▶ イミューンオンコ バイオファーマシューティカルズ （シャンハイ） カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-01
(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１とＶＥＧＦを標的化する組換えタンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220125BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220125BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220125BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220125BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220125BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220125BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220125BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220125BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220125BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220125BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220125BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220125BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220125BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220125BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C07K14/705
C12N15/13
C12N15/12
A61P43/00 111
A61P35/02
A61P35/00
A61P43/00 105
A61P1/16
A61P9/10
A61P27/02
A61K38/17
A61K48/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 U
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021531099
(86)(22)【出願日】2019-12-02
(85)【翻訳文提出日】2021-06-24
(86)【国際出願番号】 CN2019122446
(87)【国際公開番号】W WO2020114355
(87)【国際公開日】2020-06-11
(31)【優先権主張番号】62/774,849
(32)【優先日】2018-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517342693
【氏名又は名称】イミューンオンコ バイオファーマシューティカルズ （シャンハイ） カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】龍華国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ティアン、ウェンジ
(72)【発明者】
【氏名】リ、ソン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA20
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA18
4C084CA53
4C084CA56
4C084DB63
4C084NA05
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC411
4C084ZC412
4C085AA14
4C085AA15
4C085BB36
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA51
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
１）ＰＤ－Ｌ１と結合するためにジスルフィド結合で連結された抗ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖および抗ＰＤ－Ｌ１抗体軽鎖と、２）前記重鎖または前記軽鎖のＮ末端またはＣ末端にリンカを介して連結された血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外Ｉｇ様ドメインとを備える、組換えタンパク質であって、前記組換えタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦおよびＦｃ受容体を同時に結合することができる組換えタンパク質が開示されている。また、本開示の２つの組換えタンパク質を含む組換え抗体、前記組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記組換えタンパク質の製造方法、および前記組換えタンパク質を用いてＶＥＧＦおよび／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現に起因する疾患を治療する方法が開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＤ－Ｌ１と結合するためにジスルフィド結合で連結された抗ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖および抗ＰＤ－Ｌ１抗体軽鎖と、前記重鎖または前記軽鎖のＮ末端またはＣ末端にリンカを介して連結された血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外Ｉｇ様ドメインと、
を備える、組換えタンパク質であって、
前記組換えタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦおよびＦｃ受容体を同時に結合することができる
組換えタンパク質。
【請求項2】
ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、ＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）である請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項3】
ＶＥＧＦＲ１Ｄ２が配列識別番号８のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項4】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体がアテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブである、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項5】
ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、前記重鎖のＮ末端にリンカを介して連結されている、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項6】
ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインを有する前記重鎖が配列識別番号１４のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖が配列識別番号６のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の組換えタンパク質。
【請求項7】
ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、前記重鎖のＣ末端にリンカを介して連結されている、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項8】
ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインを有する前記重鎖が配列識別番号１６のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖が配列識別番号６のアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の組換えタンパク質。
【請求項9】
ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、リンカを介して前記軽鎖のＮ末端に連結されている、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項10】
前記重鎖が配列識別番号２のアミノ酸配列からなり、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインを有する前記軽鎖が配列識別番号１８のアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の組換えタンパク質。
【請求項11】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の２つの同一の組換えタンパク質を備える、組換え抗体。
【請求項12】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項13】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項１１に記載の組換え抗体、または請求項１２に記載のポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを備える、医薬組成物。
【請求項14】
ＶＥＧＦまたはＰＤ－Ｌ１、またはその両方の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するための医薬品の調製における、請求項１３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項15】
前記疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵癌、肝癌、腎細胞癌、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、肝線維症、血管肉腫などからなる群から選択される請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、組換えタンパク質／抗体、ならびに、その調製および使用に関し、特に、腫瘍治療における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
癌細胞は、宿主の免疫監視を回避するためのいくつかのメカニズムを発達させている。例えば、多くの腫瘍細胞や癌細胞は、その表面に高レベルのＰＤ－ＬｌやＰＤ－Ｌ２を発現しており、これらのＰＤ－ＬｌやＰＤ－Ｌ２は、Ｔ細胞の表面にあるＰＤ－１と結合して、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。
【0003】
また、癌細胞の増殖には、十分な栄養の供給が必要である。癌細胞自身が、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの血管の増殖を促進する因子を分泌することができる。ＶＥＧＦやその受容体の活性を阻害することで、固形腫瘍への血液供給を止め、腫瘍の増殖を阻害する。
【0004】
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１
【0005】
ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １またはＣＤ２７４としても知られているＰＤ－Ｌ１は、組織同種移植、自己免疫性疾患および癌の発生など、一部の特定のイベントにおいて免疫系を抑制する上で主な役割を担う膜貫通タンパク質である。
【0006】
ある種の癌では、ＳＴＡＴ３のような転写因子とＮＦ－κＢとの間のフィードバック制限が失われると、局所的なＰＤ－Ｌ１の発現が増加し、ＰＤ－Ｌ１を標的化する薬剤による全身治療の効果が制限される可能性がある (Vlahopoulos, SA. Aberrant control of NF-κB in cancer permits transcriptional and phenotypic plasticity to curtail dependence on host tissue: molecular mode. Cancer Biology & Bedicine. 2017, 14: 254-270)。腎細胞癌の患者からの１９６の腫瘍標本の解析から、ＰＤ－Ｌ１の高い腫瘍発現は、腫瘍の進行性の増加、および、死亡リスクの４．５倍の増加に関連することが分かった(Thompson RH, et al. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. PNAS. 2004, 101 (49): 17174-9)。
【0007】
ＰＤ－１は約２６８アミノ酸の細胞表面受容体である。ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合したとき、免疫系を下方制御し、Ｔ細胞炎症活性を抑制することにより自己寛容を促進する。免疫系に対するＰＤ－１の阻害作用は、自己免疫性疾患を防止するが、免疫系が癌細胞を破壊することも防止する。抗ＰＤ－１抗体ＢＭＳ－９３６５５８は、非小細胞性肺癌、悪性黒色腫、または腎細胞癌の患者うち、約５人中１人から４人中１人において、客観的応答を生じさせた (Suzanne L. Topalian, et al., Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer, N Engl J Med 2012, 366:2443-2454)。
【0008】
ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ
【0009】
ＶＥＧＦは、組織／傷の修復プログラムの制御に中心的な役割を果たす多面的な増殖因子で、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰＩＧＦに分類されている。組織の治癒過程において、ＶＥＧＦは、新しい血管の形成（血管新生）を駆動すると同時に、免疫をダウンレギュレートする (Canic M, et al. The role of vascular endothelial growth factor in wound healing. J Surg Res. 2009, 153:347-358; Leung DW, et al. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science. 1989, 246:1306-1309; Voron T, et al. Control of the immune response by pro-angiogenic factors. Front Oncol. 2014, 4:70)。ＶＥＧＦのこれらの特性は両方とも、腫瘍血管の発達を可能にし、抗癌免疫を抑制するため、発癌プロセスに不可欠である (Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011, 144:646-674)。特にＶＥＧＦは、ＤＣの成熟阻害、Ｔ細胞の腫瘍浸潤の軽減、腫瘍微小環境における阻止細胞の増加という３つの主要なメカニズムによって、免疫抑制効果を発揮すると考えられている。また、ＶＥＧＦの発現異常は、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、湿潤型加齢黄斑変性症、糸球体肥大などの他の疾患にも寄与している。ＦＤＡ承認の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体薬である「アバスチン」は、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害することで、癌（大腸癌、肺癌）を治療する機能を持っている。ＶＥＧＦを標的化するもう一つのタンパク質薬剤であるアフリベルセプトは、欧米では「Ｅｙｌｅａ」という商品名で湿性黄斑変性症の治療薬として、また、「Ｚａｌｔｒａｐ」という商品名で転移性大腸癌の治療薬として承認されている。
【0010】
ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）には、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２およびＶＥＧＦＲ－３の３つのサブタイプがあり、いずれも７つの免疫グロブリン様ドメインからなる細胞外部分、１つの膜貫通領域、細胞内部分を有している。ＶＥＧＦＲ－２は、ＶＥＧＦに対する既知の細胞応答のほぼすべてを媒介すると思われるが、ＶＥＧＦＲ－１はＶＥＧＦＲ－２の結合からＶＥＧＦを隔離し、ＶＥＧＦＲ－２のシグナル伝達を調節する。人間の健康にとって最も危険なタイプであるＶＥＧＦ－Ａは、ＶＥＧＦＲ－１とＶＥＧＦＲ－２の両方に結合する。ＶＥＧＦＲアンタゴニストは、主に癌の治療に使用されているか、または研究されている。ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２およびＶＥＧＦＲ－３のキナーゼに対するマルチキナーゼ阻害剤として作用するレンビマは、２０１５年に分化型甲状腺癌の治療薬として、２０１６年にはエベロリムスとの併用で進行性腎細胞癌の治療薬として承認された。
【0011】
ＦｃおよびＦｃＲ
【0012】
断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）は抗体の尾部領域であり、抗体のエフェクタ機能、すなわち、特定の細胞受容体または他の防御タンパク質とどのように係合するかを決定するドメインである。
【0013】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、Ｂリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞を含む特定の免疫エフェクタ細胞の表面上に見られるタンパク質である。これらの細胞は、免疫系の保護機能に寄与している。
【0014】
Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体、および／または、免疫系を活性化する相補系のタンパク質と相互作用し得る。例えば、Ｆｃ受容体は、感染細胞や侵入病原体に付着した抗体と結合し、食細胞や細胞傷害性細胞を刺激して、抗体介在性の食作用や抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって微生物や感染細胞を破壊する。
【0015】
治療用二重特異性または多特異性融合タンパク質／抗体
【0016】
タンパク質・抗体療法は、癌を含む疾患の治療を著しく前進させたが、臨床研究では、多くの患者が単剤療法では十分な効果が得られないことを示している。例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１を標的化する抗体で治療を受けた患者のうち、持続的な奏効および／または生存が得られるのは一部の患者に限られている。前述の２つのタンパク質を標的化するＶＥＧＦであるアバスチンとアフリベルセプトは、癌細胞の増殖をある程度阻害するが、癌細胞を排除することはできない。
【0017】
上記の制限に対処するために、２つ以上の別々の異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープに対する二重特異性または多特異性組換えタンパク質が発達される。例えば、二重特異性タンパク質の中には、細胞傷害性細胞と破壊すべき腫瘍細胞が同時に結合するように設計されたものがある。このようなタンパク質は、複数の腫瘍細胞の増殖および生存経路を遮断することができ、および／または、腫瘍細胞の破壊経路を活性化することができるため、癌の増殖をより良く阻害できる可能性がある。
【0018】
しかし、二重特異性タンパク質や多特異性タンパク質、特に二重特異性抗体や多特異性抗体は、分子の互換性、物理的に連結できるかどうか、物理的に連結できたとしても得られるタンパク質の親和性、安定性、医薬品としての特性など、多くの変数を考慮しなければならないため、設計上の大きな課題をとなっている。２つ以上の抗体やタンパク質を単に連結するだけでは、相乗効果やさらに有利な効果が得られないことが多いことはよく意識されている。下記の比較例に開示されている、ＳＩＲＰαＤ１がリンカで連結された抗ＥＧＦＲ抗体からなる組換え抗体は、ＨＴ－２９またはＮＣＬ－Ｈ１９７５腫瘍モデルにおいて、抗ＥＧＦＲ抗体またはＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ単独と比較して、抗腫瘍活性が劣ることが証明されている。
【発明の概要】
【0019】
本発明者らは、鋭意努力の結果、ＰＤ－Ｌ１とＶＥＧＦの両方を標的とし、同時にＦｃＲに結合する組換えタンパク質と組換え抗体の設計に成功した。本開示の組換えタンパク質／抗体は、組み合わせて使用したとしても、単一特異性対応物よりも優れた抗腫瘍活性を示す。
【0020】
従って、第１の態様において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１と結合するためにジスルフィド結合で連結された抗ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖および抗ＰＤ－Ｌ１抗体軽鎖と、前記重鎖または前記軽鎖のＮ末端またはＣ末端にリンカを介して連結された血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外Ｉｇ様ドメインとを備える組換えタンパク質を提供し、前記組換えタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦおよびＦｃ受容体を同時に結合することができる。
【0021】
いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、重鎖のＮ末端にリンカを介して連結されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、重鎖のＣ末端にリンカを介して連結されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、リンカを介して軽鎖のＮ末端に連結されている。
【0022】
また、本明細書に記載の組換えタンパク質を含む二量体も提供される。二量体は、上述の２つの組換えタンパク質などからなるホモ二量体であってもよく、例えば、２つの同一のものであってもよい。
【0023】
第２の態様において、本開示は、２本の重鎖および２本の軽鎖を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を備える組換え抗体を提供し、血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外Ｉｇ様ドメインが、各重鎖のＮ末端もしくはＣ末端、または各軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端にリンカを介して連結されており、組換え抗体がＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦおよびＦｃＲを同時に結合することができる。組換え抗体は、第１の態様に記載の組換えタンパク質のホモ二量体である。
【0024】
いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、リンカを介して各重鎖のＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、各重鎖のＣ末端にリンカを介して連結されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインが、リンカを介して各軽鎖のＮ末端に連結されている。
【0025】
癌細胞などの標的細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合することで、ＰＤ－１媒介阻害シグナルによるＴ細胞への牽制を解除し、ＶＥＧＦに結合することで血管の新生を禁止し、免疫抑制を解除することで、標的細胞増殖を制限する。さらに、ＮＫ細胞やマクロファージなどの免疫細胞上のＦｃＲに結合することで、ＮＫ細胞やマクロファージによる標的細胞の破壊を刺激する。
【0026】
第１の態様と第２の態様に記載された抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブなどの単離モノクローナル抗体、および、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する抗体であり得る。
【0027】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列識別番号１、３および５の核酸配列によってそれぞれコードされ得る、配列識別番号２または４のアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、配列識別番号６のアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを備える単離モノクローナル抗体であり得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合（Ｆａｂ）部分（またはパラトープ）は、癌／腫瘍細胞などの標的細胞の細胞表面上のＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞の細胞表面上のＰＤ－１との相互作用を遮断し、ＰＤ－１媒介阻害シグナルによるＴ細胞への牽制を解除することができる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＦｃ部分は、ＮＫ細胞やマクロファージなどの免疫細胞の細胞表面にあるＦｃＲに結合し、ＮＫ細胞やマクロファージによる標的細胞の破壊を刺激することができる。
【0028】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は、配列識別番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合して、Ｔ細胞の細胞表面上のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を遮断することができ、また、免疫細胞の細胞表面上のＦｃＲに結合して、これらの細胞を活性化して、癌細胞などの標的細胞を破壊することができる。
【0029】
いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列識別番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合して、Ｔ細胞の細胞表面上のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を遮断することができ、また、免疫細胞の細胞表面上のＦｃＲに結合して、癌細胞などの標的細胞を破壊するためにこれらの細胞を活性化することができる。
【0030】
第１の態様および第２の態様に記載のＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２であってもよく、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインは、ＶＥＧＦＲの第２の細胞外Ｉｇ様ドメインであってもよい。一実施形態において、ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ１であり、ＶＥＧＦＲ１の細胞外Ｉｇ様ドメインは、ＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）である。別の実施形態において、ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ２であり、ＶＥＧＦＲ２の細胞外Ｉｇ様ドメインは、ＶＥＧＦＲ２の第２の細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＶＥＧＦＲ２Ｄ２）である。ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインは、標的細胞または標的細胞の周囲の細胞、例えば癌／腫瘍細胞、が発現するＶＥＧＦ結合し、標的細胞の増殖を制限することができる。
【0031】
一実施形態において、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、配列識別番号７および８にそれぞれ記載されている核酸配列およびアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、配列識別番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、標的細胞、例えば、癌／腫瘍細胞によって発現されるＶＥＧＦまたはその周辺に結合することができ、その結果、標的細胞の増殖を制限することができる。
【0032】
第１の態様および第２の態様に記載のリンカは、約５～３０アミノ酸残基のペプチドであってもよい。実施形態において、リンカは１０～３０アミノ酸残基のペプチドである。別の実施形態において、リンカは１０～１５アミノ酸残基のペプチドである。いくつかの実施形態において、リンカは、－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２－（配列識別番号１０）または－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３－（配列識別番号１２）であり、それぞれ配列識別番号９および１１によってコードされていてもよい。
【0033】
抗ＰＤ－Ｌ１重鎖のＮ末端にＶＥＧＦＲ１Ｄ２が連結されたＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖は、配列識別番号１４のアミノ酸配列からなり、配列識別番号１３のヌクレオチドによってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖は、配列識別番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。ここで、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖とともに、ＶＥＧＦ、ＰＤ－Ｌ１およびＦｃＲに結合することができ、ｉ）標的細胞上のＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ－１との相互作用を遮断し、ｉｉ）標的細胞の表面上のＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの相互作用を遮断し、ｉｉｉ）免疫細胞による標的細胞の破壊を刺激する。
【0034】
抗ＰＤ－Ｌ１重鎖のＣ末端にＶＥＧＦＲ１Ｄ２が連結された抗ＰＤ－Ｌ１重鎖－リンカ－ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、配列識別番号１６のアミノ酸配列からなり、配列識別番号１５のヌクレオチドによってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１重鎖－リンカ－ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、配列識別番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。ここで、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖とともに、ＶＥＧＦ、ＰＤ－Ｌ１およびＦｃＲに結合することができ、ｉ）標的細胞上のＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ－１との相互作用を遮断し、ｉｉ）標的細胞の表面上のＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの相互作用を遮断し、ｉｉｉ）免疫細胞による標的細胞の破壊を刺激する。
【0035】
抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖コード配列のＮ末端にＶＥＧＦＲ１Ｄ２が連結されたＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖は、配列識別番号１８のアミノ酸配列からなり、配列識別番号１７のヌクレオチドによってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖は、配列識別番号１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖とともに、ＶＥＧＦ、ＰＤ－Ｌ１、およびＦｃＲに結合することができ、ｉ）標的細胞上のＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ－１との相互作用を遮断し、ｉｉ）標的細胞の表面上のＶＥＧＦＲとＶＥＧＦとの相互作用を遮断し、ｉｉｉ）免疫細胞による標的細胞の破壊を刺激する。
【0036】
第３の態様においては、本開示の組換えタンパク質／抗体をコードする核酸分子、ならびに当該核酸を含む発現ベクターおよび当該発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。
【0037】
第４の態様においては、発現ベクターを含む宿主細胞を用いて組換えタンパク質／抗体を調製する方法も提供され、この方法は、（ｉ）宿主細胞で組換えタンパク質／抗体を発現させる段階と、（ｉｉ）宿主細胞から組換えタンパク質／抗体を単離する段階とを含む。
【0038】
第５の態様においては、本開示は、本開示の組換えタンパク質または組換え抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【0039】
第６の態様においては、本開示は、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するための方法であって、患者またはそれを必要とする対象に、治療有効量の本開示の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0040】
一実施形態において、本開示は、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現によって引き起こされる疾患の治療のための医薬組成物の製造における、組換えタンパク質または組換え抗体の使用を提供する。
【0041】
一実施形態において、本開示の方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵癌、肝癌および腎細胞癌から成る群から選択される疾患を治療するためのものである。一実施形態において、本開示は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、肝線維症または血管肉腫を治療する方法を提供する。
【0042】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかであるが、これは限定として解釈されるべきでない。本出願全体において引用されるすべての参照内容、ＧｅｎＢａｎｋエントリ、特許および特許出願公開は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【図1】本開示の組換え抗体の構造を示す模式図である。
【0044】
【図2】本開示の組換え抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ図である。
【0045】
【図3】本開示の組換え抗体のＶＥＧＦ－１６５に対する結合活性を示す図である。
【0046】
【図4】本開示の組換え抗体のＰＤ－Ｌ１に対する結合活性を示す図である。
【0047】
【図5】ＶＥＧＦ－１６５およびＰＤ－Ｌ１に対する本開示の組換え抗体の同時結合活性を示す図である。
【0048】
【図6】ＩＭＭ２５１０のＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１に対するＡＤＣＣ活性を示す図である。
【0049】
【図7】ＶＥＧＦ－１６５存在下でのＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１に対するＩＭＭ２５１０のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【0050】
【図8】ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１異種移植モデルにおけるＩＭＭ２５０５のｉｎ ｖｉｖｏ治療効率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0051】
抗体療法は、癌を含む広範な疾患を治療するために様々な管轄領域で承認されており、患者の転帰を著しく改善している（Komeev KV et al., (2017) TLR-signaling and proinflammatory cytokines as drivers of tumorigenesis. Cytokine 89: 127-135）。疾患抗原と結合した抗体は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害を誘発したり、相補系を活性化したり、および／または、受容体がそのリガンドと相互作用するのを防止したりして、すべてが細胞死を引き起こす可能性がある。米国食品医薬品局で承認された抗体医薬品には、アレムツズマブ、ニボルマブ、リツキシマブおよびデュルバルマブがある。
【0052】
しかし、臨床研究では、多くの患者が単剤療法では十分な効果が得られないことが示されている。例えば、承認されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ）の全奏効率はわずか３３％である。さらに、数サイクルの治療後には、後天的な抗体耐性が生じることが多い。
【0053】
そのため、２つ以上の独立した固有の抗原、または同じ抗原の異なるエピトープに対する二重特異性または多特異性抗体が必要となる。
【0054】
本発明者は、鋭意実験の結果、ＰＤ－１媒介阻害シグナルによるＴ細胞への牽制または阻害を解除すること、血管の新生を禁止して免疫抑制を解除することで標的細胞増殖を制限すること、ＮＫ細胞およびマクロファージなどの免疫細胞による標的細胞の破壊を刺激することの３つの作用機序により、疾患を攻撃することができる新規の組換えタンパク質／抗体を発明した。
【0055】
本開示の組換えタンパク質は、１）抗ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖および抗ＰＤ－Ｌ１抗体軽鎖を含み、これら２つはＰＤ－Ｌ１と結合するためにジスルフィド結合で連結されており、および２）重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端にリンカを介して連結された血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外Ｉｇ様ドメインを含み、この組換えタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦおよびＦｃ受容体を同時に結合することができる。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインは、リンカを介して重鎖のＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインは、リンカを介して重鎖のＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインは、リンカを介して軽鎖のＮ末端に連結されている。重鎖のＦｃ断片は、ジスルフィド結合によって別のＦｃ断片と連結する。例えば、本開示の２つの組換えタンパク質は、ジスルフィド結合によって連結されて、本開示の組換え抗体を形成することになる。
【0056】
本開示の組換え抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外Ｉｇ様ドメインがリンカを介して各重鎖のＮ末端もしくはＣ末端に、または各軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端に連結しており、組換え抗体はＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦおよびＦｃＲを同時に結合することができる。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインは、各重鎖のＮ末端にリンカを介して連結されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインは、各重鎖のＣ末端にリンカを介して連結されている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインは、リンカを介して各軽鎖のＮ末端に連結されている。
【0057】
本願の発明者らは、驚くべきことに、抗体のＦｃ断片のＣ末端にポリペプチドが連結していても、ＦｃＲ結合能が抗体のＦｃ部分に残っていることを発見した。特に、本発明者らは、未発表の研究において、通常のＩｇ様抗体と２つのＶＥＧＦＲ１Ｄ２断片からなる組換え抗体を設計して調製し、２つのＶＥＧＦＲ１Ｄ２断片が、それぞれ抗体の２つのＦｃ断片に連結している。ＡＤＣＣアッセイにおいて、組換え抗体は正常抗体よりもやや低い活性で標的細胞を積極的に溶解し、組換え抗体の最大溶解率は約４５．０％、溶解ＥＣ５０は約６８．７１ｎｇ／ｍｌ、正常抗体の最大溶解率は約５８．０％、溶解ＥＣ５０は約４９．５５ｎｇ／ｍｌであった。その後のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍試験においては、正常抗体とＶＥＧＦＲ１Ｄ２－Ｆｃを併用した場合よりも、組換え抗体の方がより良い抗腫瘍効果を示した。
【0058】
本開示の組換えタンパク質／抗体に含まれる３つの主成分は、血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外Ｉｇ様ドメイン、リンカ、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。当業者であれば、上記３成分を選択するための設計の選択肢が多くあることを認識するであろう。非ヒト動物のタンパク質またはペプチドの強力な免疫原性はアレルギーおよびその他の副作用を引き起こし得るので、好ましくは、ヒト由来配列がヒトの疾患療法において使用される。しかしながら、異なる応用の目的に基づき、他の動物タンパク質またはペプチドも、必要に応じてヒト化されて本開示においても使用され得る。
【0059】
任意の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本開示の組換えタンパク質または抗体の形成において使用され得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブから成る群から選択される単離モノクローナル抗体であり得る。
【0060】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列識別番号１、３および５の核酸配列によってそれぞれコードされ得る、配列識別番号２または４のアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、配列識別番号６のアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを備える単離モノクローナル抗体である。抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＦａｂ部分（またはパラトープ）は、癌／腫瘍細胞などの標的細胞の細胞表面上のＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－Ｌ１と、Ｔ細胞の細胞表面上のＰＤ－１との相互作用を遮断でき、これにより、ＰＤ－１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対する牽制を解除する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＦｃ部分はＮＫ細胞またはマクロファージなどの免疫細胞の細胞表面上のＦｃＲに結合して、ＮＫ細胞およびマクロファージによる標的細胞破壊を促進できる。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は配列識別番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞の細胞表面上のＰＤ－１との相互作用を遮断でき、また、免疫細胞の細胞表面上のＦｃＲに結合でき、これにより、癌細胞などの標的細胞を破壊するようにこれらの細胞を活性化する。いくつかの実施形態において、軽鎖は配列識別番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞の細胞表面上のＰＤ－１との相互作用を遮断でき、また、免疫細胞の細胞表面上のＦｃＲに結合でき、これにより、癌細胞などの標的細胞を破壊するようにこれらの細胞を活性化する。
【0061】
ＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦ－Ａと結合することができる任意のＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３）の細胞外Ｉｇ様ドメインを、組換えタンパク質の構築のために選択してよい。一実施形態において、組換えタンパク質に含まれるＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ１であり、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインはＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）である。
【0062】
一実施形態において、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、配列識別番号７および８においてそれぞれ記載される核酸配列およびアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、配列識別番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、標的細胞、例えば、癌／腫瘍細胞によってまたはその周辺に発現されるＶＥＧＦに結合することができ、その結果、標的細胞の増殖を制限することができる。
【0063】
リンカは主に、ＶＥＧＦＲの細胞外Ｉｇ様ドメインと、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端との間のスペーサとして機能する。リンカは、ペプチド結合によって連結された、好ましくは５～３０アミノ酸のペプチド結合によって共に連結されるアミノ酸から作られ得る。ここで、アミノ酸は、天然に発生する２０アミノ酸から選択される。当業者であれば理解できるように、これらのアミノ酸のうち１または複数は、グリコシル化され得る。一実施形態において、５～３０アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、セリン、リシンから選択され得る。一実施形態において、リンカの大部分は、グリシンおよびアラニンなど、立体障害のないアミノ酸から作られる。例示的なリンカは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙｓ、（Ｇｌｙ）８、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ－Ａｌａ））およびポリアラニンである。下の例に示される好適なリンカの一例は、（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）、例えば－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３－および－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２－などである。
【0064】
リンカは非ペプチドリンカでもよい。例えば、‐ＮＨ‐、‐（ＣＨ２）ｓ‐Ｃ（Ｏ）‐などのアルキルリンカ（ｓ＝２～２０）を使用できる。これらのアルキルリンカは更に、低級アルキル（例えばＣ１‐４）、低級アシル、ハロゲン（例えばＣＩ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなど、任意の非立体障害基によって置換され得る。
【0065】
また、本開示は、組換えタンパク質または抗体をコードするポリヌクレオチド分子、および、組換えタンパク質または抗体を発現する発現ベクターを提供する。ベクターの例には、これらに限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、形質転換可能人工染色体（ＴＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）、およびヒト人工エピソーム染色体（ＨＡＥＣ）が含まれる。
【0066】
本開示は、上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされ得る。好適な宿主細胞として、大腸菌、酵母および他の真核生物が挙げられる。好ましくは、大腸菌、酵母または哺乳類の細胞株（ＣＯＳまたはＣＨＯなど）が使用される。
【0067】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本開示の組換えタンパク質または抗体を含む医薬組成物を提供する。組成物は任意で、別の抗体または薬剤など、１または複数の追加の薬学的有効成分を含み得る。本開示の医薬組成物はまた、例えば、別の免疫刺激剤、抗癌剤、抗ウイルス剤、またはワクチンなどとの併用療法において投与できる。
【0068】
医薬組成物は任意の数の賦形剤を含むことができる。使用できる賦形剤として、担体、表面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散助剤または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、着香剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切な賦形剤の選択と使用については、Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【0069】
医薬組成物における主要なビヒクルまたは担体は、本質的に水性でも非水性でもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、場合によっては注射において一般的な他の物質が添加されて得る、注射、生理食塩水、または人工脳脊髄液のための水であり得る。例えば、ビヒクルまたは担体は、中性緩衝生理食塩水、または、血清アルブミンと混合された生理食塩水であり得る。他の例示的な医薬組成物は、Ｔｒｉｓ緩衝液、または、酢酸塩緩衝液を含み、またはソルビトール、またはこれらの好適な置換物を更に含み得る。本開示の一実施形態において、組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、所望の純度を有する選択された組成物を任意の製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｓｕｐｒａ）と混合することによって、保管のために調製され得る。更に、治療用組成物は、スクロースなど適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化され得る。
【0070】
医薬組成物は、好ましくは（例えば注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に好適である。投与の経路に応じて、活性分子は、それを不活性化し得る酸または酵素および他の天然条件の作用から保護するための物質にコーティングされ得る。本明細書において使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。代替的に、本開示の抗体は、例えば、鼻腔内、口腔内、経膣、直腸、舌下または局所など、局所、表皮、または粘膜の投与経路などの非経口経路を介して投与できる。
【0071】
医薬組成物は、無菌水溶液または分散系の形態であり得る。また、それらはマイクロエマルション、リポソーム、または、高い薬剤濃度に好適な他の規則構造で製剤化され得る。
【0072】
単回投与形態を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される対象、および、特定の投与方法に応じて変動し、一般的に、治療効果を生じさせる組成物の量である。一般的に、１００％中、この量は有効成分の約０．０１％～約９９％、好ましくは、約０．１％～約７０％、もっとも好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わされる有効成分の約１％～約３０％の範囲である。
【0073】
最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように投与計画が調整される。例えば、いくつかの分割された用量を経時的に投与できる、または、治療状況の緊急事態による指示に応じて用量を比例的に減少または増加させることができる。投与を容易にするために、および、投与量を統一するために、単位用量形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される単位用量形態とは、治療される対象のための単位用量として好適な物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じさせるために算出された活性分子の予め定められた量を含む。組換えタンパク質は代替的に、徐放性製剤として投与できる。この場合、必要な投与頻度が少ない。
【0074】
組換えタンパク質の投与については、投与量は、宿主の体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。例えば、投与量は、体重あたり０．３ｍｇ／ｋｇ、体重あたり１ｍｇ／ｋｇ、体重あたり３ｍｇ／ｋｇ、体重あたり５ｍｇ／ｋｇ、または体重あたり１０ｍｇ／ｋｇ、または、１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療法は、１週間あたり２回、１週間あたり１回、２週間あたり１回、３週間あたり１回、４週間あたり１回、１か月あたり１回、３か月あたり１回、または、３～６か月あたり１回の投与を伴う。本開示の組換えタンパク質の好ましい投与計画は、腹腔内投与を介して体重あたり３ｍｇ／ｋｇ、または、体重あたり６ｍｇ／ｋｇを含み、タンパク質は、以下の投与スケジュール、すなわち、（ｉ）６回の投与は４週間ごと、その後３か月ごと、（ｉｉ）３週間ごと、（ｉｉｉ）体重あたり３ｍｇ／ｋｇを１回、その後、体重あたり１ｍｇ／ｋｇを３週間ごと、（ｖｉ）体重あたり６ｍｇ／ｋｇを１週間あたり１回投与のうち１つを使用して提供される。いくつかの方法において、約１～１０００μｇ／ｍｌ（いくつかの方法において、約２５～３００μｇ／ｍｌ）の血漿抗体濃度を達成するように、投与量が調整される。
【0075】
本開示の組換えタンパク質の「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、無疾患症状期間の頻度および期間の増加、または、疾患の苦痛に起因する機能障害または能力障害の予防を引き起こす。例えば、担癌の対象を治療する場合、「治療有効投与量」は好ましくは、未治療の対象と比較して、少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９９％だけ腫瘍増殖を阻害する。本開示の融合タンパク質の治療有効量は、腫瘍サイズを低減でき、または、そうでなければ、典型的にはヒトである、または別の哺乳類であり得る対象における症状を改善する。
【0076】
医薬組成物、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など、生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.」に参照。
【0077】
治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３； ５，３８３，８５１； ５，３１２，３３５； ５，０６４，４１３； ４，９４１，８８０； ４，７９０，８２４；および４，５９６，５５６号）、（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮装置（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）注入機器（米国特許第４，４４７，２３３および４，４４７，２２４号）、（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６および４，４７５，１９６号）などの医療装置を介して投与され得る。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0078】
特定の実施形態において、本開示の組換えタンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで適切に分布することを確実にするために製剤化され得る。例えば、本開示の治療用タンパク質が血液脳関門を超えることを確実にするために、それらは、特定の細胞または臓器への選択的輸送を強化する標的化部分を追加的に含み得るリポソームにおいて製剤化され得る。例えば、米国特許第４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；５，４１６，０１６および５，３９９，３３１号に参照。
【0079】
本開示の組換えタンパク質またはその誘導体をコードする核酸分子が対象に直接導入されるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法も考えられる。例えば、本開示の組換えタンパク質をコードする核酸配列が、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適切な送達ベクターを用いて、または用いず、核酸コンストラクトの局所注射を介して標的細胞に導入される。代替的なウイルスベクターは、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよび乳頭腫ウイルスベクターを含む。ウイルスベクターの物理的移入は、所望の核酸コンストラクト、または、所望の核酸配列を含む他の適切な送達ベクターの局所注射、リポソーム媒介移入、直接注射（ネイキッドＤＮＡ）、または微粒子ボンバードメント（遺伝子ガン）によってｉｎ ｖｉｖｏで達成され得る。
【0080】
本開示の組成物は、単独で、または、治療効果を強化するために、もしくは、潜在的な副作用を低減するために、他の治療剤と組み合わせて使用され得る。
【0081】
本開示の別の目的は、上記組換えタンパク質または組換え抗体、および、それを含む医薬組成物を調製するための方法を提供することである。一実施形態において、方法は、（１）ポリヌクレオチド分子をコードする組換えタンパク質を提供すること、（２）（１）のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを構築すること、（３）（２）の発現ベクターで好適な宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換して、タンパク質を発現させるために宿主細胞を培養すること、（４）タンパク質または抗体を精製することを含む。調製は、当業者によって、既知の技術を用いて実行され得る。
【0082】
本開示の別の目的は、上記医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者または対象に投与することを含む、本開示の医薬組成物を使用して疾患を治療する方法を提供することである。
【0083】
一実施形態において、医薬組成物は、これらに限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵癌、肝癌および腎癌を含む、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤ－Ｌ１過剰発現腫瘍または癌を治療するために使用される。
【0084】
一実施形態において、本開示は、ＶＥＧＦの過剰発現に関連する疾患を治療する方法を提供し、これには、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、肝線維症および血管肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【0085】
以下では非限定的な例を用いて、本開示を更に説明する。
【0086】
実施例
【0087】
下の説明において、ＩＭＭ２５は、ＰＤ－Ｌ１を標的化するモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体を指す。この抗体は、配列識別番号２のアミノ酸配列をそれぞれ持つ２本の重鎖と、配列識別番号６のアミノ酸配列をそれぞれ持つ２本の軽鎖を有している。
【0088】
ＩＭＭ２５１０は、２つのＶＥＧＦＲ１Ｄ２がそれぞれＧＳ－リンカを介して抗ＰＤ－Ｌ１抗体の各重鎖のＮ末端に連結したものを含む組換え抗体を指す。ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１重鎖はそれぞれ、配列識別番号１３の核酸配列によってコードされ、配列識別番号１４のアミノ酸配列を有している。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖は、配列識別番号６のアミノ酸配列を有している。
【0089】
ＩＭＭ２５０１１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の各重鎖のＣ末端に、それぞれＧＳ－リンカを介して連結した２つのＶＥＧＦＲ１Ｄ２を含む組換え抗体を指す。抗ＰＤ－Ｌ１重鎖－リンカ－ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、配列識別番号１５の核酸配列によってコードされ、アミノ酸配列と配列識別番号１６を有している。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖は、配列識別番号６のアミノ酸配列を有している。
【0090】
ＩＭＭ２５０３１は、２つのＶＥＧＦＲ１Ｄ２がそれぞれＧＳ－リンカを介して抗ＰＤ－Ｌ１抗体の各軽鎖のＮ末端に連結した組換え抗体を指す。ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－リンカ－抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖は、配列識別番号１７の核酸配列によってコードされ、配列識別番号１８のアミノ酸配列を有する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は、配列識別番号２のアミノ酸配列を有していた。
【0091】
ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃは、２つのＶＥＧＦＲ１Ｄ２を抗体Ｆｃ部分に連結させた組換えタンパク質である。各ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－Ｆｃ断片は、配列識別番号２２のアミノ酸配列を有しており、配列識別番号２１の核酸配列によってコードされていてもよい。
【0092】
これら４つの組換え抗体の基本構造を図１に示す。
【0093】
［例１：ＩＭＭ２５、ＩＭＭ２５０１１、ＩＭＭ２５０３１およびＩＭＭ２５１０を発現するベクターの構築］
【0094】
［１．１ ＩＭＭ２５］
【0095】
ＩＭＭ２５の全長コード配列を人工的に設計した。具体的には、マウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチドをコードする５７ヌクレオチド（配列識別番号１９）を抗ＰＤ－Ｌ１重鎖コード配列（配列識別番号１）の５'末端に加え、コザック配列（配列識別番号２０）をシグナルペプチド配列の５'末端に追加された。最後に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素認識部位がそれぞれ、結果として生じる配列の５'末端および３'末端に追加された。軽鎖については、同一のシグナル配列、および、コザック配列が使用されたが、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位がそれぞれ、結果として生じる配列に追加された。２つの結果として生じる配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＩＤ＃：Ｃ００１５ＢＪ１１０－１（重鎖）；Ｃ００１５ＢＪ１１０－２（軽鎖））によって合成され、それぞれｐＭａｃ－ＨおよびｐＭａｃ－Ｌベクターにサブクローニングされた。
【0096】
［１．２ ＩＭＭ２５１０］
【0097】
ＩＭＭ２５１０の全長コード配列を人工的に設計した。具体的には、重鎖については、ＶＥＧＦＲ１（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）の第２細胞外ドメインのコード配列（配列識別番号７）は、ＧＳ－リンカ（配列識別番号１１）を通じて、抗ＰＤ－Ｌ１重鎖コード配列（配列識別番号３）の５'末端に連結された。マウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチドをコードする５７ヌクレオチド（配列識別番号１９）は、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２コード配列の５'末端に追加され、コザック配列（配列識別番号２０）は、シグナルペプチド配列の５'末端に追加された。最後に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素認識部位がそれぞれ、結果として生じる配列の５'末端および３'末端に追加された。結果として生じる配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＩＤ＃：Ｃ９１４３ＤＡ１５０－１）によって合成され、ｐＭａｃ－Ｈベクターにサブクローニングされた。ＩＭＭ２５１０の軽鎖の発現ベクターは、ＩＭＭ２５のものと同一である。
【0098】
［１．３ ＩＭＭ２５０１１］
【0099】
ＩＭＭ２５０１１の全長コード配列を人工的に設計した。具体的には、重鎖については、ＶＥＧＦＲ１の第２細胞外ドメイン（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）のコード配列（配列識別番号７）の３'末端に、ＧＳ－リンカ（配列識別番号９）を介して抗ＰＤ－Ｌ１重鎖コード配列（配列識別番号３）のコード配列を連結し、生じる配列の５'末端および３'末端に、それぞれＮｈｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を追加した。生じる配列をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成し（ＩＤ#：Ｃ８３７９ＣＪ１７０－１）、ＩＭＭ２５重鎖発現ベクターにサブクローニングした。ＩＭＭ２５１０の軽鎖の発現ベクターは、ＩＭＭ２５のものと同一である。
【0100】
［１．４ ＩＭＭ２５０３１］
【0101】
ＩＭＭ２５０１１の全長コード配列を人工的に設計した。具体的には、軽鎖については、ＶＥＧＦＲ１の第２細胞外ドメイン（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）のコード配列（配列識別番号７）を、ＧＳ－リンカ（配列識別番号１１）を介して、抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖コード配列（配列識別番号５）の５'末端に連結した。マウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチドをコードする５７ヌクレオチド（配列識別番号１９）は、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２コード配列の５'末端に追加され、コザック配列（配列識別番号２０）は、シグナルペプチド配列の５'末端に追加された。最後に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位がそれぞれ、結果として生じる配列の５'末端および３'末端に追加された。結果として生じる配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＩＤ＃：Ｃ４６０８ＣＥ１５０－１）によって合成され、ｐＭａｃ－Ｌベクターにサブクローニングされた。ＩＭＭ２５０３１の重鎖の発現ベクターは、ＩＭＭ２５のものと同一である。
【0102】
［例２：組換え融合抗体の製造と品質解析］
【0103】
組換えタンパク質を製造するために、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）（ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ#２４７６５－１）をトランフェクタントとして用いて、発現ベクターをＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ（登録商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ#Ｒ８０００７）にトランスフェクトされた。細胞を約７－１０日間培養した後、細胞培養上清を採取し、親和性クロマトグラフィでタンパク質を精製した。組換えタンパク質の純度をＳＥＣ－ＨＰＬＣで解析した。
【0104】
図２のＳＥＣ－ＨＰＬＣ図では、本開示の３つの組換え抗体に大きな違いが示される。ＩＭＭ２５１０の純度が最も高く（９０．６７％）、次いでＩＭＭ２５０１１（８５．５８％）、ＩＭＭ２５０３１（７１．９７％）であった。ＩＭＭ２５０１１は凝集体の割合が高く（１５．４２％）、ＩＭＭ２５０３１は分解が多かった（２７．１１％）。
【0105】
［例３：ＶＥＧＦ－１６５に結合したリ組換え抗体］
【0106】
ＶＥＧＦの結合には、組換えヒトＶＥＧＦ－１６５（Ｃａｔ#１１０６６－ＨＮＡＨ，Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）をコーティングバッファ（製品コード：１００１３２９２８８ Ｃ３０４１－１００ＣＡＰ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で調製し、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃａｔ#４４２４０４，Ｎｕｎｃ（登録商標））に５０ｎｇ／ｗｅｌｌで移し、プレートを４℃の冷蔵庫に一晩置いておいた。その後、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄してから、連続希釈した組換え抗体と対照抗体（アバスチン）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした後、再びＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。ＨＲＰ－Ｒａｂｂｉｔ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｃａｔ#：３０９－０３６－００８，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）をプレートに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、プレートに基質を加え、１Ｎ Ｈ２Ｓ０４で色の変化を止めた後、プレートリーダで読み取った。
【0107】
図３に示すように、本開示の３つの組換え抗体は、ＶＡＧＦ－１６５に対して同様の結合活性を有していたが、アバスチンの結合活性よりも相対的に２～４倍低い値を示していた。
【0108】
［例４：ＰＤ－Ｌ１に結合した組換え抗体］
【0109】
ＰＤ－Ｌ１結合解析では、１×１０６／ｍｌのＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｏ社、Ｃａｔ#ＹＭＡＫ－Ｃ００６）１００μｌを、連続的に滴定した組換え抗体および対照抗体（アテゾリズマブおよびハーセプチン）１００μｌと一緒に、４oＣで４０分間インキュベートした。冷たいＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ共役抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ#Ｆ９５１２）とインキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ解析を行った。
【0110】
その結果、図４に示すように、ＩＭＭ２５０１１は、その構造から予想されるように、アテゾリズマブと同一の結合活性（アテゾリズマブのＥＣ５０＝０．２２ｎＭ、ＩＭＭ２５０１１のＥＣ５０＝０．２３ｎＭ）を示し、ＩＭＭ２５０３１（ＥＣ５０＝０．９６ｎＭ）およびＩＭＭ２５１０（０．８５ｎＭ）は、アテゾリズマブと同等の結合活性を示したが、アテゾリズマブと比較して相対的に４倍低い値を示した。
【0111】
［例５：ＶＥＧＦ－１６５とＰＤ－Ｌ１に同時に結合した組換え抗体］
【0112】
２つのターゲットに対する組換え抗体の同時結合活性を解析するために、１００μｌの１×１０６／ｍｌのＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｏ，Ｃａｔ#ＹＭＡＫ－Ｃ００６）を、１００μｌの順次に希釈したＩＭＭ２５１０と４℃で４５分間インキュベートした。細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、１００μｌの４０ｎＭビオチン共役ＶＥＧＦ－１６５（Ｃａｔ#１１０６６－ＨＮＡＨ，Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と４℃で４５分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ共役Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ#５５４０６０，Ｌｏｔ#６１６９６７３）により４℃でさらに４５分間染色した。洗浄後、細胞をＦＡＣＳ解析の対象とした。
【0113】
図５に示すように、ＩＭＭ２５１０の濃度を上げると、用量依存的に蛍光シグナルの増加が見られ、２つのターゲットが同時に結合していることが示唆された。ＩＭＭ２５１０の結合親和性（ＥＣ５０＝０．６３ ｎＭ）は、ＰＤ－Ｌ１を用いたシングルターゲット結合アッセイで見られたものと同様であった（ＥＣ５０＝０．８５ ｎＭ）。
【0114】
［例６：抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発した組換え抗体］
【0115】
標的細胞としてＣＦＳＥ標識Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｏ，Ｃａｔ#ＹＭＡＫ－Ｃ００７）６×１０５／ｍｌ，５０μｌを、ＦｃγＲＩＩＩａを安定的に発現しているエフェクタ細胞としてＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ#ＣＲＬ－２４０８）６×１０５／ｍｌ，１００μｌと１：２の割合で混合し、混合した細胞を５０μｌの順次に希釈したＩＭＭ２５１０またはＩＭＭ２５の存在下、５％ＣＯ２下、３７℃で４時間培養した。その後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ#Ｐ４１７０）を５μｇ／ｍｌの濃度で細胞培養液に加え、ＰＩシグナルのＦＡＣＳ解析を行った。
【0116】
ＡＤＣＣ活性がＶＥＧＦの結合に影響されないことを確認するために、低濃度（２５ｎｇ／ｍｌ）または高濃度（２５０ｎｇ／ｍｌ）のＶＥＧＦ－１６５タンパク質（Ｃａｔ#１１０６６－ＨＮＡＨ，Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、ＩＭＭ２５１０または対照抗体とともに細胞培養にそれぞれ加え、上記の手順でＡＤＣＣを解析した。
【0117】
ＡＤＣＣによる細胞溶解の割合を以下の式に基づいて算出した：溶解率（または％ＡＤＣＣ）＝（ＩＭＭ２５１０またはＩＭＭ２５を用いた％ＰＩ陽性細胞－陰性対照タンパク質を用いた％ＰＩ陽性細胞）／（１００－陰性対照タンパク質を用いた％ＰＩ陽性細胞）＊１００。
【0118】
図６に示すように、ＩＭＭ２５１０のＡＤＣＣ活性は、ＩＭＭ２５のそれと比較して６倍に減少した。これは、ＰＤ－Ｌ１結合親和性が相対的に低い（ＥＣ５０＝０．８５ｎＭ対ＩＭＭ２５のＥＣ５０＝０．２２ｎＭ）ためと考えられる。図７に示すように、アッセイにＶＥＧＦ－１６５を加えてもＩＭＭ２５１０のＡＤＣＣ活性は影響を受けず、さらに２つのターゲットが同時に、且つそれぞれに結合していることが示唆された。
【0119】
［例７：ＩＭＭ２５１０は良好な抗腫瘍効果を示した］
【0120】
Ｂ－ｈＰＤ－１ヒト化マウス（ＢＩＯＣＹＴＯＧＥＮ社）を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を評価した。ヒトＰＤ－Ｌ１を安定的に発現させたマウス大腸癌細胞（ＭＣ－３８）（ＭＣ３８－ＰＤ－Ｌ１、ＢＩＯＣＹＴＯＧＥＮ社）を無血清培地で調製し、６－８週齢のＢ－ｈＰＤ－１ヒト化マウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍体積が１００－２００ｍｍ３に達した時点で、マウスを無作為に５つのグループに分け、各グループに６匹ずつ配置した。マウスはそれぞれ、ＰＢＳ、ＩＭＭ２５（５．０ｍｇ／ｋｇ）、ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ（２．０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ２５１０（６．０ｍｇ／ｋｇ）、およびＩＭＭ２５（５．０ｍｇ／ｋｇ）とＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ（２．０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせで治療された。治療は週２回、４週間にわたって腹腔内で行われた。週２回、腫瘍体積と体重を測定した。
【0121】
腫瘍体積（Ｖ）が（長さ×幅２）／２として算出された。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、腫瘍増殖阻害率＝（投与群における１つの腫瘍体積の変化／対照群における腫瘍体積の変化）×１００％の式によって算出された。
【0122】
結果は平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表した。２群間の比較はＤｕｎｎｅｔｔの多重比較法で行い、Ｐ＜０．０５を有意とした。
【表1】
【0123】
腫瘍体積とＴＧＩは、表１と図８で確認できる。データによると、単剤を投与したマウスの腫瘍体積は、ＰＢＳ（平均値＝２９３４．０ｍｍ３）に比べて比較的ゆっくりと成長したが（２８日目の平均腫瘍体積：ＩＭＭ２５＝２１６８．０ｍｍ３、ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ＝２０８８．０ｍｍ３）、２つの単剤を組み合わせて投与したマウスの腫瘍体積は、単剤で投与したマウスに比べて有意にゆっくりと成長した（平均値＝１５５２．０ｍｍ３）。組換え抗体ＩＭＭ２５１０は、より強い効果で腫瘍増殖を阻害し（平均値＝７０６．０ｍｍ３）、併用療法よりもさらに有意に優れていた。
【0124】
［比較例１：ＨＴ－２９またはＮＣＬ－Ｈ１９７５の異種移植モデルにおけるＩＭＭ０４０４の抗腫瘍活性］
【0125】
本実施例のＩＭＭ０４０４は、それぞれＧＳ－リンカを介して各重鎖のＮ末端に抗ＥＧＦＲ抗体、エリビツクス、に連結した２つのＳＩＲＰαＤ１を含む組換え抗体である。ＳＩＲＰαＤ１－ＧＳ－リンカ－抗ＥＧＦＲ重鎖は、配列識別番号２３のアミノ酸配列を有する。抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖は、配列識別番号２４のアミノ酸配列を有する。
【0126】
ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃは、ＷＯ２０１６１６９２６１に記載されている、Ｆｃ断片に連結されたＳＩＲＰαＤ１からなる融合タンパク質である。この融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列識別番号２５に記載されている。
【0127】
ＨＴ－２９異種移植モデル
【0128】
ＨＴ－２９ヒト大腸癌細胞は、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ'ｓ ５Ａ培地を用いて、３７度、５％ＣＯ２で培養した。対数増殖期の細胞を収集し、１×ＰＢＳに再懸濁した。この懸濁液にＭａｔｒｉｇｅを１：１の体積比で加えて混合し、１ｍｌあたり３×１０７の細胞が含まれる混合液を得た。
【0129】
４０匹のマウスの右脇腹にＨＴ－２９細胞（１匹あたり３×１０６の細胞）を皮下注射した。腫瘍体積が１００－２００ｍｍ３に達した時点で、これらの動物を５つのグループに無作為に割り振り、各グループに８匹のマウスを配置した。マウスにはそれぞれ週１回、ＰＢＳ、ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ（１．２ｍｇ／ｋｇ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（２．０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ０４０４（２．７ｍｇ／ｋｇ）、ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ＋Ｅｒｂｉｔｕｘ（１．２ｍｇ／ｋｇ＋２．０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、４週間投与した。全部で４回の治療を行った。最初の投与日をＤａｙ０と定義した。週に２回、腫瘍体積と体重を測定した。
【0130】
腫瘍体積（Ｖ）が（長さ×幅２）／２として算出された。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、腫瘍増殖阻害率＝（投与群における１つの腫瘍体積の変化／対照群における腫瘍体積の変化）×１００％の式によって算出された。グループ間の差の算出には、スチューデントテストを用いた。
【表2】
【0131】
表２から見えるように、この異種移植モデルでは、ＩＭＭ０４０４は他のタンパク質よりも優れた抗腫瘍活性を示さなかった。
【0132】
ＮＣＩ－Ｈ１９７５異種移植モデル
【0133】
ＮＣＩ－Ｈ１９７５非小細胞肺癌細胞は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（ＧＩＢＣＯ， ＵＳ）を用いて、３７度、５％ＣＯ２で培養した。対数増殖期の細胞を収集し、１×１ＰＢＳ，１ｍｌあたり１×１０７の細胞でで再懸濁した。
【0134】
４０匹のＳＣＩＤマウスの右脇腹に、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞（１×１０６個／匹）を皮下注射した。腫瘍体積が１００－２００ｍｍ３に達した時点で、これらの動物を５つのグループに無作為に割り振り、各グループに８匹のマウスを配置した。マウスにはそれぞれ週１回、ＰＢＳ、ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ（２．７ｍｇ／ｋｇ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（５．０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ０４０４（６．０ｍｇ／ｋｇ）、ＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ＋Ｅｒｂｉｔｕｘ（２．７ｍｇ／ｋｇ＋５．０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３週間投与した。全部で３回の治療を行った。最初の投与日をＤａｙ０とした。週に２回、腫瘍体積と体重を測定した。
【0135】
腫瘍体積（Ｖ）が（長さ×幅２）／２として算出された。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、腫瘍増殖阻害率＝（投与群における１つの腫瘍体積の変化／対照群における腫瘍体積の変化）×１００％の式によって算出された。グループ間の差の算出には、スチューデントテストを用いた。
【表3】
【0136】
表３から見えるように、ＩＭＭ０４０４の抗腫瘍活性はＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃよりも優れていたが、エリビツクスやＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ＋エリビツクスには及ばなかった。
【0137】
本開示は、１または複数の実施形態と関連して上で説明されたが、本開示はこれらの実施形態に限定されず、本説明は、すべての代替形態、変更形態、等価形態を包含することが意図され、添付の請求項の思想および範囲内に含まれ得ることが理解されるべきである。本明細書において参照される引用はすべて、参照によって全体的に更に組み込まれる。
【0138】
本開示のいくつかの重要なアミノ酸配列を以下に列挙する。
【表4】
【0139】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】