に対になった読み取り値は、すべてのサンプルに対して＞９８％であり、読み取り値のメイトの両方が適切な配向にあり、ゲノムとの整列で特定の挿入サイズを有することを示している。すべてのサンプルについて、＞９９％の挿入配列が参照ゲノムと整列され、これは、音響的に移送された、またはピペットの移送から生成されたライブラリーが同等であり、バイアスＡＤＥまたはｇＤＮＡへの損傷が発生していないことを示している。

【表9A】

【表9B-1】

【表9B-2】

【表9C】

【表9D】

【0088】

上で考察される様々な計算方法は、ハードウェア、ソフトウェア、および／もしくはファームウェアを有するコンピュータまたは他のプロセッサと併せて、またはそれらを使用して実施され得る。様々な方法ステップは、モジュールによって実施されてもよく、モジュールは、本明細書に記載される方法ステップを実施するように配置された多種多様なデジタルならびに／またはアナログデータ処理ハードウェアおよび／もしくはソフトウェアのいずれかを含み得る。モジュールは、必要に応じて、関連付けられた適切な機械プログラミングコードを有することによって、これらのステップのうちの１つ以上を実施するように適合されたデータ処理ハードウェアを備え、２つ以上のステップ（または２つ以上のステップの一部）のためのモジュールは、単一のプロセッサボードに統合されるか、または多種多様な統合および／もしくは分散処理アーキテクチャのいずれかにおいて異なるプロセッサボードに分離される。これらの方法およびシステムは、多くの場合、上に記載される方法ステップを実施するための命令を有する機械可読コードを具現化する有形媒体を採用する。好適な有形媒体としては、メモリ（揮発性メモリおよび／もしくは不揮発性メモリを含む）、記憶媒体（フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、テープなどへの磁気記録、ＣＤ、ＣＤ－Ｒ／Ｗ、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤなどの光学メモリ、または任意の他のデジタルもしくはアナログ記憶媒体など）などを挙げることができる。

【0089】

本明細書に示される特色は、例としてであり、本開示の好ましい実施形態の例示的な考察の目的のためだけであり、本発明の様々な実施形態の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解されると考えられる説明を提供する場合に提示されている。この点に関して、本発明の基本的な理解に必要とされるよりも詳細に、本発明の構造の詳細を示すための試みは行われておらず、説明は、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具現化され得るかを当業者に明らかにする図面および／または実施例を用いて行われる。

【0090】

以下の定義および説明は、以下の実施例において明確かつ明白に修正されない限り、または意味の適用により、任意の構成が無意味もしくは本質的に無意味となる場合を除き、任意の将来の構成で制御されることを意味および意図する。用語の構成がそれを無意味または本質的に無意味にする場合、その定義は、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、またはＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）などの当業者に既知の辞書により行われる必要がある。

【0091】

別様に文脈が明確に要求しない限り、説明および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語句は、排他的または網羅的な意味とは反対の包括的な意味、つまり、「含むが、それに限定されない」という意味で解釈されるべきである。単数形または複数形の数を使用する語句はまた、それぞれ複数形および単数形の数を含む。さらに、本出願において使用される場合、「本明細書（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上記」、および「以下」という語句、ならびに同様の趣旨の語句は、本出願の任意の特定部分ではなく、本出願全体を指すものとする。

【0092】

本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または開示される正確な形態に本開示を限定することを意図するものではない。本開示の特定の実施形態および実施例が例示目的で本明細書に記載されているが、様々な同等の修正例が、関連技術の当業者が認識するように、本開示の範囲内において可能である。

【0093】

特許申請書（特許、特許出願、および特許刊行物を含む）、科学雑誌、書籍、論文、技術文献、ならびに本出願で考察される他の刊行物および資料を含むすべての参考文献は、すべての目的に対してそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0094】

本開示のなおもさらなる実施形態を提供するために、必要に応じて、本開示の態様を修正して、上記の参考文献および出願のシステム、機能、および概念を採用することができる。これらおよび他の変更を、詳細な説明を考慮して、本開示に行うことができる。

【0095】

任意の前述の実施形態の特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わされても、置換されてもよい。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連付けられた利点を、これらの実施形態の文脈において説明してきたが、他の実施形態がかかる利点を示す場合もあり、すべての実施形態が必ずしも本開示の範囲内に入るように、かかる利点を示す必要はない。

【0096】

上記は本発明の例示的な実施形態の完全かつ徹底的な開示を提供するが、様々な修正例、代替構成、および同等物を必要に応じて採用することができる。その結果、実施形態を例として、および理解を明確にするために、一部詳細に説明してきたが、様々な修正例、変更例、および適合例が当業者には明らかであろう。したがって、上記の説明および図解は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではなく、添付の特許請求の範囲によって定義され得る。

【0097】

他の変形例が本開示の趣旨の範囲内である。したがって、開示される技術は、様々な修正例および代替的な構成の影響を受けやすいが、開示される技術のある特定の図解される実施形態は、図面に示されており、詳細に上で説明されている。しかしながら、本開示を開示される特定の形態（複数可）に限定する意図はないが、反対に、意図は、添付の特許請求の範囲に定義されるように、本開示の趣旨および範囲内に入るすべての修正例、代替的な構成、および同等物を網羅することであることを理解されたい。

【0098】

開示される実施形態を説明する文脈（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに同様の参照対象の使用は、別様に本明細書に示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別様に記述されない限り、制限のない用語（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ ｔｅｒｍ）（すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。「接続された」という用語は、介在する何かが存在する場合でも、部分的または全体的に中に含まれるか、取り付けられるか、または一緒に接合されるものとして解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の列挙は、別様に本明細書に示されない限り、単に、範囲内に入る各別個の値を個別に参照する略式方法として役立つことを意図するものであり、各別個の値は、本明細書に個別に列挙されたものとして本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、別様に本明細書に示されない限り、または別様に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供される任意のおよびすべての実施例、または例示的な言い回し（例えば、「などの」）の使用は、単に本開示の実施形態をよりよく明らかにすることを意図するものであり、別様に請求されない限り、本開示の範囲に限定を課さない。本明細書のいかなる言い回しも、本開示の実施に不可欠なものとして任意の特許請求されない要素を示すように解釈されるべきではない。

【0099】

「Ｘ、Ｙ、またはＺのうちの少なくとも１つ」という表現などの離接的な言い回しは、別様に具体的に明記されない限り、項目、用語などが、Ｘ、Ｙ、もしくはＺのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、Ｘ、Ｙ、および／またはＺ）であり得ることを提示するように概して使用される文脈内で理解されることを意図する。したがって、かかる離接的な言い回しは、ある特定の実施形態が、各々が存在するために、Ｘの少なくとも１つ、Ｙの少なくとも１つ、またはＺの少なくとも１つを必要とすることを概して意図するものではなく、それを暗示するべきではない。

【0100】

本発明者らが本開示を行うための最良のモードを含む、本開示の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形例は、前述の説明を読むことで当業者には明らかになり得る。発明者らは、当業者がかかる変形例を適切に採用することを期待し、かつ発明者らは、本明細書に具体的に記載される以外の方法で本開示を実践することを意図している。したがって、本開示は、適用法によって許可された場合に、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正例および同等物を含む。さらに、それらのすべての可能な変形例における、上に記載される要素の任意の組み合わせは、別様に本明細書に示されない限り、または別様に文脈によって明らかに矛盾しない限り、本開示によって包含される。

【0101】

本明細書に引用される刊行物、特許出願、および特許を含むすべての参照文献は、各参照文献が参照により組み込まれることが個別かつ具体的に示され、その全体が本明細書に記載される場合と同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

【0102】

以下において、本発明の理解を容易にするために、さらなる例を説明する。

【0103】

例１．音響液滴イジェクタによって、非ニュートン流体を含有するリザーバから液滴を吐出する方法であって、方法は、
非ニュートン流体の流体表面に第１のトーンバーストセグメントを含む第１のパターンで、集束音響エネルギーを適用して、フィラメントを先導突出部または流体表面から分離することなく、流体表面から先導突出部およびフィラメントを生成することと、
第２のトーンバーストセグメントおよび第３のトーンバーストセグメントを含む第２のパターンで、集束音響エネルギーを先導突出部に適用して、フィラメントから先導突出部を分離することによって、液滴を吐出して、液滴を形成することと、を含む、方法。

【0104】

例２．
第１のトーンバーストセグメントは、流体表面からの先導突出部およびフィラメントを増加させるのに十分な振幅および持続時間を有し、
第２のパターンは、フィラメントから液滴を分離するように構成された第２のトーンバーストセグメントおよび第３のトーンバーストセグメントを含む、少なくとも２つの別のトーンバーストセグメントを含む、例１に記載の方法。

【0105】

例３．第１のトーンバーストセグメントは、第２および第３のトーンバーストセグメントの各々１つよりも長い持続時間を有し、第３のセグメントは、第２のセグメントよりも長い持続時間を有している、例２に記載の方法。

【0106】

例４．フィラメントは、少なくとも１つの流体のビーズを含み、集束音響エネルギーの第２のパターンは、少なくとも１つの流体のビーズが１つ以上の追加の液滴に分解することを防止する、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0107】

例５．液滴は、流体フィラメントの長さの７０％未満、３０％未満、または１０％未満である直径を有している、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0108】

例６．液滴は、流体フィラメントの残りの部分の総ボリュームの８０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満である液滴ボリュームを有している、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0109】

例７．集束音響エネルギーの振幅は、ニュートン流体から代替液滴を吐出することに関連付けられた代替振幅を超えている、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0110】

例８．トーンバーストの振幅は、第１のトーンバーストセグメントと第２のトーンバーストセグメントとの間、または第２のトーンバーストセグメントと第３のトーンバーストセグメントとの間で変化する、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0111】

例９．
集束音響エネルギーによってリザーバから生成された非ニュートン流体のフィラメントは、非ニュートン流体の０個、１個、２個、または＞２個のビーズを含む鎖を含み、
集束音響エネルギーの第２のパターンは、鎖からの液滴離脱を誘導する、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0112】

例１０．フィラメントは、非ニュートン流体の５個、１０個、または＜１０個のビーズを含む、例９に記載の方法。

【0113】

例１１．非ニュートン流体のビーズは、フィラメントの直径の１０％、２０％、５０％、または＜５０％だけフィラメントの直径を超える、厚さを有している、例９に記載の方法。

【0114】

例１２．非ニュートン流体のビーズは、結果として生じる液滴直径の５０％、７５％、または９０％以下の厚さを有している、例９に記載の方法。

【0115】

例１３．集束音響エネルギーの第２のパターンは、サテライト液滴を生成することなく、液滴吐出をもたらすように構成されている、例９に記載の方法。

【0116】

例１４．鎖上のビーズは、液滴離脱の前または後に、リザーバ内の流体と互いに合体する、例９に記載の方法。

【0117】

例１５．フィラメントを光学的または電子的に監視して、液滴離脱が成功であるか、または失敗であるかどうかを評価することをさらに含む、例９に記載の方法。

【0118】

例１６．リザーバ内に形成された流体マウンドからの光信号または電気信号に基づいて、液滴離脱を予測することをさらに含む、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0119】

例１７．非ニュートン流体は、遺伝物質を含有する溶液を含む、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0120】

例１８．
一連のキャリブレーショントーンバーストを、流体表面からの流体の量を出すように構成された流体表面に適用することと、
流体表面から出された流体の量におけるフィラメントの形成を検出するか、または流体表面からのキャリブレーション液滴の吐出を検出することと、
フィラメントの検出またはキャリブレーション液滴の吐出に基づいて、集束音響エネルギーの第１のパターン、または集束音響エネルギーの第２のパターンの１つ以上のトーンバーストの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0121】

例１９．集束音響エネルギーの第２のパターンは、サテライト液滴を生成することなく、液滴吐出をもたらすように構成されている、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0122】

例２０．集束音響エネルギーの第２のパターンは、サテライト液滴の形成を抑制するように構成されている、例１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0123】

例２１．リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、システムは、
音響イジェクタであって、
非ニュートン流体の流体表面に第１のパターンで、集束音響エネルギーを適用して、フィラメントを先導突出部または流体表面から分離することなく、流体表面から先導突出部およびフィラメントを生成すること、および
フィラメントが流体表面に引き込まれるように、サテライト液滴を吐出することなく、先導突出部に第２のパターンで集束音響エネルギーを適用して、先導突出部をフィラメントから分離させること、を行うように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、音響イジェクタに、非ニュートン流体の流体表面に第１のパターンで集束音響エネルギーを適用させ、かつ前駆葉に第２のパターンで集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶するプロセッサおよびメモリデバイスと、を含む、液滴吐出システム。

【0124】

例２２．非ニュートン流体からの液滴吐出のためのトーンバーストパターンのパラメータを設定する方法であって、方法は、
一連のキャリブレーショントーンバーストを、流体表面から流体の量を出すように構成された流体表面に適用することと、
一連のキャリブレーショントーンバーストに対応する一連のエコー信号を収集することと、
収集された一連のエコー信号に基づいて、非ニュートン流体を含有するリザーバから液滴を吐出するように構成されている、集束音響エネルギーのトーンバーストパターンの１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することであって、トーンバーストパターンは、少なくとも、
第１の別のトーンバーストセグメント、
第２の別のトーンバーストセグメント、および
第３の別のトーンバーストセグメントを含み、第１のトーンバーストセグメントは、第２および第３のセグメントよりも長い持続時間を有し、第３のセグメントは、第２のセグメントよりも長い持続時間を有している、設定することと、を含む、方法。

【0125】

例２３．
収集された一連のエコー信号に基づいて、液滴吐出に対応する最小トーンバースト電力を決定することと、
最小トーンバースト電力に少なくとも部分的に基づいて、電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、例２２に記載の方法。

【0126】

例２４．
トーンバーストパターンに従って、集束音響エネルギーをリザーバに適用することによって、リザーバから液滴を吐出することをさらに含む、例２２に記載の方法。

【0127】

例２５．
光学センサを介して液滴の吐出を検知することをさらに含む、例２４に記載の方法。

【0128】

例２６．
液滴吐出が検出されるまで、１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを繰り返し変化させることと、
検出された液滴吐出に対応する１つ以上の値に、電力、波長、または持続時間を設定することと、をさらに含む、例２４または例２５に記載の方法。

【0129】

例２７．
既知の特性を有するそれぞれの複数の非ニュートン流体に対応する複数の反射音響信号を含む比較データセットに基づいて訓練された畳み込みニューラルネットワークによって、一連のエコー信号を処理することによって、吐出された液滴に関連付けられた液滴ボリュームを予測することをさらに含む、例２４または例２５に記載の方法。

【0130】

例２８．
吐出された液滴に関連付けられた実際の液滴ボリュームを決定することと、
実際の液滴ボリュームを、予測された液滴ボリュームと比較することと、
比較に基づいて、畳み込みニューラルネットワークを修正することと、をさらに含む、例２７に記載の方法。

【0131】

例２９．
吐出された液滴に関連付けられた液滴ボリュームを決定することと、
液滴ボリュームを、予測された液滴ボリュームと比較することと、
比較に基づいて、電力、波長、または持続時間を調整することと、をさらに含む、例２４または例２５に記載の方法。

【0132】

例３０．
収集された一連のエコー信号に基づいて、非ニュートン流体の特性を決定することをさらに含む、例２２～２５のいずれか１つに記載の方法。

【0133】

例３１．
一連のエコー信号と、非ニュートン流体の既知の収集と相関した以前に受信したエコーの収集を含む記憶されたエコーデータと、を比較することと、
比較に少なくとも部分的に基づいて、電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、例２２～２５のいずれか１つに記載の方法。

【0134】

例３２．
既知の特性を有するそれぞれの複数の非ニュートン流体に対応する複数の反射音響信号を含む比較データセットに基づいて訓練された畳み込みニューラルネットワークによって、１つ以上のエコー信号を処理することによって、非ニュートン流体の特性を決定することをさらに含む、例２２～２５のいずれか１つに記載の方法。

【0135】

例３３．流体リザーバから非ニュートン流体を含有する液滴を吐出する方法であって、方法は、
集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、非ニュートン流体を含む流体リザーバに適用することであって、トーンバーストパターンの流体リザーバへの適用は、流体リザーバから非ニュートン流体の液滴を吐出し、トーンバーストパターンは、
第１の別のトーンバーストセグメント、
第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、適用することを含む、方法。

【0136】

例３４．第１のトーンバーストセグメントは、第２および第３のセグメントよりも長い持続時間を有し、第３のセグメントは、第２のセグメントよりも長い持続時間を有している、例３３に記載の方法。

【0137】

例３５．
第１の別のトーンバーストによって、非ニュートン流体の流体表面からの先導突出部およびフィラメントを増加させること、および
第２および第３の別のトーンバーストによって、フィラメントから先導突出部を分離することによって液滴吐出をもたらすこと、例３３または例３４に記載の方法。

【0138】

例３６．フィラメントは、少なくとも１つの流体のビーズを含み、トーンバーストパターンは、少なくとも１つの流体のビーズが１つ以上の追加の液滴に分解することを防止する、例３５に記載の方法。

【0139】

例３７．
集束音響エネルギーによってリザーバから生成された非ニュートン流体のフィラメントは、非ニュートン流体の１つ以上のビーズを含む鎖を含む、例３５に記載の方法。

【0140】

例３８．トーンバーストパターンは、鎖からの液滴離脱を誘導する、例３７に記載の方法。

【0141】

例３９．フィラメントは、非ニュートン流体の１個、２個、または＞２個のビーズを含む、例３７に記載の方法。

【0142】

例４０．フィラメントは、非ニュートン流体の５個、１０個、または＞１０個のビーズを含む、例３７に記載の方法。

【0143】

例４１．非ニュートン流体のビーズは、フィラメントの直径の１０％、２０％、５０％、または＜５０％だけフィラメントの直径を超える、厚さを有している、例３７に記載の方法。

【0144】

例４２．非ニュートン流体のビーズは、結果として生じる液滴直径の５０％、７５％、または９０％以下の厚さを有している、例３７に記載の方法。

【0145】

例４３．鎖上のビーズは、液滴離脱の前または後に、リザーバ内の流体と互いに合体する、例３７に記載の方法。

【0146】

例４４．吐出された液滴の液滴ボリュームは、液滴吐出中のフィラメントの残りのボリュームの８０％未満、１０％未満、または５％未満である、例３７に記載の方法。

【0147】

例４５．フィラメントが、少なくとも５個の液滴直径、少なくとも１０個の液滴直径、少なくとも２０個の液滴直径、少なくとも５０個の液滴直径、または少なくとも１００個の液滴直径の長さを有するときに、液滴の吐出が発生する、例３７に記載の方法。

【0148】

例４６．フィラメントを光学的または電子的に監視して、液滴離脱が成功であるか、または失敗であるかどうかを評価することをさらに含む、例３７に記載の方法。

【0149】

例４７．液滴は、フィラメントの長さの７０％未満、３０％未満、または１０％未満である直径を有している、例３３または例３４に記載の方法。

【0150】

例４８．液滴は、流体フィラメントの残りの部分の総ボリュームの５０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満である液滴ボリュームを有している、例３３または例３４に記載の方法。

【0151】

例４９．トーンバーストの振幅は、ニュートン流体から代替液滴を吐出することに関連付けられる代替振幅を超えている、例３３または例３４に記載の方法。

【0152】

例５０．トーンバーストの振幅は、第１のトーンバーストセグメントと第２のトーンバーストセグメントとの間、または第２のトーンバーストセグメントと第３のトーンバーストセグメントとの間で変化する、例３３または３４に記載の方法。

【0153】

例５１．リザーバ内に形成された流体マウンドからの光信号または電気信号に基づいて、液滴離脱を予測することをさらに含む、例３３または例３４に記載の方法。

【0154】

例５２．非ニュートン流体は、遺伝物質を含有する溶液を含む、例３３または例３４に記載の方法。

【0155】

例５３．
一連のキャリブレーショントーンバーストを、流体表面から流体の量を出すように構成された流体表面に適用することと、
流体表面から出された流体の量におけるフィラメントの形成を検出することと、
フィラメントの検出に基づいて、トーンバーストパターンの１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、例３３または例３４に記載の方法。

【0156】

例５４．リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、システムは、
集束音響エネルギーがリザーバから非ニュートン流体の液滴を吐出するように、集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、リザーバに適用するように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、音響イジェクタに、パターンで集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶するプロセッサおよびメモリデバイスと、を含み、パターンは、
第１の別のトーンバーストセグメント、
第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、液滴吐出システム。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図16-4】

【図16-5】

【図16-6】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【手続補正書】

【提出日】2021-05-10

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

音響液滴イジェクタによって、非ニュートン流体を含有するリザーバから液滴を吐出する方法であって、前記方法が、
前記非ニュートン流体の流体表面に、第１のトーンバーストセグメントを含む第１のパターンで、集束音響エネルギーを適用して、フィラメントを先導突出部または前記流体表面から分離することなく、前記流体表面から前記先導突出部および前記フィラメントを生成することと、
第２のトーンバーストセグメントおよび第３のトーンバーストセグメントを含む第２のパターンで、集束音響エネルギーを前記先導突出部に適用して、前記フィラメントから前記先導突出部を分離することによって、液滴を吐出して、前記液滴を形成することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記第１のトーンバーストセグメントが、前記流体表面から前記先導突出部およびフィラメントを出すのに十分な振幅および持続時間を有し、
前記第２のパターンが、前記フィラメントから前記液滴を分離するように構成された第２のトーンバーストセグメントおよび第３のトーンバーストセグメントを含む、少なくとも２つの別のトーンバーストセグメントを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のトーンバーストセグメントの各々１つよりも長い持続時間を有し、第３のトーンバーストセグメントが、前記第２のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有している、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記フィラメントが、少なくとも１つの流体のビーズを含み、前記集束音響エネルギーの第２のパターンが、前記少なくとも１つの流体のビーズが１つ以上の追加の液滴に分解することを防止する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記液滴が、前記フィラメントの長さの７０％未満、３０％未満、または１０％未満である直径を有し、または前記液滴が、前記フィラメントの残りの部分の総ボリュームの８０％未満、１０％未満、または５％未満である液滴ボリュームを有している、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンが、サテライト液滴を生成することなく、液滴吐出をもたらすように構成されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記集束音響エネルギーの振幅が、ニュートン流体から代替液滴を吐出することに関連付けられた代替振幅を超えている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記集束音響エネルギーの振幅が、前記第１のトーンバーストセグメントと第２のトーンバーストセグメントとの間、または第２のトーンバーストセグメントと第３のトーンバーストセグメントとの間で変化する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記集束音響エネルギーによって前記リザーバから生成された前記非ニュートン流体の前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の０個、１個、２個、または＞２個のビーズを含む鎖を含み、
前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンが、前記鎖からの液滴離脱を誘導する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記鎖上の前記ビーズが、液滴離脱の前または後に、前記リザーバ内で、互いに、または前記非ニュートン流体と合体する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記フィラメントを光学的または電子的に監視して、前記液滴離脱が成功であるか、または失敗であるかどうかを評価することをさらに含む、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記リザーバ内に形成された流体マウンドからの光信号または電気信号に基づいて、液滴離脱を予測することをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記流体表面から流体の量を出すように構成された一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面に適用することと、
前記流体表面から出された前記流体の量におけるフィラメントの形成を検出するか、または前記流体表面からのキャリブレーション液滴の吐出を検出することと、
前記フィラメントの前記検出または前記キャリブレーション液滴の前記吐出に基づいて、前記集束音響エネルギーの前記第１のパターン、または前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンの１つ以上のトーンバーストの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、前記システムが、
音響イジェクタであって、
前記非ニュートン流体の流体表面に第１のパターンで、集束音響エネルギーを適用して、フィラメントを先導突出部または前記流体表面から分離することなく、前記流体表面から前記先導突出部および前記フィラメントを生成すること、および
前記フィラメントが前記流体表面に引き込まれるように、サテライト液滴を吐出することなく、前記先導突出部に第２のパターンで集束音響エネルギーを適用して、前記先導突出部を前記フィラメントから分離させること、を行うように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、前記音響イジェクタに、前記非ニュートン流体の流体表面に前記第１のパターンで前記集束音響エネルギーを適用させ、かつ前記前駆葉に前記第２のパターンで集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶する前記プロセッサおよびメモリデバイスと、を含む、液滴吐出システム。

【請求項15】

非ニュートン流体からの液滴吐出のためのトーンバーストパターンのパラメータを設定する方法であって、前記方法が、
前記流体表面から流体の量を出すように構成された一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面に適用することと、
前記一連のキャリブレーショントーンバーストに対応する一連のエコー信号を収集することと、
前記収集された一連のエコー信号に基づいて、前記非ニュートン流体を含有するリザーバから液滴を吐出するように構成されている、集束音響エネルギーのトーンバーストパターンの１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することであって、前記トーンバーストパターンが、少なくとも、
第１の別のトーンバーストセグメント、
第２の別のトーンバーストセグメント、および
第３の別のトーンバーストセグメントを含み、前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有し、第３のトーンバーストセグメントが、前記第２のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有している、設定することと、を含む、方法。

【請求項16】

前記収集された一連のエコー信号に基づいて、液滴吐出に対応する最小トーンバースト電力を決定することと、
前記最小トーンバースト電力に少なくとも部分的に基づいて、前記電力、波長、または持続時間のうちの前記１つを設定することと、をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記トーンバーストパターンに従って、集束音響エネルギーを前記リザーバに適用することによって、前記リザーバから液滴を吐出することおよび
光学センサを介して、前記液滴の吐出を検知することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

液滴吐出が検出されるまで、前記第１、第２、または第３のトーンバーストセグメントのうちの１つ以上の前記電力、波長、または持続時間のうちの１つを繰り返し変化させることと、
液滴吐出の前記検出に基づいて、前記電力、波長、または持続時間を設定することと、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

既知の特性を有するそれぞれの複数の非ニュートン流体に対応する複数の反射音響信号を含む比較データセットに基づいて訓練された畳み込みニューラルネットワークによって、前記一連のエコー信号を処理することによって、前記吐出された液滴に関連付けられた液滴ボリュームを予測することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記吐出された液滴に関連付けられた実際の液滴ボリュームを決定することと、
前記実際の液滴ボリュームを、前記予測された液滴ボリュームと比較することと、
前記比較に基づいて、前記畳み込みニューラルネットワークを修正することと、をさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記吐出された液滴に関連付けられた液滴ボリュームを決定することと、
前記液滴ボリュームを、予測された液滴ボリュームと比較することと、
前記比較に基づいて、前記電力、波長、または持続時間を調整することと、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項22】

前記一連のエコー信号と、非ニュートン流体の既知の収集と相関した以前に受信したエコーの収集を含む記憶されたエコーデータと、を比較することと、
前記比較に少なくとも部分的に基づいて、前記電力、波長、または持続時間のうちの前記１つを設定することと、をさらに含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

既知の特性を有するそれぞれの複数の非ニュートン流体に対応する複数の反射音響信号を含む比較データセットに基づいて訓練された畳み込みニューラルネットワークによって、前記１つ以上のエコー信号を処理することによって、前記非ニュートン流体の特性を決定することをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

流体リザーバから非ニュートン流体を含有する液滴を吐出する方法であって、前記方法が、
集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、非ニュートン流体を含有する流体リザーバに適用することであって、前記トーンバーストパターンの前記流体リザーバへの前記適用が、前記流体リザーバから前記非ニュートン流体の液滴を吐出し、前記トーンバーストパターンが、
第１の別のトーンバーストセグメント、
前記第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
前記第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、適用することを含む、方法。

【請求項25】

前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のセグメントよりも長い持続時間を有し、前記第３のセグメントが、前記第２のセグメントよりも長い持続時間を有している、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記第１の別のトーンバーストによって、前記非ニュートン流体の流体表面から先導突出部およびフィラメントを出すことと、
前記第２および第３の別のトーンバーストによって、前記フィラメントから前記先導突出部を分離することによって液滴吐出をもたらすことと、をさらに含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記フィラメントが、少なくとも１つの流体のビーズを含み、前記トーンバーストパターンが、前記少なくとも１つの流体のビーズが１つ以上の追加の液滴に分解することを防止する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記吐出された液滴の液滴ボリュームが、液滴吐出中の前記フィラメントの残りのボリュームの８０％未満、１０％未満、または５％未満である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記フィラメントが、少なくとも５個の液滴直径、少なくとも１０個の液滴直径、少なくとも２０個の液滴直径、少なくとも５０個の液滴直径、または少なくとも１００個の液滴直径の長さを有するときに、前記液滴の吐出が発生する、請求項２６に記載の方法。

【請求項30】

前記液滴が、前記フィラメントの長さの７０％未満、３０％未満、または１０％未満の直径を有している、請求項２４または請求項２５に記載の方法。

【請求項31】

前記液滴が、液滴吐出中に、前記フィラメントの残りのボリュームの８０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満の液滴ボリュームを有している、請求項２４または請求項２５に記載の方法。

【請求項32】

前記フィラメントを光学的または電子的に監視して、前記液滴離脱が成功であるか、または失敗であるかどうかを評価することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項33】

前記リザーバ内に形成された流体マウンドからの光信号または電気信号に基づいて、液滴離脱を予測することをさらに含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。

【請求項34】

一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面から流体の量を出すように構成された前記流体表面に適用することと、
前記流体表面から出された前記流体の量におけるフィラメントの形成を検出することと、
前記フィラメントの前記検出に基づいて、前記トーンバーストパターンの１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。

【請求項35】

リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、前記システムが、
集束音響エネルギーが前記リザーバから前記非ニュートン流体の液滴を吐出するように、前記集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、前記リザーバに適用するように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、前記音響イジェクタに、パターンで前記集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶する前記プロセッサおよびメモリデバイスと、を含み、前記パターンが、
第１の別のトーンバーストセグメント、
前記第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
前記第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、液滴吐出システム。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0156】

例５４．リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、システムは、
集束音響エネルギーがリザーバから非ニュートン流体の液滴を吐出するように、集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、リザーバに適用するように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、音響イジェクタに、パターンで集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶するプロセッサおよびメモリデバイスと、を含み、パターンは、
第１の別のトーンバーストセグメント、
第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、液滴吐出システム。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
音響液滴イジェクタによって、非ニュートン流体を含有するリザーバから液滴を吐出する方法であって、前記方法が、
前記非ニュートン流体の流体表面に、第１のトーンバーストセグメントを含む第１のパターンで、集束音響エネルギーを適用して、フィラメントを先導突出部または前記流体表面から分離することなく、前記流体表面から前記先導突出部および前記フィラメントを生成することと、
第２のトーンバーストセグメントおよび第３のトーンバーストセグメントを含む第２のパターンで、集束音響エネルギーを前記先導突出部に適用して、前記フィラメントから前記先導突出部を分離することによって、液滴を吐出して、前記液滴を形成することと、を含む、方法。
(項目２)
前記第１のトーンバーストセグメントが、前記流体表面から前記先導突出部およびフィラメントを出すのに十分な振幅および持続時間を有し、
前記第２のパターンが、前記フィラメントから前記液滴を分離するように構成された第２のトーンバーストセグメントおよび第３のトーンバーストセグメントを含む、少なくとも２つの別のトーンバーストセグメントを含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のトーンバーストセグメントの各々１つよりも長い持続時間を有し、第３のトーンバーストセグメントが、前記第２のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有している、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記フィラメントが、少なくとも１つの流体のビーズを含み、前記集束音響エネルギーの第２のパターンが、前記少なくとも１つの流体のビーズが１つ以上の追加の液滴に分解することを防止する、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
前記液滴が、前記フィラメントの長さの７０％未満、３０％未満、または１０％未満である直径を有し、または前記液滴が、前記フィラメントの残りの部分の総ボリュームの８０％未満、１０％未満、または５％未満である液滴ボリュームを有している、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンが、サテライト液滴を生成することなく、液滴吐出をもたらすように構成されている、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記集束音響エネルギーの振幅が、ニュートン流体から代替液滴を吐出することに関連付けられた代替振幅を超えている、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記集束音響エネルギーの振幅が、前記第１のトーンバーストセグメントと第２のトーンバーストセグメントとの間、または第２のトーンバーストセグメントと第３のトーンバーストセグメントとの間で変化する、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目９)
前記集束音響エネルギーによって前記リザーバから生成された前記非ニュートン流体の前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の０個、１個、２個、または＞２個のビーズを含む鎖を含み、
前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンが、前記鎖からの液滴離脱を誘導する、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記鎖上の前記ビーズが、液滴離脱の前または後に、前記リザーバ内で、互いに、または前記非ニュートン流体と合体する、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記フィラメントを光学的または電子的に監視して、前記液滴離脱が成功であるか、または失敗であるかどうかを評価することをさらに含む、項目９に記載の方法。
(項目１２)
前記リザーバ内に形成された流体マウンドからの光信号または電気信号に基づいて、液滴離脱を予測することをさらに含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３)
前記非ニュートン流体が、遺伝物質を含有する溶液を含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記流体表面から流体の量を出すように構成された一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面に適用することと、
前記流体表面から出された前記流体の量におけるフィラメントの形成を検出するか、または前記流体表面からのキャリブレーション液滴の吐出を検出することと、
前記フィラメントの前記検出または前記キャリブレーション液滴の前記吐出に基づいて、前記集束音響エネルギーの前記第１のパターン、または前記集束音響エネルギーの前記第２のパターンの１つ以上のトーンバーストの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、前記システムが、
音響イジェクタであって、
前記非ニュートン流体の流体表面に第１のパターンで、集束音響エネルギーを適用して、フィラメントを先導突出部または前記流体表面から分離することなく、前記流体表面から前記先導突出部および前記フィラメントを生成すること、および
前記フィラメントが前記流体表面に引き込まれるように、サテライト液滴を吐出することなく、前記先導突出部に第２のパターンで集束音響エネルギーを適用して、前記先導突出部を前記フィラメントから分離させること、を行うように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、前記音響イジェクタに、前記非ニュートン流体の流体表面に前記第１のパターンで前記集束音響エネルギーを適用させ、かつ前記前駆葉に前記第２のパターンで集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶する前記プロセッサおよびメモリデバイスと、を含む、液滴吐出システム。
(項目１６)
非ニュートン流体からの液滴吐出のためのトーンバーストパターンのパラメータを設定する方法であって、前記方法が、
前記流体表面から流体の量を出すように構成された一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面に適用することと、
前記一連のキャリブレーショントーンバーストに対応する一連のエコー信号を収集することと、
前記収集された一連のエコー信号に基づいて、前記非ニュートン流体を含有するリザーバから液滴を吐出するように構成されている、集束音響エネルギーのトーンバーストパターンの１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することであって、前記トーンバーストパターンが、少なくとも、
第１の別のトーンバーストセグメント、
第２の別のトーンバーストセグメント、および
第３の別のトーンバーストセグメントを含み、前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有し、第３のトーンバーストセグメントが、前記第２のトーンバーストセグメントよりも長い持続時間を有している、設定することと、を含む、方法。
(項目１７)
前記収集された一連のエコー信号に基づいて、液滴吐出に対応する最小トーンバースト電力を決定することと、
前記最小トーンバースト電力に少なくとも部分的に基づいて、前記電力、波長、または持続時間のうちの前記１つを設定することと、をさらに含む、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記トーンバーストパターンに従って、集束音響エネルギーを前記リザーバに適用することによって、前記リザーバから液滴を吐出することをさらに含む、項目１６に記載の方法。
(項目１９)
光学センサを介して、前記液滴の吐出を検知することをさらに含む、項目１８に記載の方法。
(項目２０)
液滴吐出が検出されるまで、前記第１、第２、または第３のトーンバーストセグメントのうちの１つ以上の前記電力、波長、または持続時間のうちの１つを繰り返し変化させることと、
液滴吐出の前記検出に基づいて、前記電力、波長、または持続時間を設定することと、をさらに含む、項目１８または項目１９に記載の方法。
(項目２１)
既知の特性を有するそれぞれの複数の非ニュートン流体に対応する複数の反射音響信号を含む比較データセットに基づいて訓練された畳み込みニューラルネットワークによって、前記一連のエコー信号を処理することによって、前記吐出された液滴に関連付けられた液滴ボリュームを予測することをさらに含む、項目１８または項目１９に記載の方法。
(項目２２)
前記吐出された液滴に関連付けられた実際の液滴ボリュームを決定することと、
前記実際の液滴ボリュームを、前記予測された液滴ボリュームと比較することと、
前記比較に基づいて、前記畳み込みニューラルネットワークを修正することと、をさらに含む、項目２１に記載の方法。
(項目２３)
前記吐出された液滴に関連付けられた液滴ボリュームを決定することと、
前記液滴ボリュームを、予測された液滴ボリュームと比較することと、
前記比較に基づいて、前記電力、波長、または持続時間を調整することと、をさらに含む、項目１８または項目１９に記載の方法。
(項目２４)
前記収集された一連のエコー信号に基づいて、前記非ニュートン流体の特性を決定することをさらに含む、項目１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５)
前記一連のエコー信号と、非ニュートン流体の既知の収集と相関した以前に受信したエコーの収集を含む記憶されたエコーデータと、を比較することと、
前記比較に少なくとも部分的に基づいて、前記電力、波長、または持続時間のうちの前記１つを設定することと、をさらに含む、項目１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６)
既知の特性を有するそれぞれの複数の非ニュートン流体に対応する複数の反射音響信号を含む比較データセットに基づいて訓練された畳み込みニューラルネットワークによって、前記１つ以上のエコー信号を処理することによって、前記非ニュートン流体の特性を決定することをさらに含む、項目１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２７)
流体リザーバから非ニュートン流体を含有する液滴を吐出する方法であって、前記方法が、
集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、非ニュートン流体を含有する流体リザーバに適用することであって、前記トーンバーストパターンの前記流体リザーバへの前記適用が、前記流体リザーバから前記非ニュートン流体の液滴を吐出し、前記トーンバーストパターンが、
第１の別のトーンバーストセグメント、
前記第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
前記第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、適用することを含む、方法。
(項目２８)
前記第１のトーンバーストセグメントが、前記第２および第３のセグメントよりも長い持続時間を有し、前記第３のセグメントが、前記第２のセグメントよりも長い持続時間を有している、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
前記第１の別のトーンバーストによって、前記非ニュートン流体の流体表面から先導突出部およびフィラメントを出すことと、
前記第２および第３の別のトーンバーストによって、前記フィラメントから前記先導突出部を分離することによって液滴吐出をもたらすことと、をさらに含む、項目２７または項目２８に記載の方法。
(項目３０)
前記フィラメントが、少なくとも１つの流体のビーズを含み、前記トーンバーストパターンが、前記少なくとも１つの流体のビーズが１つ以上の追加の液滴に分解することを防止する、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
前記非ニュートン流体の前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の１つ以上のビーズを含む鎖を含む、項目２９に記載の方法。
(項目３２)
前記トーンバーストパターンが、前記鎖からの液滴離脱を誘導する、項目３１に記載の方法。
(項目３３)
前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の１個、２個、または＞２個のビーズを含む、項目３１に記載の方法。
(項目３４)
前記フィラメントが、前記非ニュートン流体の５個、１０個、または＞１０個のビーズを含む、項目３１に記載の方法。
(項目３５)
前記非ニュートン流体のビーズが、前記フィラメントの直径の１０％、２０％、５０％、または＜５０％だけ前記フィラメントの前記直径を超える厚さを有している、項目３１に記載の方法。
(項目３６)
前記非ニュートン流体のビーズが、結果として生じる液滴直径の５０％、７５％、または９０％以下の厚さを有している、項目３１に記載の方法。
(項目３７)
前記鎖上の前記ビーズが、液滴離脱の前または後に、前記リザーバ内で、互いに、またはの前記非ニュートン流体と合体する、項目３１に記載の方法。
(項目３８)
前記吐出された液滴の液滴ボリュームが、液滴吐出中の前記フィラメントの残りのボリュームの８０％未満、１０％未満、または５％未満である、項目３１に記載の方法。
(項目３９)
前記フィラメントが、少なくとも５個の液滴直径、少なくとも１０個の液滴直径、少なくとも２０個の液滴直径、少なくとも５０個の液滴直径、または少なくとも１００個の液滴直径の長さを有するときに、前記液滴の吐出が発生する、項目３１に記載の方法。
(項目４０)
前記液滴が、前記フィラメントの長さの７０％未満、３０％未満、または１０％未満の直径を有している、項目２７または項目２８に記載の方法。
(項目４１)
前記液滴が、液滴吐出中に、前記フィラメントの残りのボリュームの８０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満の液滴ボリュームを有している、項目２７または項目２８に記載の方法。
(項目４２)
前記トーンバーストの振幅が、ニュートン流体から代替液滴を吐出することに関連付けられる代替振幅を超えている、項目２７または項目２８に記載の方法。
(項目４３)
前記トーンバーストの振幅が、前記第１のトーンバーストセグメントと第２のトーンバーストセグメントとの間、または第２のトーンバーストセグメントと第３のトーンバーストセグメントとの間で変化する、項目２７または項目２８に記載の方法。
(項目４４)
前記フィラメントを光学的または電子的に監視して、前記液滴離脱が成功であるか、または失敗であるかどうかを評価することをさらに含む、項目３１に記載の方法。
(項目４５)
前記リザーバ内に形成された流体マウンドからの光信号または電気信号に基づいて、液滴離脱を予測することをさらに含む、項目２７または項目２８に記載の方法。
(項目４６)
前記非ニュートン流体が、遺伝物質を含有する溶液を含む、項目２７または項目２８に記載の方法。
(項目４７)
一連のキャリブレーショントーンバーストを、前記流体表面から流体の量を出すように構成された前記流体表面に適用することと、
前記流体表面から出された前記流体の量におけるフィラメントの形成を検出することと、
前記フィラメントの前記検出に基づいて、前記トーンバーストパターンの１つ以上のトーンバーストセグメントの電力、波長、または持続時間のうちの１つを設定することと、をさらに含む、項目２７または項目２８に記載の方法。
(項目４８)
リザーバ内の非ニュートン流体から液滴を吐出するように構成された液滴吐出システムであって、前記システムが、
集束音響エネルギーが前記リザーバから前記非ニュートン流体の液滴を吐出するように、前記集束音響エネルギーのトーンバーストパターンを、前記リザーバに適用するように構成されている、音響イジェクタと、
プロセッサによって実行されたときに、前記音響イジェクタに、パターンで前記集束音響エネルギーを適用させる、実行可能な命令を記憶する前記プロセッサおよびメモリデバイスと、を含み、前記パターンが、
第１の別のトーンバーストセグメント、
前記第１の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第２の別のトーンバーストセグメント、および
前記第２の別のトーンバーストセグメントに続いて適用される、第３の別のトーンバーストセグメントを含む、液滴吐出システム。

【国際調査報告】