特表 2022-523055 ＣＲＩＳＰＲ活性をモジュレートするための系および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-21

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ活性をモジュレートするための系および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220414BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20220414BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220414BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/11 Z ZNA

A61K31/7125

A61P43/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021543277

(86)(22)【出願日】2020-01-25

(85)【翻訳文提出日】2021-09-17

(86)【国際出願番号】 US2020015127

(87)【国際公開番号】W WO2020154714

(87)【国際公開日】2020-07-30

(31)【優先権主張番号】62/939,553

(32)【優先日】2019-11-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/797,122

(32)【優先日】2019-01-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/876,177

(32)【優先日】2019-07-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521324676

【氏名又は名称】シンテゴ コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ケルソ， リード

(72)【発明者】

【氏名】カールソン－スティーヴァーマー， ジャレド

(72)【発明者】

【氏名】ジョシ， サヒル

(72)【発明者】

【氏名】モーレス， トラヴィス

(72)【発明者】

【氏名】カディナ， アナスタシア

(72)【発明者】

【氏名】ウォーカー， ジョン アンドリュー ザ セカンド

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086NA14

4C086ZC80

(57)【要約】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成された配列を含むポリヌクレオチドが本発明で提供される。ポリヌクレオチドの１つまたは複数の修飾のモジュレーションを使用して、ポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性を調整することができる。本発明は例えば、以下を提供する：（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、（ｉｉｉ）前記ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含むポリヌクレオチドを切断する方法であって、前記ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップを含む、方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、（ｉｉｉ）前記ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含むポリヌクレオチドを切断する方法であって、前記ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップを含む、方法。

【請求項2】

前記切断因子がＵＶ光である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記切断因子が可視光線である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記切断可能なリンカーが、天然に存在する核酸ではない、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記切断可能なリンカーが、感光性リンカーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記感光性リンカーが、紫外線放射によって切断可能なものである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記感光性リンカーが、可視光線によって切断可能なものである、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記切断可能なリンカーが、

【化17】

（式中、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記切断可能なリンカーが、ホスホロアミダイトを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記切断可能なリンカーが、クマリンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記切断可能なリンカーが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に位置付けられている、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内または前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内、および５’から３’まで番号を付して前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記ポリヌクレオチドが、別の切断可能なリンカーを含み、前記ポリヌクレオチド内で、前記切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、別の切断可能なリンカーがヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

（ａ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、
（ｃ）可視光線によって切断可能な切断可能なリンカーと
を含むポリヌクレオチド。

【請求項20】

前記切断可能なリンカーが、

【化18】

（式中、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
を含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項21】

前記可視光線が、３８５ｎｍよりも長い波長を含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項22】

前記切断可能なリンカーが、クマリンを含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

前記ポリヌクレオチドが、別の切断可能なリンカーを含み、前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、前記別の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項25】

前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内または前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項26】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチドのステムループのループ内に存在する、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内、または、５’から３’まで番号を付して前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項28】

第２の切断可能なリンカーを含み、前記第１の切断可能なリンカーが前記ポリヌクレオチドの前記ネクサスのループ内にあり、前記第２の切断可能なリンカーが前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項29】

（ａ）請求項１から２８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に導入するステップと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップと
を含む方法。

【請求項30】

（ａ）の前に、請求項１から２８までに記載のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

（ａ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、
（ｃ）
（ｉ）前記ガイド配列内の最も５’側の塩基の３’側かつ（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドのテトラループの外側に位置付けられた切断可能なリンカーと
を含むポリヌクレオチド。

【請求項32】

前記切断可能なリンカーが、天然に存在する核酸ではない、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項33】

前記切断可能なリンカーが、ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項34】

前記切断可能なリンカーが、感光性リンカーを含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項35】

前記感光性リンカーが、紫外線放射によって切断可能なものである、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項36】

前記感光性リンカーが、可視光線によって切断可能なものである、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項37】

前記切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項38】

前記切断可能なリンカーが、

【化19】

（式中、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
を含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項39】

前記感光性リンカーが、ホスホロアミダイトを含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項40】

前記感光性リンカーが、クマリンを含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項41】

前記切断可能なリンカーが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に位置付けられている、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項42】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項43】

前記切断可能なリンカーが、ネクサスのループ内、または５’から３’まで番号を付してステムループ１のループ内に存在する、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項44】

前記切断可能なリンカーが、ネクサスのループ内、および５’から３’まで番号を付してステムループ１のループ内に存在する、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項45】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項46】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６および７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項47】

（ａ）請求項３１から４６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を導入するステップと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こすように構成された切断因子に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップと
を含む方法。

【請求項48】

（ａ）の前に、請求項３１から４６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成するステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

（ａ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、
（ｃ）第１の特定の修飾を受けて第１の修飾されたポリヌクレオチドを生成するように構成された第１のエレメントであって、第１の修飾されたポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合に、前記第１の特定の修飾を受けていないポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも高い標的特異的切断活性を有する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する、第１のエレメントと、
（ｄ）第２の特定の修飾を受けて第２の修飾されたポリヌクレオチドを生成するように構成された第２のエレメントであって、第２の修飾されたポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合に、前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的切断活性を有する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する、第２のエレメントと
を含むポリヌクレオチド。

【請求項50】

前記ガイド配列の５’側の配列エレメントをさらに含む、請求項４９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項51】

前記配列エレメントが、ＲＮＡを含む、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項52】

前記配列エレメントが、ステムループを形成する、請求項５０または５１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項53】

前記ステムループが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項54】

前記ステムループが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項55】

前記ステムループの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項56】

前記第１のエレメントが、第１の切断可能なリンカーを含む、請求項５０から５５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項57】

前記第１の切断可能なリンカーが、前記ガイド配列のすぐ５’側に位置付けられている、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項58】

前記第１の切断可能なリンカーが、光、小分子の存在、または細胞プロセスによって切断されやすいものである、請求項５６または５７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項59】

前記第１の切断可能なリンカーが、感光性リンカーを含む、請求項５６または５７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項60】

前記第１の切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含む、請求項５６または５７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項61】

前記第１の切断可能なリンカーが、

【化20】

（式中、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
を含む、請求項５６または５７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項62】

前記第２のエレメントが、前記第１のエレメントと同じ型のエレメントである、上記の請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

【請求項63】

前記第２のエレメントが、前記第１のエレメントとは異なる型のエレメントである、請求項４９から５９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項64】

前記ポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合に、前記第２のエレメントを有さないポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合と実質的に同様の標的特異的切断活性を含む、上記の請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

【請求項65】

前記第２のエレメントが、第２の切断可能なリンカーを含む、請求項４９から５９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項66】

前記第２の切断可能なリンカーが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列内に位置付けられている、請求項６５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項67】

前記第２の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項６６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項68】

請求項４９に記載のポリヌクレオチドの前記第１のエレメントに第１の特定の修飾を受けさせ、それにより、前記第１の修飾されたポリヌクレオチドを生成するステップを含む方法。

【請求項69】

前記第１の修飾されたポリヌクレオチドと前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成し、それにより、前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記ポリヌクレオチドが、前記ガイド配列の５’側の配列エレメントを含む、請求項６８または６９に記載の方法。

【請求項71】

前記配列エレメントが、ＲＮＡを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記配列エレメントが、ステムループを形成する、請求項７０または７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ステムループが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ステムループが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、請求項７２に記載の方法。

【請求項75】

前記ステムループの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、請求項７３に記載の方法。

【請求項76】

前記第１のエレメントが、第１の切断可能なリンカーを含む、請求項６８から７５までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記第１の切断可能なリンカーが、前記ガイド配列のすぐ５’側に位置付けられている、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記第１の切断可能なリンカーが、感光性リンカーを含む、請求項７６または７７に記載の方法。

【請求項79】

前記第１の特定の修飾が、前記切断可能なリンカーの特異的切断を含む、請求項７６から７８までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記第１のエレメントに前記第１の特定の修飾を受けさせるステップが、前記ポリヌクレオチドを光に曝露させることを含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項81】

前記光が、紫外線を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記第１のエレメントに前記第１の修飾を受けさせた後に、前記第２のエレメントに前記第２の特定の修飾を受けさせ、それにより、前記第２の修飾されたポリヌクレオチドを形成するステップをさらに含む、請求項６８から８１までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記第２のエレメントが、感光性リンカーを含む、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記第２の切断可能なリンカーが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列内に位置付けられている、請求項８２または８３に記載の方法。

【請求項85】

前記第２の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記第１の切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、前記第２の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項８４に記載の方法。

【請求項87】

前記ポリヌクレオチドが、第１のステムループを含み、前記切断可能なリンカーが、ネクサスまたは前記ポリヌクレオチドの５’末端から３’末端まで番号を付してステムループ１内に存在する、請求項８４に記載の方法。

【請求項88】

前記第２の切断可能なリンカーが、ネクサスのループまたはステムループ１のループ内に位置付けられており、ステムループに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記第１の切断可能なリンカーが、ネクサスのループ内にあり、前記第２の切断可能なリンカーが、ステムループ１のループ内にあり、ステムループに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項８７に記載の方法。

【請求項90】

前記第２のエレメントに前記第２の特定の修飾を受けさせるステップが、前記第１の修飾されたポリヌクレオチドを別の光に曝露させることを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項91】

前記別の光が、紫外線を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記別の光が、４２０ｎｍよりも長い光波長を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項93】

標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、前記ガイド配列の最も５’側の塩基の３’側に位置付けられた第１の切断可能なリンカーとを含み、前記切断可能なリンカーが、感光性リンカーを含まず、前記切断可能なリンカーが、核酸内に天然に存在しない、ポリヌクレオチド。

【請求項94】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない、請求項９３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項95】

前記第１の切断可能なリンカーが、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列内に位置付けられている、請求項９３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項96】

請求項９３に記載のポリヌクレオチドを、前記切断可能なリンカーを切断することが可能な薬剤に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップを含む方法。

【請求項97】

標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、前記ガイド配列の５’末端に共有結合により連結し、前記ガイド配列とハイブリダイズした配列エレメントと、前記配列エレメントと前記ガイド配列の５’末端の間に位置付けられた感光性基とを含むポリヌクレオチド。

【請求項98】

前記配列エレメントが、ＲＮＡを含む、請求項９７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項99】

前記配列エレメントが、ステムループを形成する、請求項９７または９８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項100】

前記ステムループが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、請求項９９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項101】

前記ステムループが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、請求項１００に記載のポリヌクレオチド。

【請求項102】

前記ステムループの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、請求項９９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項103】

前記感光性基が、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含む、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項104】

前記感光性基が、

【化21】

（式中、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
を含む、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項105】

（ａ）請求項９７から１０３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を導入するステップと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを光に曝露させ、それにより、前記ポリヌクレオチドを前記感光性リンカーにおいて切断するステップと
を含む方法。

【請求項106】

（ａ）の前に、請求項９７から１０３までに記載のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成するステップをさらに含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記ポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成するものである、請求項１０５に記載の方法。

【請求項108】

前記ポリヌクレオチドが、細胞内に存在しない、請求項１０５または１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記ポリヌクレオチドが、細胞内に存在する、請求項１０５または１０７に記載の方法。

【請求項110】

前記曝露により、前記ポリヌクレオチドと複合体を形成した前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の標的特異的切断活性が低下する、請求項１０７に記載の方法。

【請求項111】

標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列とＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列とを含むポリヌクレオチドを特異的に切断し、それにより、前記ポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素の標的特異的切断活性を低下させるステップを含む方法。

【請求項112】

前記ポリヌクレオチドが、切断可能なリンカーを含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記切断可能なリンカーが、感光性リンカーを含む、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記切断が、前記ポリヌクレオチドを前記感光性リンカーにおいて切断することを含む、請求項１１２に記載の方法。

【請求項115】

前記切断可能なリンカーが、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列内に位置付けられている、請求項１１２に記載の方法。

【請求項116】

前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記第１の切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、前記第２の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１１２に記載の方法。

【請求項118】

前記ポリヌクレオチドが、第１のステムループを含み、前記ポリヌクレオチドの５’末端から３’末端まで番号を付して、前記切断可能なリンカーが、ネクサスまたはステムループ１内に存在する、請求項１１７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項119】

前記第２の切断可能なリンカーが、ネクサスのループまたはステムループ１のループ内に位置付けられており、ステムループに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記第１の切断可能なリンカーが、ネクサスのループ内にあり、前記第２の切断可能なリンカーが、ステムループ１のループ内にあり、ステムループに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１１８に記載の方法。

【請求項121】

前記ポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲ酵素が、細胞内に存在しない、請求項１１１から１１６までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記ポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲ酵素が、細胞内に存在する、請求項１１１から１１６までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列とを含み、修飾を含むポリヌクレオチドであって、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合に、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した前記修飾を有さない前記ポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりもオフターゲット核酸分子に対する編集活性が低い第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される、ポリヌクレオチド。

【請求項124】

前記修飾が、標準的なヌクレオチド塩基を含まないリンカーを含む、請求項１２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項125】

前記修飾が、標準的なヌクレオチド塩基を含まないリンカーを少なくとも２つ含む、請求項１２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項126】

ｉｉ）の配列が、５’から３’まで、テトラループ、第１のステムループ、第２のステムループ、および第３のステムループを形成する、請求項１２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項127】

第４のステムループを含まない、請求項１２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項128】

前記ポリヌクレオチドの５’末端にはステムループを含まない、請求項１２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項129】

前記リンカーが、切断可能なリンカーを含む、請求項１２４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項130】

前記リンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含む、請求項１２９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項131】

前記リンカーが、

【化22】

（式中、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
を含む、請求項１２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項132】

前記修飾が前記ポリヌクレオチドの５７位または７４位にあり、１位が前記ガイド配列の５’末端に存在し、位置が５’から３’まで計数される、請求項１３０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項133】

前記修飾が、前記ポリヌクレオチドの５７位および７４位に存在する、請求項１３２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項134】

前記修飾が、前記テトラループのループ、前記第１のステムループ、前記第２のステムループ、または前記第３のステムループ内に存在する、請求項１２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項135】

前記修飾が、前記第１のステムループまたは前記第２のステムループ内に存在する、請求項１２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項136】

前記修飾が、前記第１のステムループのループまたは前記第２のステムループのループ内に存在する、請求項１３５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項137】

前記修飾が、５７位および７４位の一方または両方に存在し、１位が、前記ガイド配列の５’末端に存在し、位置が、５’から３’まで計数される、請求項１３５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項138】

前記修飾が、光切断可能な結合を含む、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項139】

前記修飾が、ステムループ内には存在しない、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項140】

最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項１２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項141】

前記編集活性が、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定される、請求項１２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項142】

前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体による前記オフターゲット核酸分子に対する編集活性が、前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低く、ｐ値≦０．０００１である、請求項１２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項143】

前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性と前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性が５％以内である、請求項１２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項144】

前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性および前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性が、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定される、請求項１４３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項145】

第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に供給するステップであって、前記第１の複合体が、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した請求項１２３に記載のポリヌクレオチドを含む、ステップと、前記細胞の標的配列を編集するステップであって、オフターゲット核酸分子に対する編集活性が、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した修飾を有さないポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い、ステップとを含む方法。

【請求項146】

請求項３１～４２、４９～６７、９３～９４、９７～１０２、または７０～１４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素。

【請求項147】

請求項３１～４２、４９～６７、９３～９４、９７～１０２、または７０～１４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび説明書を含むキット。

【請求項148】

請求項３１～４２、４９～６７、９３～９４、９７～１０２、または７０～１４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤。

【請求項149】

請求項１４８に記載の医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法。

【請求項150】

請求項３１～４２、４９～６７、９３～９４、９７～１０２、または７０～１４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを合成するステップを含む方法

【請求項151】

請求項３１～４２、４９～６７、９３～９４、９７～１０２、または７０～１４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入するステップを含む方法。

【請求項152】

請求項１２３から１４４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ複合体。

【請求項153】

請求項１２３から１４４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび説明書を含むキット。

【請求項154】

請求項１５２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体および説明書を含むキット。

【請求項155】

請求項１２３から１４４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む医薬製剤。

【請求項156】

薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１５５に記載の医薬製剤。

【請求項157】

請求項１５２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を含む医薬製剤。

【請求項158】

薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１５７に記載の医薬製剤。

【請求項159】

請求項１２３から１４４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入するステップを含む方法。

【請求項160】

請求項１５９に記載の細胞を含む医薬製剤。

【請求項161】

薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１６０に記載の医薬製剤。

【請求項162】

請求項１５２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に導入するステップを含む方法。

【請求項163】

請求項１５５から１５７までのいずれか一項に記載の医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法。

【請求項164】

前記ＣＲＩＳＰＲ複合体により前記標的配列が編集される、請求項１６２に記載の方法。

【請求項165】

式（Ｉ）：

【化23】

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くは、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、２から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはジシアノメチレンから選択され、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
のリンカーを含むヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。

【請求項166】

前記式（Ｉ）のリンカーが、式（Ｉ’）：

【化24】

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^２、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くは、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、請求項１６５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。

【請求項167】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、Ｃ_１～６アルキルである、請求項１６６に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。

【請求項168】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、それぞれエチルである、請求項１６６に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。

【請求項169】

【化25】

（式中、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
を含む化合物。

【請求項170】

請求項１６９に記載の化合物を含むポリヌクレオチド。

【請求項171】

ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合するように構成された配列をさらに含む、請求項１７０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項172】

標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列をさらに含む、請求項１７１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項173】

ＣＲＩＳＰＲ酵素および請求項１７０から１７２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体。

【請求項174】

式（Ｉ）：

【化26】

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くは、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、２から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはジシアノメチレンから選択され、
＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、
＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）
を含む化合物。

【請求項175】

式（Ｉ）が、式（Ｉ’）：

【化27】

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^２、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くは、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
で表される、請求項１７４に記載の化合物。

【請求項176】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、Ｃ_１～６アルキルである、請求項１７５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。

【請求項177】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、それぞれエチルである、請求項１７５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１月２５日出願の米国仮特許出願第６２／７９７，１２２号、２０１９年７月１９日出願の米国仮特許出願第６２／８７６，１７７号、および２０１９年１１月２２日出願の米国仮特許出願第６２／９３９，５５３号の優先権を主張するものである。

【背景技術】

【0002】

核酸編集を遺伝子疾患の処置に使用することができる。最先端の編集機構は、機構の標的細胞への送達、および編集機構が細胞に導入された際のどちらに関しても、本質的に制御できないものであり得る。この制御できないことに起因して、修飾がゲノム内の望ましくない場所に導入される可能性があり、これは、オフターゲット効果として公知である。Ｃａｓヌクレアーゼの望ましくないオフターゲット活性により、染色体転座を含めた破局的な生物学的事象が導かれる恐れがある。ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の活性により、ｉｎ ｖｉｖｏ編集に対する難題も創出される可能性がある。さらに、生物体への全身送達により、所望の細胞型ならびに意図されたものではない細胞型におけるオンターゲット編集が生じる可能性がある。したがって、ゲノム編集の特異性を改善することが、科学的および治療的関心のある話題である。

【0003】

プログラム可能な核酸編集には、広範な生物学的適用および治療的適用があり得る。プログラム可能な核酸編集とは、活性およびゲノムまたはトランスクリプトームにわたる種々の標的部位の認識をますます精密に制御するための、ヌクレアーゼに基づくプラットフォーム、例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と、標的核酸分子の標的配列とアニーリングするように構成された配列およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合するように構成された配列を含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとを含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰなどを工学的に作製できることを指し得る。

【0004】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを修飾することは、プログラム可能なゲノム編集の実行可能かつ強力な代替手法になり得る。オフターゲット編集活性の低下およびゲノム編集活性の制御できる誘導および休止ならびにＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド複合体の持続性を可能にする、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

一態様では、（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、（ｉｉｉ）ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含むポリヌクレオチドを切断する方法であって、ポリヌクレオチドを切断因子（ｃｌｅａｖａｇｅ ａｇｅｎｔ）に曝露させ、それにより、切断可能なリンカーを切断するステップを含む、方法が本発明で提供される。切断因子は、ＵＶ光であり得る。切断因子は、可視光線であり得る。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、天然に存在する核酸ではない。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない。切断可能なリンカーは、感光性リンカーを含み得る。感光性リンカーは、紫外線放射によって切断可能なものであり得る。感光性リンカーは、可視光線によって切断可能なものであり得る。切断可能なリンカーは、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。切断可能なリンカーは、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピルを含み得る。切断可能なリンカーは、

【化1】

（式中、＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）を含み得る。感光性リンカーは、ホスホロアミダイトを含み得る。感光性リンカーは、クマリンを含み得る。切断可能なリンカーは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に位置付けることができる。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。ポリヌクレオチドは、５’から３’まで、テトラループ、ネクサス、ステムループ１、およびステムループ２を含み得、切断可能なリンカーは、ネクサスのループまたはステムループ１のループ内に存在する。切断可能なリンカーは、ネクサスのループ内、または５’から３’まで番号を付してステムループ１のループ内に存在し得る。テトラループは、ヌクレオチド２１～５１を含み得る。ネクサスは、ヌクレオチド５２～６２を含み得る。ステムループ１は、ヌクレオチド６８～８１を含み得る。ステムループ２は、ヌクレオチド８１～９７を含み得る。切断可能なリンカーは、ネクサスのループ内、および５’から３’まで番号を付してステムループ１のループ内に存在し得る。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。切断可能なリンカーは、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けることができ、別の切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。

【0006】

別の態様では、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、４２０ｎｍよりも長い波長の光によって切断可能な切断可能なリンカーとを含むポリヌクレオチドが本発明で提供される。切断可能なリンカーは、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピルを含み得る。切断可能なリンカーは、

【化2】

（式中、＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）を含み得る。切断可能なリンカーは、クマリンを含み得る。切断可能なリンカーは、ホスホロアミダイトを含み得る。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。ポリヌクレオチドは、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み得、切断可能なリンカーは、ネクサスのループまたはステムループ１のループ内に存在する。切断可能なリンカーは、ネクサスのループ内、および５’から３’まで番号を付してステムループ１のループ内に存在し得る。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。ポリヌクレオチドは、別の切断可能なリンカーを含み得、ポリヌクレオチド内で切断可能なリンカーがヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、別の切断可能なリンカーがヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。第１の切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けることができ、第２の切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。

【0007】

別の態様では、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、可視光線によって切断可能な切断可能なリンカーとを含むポリヌクレオチドが本発明で提供される。切断可能なリンカーは、

【化3】

（式中、＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）を含み得る。可視光線は、３８５ｎｍよりも長い波長を含み得る。切断可能なリンカーは、クマリンを含み得る。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。ポリヌクレオチドは、別の切断可能なリンカーを含み得、切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、別の切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。ポリヌクレオチドは、５’から３’まで、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み得、切断可能なリンカーは、ネクサスのループまたはステムループ１のループ内に存在する。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチドのステムループのループ内に存在し得る。切断可能なリンカーは、ネクサスのループ内、または５’から３’まで番号を付してステムループ１のループ内に存在し得る。ポリヌクレオチドは、第２の切断可能なリンカーを含み得、第１の切断可能なリンカーはネクサスのループ内にあり、第２の切断可能なリンカーはポリヌクレオチドのステムループ１のループ内に存在する。

【0008】

別の態様では、上述のポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に導入するステップと、ポリヌクレオチドを切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）に曝露させ、それにより、切断可能なリンカーを切断するステップとを含む方法が本発明で提供される。方法は、（ａ）の前に、上述のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成するステップをさらに含み得る。

【0009】

別の態様では、ポリヌクレオチドを光に曝露させ、それにより、ポリヌクレオチドを感光性リンカーにおいて切断するステップを含む方法が本発明で提供される。ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成し得る。ポリヌクレオチドは、細胞内に存在し得る。ポリヌクレオチドは、細胞の外側に存在し得る。曝露により、ポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素の標的特異的切断活性が低下し得る。

【0010】

別の態様では、（ａ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、（ｃ）（ｉ）ガイド配列内の最も５’側の塩基の３’側かつ（ｉｉ）ポリヌクレオチドのテトラループの外側に位置付けられた切断可能なリンカーとを含むポリヌクレオチドが本発明で提供される。切断因子は、ＵＶ光であり得る。切断因子は、可視光線であり得る。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、天然に存在する核酸ではない。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない。切断可能なリンカーは、感光性リンカーを含み得る。感光性リンカーは、紫外線放射によって切断可能なものであり得る。感光性リンカーは、可視光線によって切断可能なものであり得る。切断可能なリンカーは、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。切断可能なリンカーは、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピルを含み得る。切断可能なリンカーは、

【化4】

（式中、＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）を含み得る。切断可能なリンカーは、感光性リンカーであり得る。感光性リンカーは、ホスホロアミダイトを含み得る。感光性リンカーは、クマリンを含み得る。切断可能なリンカーは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に位置付けることができる。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。切断可能なリンカーは、ネクサスのループ内、または５’から３’まで番号を付してステムループ１のループ内に存在し得る。切断可能なリンカーは、ネクサスのループ内、および５’から３’まで番号を付してステムループ１のループ内に存在し得る。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６および７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。

【0011】

別の態様では、上述のポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を導入するステップと、ポリヌクレオチドを、切断可能なリンカーの切断を引き起こすように構成された切断因子に曝露させ、それにより、切断可能なリンカーを切断するステップとを含む方法が本発明で提供される。方法は、（ａ）の前に、上述のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成するステップをさらに含み得る。

【0012】

別の態様では、（ａ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、（ｃ）第１の特定の修飾を受けて第１の修飾されたポリヌクレオチドを生成するように構成された第１のエレメントであって、第１の修飾されたポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合に、第１の特定の修飾を受けていないポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも高い標的特異的切断活性を有する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する、第１のエレメントと、（ｄ）第２の特定の修飾を受けて第２の修飾されたポリヌクレオチドを生成するように構成された第２のエレメントであって、第２の修飾されたポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合に、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的切断活性を有する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する、第２のエレメントとを含むポリヌクレオチドが本発明で提供される。ポリヌクレオチドは、ガイド配列の５’側の配列エレメントを含み得る。配列エレメントは、ＲＮＡを含み得る。配列エレメントは、ステムループを形成し得る。一部の実施形態では、ステムループは、ガイド配列に対する塩基対を含まない。ステムループは、ガイド配列に対する塩基対を含み得る。ステムループの最も５’側の塩基は、ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングし得る。第１のエレメントは、第１の切断可能なリンカーを含み得る。第１の切断可能なリンカーは、ガイド配列のすぐ５’側に位置付けることができる。第１の切断可能なリンカーは、光、小分子の存在、または細胞プロセスによって切断されやすいものであり得る。第１の切断可能なリンカーは、感光性リンカーを含み得る。第１の切断可能なリンカーは、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。第１の切断可能なリンカーは、

【化5】

（式中、＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）を含み得る。第２のエレメントは、第１のエレメントと同じ型のエレメントであり得る。第２のエレメントは、第１のエレメントとは異なる型のエレメントであり得る。ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合に、第２のエレメントを有さないポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合と実質的に同様の標的特異的切断活性を含み得る。第２のエレメントは、第２の切断可能なリンカーを含み得る。第２の切断可能なリンカーは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列内に位置付けることができる。第２の切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ここで、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり得、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。

【0013】

別の態様では、上述のポリヌクレオチドの第１のエレメントに第１の特定の修飾を受けさせ、それにより、第１の修飾されたポリヌクレオチドを生成するステップを含む方法が本発明で提供される。方法は、第１の修飾されたポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成し、それにより、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するステップをさらに含み得る。ポリヌクレオチドは、ガイド配列の５’側の配列エレメントを含み得る。配列エレメントは、ＲＮＡを含み得る。配列エレメントは、ステムループを形成し得る。一部の実施形態では、ステムループは、ガイド配列に対する塩基対を含まない。ステムループは、ガイド配列に対する塩基対を含み得る。ステムループの最も５’側の塩基は、ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングし得る。第１のエレメントは、第１の切断可能なリンカーを含み得る。第１の切断可能なリンカーは、ガイド配列のすぐ５’側に位置付けることができる。第１の切断可能なリンカーは、感光性リンカーを含み得る。第１の特定の修飾は、切断可能なリンカーの特異的切断を含み得る。第１のエレメントに第１の特定の修飾を受けさせるステップは、ポリヌクレオチドを光に曝露させることを含み得る。光は、紫外線を含み得る。方法は、第１のエレメントに第１の修飾を受けさせた後に、第２のエレメントに第２の特定の修飾を受けさせ、それにより、第２の修飾されたポリヌクレオチドを形成するステップをさらに含み得る。第２のエレメントは、感光性リンカーを含み得る。第２の切断可能なリンカーは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列内に位置付けることができる。第２の切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ここで、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり得、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。第１の切断可能なリンカーは、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けることができ、第２の切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ここで、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり得、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。ポリヌクレオチドは、第１のステムループを含み得、切断可能なリンカーは、ネクサス内、またはポリヌクレオチドの５’末端から３’末端まで番号を付してステムループ１内に存在し得る。第２の切断可能なリンカーは、ネクサスのループ内またはステムループ１のループ内に位置付けることができ、ステムループに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。第１の切断可能なリンカーはネクサスのループ内に位置付けることができ、第２の切断可能なリンカーはステムループ１のループ内に位置付けることができ、ステムループに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。第２のエレメントに第２の特定の修飾を受けさせるステップは、第１の修飾されたポリヌクレオチドを別の光に曝露させることを含み得る。別の光は、紫外線を含み得る。別の光は、４２０ｎｍよりも長い光波長を含み得る。

【0014】

別の態様では、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、ガイド配列の最も５’側の塩基の３’側に位置付けられた第１の切断可能なリンカーとを含み、切断可能なリンカーが、感光性リンカーを含まず、切断可能なリンカーが、核酸内に天然に存在しない、ポリヌクレオチドが本発明で提供される。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない。第１の切断可能なリンカーは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列内に位置付けることができる。

【0015】

別の態様では、上述のポリヌクレオチドを、切断可能なリンカーを切断することが可能な薬剤に曝露させ、それにより、切断可能なリンカーを切断するステップを含む方法が本明細書に開示される。

【0016】

別の態様では、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列と、ガイド配列の５’末端に共有結合により連結し、ガイド配列とハイブリダイズした配列エレメントと、配列エレメントとガイド配列の５’末端の間に位置付けられた感光性基とを含むポリヌクレオチドが本明細書に開示される。配列エレメントは、ＲＮＡを含み得る。配列エレメントは、ステムループを形成する。一部の実施形態では、ステムループは、ガイド配列に対する塩基対を含まない。ステムループは、ガイド配列に対する塩基対を含み得る。ステムループの最も５’側の塩基は、ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングし得る。感光性基は、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。感光性基は、

【化6】

（式中、＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）を含み得る。

【0017】

別の態様では、上述のポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を導入するステップと、ポリヌクレオチドを光に曝露させ、それにより、ポリヌクレオチドを感光性リンカーにおいて切断するステップと方法が本明細書に開示される。方法は、（ａ）の前に、上述のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成するステップを含み得る。ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞内に存在しない。ポリヌクレオチドは、細胞内に存在し得る。曝露により、ポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素の標的特異的切断活性が低下し得る。

【0018】

別の態様では、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列とＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列とを含むポリヌクレオチドを特異的に切断し、それにより、ポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素の標的特異的切断活性を低下させるステップを含む方法が本明細書に開示される。ポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーを含み得る。切断可能なリンカーは、感光性リンカーを含み得る。切断は、ポリヌクレオチドを感光性リンカーにおいて切断することを含み得る。切断可能なリンカーは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列内に位置付けることができる。切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ここで、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり得、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。第１の切断可能なリンカーは、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けることができ、第２の切断可能なリンカーは、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けることができ、ここで、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり得、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。ポリヌクレオチドは、第１のステムループを含み得、切断可能なリンカーは、ネクサス内、またはポリヌクレオチドの５’末端から３’末端まで番号を付してステムループ１内に存在し得る。第２の切断可能なリンカーは、ネクサスのループ内またはステムループ１のループ内に位置付けることができ、ステムループに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。第１の切断可能なリンカーはネクサスのループ内に位置付けることができ、第２の切断可能なリンカーはステムループ１のループ内に位置付けることができ、ステムループに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、細胞内に存在しない。ポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、細胞内に存在し得る。

【0019】

別の態様では、（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するように構成された配列とを含み、修飾を含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成し得る場合、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され得、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した修飾を有さないポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い、ポリヌクレオチドが本明細書に開示される。修飾は、標準的なヌクレオチド塩基を含まないリンカーを含み得る。修飾は、標準的なヌクレオチド塩基を含まない少なくとも２つのリンカーを含み得る。ｉｉ）の配列は、５’から３’まで、テトラループ、第１のステムループ、第２のステムループ、および第３のステムループを形成し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第４のステムループを含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端にはステムループを含まない。リンカーは、切断可能なリンカーを含み得る。リンカーは、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。リンカーは、

【化7】

（式中、＊は、Ｈの付着点または第１のヌクレオチドを示し、＊＊は、ＯＨの付着点または第２のヌクレオチドを示す）を含み得る。修飾は、ポリヌクレオチドの５７位または７４位に存在し得、ここで、１位はガイド配列の５’末端にあり得、位置は、５’から３’まで計数される。修飾は、ポリヌクレオチドの５７位および７４位に存在し得る。修飾は、テトラループ、第１のステムループ、第２のステムループ、または第３のステムループのループ内に存在し得る。修飾は、第１のステムループ内または第２のステムループ内に存在し得る。修飾は、第１のステムループのループ内または第２のステムループのループ内に存在し得る。修飾は、５７位および７４位の一方または両方に存在し得、ここで、１位はガイド配列の５’末端にあり得、位置は、５’から３’まで計数される。修飾は、光切断可能な結合を含み得る。一部の実施形態では、修飾は、ステムループ内には存在しない。ポリヌクレオチドは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る。編集活性は、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定することができる。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体によるオフターゲット核酸分子に対する編集活性は、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低いものであり得、ｐ値≦０．０００１である。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性と第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性は、５％以内である。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性は、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定される。

【0020】

別の態様では、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に供給するステップであって、第１の複合体が、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した上述のポリヌクレオチドを含み得る、ステップと、細胞の標的配列を編集するステップであって、オフターゲット核酸分子に対する編集活性が、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した修飾を有さないポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低いものであり得る、ステップとを含む方法が本発明で提供される。

【0021】

別の態様では、上記のポリヌクレオチドのいずれかと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素が本発明で提供される。別の態様では、上記のポリヌクレオチドのいずれかと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む医薬製剤が本発明で提供される。別の態様では、上述のポリヌクレオチドのいずれか、および説明書を含むキットが本発明で提供される。別の態様では、上述のポリヌクレオチドのいずれか、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤が本発明で提供される。別の態様では、医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法が本発明で提供される。別の態様では、上述のポリヌクレオチドのいずれかを合成するステップを含む方法が本発明で提供される。別の態様では、上述のポリヌクレオチドのいずれかを細胞に導入するステップを含む方法が本発明で提供される。上述のポリヌクレオチドのいずれかを細胞に導入するステップを含む方法が本明細書に開示される。別の態様では、上述の細胞を含む医薬製剤が本発明で提供される。

【0022】

別の態様では、式（Ｉ）：

【化8】

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、ｍは、１から１０までから選択される整数であり得、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｈ、ＯＴＢＤＭＳ（Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルエーテル）、ジシアノメチレンまたはＯＭｅから選択され得、＊は、Ｈの付着点またはペントース部分を示し得、＊＊は、ＯＨの付着点またはヌクレオチドのリン酸基を示し得る。式（Ｉ）のリンカーは、式（Ｉ’）：

【化9】

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；あるいは、Ｒ^２、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くは、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し得、Ｘは、酸素であり得る）によって表され得る。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり得、Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂは、Ｃ_１～６アルキルであり得る。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ、Ｈであり得る；ならびにＲ^３ａ、およびＲ^３ｂは、それぞれ、エチルであり得る。

【0023】

別の態様では、

【化10】

を含む化合物が本発明で提供される。上述の化合物を含むポリヌクレオチドが本明細書に開示される。ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合するように構成された配列をさらに含み得る。ポリヌクレオチドは、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列をさらに含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素と上述のポリヌクレオチドで構成されるＣＲＩＳＰＲ複合体が本明細書に開示される。

【0024】

別の態様では、式（Ｉ）：

【化11】

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、ｍは、１から１０までから選択される整数であり得、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｈ、ＯＴＢＤＭＳ（Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルエーテル）、ジシアノメチレンまたはＯＭｅから選択され得、＊は、Ｈの付着点またはペントース部分を示し得、＊＊は、ＯＨの付着点またはヌクレオチドのリン酸基を示し得る）を含む化合物が本明細書に記載される。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ’）：

【化12】

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；あるいは、Ｒ^２、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くは、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、Ｘは、酸素であり得る。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり得、Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂは、Ｃ_１～６アルキルであり得る。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ、Ｈであり得る；ならびにＲ^３ａ、およびＲ^３ｂは、それぞれ、エチルであり得る）によって表され得る。
参照による組込み

【0025】

本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。

【0026】

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の詳細な説明および付属図を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られよう。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】図１Ａ～１Ｃは、ＣＲＩＳＰＲオン（ＣＲＩＳＰＲ－ＯＮ）標的切断活性の活性化の例示的なモデルを示す図である。図１Ａは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質であるＣａｓ９と複合体を形成した標準的なｓｇＲＮＡの５’末端に位置する付加されたステムループ構造を含むＣＲＩＳＰＲオン単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を例示する。ステムループ構造により、複合体の活性を抑止し、その結果、不活性型（ｉｎａｃｔｉｖｅ）複合体をもたらすことができる。切断因子の添加（図１Ｂ）により、ステムループ構造を遊離させ（図１Ｃ）、それにより、ゲノム編集を生じさせることを可能にし得る活性型（ＯＮ）複合体を生成することができる。

【0028】

【図2】図２は、活性化可能なＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡバリアントの切断の有効性を示す図である。ＵＶの影響を受けやすい切断可能なリンカーによってガイド配列と分離された５’ステムループエレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡを、ＵＶ光に０分間、５分間、１０分間、または１５分間曝露させた。１５分間の曝露後、ｓｇＲＮＡは、ガイド配列の５’側の配列の切断と一致する横縞模様を示した。「対照」レーンは、ガイド配列の５’側にいかなる追加的な配列も有さないｓｇＲＮＡであり、「第２なし（Ｎｏ ２ｎｄ）」条件は、ガイド配列に対するステムを形成しない５’付加を伴うｓｇＲＮＡを使用したものである。「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」条件は、ガイド配列の５’末端にそれぞれ３ｂｐおよび６ｂｐの長さのステム領域を有するように設計されたｓｇＲＮＡを使用するものである。

【0029】

【図3】図３は、標的ＤＮＡ切断に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡ活性化の有効性を示すグラフである。切断可能な５’ステムループを有するＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡを、標的ＤＮＡ（ヒトＦＡＮＣＦ）と一緒に１時間インキュベートし、切断因子であるＵＶＡ光（３２０～３９０ｎｍ）に規則的な間隔で曝露させた。「Ｍｏｄｓ」は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、ガイド配列の５’へのいかなる塩基付加も有さないように修飾されたｓｇＲＮＡである。ｓｇＲＮＡに対する標準の修飾は含む。「二次構造なし（Ｎｏ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）」条件は、ガイド配列に対するステムを形成しない５’付加を伴うｓｇＲＮＡを使用したものである。「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」条件は、ｓｇＲＮＡの５’末端に、それぞれ３ｂｐおよび６ｂｐのステム領域を形成するように設計された配列を有するｓｇＲＮＡを使用するものである。

【0030】

【図4】図４は、非活性化可能なＣＲＩＳＰＲオフ（ＣＲＩＳＰＲ－ＯＦＦ）ｓｇＲＮＡバリアントの切断の有効性を示す図である。５つの異なる切断点を有するｓｇＲＮＡを切断因子（ＵＶ光）に０分間（左側）または５分間（右側）晒した。

【0031】

【図5】図５は、ｓｇＲＮＡにおける切断可能なリンカーの位置を例示する概略図である。

【0032】

【図6】図６は、細胞におけるゲノム編集効率の時間依存的なＣＲＩＳＰＲオフ非活性化の概略図を示すグラフである。非活性化可能なｓｇＲＮＡバリアントをトランスフェクトした細胞をＲＮＰ送達後の時点でＵＶ光を用いて処理し、ＲＮＰ送達後に合計４８時間、編集、修復、および回復を生じさせた。４８時間後、ゲノムＤＮＡを全ての試料から収集し、インデルの存在について分析した。２種のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡ（５７および７４）でゲノム編集効率の時間依存的な非活性化が示された。

【0033】

【図7】図７は、ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を使用して遺伝子配列を切断する実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

【0034】

【図8】図８は、標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して遺伝子配列を切断する、図７に対応する実験に対する対照としての実験実行の結果を示すグラフである。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

【0035】

【図9】図９は、ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を使用して遺伝子配列を切断する実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

【0036】

【図10】図１０は、標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して遺伝子配列を切断する、図９に対応する実験に対する対照としての実験実行の結果を示すグラフである。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

【0037】

【図11】図１１は、ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を使用して遺伝子配列を切断する実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

【0038】

【図12】図１２は、標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して遺伝子配列を切断する、図１１に対応する実験に対する対照としての実験実行の結果を示す。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

【0039】

【図13】図１３は、３種の遺伝子標的にわたって、上位の予測されるオフターゲット部位において、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡまたは修飾ｓｇＲＮＡのいずれかを使用したオフターゲット編集活性を比較する一連の散布図である。ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡでは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むようにだけ編集されたｓｇＲＮＡよりも有意に少ないオフターゲットインデルが引き起こされた（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、スチューデントの対応のないｔ検定、ｎ＝２４の技術的反復実験）。

【0040】

【図14】図１４は、ＤＮＭＴ１を標的とするＣＲＩＳＰＲオフ複合体の時間依存的な編集活性を、ＤＮＭＴ１を標的とする標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体と比較して示すグラフである。

【0041】

【図15】図１５は、ＧＲＫ１を標的とするＣＲＩＳＰＲオフ複合体の時間依存的な編集活性を、ＧＲＫ１を標的とする標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体と比較して示すグラフである。

【0042】

【図16】図１６は、ＶＥＧＦＡを標的とするＣＲＩＳＰＲオフ複合体の時間依存的な編集活性を、ＶＥＧＦＡを標的とする標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体と比較して示すグラフである。

【0043】

【図17】図１７は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対して修飾を行うことができる例示的な位置を例示する図である。

【0044】

【図18】図１８は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対してクマリンリンカーを含む修飾を行うことができる例示的な位置を例示する図である。

【0045】

【図19】図１９は、切断可能なリンカーを有さない修飾ｓｇＲＮＡと比較した、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対して切断可能なリンカーを含む修飾を行うことができる例示的な位置を例示する図である。

【0046】

【図20-1】図２０Ａは、断片化が光の非存在下では観察されないことを実証する、図１８のインタクトなＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析トレースである。

【0047】

【図20-2】図２０Ｂは、ポリヌクレオチドが、４２０ｎｍよりも長い波長の光に曝露すると、両方の光切断可能な部位で切断されることを実証する、光切断後の図１８のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析トレースである。

【0048】

【図21】図２１は、ＵＶ光への曝露後に５７位および７４位における光切断可能なリンカーの切断後に創出された断片、ＵＶ光への曝露後に創出された断片、およびインタクトなｓｇＲＮＡに対応するポリヌクレオチド断片の比較を示すゲルの画像である。

【0049】

【図22】図２２は、図１８の光切断可能な部位を含む２３カ所の異なる標的部位を標的とする２３種のガイドＲＮＡのＨＥＫ２９３細胞におけるパーセント編集として数量化された性能を比較し、３つの条件：光なし、環境光あり、または３４５ｎｍよりも長い波長の光ありを比較したグラフである。

【0050】

【図23】図２３は、５７位および７４位の光切断可能なリンカーを含む、２３カ所の異なる標的部位を標的とする２３種のガイドＲＮＡのＨＥＫ２９３細胞におけるパーセント編集として数量化された性能を比較し、３つの条件：光なし、環境光あり、または３４５ｎｍよりも長い波長の光ありを比較し、光切断可能な部位を有さないｓｇＲＮＡと比較したグラフである。

【0051】

【図24】図２４は、５７位および７４位の光切断可能なリンカーを含む、１８カ所の異なる標的部位を標的とする１８種のガイドＲＮＡのＨｅｐ３Ｂ細胞におけるパーセント編集として数量化された性能を比較し、３つの条件：光なし、環境光あり、または３４５ｎｍよりも長い波長の光ありを比較し、光切断可能な部位を有さないｓｇＲＮＡと比較したグラフである。

【0052】

【図25】図２５は、５７位および７４位の光切断可能なリンカーを含む、１３カ所の異なる標的部位を標的とする１３種のガイドＲＮＡのＵ２ＯＳ細胞におけるパーセント編集として数量化された性能を比較し、３つの条件：光なし、環境光あり、または３４５ｎｍよりも長い波長の光ありを比較し、光切断可能な部位を有さないｓｇＲＮＡと比較したグラフである。

【0053】

【図26】図２６は、修飾されていないｓｇＲＮＡを対照として用いて、ｓｇＲＮＡをより長く活性にさせておくとオフターゲット編集が増加することによって実証される、ｓｇＲＮＡが活性である時間の量とオンターゲット編集とオフターゲット編集の比の関係を例示する図である。

【0054】

【図27】図２７は、細胞において観察されるパーセント編集が、３８５ｎｍの光への曝露が増加するに伴って低減することを示すグラフである。

【0055】

【図28】図２８は、一部の細胞に対して光への曝露を防ぎ、したがって、暗闇で維持された細胞ではＧＦＰ遺伝子がノックアウトされ、一方、光に曝露した細胞はＧＦＰを発現するように選択的に遮蔽された細胞のプレートの画像である。

【0056】

【図29】図２９は、光切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと比較して、図１８のポリヌクレオチドの存在量が光に曝露すると有意に減少することを示すグラフである。

【0057】

【図30】図３０は、光切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと比較して、図１８のポリヌクレオチドによるパーセント編集が、光に曝露すると有意に低減することを示すグラフである。

【0058】

【図31】図３１は、ＨＥＫ２９３細胞において観察された、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した図１８のポリヌクレオチドによるパーセント編集活性の経時的な変化を示すグラフである。各時点は、試験したＨＥＫ２９３細胞の集団を光に曝露させた時間を表す。

【0059】

【図32】図３２は、図２７と同じプロトコールを使用した、図１８のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが４３０±２３ｎｍの波長の光への曝露によって不活性化される時間枠を示すグラフである。

【0060】

【図33】図３３は、切断可能なリンカーをｓｇＲＮＡに沿って異なる場所で活性化した場合に得られた切断生成物を示すゲルである。

【0061】

【図34】図３４Ａ～Ｃは、異なる遺伝子を標的とした場合の種々のＣＲＩＳＰＲオフ切断可能なリンカーの場所の編集活性のグラフである。

【0062】

【図35】図３５は、光への曝露の持続時間に対する編集の消失の影響のグラフを示す。完全な消失が４５秒から６０秒の間に実現される。

【0063】

【図36】図３６は、細胞を広スペクトルの光に曝露させる時間の増大の細胞生存率に対する影響を示すグラフである。

【0064】

【図37】図３７は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した、ＣＡＭＫ１を標的とするＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドのインデルプロファイルをＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した標準ｓｇＲＮＡと比較して示す図である。

【0065】

【図38】図３８は、必須遺伝子を標的とするためにＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した図１８のポリヌクレオチドを使用する細胞培養物の画像である。光に曝露させた細胞培養物（＋ｈｖ）では、光に曝露させていない細胞培養物よりも高い集密度が実証され、これにより、不活性化の欠如により高度の細胞死が引き起こされたことが示される。

【0066】

【図39】図３９は、トランスフェクション後様々な時点でのオンターゲット編集：オフターゲット編集比を示すグラフである。

【0067】

【図40】図４０は、透明な領域では光の通過が可能になり、それにより、ＣＲＩＳＰＲオフと複合体を形成したＣａｓ９ヌクレアーゼの編集活性が不活性化され、暗闇領域は不透明になって編集が妨害されずに進行することが可能になるように、図２８の細胞培養に適用した薄膜遮蔽の画像である。

【0068】

【図41-1】図４１Ａは、５７位および７４位に光切断可能なリンカーを有するインタクトなＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析トレースを示すグラフである。断片化が光の非存在下では観察されないことが実証される。

【0069】

【図41-2】図４１Ｂは、５７位および７４位に光切断可能なリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの光切断後のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析トレースを示すグラフである。ポリヌクレオチドが、３４５ｎｍよりも長い波長の光に曝露すると、両方の光切断可能な部位において切断されることが実証される。

【発明を実施するための形態】

【0070】

Ｉ．概要
一般に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９と複合体を形成することができるクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）ポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））が本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成された配列と、（ｉｉ）必要に応じて、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性に影響を及ぼすようにモジュレートすることができる１つまたは複数のエレメントとを含み得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、「調整可能」であるとみなすことができる。一部の場合では、１つまたは複数のエレメントを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性が増大するようにモジュレートすることができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ「ＯＮ」複合体）。一部の場合では、１つまたは複数のエレメントを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性が低下するようにモジュレートすることができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ「オフ」複合体）。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの第１のエレメントを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性が増大するようにモジュレートすることができ、第２のエレメントを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性が低下するようにモジュレートすることができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ「オン／オフ」複合体）。ＣＲＩＳＰＲ複合体の使用を使用して、活性をモジュレートすることができないｓｇＲＮＡと比較してオフターゲット編集を低減することができる。一部の場合では、１つまたは複数の修飾をＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに導入することができ、したがって、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、１つまたは複数の修飾を有さないポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体と比べてオフターゲット編集活性が低いＣＲＩＳＰＲ複合体がもたらされる。

【0071】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲオン複合体；ＣＲＩＳＰＲオフ複合体；またはＣＲＩＳＰＲオン／オフ複合体）も本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをモジュレートする方法が本発明で提供される。ポリヌクレオチド、および、例えば説明書、および必要に応じてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含むキットが提供される。さらに、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤、ならびに医薬製剤を投与する方法が提供される。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞に導入する方法も本発明で提供される。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲオン

【0072】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成して、ＣＲＩＳＰＲオン複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドは、（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成された配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と、（ｉｉｉ）第１のガイド配列の５’側の配列エレメントとを含み得る。第１のガイド配列の５’側の配列エレメントは、ポリヌクレオチドリーダー配列と称することができる。第１の配列エレメントは、二次構造、例えばステムループを含み得る。ステムループは、約３塩基対（ｂｐ）から約３０ｂｐまでを含み得る。第１の配列エレメントの５’末端は、ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングし得る。一部の場合では、第１の配列エレメントの５’末端はガイド配列とアニーリングする。ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドは、第１の切断可能なエレメント、例えば、第１の天然に存在しない切断可能なエレメント、例えば、感光性リンカーをさらに含み得る。切断可能なエレメントは、ガイド配列のすぐ５’側に位置付けることができる。切断可能なエレメントは、光、小分子、または１つまたは複数の細胞プロセスによる切断を受けやすい場合がある。ポリヌクレオチドリーダー配列は、ガイド配列の標的配列とアニーリングする能力に干渉し得る。

【0073】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドとを含む複合体をアセンブルすることができる（例えば、図１Ａを参照されたい）。第１のガイド配列の５’側の配列エレメントを有するＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１の配列エレメントを有さないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的活性を有し得る；例えば、活性は、約２分の１～約１００分の１であり得る。標的核酸、例えば、ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ複合体の調整可能なターゲティングのための方法が本発明で提供される。方法は、切断可能なエレメントを切断因子で切断し（例えば、図１Ｂを参照されたい）、それにより、第１のガイド配列の５’側の配列エレメントを遊離させる（例えば、図１Ｃを参照されたい）ステップを含み得る。例えば、切断可能なエレメントは、感光性リンカーであり得、感光性リンカーは、光に曝露すると切断され得る。切断可能なリンカーの切断により、切断前のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも標的特異的切断活性が高いＣＲＩＳＰＲ複合体をもたらすことができる。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲオフ

【0074】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成してＣＲＩＳＰＲオフ複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドが本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成された配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と、（ｉｉ）切断可能なリンカーとを含み得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドは、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列をさらに含む。切断可能なリンカーは、天然に存在しない切断可能なリンカーであり得る。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドがガイド配列を含む場合、切断可能なリンカーは、ガイド配列の最も５’側の塩基の３’側に位置付けることができる。切断可能なリンカーは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成された配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）内に位置付けることができる。一部の場合では、切断可能なリンカーのすぐ３’側および／またはすぐ５’側の塩基は、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド内の別の塩基とはアニーリングしない。切断可能なリンカーは、感光性リンカーであり得る。切断可能なリンカーは、光、小分子、または１つまたは複数の細胞プロセスによる切断を受けやすい場合がある。

【0075】

ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオフターゲット編集活性は、非ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、例えば、１つまたは複数の切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオフターゲット編集活性よりも低いものであり得る。１つまたは複数の切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結のみで修飾されたものであり得る。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の、切断されていない（例えば、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドが光切断可能なリンカーを有する場合、光に曝露していない）場合のオフターゲット編集活性は、非ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質よりも統計学的に低いものであり得、ｐ値≦０．０５、≦０．０１、≦０．００５、≦０．００１、≦０．０００５、または≦０．０００１である。オフターゲット編集活性（例えば、本明細書に記載の通り測定される）は、約１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、もしくは６０分の１；少なくとも１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、もしくは６０分の１；または最大で１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、または６０分の１に低下し得る。一部の場合では、低下は、切断因子、例えば、ＵＶ光または可視光線への曝露の非存在下で生じる；一部の場合では、低下は、切断因子への曝露後に生じる。例えば、５７位および／または７４位に切断可能なリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体は、切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質よりも低いオフターゲット編集効率を有し得る。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体は、切断されていない（例えば、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドが光切断可能なリンカーを有する場合、光に曝露していない）場合、非ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、例えば切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオンターゲット編集効率と同じ、またはその１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、または５％以内のオンターゲット編集効率を有し得る。

【0076】

ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体をアセンブルすることができる。標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ複合体の調整可能なターゲティングのための方法が本発明で提供される。方法は、切断可能なリンカーの切断を含み得る。切断可能なリンカーの切断により、切断前よりも標的特異的切断活性が低いＣＲＩＳＰＲ複合体をもたらすことができる。一部の場合では、切断可能なリンカーの切断により、切断してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質から解離させることによって生成されるＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの断片が生じる。一部の場合では、切断可能なリンカーの切断により、ＣＲＩＳＰＲ複合体が不活性になる。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲオン／オフ

【0077】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成して、ＣＲＩＳＰＲ「オン／オフ」複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲ「オン／オフ」ポリヌクレオチドが本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成された配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と、（ａ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１の特定の修飾を受けていないポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも高い標的特異的切断活性を有する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する第１の特定の修飾を受けて第１の修飾されたポリヌクレオチドを生成するように構成された第１のエレメント、および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的切断活性を有する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する第２の特定の修飾を受けて第２の修飾されたポリヌクレオチドを生成するように構成された第２のエレメントを含み得る。ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの特色を含み得る。

【0078】

ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドと複合体を形成するＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体をアセンブルすることができる。標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ複合体の調整可能なターゲティングのための方法が本発明で提供される。方法は、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドの第１のエレメントに第１の特定の修飾を受けさせ、それにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１の特定の修飾を受けていないポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも高い標的特異的切断活性を有する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する第１の修飾されたポリヌクレオチドを生成するステップを含み得る。方法は、第１のエレメントに第１の修飾を受けさせた後に、第２のエレメントに第２の特定の修飾を受けさせ、それにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的切断活性を有する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する第２の修飾されたポリヌクレオチドを形成するステップをさらに含み得る。一部の場合では、第２の修飾により、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの断片化および／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質からの解離を引き起こすことができる。

【0079】

別の実施形態が本明細書に記載されている。
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲの概要
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ複合体の概要

【0080】

ＣＲＩＳＰＲ複合体は、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとを含む、天然に存在しないまたは工学的に作製されたＤＮＡまたはＲＮＡ標的化系である。１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、本明細書に提示される任意のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであり得る。標的配列は、それと相補性を有するようにＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列を設計することができる配列であり得、「相補性」は、核酸の、別の核酸配列と従来のワトソン・クリック塩基対合または他の従来型ではない塩基対合のいずれかによって水素結合を形成する能力を指し得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、二重鎖構造を形成する２つの核酸鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せと相互作用し得る。

【0081】

ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的配列に付随する配列がＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって修飾され得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に加えて約１個もしくは約１個よりも多く、約２個もしくは約２個よりも多く、約３個もしくは約３個よりも多く、約４個もしくは約４個よりも多く、約５個もしくは約５個よりも多く、約６個もしくは約６個よりも多く、約７個もしくは約７個よりも多く、約８個もしくは約８個よりも多く、約９個もしくは約９個よりも多く、約１０個もしくは約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのドメイン）を含み得る融合タンパク質の一部であり得る。一部の実施例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体の機能性は異種タンパク質ドメインによって付与される。

【0082】

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来するものであり得る。ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型系では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用し、Ｃａｓ酵素のヌクレアーゼ活性を標的領域に方向付けることができる。標的領域は、「プロトスペーサー」および「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）を含み得、両方のドメインがＣａｓ酵素により媒介される活性（例えば、切断）に使用され得る。ガイド配列は、プロトスペーサーの逆の鎖（結合性部位）と対合（またはハイブリダイズ）して、Ｃａｓ酵素を標的領域に方向付けることができる。ＰＡＭ部位は、Ｃａｓ酵素によって認識され、一部の場合では、Ｃａｓ酵素活性に必要な短い配列を指し得る。ＰＡＭ部位のヌクレオチドの配列および数はＣａｓ酵素の型に応じて異なり得る。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの概要

【0083】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオン、ＣＲＩＳＰＲオフ、ＣＲＩＳＰＲオン／オフは、ガイド配列を含み得る。ガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ）内に存在し得る。ガイド配列は、標的核酸配列に対して、標的核酸配列とハイブリダイズするために十分な相補性を含み得る。相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントした場合、約５０％もしくは約５０％よりも大きい、約６０％もしくは約６０％よりも大きい、約７５％もしくは約７５％よりも大きい、約８０％もしくは約８０％よりも大きい、約８５％もしくは約８５％よりも大きい、約９０％もしくは約９０％よりも大きい、約９５％もしくは約９５％よりも大きい、約９７．５％もしくは約９７．５％よりも大きい、または約９９％もしくは約９９％よりも大きいものであり得る。相補性の程度は１００％であり得る。一部の場合では、ガイド配列は、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列は、約５～約４０ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列を、ガイド配列がそれ自体と塩基対合するまたはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの別の部分と塩基対合する可能性が低下するように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが最適にフォールディングされた場合、ガイド配列の別の部分またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの別の部分と塩基対合するのは、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％もしくは約７５％未満、約５０％もしくは約５０％未満、約４０％もしくは約４０％未満、約３０％もしくは約３０％未満、約２５％もしくは約２５％未満、約２０％もしくは約２０％未満、約１５％もしくは約１５％未満、約１０％もしくは約１０％未満、約５％もしくは約５％未満、約１％もしくは約１％未満、またはそれ未満であり得る。

【0084】

一部の場合では、単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが単一のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する。単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ガイド配列、およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合し得る配列は、トランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり得る。単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドがガイド配列およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む場合、単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、単一ガイドＲＮＡ（またはｓｇＲＮＡ）と称することができる。

【0085】

一部の場合では、２つのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが単一のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する。第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはガイド配列を含むものであり得、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ガイド配列を欠くものであり得る。

【0086】

一部の場合では、第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ガイド配列、およびｃｒＲＮＡを形成する配列の第１の部分（ｔｒａｃｒメイト配列と称することができる）を含み、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ配列と称することができる）を形成する配列の第２の部分を含む。一部の場合では、ｔｒａｃｒ配列（またはｔｒａｃｒＲＮＡ）はｃｒＲＮＡ内の「ｔｒａｃｒメイト」配列とハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって認識される二本鎖ＲＮＡ二重鎖タンパク質結合性セグメントが形成される。ガイド配列（スペーサー配列としても公知）を含むが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合し得る配列は欠くＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（またはｇＲＮＡ）と称することができる。ガイド配列およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合し得る配列の一部分（例えば、ｔｒａｃｒメイト配列）のみを含む（ｔｒａｃｒ配列を欠く）ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドもガイドＲＮＡ（またはｇＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡと称することができる。

【0087】

ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡ内の「ｔｒａｃｒメイト」配列とハイブリダイズし得、それにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって認識される二本鎖ＲＮＡ二重鎖タンパク質結合性セグメントが形成される。一部の実施例では、これら２つのハイブリダイゼーションにより、ヘアピンなどの二次構造が生じる。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド配列は、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くのヘアピンを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つまたは複数のヘアピンを含み得るまたはそれからなり得、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。

【0088】

一部の場合では、第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはｃｒＲＮＡであり得、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはｔｒａｃｒＲＮＡであり得、第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは２つの別々のＲＮＡ分子であり得る。一部の場合では、単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、（１）標的配列（例えば、真核細胞のゲノム標的遺伝子座）とハイブリダイズすることができるガイド配列（またはガイド配列を含むｃｒＲＮＡ）と（２）ｔｒａｃｒＲＮＡとを含み得る。一部の場合では、第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、（１）ガイド配列（またはガイド配列を含むｃｒＲＮＡ）（例えば、真核細胞の標的配列とハイブリダイズすることができる）と（２）ｔｒａｃｒメイト配列（ダイレクトリピート配列としても公知）とを含むが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は欠くものであり得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質には、標的配列とハイブリダイズすることができるガイド配列およびｔｒａｃｒメイト配列（ダイレクトリピート配列）が付随し得るが、ｔｒａｃｒＲＮＡの必要性は伴わない。

【0089】

ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列が単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとして存在する場合、ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列は、共有結合により連結していてよい。ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列は、リン酸ジエステル結合によって連結していてよい。ｔｒａｃｒとｔｒａｃｒメイトは、スペーサー、付着、バイオコンジュゲート、発色団、レポーター基、色素標識されたＲＮＡ、または天然に存在しないヌクレオチド類似体などの部分を含む非ヌクレオチドループを介して共有結合により連結していてよい。スペーサーは、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール、多価アルコール、ポリプロピレングリコールまたはエチレンとプロピレングリコールの混合物）、ポリアミン基（例えば、スペルミン（ｓｐｅｎｎｉｎｅ）、スペルミジン、またはそのポリマー誘導体）、ポリエステル（例えば、ポリ（アクリル酸エチル））、ポリホスホジエステル、アルキレン、およびこれらの組合せであり得る。付着は蛍光標識であり得る。バイオコンジュゲートは、例えば、ペプチド、配糖体、脂質、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、脂肪酸、炭化水素、酵素基質、ステロイド、ビオチン、ジゴキシゲニン、炭水化物、または多糖であり得る。発色団、レポーター基、または色素標識されたＲＮＡは、蛍光色素、例えば、フルオレセインまたはローダミン、化学発光、電気化学発光、または生物発光マーカー化合物であり得る。

【0090】

一部の場合では、例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの効果を増大させるために、他の二次構造をＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに付加して、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの安定性を増強する。一部の場合では、安定性の増大により、核酸編集が改善し得る。

【0091】

一部の場合では、例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの効果を増大させるために、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのオフターゲット編集活性を低下させる１つまたは複数の修飾をＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに付加することができる。１つまたは複数の修飾は、糖部分、リン酸ジエステル連結、および／または塩基を含めた種々の場所に存在し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート連結、Ｏ－メチルホスホロアミダイト連結、および／またはペプチド核酸を含む骨格を含み得る。１つまたは複数は、２’フルオロ－アラビノ核酸、三環－ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、リボース環の２’炭素と４’炭素の間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）、エチレン－架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホジアミデートモルホリノ、（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）、またはこれらの組合せを含み得る。

【0092】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオン、ＣＲＩＳＰＲオフ、およびＣＲＩＳＰＲオン／オフは、ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはその誘導体を含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、糖部分、例えば、リボースまたはデオキシリボースに共有結合により付着した塩基を含み得るヌクレオシドを含み得る。ヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、遊離のカルボキシル基、遊離のアミノ基、または保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）を含み得るアミノ酸またはアミノ酸類似体と連結した塩基を含み得る。保護基は、例えば、Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ， ”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９に記載されている保護基であり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、標準的な環状ヌクレオチド、例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｃＣＭＰ、ｃＵＭＰ、ｃＩＭＰ、ｃＸＭＰ、またはｃＴＭＰを含み得る。標準的なヌクレオチド塩基は、アデニン、シトシン、ウラシル、グアニン、またはチミンであり得る。ヌクレオチドは、リン酸基またはリン酸類似体に付着したヌクレオシドを含み得る。

【0093】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、またはＤＮＡの１つまたは複数の分子として存在し得る（例えば、前記ＲＮＡの１つまたは複数の分子またはタンパク質をコードする１つまたは複数のベクター内）。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二本鎖形態または多重鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーであり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖または多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよび／もしくはピリミジン塩基または他の天然の、化学修飾された、生化学的に修飾された、天然でない、合成のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含み得る。

【0094】

本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、糖部分、リン酸ジエステル連結、および／または塩基を含めた種々の場所に１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート連結、Ｏ－メチルホスホロアミダイト連結、および／またはペプチド核酸を含む骨格を含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、２’フルオロ－アラビノ核酸、三環－ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、リボース環の２’炭素と４’炭素の間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）、エチレン－架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホジアミデートモルホリノ、またはこれらの組合せを含み得る。

【0095】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエート連結を有するヌクレオチド、ボラノホスフェート連結を有するヌクレオチド、リボース環の２’炭素と４’炭素の間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドまたは架橋核酸（ＢＮＡ）を含み得る。天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、２’－０－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、２－チオウリジン類似体、Ｎ６－メチルアデノシン類似体、または２’－フルオロ類似体であり得る。

【0096】

一部の場合では、ポリヌクレオチドは、５’末端の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドに修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、３’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドに修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、５’末端の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドまたは３’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドに修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、５’末端の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド、および３’末端の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドに修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。修飾は、２’－Ｏ－メチル類似体および／または３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結であり得る。

【0097】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾された塩基を含み得る。１つまたは複数の修飾された塩基は、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ＾メチルプソイドウリジン（ｍｅｌ Ｐ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、または７－メチルグアノシンであり得る。

【0098】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、糖部分を含み得る。糖部分は、天然の、修飾されていない糖、例えば、単糖（例えば、ペントース、例えば、リボース、デオキシリボース）、修飾された糖、または糖類似体であり得る。一部の場合では、糖部分は、１つもしくは複数のヒドロキシル基がハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基で置き換えられたものであり得る、または、１つもしくは複数のヒドロキシル基がエーテル、アミン、チオールなどに官能化されたものであり得る。

【0099】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、リボースの２’位に１つまたは複数の修飾を含み得る。リボースの２’位の１つまたは複数の修飾は、例えば、細胞の状況下で免疫刺激を低減するために導入することができる。２’部分は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、Ｈ２、ＨＲ、Ｒ２またはＯＮであり得、ＲはＣ１～Ｃ６のアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、ＣＩ、ＢｒまたはＩである。糖修飾の例としては、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－０－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－メチルウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体（２’－アラシチジン－５’－三リン酸、２’－アラウリジン－５’－三リン酸）、アジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、およびこれらの組合せが挙げられる。糖修飾されたリボヌクレオチドは、２’ＯＨ基がＨ、アルコキシ（もしくはＯＲ）、Ｒもしくはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（例えば、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２など）、またはＣＮ基で置き換えられたものであり得、Ｒは低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。２’位における修飾は、メチル基であり得る。

【0100】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、１つまたは複数の核酸塩基修飾されたリボヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数の修飾されたリボヌクレオチドは、５’位において修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、５’（２－アミノ）プロピルウリジンまたは５’－ブロモウリジン；８位において修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；ならびにＮ－アルキル化されたヌクレオチド、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンなどの、天然に存在しない塩基を含有し得る（天然に存在する塩基の代わりに）。

【0101】

核酸塩基修飾されたリボヌクレオチドは、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、Ｕｍ（２’－０－メチルウリジン）、ｍｌＡ（１－メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）、Ａｍ（２－１－Ｏ－メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６ イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６．－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’－０－リボシルアデノシン（リン酸）、Ｉ（イノシン）、ｍｉ ｌ（１－メチルイノシン）、ｍ’ｌｍ（ｌ，２’－０－ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）、Ｃｍ（２Ｔ－０－メチルシチジン）、ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５－フォンニルシチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍｌＧ（１－メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’－０－メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－０－ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－０－トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’－０－リボシルグアノシン（リン酸）、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）、Ｑ（キューオシン）、ｏＱ（エポキシキューオシン）、ｇａｌＱ（ガルタクトシル－キューオシン）、ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）、ｐｒｅＱｏ（７－シアノ－７－デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｉ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）、Ｇ（アルカエオシン）、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’－０－ジメチルウリジン）、ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－０－メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチル エステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－０－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｌ－Ｏメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）、Ｔｍ（２’－０－メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２－０－ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ－０－ジメチルアデノシン）、ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，０－２－トリメチルアデノシン）、ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）、ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ－０－ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－０－メチルシチジン）、ｍｌＧｍ（１，２’－０－ジメチルグアノシン）、ｍ’Ａｍ（１，２－０－ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）、ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ－タウリノメチル－２－チオウリジン））、ｉｍＧ－１４（４－デメチルグアノシン）、ｉｍＧ２（イソグアノシン）、またはａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８－オキソ－アデニン、その７置換誘導体、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃ１～Ｃ６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃ１～Ｃ６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２～Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７置換プリン、７－デアザ－８置換プリン、およびこれらの組合せであり得る。

【0102】

核酸塩基修飾されたリボヌクレオチドは、アミノプリン、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ））、５－ブロモｄＵ、デオキシウリジン、逆向きｄＴ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ）、逆向きジデオキシ－Ｔ、ジデオキシ－Ｃ、５－メチルｄＣ、Ｓｕｐｅｒ（Ｔ）、Ｓｕｐｅｒ（Ｇ）、５－ニトロインドール、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、ヒドロキシメチルｄＣ、イソｄＧ、イソｄＣ、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ、２－メトキシエトキシＭｅＣ、２－メトキシエトキシＧ、または２－メトキシエトキシＴであり得る。

【0103】

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性、血清の安定性、標的特異性、血液系循環、組織分布、組織透過、細胞内取り込み、効力、および／または細胞透過性が改善されるように修飾することができる。例えば、ある特定のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）修飾により、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の活性に有意に影響を及ぼすことなく、ヌクレアーゼ安定性を増大させ、かつ／またはインターフェロン誘導を低減することができる。修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、同じ配列を有する修飾されていないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと比較して改善された血清および／または脳脊髄液中での安定性を有し得る。

【0104】

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの３’末端および５’末端を、例えば、３’または５’連結を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護することができる（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号およびＷＯ９８／１３５２６）。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、１つまたは複数の「ブロッキング基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」を含めることによって抵抗性にすることができる。１つまたは複数の「ブロッキング基」は、ポリヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに保護基としてまたは合成用のカップリング基としてのいずれかで付着させることができる置換基（例えば、ＯＨ基以外）であり得る（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３）、グリコール（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）リン酸（ＰＯ３ ２－）、水素ホスホネート、またはホスホロアミダイト）。１つまたは複数のブロッキング基は、修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ抵抗性構造を含めた、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を保護することができる１つまたは複数の「末端ブロッキング基」または１つまたは複数の「エキソヌクレアーゼブロッキング基」であり得る。

【0105】

１つまたは複数の末端ブロッキング基は、キャップ構造（例えば、７－メチルグアノシンキャップ）、例えば３’－３’または５’－５’末端逆位を有する逆向きヌクレオモノマー（例えば、Ｏｒｔｉａｇａｏ ｅｔ ａｌ． １９９２． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ． ２： １２９を参照されたい）、メチルホスホネート、ホスホロアミダイト、非ヌクレオチド基（例えば、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、コンジュゲート）などであり得る。３’末端ヌクレオモノマーは、修飾された糖部分を含み得る。例えば、３’－ヒドロキシルをヌクレオチドに対して３’→３’ヌクレオチド間連結を通じてエステル化することができる。例えば、アルキルオキシラジカルは、メトキシ、エトキシ、またはイソプロポキシであり得る。必要に応じて、３’末端において３’→３’連結したヌクレオチドを置換連結によって連結することができる。ヌクレアーゼ分解を低減するために、最も５’側の３’→５’連結を、修飾された連結、例えば、ホスホロチオエートまたはＰ－アルキルオキシホスホトリエステル連結にすることができる。

【0106】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、１つまたは複数の標識またはタグを含み得る。１つまたは複数の「標識」または「タグ」は、別の分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドまたはそのセグメントに付着させて、他の分子を容易に検出することができる手段をもたらすことができる分子であり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、蛍光性、発光性、放射性、酵素的に活性なものなどの標識を含み得る。１つまたは複数の標識として、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２，７－ジメトキシ－４，５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシ－２，４，７，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射性標識、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなどを挙げることができる。１つまたは複数の標識は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを親和性が高い結合パートナー、例えば、アビジン、特異的抗体などを有するビオチン、ハプテンなどとコンジュゲートし、結合パートナーを検出可能な標識とコンジュゲートする、二段階系であり得る。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の概要

【0107】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、Ｃａｓタンパク質であり得る。「Ｃａｓ」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質、その断片、またはその突然変異体もしくはバリアントを指し得る。

【0108】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸまたはＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＹ細菌系に由来する酵素のいずれかであり得る。Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡによりガイドされるポリヌクレオチド結合性またはヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系のタンパク質またはそれに由来するタンパク質を含み得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘｌ２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｕ１９６６、そのホモログ、またはその修飾バージョンであり得る。一部の場合では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、そのホモログ、および修飾バージョンなどの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｖ型またはＶＩ型系のタンパク質またはそれに由来するタンパク質を含み得る。

【0109】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、以下の細菌種のいずれかにおいて見出されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の配列、または以下の種のいずれかにおいて見出されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に由来する配列を含む：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．Ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｊｒｉｎｇｅｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、またはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ。

【0110】

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする核酸配列を、真核生物、例えばヒトにおける発現のために最適化することができる（すなわち、ヒトにおける発現のために最適化される）、または本明細書で考察されている別の真核生物、動物もしくは哺乳動物における発現のために最適化することができる。一般に、コドン最適化は、目的の宿主細胞における発現を増強するために、ネイティブな配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１個もしくは約１個よりも多く、約２個もしくは約２個よりも多く、約３個もしくは約３個よりも多く、約４個もしくは約４個よりも多く、約５個もしくは約５個よりも多く、約１０個もしくは約１０個よりも多く、約１５個もしくは約１５個よりも多く、約２０個もしくは約２０個よりも多く、約２５個もしくは約２５個よりも多く、約５０個もしくは約５０個よりも多く、またはそれよりも多くのコドン）を、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンに置き換える一方で、ネイティブなアミノ酸配列を維持することによって核酸配列を修飾するプロセスを指し得る。

【0111】

一部の実施例では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に修飾を導入して、安定性、調整可能性を増強し、かつ／またはインターフェロン誘導を低減することなどができる。
ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドにおけるポリヌクレオチドリーダー配列

【0112】

ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、第１のガイド配列の５’側の配列エレメントを含み得る。第１のガイド配列の５’側の配列エレメントは、ポリヌクレオチドリーダー配列と称することができる。ポリヌクレオチドリーダー配列を有するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、ポリヌクレオチドリーダー配列を有さないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い活性を有し得る。ポリヌクレオチドリーダー配列の除去により、活性が増大したＣＲＩＳＰＲ複合体（ＣＲＩＳＰＲオン）をもたらすことができる。
Ａ．ポリヌクレオチドリーダー配列の長さ

【0113】

ポリヌクレオチドリーダー配列は、約１ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドまで、例えば、約５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、または少なくとも４ヌクレオチド、３ヌクレオチド～約１５ヌクレオチド、例えば、約５ヌクレオチド～約１５ヌクレオチド、約３ヌクレオチド～約１０ヌクレオチド、約３～約１５ヌクレオチド、または約３ヌクレオチド～約１２ヌクレオチド、約４ヌクレオチド～約１３ヌクレオチド、約３ヌクレオチド～約１８ヌクレオチド、約４ヌクレオチド～約１９ヌクレオチド、４ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまで、４ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで、５ヌクレオチドから約１２ヌクレオチドまで、５ヌクレオチドから約少なくとも４ヌクレオチド、または３０またはそれ未満のヌクレオチドの長さにわたり得る。
Ｂ．ポリヌクレオチドリーダー配列の組成

【0114】

ポリヌクレオチドリーダー配列は、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドリーダー配列は、非標準ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含み得る。ポリヌクレオチドリーダー配列は、本明細書に記載の任意のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結を含み得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列は、本明細書に記載の任意のリンカーを含み得る。
Ｃ．ポリヌクレオチドリーダー配列の二次構造

【0115】

ポリヌクレオチドリーダー配列は、二次構造を形成し得るまたはそれを形成するように設計することができる。二次構造は、例えば、ステムループ構造であり得る。ステムループのステムは、相補的なＸ配列とＹ配列で構成される少なくとも約３ｂｐを含み得る（Ｘはステムの一方の鎖の配列を表し、Ｙはステムの他方の鎖の配列を表す）。ステムは、少なくとも（または最大で）２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０塩基対を含み得る。ステムは、１～２０ｂｐ、または２～５ｂｐ、２～９ｂｐ、３～１０ｂｐ、４～９ｂｐ、５～１０ｂｐ、５～２０ｂｐ、６～２０ｂｐ、７～２０ｂｐ、８～２０ｂｐなどにわたる二重鎖ドメインを含み得る。一部の場合では、ステムの２つの鎖は共有結合により架橋結合していてよい。

【0116】

ステムループは、一本鎖ループを含み得る。一本鎖ループは、１～５０塩基、例えば、３～５塩基、３～７塩基、４～１０塩基、５～２０塩基、６～２５塩基、３～２５塩基、３～３０塩基、４～３０塩基、または４～５０塩基にわたり得る。

【0117】

ステムループまたはポリヌクレオチドリーダー配列の最も５’側の塩基は、ガイド配列のすぐ５’側のポリヌクレオチドリーダー配列内の塩基とアニーリングし得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列の最も５’側の塩基は、ガイド配列の最も５’側の塩基から１～２０塩基３’側、例えば、ガイド配列の最も５’側の塩基から２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１５塩基、または２０塩基３’側の塩基とアニーリングし得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列は、ガイド配列内の塩基と塩基対合する塩基を含まない。

【0118】

ポリヌクレオチドリーダー配列は、１つまたは複数のバルジ（一本鎖配列の領域；これらの領域は、二次構造における配列塩基対合の１００％未満を含む位置に対応し得る）を含むヘアピンループまたはステムループ構造を形成し得る。１つまたは複数のバルジの数、長さ、および／または位置は、変動し得、ステムループ構造の全体的な安定性に影響を及ぼし得る。ポリヌクレオチドリーダー配列は、最適にフォールディングされた場合、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くのバルジを含み得る。

【0119】

一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列は、非ポリヌクレオチド部分を含み得る。ポリヌクレオチドリーダー配列内の非ヌクレオチド部分は、ビオチン、抗体、ペプチド、親和性、レポーターまたはタンパク質部分（例えば、ＮＨＳエステルまたはイソチオシアネートなど）、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼなどの酵素などであり得る。

【0120】

一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列は二次構造を欠く。ポリヌクレオチドリーダー配列は、ヌクレオチドの一本鎖の連続したひと続きを含み得る、またはそれからなり得る。

【0121】

ポリヌクレオチドリーダー配列によって形成されるステムループの融解温度は、約２５℃～約６０℃、または約３０℃～約５０℃、または約４０℃～約５０℃であり得る。
Ｄ．ポリヌクレオチドリーダー配列が原因の活性の低下

【0122】

ポリヌクレオチドリーダー配列を有するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体（例えば、Ｃａｓ９）は、ポリヌクレオチドリーダー配列を有さないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い活性を有し得る。一部の場合では、活性は、少なくとも（または最大で）０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２分の１、５分の１、１０分の１、５０分の１、１００分の１、または１０００分の１である。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列を有するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体は活性を有さない。活性は、例えば、酵素活性または転写活性化活性であり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が触媒として活性型のＣａｓタンパク質である場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的核酸を切断することができないものであり得る。別の例では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、転写活性化ドメインと融合した、触媒として不活性型のＣａｓタンパク質である場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的遺伝子の転写を活性化することができないものであり得る。
Ｅ．ポリヌクレオチドリーダー配列の除去

【0123】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドリーダー配列の遊離を可能にするための１つまたは複数の切断可能なエレメントを含み得る。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の間に存在し得る。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ポリヌクレオチドリーダー配列内に存在する。一部の場合では、少なくとも１つの切断可能なエレメントがポリヌクレオチドリーダー配列内に存在し、少なくとも１つの切断可能なエレメントがポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の間に存在する。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントはガイド配列の５’側に位置付けられた。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、少なくとも、または最大で、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の切断可能なエレメントであり得る。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントを、切断後にポリヌクレオチドリーダー配列の一部（例えば、１塩基、２塩基、５塩基、または１０塩基）がガイド配列と共有結合により連結したままになるように位置付ける。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントを、切断後に、ポリヌクレオチドリーダー配列のいずれもガイド配列と共有結合により付着したままにならないように位置付ける。

【0124】

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、同じ型の切断可能なエレメントまたは異なる型の切断可能なエレメントであり得る。

【0125】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合していない。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成している。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成し、標的配列に結合している。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列により、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成することが妨げられる、またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する能力が、ポリヌクレオチドリーダー配列を欠くＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと比べて低下する；ポリヌクレオチドリーダー配列をＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドから切断することにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する能力が増大し得る。

【0126】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞または生物体、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、霊長類、例えば、チンパンジー、ゴリラ、またはヒトにおいて１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。

【0127】

１つまたは複数の切断可能なエレメントにおけるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断のタイミングは、変動し得る。例えば、１つまたは複数の切断可能なエレメントをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが細胞もしくは生物体に導入された直後に、または細胞もしくは生物体への導入の少なくとも（もしくは最大で）０．２５時間後、０．５時間後、０．７５時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、または９６時間後に切断することができる。

【0128】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に１回曝露させることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に１回よりも多く、例えば、２回、３回、５回、または１０回晒すことができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、１つよりも多くの型の切断因子、例えば、少なくとも（または最大で）２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の切断因子に曝露させることができる。

【0129】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に種々の持続時間にわたって曝露させることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に０．１分間、０．５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、３０分間、６０分間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたって曝露させることができる。

【0130】

一部の場合では、試料は複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み、切断因子を使用してある特定のパーセンテージのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断することができる。例えば、切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を使用して、試料中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの少なくとも（または最大で）５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を切断することができる。ある用量の切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を使用して、試料中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの１００％を切断することができる。その量の切断が少なくとも（または最大で）１分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたって起こり得る。

【0131】

ポリヌクレオチドリーダー配列の遊離の結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと結合したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）の活性の増大がもたらされ得る。一部の場合では、試料において、ポリヌクレオチドリーダー配列の遊離の結果、活性の少なくとも０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍の増大がもたらされる。
Ｆ．他の特色

【0132】

ポリヌクレオチドリーダー配列を含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、標的特異的切断活性がより低い第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを生成するために特定の修飾を受けさせることができる１つまたは複数のエレメントの第２のセットを含み得る。１つまたは複数のエレメントの第２のセットは、１つまたは複数の切断可能なエレメントの第２のセットであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドリーダー配列、および、ポリヌクレオチドリーダー配列の遊離が可能になるように構成された１つまたは複数の切断可能なエレメントの第１のセット、および残りのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断が可能になるように構成された１つまたは複数の切断可能なエレメントの第２のセットを含み得る；このポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドと称することができる。
ＩＶ．ＣＲＩＳＰＲオフおよびＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド

【0133】

ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、特定の修飾を受けて、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成した場合に第１のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的切断活性を有する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を生成するように構成されたエレメントを含み得る。エレメントは、１つまたは複数の切断可能なエレメントであり得、特定の修飾は、１つまたは複数の切断可能なエレメントの切断であり得る。
Ａ．１つまたは複数の切断可能なエレメントの位置

【0134】

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ガイド配列内の最も５’側の塩基（またはヌクレオチド）の３’側またはガイド配列内の最も３’側の塩基（またはヌクレオチド）の５’側に位置付けることができる。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｃｒＲＮＡまたはガイド配列の５’末端の約１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に位置付けることができる。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｃｒＲＮＡ配列またはガイド配列の３’末端から約１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に位置付けることができる。

【0135】

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に位置付けることができる。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｔｒａｃｒ配列の５’末端の１～３０塩基、例えば２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に存在し得る。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｔｒａｃｒ配列の３’末端の１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基５’側に存在し得る。

【0136】

一部の実施例では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）内の塩基（またはヌクレオチド）５６および／またはヌクレオチド７３のすぐ５’側または３’側に位置付けることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の最も５’側のヌクレオチドはヌクレオチド１である、またはヌクレオチド５７および／もしくはヌクレオチド７４に置き換わる。一部の実施例では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基（またはヌクレオチド）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のすぐ５’側または３’側に位置付けることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の最も５’側の塩基（またはヌクレオチド）は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基（またはヌクレオチド）１である、または塩基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００に置き換わる。
Ｂ．切断因子への曝露前の１つまたは複数の切断エレメントの影響

【0137】

一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントを含み、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の切断可能なエレメントを有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べて活性の低下を有さない（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントを含み、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の切断可能なエレメントを有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べて活性の低下を有する（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。
Ｃ．１つまたは複数の切断可能なエレメントの切断

【0138】

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、同じ型の切断可能なエレメントまたは異なる型の切断可能なエレメントであり得る。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、少なくとも、または最大で、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の切断可能なエレメントであり得る。

【0139】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合していない。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成している。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成しており、標的配列に結合している。一部の場合では、切断後に、得られたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の断片のうちの１つまたは複数はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合したままである。一部の場合では、切断後に、得られたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の断片のうちの１つまたは複数（または全て）はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）ともはや結合しない、またはもはや結合することができない。

【0140】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞または生物体、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、霊長類、例えば、チンパンジー、ゴリラ、またはヒトにおいて１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。

【0141】

１つまたは複数の切断可能なエレメントにおけるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の切断のタイミングは、変動し得る。例えば、１つまたは複数の切断可能なエレメントをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）が細胞もしくは生物体に導入された直後に、または細胞もしくは生物体への導入の少なくとも（もしくは最大で）０．２５時間後、０．５時間後、０．７５時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、または９６時間後に切断することができる。

【0142】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断因子に１回曝露させることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断因子に１回よりも多く、例えば、２回、３回、５回、または１０回晒すことができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つよりも多くの型の切断因子、例えば、少なくとも（または最大で）２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の切断因子に曝露させることができる。

【0143】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断因子に種々の持続時間にわたって曝露させることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断因子に０．１分間、０．５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、３０分間、６０分間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたって曝露させることができる。

【0144】

一部の場合では、試料は複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含み、切断因子を使用してある特定のパーセンテージのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断することができる（例えば、ｓｇＲＮＡ）。例えば、切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を使用して、試料中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の少なくとも（または最大で）５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を切断することができる。ある用量の切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を使用して、試料中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の１００％を切断することができる。その量の切断が少なくとも（または最大で）１分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたって起こり得る。

【0145】

切断の結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと結合したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）の活性（例えば、ｓｇＲＮＡ）の低下がもたらされ得る。一部の場合では、試料において、１つまたは複数の切断因子への曝露の結果、活性が少なくとも０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２分の１、５分の１、１０分の１、５０分の１、１００分の１、または１０００分の１に低下する。一部の場合では、試料において、もう１つの切断因子への曝露の結果、活性の完全な喪失がもたらされる。

【0146】

ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を使用して、オフターゲット編集を標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９と比較して低減することができる。オフターゲット編集は、Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ． ”Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ”， Ｊａｎｕａｒｙ １４， ２０１９ ｂｉｏＲｘｉｖ ｏｒ ｄｅｅｐ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ． ”ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３， １８７－１９７ （２０１５）に記載されている通り、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定したＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｉｎｇ））を使用して決定することができる。

【0147】

Ｖ．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドおよびオフターゲット編集の低減

【0148】

ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成した場合に、ＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、光または別の切断誘導処理に曝露していない場合に、１つまたは複数の修飾を有さないポリヌクレオチドを有するＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低いオフターゲット編集活性を有するように、１つまたは複数の修飾を含み得る。１つまたは複数の修飾は、本明細書に記載の１つまたは複数のリンカーであり得る。１つまたは複数の修飾は、本明細書に記載の１つまたは複数の切断可能なリンカーであり得る。１つまたは複数の修飾は、本明細書に記載のリボースの２’位における１つまたは複数の修飾であり得る。１つまたは複数の修飾は、１つまたは複数の切断可能なエレメントであり得る。１つまたは複数の修飾は、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含み得る。
Ａ．１つまたは複数の修飾の位置

【0149】

１つまたは複数の修飾は、ガイド配列内の最も５’側の塩基（またはヌクレオチド）の３’側またはガイド配列内の最も３’側の塩基（またはヌクレオチド）の５’側に位置付けることができる。１つまたは複数の修飾は、ｃｒＲＮＡまたはガイド配列の５’末端の約１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に位置付けることができる。１つまたは複数の修飾は、ｃｒＲＮＡ配列またはガイド配列の５’末端の約１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に位置付けることができる。

【0150】

１つまたは複数の修飾は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に位置付けることができる。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、図１７に示されているＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのテトラループ、ネクサス、ステムループ１、またはステムループ２内に存在し得る。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、テトラループのループ、テトラループのバルジ、テトラループの第１のステム、テトラループの第２のステム、ネクサスのループ構造内、ネクサスのステム内、ステムループ１のループ構造内、ステムループ１のステム内、ステムループ２のループ構造内、またはステムループ２のステム内に存在し得る；テトラループ、ネクサス、ステムループ１、およびステムループ２の例は図１７に例示されている。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、例えば、ガイド配列とステムループを形成するように構成されたガイド配列の５’側の配列を含まない。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、ｔｒａｃｒ配列の５’末端の１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に存在し得る。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、ｔｒａｃｒ配列の３’末端の１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基５’側に存在し得る。

【0151】

一部の実施例では、１つまたは複数の修飾は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）内の塩基（またはヌクレオチド）５６および／またはヌクレオチド７３のすぐ５’側または３’側に位置付けることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の最も５’側のヌクレオチドはヌクレオチド１である、またはヌクレオチド５７および／もしくはヌクレオチド７４に置き換わる。一部の実施例では、１つまたは複数の複合体を変更させるエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基（またはヌクレオチド）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のすぐ５’側または３’側に位置付けることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の最も５’側の塩基（またはヌクレオチド）は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基（またはヌクレオチド）１である、または塩基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００に置き換わる。
Ｂ．１つまたは複数の修飾の影響

【0152】

一部の場合では、１つまたは複数の修飾を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の修飾を有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べて標的配列における編集活性の低下を有さない（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。一部の場合では、１つまたは複数の修飾を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の複合体を変更させるエレメントを有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べて標的配列における編集活性の低下を有する（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。一部の場合では、標的配列における編集活性は、標準のＣＲＩＳＰＲ複合体と比べて約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％または最大で１％、２％、または３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％低下する。

【0153】

一部の場合では、１つまたは複数の修飾を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の修飾を有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べてオフターゲット配列における編集活性の低下を有する（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。オフターゲット配列における編集活性は、オフターゲット編集と記載される。オフターゲット編集は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列と正確には相補的でない配列における編集であり得る。一部の場合では、オフターゲット配列における編集活性は、約、少なくとも、または最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低下する。一部の場合では、オフターゲット編集活性は、０％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。一部の場合では、オフターゲット編集活性は、１％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満である。一部の場合では、オフターゲット編集活性は、０％～５％、５％～１０％、１０％～２５％、２５％～５０％、５０％～７５％、または７５％～９５％である。

【0154】

オフターゲット編集活性（例えば、本明細書に記載の通り測定される）は、約１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、または６０分の１；少なくとも１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、または６０分の１；または最大で１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、または６０分の１に低下し得る。

【0155】

一部の場合では、オフターゲット編集活性を１つの核酸領域において測定する。オフターゲット編集活性を１つよりも多くのゲノム領域（例えば、遺伝子）において測定することができる。オフターゲット編集活性を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、または１００のゲノム領域（例えば、遺伝子）において測定することができる。オフターゲット編集活性を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、１０００、または１０，０００のゲノム領域（例えば、遺伝子）において測定することができる。オフターゲット編集活性を最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、１０００、または１０，０００のゲノム領域（例えば、遺伝子）において測定することができる。

【0156】

オフターゲット編集活性は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を接触させた細胞由来の核酸分子を解析することによって測定することができる。測定は、形質転換の約または最大で３０分後、１時間後、２時間後、５時間後、１０時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、４日後、５日後、または６日後に細胞から抽出された核酸分子を使用して行うことができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞にトランスフェクションによって導入することができる。核酸分子を、例えば、配列決定、ＰＣＲ、質量分析、サザンブロットなどによって解析することができる。オフターゲット編集を、例えば、データを、例えば、グラフ、例えば、散布図として提示することによって可視化することができる。

【0157】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、本明細書に記載の修飾を有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９と比較してオフターゲット編集を低減することができる。オフターゲット編集は、Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ． ”Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ”， Ｊａｎｕａｒｙ １４， ２０１９ ｂｉｏＲｘｉｖ ｏｒ ｄｅｅｐ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ． ”ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３， １８７－１９７ （２０１５）に記載されている通り、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定するためのＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｉｎｇ））を使用して決定することができる

【0158】

オフターゲット編集部位は、標的配列に対するパーセント配列同一性が高い配列を有し得る。配列同一性は、９９％未満であるもしくは９９％と等しい、９８％未満であるもしくは９８％と等しい、９７％未満であるもしくは９７％と等しい、９６％未満であるもしくは９６％と等しい、９５％未満であるもしくは９５％と等しい、９４％未満であるもしくは９４％と等しい、９３％未満であるもしくは９３％と等しい、９２％未満であるもしくは９２％と等しい、９１％未満であるもしくは９１％と等しい、９０％未満であるもしくは９０％と等しい、８９％未満であるもしくは８９％と等しい、８８％未満であるもしくは８８％と等しい、８７％未満であるもしくは８７％と等しい、８６％未満であるもしくは８６％と等しい、８５％未満であるもしくは８５％と等しい、８４％未満であるもしくは８４％と等しい、８３％未満であるもしくは８３％と等しい、８２％未満であるもしくは８２％と等しい、８１％未満であるもしくは８１％と等しい、８０％未満であるもしくは８０％と等しい、７９％未満であるもしくは７９％と等しい、７８％未満であるもしくは７８％と等しい、７７％未満であるもしくは７７％と等しい、７６％未満であるもしくは７６％と等しい、７５％未満であるもしくは７５％と等しい、７４％未満であるもしくは７４％と等しい、７３％未満であるもしくは７３％と等しい、７２％未満であるもしくは７２％と等しい、７１％未満であるもしくは７１％と等しい、７０％未満であるもしくは７０％と等しい、６９％未満であるもしくは６９％と等しい、６８％未満であるもしくは６８％と等しい、６７％未満であるもしくは６７％と等しい、６６％未満であるもしくは６６％と等しい、６５％未満であるもしくは６５％と等しい、６４％未満であるもしくは６４％と等しい、６３％未満であるもしくは６３％と等しい、６２％未満であるもしくは６２％と等しい、６１％未満であるもしくは６１％と等しい、６０％未満であるもしくは６０％と等しい、５９％未満であるもしくは５９％と等しい、５８％未満であるもしくは５８％と等しい、５７％未満であるもしくは５７％と等しい、５６％未満であるもしくは５６％と等しい、５５％未満であるもしくは５５％と等しい、５４％未満であるもしくは５４％と等しい、５３％未満であるもしくは５３％と等しい、５２％未満であるもしくは５２％と等しい、５１％未満であるもしくは５１％と等しい、５０％未満であるもしくは５０％と等しい、４９％未満であるもしくは４９％と等しい、４８％未満であるもしくは４８％と等しい、４７％未満であるもしくは４７％と等しい、４６％未満であるもしくは４６％と等しい、４５％未満であるもしくは４５％と等しい、４４％未満であるもしくは４４％と等しい、４３％未満であるもしくは４３％と等しい、４２％未満であるもしくは４２％と等しい、４１％未満であるもしくは４１％と等しい、４０％未満であるもしくは４０％と等しい、３９％未満であるもしくは３９％と等しい、３８％未満であるもしくは３８％と等しい、３７％未満であるもしくは３７％と等しい、３６％未満であるもしくは３６％と等しい、３５％未満であるもしくは３５％と等しい、３４％未満であるもしくは３４％と等しい、３３％未満であるもしくは３３％と等しい、３２％未満であるもしくは３２％と等しい、３１％未満であるもしくは３１％と等しい、または３０％未満であるもしくは３０％と等しい。オフターゲット編集部位は、ＰＡＭ領域の極めて近くの配列を有し得、例えば、オフターゲット編集が生じるにはプロトスペーサーの５’末端（ＰＡＭより遠位）におけるガイドＲＮＡとＤＮＡの間のミスマッチが許容され得る。２つの核酸間の配列同一性の決定の仕方は当業者には容易に理解される。例えば、２つの配列をアラインメントした後に配列同一性を算出することができ、したがって、配列同一性はその最高レベルになる。配列同一性を算出する別のやり方は、公開されているアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の光学的アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２ （１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． ＭｏＬ Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３ （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８５： ２４４４ （１９８８）の類似性の方法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂ１２ｓｅｑ／ｂ１２．ｈｔｍｌから入手可能なＴａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １７４： ２４７－２５０ （１９９９）のＢＬＡＳＴアルゴリズム）、または検査によって行うことができる。
ＶＩ．切断可能なエレメント

【0159】

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。
Ａ．切断可能なエレメントの型

【0160】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断特性は、妥当な条件下で、組み入れられた点におけるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断の傾向を変更することができる切断可能なエレメントによって変更することができる。「切断可能なエレメント」は、天然のヌクレオチドまたは１つもしくは複数の修飾されたヌクレオチドを含み得る。切断可能なエレメントは、核酸合成の間にＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）に組み入れることができる。

【0161】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の２つまたはそれよりも多くの切断可能なエレメントは、異なる切断特徴を有し得、例えば、２つまたはそれよりも多くの切断可能なエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）に組み入れられた場合、異なる作用因子および／または反応条件を使用することによって互いの存在下で選択的に切断することができる。

【0162】

本明細書で使用される場合、「切断すること（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」、「切断された（ｃｌｅａｖｅｄ）」および「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」という用語は全て、実質的に、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）内の切断可能なエレメントが存在する各ポイントでＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切ることに関し得る。

【0163】

切断は、作用因子によって開始することができる。作用因子は、例えば、切断可能なエレメントの切断を引き起こす化学的実体または物理的な力であり得る。作用因子は、化学物質もしくは化学物質の組合せ、生体分子もしくは生体分子の組合せ、正常なもしくは可干渉性の（レーザー）可視光もしくは紫外線（ＵＶ）光、熱または他の形態の電磁気エネルギーであり得る。一部の場合では、作用因子、例えば、２つまたはそれよりも多くの作用因子の組合せを同時にまたは逐次的に使用してＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断することができる。同時にとは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を２つまたはそれよりも多くの作用因子に同じ時間に曝露させることができるが、２つまたはそれよりも多くの作用因子はＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と１つずつ反応することができることを意味する。逐次的にとは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つの作用因子と接触させ、次いで、その後に第２の作用因子と接触させることができることを意味する。

【0164】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つよりも多くの型の切断可能なエレメントを含み得る。一部の実施例では、第１の切断可能なエレメントと第２の切断可能なエレメントは同じ切断特徴を有する。一部の実施例では、第２の切断可能なエレメントは第１の切断可能なエレメントとは異なる切断特徴を有する。例えば、第１の切断可能なエレメントは光切断可能なリンカーであり得、第２の切断可能なエレメントは化学的ヌクレアーゼによる切断を受けやすい場合がある。別の例では、第１の切断可能なエレメントは化学的ヌクレアーゼによる切断を受けやすく、第２の切断可能なエレメントは光切断可能になるように工学的に作製されていてよく、それにより、オルソゴナルな（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）処理レジメンを適用することが可能になる。一部の場合では、同じ切断可能なエレメントは、１つよりも多くの型の切断特徴を有し得る。第１の切断可能なエレメントおよび第２の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。

【0165】

切断可能なエレメント（例えば、切断可能なリンカー）は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を妥当な条件下での切断を受けやすいものにするＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の２つまたはそれよりも多くの構成物を接続することができる実体を指し得る。例えば、妥当な条件は、ＵＶ光への曝露であり得る。切断可能なリンカーは、妥当な条件下で切れやすい１つまたは複数の修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドを含み得る。

【0166】

切断可能なリンカーは、修飾されたヌクレオシド間連結を含み得る。修飾されたヌクレオシド間連結は、リン原子を有するヌクレオチド間連結またはリン原子を有さないヌクレオチド間連結であり得る。リン原子を含有するヌクレオシド間連結としては、例えば、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステラーゼ、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含めたホスホラミデート、Ｐ－エチオキシホスホジエステル、Ｐ－エトキシホスホジエステル、Ｐ－アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、ならびにリンを含有しない連結、例えば、アセタールおよびアミド、例えば、これらの通常の３’－５’連結を有することが当技術分野で公知であるもの、２’－５’連結類似体、および１つまたは複数のヌクレオチド間連結が３’－３’、５’－５’または２’－２’連結である逆極性を有するものなどが挙げられる。逆極性を有するポリヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間連結において単一の３’－３’連結、すなわち、塩基を欠く（核酸塩基が欠損しているまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）であり得る単一の逆方向ヌクレオシド残基を含み得る。

【0167】

リンを含有しないヌクレオシド間連結としては、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合ヘテロ原子シクロアルキル、１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子および１つまたは複数の短鎖複素環が挙げられる。これらのヌクレオシド間連結としては、これだけに限定されないが、シロキサン、硫化物、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファミン酸；メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、アミドおよび混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他が挙げられる。他のリン原子を含有しない修飾されたヌクレオシド間連結としては、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－（メチレン（メチルイミノ）骨格として公知）、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－および－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－が挙げられる。

【0168】

切断可能なリンカーは、非ヌクレオチドの性質であり得る。「非ヌクレオチド」は、糖および／またはリン酸置換のいずれも含めた、１つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりにポリヌクレオチド鎖に組み入れることができる任意の基または化合物を指し得る。基または化合物は、例えば糖のＣ１位に、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの一般に理解されるヌクレオチド塩基を含有しないという点で、塩基を欠くものであり得る。

【0169】

非ヌクレオチドリンカーは、例えば、塩基を欠く残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール（スペーサー９）もしくはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコール、またはブタンジオールなどのアルカン－ジオールであり得る。スペーサー単位は、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合によって連結していることが好ましい場合がある。リンカー単位は、例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、またはアミド連結を介して、分子内にただ１回出現し得る、または数回組み入れることができる。別の好ましいリンカーは、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２アミノリンカーなどのアルキルアミノリンカー、および同様にＣ３またはＣ６チオールリンカーなどのアルキルチオールリンカーである。一部の実施例では、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分を使用してペプチドおよびタンパク質をヌクレオチドとコンジュゲートすることができる。例としては、５’－アミノ－修飾因子Ｃ６および３’－アミノ－修飾因子Ｃ６試薬が挙げられる。
Ｂ．切断可能なエレメントを切断する方法

【0170】

切断可能なエレメントを、酸、塩基、求核試薬、求電子試薬、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素、小分子、核酸、タンパク質などへの曝露を含めた任意の適切な方法によって切断することができる。一部の実施例では、切断可能なエレメント（例えば、切断可能なリンカー）は、細胞プロセスまたはその副産物による切断を受けやすい。細胞プロセスは、酵素、二次メッセンジャー分子、代謝産物、タンパク質、およびフリーラジカルを伴い得る。
Ｃ．感光性基

【0171】

切断可能なエレメントは、感光性基であり得る。感光性基は、ホスホロアミダイト化学によってＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに導入することができる。ＰＣ－アミノタグホスホロアミダイトと成長しているオリゴヌクレオチド鎖の遊離の５’－ＯＨ基の選択的反応、その後の支持体からの切断および脱保護の結果、第一脂肪族アミノ基に光切断可能なリンカーを通じて連結したリン酸ジエステル基の導入をもたらすことができる。次いで、このアミノ基を使用して、アミン反応性試薬との合成後修飾反応を通じて種々の光切断可能なマーカーを導入することができる（Ｏｌｅｊｎｉｋ Ｊ ｅｔ． ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． １９９８； ２６： ３５７２－６）。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の２つのヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド５３とヌクレオチド５４）を連結する光切断可能な脂肪族基を含み得、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをＵＶ光に曝露させ、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド５３と５４の間）の切断（ｂｒｅａｋ）をもたらすことができる。他の例では、光切断可能なアミノタグホスホロアミダイトをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の間に位置付けることができ、ＵＶ光を使用して光切断可能なアミノタグホスホロアミダイトにおける切断を開始させ、それにより、ポリヌクレオチドリーダー配列を分離することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を開始させるために使用することができる光切断可能なリンカーの例は、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の２つのヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド５３とヌクレオチド５４）を連結する光切断可能な脂肪族基を含み得、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを可視光線に曝露させ、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド５３と５４の間）切断（ｂｒｅａｋ）をもたらすことができる。他の例では、光切断可能なクマリンフォトリンカーをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の間に位置付けることができ、可視光線を使用して光切断可能なクマリンフォトリンカーの切断を開始させ、それにより、ポリヌクレオチドリーダー配列を分離することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を開始させるために使用することができる光切断可能なリンカーの例は、クマリンリンカーであり得る。光切断可能なリンカーをポリヌクレオチド配列に導入する他の方法は、例えば、その内容全体が本明細書において参照される米国特許出願第ＵＳ２００８０２２７７４２Ａ１号、同第ＵＳ２０１０００２２７６１Ａ１号、同第ＵＳ７８９７７３７Ｂ２号に記載されている。
Ｄ．リボヌクレアーゼに基づく切断

【0172】

一部の実施例では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、エンドリボヌクレアーゼ、例えば、ＲＮＡを定義されたリボヌクレオチド配列モチーフにおいてまたはその内部で切断するエンドリボヌクレアーゼに対する切断部位を含む。例えば、切断可能なエレメントは、配列特異的エンドリボヌクレアーゼによって認識される切断部位を含み得る。エンドリボヌクレアーゼは、天然に存在するものまたは工学的に作製されたものであり得る。一部の実施例では、エンドリボヌクレアーゼは、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドによって形成されるヌクレオチド配列に特異的なものであり得る。一部の実施例では、エンドリボヌクレアーゼの配列特異性を、オリゴヌクレオチドとの融合によって、または他のタンパク質ドメインとの融合によって工学的に操作することができる。例えば、配列特異的エンドリボヌクレアーゼ酵素を、２つの機能的に独立したドメイン、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド内のＲＮＡを前進的かつ配列に無関係の様式で加水分解するＲＮａｓｅ ＨＩと、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド内の配列を認識するジンクフィンガーとを融合することによって工学的に操作することができる。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドとリボヌクレアーゼＨの別のコンジュゲーションにより、配列特異的切断をもたらすことができる。例えば、Ｓｕｌｅｊ ｅｔ．ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１２； ４０ （２２）： １１５６３－７０およびＦｕｋｕｍａ ｅｔ． ａｌ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００３； １４ （２）： ２９５－３０１を参照されたい。一部の場合では、切断可能なエレメントは、ＲＮａｓｅ Ｈ１を動員してＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの二本鎖領域を切断することができる（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい）。

【0173】

切断可能なエレメントは、例えば、Ｚａｕｇ ｅｔ． ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８； ２７， ２５， ８９２４－８９３１に記載されている通り、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａの切除されたＩＶＳ ｒＲＮＡ部分などの配列特異的ｓｓＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される切断部位を含み得る。他の例では、切断可能なエレメントは、例えば、Ｂｅｌｏｇｌａｚｏｖａ ｅｔ．ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００８；２８３ （２９）： ２０３６１－２０３７１に記載されている通り、配列特異的ｓｓＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＣａｓ２によって認識される１つまたは複数の切断部位を含み得る。他の例では、切断可能なエレメントは、例えば、Ｇｌｏｗ ｅｔ． ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１５； ４３ （５）２８６４－７３において考察されている通り、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＲＮａｓｅ Ｍｉｎｉ－ＩＩＩによって認識されるｄｓＲＮＡ１つまたは複数の好ましい部位を含み得る。他の例では、短いオリゴヌクレオチドを外部ガイド配列（ＥＧＳ）として使用してヒトＲＮａｓｅ Ｐによる部位特異的ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を方向付けることができる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の２．１ｋｂの表面抗原ｍＲＮＡを標的とする１３ｍｅｒのＥＧＳにより、ＲＮａｓｅ ＰによるＨＢＶ ＲＮＡの切断を誘導することができた。（Ｗｅｒｎｅｒ Ｍ ｅｔ． ａｌ， ＲＮＡ． １９９８；４（７）：８４７－５５． を参照されたい）。エンドリボヌクレアーゼは、配列または構造特異的エンドリボヌクレアーゼＣａｓ６スーパーファミリー、例えばＣａｓ６Ａのメンバーであり得る（Ｈｏｎｇ Ｌｉ （２０１５）， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｊａｎｕａｒｙ ６； ２３（１）： １３－２０を参照されたい）。エンドリボヌクレアーゼは、Ｃａｓ６ｆとしても公知のＣｓｙ４であり得る。ｓｓＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲエンドリボヌクレアーゼのＣａｓ１３ファミリーに属するものまたはその誘導体であり得る。エンドリボヌクレアーゼは、プレｃｒｅＲＮＡ転写物を処理することができるＣｐｆ１またはＣａｓ５ｄ酵素であり得る（Ｚｅｔｓｃｈｅ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． （２０１６）， ”Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｒＲＮＡ ａｒｒａｙ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２０１６）ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｂｔ．３７３７）。

【0174】

切断可能なエレメントは、リボザイム、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム、デルタ肝炎ウイルスリボザイムなどによって切断可能なエレメントであり得る。リボザイムは、天然に存在するものであってもよく、例えばＬｅｖｙ ｅｔ． ａｌ， ＲＮＡ ２００５． １１： １５５５－１５６２において考察されている通り、「触媒」鎖と「基質」鎖に分離することによってトランス作用リボザイムになるように工学的に作製されたものであってもよい。一部の場合では、２つのリボザイムを協働させて使用して、所望の標的配列の後での切断を可能にすることができる。一部の場合では、異なる細胞の区画において機能する代替の人工リボザイム－タンパク質複合体を、Ｓａｍａｒｓｋｙ ｅｔ． ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９９；９６ （１２）： ６６０９－６６１４において示されている通り、リボザイムを特定の細胞内部位に送達するため、または特定の型のＲＮＡを標的とするために局在化決定因子を使用することによって設計することができる。一部の場合では、リボザイムの使用には、活性のための外因性小分子の結合、例えば、ｇｌｍＳリボザイムが伴い得る。

【0175】

一部の実施例では、アプタマーとカップリングすることにより、リボザイムの活性をリガンドにより制御されるようにさらに調整することができる。アプタマーは、リガンドに結合する、または他の点では、環境（例えば、ｐＨ、温度、容量オスモル濃度、塩濃度など）の変化を、情報伝達ドメインを通じてループＩおよび／またはループＩＩと直接カップリングした様式で「検知する」能力に基づいて選択することができる。リガンドは、例えば、タンパク質、ヌクレオチドまたは小分子リガンドであり得る。例えば、ＵＳ８６０３９９６Ｂ２に記載されている通り、リガンドのアプタマーへの結合により、情報伝達ドメインとループ、ステムまたは触媒コアのうちの１つまたは複数の相互作用の変化を引き起こすことができ、したがって、リボザイム活性をリガンドの存在または非存在に依存的にモジュレートすることができる。

【0176】

切断可能なエレメントのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断（例えば、ｓｇＲＮＡ）を所望の時点で独立に誘導することができる；例えば、遺伝子にコードされたエンドリボヌクレアーゼを宿主細胞内で活性化することができる。エンドリボヌクレアーゼをコードするベクターまたはプラスミドを所望の時点で細胞にトランスフェクトすることができる。１つまたは複数のエンドリボヌクレアーゼを１つまたは複数の独立したプロモーターの制御下に置くことができる。プロモーターのうちの１つまたは複数を所望の時点で活性化することができる。
Ｅ．アンチセンスオリゴヌクレオチド

【0177】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの１つまたは複数の切断可能なエレメントを、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合が可能になるように設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドであり得る。ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の一本鎖ＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、ＲＮＡｓｅ Ｈを使用して、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡを切断することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合することができる切断可能なエレメント（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のステムループのＲＮＡループ）に関しては、切断可能なエレメント（例えば、ステムループのループ）は、約６～約４０ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１２～約１６ヌクレオチドの長さ、または約１２～約２５ヌクレオチド、または約１０～約３０ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断可能なエレメント（例えば、ステムループのループ）の相補性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であり得る。配列が切断可能なエレメントと完全にまたは部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを宿主細胞内で産生させることまたは宿主細胞に導入することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または他の公知のトランスフェクション方法を使用して細胞にトランスフェクトすることができる。

【0178】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｍｉＲＮＡ応答エレメントを含み得る。ｍｉＲＮＡ応答エレメントの長さは、約１５～約３０ヌクレオチド、例えば、約２０～約２５ヌクレオチドの長さであり得る。ｍｉＲＮＡの長さは、約２０～約２４ヌクレオチド、例えば、約２１～約２３ヌクレオチド、例えば、約２２ヌクレオチドの長さであり得る。ｍｉＲＮＡとＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のｍｉＲＮＡ応答エレメントの配列相補性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であり得る。

【0179】

切断可能なエレメントはｍｉＲＮＡ応答エレメント（ＭＲＥ）を含み得、ＭＲＥに結合することができるｍｉＲＮＡを宿主細胞内で産生させることまたは宿主細胞に導入することができる。ｍｉＲＮＡは、ＭＲＥを標的とし、第１の切断可能なエレメントを切断することができるｍｉＲＩＳＣ複合体の形態で存在し得る。
Ｆ．部位特異的化学的ヌクレアーゼ

【0180】

特異的ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断は、部位特異的ヌクレアーゼ活性を有するように設計された化学化合物によって実現することができる。

【0181】

化学的ヌクレアーゼを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドに対する配列特異的親和性を有するように設計することができる。例えば、トリス（２－アミノベンズイミダゾール）を切断するＲＮＡをＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メチルオリゴリボヌクレオチドにジスルフィド結合またはアミド結合を介して付着させて、ＲＮＡ基質および部位選択性を示す有機触媒ヌクレアーゼを形成することができる（例えば、Ｇｎａｃｃａｒｉｎｉ ｅｔ．ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２００６， １２８ （２４）， ｐｐ ８０６３－８０６７を参照されたい）。他の例では、化学的ＲＮＡｓｅ（例えば、１，１０－フェナントロリン部分、ネオクプロイン（ｎｅｏｃｕｐｒｉｎｅ）Ｚｎ（ＩＩ）、ネアミン）のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対する部位特異性は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えば、ポリアミド核酸を使用することによって実現することができる。

【0182】

化学的ＲＮＡｓｅ（例えば、ジエチレントリアミン部分）のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対する部位特異性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチドタンパク質またはＰＮＡを組み合わせて使用することによって実現することができる。一部の実施例では、ＲＮＡ結合性タンパク質を、１，１０－フェナントロリン－銅複合体などの配位化合物を共有結合により付着させることにより、配列特異的ヌクレアーゼに化学的に変換することができる。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ．ａｌ， Ｓｉｇｍａｎ ＤＳ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８７； ２３７ （４８１９）： １１９７－２０１を参照されたい。別の例では、部位特異的ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を、ブレオマイシン－Ｆｅ（ＩＩ）とＥＤＴＡまたはオリゴヌクレオチドをコンジュゲートして、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対する特異性を有する人工ヌクレアーゼを形成することによって実現することができる。

【0183】

化学的ヌクレアーゼの例としては、１，１０－フェナントロリン銅（Ｓｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、二価鉄エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、大環状ランタニド複合体、メタロポルフィリン、サレンの金属複合体、酢酸ウラニル、ロジウム（ＩＩＩ）の八面体金属錯体、ベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレート、脂肪族モノアミン－、ジアミン－およびポリアミン、ネオマイシンＢならびに銅（ＩＩ）アミノグリコシド複合体などのアミノグリコシドなどが挙げられる。一部の場合では、化学的ヌクレアーゼは、ヌクレオシドの糖部分を標的とし、切断部位において糖から水素原子を引く抜くことによる酸化的切断を触媒することができる。
Ｇ．光化学的切断

【0184】

一部の実施例では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断に使用される作用因子の活性をさらに制御するために、光ケージング基を使用することができる。例えば、本開示に記載されている部位特異的化学的ヌクレアーゼの遊離を制御するために、光活性化可能なまたは「ケージド」プローブの光分解を使用することができる。別の例では、例えば、Ｂｏｈａｃｏｖａ ｅｔ．ａｌ， Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０１８． １６， １５２７に示されている通り、光ケージング基を使用して、リボヌクレアーゼまたは制限酵素によるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を、光分解による遊離まで遮断することができる。別の例では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のヌクレオチドの１つまたは複数上の光ケージング基を使用して、アンチセンスヌクレオチドに対する認識配列を、光分解による遊離まで遮蔽し、それにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を開始させることができる。別の例では、光ケージング基をアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの切断因子に付着させることができ、これは、光分解されると、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドへの結合およびＲＩＳＣ複合体の形成の開始に利用可能になる。別の例では、光ケージング基を使用して、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断のための「ｍｉＲＮＡ応答エレメント」を光分解による遊離まで遮蔽することができる。他の態様では、これだけに限定することなく、光ケージング基を、異なる切断特徴を有する多数の切断エレメントの切断のためにオルソゴナルな処理レジメンで使用することができる。

【0185】

光ケージング基を、タグが１つまたは複数の方法による検出および／または数量化に適し得る「タグ付け」切断反応に使用することができる。例えば、２－ニトロ－ベンジルに基づく光切断可能な基を、光分解時に遊離する色素をさらに用いて標識することができ、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの活性化の「効率」またはＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの非活性化に関する検出可能なマーカーとして使用することができる。別の例では、「切断事象」が開始されたら、切断可能なエレメントに組み入れられた光ケージドヌクレオチドからの「蛍光タグ」の遊離によりＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断可能なエレメントに結合するリボヌクレアーゼタンパク質がタグ付けされ得、ここで、蛍光タグの測定値がＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断に関する代理マーカーになり得る。

【0186】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに合成により組み入れることができる光ケージング基の例としては、当技術分野で公知の方法によってヘテロ原子（通常Ｏ、ＳまたはＮ）にエーテル、チオエーテル、エステル（リン酸またはチオホスフェートエステルを含む）、アミンまたは同様の官能基として連結することができるオルト－ニトロベンジルに基づくケージング基が挙げられる。２－ニトロベンジルに基づくケージング基の例としては、α－カルボキシ－２－ニトロベンジル、１－（２－ニトロフェニル）エチル、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル、１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル、５－カルボキシメトキシ－２－ニトロベンジル、ニトロフェニルなどが挙げられる。光除去可能な保護基の他の例としては、ベンジルオキシカルボニル、３－ニトロフェニル、フェナシル、３，５－ジメトキシベンゾイニル、２，４－ジニトロベンゼンスルフェニル、エチジウムモノアジド、ビマンアジドおよびそれらのそれぞれの誘導体が挙げられる。

【0187】

本明細書に記載の感光性リンカーは、いくつかのメソメリズム形態として表すことができる。単一の構造が描かれている場合、関連性のあるメソメリズム形態のいずれも意図されている。構造式によって表される本明細書に記載のクマリンリンカーは関連するメソメリズム形態のいずれかで示すことができる。例示的なメソメリズム構造を以下に式（Ｉ’）に関して示す：

【化13】

【0188】

感光性保護基をヌクレオシドおよびヌクレオチド内のヒドロキシおよびリン酸または核酸塩基に付着させることができる。例えば、Ｂｏｈａｃｏｖａ ｅｔ．ａｌ， Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０１８， １６，１５２に記載されている通り、例えば、２－ニトロベンジル－、６－ニトロピペロニル－およびアントリル－９－メチル基によって保護された２’－デオキシ－５－（ヒドロキシメチル）ウリジンヌクレオシド、一リン酸および三リン酸の光ケージド誘導体をポリヌクレオチドに酵素的に組み入れることができる。光切断は、糖環からの水素結合の引き抜き、塩基から光により励起された切断因子までの直接電子伝達、または光切断からのエネルギーの伝達および付加生成物の形成による一重項酸素生成などの種々の機構を通じて起こり得る。
Ｈ．切断可能なエレメントの切断

【0189】

２種またはそれよりも多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種）のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断可能なエレメントを同じ切断性部分によって切断することができる。２種またはそれよりも多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種）の異なるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を異なる外部因子によって誘導することができる。

【0190】

切断誘導性作用因子は、電磁放射線であり得る。切断誘導性作用因子は、可視スペクトル内の特定の波長の光であり得る。切断エレメントを、ＵＶ光によって切断することができる。

【0191】

光の波長は、２２０～４６５ｎｍにわたり得る。曝露プロトコールにおける光の強度は、約５、１０、１５、２０、２５、３５、４０、５０、７０、９０、１１０、１２０、１４０、１６０、１７５、１９０、２００、２２０、２４０、２６０ ２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６５０、６７５、７００、７２０、７４５、７６５、７９０、８１０、８３０、８５０、８７０、９００、９２０、９４５、９６５、９８５、１０００、１０２５、１０５０、１０８０、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２４０、１２７５、１２９０、１３２０、１３５０、１３８０、１４００、１４２０、１４５０、１４７０、１４９０、１５２０、１５４０、１５６０、１６００、１６３０、１６５０、１６７０、１７００、１７２０または１７５０ｍＷ／ｃｍ^２であり得る。曝露プロトコールにおける光の強度は、約７０ｍＷ／ｃｍ^２から１００ｍＷ／ｃｍ^２まで、８０ｍＷ／ｃｍ^２～１１０ｍＷ／ｃｍ^２、９０ｍＷ／ｃｍ^２～１２０ｍＷ／ｃｍ^２、１００ｍＷ／ｃｍ^２～１３０ｍＷ／ｃｍ^２、１１０ｍＷ／ｃｍ^２～１４０ｍＷ／ｃｍ^２、１２０ｍＷ／ｃｍ^２～１５０ｍＷ／ｃｍ^２、１３０ｍＷ／ｃｍ^２～１６０ｍＷ／ｃｍ^２、１４０ｍＷ／ｃｍ^２～１７０ｍＷ／ｃｍ^２、１５０ｍＷ／ｃｍ^２～１８０ｍＷ／ｃｍ^２、１６０ｍＷ／ｃｍ^２～１９０ｍＷ／ｃｍ^２、１７０ｍＷ／ｃｍ^２～２００ｍＷ／ｃｍ^２、１８０ｍＷ／ｃｍ^２～２１０ｍＷ／ｃｍ^２、１９０ｍＷ／ｃｍ^２～２２０ｍＷ／ｃｍ^２、２００ｍＷ／ｃｍ^２～２３０ｍＷ／ｃｍ^２、２１０ｍＷ／ｃｍ^２～２４０ｍＷ／ｃｍ^２、２２０ｍＷ／ｃｍ^２～２５０ｍＷ／ｃｍ^２、２３０ｍＷ／ｃｍ^２～２６０ｍＷ／ｃｍ^２、２４０ｍＷ／ｃｍ^２～２７０ｍＷ／ｃｍ^２、２５０ｍＷ／ｃｍ^２～２８０ｍＷ／ｃｍ^２、２６０ｍＷ／ｃｍ^２～２９０ｍＷ／ｃｍ^２、または２７０ｍＷ／ｃｍ^２～３００ｍＷ／ｃｍ^２にわたり得る。光の波長は、約３２０ｎｍから約３９０ｎｍまでにわたり得る。光の波長は、約３２０ｎｍから４２５ｎｍまで、３２０ｎｍ～４２０ｎｍ、４２０ｎｍ～５２０ｎｍ、５２０ｎｍ～６２０ｎｍ、４２０ｎｍ～７００ｎｍにわたり得る。光の波長は、約３２０ｎｍよりも長い、３３０ｎｍよりも長い、３４０ｎｍよりも長い、３５０ｎｍよりも長い、３６０ｎｍよりも長い、３７０ｎｍよりも長い、３８０ｎｍよりも長い、３９０ｎｍよりも長い、４００ｎｍよりも長い、４１０ｎｍよりも長い、４２０ｎｍよりも長い、４３０ｎｍよりも長い、４４０ｎｍよりも長い、４５０ｎｍよりも長い、４６０ｎｍよりも長い、４７０ｎｍよりも長い、４８０ｎｍよりも長い、４９０ｎｍよりも長い、５００ｎｍよりも長い、５１０ｎｍよりも長い、５２０ｎｍよりも長い、５３０ｎｍよりも長い、５４０ｎｍよりも長い、５５０ｎｍよりも長い、５６０ｎｍよりも長い、５７０ｎｍよりも長い、５８０ｎｍよりも長い、５９０ｎｍよりも長い、６００ｎｍよりも長い、６１０ｎｍよりも長い、６２０ｎｍよりも長い、６３０ｎｍよりも長い、６４０ｎｍよりも長い、６５０ｎｍよりも長い、６６０ｎｍよりも長い、６７０ｎｍよりも長い、６８０ｎｍよりも長い、６９０ｎｍよりも長い、または７００ｎｍよりも長いものであり得る。光の波長は、約７００ｎｍ未満、６９０ｎｍ未満、６８０ｎｍ未満、６７０ｎｍ未満、６６０ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６４０ｎｍ未満、６３０ｎｍ未満、６２０ｎｍ未満、６１０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５９０ｎｍ未満、５８０ｎｍ未満、５７０ｎｍ未満、５６０ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５４０ｎｍ未満、５３０ｎｍ未満、５２０ｎｍ未満、５１０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４９０ｎｍ未満、４８０ｎｍ未満、４７０ｎｍ未満、４６０ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４４０ｎｍ未満、４３０ｎｍ未満、または４２５ｎｍ未満であり得る。光の波長は、約４２０ｎｍから４３０ｎｍまで、４３０ｎｍ～４４０ｎｍ、４４０ｎｍ～４５０ｎｍ、４５０ｎｍ～４６０ｎｍ、４６０ｎｍ～４７０ｎｍ、４７０ｎｍ～４８０ｎｍ、４８０ｎｍ～４９０ｎｍ、４９０ｎｍ～５００ｎｍ、５００ｎｍ～５１０ｎｍ、５１０ｎｍ～５２０ｎｍ、５２０ｎｍ～５３０ｎｍ、５３０ｎｍ～５４０ｎｍ、５４０ｎｍ～５５０ｎｍ、５５０ｎｍ～５６０ｎｍ、５６０ｎｍ～５７０ｎｍ、５７０ｎｍ～５８０ｎｍ、５８０ｎｍ～５９０ｎｍ、５９０ｎｍ～６００ｎｍ、６００ｎｍ～６１０ｎｍ、６１０ｎｍ～６２０ｎｍ、６２０ｎｍ～６３０ｎｍ、６３０ｎｍ～６４０ｎｍ、６４０ｎｍ～６５０ｎｍ、６５０ｎｍ～６６０ｎｍ、６６０ｎｍ～６７０ｎｍ、６７０ｎｍ～６８０ｎｍ、６８０ｎｍ～６９０ｎｍ、または６９０ｎｍ～７００ｎｍにわたり得る。曝露プロトコールにおいて使用される光の出力ワット数は、ＯＡＩ ３０６ ＵＶパワーメーターによって測定して、約５０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１７５、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、２５０、３７０、３９０、４２０、４４５０、４８０、５００、５３０、５５０、５７０、６００、６２０、６５０、６７０、７００、７２０、７５０、７７０、８００、８２０、８５０、８７０、９００、９２０、９５０、９７０、１０００、１０２０、１０５０、１０７０、１１００、１１２０、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００ ４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、または６０００Ｗであり得る。

【0192】

曝露の持続時間は、１秒間から３０分間までであり得る。曝露の持続時間は、１秒間から３０秒間まで、３０秒間～６０秒間、１分間～５分間、５分間～１０分間、１０分間～２０分間、２０分間～３０分間、３０分間～４０分間、４０分間～５０分間、または５０分間～１時間であり得る。曝露の持続時間は、約１時間よりも長く、約５０分間よりも長く、約４０分間よりも長く、約３０分間よりも長く、約２０分間よりも長く、約１０分間よりも長く、約５分間よりも長く、約１分間よりも長く、約３０秒間よりも長く、または約１秒間よりも長くであり得る。曝露の持続時間は、約２秒間未満、約３０秒間未満、約１分間未満、約５分間未満、約１０分間未満、約２０分間未満、約３０分間未満、約４０分間未満、約５０分間未満、または約１時間未満であり得る。曝露プロトコールは、連続した曝露またはパルス状曝露またはその両方を含み得る。パルス曝露の持続時間は均一であっても変動してもよい。

【0193】

光源は、帯域フィルターにかけた広範なスペクトルの光であり得る。帯域フィルターは、３４５ｎｍの帯域フィルターであり得る。帯域フィルターは、４２０ｎｍロングパスフィルターであり得る。光源は紫外線（ＵＶ）であり得る。光源はＬＥＤであり得る。ＬＥＤは紫外線を放出し得る。ＬＥＤは可視光線を放出し得る。ＬＥＤは赤外線を放出し得る。
ＶＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ複合体の機能

【0194】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体は、異なる機能に関して使用することができる。機能としては、酵素活性、例えば、標的特異的核酸編集を挙げることができる。一部の場合では、触媒として不活性型のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために使用することができる。一部の場合では、１つまたは複数の機能的ドメインを、ＣＲＩＳＰＲ複合体に、例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、またはその両方を通じて、共有結合によりまたは非共有結合により連結することができる。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドステムループおよびＲＮＡ結合性タンパク質

【0195】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数のステムループＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）と相互作用することができる１つまたは複数のステムループを含み得る。これらのステムループは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）の相互作用またはＣＲＩＳＰＲ複合体と標的ＤＮＡの結合に悪影響が及ばないように位置付けることができる。１つまたは複数のステムループをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の外側に置くことができる。１つまたは複数のステムループＲＮＡ結合性タンパク質は、例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑｐ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、Ｆｌ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、Ｓ１、Ｓ１ｍ、７ｓ、またはＰＲＲ１であり得る。

【0196】

一部の場合では、ステムループＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）は、ステムループＲＮＡと１種もしくは複数種の他のタンパク質もしくはポリペプチド、または１つもしくは複数の機能的ドメインのどちらにも結合することができるアダプタータンパク質（すなわち、媒介体）として作用し得る。アダプタータンパク質は、１つまたは複数の機能的ドメインを含み得るエフェクタータンパク質または融合体を動員することができる。一部の場合では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、１つまたは複数の機能的ドメインを有する融合タンパク質であり得る。
Ｂ．ＣＲＩＳＲＰエフェクタータンパク質および機能的ドメイン。

【0197】

一部の場合では、１つまたは複数の機能的ドメインをＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）に直接または間接的に付着させることができる。１つまたは複数の機能的ドメインをＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と共有結合により融合することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、触媒として活性型のＣａｓタンパク質または触媒として不活性型のＣＲＩＳＰＲタンパク質であり得る。
Ｃ．機能的ドメインの例

【0198】

１つまたは複数の機能的ドメインは、核局在化配列（ＮＬＳ）または核外移行シグナル（ＮＥＳ）であり得る。

【0199】

１つまたは複数の機能的ドメインは、転写活性化ドメインであり得る。転写活性化ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼであり得る。

【0200】

１つまたは複数の機能的ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑止活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性または核酸結合活性を含む１つまたは複数の活性を有し得る。

【0201】

１つまたは複数の機能的ドメインは、トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡヒドロキシルメチラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストン脱アセチル化酵素ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、活性化因子ドメイン、核局在シグナルドメイン、転写調節タンパク質（または転写複合体動員）ドメイン、細胞内取り込み活性関連ドメイン、核酸結合性ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素の動員因子；ヒストン修飾酵素の阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ、ヒストンデリボシラーゼ、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼ、またはヒストン尾部プロテアーゼであり得る。

【0202】

一部の場合では、機能的なドメインを不活性型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、不活性型Ｃａｓ９酵素）に連結することができる。不活性型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、不活性型Ｃａｓ９酵素）と連結した機能的なドメインを、プロモーターまたはエンハンサーに結合させ、かつ／またはそれを活性化するために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、不活性型Ｃａｓ９）を含むＣＲＩＳＰＲ複合体をプロモーターまたはエンハンサーとの結合に方向付けるために、プロモーターまたはエンハンサーとアニーリングし得るガイド配列を含む１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを提供することもできる。
Ｄ．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の突然変異

【0203】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、１つまたは複数の突然変異を含み得る（したがって、それをコードする核酸分子も突然変異を有し得る）。１つまたは複数の突然変異は、人工的に導入された突然変異であり得、触媒ドメイン内の１つまたは複数の突然変異であり得る。Ｃａｓ９酵素を参照した触媒ドメインの例は、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩおよびＨＮＨドメインであり得る。１つまたは複数の突然変異により、Ｃａｓ９の１つまたは複数の触媒ドメインを不活性にすることができる。１つまたは複数の突然変異により、Ｃａｓ９の触媒活性を０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２分の１、５分の１、１０分の１、５０分の１、１００分の１、または１０００分の１に低下させることができる。一部の場合では、１つまたは複数の突然変異により、Ｃａｓ９の触媒活性を０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍増大させることができる。
Ｅ．ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞に送達するためのＲＮＡアプタマー

【0204】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、細胞透過性ＲＮＡアプタマーを用いて修飾することができる。細胞透過性ＲＮＡアプタマーにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの細胞への有効な送達を改善することができる。ＲＮＡアプタマーは、細胞表面受容体に結合し、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの細胞への進入を促進することができる。細胞特異的送達を媒介するために、細胞透過性アプタマーを、特定の細胞受容体を標的とするように設計することができる。
Ｆ．多数のＣＲＩＳＰＲ複合体

【0205】

一部の場合では、系は、本発明で提供される１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ複合体を含む。第１のおよび第２の（またはそれよりも多くの）ＣＲＩＳＰＲ複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける方法に使用することができる。第１のおよび第２の（およびそれよりも多くの）ＣＲＩＳＰＲ複合体内のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）は同じであっても異なってもよい。一実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ系は、異なるガイド配列と同じＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を有する複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み得る。別の例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ系は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複数の異なるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、触媒として活性型のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と触媒として不活性型（ｉｎａｃｔｉｖｅ）のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の混合物）を含み得る。
Ｇ．例えば細胞における多数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド

【0206】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ系またはｉｎ ｖｉｖｏ系、例えば、宿主細胞は、２種またはそれよりも多く（例えば、２種、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９種または１００種）の異なるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み得、ここで、異なるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列のヌクレオチド配列は、独立に、２種またはそれよりも多くの異なる標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の領域と完全にまたは部分的に相補的である。多数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、２種、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９種または１００種の異なるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド）を使用して、１つまたは複数の細胞型における標的配列を同時にまたは同時にではなく切断することができる。異なるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、異なる１つもしくは複数の切断エレメントの相対的位置、または同じ１つもしくは複数の切断エレメントの相対的位置を有し得る。
ＶＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分の発現

【0207】

一部の場合では、本発明で提供されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを核酸から発現させることができる。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの発現

【0208】

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を発現させるための１つまたは複数の発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターをまず宿主細胞にトランスフェクトし、次いで、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターおよび誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを宿主細胞に同時にトランスフェクトすることができる。単一の（型の）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターおよび誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞にトランスフェクトすることができる。宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を内因性に発現する宿主細胞であり得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードするメッセンジャーＲＮＡを遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ｓｇＲＮＡと一緒に使用することもできる。ベクターを使用する場合、ベクターは、誘導性プロモーターを含有し得る。条件付きプロモーターおよび／または誘導性プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターであり得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードする導入遺伝子を細胞のゲノム内に組み込むことができる。

【0209】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を発現する導入遺伝子を細胞に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）導入遺伝子を単離された細胞に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体トランスジェニック細胞を、トランスジェニック生物体から細胞を単離することによって得ることができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）導入遺伝子を、同じく本明細書に記載の通り、ベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）および／または粒子および／またはナノ粒子送達によって真核細胞に送達することができる。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の誘導性発現

【0210】

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを誘導的に発現させることができる。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を誘導的に発現させることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）の発現を誘導することにより、所望の時点で、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）を標的とし、その標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）を切断するように「オン」にすることができるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド／ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）複合体の形成をもたらすことができる。誘導性複合体を使用して、複合体の活性半減期を限定することによってまたはモデル生物体またはヒト細胞における組織特異的編集を実現することによってオフターゲット効果を低減することができる。誘導性複合体を使用して、ディープシーケンシングによって測定して、細胞に依存しない刺激に曝露させる前の活性の持続時間を最適化することによってオフターゲット効果を除去することができる。誘導性複合体を使用して、細胞に依存しない刺激に曝露させる前の活性の持続時間を最適化することによって最大化されたオンターゲット編集効率：オフターゲット編集効率の比を得ることができる。誘導性組織特異的編集を使用して、標的化された組織の編集された領域と編集されていない領域の間の表現型の差異を観察することができる。

【0211】

誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を宿主細胞内で発現させることができる。発現は任意の順序であってよい。
ＩＸ．適用

【0212】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用して、細胞または生物体における変化を引き起こすことができる。ＣＲＩＳＲＰポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を複合体として導入することもでき、細胞内でそれらの複合体を形成させることもできる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を細胞に受動的に導入することもでき、ビヒクルを通じて導入することもできる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は導入時に緩衝剤中に存在し得る。

【0213】

一部の場合では、遮蔽を、細胞培養物全体を覆うように創出することができる。遮蔽は、様々な技法（レーザー切断、３Ｄ印刷、写真平板など）を使用して創出することができる。遮蔽は、光を定義済みの領域内に透過するように設計することができる。光切断可能なリンカーを含むＣＲＩＳＰＲオフ複合体と併せて使用する場合、光（例えば、ＵＶ光）が透過する領域における編集を低減することができ、光に曝露されない領域における編集は維持することができる。ＣＲＩＳＰＲオン複合体と併せて使用する場合、光（例えば、ＵＶ光）が透過する領域における編集を開始させることができる。

【0214】

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲオフ複合体活性は時間依存的であり得る（例えば、実施例８、図１４～１６において見ることができる通り）。細胞を、完全な編集前の時点でＵＶ光などの切断活性化因子に曝露させることができ、その結果、ヘテロ接合性クローンが生じる。あるいは、そのような方法を使用して、患者由来の細胞系の病的な対立遺伝子を標的化することができる。
Ａ．核酸編集

【0215】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体により、真核細胞における１つまたは複数の突然変異を誘導することができる。１つまたは複数の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）による細胞の各標的配列における１つまたは複数のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含み得る。１つまたは複数の突然変異は、前記細胞の各標的配列における約１～約７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換であり得る。１つまたは複数の突然変異は、前記細胞の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換であり得る。標的配列は遺伝子であり得、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＡＭＫ１、ＰＲＫＡＧ３、ＳＴＫ３、ＣＡＭＫ１、Ｃｈｒ８ｑ２３、ＣＥＬ、ＩＲＡＫ４、ＤＮＭＴ１、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＧＲＫ１、ＰＲＧＮ、ＡＡＶＳ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＸＣＲ４、ＦＡＭ１６３Ａ、ＧＡＡ、ＣＲＫ１、ＩＲＡＫ４、ＭＡＰＲＥ１、ＭＩＰ、ＯＭＰ、ＯＰＮ１ＳＷ、ＰＲＫＡＧ３、ＳＴＫ３、ならびにＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＡを含み得る（例えば、実施例５、６、９、１１および１２において見ることができる通り）。

【0216】

核酸編集は、内因性調節性制御エレメント（例えば、エンハンサーまたはサイレンサー）を標的とし得る。核酸編集は、プロモーターまたはプロモーターの近位のエレメントを標的とし得る。これらの制御エレメントは、転写開始部位（ＴＳＳ）の上流または下流に、ＴＳＳから２００ｂｐのところから開始して１００ｋｂ離れたところまで位置し得る。公知の制御エレメントを標的とすることを使用して、目的の遺伝子を活性化または抑止することができる。単一の制御エレメントが多数の標的遺伝子の転写に影響を及ぼし得る。したがって、単一の制御エレメントを標的とすることを使用して、多数の遺伝子の転写を同時に制御することができる。

【0217】

１．核酸編集のためのＣＲＩＳＰＲオン機構

【0218】

一部の場合では、ＯＮ ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が細胞内に入ったら、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができる。ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドは、光切断可能なエレメントによってガイド配列から分離されたポリヌクレオチドリーダー配列を含み得る。細胞をＵＶ照射に曝露させ、その結果、切断エレメントの切断およびポリヌクレオチドリーダー配列の遊離をもたらすことができる。次いで、ＣＲＩＳＰＲ複合体により標的配列を切断することができる。一部の場合では、ドナー核酸も細胞に導入し、それを、切断部位における相同組換えに使用して、核酸に編集を導入することができる。

【0219】

２．核酸編集のためのＣＲＩＳＰＲオン／オフ機構

【0220】

一部の場合では、宿主細胞内の標的ＤＮＡの標的遺伝子の編集の調整可能なモジュレーションは、（ｉ）本明細書に記載のまたは当技術分野で公知のウイルスによるまたはウイルスによらない送達方法またはこれらの組合せを使用して、（ａ）第１の切断エレメントおよび第２の切断エレメントを含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、切断エレメントが、切断を受けやすく、ガイド配列のヌクレオチド配列が、標的核酸配列と完全にまたは部分的に相補的であり、第１の切断エレメントが、ポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の５’末端の間に位置付けられている、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、（ｂ）触媒活性を有するＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）とを宿主細胞に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素がＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する、ステップと、（ｉｉ）ＵＶ光への曝露により、ポリヌクレオチド内の第１の配列エレメントの切断を誘導し、それにより、ポリヌクレオチドリーダー配列を遊離させ、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子のより高い標的特異的切断を活性化するステップとを含む。その後、方法は、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの足場配列内に位置し得る第２の配列エレメントの切断を所望の時点でＵＶ光へのパルス状曝露によって誘導し、それにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断し、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子の標的特異的切断を非活性化または低減するステップを含み得る。
Ｂ．遺伝子の調節

【0221】

ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、触媒として不活性型のＣａｓ９であり得るＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成させることができる。触媒として不活性型のＣａｓ９を転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）と融合することができる。融合、例えば、Ｃａｓ９－ＶＰ６４融合を使用して、標的遺伝子またはクロマチン領域の発現を調整可能にモジュレートすることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのポリヌクレオチドリーダー配列は、ガイド配列を介したＣＲＩＳＰＲ複合体の標的遺伝子への効率的な局在を妨げ得る。ポリヌクレオチドリーダー配列の切断により、ガイド配列を介したＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への効率的なターゲティングをもたらすことができ、これにより、転写活性化をもたらすことができる。その後、第２の切断因子を、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに曝露することにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断をもたらし、ＣＲＩＳＰＲ複合体（または切断されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質から解離されている場合にはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質）の、遺伝子の転写を活性化する能力を低下させるかまたは阻害することができる。

【0222】

本明細書に記載の活性化系または抑止系のいずれかを有する領域を標的とした後、例えば、ＲＮＡｓｅｑまたはマイクロアレイによる、ａ）推定上の標的のセット（例えば、制御エレメントの極めて近くに位置する遺伝子のセット）の転写の読み取り、またはｂ）全トランスクリプトーム読み取りのいずれかを行うことができる。

【0223】

別の例では、本発明で提供されるＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、宿主細胞における２種またはそれよりも多くの標的遺伝子の上位相互作用を試験することができる。方法は、（ｉ）ウイルスによるまたはウイルスによらない送達方法またはこれらの組合せを使用して、（ａ）第１の切断エレメントおよび第２の切断エレメントを含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、切断エレメントが、切断を受けやすく、ガイド配列のヌクレオチド配列が、第１の標的核酸配列と完全にまたは部分的に相補的である、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、（ｂ）触媒活性を有するＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）酵素とを宿主細胞に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲ酵素がＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するステップと、（ｉｉ）所望の時点で、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の第１の切断エレメントの切断を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子のより高い標的特異的切断を活性化するステップと、次いで、（ｉｉｉ）所望の時点で第２の切断エレメントの切断を誘導し、それにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子の標的特異的切断を非活性化または低減するステップとを含み得る。

【0224】

方法は、（ｉ）ウイルスによるまたはウイルスによらない送達方法またはこれらの組合せを使用して、（ａ）第１の切断エレメントおよび第２の切断エレメントを含む第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、切断エレメントが、切断を受けやすく、ガイド配列のヌクレオチド配列が、第２の標的配列の領域（例えば、標的遺伝子内）と完全にまたは部分的に相補的である、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、（ｂ）触媒活性を有するＣＲＩＳＰＲ酵素とを宿主細胞に導入し、その結果、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲ酵素が第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するステップと、（ｉｉ）所望の時点で、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の第１の切断エレメントの切断を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子のより高い標的特異的切断を活性化するステップと、次いで、（ｉｉｉ）所望の時点で第２の切断エレメントの切断を誘導し、それにより、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子の標的特異的切断を非活性化または低減するステップとをさらに含み得る。

【0225】

さらに、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体内の第１の切断エレメントの切断は、組織特異的プロモーター、例えば、筋肉特異的プロモーターの制御下に置くことができる。例えば、細胞における遺伝子操作されたエンドリボヌクレアーゼＣａｓ６ａ／Ｃｓｙ４の発現を、所与の時点で第１の切断エレメントの切断を誘導するために活性化することができる組織特異的プロモーター（例えば、筋肉）プロモーターの制御下に置くことができる。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体内の第２の切断エレメントを所望の時点で所与の配列特異的小分子に曝露させることによって誘導的に切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、転写活性化因子またはリプレッサー活性を有するドメインと融合したｄＣａｓ９であり得、特定の組織における所与の遺伝子の対間の上位相互作用を試験するために使用することができる。

【0226】

別の例では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、１つまたは複数の宿主細胞内の標的ＤＮＡ内の２種またはそれよりも多くの標的遺伝子のオルソゴナルな転写を誘導することができる。「オルソゴナル」という用語は、独立していることを意味し得る、すなわち、２種またはそれよりも多くの標的遺伝子は、独立に調節され得るまたは独立に転写され得る。方法は、（ａ）第１の切断エレメントおよび第２の切断エレメントを含む２種またはそれよりも多くの異なる誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、第１の配列エレメントおよび第２の配列エレメントが、切断を受けやすく、ガイド配列のヌクレオチド配列が、２種またはそれよりも多くの異なる標的遺伝子の付近の１つまたは複数の標的ＤＮＡと完全にまたは部分的に相補的である、誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、（ｂ）転写活性化因子ドメインと連結した触媒として不活性型（ｉｎａｃｔｉｖｅ）のＣＲＩＳＰＲ酵素とを宿主細胞に導入し、その結果、異なる誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素が異なるＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するように、ウイルスによるまたはウイルスによらない送達方法またはこれらの組合せを使用するステップであって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、１つまたは複数のエフェクタードメインを含む、ステップと、（ｉｉ）所望の時点で、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド内の第１の切断エレメントの切断を誘導し、したがって、標的遺伝子の発現を調和させるステップとを含み得る。標的ＤＮＡは、単一の遺伝子または制御エレメント内の隣接領域であり得る。
Ｘ．キット

【0227】

キットは、本明細書に記載の構成成分のうちの１つまたは複数を含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含む本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を含み得る。キットは、リンカー、例えば、切断可能なリンカーを含み得る。キットは、光切断可能なリンカーを含み得る。キットは、説明書を含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ複合体を含む細胞または生物体を含み得る。

【0228】

キットは、遺伝子構築物、例えば、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／または１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を発現させるためのベクター系ならびにキットの使用に関する説明書を含む。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を発現させるための１つまたは複数の遺伝子構築物（例えば、１つまたは複数のベクター系）を含む細胞を含み得る。

【0229】

キットは、核酸標的を、例えば本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体と接触させるために適した組成物を生成するための賦形剤を含み得る。組成物は、ゲノム内の核酸標的配列を接触させるために適したものであり得る。組成物は、組成物（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｓｇＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９と複合体を形成したもの）を細胞に送達するために適したものであり得る。組成物は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡ、またはそれとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体）を対象に送達するために適したものであり得る。賦形剤は、薬学的に許容される賦形剤であり得る。

【0230】

キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断可能なエレメントの１つまたは複数の切断に使用するための１つまたは複数の試薬を含み得る。１つまたは複数の試薬は、任意の適切な容器に入れて提供することができる。キットは、１種または複数の反応または保管緩衝剤を含み得る。キットは、試薬を含み得る。試薬は、特定のアッセイに使用可能な形態で、または使用前に１種または複数の他の構成成分の添加を必要とする形態で（例えば、濃縮物または凍結乾燥した形態で）提供することができる。反応または保管緩衝剤は、任意の緩衝剤、例えば、炭酸ナトリウム緩衝剤、炭酸水素ナトリウム緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、またはこれらの組合せであり得る。緩衝剤のｐＨは約７から約１０までであり得る。

【0231】

キットは、ガイド配列および調節エレメントに作動可能に連結するようにベクターに挿入するための、ガイド配列に対応する１種または複数のポリヌクレオチドを含み得る。キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含み得る。
ＸＩ．ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの合成

【0232】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の方法によって合成することができる。ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、化学的に合成することができ。ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、２’－０－チオノカルバメートで保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトを使用して合成することができる。ポリヌクレオチドの合成方法は、例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３， １１５４０－１１５５６ （２０１１）；Ｔｈｒｅｌｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０， ７４６－７５４ （２０１２）；およびＤｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２５， ９４０－９５０ （２００３）に記載されている。本明細書に記載の修飾のいずれかを組み合わせ、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、例えば、ガイド配列および／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する配列（例えば、足場配列）に組み入れることができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、そのそれぞれが具体的に参照により本明細書に組み込まれるＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ （Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， （１９８１） ２２： １８５９－１８６２）に記載されているホスホロアミダイト法によって、またはＭａｔｔｅｕｃｃｉ， ｅｔ ａｌ．， （Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， （１９８１） １０３： ３１８５）によるトリエステル法によって、または市販の自動ポリヌクレオチドの合成機を使用する他の化学的方法によって調製することができる。

【0233】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２２： １８５９－１８６２ （１９８１）に最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ． ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ６１５９－６１６８ （１９８４）に記載されている通り、自動合成機を使用して化学的に合成することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの合成は、固相合成の間に特別なホスホロアミダイト試薬を使用する化学修飾を導入することを含み得る。
Ａ．ｓｇＲＮＡ連結

【0234】

ｓｇＲＮＡであるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、非リン酸ジエステル結合を介して化学的に連結またはコンジュゲートした、修飾されたｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み得る。修飾されたｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、非ヌクレオチドループを介して化学的に連結またはコンジュゲートすることができる。修飾されたｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、非リン酸ジエステル共有結合性リンカーを介して接合することができる。共有結合性リンカーは、クマリン、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルホン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性連結、ディールス・アルダー環化付加対または閉環メタセシス対、およびマイケル反応対などのＣ－Ｃ結合形成基からなる群から選択される化学的部分であり得る。
Ｂ．切断可能なエレメント

【0235】

本明細書のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の切断可能なエレメントは、適切に保護または活性化することができる官能基を各末端に伴って提供することができる。官能基は、エーテル、エステル、カルバメート、リン酸エステルまたはアミン連結を介して共有結合により付着させることができる。例えば、ヘキサエチレングリコールを、一方の末端において感光性保護基（すなわち、ＮＶＯＣまたはＭｅＮＰＯＣ）を用いて保護することができ、他の末端において２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ－クロロホスファイトを用いて活性化して、ホスホロアミダイトを形成することができる。エーテル、カルバメートまたはアミン連結を形成する他の方法は、当業者に公知であり、特定の試薬および参考文献は、Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９２などのテキストに見出すことができる。
Ｃ．ｓｇＲＮＡの合成

【0236】

まず、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡを、ホスホロアミダイト合成プロトコールを使用して合成することができる（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｐ．， ｅｄ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌ ２８８， Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ （２０１２））。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡ配列を、ライゲーションのための妥当な官能基を含有するように官能化することができる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ．Ｔ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （２０１３）を参照されたい）。官能基は、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、クマリン、ソラレン、ジアジリン、またはアジドであり得る。修飾されたｔｒａｃｒおよびｔｒａｃｒメイト配列が官能化されたら、この２つのポリヌクレオチド間に共有結合性の化学結合または連結を形成することができる。化学結合は、クマリン、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルホン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性連結、ディールス・アルダー環化付加対または閉環メタセシス対、およびマイケル反応対などのＣ－Ｃ結合形成基に基づくものであり得る。

【0237】

ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡ配列を化学的に合成することができる。ｓｇＲＮＡは、融合体の形態で一緒に合成してもよいし、別々に合成してもよいし、化学的に連結してもよい。化学合成は、固相ポリヌクレオチド合成機械を使用した自動化を使用し、２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９８） １２０： １１８２０－１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （２０００） ３１７： ３－１８）または２’－チオノカルバメート（２’－ＴＣ）化学（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （２０１１） １３３： １１５４０－１１５４６；Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１５） ３３： ９８５－９８９）を用いることができる。

【0238】

ｓｇＲＮＡは、糖の修飾、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合、プリンおよびピリミジン残基を介した種々のバイオコンジュゲーション反応、ループ、架橋、および非ヌクレオチド連結を用いて共有結合により連結することができる。Ｓｌｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． （２００９） ４８： ６９７４－６９９８；Ｍａｎｏｈａｒａｎ， Ｍ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． （２００４） ８： ５７０－９；Ｂｅｈｌｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （２００８） １８： ３０５－１９；Ｗａｔｔｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ． Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ （２００８） １３： ８４２－５５；Ｓｈｕｋｌａ， ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ （２０１０） ５： ３２８－４９。

【0239】

ｓｇＲＮＡは、クリックケミストリーを使用してアセンブルすることができる。ｃｒＲＮＡ ｔｒａｃｒＲＮＡおよび／またはその中の配列エレメントをトリアゾールリンカーを使用して共有結合性の連結によってアセンブルすることができる。５’－ヘキシンｔｒａｃｒＲＮＡと３’－アジドｃｒＲＮＡをライゲーションすることによって共有結合により連結したｓｇＲＮＡにすることができる。５’－ヘキシンｔｒａｃｒＲＮＡおよび３’－アジドｃｒＲＮＡのいずれかまたは両方を２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）基で保護することができ、これはその後、Ｄｈａｒｍａｃｏｎプロトコールを使用して除去することができる（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９８） １２０： １１８２０－１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （２０００） ３１７： ３－１８）。
ＸＩＩ．ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの細胞への投与

【0240】

ウイルス媒介性技法および非ウイルス媒介性技法を使用してＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。非ウイルス媒介性技法は、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、微量注射、微粒子銃媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）または細胞融合であり得る。

【0241】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドおよび関連するベクターを細胞にネイキッドで（すなわち、トランスフェクションを促進する作用因子を伴わずに）送達することができる。ネイキッドＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞に、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して送達することができる。
ＸＩＩＩ．医薬組成物：製剤化、投与、送達および投薬

【0242】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、１種または複数種の追加的な活性な物質、例えば、治療的におよび／または予防的に活性な物質を含み得る。医薬組成物の製剤化および／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００５（その全体が本明細書に参照により組み込まれる）に見出すことができる。

【0243】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、（１）安定性を増大させる；（２）細胞トランスフェクションを増大させる；（３）持続放出または遅延放出を可能にする（例えば、ポリヌクレオチドのデポ製剤から）；（４）体内分布（例えば、標的ポリヌクレオチド、一次構築物、または特定の組織もしくは細胞型に対するｍＲＮＡ）を変更する；（５）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるコードされるタンパク質の翻訳を増加させる；かつ／または（６）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるコードされるタンパク質の放出プロファイルを変更するための１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化することができる。

【0244】

賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁の補助剤、表面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、保存剤、および／または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、保存剤、緩衝剤、平滑剤、および／または油であり得る。賦形剤は、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞、一次構築物、またはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、対象への移植のため）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体およびこれらの組合せであり得る。

【0245】

医薬組成物中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、またはいずれかをコードする核酸、および薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加的な成分の相対量は、処置を受ける対象の同一性、サイズ、および／または状態に応じて変動し得、組成物を投与する経路にもさらに依存する。組成物は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、またはいずれかをコードする核酸を、０．１％から１００％の間、例えば、０．５％から５０％の間、１～３０％の間、５～８０％の間、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）含み得る。

【0246】

リピドイドの合成は広範囲にわたって記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、本明細書に記載の修飾されたＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、および一次構築物の送達に特に適する（Ｍａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２０１０ ２１： １４４８－１４５４；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． ２０１０ ２６７： ９－２１；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８ ２６： ５６１－５６９；Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１０ １０７： １８６４－１８６９；Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１ １ １０８： １２９９６－３００１を参照されたい；全てその全体が本明細書に組み込まれる）。リピドイドと、これだけに限定されないが、ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ－ＤＭＧを含めた他の構成成分の異なる比を使用して、ポリヌクレオチドの製剤、一次構築物、またはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを、これだけに限定されないが、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞などを含めた異なる細胞型を送達するために最適化することができる。

【0247】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して製剤化することができる。医薬組成物はリポソームを含み得る。本明細書に記載の医薬組成物は、以前に記載されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるポリヌクレオチド送達に適することが示されている、安定化されたプラスミド－脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化された核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるものなどのリポソームを含み得る（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． １９９９ ６： ２７１－２８１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． １９９９ ６： １４３８－１４４７；Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２００５ ２２： ３６２－３７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ ２： １００２－１００７を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、官能化された脂質二重層間に架橋結合を有し得る脂質小胞として製剤化することができる。

【0248】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、脂質－ポリカチオン複合体として製剤化することができる。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で公知であり、かつ／またはその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２０１７８７０２号に記載されている方法によって実現することができる。医薬組成物は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１２０９９７５５号に記載されているＰＥＧ化された脂質のうちの少なくとも１つを含み得る。

【0249】

ＬＮＰ製剤は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１１ １２７２５５号または同第ＷＯ２００８ １０３２７６号に記載されている方法によって製剤化することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１ １２７２５５および／またはＷＯ２００８１０３２７６に記載されている通りＬＮＰ製剤に封入することができる。

【0250】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、固体脂質ナノ粒子として製剤化することができる。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０～１０００ｎｍの球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性物質および／または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）を用いて安定化することができる固体脂質コアマトリックスを有し得る。脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質－ポリマーナノ粒子であり得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， ＡＣＳ Ｎａｎｏ， ２００８， ２ （８）， ｐｐ １６９６－１７０２を参照されたい）。

【0251】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、一次構築物、またはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを脂質ナノ粒子または迅速に排出される脂質ナノ粒子に封入することができ、次いで、脂質ナノ粒子または迅速に排出される脂質ナノ粒子を本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知のポリマー、ハイドロゲルおよび／または外科用密封材に封入することができる。

【0252】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、制御放出および／または標的化送達のための製剤は、少なくとも１つの制御放出コーティングも含み得る。制御放出コーティングとしては、これだけに限定されないが、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースが挙げられる。

【0253】

制御放出および／または標的化送達製剤は、ポリカチオン側鎖を含有し得る分解性ポリエステルを少なくとも１つ含み得る。分解性ポリエステルは、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リシン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、およびこれらの組合せであり得る。分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲーションを含み得る。

【0254】

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、治療用ナノ粒子に封入することができる。治療用ナノ粒子は、持続放出用に製剤化することができる。期間は、数時間、数日、数週、数カ月および数年を含み得る。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマーおよび治療剤、例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み得る（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１００７５０７２号ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号および同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号を参照されたい）。治療用ナノ粒子は、標的特異的になるように製剤化することができる。治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含み得る（国際特許公開第ＷＯ２０１１０８４５１８号を参照されたい）。

【0255】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、合成ナノ担体に封入する、それと連結するおよび／またはそれと結び付けることができる。合成ナノ担体は国際特許公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号に記載されている方法によって製剤化することができる。合成ナノ担体は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを放出するための反応性基を含有し得る（そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１２０９５２５５２号および米国特許公開第ＵＳ２０１２０１７１２２９号を参照されたい）。

【0256】

合成ナノ担体は、標的化放出用に製剤化することができる。合成ナノ担体は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを指定のｐＨにおいて、かつ／または所望の時間間隔後に放出するように製剤化することができる。合成ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを２４時間後に、かつ／またはｐＨ４．５で放出するように製剤化することができる（そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１０１３８１９３号および同第ＷＯ２０１０１３８１９４号ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１ １００２０３８８号および同第ＵＳ２０１１００２７２１７号を参照されたい）。

【0257】

合成ナノ担体は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの制御放出および／または持続放出のために製剤化することができる。持続放出用の合成ナノ担体は、例えば、本明細書に記載の通りおよび／またはそのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１０１３８１９２号および米国特許公開第２０１００３０３８５０号に記載されている通り製剤化することができる。

【0258】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、高分子化合物と共にまたはその中に製剤化することができる。ポリマーとしては、少なくとも１つのポリマーポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬに移植されたＰＥＧ、カチオン性脂質ポリマー、生分解性カチオン性脂質ポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋結合した分枝ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、生分解性ブロック共重合体、生分解性ランダム共重合体、生分解性ポリエステル共重合体、生分解性ポリエステルブロック共重合体、生分解性ポリエステルブロックランダム共重合体、直鎖状生分解性共重合体、ポリ［ａ－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋結合カチオン性マルチブロック共重合体、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リシン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマーまたはこれらの組合せを挙げることができる。

【0259】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、別の化合物とコンジュゲートすることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、および／または他の生分解性作用因子、例えば、リン酸カルシウムの組合せを使用してナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分を、ナノ粒子の微調整が可能になるように組み合わせてコアシェル、ハイブリッド、および／または層ごとのアーキテクチャにすることができ、したがって、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの送達を増強することができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ． ２００６ ５： ７９１－７９６；Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２００８ ２９： １５２６－１５３２；ＤｅＫｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ２０１ １ ６３： ７４８－７６１；Ｅｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０１１ ３２： ７７２１－７７３１；Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１１ Ｊｕｎ ６； ８ （３）： ７７４－８７；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0260】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増大させるために、ペプチドおよび／またはタンパク質と共に製剤化することができる。ペプチドは細胞透過性ペプチドおよびタンパク質であり得、細胞内送達を可能にするペプチドを使用して医薬製剤を送達することができる。

【0261】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドをｅｘ ｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトし、その後、対象に移植することができる。そのようなベクターの例としては、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質または関連するポリペプチドをコードする一次核酸構築物または合成配列が挙げられる。医薬組成物は、修飾されたＲＮＡを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾されたＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）中に入れて送達するためのビロソーム、ならびに、修飾されたＲＮＡを送達するための電気穿孔された細胞、例えば、ＭＡＸＣＹＴＥ（登録商標）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）およびＥＲＹＴＥＣＨ（登録商標）（Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）からのものを含み得る。

【0262】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、または関連するベクター構築物の細胞に基づく製剤を、細胞トランスフェクション（例えば、細胞担体において）を確実にするため、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの体内分布を変更するため（例えば、細胞担体を特定の組織または細胞型にターゲティングすることによって）、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させるために使用することができる。

【0263】

組成物は、例えば、直接浸漬するまたは浸すことによって、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏剤、クリーム剤、ゲル、ローション剤、および／または点滴薬によって、組成物をコーティングしたまたは含浸させたファブリックまたは生分解性材料などの基質を使用することなどによって、臓器または組織への直接送達のために製剤化することもできる。

【0264】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、および関連する配列／ポリペプチドは、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与することができる。これらとしては、経腸、胃腸内、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ））、脳内（大脳の中に）、脳室内（脳室の中に）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体の中に）、皮下（皮膚の下に）、経鼻投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中に）、動脈内（動脈の中に）、筋肉内（筋肉の中に）、心臓内（心臓の中に）、骨内注入（骨髄の中に）、くも膜下腔内（脊柱管の中に）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（陰茎の基部の中に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身に分布させるための無傷の皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、吹送（鼻で吸い込むこと）、舌下、唇下、浣腸、点眼剤（結膜上に）、または点耳剤中が挙げられる。組成物は、組成物が血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門を横断することを可能にするやり方で投与することができる。

【0265】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、物質（「ペイロード」）の生物学的標的への送達が望まれる多数の異なるシナリオ、例えば、標的を検出するための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび関連するベクター構築物を１種または複数種の他の治療剤、予防剤、診断剤、または造影剤と組み合わせて使用することができる。

【0266】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、および他の一次構築物は、リンカーおよびペイロードの両方を任意の有用な方向で含むように設計することができる。例えば、末端を２つ有するリンカーを使用して、一方の末端をペイロードに付着させ、他方の末端を核酸塩基に、例えばデアザ－アデノシンもしくはデアザ－グアノシンのＣ７位もしくはＣ８位またはシトシンもしくはウラシルのＮ－３位もしくはＣ５位に付着させることができる。ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法薬、または他の治療剤などの治療剤であり得る。

【0267】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、細胞の表現型を変更するために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする配列を治療薬ならびに／または臨床および研究の場において使用することができる。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドおよび関連するベクター構築物ならびにそれらから翻訳されたタンパク質を治療剤または予防剤として使用することができる。例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドまたはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチドまたはエフェクタータンパク質をコードする修飾されたｍＲＮＡ）を対象に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳させて、対象における治療的に関連性のあるまたは予防的ポリペプチドの発現を方向付けることができる。

【0268】

ガイド配列（核酸標的化ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ内の）の、核酸標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を方向付ける能力を任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、試験されるガイド配列を含めた、核酸標的化複合体を形成するために十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に、例えば核酸標的化複合体の構成成分をコードするベクターを用いたトランスフェクションによって供給することができ、その後、標的核酸配列内の優先的な標的化（例えば、切断）の評価を行うことができる。標的核酸配列の切断を、試験管中、標的核酸配列、試験されるガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含めた核酸標的化複合体の構成成分を準備し、試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で標的配列における結合または切断率を比較することによって評価することができる。

【0269】

本発明で提供される組成物は、種々の疾患、障害、および／または状態のいずれか、例えば、以下のうちの１つまたは複数の処置に使用することができる：自己免疫障害（例えば、糖尿病、ループス、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染性疾患（例えば、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染症、真菌感染症、敗血症）；神経性障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性症などの血管新生障害）；増殖性障害（例えばがん、良性新生物）；呼吸器疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化性障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌障害、代謝障害、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例えば、腎疾患）；心理学的障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ性障害（例えば、貧血、血友病）など。

【0270】

【実施例】

【0271】

以下の実施例は、本発明の作製および使用の仕方の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するものでも、以下の実験が、実施した全ての実験または唯一の実験であることを表すものでもない。標準の略語、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｎｔ、ヌクレオチド；などが使用される場合がある。

【0272】

（実施例１）
光切断可能なリンカーを有する修飾されたポリヌクレオチドの生成および機能的特徴付け

【0273】

４種のｓｇＲＮＡを合成した。ｓｇＲＮＡの一部を表す配列を以下に提示する。ｓｇＲＮＡに対する修飾は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。

【0274】

「対照」：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
「第２なし」：
ＧＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
「３ｂｐステム」：
ＵＧＡＧＡＡＡＵＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
「６ｂｐステム」：

【0275】

ＣＡＣＵＧＡＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ

【0276】

第１のｓｇＲＮＡ（「対照」または「Ｍｏｄｓ」）は、ガイド配列の５’側のポリヌクレオチドリーダー配列を欠くｓｇＲＮＡである。第２のｓｇＲＮＡ（「第２なし」または「二次構造なし」）は、ステムループを形成しないように設計されたガイド配列の５’側のポリヌクレオチドリーダー配列を有し、その後、光切断可能なリンカー、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｄａｔａ／ＰｒｏｄｕｃｔＩｎｆｏ．ｐｈｐ？ｉｔｅｍ＝１０－４９２０）がポリヌクレオチドリーダー配列の３’末端とガイド配列の５’側の間に挿入されたものであった。ガイド配列の５’側の塩基の前でステムループを形成するように設計されたポリヌクレオチドリーダー配列が追加され、その後、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｄａｔａ／ＰｒｏｄｕｃｔＩｎｆｏ．ｐｈｐ？ｉｔｅｍ＝１０－４９２０）光切断可能なリンカーが追加されたポリヌクレオチドリーダー配列の３’末端とガイド配列の５’側の塩基の間に挿入された、２種の追加的なｓｇＲＮＡを合成した。第３のｓｇＲＮＡ（「３ｂｐステム」）は、３ｂｐのステムループを形成するように設計されたポリヌクレオチドリーダー配列を有するものであり、第４のｓｇＲＮＡ（「６ｂｐステム」）は、６ｂｐのステムループを形成するように設計されたポリヌクレオチドリーダー配列を有するものであった。次いで、これらの４つの型のｓｇＲＮＡを、ｓｇＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで光切断するために十分であることが分かっている条件を使用してＵＶＡ光（３２０～３９０ｎｍ）に曝露させた。

【0277】

図２は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌからの低分子ＲＮＡ解析キットを使用して断片解析機器で流したゲル画像であり、ＵＶ光に０分間、５分間、１０分間、または１５分間曝露させた後の４種のｓｇＲＮＡが示されている。設定時点からの全ての画像は、同じゲルにおいて隣接するレーンに流したものである、すなわち、１０分間の試料は全て互いの隣で流したものである。異なる時点からの試料は、多数のｓｇＲＮＡ標的部位の試験を可能にするために異なるゲルで流したものである。条件間の比較は、主に定性的観察に基づくものであった。ＵＶ光に５分間曝露させた後、第２のｓｇＲＮＡ、第３のｓｇＲＮＡ、および第４のｓｇＲＮＡではポリヌクレオチドリーダー配列の切断と一致する横縞模様が示された。１０分曝露後および１５分曝露後の横縞模様も、第２のｓｇＲＮＡ、第３のｓｇＲＮＡ、および第４のｓｇＲＮＡからのポリヌクレオチドリーダー配列の切断と一致するものであった。

【0278】

（実施例２）
ｓｇＲＮＡ活性化の際の標的ＤＮＡカット効率の特徴付け

【0279】

上記の通り、４種のｓｇＲＮＡを、ｓｐＣａｓ９と複合体を形成させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて標的ＤＮＡと一緒に妥当な持続時間にわたってインキュベートした。次いで、図３に示されているように、４種のｓｇＲＮＡをそれぞれＵＶ光（３２０～３９０ｎｍ）に１７５ｍＷ／ｃｍ^２、示されている周期的間隔で曝露させた。設計されたステム（「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」）を有するｓｇＲＮＡのＵＶ媒介性切断は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を活性化する働きをし、その結果、標的特異的ＤＮＡのカットがもたらされた。次いで、標的ＤＮＡを断片解析機器に流して、ＣＲＩＳＰＲ媒介性カットを実証した。図３は、標的ＤＮＡ（ＦＡＮＣＦ）と一緒にインキュベートし、切断因子に規則的な間隔で曝露させたｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体の例を示す。曝露後０分の時点で、第３のｓｇＲＮＡおよび第４のｓｇＲＮＡ（「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」）では、第１のｓｇＲＮＡおよび第２のｓｇＲＮＡと比較してカット効率の低下が示された。切断因子に１５分間曝露させた後、活性化されたｓｇＲＮＡでは標的ＤＮＡのカット効率の上昇が記録された。カットされなかったＤＮＡとカットされたＤＮＡの比の測定により、「６ｂｐステム」について１５分間の曝露での約４５％から３０分間の曝露での約２０％までの低下が示された。比較して、５’ポリヌクレオチドリーダー配列を欠く第１のｓｇＲＮＡ（「Ｍｏｄｓ」）または５’二次構造を欠くｓｇＲＮＡ（「二次構造なし」）では、カットされなかったＤＮＡとカットされたＤＮＡの比によって測定して、切断因子による活性化は示されなかった。「Ｍｏｄｓ」は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有し、ガイド配列の５’へのいかなる塩基付加も有さない修飾された合成ｓｇＲＮＡであり、「二次構造なし」条件では、ガイド配列に対するステムを形成しない５’付加を伴うｓｇＲＮＡを使用する。「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」条件では、ｓｇＲＮＡの５’末端にそれぞれ長さ３ｂｐおよび６ｂｐのステムを形成するように設計された領域を有するｓｇＲＮＡを使用する。

【0280】

（実施例３）
非活性化可能なｓｇＲＮＡの生成および特徴付け

【0281】

６種のｓｇＲＮＡを合成した。ｓｇＲＮＡの一部を表す配列を以下に提示する。ｓｇＲＮＡに対する修飾は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。

【0282】

対照：

【0283】

ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
２１
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ＊ＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
２４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵ＊ＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
５０
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ＊ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
５７
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵ＊ＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
７４

【0284】

ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ＊ＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ

【0285】

第１のｓｇＲＮＡ（「対照」）は光切断可能なエレメントを含まないものであった。第２のｓｇＲＮＡ、第３のｓｇＲＮＡ、第４のｓｇＲＮＡおよび第５のｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’末端から２１位、２４位、５０位、５７位および７４位に光切断可能な結合を有するものであった。次いで、５種のｓｇＲＮＡをＵＶ光に５分間曝露させた。図４は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌからの断片解析機器を使用して流した、ＵＶ光に曝露させた後の５種のｓｇＲＮＡのゲルの画像である。全ての試料を、低分子ＲＮＡキットを用い、製造者のプロトコールに従って流した。ＵＶ光に５分間曝露させた後、５種のｓｇＲＮＡ全てで、それぞれの光切断可能な結合の位置における切断と一致する横縞模様が示された。

【0286】

（実施例４）
ゲノム編集された細胞系の迅速な生成

【0287】

Ｃａｓ９を発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、光切断可能なリンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、切断因子に晒した。図５は、ＤＮＭＴ１を標的とする６種の異なるｓｇＲＮＡを用いたプログラム可能なゲノム編集効率の概略図を示す。第１のｓｇＲＮＡ（「Ｍｏｄ」）は、光切断可能な部位を欠くものであった。第２のｓｇＲＮＡ、第３のｓｇＲＮＡ、第４のｓｇＲＮＡおよび第５のｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’末端から２１位、２４位、５０位、５７位および７４位に光切断可能な結合を有するものであった（それぞれｂ２１、ｂ２４、ｂ５０、ｂ５７、およびｂ７４）。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９混合物［９：１の比］を細胞に導入した。細胞を４８時間にわたって２時間ごとに切断因子に曝露させた。各試料を指定された時点まで暗闇で維持し、次いで、ＵＶ光に１回曝露させて切断を誘導した。次いで、細胞を、トランスフェクションの４８時間後まで暗闇に置いた。トランスフェクションの４８時間後に全ての試料を収集した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノムＤＮＡを全ての試料から収集し、挿入および欠失の存在について当技術分野で公知の標準の手順を使用して解析した。Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ． ”Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ”， Ｊａｎｕａｒｙ １４， ２０１９ ｂｉｏＲｘｉｖに記載されているものと同様に、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。図６のグラフは編集効率を表す。試料を、ＰＣＲを使用して増幅し、配列決定にかけた。配列決定後、増幅後に野生型であるまたは編集された配列の数をＩＣＥによって解析した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。５７位に光切断可能な結合を有するｓｇＲＮＡおよび７４位に光切断可能な結合を有するｓｇＲＮＡではゲノム編集効率の時間依存的な非活性化が示された。

【0288】

（実施例５）
編集されたＨＥＫ２９３細胞系の生成

【0289】

ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＵＶ光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられたＰＣリンカー、ホスホロアミダイト（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）を含み、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡ）、ＣＡＭＫ１（ｓｇ１：ＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡ）、ＰＲＫＡＧ３（ｓｇ１－ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡ；ｓｇ２－ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）、ＳＴＫ３（ｓｇ１－ＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＡＡＣ；ｓｇ２－ＡＡＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＴＣ；ｓｇ３－ＣＣＡＴＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣ；４－ＵＵＵＡＡＵＵＧＣＧＡＣＡＡＣＵＵＧＡＣ）、ＩＲＡＫ４（ＧＴＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＡＡ）、およびＣｈｒ８ｑ２３（ｓｇ１－ＡＧＴＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧ；ｓｇ２－ＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴ；ｓｇ３－ＡＡＧＣＣＴＣＡＡＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＡ）を標的とする標的結合性領域を有する、１２種の異なるｓｇＲＮＡと複合体を形成させて（ＣＲＩＳＰＲオフ）、１２種の実験集団を作製した。Ｃａｓ９をまた、光切断可能なリンカーを有さない、上記の標的結合性領域を有する１２種の異なるｓｇＲＮＡ（標準）とも複合体を形成させた。２４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、室温で１５分間にわたって混合させた。ＨＥＫ２９３細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して室温で５分間にわたって収集して細胞を個別化した。集団を計数して妥当な細胞数を決定し、その後、１００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、得られたペレットをヌクレオフェクション緩衝剤に５μＬ当たり細胞２００，０００個の濃度で再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を予め複合体形成させたＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ溶液に添加し、トランスフェクトを行った。各実験集団を２つのウェルに分割して対照と処理細胞の対の反復実験を形成した。トランスフェクションの４時間後、処理細胞をＵＶ光に１分間、および１５秒間曝露させた（帯域フィルターを用いて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した）。その後、細胞をインキュベーターに戻した。トランスフェクションの４８時間後、対照および処理試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑならびにオンターゲット遺伝子座およびオフターゲット遺伝子座に特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。配列決定データを編集の存在についてＩＣＥを使用して解析した。Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ． ”Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ”， Ｊａｎｕａｒｙ １４， ２０１９ ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。

【0290】

図７は、１２種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率のグラフを示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

【0291】

図８は、光切断可能なリンカーを有さない、図７のｓｇＲＮＡと同じ標的結合性領域を有する１２種の異なる標準ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の編集効率を示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

【0292】

（実施例６）
編集されたＵ２ＯＳ細胞系の生成

【0293】

Ｕ２ＯＳ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能なリンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＵＶ光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられたホスホロアミダイト（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）を含む、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧ）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧ）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧ）を標的とする標的結合性領域を有する６種の異なるｓｇＲＮＡと複合体を形成させて（ＣＲＩＳＰＲオフ）、６種の実験集団を作製した。Ｃａｓ９をまた、光切断可能なリンカーを有さない、上記の標的結合性領域を有する６種の異なるｓｇＲＮＡ（標準）とも複合体を形成させた。１２種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、室温で１５分間にわたって混合させた。Ｕ２０Ｓ細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して室温で５分間にわたって収集して細胞を個別化した。集団を計数して妥当な細胞数を決定し、その後、１００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、得られたペレットをヌクレオフェクション緩衝剤に５μＬ当たり細胞２００，０００個の濃度で再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を予め複合体形成させたＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ溶液に添加し、トランスフェクトを行った。各実験集団を２つのウェルに分割して対照と処理細胞の対の反復実験を形成した。トランスフェクションの４時間後、処理細胞をＵＶ光に１分間、および１５秒間曝露させた（帯域フィルターを用いて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した）。その後、細胞をインキュベーターに戻した。トランスフェクションの４８時間後、対照および処理試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑならびにオンターゲット遺伝子座およびオフターゲット遺伝子座に特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。配列決定データを編集の存在についてＩＣＥを使用して解析した。Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ． ”Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ”， Ｊａｎｕａｒｙ １４， ２０１９ ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。

【0294】

図９は、６種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率のグラフを示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

【0295】

図１０は、光切断可能なリンカーを有さない、図９のｓｇＲＮＡと同じ標的結合性領域を有する６種の異なる標準ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の編集効率を示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

【0296】

（実施例７）
ＵＶ光への曝露なしの場合の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフＣａｓ９複合体によるオフターゲット編集の解析

【0297】

図１３は、上記のＤＮＭＴ１、ＦＡＮＣＦ、およびＶＥＧＦＡを標的とするｓｇＲＮＡに関して高度のオフターゲット編集を有することが分かっているオフターゲット部位における編集のパーセンテージを示すグラフを含む。

【0298】

使用した配列は以下の通りであり、＊は、リンカー（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）の場所を示す：

【0299】

ＤＮＭＴ１

【0300】

オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ

【0301】

オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ

【0302】

オフターゲット１：ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣ

【0303】

ＦＡＮＣＦ

【0304】

オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ

【0305】

オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ

【0306】

オフターゲット２：ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧ

【0307】

ＶＥＧＦＡ

【0308】

オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ

【0309】

オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ

【0310】

オフターゲット３：ＧＣＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＴＧ

【0311】

Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ． ”Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ”， Ｊａｎｕａｒｙ １４， ２０１９ ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９の比３０ｐｍｏｌ：１０ｐｍｏｌを使用してＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。次いで、ＲＮＰをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ｎ＝２４の生物学的反復実験で細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを細胞から収集した。細胞をＵＶ光に曝露させなかった。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。Ｘ軸は、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含むｓｇＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲオフ」）と複合体を形成したＣａｓ９によって、または３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有さないｓｇＲＮＡ（「標準ｓｇＲＮＡ」）と複合体を形成したＣａｓ９によってオフターゲット編集が生じたかどうかを示す。Ｙ軸は、編集されたオフターゲット部位のパーセンテージを示す。図１３において見ることができる通り、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有さない、ＤＮＭＴ１を標的とするｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素に関して観察されるオフターゲット編集は、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素よりも多く、ｐ値≦０．０００１である；３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有さない、ＦＡＮＣＦを標的とするｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素に関して観察されるオフターゲット編集は、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素よりも多く、ｐ値≦０．０００１である；３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有さない、ＶＥＧＦＡを標的とするｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素に関して観察されるオフターゲット編集は、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素よりも多く、ｐ値≦０．０００１である。上述のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのそれぞれの標的部位における編集効率は、上記の通りＩＣＥによって測定して、上述の標準ｓｇＲＮＡのそれぞれの標的部位における編集効率と同じかまたは１～３％低かった。結果から、ネクサスおよびステムループ１内に３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有するｓｇＲＮＡを編集アッセイにおいて使用することにより、ネクサスおよびステムループ１内に３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを欠くｓｇＲＮＡの使用と比べて低いオフターゲット編集活性がもたらされることが例示される。

【0312】

（実施例８）
Ｕ２ＯＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフと複合体を形成したＣａｓ９の時間依存的活性の解析

【0313】

図１４～１６は、「標準ｓｇＲＮＡ」と複合体を形成したＣａｓ９の活性と対照した、ＤＮＭＴ１、ＧＲＫ１、およびＶＥＧＦＡを標的とする「ＣＲＩＳＰＲオフ」と複合体を形成したＣａｓ９の時間依存的活性を示すグラフである。細胞を、４８時間にわたって２時間ごとにＵＶ光に曝露させた。Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ． ”Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ”， Ｊａｎｕａｒｙ １４， ２０１９ ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。

【0314】

（実施例９）
編集されたＫ５６２細胞系の生成

【0315】

Ｋ５６２細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能なリンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＵＶ光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられたホスホロアミダイト（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）を含む、ＥＭＸ１（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）およびＧＲＫ１（ＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧ）を標的とする標的結合性領域を有する２種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、２種の実験集団を作製した。Ｃａｓ９をまた、光切断可能なリンカーを有さない、上記の標的結合性領域を有する２種の異なるｓｇＲＮＡ（標準）とも複合体を形成させた。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、室温で１５分間にわたって混合させた。Ｋ５６２細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して室温で５分間にわたって収集して細胞を個別化した。集団を計数して妥当な細胞数を決定し、その後、１００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、得られたペレットをヌクレオフェクション緩衝剤に５μＬ当たり細胞２００，０００個の濃度で再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を予め複合体を形成させたＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ溶液に添加し、トランスフェクトを行った。各実験集団を２つのウェルに分割して対照と処理細胞の対の反復実験を形成した。トランスフェクションの４時間後、処理細胞をＵＶ光に１分間、および１５秒間曝露させた（帯域フィルターを用いて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した）。その後、細胞をインキュベーターに戻した。トランスフェクションの４８時間後、対照および処理試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑならびにオンターゲット遺伝子座およびオフターゲット遺伝子座に特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。配列決定データを編集の存在についてＩＣＥを使用して解析した。Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ． ”Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ”， Ｊａｎｕａｒｙ １４， ２０１９ ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。

【0316】

図１１は、２種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の編集効率のグラフを示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

【0317】

図１２は、光切断可能なリンカーを有さない、図１１のｓｇＲＮＡと同じ標的結合性領域を有する２種の異なる標準ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の編集効率を示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

【0318】

（実施例１０）
転写調節

【0319】

１０ｂｐのステムループを形成する５’ポリヌクレオチドリーダー配列を含む修飾された活性化可能な（ＣＲＩＳＰＲオン）ｓｇＲＮＡポリヌクレオチドを、ＶＰ６４の転写活性化因子ドメインと融合した不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）と複合体を形成させる。光切断可能なエレメントを、ポリヌクレオチドリーダー配列の３’側およびガイド配列のすぐ５’側に挿入する。ｄＣａｓ９融合酵素と複合体を形成したｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。５’ポリヌクレオチドリーダー配列により、ＣＲＩＳＰＲ複合体がガイド配列と相補的な標的配列のプロモーターと効率的にアニーリングすることができなくなる。標的遺伝子は比較的低い転写活性を有する。所望の時点で、トランスフェクトされた細胞をＵＶ光に曝露させ、その結果、光切断可能な結合およびポリヌクレオチドリーダー配列の遊離の切断をもたらす。その時からＣＲＩＳＰＲ複合体は標的配列のプロモーターにより効率的に結合し、標的配列のより効率的な転写がもたらされる。

【0320】

（実施例１１）
ＵＶ光への曝露ありの場合およびＵＶ光への曝露なしの場合の、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフＣａｓ９複合体によるオンターゲット編集の解析

【0321】

ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を先進の改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０％ｖ／ｖのＦＢＳ中、５回～２０回の間の継代で維持した。細胞を２週間に１回、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１：８の比で継代した。

【0322】

ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）、ＣＥＬ（ＡＡＣＣＡＧＵＵＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＣＡ）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）、ＣＸＣＲ４（ＧＡＵＡＡＣＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＵ）、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）、ＧＡＡ（ＡＧＧＡＧＣＣＧＧＵＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧ）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）、ＭＡＰＲＥ１（ＵＵＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＵＣＣＵＧ）、ＭＩＰ（ＧＣＵＧＧＧＧＵＣＣＵＣＡＣＵＧＣＧＣＵ）、ＯＭＰ（ＧＡＡＣＵＧＵＡＧＣＣＧＣＵＧＣＵＧＣＵ）、ＯＰＮ１ＳＷ（ＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＡＣＵＧ）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とする標的結合性領域を有する２３種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、２３種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を、環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

【0323】

ゲノム解析

【0324】

ＤＮＡ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを単離した。収集後、抽出物溶液を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、その後、９８℃で１０分間インキュベートした。ゲノムＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用し、表１に見出されるプライマー配列を使用して実施した。サンガー配列決定後、インデルの存在をＩＣＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって解析した。

【0325】

図２２は、２３種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率のグラフを示す。左から右に、各ｓｇＲＮＡについて：黒棒（丸）は、光への曝露なしの場合の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す；灰色の棒（四角）は、環境光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す；薄い灰色の棒（三角形）は、３４５ｎｍよりも長い波長の光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。矢印で示されている通り、ＦＡＮＣＦおよびＦＡＭ１６３部位では、曝露後に編集の低減は示されない。使用したランプは６００Ｗ、強度は９０～１２０ｍＷ／ｃｍ^２であった。核局在化シグナルを有するＡｌｄｅｖｒｏｎからのＣａｓ９（ＮＬＳ－Ｓｐ．Ｃａｓ９－ＮＬＳ）を全ての実験に使用した。

【0326】

図２３は、２６種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率を同じ標的結合性配列を有する修飾されていないｓｇＲＮＡと比較したグラフを示す。

【0327】

図３０は、光への曝露後の、Ｃａｓ９と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲオフを発現する細胞において観察される、光への曝露なしの場合のＣａｓ９と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲオフを発現する細胞、および光への曝露ありの場合となしの場合の標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９を発現する細胞と比較したパーセント編集の低減を実証するグラフを示す。

【0328】

図３１は、試験した細胞によって発現されるＣａｓ９－ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を光で不活性化する前の期間を漸増させて観察されたパーセント編集の増大を実証するグラフを示す。

【0329】

図３７は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成したＣＡＭＫ１を標的とする上述のポリヌクレオチドのＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した標準ｓｇＲＮＡと比較したインデルプロファイルである。

【0330】

図３５は、光への曝露の持続時間に対する編集の消失の影響のグラフを示し、完全な消失が４５秒から６０秒の間に実現される。

【0331】

図３６は、細胞を広スペクトルの光に曝露させる時間の増大の細胞生存率に対する影響を示すグラフである。
表１：標的配列プライマー

【表1-1】

【表1-2】

【0332】

（実施例１２）
ＵＶ光への曝露ありの場合およびＵＶ光への曝露なしの場合の、Ｕ２ＯＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフＣａｓ９複合体によるオンターゲット編集の解析

【0333】

Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％ｖ／ｖのＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中、５回～１５回の間の継代で維持した。細胞を、週に１回、ＴｒｙｐＬＥを用いて１：４の比で継代した。全ての細胞を３７℃および５％ＣＯ２で維持した。

【0334】

Ｕ２ＯＳ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ２（ＡＧＵＣＵＡＣＵＡＵＧＡＧＵＵＵＵＣＵＧ）、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とする標的結合性領域を有する１８種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、１８種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を、環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

【0335】

ゲノム解析

【0336】

ＤＮＡ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを単離した。収集後、抽出物溶液を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、その後、９８℃で１０分間インキュベートした。ゲノムＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用し、表１に見出されるプライマー配列を使用して実施した。サンガー配列決定後、インデルの存在をＩＣＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって解析した。

【0337】

図２４は、１８種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率を同じ標的結合性配列を有する修飾されていないｓｇＲＮＡと比較したグラフを示す。

【0338】

（実施例１３）
ＵＶ光への曝露ありの場合およびＵＶ光への曝露なしの場合の、Ｈｅｐ３ｂ細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフＣａｓ９複合体によるオンターゲット編集の解析

【0339】

Ｈｅｐ３Ｂ細胞を先進の改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０％ｖ／ｖのＦＢＳ中、５回～２０回の間の継代で維持した。細胞を２週間に１回、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１：８の比で継代した。

【0340】

Ｈｅｐ３ｂ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）、ＣＥＬ（ＡＡＣＣＡＧＵＵＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＣＡ）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）、ＣＸＣＲ４（ＧＡＵＡＡＣＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＵ）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）、ＧＡＡ（ＡＧＧＡＧＣＣＧＧＵＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧ）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）、ＭＡＰＲＥ１（ＵＵＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＵＣＣＵＧ）、ＭＩＰ（ＧＣＵＧＧＧＧＵＣＣＵＣＡＣＵＧＣＧＣＵ）、ＯＭＰ（ＧＡＡＣＵＧＵＡＧＣＣＧＣＵＧＣＵＧＣＵ）、ＯＰＮ１ＳＷ（ＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＡＣＵＧ）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とする標的結合性領域を有する２３種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、２３種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を４２０ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

【0341】

ゲノム解析

【0342】

ＤＮＡ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを単離した。収集後、抽出物溶液を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、その後、９８℃で１０分間インキュベートした。ゲノムＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用し、表１に見出されるプライマー配列を使用して実施した。サンガー配列決定後、インデルの存在をＩＣＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって解析した。

【0343】

図２５は、２３種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率を同じ標的結合性配列を有する修飾されていないｓｇＲＮＡと比較したグラフを示す。

【0344】

（実施例１４）
クマリンリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡの可視光線への曝露

【0345】

図１８は、ｓｇＲＮＡの５７位および７４位にクマリンリンカー、ジエチルアミノクマリン（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの図である。クマリンリンカーは有意に赤色移動し、可視光線を使用してオリゴヌクレオチドを切断するために使用することができる。クマリンリンカーの遊離は、密接なイオン対形成、その後のクマリニルメチルカチオンと水および他の入手可能な求核試薬との反応を通じて起こる。

【0346】

エレクトロスプレーイオン化

【0347】

ＴＥ緩衝剤（３μＭ）中ＲＮＡ試料を質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ液体クロマトグラフィーシステム（ＬＣ）とＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０Ｂ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計（ＭＳ）の結合）により、陰イオン極性モードで分析した。ＬＣを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ（１．７μｍ、２．１×５ｍｍ）でグラジエント溶離（緩衝剤Ａ：５０ｍＭのＨＦＩＰ；１５ｍＭのヘキシルアミン２％ＭｅＯＨ；緩衝剤Ｂ：ＭｅＯＨ、毎分０．７５ｍＬ、１．０５分で２～９５％Ｂ）を用いて実施した。エレクトロスプレーイオン化をデュアルＥＳＩソース（ガス温度３２５℃、乾燥ガス毎分１２Ｌ、ネブライザー４０ｐｓｉ、Ｖｃａｐ ４ｋＶ、フラグメンター２５０、スキマー６５）を用いて実施した。データを１００～３２００ｍ／ｚ範囲で取得し、４０００～３５０００ｍ／ｚ範囲にデコンボリューションした。

【0348】

図２０Ａは、光への曝露前の、ＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とする上記のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。

【0349】

図２０Ｂは、４２０ｎｍロングパスフィルターにかけた光への曝露後の、上記のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。光に晒さなかったＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡは修飾されていないｓｇＲＮＡと同じ分子量に保持された。光に晒さなかったＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡについて断片化は観察されなかった。図２０Ｂは、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡが４２０ｎｍの光に曝露したら両方の光切断可能な部位において切断されたことを実証する。

【0350】

（実施例１５）
ＵＶにより切断可能なリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＵＶ光への曝露

【0351】

エレクトロスプレーイオン化

【0352】

ＴＥ緩衝剤（３μＭ）中ＲＮＡ試料を質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ液体クロマトグラフィーシステム（ＬＣ）とＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０Ｂ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計（ＭＳ）の結合）により、陰イオン極性モードで分析した。ＬＣを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ（１．７μｍ、２．１×５ｍｍ）でグラジエント溶離（緩衝剤Ａ：５０ｍＭのＨＦＩＰ；１５ｍＭのヘキシルアミン２％ＭｅＯＨ；緩衝剤Ｂ：ＭｅＯＨ、毎分０．７５ｍＬ、１．０５分で２～９５％Ｂ）を用いて実施した。エレクトロスプレーイオン化をデュアルＥＳＩソース（ガス温度３２５℃、乾燥ガス毎分１２Ｌ、ネブライザー４０ｐｓｉ、Ｖｃａｐ ４ｋＶ、フラグメンター２５０、スキマー６５）を用いて実施した。データを１００～３２００ｍ／ｚ範囲で取得し、４０００～３５０００ｍ／ｚ範囲にデコンボリューションした。

【0353】

図４１Ａは、ＵＶ光への曝露前の、５７位および７４位に光切断可能なリンカーを有する、ＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とするＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。

【0354】

図４１Ｂは、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光への曝露後の、図４１ＡのＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。光に晒さなかったＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡは修飾されていないｓｇＲＮＡと同じ分子量に保持された。図４１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡが、３４５ｎｍの光に曝露したら両方の光切断可能な部位で切断されたことを実証する。

【0355】

（実施例１６）
ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９のＵＶ光を用いた不活性化

【0356】

１０ｐｍｏｌのＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）を３０ｐｍｏｌの合成ｓｇＲＮＡと合わせて総体積２０μＬにし、１０分間にわたって複合体を形成させた。このインキュベーション中、細胞を収集し、計数した。ＲＮＰ溶液に細胞溶液５μＬを１μＬ当たり細胞４×１０^４個の濃度で添加し、穏やかに混合した。

【0357】

４Ｄ－ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）システム（Ｌｏｎｚａ）を２０μＬフォーマットで使用して細胞＋ＲＮＰ溶液をトランスフェクトした。トランスフェクションは製造者のプロトコールに従って行った。トランスフェクション後、細胞を培養培地中に回収し、９６ウェルプレートにプレーティングした。

【0358】

ＣＲＩＳＰＲオフ不活性化を、Ｓｕｎｒａｙ ６００ ＵＶ Ｆｌｏｏｄ Ｌａｍｐ（Ｕｖｉｔｒｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して実施した。３４５ｎｍおよび３５５ｎｍの６．５インチ×６．５インチの色ガラス代替ロングパスフィルターをＮｅｗｐｏｒｔ．ｃｏｍから入手し、特注の３Ｄプリントした容器に乗せた。

【0359】

正立顕微鏡を使用した不活性化を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒを使用し、Ｃｏｌｉｂｒｉの７つのフレキシブルな光源および３８５ｎｍのＬＥＤを用いて実施した。

【0360】

図３８は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲオフを使用して必須遺伝子を標的とした細胞培養物の画像である。光に曝露させた細胞培養物（＋ｈｖ）では、光に曝露させていない細胞培養物よりも高い集密度が実証され、これにより、不活性化の欠如により高度の細胞死が引き起こされたことが示される。

【0361】

図２６は、標準ｓｇＲＮＡを用いた場合に見られる比と比較した、オフターゲット編集が起こる前にＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを不活性化することによるオンターゲット編集とオフターゲット編集の比のモジュレーションを示す。ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡの不活性化を、トランスフェクション後の別個の時点で細胞に光を当てることによって実現した。表２において見ることができる通りゲノム内の１つまたは２つの部位で有意なレベルのオフターゲット編集を有した標的部位を選択した。

【0362】

図３９は、ＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクション後の種々の時点でのオンターゲット編集：オフターゲット編集比を示すグラフである。

【0363】

表２：オフターゲット部位

【表2】

【0364】

表３：オフターゲット配列決定プライマー

【表3-1】

【表3-2】

【0365】

ゲノム解析

【0366】

ＤＮＡ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを単離した。収集後、抽出物溶液を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、その後、９８℃で１０分間インキュベートした。ゲノムＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用し、表１に見出されるプライマー配列を使用して実施した。サンガー配列決定後、インデルの存在をＩＣＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって解析した。

【0367】

（実施例１７）
Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲオフを使用したＧＦＰノックアウト

【0368】

１０ｐｍｏｌのＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）を３０ｐｍｏｌの合成ｓｇＲＮＡと合わせて総体積２０μＬにし、１０分間にわたって複合体を形成させた。このインキュベーション中、細胞を収集し、計数した。ＲＮＰ溶液に細胞溶液５μＬを１μＬ当たり細胞４×１０^４個の濃度で添加し、穏やかに混合した。

【0369】

４Ｄ－ヌクレオフェクターシステム（Ｌｏｎｚａ）を２０μＬフォーマットで使用して細胞＋ＲＮＰ溶液をトランスフェクトした。トランスフェクションは製造者のプロトコールに従って行った。トランスフェクション後、細胞を培養培地中に回収し、９６ウェルプレートにプレーティングした。

【0370】

ＣＲＩＳＰＲオフ不活性化を、Ｓｕｎｒａｙ ６００ ＵＶ Ｆｌｏｏｄ Ｌａｍｐ（Ｕｖｉｔｒｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して実施した。３４５ｎｍおよび３５５ｎｍの６．５インチ×６．５インチの色ガラス代替ロングパスフィルターをＮｅｗｐｏｒｔ．ｃｏｍから入手し、特注の３Ｄプリントした容器に乗せた。

【0371】

正立顕微鏡を使用した不活性化を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒを使用し、Ｃｏｌｉｂｒｉの７つのフレキシブルな光源および３８５ｎｍのＬＥＤを用いて実施した。

【0372】

図２７は、細胞において観察されるパーセント編集が、３８５ｎｍの光への曝露が増加するに伴って低減することを示すグラフである。

【0373】

図２８は、光に曝露した細胞内のＧＦＰをコードする遺伝子は不活性化される一方で光に曝露していない細胞はＧＦＰを発現し続けるように、遮蔽を使用してＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを発現する細胞を光に選択的に曝露させた細胞培養物を示す。

【0374】

図４０は、透明な領域では光の通過が可能になり、それにより、ＣＲＩＳＰＲオフと複合体を形成したＣａｓ９ヌクレアーゼの編集活性が不活性化され、暗闇領域は不透明になって編集が妨害されずに進行することが可能になるように図２８の細胞培養物に適用した薄膜遮蔽の画像である。

【0375】

（実施例１８）
ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の可視光線を用いた不活性化

【0376】

図３２は、５７位および７４位にクマリンリンカーを有する、ＭＩＰを標的とするＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡがＬＥＤ光源によってどのくらい迅速に不活性化されるかを示す。クマリンリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を５つの独立したウェルに分割した。４時間後、対の反復実験に覆いをして環境光を取り除いたか、または４３０±２３ｎｍのＬＥＤに１分間、２分間、３分間、または４分間曝露させた。遺伝子編集を不活性化するには１分で十分であった。１００％強度の４３０±２３ｎｍのＬＥＤを有するＣｏｌｉｂｒｉ ７光源を、１回に１つのウェルに光を当てることができる標準の倒立蛍光顕微鏡と一緒に使用した。

【0377】

（実施例１９）
ｓｇＲＮＡ上の多数のリンカーの場所に関する試験。

【0378】

ＲＮＰの形成および送達

【0379】

１０ｐｍｏｌのＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）を３０ｐｍｏｌの合成ｓｇＲＮＡと合わせて総体積２０μＬにし、１０分間にわたって複合体を形成させた。このインキュベーション中、細胞を収集し、計数した。ＲＮＰ溶液に細胞溶液５μＬを１μＬ当たり細胞４×１０^４個の濃度で添加し、穏やかに混合した。

【0380】

４Ｄ－ヌクレオフェクターシステム（Ｌｏｎｚａ）を２０μＬフォーマットで使用して細胞＋ＲＮＰ溶液をトランスフェクトした。トランスフェクションは製造者のプロトコールに従って行った。トランスフェクション後、細胞を培養培地中に回収し、９６ウェルプレートにプレーティングした。

【0381】

ＣＲＩＳＰＲオフ不活性化

【0382】

ＣＲＩＳＰＲオフ不活性化を、Ｓｕｎｒａｙ ６００ ＵＶ Ｆｌｏｏｄ Ｌａｍｐ（Ｕｖｉｔｒｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して実施した。３４５ｎｍおよび３５５ｎｍの６．５インチ×６．５インチの色ガラス代替ロングパスフィルターをＮｅｗｐｏｒｔ．ｃｏｍから入手し、特注の３Ｄプリントした容器に乗せた。

【0383】

正立顕微鏡を使用した不活性化を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒを使用し、Ｃｏｌｉｂｒｉの７つのフレキシブルな光源および３８５ｎｍのＬＥＤを用いて実施した。

【0384】

ゲノム解析

【0385】

ＤＮＡ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを単離した。収集後、抽出物溶液を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、その後、９８℃で１０分間インキュベートした。ゲノムＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用し、表１に見出されるプライマー配列を使用して実施した。サンガー配列決定後、インデルの存在をＩＣＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって解析した。

【0386】

図３４Ａ～３４Ｃは、上記の通りＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した１８種の異なるｓｇＲＮＡによって観察されたパーセント編集を示す。図３４Ａは、それぞれＤＮＭＴ１を標的とする、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した６種の異なるｓｇＲＮＡにおいて観察されたパーセント編集を示す。ｓｇＲＮＡは、標準（Ｍｏｄ）または２１位、２４位、５０位、５７位、または７４位に単一の切断可能なリンカーを有するものである。図３４Ｂは、それぞれＦＡＮＣＦを標的とする、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した６種の異なるｓｇＲＮＡにおいて観察されたパーセント編集を示す。ｓｇＲＮＡは、標準（Ｍｏｄ）または２１位、２４位、５０位、５７位、または７４位に単一の切断可能なリンカーを有するものである。図３４Ｃは、それぞれＶＥＧＦＡを標的とする、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した６種の異なるｓｇＲＮＡにおいて観察されたパーセント編集を示す。ｓｇＲＮＡは、標準（Ｍｏｄ）または２１位、２４位、５０位、５７位、または７４位に単一の切断可能なリンカーを有するものである。

【0387】

（実施例２０）
光への曝露後のＣＲＩＳＰＲオフの断片化を検出するための液滴ＰＣＲ

【0388】

デジタル液滴ＰＣＲ

【0389】

細胞ＲＮＡを、ＤＮａｓｅを伴わないＲＮＡ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して抽出した。ＲＮＡを、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して数量化し、正規化した。

【0390】

ＣＲＩＳＰＲオフ不活性化を、Ｓｕｎｒａｙ ６００ ＵＶ Ｆｌｏｏｄ Ｌａｍｐ（Ｕｖｉｔｒｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して実施した。３４５ｎｍおよび３５５ｎｍの６．５インチ×６．５インチの色ガラス代替ロングパスフィルターをＮｅｗｐｏｒｔ．ｃｏｍから入手し、特注の３Ｄプリントした容器に乗せた。

【0391】

正立顕微鏡を使用した不活性化を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒを使用し、Ｃｏｌｉｂｒｉの７つのフレキシブルな光源および３８５ｎｍのＬＥＤを用いて実施した。

【0392】

全ＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、０．４μＭの転写用リバースプライマーを用いて逆転写した。逆転写産物を、２×ＥｖａＧｒｅｅｎ ｄｄＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘおよび９５℃で３分間の熱サイクル、その後、９５℃で３０秒間および５２．４℃で１分の４０サイクルを使用して増幅した。次いで、シグナルを４℃で５分間にわたって安定化し、その後、９０℃で５分間にわたって不活性化した。次いで、液滴をＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）によって読み取った。

【0393】

表４：ｄｄＰＣＲ試薬：

【表4】

【0394】

図２９は、標準ｓｇＲＮＡと比較した、光への曝露後のＣＲＩＳＰＲオフの存在量の減少を実証するグラフを示す。

【0395】

（実施例２１）
１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピルの調製

【0396】

ホスホロアミダイト化合物３（３－（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）－１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト）をＷｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００３）（ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ、ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＆ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ， Ｖｏｌ． ２２， Ｎｏｓ． ５－８， ｐｐ． １５７９－１５８１）に開示されている方法に従い、アルデヒド化合物１（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－カルバルデヒド）とアリルトリメチルシランをＴｉＣｌ_４の存在下で反応させることによって合成する。次に、前の化合物のオゾン分解およびＮａＢＨ_４を用いた還元ワークアップによってジオール化合物２（７－（ジエチルアミノ）－４－（１，３－ジヒドロキシプロピル）－２Ｈ－クロメン－２－オン）を生成する。２のジメトキシトリチル化、その後のホスフィチル化により、ホスホロアミダイト化合物３を優れた収量で得る。

【化14】

【0397】

（実施例２２）
１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピルとヌクレオチドの連結

【0398】

化合物３の添加後に形成されたリンカーを有するＲＮＡのＤＭＴ（ＤＭＴ＝４，４’－ジメトキシトリチル）保護基を酸により触媒される脱トリチル化反応で除去した。脱トリチル化ＲＮＡは、ヌクレオシドホスホロアミダイト単量体の形態で添加されるヌクレオチドと反応する準備ができている。妥当なヌクレオシドホスホロアミダイトを性化因子（テトラゾールまたは誘導体）と混合する。これらの両方をアセトニトリルに溶解させる。ヌクレオシドホスホロアミダイトのジイソプロピルアミノ基が活性化因子によりプロトン化され、それにより、良好な脱離基に変換される。これは脱トリチル化ＲＮＡの脱保護されたヒドロキシル基によるその近くのリン原子に対する攻撃によって急速に除かれ、新しいリン－酸素結合が形成され、それにより、ホスファイトトリエステル結合が創出される（すぐ下の図に示されている通り）。ヌクレオシドホスホロアミダイトは不活性雰囲気中で合理的に安定であり、多量に調製することができる。

【0399】

【化15】

【0400】

Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｈ、ＯＴＢＤＭＳ（Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルエーテル）、ジシアノメチレンまたはＯＭｅであり得る。

【0401】

一部の実施形態では、ホスホロアミダイトリンカー化合物３のジイソプロピルアミノ基が活性化因子によってプロトン化され、それにより、良好な脱離基に変換される。これは、ヌクレオシド塩基の３’または５’ヒドロキシル基の攻撃によって急速に除かれ、新しいリン－酸素結合が形成される（すぐ下の図に示されている通り）

【化16】

【0402】

Ｘは、Ｈ、ＯＴＢＤＭＳ（Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルエーテル）、またはＯＭｅであり得る。

【0403】

前述の例に記載されているホスホロアミダイト法は、一般に、４つのステップ：ステップ１（脱トリチル化）、ステップ２（カップリング）、ステップ３（キャップ形成）、およびステップ４（酸化）を含むことが当業者には理解されよう。

【0404】

本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態が単に例として提供されていることは当業者には明白であろう。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに思いつくであろう。本明細書に記載の発明の実施形態に対する種々の代替を本発明の実施に任意の組合せで使用することができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびに、それにより、これらの特許請求の範囲内の方法および構造およびそれらの等価物が包含されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41-1】

【図41-2】

【国際調査報告】