(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-02
(54)【発明の名称】低酸素調節プロモーター及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220422BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220422BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220422BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220422BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220422BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220422BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220422BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20220422BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220422BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220422BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220422BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220422BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220422BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220422BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220422BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220422BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220422BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220422BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20220422BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220422BHJP
A61K 47/61 20170101ALN20220422BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/62
C12N15/13
C12N15/12
C07K19/00
C07K16/28
C07K14/705
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C12N15/867 Z
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12N5/0783
C12Q1/02
A61P35/00
A61P35/02
A61K35/17 A
A61K35/76
A61K31/7088
A61K35/761
A61K48/00
A61K47/61
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555018
(86)(22)【出願日】2020-02-24
(85)【翻訳文提出日】2021-10-28
(86)【国際出願番号】 CN2020076429
(87)【国際公開番号】W WO2020181983
(87)【国際公開日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】201911236679.3
(32)【優先日】2019-12-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910184426.X
(32)【優先日】2019-03-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201911236670.2
(32)【優先日】2019-12-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520272880
【氏名又は名称】重▲慶▼精准生物技▲術▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＯＮＧＱＩＮＧ ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯＭＰＡＮＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３８ Ｈａｎｘｉｎｇ Ｒｄ， Ｈａｎｇｕ Ｔｏｗｎ， Ｊｉｕｌｏｎｇｐｏ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３８ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】特許業務法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】張 巍
(72)【発明者】
【氏名】陳 軍
(72)【発明者】
【氏名】斉 亜男
(72)【発明者】
【氏名】徐 艶敏
(72)【発明者】
【氏名】趙 文旭
(72)【発明者】
【氏名】黄 霞
(72)【発明者】
【氏名】趙 永春
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C076
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
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4C087ZB27
4H045AA10
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4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
低酸素調節可能なプロモーターを含むＣＡＲ構造、発現ベクター、ＣＡＲ－Ｔ細胞とその応用、及び、低酸素環境下におけるＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２因子の分泌能力を向上させる方法、並びに、低酸素環境下でＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を向上させる方法を開示する。前記ＣＡＲ構造は、低酸素調節可能なプロモーターを含む。当該低酸素調節可能なプロモーターは、Ｈｉｆ１ａ調節エレメントとミニプロモーターを連結して構成される。当該Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は３～５個である。当該ＣＡＲ構造は、腫瘍の標的療法に使用可能である。
【選択図】図４ａ１
【選択図】図４ａ１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロモーターであって、前記プロモーターは低酸素調節が可能であり、前記プロモーターは、Ｈｉｆ１ａ調節エレメントとミニプロモーターを連結して構成され、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は３～５であることを特徴とするプロモーター。
【請求項2】
前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は３であり、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
【請求項3】
前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの構造を最適化することで最適化したＨｉｆ１α調節エレメントが得られ、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されることを特徴とする請求項２に記載のプロモーター。
【請求項4】
前記プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されることを特徴とする請求項２又は３に記載のプロモーター。
【請求項5】
前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は４であり、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
【請求項6】
前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの構造を最適化することで最適化したＨｉｆ１α調節エレメントが得られ、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されることを特徴とする請求項５に記載のプロモーター。
【請求項7】
前記プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されることを特徴とする請求項５又は６に記載のプロモーター。
【請求項8】
前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は５であることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
【請求項9】
前記プロモーターのヌクレオチド配列はＩＤ ＮＯ：７で示されることを特徴とする請求項８に記載のプロモーター。
【請求項10】
前記ＩＤ ＮＯ：７を処理することで、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるプロモーターが得られることを特徴とする請求項９に記載のプロモーター。
【請求項11】
前記ミニプロモーターは、細胞ウイルスのプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼのプロモーター、シミアンウイルス４０のプロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター、及び合成プロモーターのいずれかから選択されることを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載のプロモーター。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロモーターを含むＣＡＲ構造。
【請求項13】
前記ＣＡＲ構造の抗原識別領域が識別する抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＰＣ－３、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ＴＣＲのうちの１又は複数であることを特徴とする請求項１２に記載のＣＡＲ構造。
【請求項14】
前記ＣＡＲ構造の抗原識別領域はＳｃＦｖであり、前記ＳｃＦｖのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるか、その機能的バリアントであり、或いは、前記ＳｃＦｖは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示される重鎖の可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示される軽鎖の可変領域を含むか、或いは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示される重鎖の可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示される軽鎖の可変領域を含むか、或いは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示される重鎖の可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示される軽鎖の可変領域を含むことを特徴とする請求項１３に記載のＣＡＲ構造。
【請求項15】
前記ＣＡＲ構造のヒンジ領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又はＳＥＱ ＩＤＮＯ：２４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるか、その機能的バリアントであることを特徴とする請求項１２に記載のＣＡＲ構造。
【請求項16】
前記ＣＡＲ構造の膜貫通領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるか、その機能的バリアントであることを特徴とする請求項１２に記載のＣＡＲ構造。
【請求項17】
前記ＣＡＲ構造の細胞内共刺激ドメインは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるか、その機能的バリアントであることを特徴とする請求項１２に記載のＣＡＲ構造。
【請求項18】
前記ＣＡＲ構造の細胞内活性化シグナルは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるか、その機能的バリアントであることを特徴とする請求項１２に記載のＣＡＲ構造。
【請求項19】
前記ＣＡＲ構造は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で示されるか、その機能的バリアントであることを特徴とする請求項１２に記載のＣＡＲ構造。
【請求項20】
分離した核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１９のいずれかに記載のＣＡＲ構造をコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項21】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロモーターを含むＣＡＲ発現ベクターであって、前記低酸素プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示され、
前記発現ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのいずれかであることを特徴とするＣＡＲ発現ベクター。
【請求項22】
前記ベクターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示されることを特徴とする請求項２１に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項23】
前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数が５の場合、前記発現ベクターは、ｐＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＡＲ／ａｎｔｉ－ＰＳＣＡ－ｏＰＲＥであり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５で示されるＣＡＲ構造を含み、
前記ベクターは、ｐＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＡＲ／ａｎｔｉ－ＣＤ１９－ｏＰＲＥであり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６で示されるＣＡＲ構造を含み、
前記ベクターは、ｐＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＡＲ／ａｎｔｉ－ＣＥＡ－ｏＰＲＥであり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７で示されるヌクレオチド配列のＣＡＲ構造を含むことを特徴とする請求項２１に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項24】
請求項２１～２３のいずれか１項に記載の発現ベクターを含むＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項25】
低酸素環境下でＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を向上させる方法であって、請求項２１～２３のいずれか１項に記載のＣＡＲ構造の発現ベクターを作製し、Ｔ細胞に感染させたあと、標的細胞に作用させることを特徴とする方法。
【請求項26】
低酸素環境下におけるＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２因子の分泌能力を向上させる方法であって、低酸素調節可能なプロモーターを含むＣＡＲ構造を作製し、前記低酸素調節可能なプロモーターは、Ｈｉｆ１ａ調節エレメントとミニプロモーターを連結して構成され、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの反復数は３～５個であり、前記ミニプロモーターは、細胞ウイルスのプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼのプロモーター、シミアンウイルス４０のプロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター又は合成プロモーターから選択されることを特徴とする方法。
【請求項27】
腫瘍用薬の製造における請求項１に記載のプロモーター、又は請求項１２に記載のＣＡＲ構造、又は請求項２０に記載の核酸分子、又は請求項２１に記載の発現ベクター、又は請求項２４に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の応用。
【請求項28】
前記腫瘍には、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍及び皮膚癌が含まれ、前記腫瘍は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＰＣ－３、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ＴＣＲのうちの１又は複数を高発現することを特徴とする請求項２７に記載の応用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子工学の技術分野に属し、具体的には、プロモーター、ＣＡＲ構造、分離した核酸分子、発現ベクターと、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び腫瘍用薬の製造におけるその応用、並びに、低酸素環境下でＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＡＲ－Ｔは、正式名称をキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法といい、血液系腫瘍において良好な結果を得ている。しかし、ＣＡＲ－Ｔは、固形腫瘍における効果が血液系腫瘍ほどではない。これは、ＣＡＲ－Ｔが固形腫瘍の内部に進入しにくいこと、及び、仮にＣＡＲ－Ｔ細胞が固形腫瘍の内部に進入したとしても、腫瘍の微小環境が要因となって機能を正常に発揮し得ないためである。これらは、いずれも固形腫瘍治療におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果に影響を及ぼしている。且つ、固形腫瘍は不均一性の度合が高く、往々にして正常組織にも固形腫瘍の標的が発現するため、オフターゲットリスク等の安全上の問題が存在する。現在は、第４世代ＣＡＲの作製や、Ｄｕａｌ ＣＡＲの作製（二重抗原を有するＣＡＲ－Ｔの作製）、或いは活性抑制機能を有するｉＣＡＲ構造によって、固形腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ治療の有効性及び安全性を向上させようとしているが、これらのＣＡＲ構造には依然として安全性の問題や、活性化されにくいとの問題が存在している。そのため、腫瘍の微小環境内で特異的に起動して活性化するＣＡＲ構造を作製することが強く求められている。
【0003】
酸性及び低酸素は、腫瘍の微小環境における二大物理要因である。固形腫瘍の大部分の細胞は低酸素環境下に置かれており、低酸素が腫瘍細胞の糖代謝経路を変化させる。これにより、大量の乳酸が発生する結果、腫瘍の微小環境における酸性的特徴が形成される。これらの酸性は腫瘍のアポトーシスを低下させ、細胞の増殖及び成長を強化するとともに、腫瘍細胞の遊走を助ける。一方、固形腫瘍の微小環境における低酸素の研究より、低酸素条件下で活性化される調節可能プロモーターを設計できれば、腫瘍の微小環境内で下流のタンパク質の発現が特異的に活性化する結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性と安全性を向上させるとの目的を達成可能なことが比較的明らかとなっている。
【0004】
腫瘍組織の低酸素に関する理論研究は数多くなされているが、如何にして低酸素環境にＣＡＲ－Ｔ療法を組み合わせるかは新たな方向性であり、包括的な研究及び試みが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
以上に鑑みて、本発明の目的は、プロモーターを提供することである。前記プロモーターは、低酸素環境下で目的遺伝子の発現及び標的因子（タンパク質、核酸等）の発現を強化可能であり、抗腫瘍薬の治療効果を向上させる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明では、腫瘍自身の低酸素微小環境に鑑みて、低酸素で活性化する調節エレメントを作製することでタンパク質の発現を特異的に調節し、ＣＡＲ－Ｔの特異的活性化を調節した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの薬物による低酸素環境の作製成功、及びその後のＣＡＲ－Ｔの殺傷効果より、ＣｏＣｌ２で誘導した低酸素条件下におけるＣＡＲ－Ｔは、非誘導時のＣＡＲ－Ｔよりも強い殺傷作用を有することが明らかとなった。また、このことは、作製したＣＡＲ構造及びＣＡＲ－Ｔが低酸素微小環境におけるパッシブターゲティング特性を有しており、低酸素微小環境でより強い活性と殺傷力を有する一方、非低酸素微小環境では安
全性を特徴として示すことを意味していた。このことは、ＣＡＲ－Ｔの臨床応用や、腫瘍の併用療法の新戦略開発のために重要な指導的意義を有している。
全性を特徴として示すことを意味していた。このことは、ＣＡＲ－Ｔの臨床応用や、腫瘍の併用療法の新戦略開発のために重要な指導的意義を有している。
【0007】
上記の目的を実現するために、本発明では以下の方案を使用した。
【0008】
前記プロモーターは低酸素調節が可能である。また、前記プロモーターは、Ｈｉｆ１ａ調節エレメントとミニプロモーターを連結して構成される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの反復数は３～５である。
【0009】
具体的に、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントは３～５個が反復して直列に連結されている。前記直列とは、２つのヌクレオチド配列が直接連結される場合、即ち、１つのヌクレオチド配列の３’末端ともう１つのヌクレオチド配列の５’末端が直接連結される場合だけでなく、２つのヌクレオチド配列が間接的に連結される場合、即ち、２つのヌクレオチド配列の間にその他のヌクレオチド配列が連結される場合も含み得る。つまり、これら２つのヌクレオチド配列の機能の発現に支障が生じなければよい。
【0010】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は３であり、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される。前記プロモーターは、好ましくは、３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの構造を最適化することで最適化したＨｉｆ１α調節エレメントが得られ、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントを最適化することで、異なる発現ベクターに適合可能となる。更に、前記プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される。
【0011】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は４であり、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される。前記プロモーターは、好ましくは、４ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの構造を最適化することで最適化したＨｉｆ１α調節エレメントが得られ、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントを最適化することで、異なる発現ベクターに適合可能となる。更に、前記プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示される。
【0012】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は５であり、前記プロモーターのヌクレオチド配列はＩＤ ＮＯ：７で示される。プロモーターは、好ましくは、５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記ＩＤ ＮＯ：７の配列の両端を最適化することで、プロモーターとベクターの適合が容易となる。最適化によって、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるプロモーターが得られる。
【0013】
更に、前記プロモーターは、低酸素環境で調節される。前記ミニプロモーターは、細胞ウイルスのプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼのプロモーター、シミアンウイルス４０のプロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター、及び合成プロモーターのいずれかから選択される。好ましくは、ミニプロモーターとしてｍｉｎｉＣＭＶを選択する。
【0014】
本発明の目的は、更に、前記プロモーターを含むＣＡＲ構造を提供することである。
【0015】
具体的に、前記ＣＡＲ構造は、一般的な第１世代、第２世代、第３世代のＣＡＲ構造としてもよいし、改良型のＤｕａｌ ＣＡＲや、調節可能ＣＡＲ構造（例えば、ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２調節）等の新型のＣＡＲ構造としてもよい。
【0016】
更に、前記ＣＡＲ構造の抗原識別領域が識別する抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２
３、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＰＣ－３、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ、ＭＡＧＥ
Ａ３ＴＣＲのうちの１又は複数である。
３、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＰＣ－３、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ、ＭＡＧＥ
Ａ３ＴＣＲのうちの１又は複数である。
【0017】
更に、前記ＣＡＲ構造の抗原識別領域はＳｃＦｖである。前記ＳｃＦｖのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるか、その機能的バリアントである。或いは、前記ＳｃＦｖは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示される重鎖の可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示される軽鎖の可変領域を含むか、或いは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示される重鎖の可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示される軽鎖の可変領域を含むか、或いは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示される重鎖の可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示される軽鎖の可変領域を含む。
【0018】
更に、前記重鎖のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４及び軽鎖のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の第２６位～第３３位、第５１位～第５８位、第９７位～第１０１位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の第２３位～第３１位、第４９位～第５１位、第８８位～第９６位である。
【0019】
更に、前記重鎖のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及び軽鎖のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の第２６位～第３３位、第５１位～第５７位、第９６位～第１０９位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の第２７位～第３２位、第５０位～第５２位、第８９位～第９７位である。
【0020】
更に、前記ＣＡＲ構造におけるヒンジ領域の配列は、ＩｇＧ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ４から入手可能であり、ＣＡＲ構造における膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１３７、ＣＤ８０及びＣＤ８６から入手可能であり、ＣＡＲ構造における細胞内シグナル領域は、ＣＤ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ１Ｌ、Ｂ７－Ｈ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ１２７から入手可能である。
【0021】
好ましくは、前記ＣＡＲ構造のヒンジ領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるか、その機能的バリアントである。
【0022】
更に、前記ＣＡＲ構造の膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１３７、ＣＤ８０及びＣＤ８６から入手可能である。
【0023】
好ましくは、前記ＣＡＲ構造の膜貫通領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるか、その機能的バリアントである。
【0024】
更に、前記ＣＡＲ構造における細胞内シグナル領域は、ＣＤ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ１Ｌ、Ｂ７－Ｈ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ１２７から入手可能である。前記細胞内シグナル領域は、細胞内共刺激ドメイン及び細胞内活性化シグナルを含む。
【0025】
好ましくは、前記ＣＡＲ構造の細胞内共刺激ドメインは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるか、その機能的バリアントである。
Ｏ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるか、その機能的バリアントである。
【0026】
好ましくは、前記ＣＡＲ構造の細胞内活性化シグナルは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるか、その機能的バリアントである。
【0027】
更に、前記ＣＡＲ構造は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で示されるか、その機能的バリアントである。
【0028】
具体的に、前記「機能的バリアント」とは、通常、前記アミノ酸配列とほぼ同一の機能を有し（例えば、前記キメラ抗原受容体の性質を有していてもよい）、且つ、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列のことである。いずれかの実施形態において、前記アミノ酸配列のバリアントは、そのアミノ酸配列とほぼ同一の機能を有している。
【0029】
いずれかの実施例において、上記の前記低酸素プロモーターを含むＣＡＲ構造は切断されたＥＧＦＲｔ調節タグを有している。いずれかの実施例において、前記低酸素プロモーターを含むＣＡＲは汎用型のＣＡＲ構造をなしている。いずれかの実施例において、前記低酸素プロモーターを含むＣＡＲ構造は、ｉＣａｓｐ９のような自殺遺伝子を有している。
【0030】
いずれかの実施例において、抗原識別領域は標的抗原のリガンド／受容体を識別可能である。いずれかの実施例において、ＳｃＦｖは、マウス抗体又は完全ヒト抗体又はヒト／マウスキメラ抗体のＳｃＦｖとしてもよいし、サメ、アルパカ又はラクダ抗体等のシングルドメイン抗体としてもよいし、二重特異性抗体としてもよいし、特定の標的を識別する人工的に設計された標的特異性フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの組み合わせとしてもよい。
【0031】
いずれかの実施例において、前記ＣＡＲ構造は、ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）の１又は複数の成分を含むことで、ＮＫＲ－ＣＡＲを形成する。ＮＫＲの成分は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１及びＫＩＲ３ＤＰ１）、自然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６）、免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー（例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ－Ａ、ＣＲＡ、ＢＬＡＭＥ及びＣＤ２Ｆ－１０）、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ＣＤ１６やＣＤ６４）、及びＬｙ４９受容体（例えば、ＬＹ４９ＡやＬＹ４９Ｃ）、といったナチュラルキラー細胞受容体のいずれかの膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン又は細胞質ドメインとすることができる。前記ＮＫＲ－ＣＡＲ分子は、アダプター分子又は細胞内シグナルドメイン（例えば、ＤＡＰ１２）と相互に作用可能である。
【0032】
本発明の目的は、更に、分離した核酸分子を提供することである。前記核酸分子は、上記いずれかのＣＡＲ構造をコードする。
【0033】
本発明の目的は、更に、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロモーターを含むＣＡＲ発現ベクターを提供することである。
【0034】
更に、前記低酸素プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示される。前記発現ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのいずれかである。
ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示される。前記発現ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのいずれかである。
【0035】
好ましくは、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。
【0036】
いずれかの実施例において、前記レンチウイルスベクターは、基本的に、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ－２）、ビスナ－マエディウイルス（ｖｉｓｎａ－ｍａｅｄｉ ｖｉｒｕｓ，ＶＭＶ）、山羊関節炎－脳脊髄炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）で構成される群から選択される。
【0037】
いずれかの実施例において、ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリンセグメント／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルスエクスポートエレメント、本文でカバーするＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されるプロモーター、及び右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。
【0038】
いずれかの実施例において、ＣＡＲは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）、又はマーモット転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、及び最適化したマーモット転写後調節エレメント（ｏＰＲＥ）を含む。
【0039】
いずれかの実施例において、前記５’ＬＴＲのプロモーターは異種プロモーターで置換される。
【0040】
いずれかの実施例において、前記異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）プロモーター、又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【0041】
いずれかの実施例において、前記５’ＬＴＲ又は３’ＬＴＲはレンチウイルスＬＴＲである。
【0042】
いずれかの実施例において、前記３’ＬＴＲは自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
【0043】
いずれかの実施例において、本文でカバーするＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、最適化されたＫｏｚａｒｋ配列を含む。
【0044】
いずれかの実施例において、本文でカバーするＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結される前記プロモーターは、サイトメガロウイルス主要前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１－α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン－Ｃプロモーター（ＵＢＱ－Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマウイルスエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、βアクチンプロモーター（β－ＡＣＴ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及び、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー／陰性対照領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライ
マー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターで構成される群から選択される。
マー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターで構成される群から選択される。
【0045】
【表1】
【0046】
いずれかの実施例において、ＣＡＲを含むベクターは、分泌型の抗ＰＤ－１ ＳｃＦｖを含むことができる。いずれかの実施例において、ＣＡＲを含むベクターは、ＰＤ－１共役形質導入ペプチド（例えば、ＰＤ－１－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３のシグナル構造）を含む。いずれかの実施例において、ＣＡＲを含むベクターには複数のＣＡＲが組み合わされる。例えば、異なる抗原又は同一抗原の異なる識別部位を標的とする２つのＣＡＲが組み合わされる。
【0047】
好ましくは、前記ベクターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３又はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４４で示される。
ＮＯ：４４で示される。
【0048】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数が５の場合、前記発現ベクターは、ｐＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＡＲ／ａｎｔｉ－ＰＳＣＡ－ｏＰＲＥであり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５で示されるＣＡＲ構造を含む。また、前記ベクターは、ｐＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＡＲ／ａｎｔｉ－ＣＤ１９－ｏＰＲＥであり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６で示されるＣＡＲ構造を含む。また、前記ベクターは、ｐＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＡＲ／ａｎｔｉ－ＣＥＡ－ｏＰＲＥであり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４７で示されるヌクレオチド配列のＣＡＲ構造を含む。
ＩＤ ＮＯ：４７で示されるヌクレオチド配列のＣＡＲ構造を含む。
【0049】
本発明の目的は、更に、上記いずれかの発現ベクターを含むＣＡＲ－Ｔ細胞を提供することである。前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、低酸素環境及び標的抗原の存在下で活性化を誘導可能であり、低酸素環境下で標的抗原から刺激を受けた場合に、ＣＡＲの発現能力及び存在量がいずれも向上する結果、ＣＡＲ－Ｔの有効性が強化される。一方、非低酸素環境下で標的抗原から刺激を受けた場合、ＣＡＲの発現能力及び存在量はいずれも一般的なＣＡＲ－Ｔよりも低いため、安全性にいっそう優れている。
【0050】
本発明の目的は、更に、低酸素環境下でＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を向上させる方法を提供することである。当該方法は、上記いずれかのＣＡＲ構造の発現ベクターを作製し、Ｔ細胞に感染させたあと、標的細胞に作用させることを特徴とする。
【0051】
具体的には、低酸素調節可能なプロモーターを含むＣＡＲ構造を作製する。前記低酸素調節可能なプロモーターはＨｉｆ１ａ調節エレメントとミニプロモーターを連結して構成される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの反復数は３～５個である。前記ミニプロモーターは、細胞ウイルスのプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼのプロモーター、シミアンウイルス４０のプロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター又は合成プロモーターか
ら選択される。
ら選択される。
【0052】
好ましくは、ミニプロモーターとしてｍｉｎｉＣＭＶを選択する。
【0053】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は３であり、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される。前記プロモーターは、好ましくは、３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの構造を最適化することで最適化したＨｉｆ１α調節エレメントが得られ、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントを最適化することで、異なる発現ベクターに適合可能となる。更に、前記プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される。
【0054】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は４であり、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される。前記プロモーターは、好ましくは、４ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの構造を最適化することで最適化したＨｉｆ１α調節エレメントが得られ、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントを最適化することで、異なる発現ベクターに適合可能となる。更に、前記プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示される。
【0055】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は５であり、前記プロモーターのヌクレオチド配列はＩＤ ＮＯ：７で示される。プロモーターは、好ましくは、５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記ＩＤ ＮＯ：７の配列の両端を最適化することで、プロモーターとベクターの適合が容易となる。最適化によって、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるプロモーターが得られる。
【0056】
本発明の目的は、更に、低酸素環境下におけるＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２因子の分泌能力を向上させる方法を提供することである。当該方法の特徴は以下の通りである。即ち、低酸素調節可能なプロモーターを含むＣＡＲ構造を作製する。前記低酸素調節可能なプロモーターは、Ｈｉｆ１ａ調節エレメントとミニプロモーターを連結して構成される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの反復数は３～５個である。前記ミニプロモーターは、細胞ウイルスのプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼのプロモーター、シミアンウイルス４０のプロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター又は合成プロモーターから選択される。
【0057】
具体的には、低酸素調節可能なプロモーターを含むＣＡＲ構造を作製する。前記低酸素調節可能なプロモーターはＨｉｆ１ａ調節エレメントとミニプロモーターを連結して構成される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの反復数は３～５個である。前記ミニプロモーターは、細胞ウイルスのプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼのプロモーター、シミアンウイルス４０のプロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター又は合成プロモーターから選択される。
【0058】
好ましくは、ミニプロモーターとしてｍｉｎｉＣＭＶを選択する。
【0059】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は３であり、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される。前記プロモーターは、好ましくは、３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの構造を最適化することで最適化したＨｉｆ１α調節エレメントが得られ、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントを最適化することで、異なる発現ベクターに適合可能となる。更に、前記プロモー
ターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される。
ターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される。
【0060】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は４であり、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される。前記プロモーターは、好ましくは、４ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記Ｈｉｆ１α調節エレメントの構造を最適化することで最適化したＨｉｆ１α調節エレメントが得られ、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される。前記Ｈｉｆ１α調節エレメントを最適化することで、異なる発現ベクターに適合可能となる。更に、前記プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示される。
【0061】
好ましくは、前記Ｈｉｆ１ａ調節エレメントの反復数は５であり、前記プロモーターのヌクレオチド配列はＩＤ ＮＯ：７で示される。プロモーターは、好ましくは、５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。更に、前記ＩＤ ＮＯ：７の配列の両端を最適化することで、プロモーターとベクターの適合が容易となる。最適化によって、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるプロモーターが得られる。
【0062】
本発明の目的は、更に、腫瘍用薬の製造における前記プロモーター又は前記ＣＡＲ構造又は前記核酸分子又は前記発現ベクター又は前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の応用を提供することである。
【0063】
更に、前記腫瘍には、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍及び皮膚癌が含まれる。前記腫瘍は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＰＣ－３、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ＴＣＲのうちの１又は複数を高発現する。
【0064】
具体的に、前記細胞は、ＣＡＲの発現活性を強化可能なその他の活性化剤及び／又は治療と組み合わせて使用することが可能である。
【0065】
具体的に、前記活性化剤及び／又は治療は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）及びＦＫ５０６）、抗体又はその他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体又はその他の抗体治療、シクロホスファミド（ｃｙｔｏｘａｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、ＦＫ５０６、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ）、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン及び放射線）とすることができる。
【0066】
いずれかの実施例において、前記細胞は、その他の活性化剤（例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する活性化剤）を発現可能である。活性化剤は、抑制性分子を阻害する活性化剤とすることができる。ＰＤ１のような抑制性分子は、いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の免疫エフェクター反応の発動能力を低下させ得る。抑制性分子には、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣ Ｉ
系、ＭＨＣ ＩＩ系、ＧＡＬ９、アデノシン、ＴＧＦＲ（ＴＧＦＲβ）及びＴＧＦＲβが含まれる。前記抑制性分子の細胞外ドメイン（アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）は、例えばＰＤ１ＣＡＲ（ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）のように、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに融合可能である。
系、ＭＨＣ ＩＩ系、ＧＡＬ９、アデノシン、ＴＧＦＲ（ＴＧＦＲβ）及びＴＧＦＲβが含まれる。前記抑制性分子の細胞外ドメイン（アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）は、例えばＰＤ１ＣＡＲ（ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）のように、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに融合可能である。
【発明の効果】
【0067】
本発明の有益な効果は以下の通りである。
【0068】
本発明は、低酸素調節可能なプロモーターのＣＡＲ－Ｔにおける応用を提供する。これによれば、低酸素微小環境で誘導されたプロモーターが、低酸素環境において、目的遺伝子やタンパク質等の因子の発現を強化可能となるため、腫瘍の薬物治療効果及びＣＡＲ－Ｔ治療の有効性と安全性が向上する。
【0069】
本発明で提供する低酸素微小環境で起動が誘導されるＣＡＲ構造は、Ｔ細胞上に有効に発現可能なだけでなく、低酸素環境下でＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を強化可能である。これにより、ＣＡＲ－Ｔの有効性が強化されるとともに、ＣＡＲ－Ｔ細胞がＩＦＮ－γ及びＩＬ－２因子について高い分泌能力を持つようになるため、腫瘍標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力が向上する。よって、腫瘍の標的療法に使用可能である。
【0070】
本発明で提供する低酸素微小環境で起動が誘導されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、非低酸素環境下で標的抗原から刺激を受けた場合のＣＡＲの発現能力及び存在量がいずれも一般的なＣＡＲ－Ｔよりも低いため、安全性にいっそう優れている。
【0071】
本発明で提供するＣＡＲ－Ｔ細胞は、低酸素環境下で活性が強化されるため、腫瘍治療薬の製造における養子細胞療法に使用可能である。このことは、ＣＡＲ－Ｔの臨床応用や、腫瘍の併用療法の新戦略開発のために重要な指導的意義を有している。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【発明を実施するための形態】
【0073】
以下に、図面を参照して、本発明の好ましい実施例につき詳細に記載する。なお、好ましい実施例において、具体的条件を明記していない実験方法については、通常は一般的条件に従うものとする。例えば、『分子クローニング実験ガイド』（第３版、Ｊ．サムブルック他著）に記載されている条件や、メーカーが推奨する条件に従うものとする。また、提示する実施例は本発明の内容をより良好に説明するためのものであって、本発明の内容はここで提示する実施例に限らない。よって、当業者が、上述した発明の概要に基づいて実施形態について行う本質的でない改良及び調整は、依然として本発明の保護の範囲に属する。
【実施例1】
【0074】
プラスミドの作製
（１）レンチウイルスベクターに適合するプロモーター３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（３Ｈ１Ｐ）の作製
レンチウイルスベクターに適合するプロモーター３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（３Ｈ１Ｐ）を作製した。ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示す通りであった。次に、ダブルダイジェストでそれぞれ切断して断片を回収し、遺伝子断片を接続、形質転換するとともに、単クローンを選別して、組換えベクターを取得した。ベクター番号は、それぞれ５、６、７、８とした。ＣＡＲの構成要素は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のＰＳＣＡ又はＣＥＡを標的とするＳｃＦｖ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２５で示されるヒンジ構造、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示される膜貫通構造、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示される細胞内共刺激ドメイン、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示される細胞内活性化シグナルを含んでいた。取得した低酸素プロモーターで改変したＣＡＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＣＡＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で示す通りであった。図１ａは、プロモーター３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩの構造図である。
（１）レンチウイルスベクターに適合するプロモーター３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（３Ｈ１Ｐ）の作製
レンチウイルスベクターに適合するプロモーター３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（３Ｈ１Ｐ）を作製した。ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示す通りであった。次に、ダブルダイジェストでそれぞれ切断して断片を回収し、遺伝子断片を接続、形質転換するとともに、単クローンを選別して、組換えベクターを取得した。ベクター番号は、それぞれ５、６、７、８とした。ＣＡＲの構成要素は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のＰＳＣＡ又はＣＥＡを標的とするＳｃＦｖ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２５で示されるヒンジ構造、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示される膜貫通構造、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示される細胞内共刺激ドメイン、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示される細胞内活性化シグナルを含んでいた。取得した低酸素プロモーターで改変したＣＡＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＣＡＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で示す通りであった。図１ａは、プロモーター３ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩの構造図である。
【0075】
（２）レンチウイルスベクターに適合するプロモーター４ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（４Ｈ１Ｐ）の作製
レンチウイルスベクターに適合するプロモーター４ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（４Ｈ１Ｐ）を作製した。ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示す通りであった。次に、ダブルダイジェストでそれぞれ切断して断片を回収し、遺伝子断片を接続、形質転換するとともに、単クローンを選別して、組換えベクターを取得した。ベクター番号は、それぞれ１、２、３、４とした。ＣＡＲの構成要素は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のＰＳＣＡ又はＣＥＡを標的とするＳｃＦｖ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２５で示されるヒンジ構造、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示される膜貫通構造、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示される細胞内共刺激ドメイン、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示される細胞内活性化シグナルを含んでいた。取得した低酸素プロモーターで改変したＣＡＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＣＡＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で示す通りであった。図１ｂは、４ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩの構造図である。
レンチウイルスベクターに適合するプロモーター４ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（４Ｈ１Ｐ）を作製した。ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示す通りであった。次に、ダブルダイジェストでそれぞれ切断して断片を回収し、遺伝子断片を接続、形質転換するとともに、単クローンを選別して、組換えベクターを取得した。ベクター番号は、それぞれ１、２、３、４とした。ＣＡＲの構成要素は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のＰＳＣＡ又はＣＥＡを標的とするＳｃＦｖ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２５で示されるヒンジ構造、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示される膜貫通構造、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示される細胞内共刺激ドメイン、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示される細胞内活性化シグナルを含んでいた。取得した低酸素プロモーターで改変したＣＡＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＣＡＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で示す通りであった。図１ｂは、４ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩの構造図である。
【0076】
（３）レンチウイルスベクターに適合するプロモーター５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（５Ｈ１Ｐ）の作製
表２に示す条件に従ってプラスミドを作製し、後の実験に使用した。プラスミドの作製は、ミニプロモーターｍｉｎｉＣＭＶ、レンチウイルス発現ベクター、抗原識別領域ＣＤ１９及びＰＳＣＡの場合を例に実施した。
表２に示す条件に従ってプラスミドを作製し、後の実験に使用した。プラスミドの作製は、ミニプロモーターｍｉｎｉＣＭＶ、レンチウイルス発現ベクター、抗原識別領域ＣＤ１９及びＰＳＣＡの場合を例に実施した。
【0077】
核酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示される低酸素プロモーター配列５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒを合成し、更に、レンチウイルスベクターに適合するプロモーターＥｃｏＲＶ－５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ＮｈｅＩ（５Ｈ１Ｐ）を作製した。核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示す通りであった。次に、ダブルダイジェストでそれぞれ切断して断片を回収し、遺伝子断片を接続、形質転換するとともに、単クローンを選別して、組換えベクターＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ（１）－ＯＰＲＥ、ＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＤ１９－ＯＰＲＥ、ＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＥＡ－ＯＰＲＥを取得した。ヌクレオチド配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７で示す通りであった。また、ＣＡＲ遺伝子を含まない対照ベクターとしてＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＧＦＰ－ＯＰＲＥを作製した。
【0078】
低酸素プロモーター及びプラスミド構造の核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８で示す通りであった。図１ｃは、ＣＡＲ構造及びＣＡＲを含む低酸素誘導性ベクターの図である。
取得したプラスミドは、ダブルダイジェストＮｈｅＩ＋ＳａｌＩによる鑑定結果及びシーケンシング検証の結果、正しいことが分かった。結果は図１ｄに示す通りであった（Ｍ：ＤＬ１００００、ＤＮＡ分子量の基準、１：プラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ（１）－ＯＰＲＥ（８３２５ｂｐ）、２：プラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＧＦＰ－ＯＰＲＥ（７４４３ｂｐ）、３：プラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ（１）－ＯＰＲＥをＮｈｅＩ＋ＳａｌＩでダブルダイジェストして得た６７１７ｂｐ、１６０８ｂｐ断片、４：プラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＧＦＰ－ＯＰＲＥをＮｈｅＩ＋ＳａｌＩでダブルダイジェストして得た６７１７ｂｐ、７２６ｂｐ断片）。
取得したプラスミドは、ダブルダイジェストＮｈｅＩ＋ＳａｌＩによる鑑定結果及びシーケンシング検証の結果、正しいことが分かった。結果は図１ｄに示す通りであった（Ｍ：ＤＬ１００００、ＤＮＡ分子量の基準、１：プラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ（１）－ＯＰＲＥ（８３２５ｂｐ）、２：プラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＧＦＰ－ＯＰＲＥ（７４４３ｂｐ）、３：プラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ（１）－ＯＰＲＥをＮｈｅＩ＋ＳａｌＩでダブルダイジェストして得た６７１７ｂｐ、１６０８ｂｐ断片、４：プラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＧＦＰ－ＯＰＲＥをＮｈｅＩ＋ＳａｌＩでダブルダイジェストして得た６７１７ｂｐ、７２６ｂｐ断片）。
【0079】
【表2】
【実施例2】
【0080】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ低酸素モデルの検証
ＣｏＣｌ２による低酸素誘導の原理：塩化コバルト（ＩＩ）（ＣｏＣｌ２）における二価のコバルトイオン（Ｃｏ２＋）は、ＰＨＤの補因子である二価の鉄イオンと置換可能である。Ｃｏ２＋は酸素に対する親和性が低いため、ヘムが酸素と結合し得なくなる結果、構造が酸化状態に変化不可能となる。これにより、低酸素状態が形成される。
ＣｏＣｌ２による低酸素誘導の原理：塩化コバルト（ＩＩ）（ＣｏＣｌ２）における二価のコバルトイオン（Ｃｏ２＋）は、ＰＨＤの補因子である二価の鉄イオンと置換可能である。Ｃｏ２＋は酸素に対する親和性が低いため、ヘムが酸素と結合し得なくなる結果、構造が酸化状態に変化不可能となる。これにより、低酸素状態が形成される。
【0081】
（１）低酸素誘導方案の検証：
ＰＢＫＬ１－３ＨＲＥ－ＧＦＰ、ＰＢＫＬ１－４ＨＲＥ－ＧＦＰ、ＰＢＫＬ１－５ＨＲＥ－ＧＦＰでウイルス感染及び活性化したＰＢＭＣをそれぞれ用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ低酸素細胞モデルを作製し、１２～１８ｈ培養してから液交換した。次に、ＣｏＣｌ２を用いて低酸素環境を誘導し、４日目まで培養してから、緑色蛍光検出及びＷＢにより低酸素モデルの作製が完了したか否かを検証した。対照群（ＣｏＣｌ２を加えない）、実験群（ＣｏＣｌ２を加える）、及び陽性群（低酸素調節プロモーターを含まない通常の感染ＧＦＰ細胞）をそれぞれ設け、２４時間の薬物処理後に、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現強度を撮影及び検出した。また、Ｍ－ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）の説明書に従ってタンパク質を抽出し、ＷＢにより細胞内のＨＩＦ－１ａの発現状況を検出した。
ＰＢＫＬ１－３ＨＲＥ－ＧＦＰ、ＰＢＫＬ１－４ＨＲＥ－ＧＦＰ、ＰＢＫＬ１－５ＨＲＥ－ＧＦＰでウイルス感染及び活性化したＰＢＭＣをそれぞれ用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ低酸素細胞モデルを作製し、１２～１８ｈ培養してから液交換した。次に、ＣｏＣｌ２を用いて低酸素環境を誘導し、４日目まで培養してから、緑色蛍光検出及びＷＢにより低酸素モデルの作製が完了したか否かを検証した。対照群（ＣｏＣｌ２を加えない）、実験群（ＣｏＣｌ２を加える）、及び陽性群（低酸素調節プロモーターを含まない通常の感染ＧＦＰ細胞）をそれぞれ設け、２４時間の薬物処理後に、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現強度を撮影及び検出した。また、Ｍ－ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）の説明書に従ってタンパク質を抽出し、ＷＢにより細胞内のＨＩＦ－１ａの発現状況を検出した。
【0082】
結果は、図２ａから明らかなように、ＣｏＣｌ２を加えた誘導群（即ち、微小環境低酸素群）は、ＧＦＰの発現がＣｏＣｌ２を加えなかった群よりも明らかに強く、且つ、蛍光強度が陽性対照群よりも遥かに強かった。つまり、低酸素環境下において、ＰＢＫＬ１－３ＨＲＥ－ＧＦＰの低酸素プロモーターは下流のＧＦＰの発現を正常に起動可能なことが示された。
【0083】
また、結果は、図２ｂから明らかなように、ＣｏＣｌ２を加えた誘導群（即ち、微小環境低酸素群）は、ＧＦＰの発現がＣｏＣｌ２を加えなかった群よりも明らかに強く、且つ、蛍光強度が陽性対照群よりも遥かに強かった。つまり、低酸素環境下において、ＰＢＫＬ１－４ＨＲＥ－ＧＦＰの低酸素プロモーターは下流のＧＦＰの発現を正常に起動可能なことが示された。
【0084】
また、結果は、図２ｃ１及び図２ｃ２から明らかなように、ＣｏＣｌ２を加えた誘導群（即ち、微小環境低酸素群）は、ＧＦＰの発現がＣｏＣｌ２を加えなかった群よりも明らかに強く、且つ、蛍光強度が陽性対照群よりも遥かに強かった。つまり、低酸素環境下において、ＰＢＫＬ１－３ＨＲＥ－ＧＦＰの低酸素プロモーターは下流のＧＦＰの発現を正常に起動可能なことが示された。
【0085】
（２）細胞増殖に対する低酸素誘導薬物の影響
当日の朝に、適量のＨｅｌａ細胞及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、細胞を５ｈ単層培養したあと、ＣｏＣｌ２の終濃度を０ｕＭ、１００ｕＭ、２００ｕＭ、３００ｕＭ、４００ｕＭ、５００ｕＭとして薬物添加処理した。２４時間処理したあと、インキュベートした試薬ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを体積１：１で加え、室温で１０分間インキュベートしてからマイクロプレートリーダーに投入して吸光度を測定した。
当日の朝に、適量のＨｅｌａ細胞及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、細胞を５ｈ単層培養したあと、ＣｏＣｌ２の終濃度を０ｕＭ、１００ｕＭ、２００ｕＭ、３００ｕＭ、４００ｕＭ、５００ｕＭとして薬物添加処理した。２４時間処理したあと、インキュベートした試薬ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを体積１：１で加え、室温で１０分間インキュベートしてからマイクロプレートリーダーに投入して吸光度を測定した。
【0086】
結果は、図３ａに示したように、ＣｏＣｌ２を加えても元の細胞の増殖状況に影響することはなかった。そのため、（ＰＢＫＬ１－３ＨＲＥ－ＧＦＰプロモーター型の）ＣＡＲ－Ｔ細胞による殺傷効果は、外部から添加するＣｏＣｌ２の影響を受けることがなく、低酸素プロモーターを含むか否かにのみ関係していた。
【0087】
また、結果は、図３ｂに示したように、ＣｏＣｌ２を加えても元の細胞の増殖状況に影響することはなかった。そのため、（ＰＢＫＬ１－４ＨＲＥ－ＧＦＰプロモーター型の）ＣＡＲ－Ｔ細胞による殺傷効果は、外部から添加するＣｏＣｌ２の影響を受けることがなく、低酸素プロモーターを含むか否かにのみ関係していた。
【0088】
また、結果は、図３ｃ１及び図３ｃ２から明らかなように、ＣｏＣｌ２を加えても元の細
胞の増殖状況に影響することはなかった。そのため、（ＰＢＫＬ１－５ＨＲＥ－ＧＦＰプロモーター型の）ＣＡＲ－Ｔ細胞による殺傷効果は、外部から添加するＣｏＣｌ２の影響を受けることがなく、低酸素プロモーターを含むか否かにのみ関係していた。
胞の増殖状況に影響することはなかった。そのため、（ＰＢＫＬ１－５ＨＲＥ－ＧＦＰプロモーター型の）ＣＡＲ－Ｔ細胞による殺傷効果は、外部から添加するＣｏＣｌ２の影響を受けることがなく、低酸素プロモーターを含むか否かにのみ関係していた。
【実施例3】
【0089】
レンチウイルス及び感染Ｔ細胞の作製
本実施例では、３Ｈ１Ｐプロモーター、４Ｈ１Ｐプロモーター及び５Ｈ１Ｐプロモーターを用いてそれぞれ実験を行った。
本実施例では、３Ｈ１Ｐプロモーター、４Ｈ１Ｐプロモーター及び５Ｈ１Ｐプロモーターを用いてそれぞれ実験を行った。
【0090】
本実施例では、レンチウイルスのパッケージングにリン酸カルシウム法を採用した。具体的には、１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含有するＤＭＥＭ培地を用いて２９３Ｔ細胞を好ましい状態まで培養し、トランスフェクション時の細胞のコンフルエンシーが７０～８０％となるよう保証した。また、細胞は予め液体を交換した。パッケージングプラスミド（ＲＲＥ：ＲＥＶ：２Ｇ）と発現プラスミドを一定の割合で１．５の遠沈管に投入し、２．５ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２を加えてから、ｄｄＨ２Ｏを総体積が６００ｕｌとなるまで補充して均一に混合した。次に、ピペットで２×ＨＢＳを一滴ずつ混合液に加え、均一に混合したあと室温で１５ｍｉｎ静置した。これを処理済みの２９３Ｔ細胞培養液に加え、３～５ｈ後に再び液体を１０％ＦＢＳを含有する１０ｍＬのＤＭＥＭ培地に交換した。そして、４８ｈ又は７２ｈ後に細胞上清を収集し、ウイルスを精製して、力価を測定した。
【0091】
勾配遠心法によりリンパ球を分離した。遠心分離後、第２層の白血球層を採取して生理食塩水で洗浄した。これに１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地を加えて培養し、ヒトＰＢＭＣ細胞を取得した。次に、取得したＰＢＭＣ細胞を抗ＣＤ３、ＣＤ２８モノクローナル抗体で２４ｈ活性化させたあと、活性化したＰＢＭＣを一定の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させるとともに、ポリブレンを加えてウイルス感染を補助した。これを一晩培養したあと液体を交換し（１０％ＲＰＭＩ １６４０＋ＩＬ－２＋二重抗体）、３７℃のインキュベーターで培養を続けた。ウイルス感染から１２日目にＣＡＲ－Ｔの陽性率を測定した。測定方法はフローサイトメトリー測定とし、抗体はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌ－ＰＥとした。Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌは抗体の軽鎖を識別可能であり、ＣＡＲの抗原識別領域におけるＳｃＦｖ配列の軽鎖をＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌで識別可能なことから、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌを用いることでＣＡＲの陽性率及びＣＡＲの陽性率を測定可能であった。
【0092】
３Ｈ１Ｐプロモーターの実験結果は図４ａ１及び図４ａ２に示す通りとなった。３Ｈ１Ｐプロモーター改変型の各種構造のＣＡＲ－Ｔ細胞は、低酸素誘導環境下でのＣＡＲ発現が著しく増加した。図４ａ１において、３Ｈ１Ｐプロモーター改変型の各種構造のＣＡＲ－Ｔ細胞について、黒色のヒストグラムは、非低酸素環境下におけるプロモーター改変型ＣＡＲのＣＡＲ発現強度を示している。また、白色のヒストグラムは、低酸素環境下におけるプロモーター改変型ＣＡＲのＣＡＲ発現強度を示しており、ＣＡＲの発現強度は低酸素誘導環境下で増加した。
【0093】
４Ｈ１Ｐプロモーターの実験結果は図４ｂ１及び図４ｂ２に示す通りとなった。４Ｈ１Ｐプロモーター改変型の各種構造のＣＡＲ－Ｔ細胞は、低酸素誘導環境下でのＣＡＲ発現が著しく増加した。図４ｂ１において、４Ｈ１Ｐプロモーター改変型の各種構造のＣＡＲ－Ｔ細胞について、黒色のヒストグラムは、非低酸素環境下におけるプロモーター改変型ＣＡＲのＣＡＲ発現強度を示している。また、白色のヒストグラムは、低酸素環境下におけるプロモーター改変型ＣＡＲのＣＡＲ発現強度を示しており、ＣＡＲの発現強度は低酸素誘導環境下で増加した。
【0094】
５Ｈ１Ｐプロモーターの実験結果は図４ｃに示す通りとなった。低酸素誘導５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ ＣＡＲ－Ｔ群は、ＣｏＣｌ２で誘導した低酸素プロモーターを含むＣＡＲ－Ｔ群
である。低酸素誘導ＰＳＣＡ ＣＡＲ－Ｔ群は、ＣｏＣｌ２で誘導した低酸素プロモーターを含まないＣＡＲ－Ｔ群である。未誘導５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ ＣＡＲ－Ｔ群は、ＣｏＣｌ２で誘導しなかった低酸素プロモーターを含むＣＡＲ－Ｔ群である。また、ＢＬＡＮＫはブランク対照群である。低酸素プロモーター改変型のＣＡＲ構造は、低酸素環境下においてＣＡＲの発現存在量がより向上した。また、ＣＡＲ分子がより高密度でＴ細胞の表面に発現した。
である。低酸素誘導ＰＳＣＡ ＣＡＲ－Ｔ群は、ＣｏＣｌ２で誘導した低酸素プロモーターを含まないＣＡＲ－Ｔ群である。未誘導５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ ＣＡＲ－Ｔ群は、ＣｏＣｌ２で誘導しなかった低酸素プロモーターを含むＣＡＲ－Ｔ群である。また、ＢＬＡＮＫはブランク対照群である。低酸素プロモーター改変型のＣＡＲ構造は、低酸素環境下においてＣＡＲの発現存在量がより向上した。また、ＣＡＲ分子がより高密度でＴ細胞の表面に発現した。
【実施例4】
【0095】
低酸素プロモーターを含むＣＡＲ－Ｔの低酸素誘導後の有効性測定
本実施例では、３Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔ、４Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔ及び５Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔを用いてそれぞれ実験を行った。
本実施例では、３Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔ、４Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔ及び５Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔを用いてそれぞれ実験を行った。
【0096】
ＰＳＣＡ陽性のＨｅｌａ細胞と、ｉｎ ｖｉｔｒｏ改変したＣＥＡ陽性のＤＬＤ１－ＣＥＡ細胞をそれぞれ標的細胞として、プロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔの有効性機能を検証した。エフェクター細胞（プロモーター改変型ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を含む）を低酸素で前処理したあと、一晩置いてからＣＡＲ－Ｔ細胞を収集した。これを一定のＥＴ比で標的細胞にプレーティングし、計器としてＡＣＥＡ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰを用いて標的細胞に対する各種ＣＡＲ－Ｔの殺傷能力を測定した。なお、実験手順は計器の説明書に従った。ＡＣＥＡ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰの原理は、ウェルの底に付着した腫瘍細胞について、電気抵抗指数をデータとして１５分に１回記録し、単層培養された標的細胞の増殖又は死亡状況を電気抵抗指数から判断するというものである。電気抵抗指数を利用して結果を分析する際の公式は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷率＝ベースライン電気抵抗指数－リアルタイム電気抵抗指数、とした。
【0097】
３Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔの実験結果は図５ａに示す通りとなった。即ち、対照群と比較して、低酸素プロモーター３Ｈ１Ｐを含む各種構造のＣＡＲ－Ｔ細胞と、低酸素プロモーター４Ｈ１Ｐを含む各種構造のＣＡＲ－Ｔ細胞は、いずれも正常な機能を発揮可能であった。
【0098】
４Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔの実験結果は図５ｂに示す通りとなった。即ち、対照群と比較して、低酸素プロモーター３Ｈ１Ｐを含む各種構造のＣＡＲ－Ｔ細胞と、低酸素プロモーター４Ｈ１Ｐを含む各種構造のＣＡＲ－Ｔ細胞は、いずれも正常な機能を発揮可能であった。
【0099】
５Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔの実験結果は図５ｃ１及び図５ｃ２に示す通りとなった。図５ｃ１は、標的細胞ＨｅｌａのＰＳＣＡ発現を示している。また、図５ｃ２は、ＣＡＲ－Ｔを加えて２４ｈ後の標的細胞Ｈｅｌａに対する各群のＣＡＲ－Ｔの殺傷効率を示している。図中のＭｅｄｉｕｍは培地のみを加えた場合、Ｍｅｄｉｕｍ＋は低酸素環境を誘導した培地を意味する。また、５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡは低酸素プロモーター５Ｈ１Ｐを含むＣＡＲ－Ｔ、５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ＋は低酸素環境下における低酸素プロモーター５Ｈ１Ｐを含むＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＧ－ＰＳＣＡは低酸素プロモーターを含まないＣＡＲ－Ｔ、５Ｈ１Ｐ－ＧＦＰ＋は陰性対照を意味する。薬物添加により誘導した低酸素環境下において、本件特許で保護する５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ＋の殺傷効果は著しく増加し、且つ、低酸素プロモーターを導入しなかったＣＡＧ－ＰＳＣＡ群を超えていた。
【0100】
図６ａ及び図６ｂは、更に、低酸素環境及び非低酸素環境下において、改変型の低酸素特異性プロモーターである３Ｈ１Ｐプロモーター（図６ａ）及び４Ｈ１Ｐプロモーター（図６ｂ）によるＣＡＲ－Ｔの殺傷活性調節を検証したものである。結果から明らかなように、低酸素環境下において、１：５の低ＥＴ比条件の場合に、低酸素特異性プロモーターは
特異的にＣＡＲ－Ｔを誘導して効率的な殺傷を行うことが可能であった。これに対し、一般的なＣＡＲ－Ｔは、低酸素環境下における殺傷能力に極めて劣っていた。殺傷パーセンテージデータは、下記の表３に示す通りであった。
特異的にＣＡＲ－Ｔを誘導して効率的な殺傷を行うことが可能であった。これに対し、一般的なＣＡＲ－Ｔは、低酸素環境下における殺傷能力に極めて劣っていた。殺傷パーセンテージデータは、下記の表３に示す通りであった。
【0101】
【表3】
【0102】
２４時間の殺傷後に細胞の上清を収集し、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞から刺激を受けたあとのＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌能力を測定した。
【実施例5】
【0103】
ＥｌｉｓａによるＩＦＮ－γ検出
本実施例では、３Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔ、４Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔ及び５Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔを用いてそれぞれ実験を行った。
本実施例では、３Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔ、４Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔ及び５Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔを用いてそれぞれ実験を行った。
【0104】
実施例４で収集した上清について、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫）法を用いてＩＦＮ－γの分泌状況を検出した。ＩＦＮ－γは製品番号５５５１４２のＢＤ ＩＦＮ－γ試薬キットを用いて検出した。なお、実験ステップは製品説明書に従った。
【0105】
３Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔの結果は図７ａに示すりとなった。Ｔｒｅａｔは、低酸素環境下で標的細胞が殺傷されたあとのプロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔ細胞の因子分泌状況を示している。また、ＵｎＴｒｅａｔは、非低酸素環境下で標的細胞が殺傷されたあとのプロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔ細胞の因子分泌状況を示している。結果から明らかなように、低酸素環境下でプロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔ細胞が活性化された場合にのみ高いＩＦＮ－γの分泌が可能であった。
【0106】
４Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔの結果は図７ｂに示す通りとなった。Ｔｒｅａｔは、低酸素環境下で標的細胞が殺傷されたあとのプロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔ細胞の因子分泌状況を示している。また、ＵｎＴｒｅａｔは、非低酸素環境下で標的細胞が殺傷されたあとのプロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔ細胞の因子分泌状況を示している。結果から明らかなように、低酸素環境下でプロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔ細胞が活性化された場合にのみ高いＩＦＮ－γの分泌が可能であった。
【0107】
４Ｈ１Ｐプロモーター型のＣＡＲ－Ｔの結果は図７ｃ１及び図７ｃ２に示す通りとなった。５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡは低酸素プロモーター５Ｈ１Ｐを含むＣＡＲ－Ｔ、５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡ＋は低酸素環境下における低酸素プロモーター５Ｈ１Ｐを含むＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＧ－ＰＳＣＡは低酸素プロモーターを含まないＣＡＲ－Ｔ、５Ｈ１Ｐ－ＧＦＰ＋は陰性対照を意味する。低酸素プロモーターを含むＣＡＲ－Ｔ細胞は、低酸素環境下で抗原刺激を受けたあとのＩＦＮ－γ及びＩＬ－２、特に、ＩＬ－２の分泌能力が非低酸素環境時よりも遥かに高かった。また、低酸素プロモーター５Ｈ１Ｐを含むＣＡＲ－Ｔは、非低酸素環境下で抗原刺激を受けたあとのＩＦＮ－γ分泌が低酸素プロモーターを含まないＣＡＲ－Ｔ ＣＡＧ－ＰＳＣＡよりも遥かに低かった。つまり、正常組織の非低酸素環境下において、
抗原刺激を受けた５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡのＩＦＮ－γ分泌は低酸素プロモーターを含まない場合よりも遥かに低く、いっそう高い安全性を有することが分かった。且つ、腫瘍の低酸素環境下において、抗原刺激を受けた５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡのＩＦＮ－γ分泌能力が強化されたことは、５Ｈ１Ｐが低酸素環境下で作用を発揮することを意味している。また、腫瘍の低酸素環境下において、５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡのＩＬ－２分泌能力はＣＡＧ－ＰＳＣＡと同等であり、且つ、非低酸素環境下における５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡのＩＬ－２分泌能力を遥かに超えていた。つまり、本発明の５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒは、低酸素環境下においてＣＡＲ－Ｔの安全性及び有効性を確実に改善可能であった。
抗原刺激を受けた５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡのＩＦＮ－γ分泌は低酸素プロモーターを含まない場合よりも遥かに低く、いっそう高い安全性を有することが分かった。且つ、腫瘍の低酸素環境下において、抗原刺激を受けた５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡのＩＦＮ－γ分泌能力が強化されたことは、５Ｈ１Ｐが低酸素環境下で作用を発揮することを意味している。また、腫瘍の低酸素環境下において、５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡのＩＬ－２分泌能力はＣＡＧ－ＰＳＣＡと同等であり、且つ、非低酸素環境下における５Ｈ１Ｐ－ＰＳＣＡのＩＬ－２分泌能力を遥かに超えていた。つまり、本発明の５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒは、低酸素環境下においてＣＡＲ－Ｔの安全性及び有効性を確実に改善可能であった。
【実施例6】
【0108】
低酸素プロモーターを含むＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性検証
本実験では、５Ｈ１Ｐ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔを用いて検証を行った。
本実験では、５Ｈ１Ｐ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔを用いて検証を行った。
【0109】
ヒトリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ、ＣＤ１９陽性）マウス担癌モデルと、ヒト結腸直腸癌マウス担癌モデルを作製し、低酸素プロモーターの導入がＣＡＲ－Ｔ細胞による抗腫瘍治療効果に及ぼす作用を検証した。
【0110】
ｉｎ ｖｉｖｏ検証に使用したマウスは、ＮＯＧマウスと略称されるＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＣｒｌであった。ＮＯＧマウスは日本国実験動物研究所（ＣＩＥＡ）の伊藤守（Ｍａｍｏｒｕ Ｉｔｏ）により開発されたものであり、ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成関連実験において国際的に最も一般的な品種である。また、ｉｎ ｖｉｖｏ検証に使用する腫瘍形成標的細胞としてＲａｊｉ細胞を選択し、ヒトリンパ腫担癌マウスモデルを作製した。６～８週齢のオスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを選択し、耳タグを付けたあと、マウスの背部に１×１０６細胞／匹でＬｏＶｏ又はＲａｊｉ細胞を皮下注射した。そして、腫瘍形成から６日目にマウスの腫瘍体積を測定し、腫瘍体積に基づいて、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群、低酸素プロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔ群（５Ｈ１Ｐ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ）、未改変プロモーター型ＣＡＲ－Ｔ群（ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ）、及び低酸素プロモーター改変型ＣＡＲ－Ｔ群（５Ｈ１Ｐ ＣＥＡ ＣＡＲ－Ｔ）、対照群の２つの部分にランダムに分けて実験を行った。ヒトリンパ腫担癌マウス群については、腫瘍形成から８日目に、対応するＣＡＲ－Ｔ細胞を各群のマウスの尾静脈に３＊１０６ＣＡＲ－Ｔ細胞／匹注射した。また、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群については、８日目に総数が同一のＴ細胞を戻した。ヒト結腸直腸癌担癌マウス群については、腫瘍形成から７日目に、各群のマウスの尾静脈に５Ｈ１Ｐ ＣＥＡ ＣＡＲ－Ｔ及びＣＯＮＴＲＯＬ Ｔ細胞を１＊１０６ＣＡＲ－Ｔ細胞／匹注射した。また、１４日目に、再び５Ｈ１Ｐ ＣＥＡ ＣＡＲ－Ｔ及びＣＯＮＴＲＯＬ Ｔ細胞を１＊１０６ＣＡＲ－Ｔ細胞／匹注入した。
【0111】
各群のマウスの腫瘍体積を週１回測定したところ、実験結果は図８ａ、図８ｂ及び図９ａ、図９ｃに示す通りとなった。図８ａは、Ｒａｊｉ担癌マウスによる実験を示している。図面から明らかなように、低酸素プロモーター改変型の５Ｈ１Ｐ群（５Ｈ１Ｐ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ）は、未改変型のＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ群に比べ、マウス体内における有効性が著しく向上した。つまり、ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験の結果、本発明で記載した５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒを用いたＣＡＲ構造改変型のＣＡＲ－Ｔ細胞は、担癌マウスに対する有効性が著しく向上した。
【0112】
図９ａ及び図９ｂは、ヒト結腸直腸癌マウス担癌モデルを用いて行った実験を示している。図９ａは、低酸素プロモーター改変型の５Ｈ１Ｐ群と、未改変群におけるＣＡＲ－Ｔ後の腫瘍増殖曲線であり、図９ｂは、各改変群の治療後のマウス腫瘍体積の統計結果である。結果から明らかなように、低酸素プロモーター改変型の５Ｈ１Ｐ群（５Ｈ１Ｐ ＣＥＡ ＣＡＲ－Ｔ）は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群よりも顕著な治療効果を有していた。
【0113】
以上の結果より、本発明で記載した５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒを用いたＣＡＲ構造改変型のＣＡＲ－Ｔ細胞は、担癌マウスに対する有効性が著しく向上した。
【0114】
最後に、説明すべき点として、以上の実施例は本発明の技術方案を制限するものではなく、説明するためのものにすぎない。本発明については、好ましい実施例を参照して詳細に説明したが、当業者は、本発明の技術方案に対し修正又は同等の置換を行うことが可能であり、本発明の技術方案の主旨及び範囲を逸脱しない限り、いずれも本発明の特許請求項の範囲に含まれると解釈すべきである。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図2a】
【図2b】
【図2c1】
【図2c2】
【図3a】
【図3b】
【図3c1】
【図3c2】
【図4a1】
【図4a2】
【図4b1】
【図4b2】
【図4c】
【図5a】
【図5b】
【図5c1】
【図5c2】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図7c1】
【図7c2】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【配列表】
【国際調査報告】