特表 2022-527162 ＣＡＲを発現する遺伝的にリプログラミングされたＴＲＥＧ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-31

(54)【発明の名称】ＣＡＲを発現する遺伝的にリプログラミングされたＴＲＥＧ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220524BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20220524BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220524BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220524BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220524BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220524BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220524BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220524BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20220524BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220524BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20220524BHJP

   C07K 16/12 20060101ALN20220524BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20220524BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/24

C12N15/63 Z

C12N5/10

A61K48/00

A61P37/02

A61P37/06

A61P11/06

A61P37/08

A61P1/04

A61P3/10

A61P19/02

A61P9/00

A61P17/06

A61P25/00

A61P5/14

A61P21/04

A61P7/06

A61P9/10

A61P29/00 101

A61P17/00

A61K35/17 Z

C12N15/13

C12N15/12

C12N5/0783

C07K19/00

C07K16/28

C07K16/12

C07K14/725

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021557247

(86)(22)【出願日】2020-03-26

(85)【翻訳文提出日】2021-11-22

(86)【国際出願番号】 IL2020050360

(87)【国際公開番号】W WO2020194306

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/823,711

(32)【優先日】2019-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/898,471

(32)【優先日】2019-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519112058

【氏名又は名称】ガビッシュ－ガリラヤ バイオ アプリケーションズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】グロス、ギデオン

(72)【発明者】

【氏名】ウェインスタイン－マロム、ハダス

(72)【発明者】

【氏名】ポズナー、サラ

(72)【発明者】

【氏名】クローナー、アミット

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AA92Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA26

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA31

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA36

4C084ZA45

4C084ZA55

4C084ZA591

4C084ZA66

4C084ZA89

4C084ZA94

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB08

4C084ZB11

4C084ZB13

4C084ZB15

4C084ZC06

4C084ZC35

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB43

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA36

4C087ZA45

4C087ZA55

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA68

4C087ZA89

4C087ZA94

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB11

4C087ZB13

4C087ZB15

4C087ZC06

4C087ZC35

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA50

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供され、上記ａＣＡＲは（ｉ）共生腸内細菌叢の抗原、及び、消化管の粘膜固有層（ＬＰ）又は粘膜下層に特有の自己細胞表面抗原から選択される抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）Ｔ細胞を活性化及び／又は共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメイン；及び任意選択で（ｉｖ）細胞外ドメインと膜貫通ドメインをつなぐストーク領域を含む。ａＣＡＲをコードする核酸分子を含む組成物及びベクター、ならびにそのベクターを含み、ａＣＡＲを発現する制御性Ｔ細胞を調製する方法が、対象の免疫系の過剰な活性に現れる疾患、障害又は状態を治療又は予防する方法と同様にさらに提供され、その方法は、表面にａＣＡＲを発現する哺乳類Ｔｒｅｇを上記対象に投与することを含む。制御性Ｔ細胞は任意選択的に、安定したＴｒ１表現型を付与する膜結合ホモ二量体ＩＬ－１０を発現する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ａＣＡＲが：
（ｉ）共生腸内細菌叢の抗原、及び、消化管の粘膜固有層（ＬＰ）又は粘膜下層に特有の自己細胞表面抗原から選択される抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；
（ｉｉ）膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）Ｔ細胞を活性化及び／又は共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメイン；及び任意選択で
（ｉｖ）前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインをつなぐストーク（ｓｔａｌｋ）領域を含む核酸分子。

【請求項2】

膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記抗原は、共生腸内細菌叢のトル様受容体（ＴＬＲ）－リガンド抗原である、請求項１又は２に記載の核酸分子。

【請求項4】

前記ＴＬＲ－リガンド抗原は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０のリガンドから選択される、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項5】

前記ＴＬＲ－リガンド抗原は、ペプチドグリカン；トリアシルリポペプチドなどのリポペプチド；リポテイコ酸；リポ多糖；フラジェリン；細菌ＣｐＧ含有ＤＮＡ及びウイルスＣｐＧ含有ＤＮＡから選択される、請求項４に記載の核酸分子。

【請求項6】

前記細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０の細胞外ドメイン；及び前記ＴＬＲ－リガンド抗原に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から選択される、請求項４又は５に記載の核酸分子。

【請求項7】

前記細胞外結合ドメインは、ペプチドグリカンに特異的に結合するｓｃＦｖである、請求項６に記載の核酸分子。

【請求項8】

前記細胞内ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η鎖、又はＦｃＲγ鎖の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に；例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０のトル／ＩＬ－１受容体ドメイン（ＴＩＲ）に；あるいは、例えば、Ｂ細胞受容体ポリペプチド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０の共刺激シグナル伝達要素に；又はそれらの組み合わせに相同である少なくとも１つのドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項9】

前記細胞内ドメインは、ＴＩＲがＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０に由来するＴＩＲ－ＣＤ２８－ＦｃＲγから選択されるシグナル伝達要素；及びＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素のタンデム配置を含む、請求項８に記載の核酸分子。

【請求項10】

前記膜貫通ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０の膜貫通ドメイン、及びＦｃ受容体から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項11】

前記ａＣＡＲは前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインをつなぐストーク領域を含み、前記ストーク領域は、ＣＤ２８、ＣＤ８α、ＣＤ８βのストーク及びＩｇＧ又はＩｇＤの重鎖から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項12】

前記抗原は、共生腸内細菌叢のトル様受容体（ＴＬＲ）－リガンド抗原であり；前記細胞内ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η鎖、又はＦｃＲγ鎖の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に；例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０のトル／ＩＬ－１受容体ドメイン（ＴＩＲ）に；あるいは、例えば、Ｂ細胞受容体ポリペプチド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０の共刺激シグナル伝達要素に；又はそれらの組み合わせに相同である少なくとも１つのドメインを含み；前記膜貫通ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０の膜貫通ドメイン、及びＦｃ受容体から選択され；前記ａＣＡＲは前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインをつなぐストーク領域を含み、前記ストーク領域は、ＣＤ２８、ＣＤ８α、ＣＤ８βのストーク及びＩｇＧ又はＩｇＤの重鎖から選択される、請求項１又は２に記載の核酸分子。

【請求項13】

前記ＴＬＲ－リガンド抗原は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０のリガンドから選択され；前記細胞内ドメインは、ＴＩＲがＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０に由来するＴＩＲ－ＣＤ２８－ＦｃＲγから選択されるシグナル伝達要素；及びＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素のタンデム配置を含む、請求項１２に記載の核酸分子。

【請求項14】

前記ＴＬＲ－リガンド抗原は、ペプチドグリカン；トリアシルリポペプチドなどのリポペプチド；リポテイコ酸；リポ多糖；フラジェリン；細菌ＣｐＧ含有ＤＮＡ及びウイルスＣｐＧ含有ＤＮＡから選択される、請求項１３に記載の核酸分子。

【請求項15】

前記細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０の細胞外ドメイン；及び前記ＴＬＲ－リガンド抗原に特異的に結合するｓｃＦｖから選択される、請求項１４に記載の核酸分子。

【請求項16】

前記ｓｃＦｖはペプチドグリカンに特異的に結合する、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項17】

前記ａＣＡＲはペプチドグリカンに特異的に結合するｓｃＦｖを含み、ストーク領域はＣＤ８αのヒンジを含み、膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞内ドメインはＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素のタンデム配置を含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項18】

前記ａＣＡＲは、ＴＬＲ２などのＴＬＲを含み、細胞内ドメインは、任意選択で不活性化突然変異を含む、前記ＴＬＲのＴＩＲドメインに連結されたＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素；又はＣＤ３ζのシグナル伝達要素のタンデム配置を含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項19】

前記ホモ二量体ＩＬ－１０は、第１のＩＬ－１０単量体のＣ末端が第１のフレキシブルリンカーを介して第２のＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されるように一本鎖構成で連結された第１及び第２のＩＬ－１０単量体を含む、請求項２に記載の核酸分子。

【請求項20】

前記第１のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ［配列番号５］を有する、請求項１９に記載の核酸分子。

【請求項21】

前記ホモ二量体ＩＬ－１０は、フレキシブルヒンジを介して膜貫通－細胞内ストレッチに連結され、前記フレキシブルヒンジは、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域、ＩｇＤの重鎖のヒンジ領域；ＩＬ－１０Ｒβ鎖の細胞外ストレッチ；及び最大２８アミノ酸のアミノ酸スペーサー、例えば１つのＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２配列［配列番号３６］及び配列ＳＳＱＰＴＩＰＩ［配列番号４０］の追加の８アミノ酸ブリッジからなる２１アミノ酸スペーサーを含む第２のフレキシブルリンカーから選択されるポリペプチドを含む、請求項２に記載の核酸分子。

【請求項22】

前記膜貫通－細胞内ストレッチは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ２；又はＩＬ－１０Ｒβ鎖から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子の重鎖に由来する、請求項２１に記載の核酸分子。

【請求項23】

前記ホモ二量体ＩＬ－１０は、本質的に完全なＩＬ－１０Ｒβ鎖のＮ末端に連結されている、請求項２２に記載の核酸分子。

【請求項24】

前記ホモ二量体ＩＬ－１０は、第１のＩＬ－１０単量体のＣ末端が第１のフレキシブルリンカーを介して第２のＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されるように一本鎖構成で連結された第１及び第２のＩＬ－１０単量体を含み；前記ホモ二量体ＩＬ－１０は、フレキシブルヒンジを介して膜貫通－細胞内ストレッチに連結され、前記フレキシブルヒンジは、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域、ＩｇＤの重鎖のヒンジ領域；ＩＬ－１０Ｒβ鎖の細胞外ストレッチ；及び最大２８アミノ酸のアミノ酸スペーサー、例えば１つのＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２配列［配列番号３６］及び配列ＳＳＱＰＴＩＰＩ［配列番号４０］の追加の８アミノ酸ブリッジからなる２１アミノ酸スペーサーを含む第２のフレキシブルリンカーから選択されるポリペプチドを含み；前記ホモ二量体ＩＬ－１０の前記膜貫通－細胞内ストレッチは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ２；又はＩＬ－１０Ｒβ鎖から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子の重鎖に由来する、請求項２～２３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項25】

前記第１のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ［配列番号５］を有する、請求項２４に記載の核酸分子。

【請求項26】

前記ホモ二量体ＩＬ－１０は、本質的に完全なＩＬ－１０Ｒβ鎖のＮ末端に連結されている、請求項２５に記載の核酸分子。

【請求項27】

請求項１～２６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組成物。

【請求項28】

請求項１～２６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むウイルスベクターなどのベクター。

【請求項29】

少なくとも１つのベクターを含む組成物であって、前記組成物は請求項２８に記載の１つのベクターを含むか；又は前記組成物は少なくとも２つのベクターを含み、ベクターの１つは、請求項１に記載の核酸分子を含み、別のベクターは、膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されたホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、組成物。

【請求項30】

哺乳類制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２８に記載のベクター；又は、請求項１に記載の核酸分子を含む前記ベクターと、膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されたホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターとの組み合わせを含む哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項31】

前記核酸分子にコードされた活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）を表面に発現する、請求項３０に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項32】

細胞表面マーカーＣＤ４９ｂ及びＬＡＧ－３を提示する安定したＴｒ１表現型を有する、請求項３１に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項33】

ヒトＴｒｅｇである、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項34】

同種異系又は自家Ｔｒｅｇを調製する方法であって、ＣＤ４Ｔ細胞を、請求項１又は２に記載の核酸分子又はそれを含むベクター；又は、請求項１に記載の核酸分子を含むベクターと、膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されたホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターとの組み合わせと接触させることにより、同種異系又は自家Ｔｒｅｇを調製することを含む方法。

【請求項35】

対象の疾患、障害又は状態の治療又は予防に使用するための請求項３０～３２のいずれか一項に記載の哺乳類Ｔｒｅｇであって、前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、ならびに器官及び骨髄移植などの免疫系の過剰な活性に現れる、哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項36】

自己免疫疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；セリアック病；１型糖尿病；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；シェーグレン症候群；ベーチェット病；強皮症；コラーゲン血管疾患；全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症；チャーグ－ストラウス症候群；乾癬；乾癬性関節炎；多発性硬化症；アディソン病；バセドウ病；橋本甲状腺炎；重症筋無力症；血管炎；悪性貧血；及びアテローム性動脈硬化症から選択される、請求項３５に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項37】

自己免疫疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；１型糖尿病；及びセリアック病から選択される、請求項３６に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項38】

自己免疫疾患は炎症性腸疾患である、請求項３７に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項39】

前記対象はヒトであり、前記哺乳類Ｔｒｅｇはヒトのものである、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。

【請求項40】

前記Ｔｒｅｇは同種異系Ｔｒｅｇである、請求項３９に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、膜結合ＩＬ－１０を任意に発現する遺伝的にリプログラミングされた制御性Ｔ細胞、ならびに全身的な又は組織に限定された免疫抑制のいずれかを誘導し、免疫系の過剰な活性に現れる疾患を治療する際のそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

局所炎症を抑制し、免疫学的バランスを回復するためにＣＤ４調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を利用することは、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、移植片拒絶、移植片対宿主病などの多様な病態の治療に大きな期待を寄せられている。しかし、Ｔｒｅｇは、１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）を含め、天然型（ｎＴｒｅｇｓ）も誘導性（ｉＴｒｅｇｓ）も、ヒトＣＤ４Ｔ細胞集団全体でごくわずかな割合しか形成しない。そのため、臨床的有効性と治療の安全性に重要な十分な数と安定した表現型で自家又は同種異系Ｔｒｅｇをリクルートし、誘導し、又は操作するために設計されたＴｒｅｇベースの治療法の開発が緊急に必要とされている。

【0003】

ｉＴｒｅｇの重要なサブタイプである１型すなわちＴｒ１細胞は、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）の存在下で樹状細胞上の抗原に慢性的に曝露されると、ＴＣＲ及び抗原特異的な方法で末梢において誘導される。Ｔｒ１細胞は、非増殖性（アネルギー）状態、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βの高産生、及び細胞間接触に依存しない方法でエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を抑制する能力を特徴としている。最近の研究では、レンチウイルス形質導入によって達成された、ヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の強制的な構成的発現が、これらの細胞にオートクリン様式で特に安定したＴｒ１表現型を与えるのに十分であることが示された（１）。このプロトコルは、Ｔｒ１細胞のデノボ生成に対し洗練された解決策を提供するが、活性化に依存しない方法で構成的にＩＬ－１０を産生するＴｒ１細胞をもたらす。臨床現場では、この制御されていないＩＬ－１０分泌は、全身性及び長期の免疫抑制のリスクをもたらし、Ｔｒ１細胞によって発揮される治療効果の意図された抗原又は組織選択性を失う。

【0004】

したがって、自己免疫疾患及び他の自己免疫関連障害のための効率的なＴｒｅｇ、特に効率的なＴｒ１免疫療法の差し迫った必要性が残っている。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、本発明は、活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、上記ａＣＡＲが（ｉ）共生腸内細菌叢の抗原、及び、消化管の粘膜固有層（ＬＰ）又は粘膜下層に特有の自己細胞表面抗原から選択される抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）Ｔ細胞を活性化及び／又は共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメイン；及び任意選択で（ｉｖ）細胞外ドメインと膜貫通ドメインをつなぐストーク（ｓｔａｌｋ）領域を含む核酸分子を提供する。

【0006】

特定の実施形態において、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に加えて、上記核酸分子は、膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0007】

さらなる態様では、本発明は、本発明のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むが、ホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を欠く核酸分子を含む組成物を提供する。

【0008】

別の態様では、上記組成物は、本発明のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と、膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結される、本明細書で定義されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列とを含む核酸分子を含む。

【0009】

さらなる態様において、本発明は、本発明のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子と、膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結される、本明細書で定義されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含む第２の物理的に別個の核酸分子とを含む組成物を提供する。

【0010】

さらに追加の態様では、本発明は、本明細書で定義されるような核酸分子のいずれか１つを含む、ウイルスベクターなどのベクターを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、ウイルスベクターなどの少なくとも１つのベクターを含む組成物を提供し、ここで、前記組成物は本発明の１つのベクターを含むか、又は前記組成物は少なくとも２つのベクターを含み、ベクターの１つは、本発明のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、別のベクターは、本明細書で定義されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

【0011】

さらに別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子のいずれか、又は本明細書で定義されるように細胞のゲノムに任意選択で組み込まれるベクターを含む哺乳類制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。

【0012】

さらに追加の態様では、本発明は、同種異系又は自家Ｔｒｅｇを調製する方法を提供し、この方法は、ＣＤ４Ｔ細胞を、本発明のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を単独で、又は、本明細書で定義されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列、それを含むレトロウイルスベクター、又は上記の実施形態のいずれか１つによる組成物と組み合わせて含む核酸分子と接触させることにより、ｍｅｍ－ＩＬ－１０を伴うか否かにかかわらず、表面にａＣＡＲを発現する同種異系又は自家Ｔｒｅｇを調製することを含む。

【0013】

さらに別の態様では、本発明は、対象の疾患、障害又は状態を治療又は予防する方法を提供し、前記対象に、表面にａＣＡＲを単独で、又は本明細書で定義されるホモ二量体ＩＬ－１０と組み合わせて発現する哺乳類Ｔｒｅｇを投与することを含み、前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、ならびに器官及び骨髄移植などの免疫系の過剰な活性に現れる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】膜固定ホモ二量体ＩＬ－１０の概略図を示す。

【図2A】図２Ａ～Ｄは、Ｔ細胞における膜固定ホモ二量体ＩＬ－１０（ｍｅｍＩＬ－１０）発現の分析、及びＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒ）及びＣＤ４９ｂに対するその効果を示す。ヒトＪｕｒｋａｔ又は初代末梢血リンパ球由来ＣＤ４Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）及びマウスＢ３Ｚ又はＮＯＤ脾臓ＣＤ４Ｔ細胞（Ｃ、Ｄ）に、ヒト又はマウスｍｅｍＩＬ－１０をコードする１０μｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡをそれぞれエレクトロポレーションした。トランスフェクションの２４時間後（Ａ～Ｃ）又は４８時間後（Ｄ、左及び右）にフローサイトメトリーで細胞を分析した。ヒト又はマウスのｍｅｍＩＬ－１０及びＩＬ－１０Ｒ及びヒトＣＤ４９ｂを、それぞれヒト又はマウスのタンパク質に特異的なモノクローナル抗体によって分析した。

【図2B】同上。

【図2C】同上。

【図2D】同上。

【図3A】３Ａ～Ｄは、細胞表面受容体に結合した天然ＩＬ－１０ホモダイマー（Ａ）及びＩＬ－１０の３つの膜固定型誘導体（ｍｅｍ－ＩＬ－１０）：（Ｂ）短リンカーを有するｍｅｍ－ＩＬ－１０；（Ｃ）長リンカーを有するｍｅｍ－ＩＬ－１０；及び（Ｄ）ＩＬ－１０Ｒβに連結されたｍｅｍ－ＩＬ－１０（ＩＬ－１０Ｒβ融合）の概略図を示す。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図3D】同上。

【図4】ｍＲＮＡエレクトロポレーションの２４時間後のＪｕｒｋａｔ細胞における３つのｍｅｍＩＬ－１０誘導体の細胞表面発現を示す。ヒトＪｕｒｋａｔＣＤ４Ｔ細胞に、示された各ｍＲＮＡを１０μｇエレクトロポレーションした（ｓＬ及びｌＬは、それぞれ短リンカー及び長リンカーを表す）。２４時間の細胞を、ＩＬ－１０の表面発現についてフローサイトメトリーにより分析した。

【図5A】図５Ａ～Ｃは、ＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ－１０の発現がＳＴＡＴ３の自発的なリン酸化を誘導することを示す。マウスＣＤ４Ｔ細胞に、無関係なｍＲＮＡ（Ｉｒｒ．ｍＲＮＡ）、短リンカーｍｅｍＩＬ－１０（ｓＬｍｅｍＩＬ－１０）、長リンカーｍｅｍＩＬ－１０（ｌＬｍｅｍＩＬ－１０）、又はＩＬ－１０Ｒβ鎖に連結されたＩＬ－１０（ｍｅｍＩＬ－１０Ｒβ）をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションするか、又は２０ｎｇ／ｍｌの可溶性組換えＩＬ－１０（ｓＩＬ－１０）で処理した。２４時間後、細胞を表面ＩＬ－１０（Ａ）、表面ＩＬ－１０Ｒα鎖（Ｂ）、又は細胞内のリン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）（Ｃ）のフローサイトメトリー分析に供した。

【図5B】同上。

【図5C】同上。

【図6A】図６Ａ～Ｂは、ｍｅｍｌＬ－１０を発現するレトロウイルスで形質導入されたマウスＣＤ４Ｔ細胞の分析を示す。形質導入後４８時間（Ａ）及び６日（Ｂ）の短リンカーｍｅｍＩＬ－１０形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞（ｖ－ｍｅｍＩＬ－１０）の表現型分析。分析は、同じ細胞培養で増殖するｍｅｍＩＬ－１０（＋）及びｍｅｍｌＬ－１０（－）細胞で並行して行い、ＬＡＧ－３、ＣＤ４９ｂ、及びＰＤ－１で染色した。陽性対照として、形質導入されていない細胞を可溶性ＩＬ－１０（ｓＩＬ－１０）で処理した。モックは、レトロウイルスで形質導入された細胞と同じプロトコルで処理されたが、ウイルス粒子への曝露がない細胞である。

【図6B】同上。

【図7】活性化されたｍｅｍＩＬ－１０形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞によるＩＬ－１０の分泌を示す。図６と同じ実験からの細胞を抗ＴＣＲ－ＣＤ３ ｍＡｂ（２Ｃ１１）で刺激し、それらの増殖培地をＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡに供した。モック及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で形質導入されたＴ細胞は陰性対照として機能した。

【図8A】図８Ａ～Ｃは、ｍｅｍＩＬ－１０で形質導入されたヒトＣＤ４Ｔ細胞の表現型の特徴解析を示す。ＣＤ４Ｔ細胞は、健康なドナーの血液サンプルから調製された末梢血単核細胞から磁気ビーズによって分離された。細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ－２の存在下で所望の数まで増殖させ、ｍｅｍＩＬ－１０又は無関係な遺伝子（Ｉｒｒ．）をコードする組換えレトロウイルスで形質導入するか、又は可溶性ＩＬ－１０（ｓＩＬ－１０）で処理した。細胞をＩＬ－２の存在下で増殖させ、１日目（Ａ）、５日目（Ｂ）、及び１８日目（Ｃ）に示された細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のためにサンプルを採取した。１８日目に、細胞表面マーカーを比較するために、形質導入されていないＴｒｅｇを分析に追加した。各時点で、ｍｅｍＩＬ－１０を発現する細胞（陽性、実線の枠））を、ＩＬ－１０を発現しない同じ培養物の細胞（陰性、点線の枠）と並べて分析した。

【図8B】同上。

【図8C】同上。

【図9】ｍｅｍＩＬ－１０を形質導入したヒトＣＤ４Ｔ細胞の表現型を決定する第２の実験を示している。細胞を調製し、ｍｅｍＩＬ－１０を形質導入し、４日後に、図８の凡例に記載されているように、示されたマーカーについて分析した。非形質導入（ナイーブ）及び模擬形質導入（モック）ＣＤ４細胞は陰性対照として機能した。ＭｅｍＩＬ－１０陽性細胞を、同じ培養物からのｍｅｍＩＬ－１０陰性細胞、及び５０、１００、又は３００ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ－１０の存在下で増殖させたナイーブＣＤ４Ｔ細胞と比較した。示されているのは、各サンプルで陽性に染色された細胞の％である。二重陽性は、ＬＡＧ－３及びＣＤ４９ｂに対して陽性に染色された細胞の％である。

【図10A】図１０Ａ～Ｃは、３つのタイプの抗ペプチドグリカン（ＰＧＮ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（Ａ）及びそれらの表面発現（Ｂ、Ｃ）の概略図を示す。（Ａ、左）及び（Ａ、中央）に示されているＣＡＲ構築物はＴＬＲ２に基づいており、（Ａ、右）は従来のＣＡＲを表す。重鎖可変ドメイン、Ｖ_Ｈ；軽鎖可変ドメイン、Ｖ_Ｌ；単鎖可変フラグメント、ＳｃＦｖ；Ｔｏｌｌ／インターロイキン－１受容体ドメイン、ＴＩＲ；＊、ＴＬＲ２のＴＩＲドメインの不活性化変異。（Ｂ）ＴＬＲ－２ベースのＣＡＲをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞のＴＬＲ２発現のフローサイトメトリー分析。ＴＬＲ－２を自然に発現するヒトＴＨＰ－１細胞は、陽性対照（Ｐ．Ｃ．）として機能した。（Ｃ）抗ＰＧＮ従来型ＣＡＲをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＫ６５２細胞によるＭｙｃタグ発現のフローサイトメトリー分析。

【図10B】同上。

【図10C】同上。

【図11】ａＣＡＲの様々なメンバーの線形配置を示す。タグ（この場合はＭｙｃタグ）、Ｔ。

【図12】２つの抗ＰＧＮモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、３Ｃ１１（マウスＩｇＧ、ハイブリドーマから精製）及び３Ｆ６（マウスＩｇＭ、ハイブリドーマ上清）のＰＧＮへの結合をＥＬＩＳＡ試験した結果を示す。ＯＤ４５０、４５０ｎｍでの光学密度；Ｉｒｒ．Ａｂ、対照の無関係なＩｇＧ。

【図13】抗ＰＧＮ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＧＮ特異的活性化を示している。Ｔ細胞活性化のための、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）－ＬａｃＺレポーター遺伝子を有するＢ３Ｚ Ｔ細胞に、２つの抗ＰＧＮ ＣＡＲ（ＣＡＲ－３Ｃ１１及びＣＡＲ－３Ｆ６）又は対照としてのＧＦＰのそれぞれをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした。次に、黄色ブドウ球菌由来のＰＧＮの存在下又は非存在下で細胞を一晩インキュベートした。結果は、β－Ｇａｌ活性について、比色クロロフェノールレッド－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）アッセイのＯＤとして示されている。３Ｃ１１ハイブリドーマから調製された抗ＰＧＮ ＣＡＲ、１５６４；３Ｆ６からの抗ＰＧＮ ＣＡＲ、１５６５。

【図14】２つの抗ＰＧＮ ＣＡＲ（ＣＡＲ－３Ｃ１１及びＣＡＲ－３Ｆ６）及び対照をコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションされ、グラム陰性菌又はグラム陽性菌に由来するＰＧＮの存在下で培養されたＢ３ＺレポーターＴ細胞を示す。２４時間後、細胞をＴ細胞活性化のための比色ＣＰＲＧレポーターアッセイに供した。３Ｃ１１ハイブリドーマから調製された抗ＰＧＮ ＣＡＲ、１５６４；３Ｆ６からの抗ＰＧＮ ＣＡＲ、１５６５；３Ｆ６からの非生産的なＣＡＲ、１５６６；無関係なＣＡＲ、陰性対照；黄色ブドウ球菌ＰＧＮ、ＳＡ；大腸菌ＰＧＮ、ＥＫ。

【発明を実施するための形態】

【0015】

詳細な説明
ＣＤ４制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に治療上の大きな期待を寄せられている特定の治療法の１つは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、つまりクローン病（ＣＤ）と潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の治療である。ＩＢＤは、遺伝的に感受性の高い個人の腸管上皮バリアの損傷後の微生物成分に対する不適切な炎症反応に起因すると考えられている（２）。慢性炎症を選択的に抑制し、腸の恒常性を回復するためにＴｒｅｇを利用することは、ＩＢＤの治療法として広く探求されている（３～５）。しかし、この分野での進歩は、病因に関連する真のＴ細胞抗原に関する情報の全体的な欠如及びＴｒｅｇ特異性の全般的な捉えどころのなさに悩まされている。

【0016】

Ｔｒｅｇ標的としての食餌性抗原の使用が検討されているが（６）、本発明の発明者らは、リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン及びリポペプチドなどの共生腸内細菌叢の成分が上皮層を通過して粘膜固有層（ＬＰ）及び腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）に到達することができ、臨床的に関連性があることを発見した。これらの物質はＬＰを出ることができるという証拠はあるが、それらの全身濃度は非常に低い（７～９）。特に、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方の主要な高分子細胞壁成分であり、腸バリアを構成する様々な細胞によって、細胞内ではＮＯＤ２（１０、１１）により、又は細胞外ではＴＬＲ２（ＴＬＲ２）により（１２、１３）感知される。

【0017】

現在、内因性ＴＣＲを介したＴｒｅｇと抗原の関与が、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫抑制に重要であるという説得力のある証拠がある（１４）。しかし、ペプチド／ＨＬＡ－ＩＩ複合体としてＣＤ４Ｔｒｅｇに提示され得る上記の障害に関連する真のＴ細胞抗原の選択は限られている。さらに、十分な数のＴｒｅｇによってそのような複合体を標的とする従来の戦略は、ＨＬＡ－ＩＩに依存し、非常に手間がかかる可能性がある（例えば、クローン病の治療のための自家ＯＶＡ特異的Ｔｒｅｇの拡張を参照）。対照的に、本発明のアプローチは、キメラ抗原受容体、又はＣＡＲを使用して、選択した細胞表面抗原に対してＴ細胞を遺伝的にリダイレクトする十分に確立された能力に基づいている。ＣＡＲはもともと１９８０年代後半に本発明者の１人によって開発され（１５）、今日では主にＴｅｆｆ細胞による腫瘍の選択的標的化のためのがん免疫療法で使用されている（１６）。

【0018】

本発明によれば、２つの異なる抗ＰＧＮ ＣＡＲがＰＧＮ依存的にＴ細胞を活性化すること、及びグラム陰性菌及びグラム陽性菌からのＰＧＮがＴ細胞を活性化するのに等しく有効であることが見出された。

【0019】

したがって、一態様では、本発明は、（ｉ）共生腸内細菌叢の抗原及び消化管の粘膜固有層（ＬＰ）又は粘膜下層に特異的な自己細胞表面抗原から選択される抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）Ｔ細胞を活性化及び／又は共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメイン；及び任意選択で（ｉｖ）前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインをつなぐストーク領域を含む活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

【0020】

特定の実施形態において、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に加えて、核酸分子は、膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードする、本明細書ではｍｅｍ－ＩＬ－１０とも呼ばれるヌクレオチド配列をさらに含む。ｍｅｍ－ＩＬ－１０及びそれを製造及び使用する方法は、国際公開第２０１９／１８０７２４号に開示されており、本明細書に完全に開示されているかのように参照により組み込まれる。

【0021】

特定の実施形態において、核酸分子は、本発明のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むが、ホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を欠いている。
任意の関連技術を使用して、ａＣＡＲにその標的への特異的結合を与える認識部分／結合ドメインを操作することができる。特定の実施形態において、細胞外ドメインは、（ｉ）抗体、その誘導体又はフラグメント、例えばヒト化抗体；ヒト抗体；抗体の機能的フラグメント；ナノボディなどの単一ドメイン抗体；組換え抗体；及び単鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）；（ｉｉ）ＴＬＲの細胞外ドメイン、その誘導体又はフラグメント（ＴＬＲ－リガンドの場合）；（ｉｉｉ）抗体模倣物、例えばアフィボディ分子；アフィリン；アフィマー；アフィチン；アルファボディ；アンティカリン；アビマー；ＤＡＲＰｉｎ；ファイノマー；クニッツドメインペプチド；及びモノボディ；又は（ｉｖ）アプタマーを含む。

【0022】

原則として、選択したＴＬＲリガンドに対して新しいｓｃＦｖを調製する方法は、当業者に容易に利用可能であり、例えば、Ａｂディスプレイ技術を使用して選択することができる（１７）。

【0023】

特定の実施形態において、ａＣＡＲの細胞外結合ドメインが特異的に結合する共生腸内細菌叢の抗原は、哺乳類、特にヒトの胃腸内微生物叢（腸内フローラ又は腸内細菌叢としても知られている、ヒトなどの哺乳類の消化管に無害な共存をする微生物）の抗原である。

【0024】

特定の実施形態において、共生腸内細菌叢の抗原は、嫌気性細菌の抗原であり、これは、腸内細菌の９９％以上を占める。
特定の実施形態において、共生腸内細菌叢の抗原は、ヒト腸内の４つの優勢な細菌門のうちの１つに属する細菌、すなわち、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、及びプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の抗原、特に、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）又はラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌の抗原である。

【0025】

特定の実施形態において、抗原は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０のリガンドなどの、共生腸内細菌叢のトル様受容体（ＴＬＲ）リガンド抗原である。

【0026】

特定の実施形態において、ＴＬＲの細胞外ドメインは、ヒトＴＬＲの細胞外ドメインなどの、哺乳類ＴＬＲの細胞外ドメインであるか、又はそれに由来する。
特定の実施形態において、結合ドメインが結合するＴＬＲ－リガンド抗原は、表１から選択される。

【0027】

【表1】

【0028】

特定の実施形態では、抗原はペプチドグリカン；トリアシルリポペプチドなどのリポペプチド；リポテイコ酸；リポ多糖（ＬＰＳ）；フラジェリン；細菌ＣｐＧ含有ＤＮＡ及びウイルスＣｐＧ含有ＤＮＡから選択される。

【0029】

ムレインとしても知られるペプチドグリカンは、細菌の原形質膜（古細菌ではない）の外側にメッシュ状の層を形成し、細胞壁を形成する糖及びアミノ酸からなるポリマーである。糖成分は、β－（１，４）結合Ｎ－アセチルグルコサミン及びＮ－アセチルムラミン酸の交互の残基で構成されている。Ｎ－アセチルムラミン酸には、３～５個のアミノ酸からなるペプチド鎖が結合している。それはＴＬＲ２のリガンドであり、したがって特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ２結合ドメイン、その誘導体又はフラグメント、好ましくはヒトＴＬＲ２結合ドメイン、その誘導体又はフラグメントである。あるいは、細胞外結合ドメインは、ペプチドグリカンの特異的結合が可能な抗体、その誘導体又はフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）である。このような抗体の例は、ペプチドグリカンモノクローナル抗体、クローン３Ｆ６Ｂ３、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、３Ｃ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８５１１（商標））、ＩｇＧ１（κ）及び３Ｆ６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８５１２（商標））、ＩｇＭ（κ）であり、これらから抗ペプチドグリカンｓｃＦｖは容易にクローニングされる。

【0030】

細胞外結合ドメインが結合するリポペプチドの非限定的な例は、ＰＡＭ２Ｃｙｓ、ＰＡＭ３Ｃｙｓ、Ｏ－パルミトイル－Ｓｅｒ、Ｎ’－パルミトイル－Ｌｙｓ、リポアミノ酸（ＬＡＡ）及びジパルミチルグルタミン酸である（Ｔａｇｕｃｈｉ． Ｍｉｃｒｏ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｍｉｃｒｏ ａｎｄ Ｎａｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２０１７、１４９～１７０頁、第８章－Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－Ｂａｓｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｔｏｐｉｃｓ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ－ａｎｄ－ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ／ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ．表２参照）。

【0031】

【表2-1】

【0032】

【表2-2】

【0033】

【表2-3】

【0034】

リポタイコ酸（ＬＴＡ）は、グラム陽性菌の細胞壁の主成分である。ＬＴＡの構造はグラム陽性菌の種類によって異なり、長鎖のリビトール又はリン酸グリセロールを含み得る。それはＴＬＲ２のリガンドであり、したがって特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ２結合ドメイン、その誘導体又はフラグメント、好ましくはヒトＴＬＲ２結合ドメイン、その誘導体又はフラグメントである。あるいは、細胞外結合ドメインは、ＬＴＡの特異的結合が可能な抗体、その誘導体又はフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）である。そのような抗体の１つは、抗リポタイコ酸（ＬＴＡ）ｍＡｂ、クローン５５、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓであり、そこから抗ＬＴＡ ｓｃＦｖが容易にクローニングされる。

【0035】

リポグリカン及びエンドトキシンとしても知られるリポ多糖類は、脂質と、共有結合によって結合されたＯ抗原、外核及び内核から構成される多糖類とからなる大きな分子である。それらはグラム陰性菌の外膜に見られる。Ｏ－抗原は、ＬＰＳ内に含まれる反復グリカンポリマーである。Ｏ抗原はコアオリゴ糖に結合しており、ＬＰＳ分子の最も外側のドメインを含む。コアドメインには、リピドＡに直接結合するオリゴ糖成分が常に含まれており、通常、ヘプトースや３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ、ケト－デオキシオクツロソン酸としても知られている）などの糖が含まれている。多くの細菌のＬＰＳコアには、リン酸塩、アミノ酸、エタノールアミン置換基などの非炭水化物成分も含まれている。本明細書で使用されるリポ多糖という用語は、リポ多糖の低分子量形態であるリポオリゴ糖（「ＬＯＳ」）も指す。それはＴＬＲ４のリガンドであり、したがって特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ４結合ドメイン、その誘導体又はフラグメント、好ましくはヒトＴＬＲ４結合ドメイン、その誘導体又はフラグメントである。あるいは、細胞外結合ドメインは、ＬＰＳの特異的結合が可能な抗体、その誘導体又はフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）である。そのような抗体の１つは、抗ＬＰＳｍＡｂ、クローンＮＹＲＣｈｌａｍ ＬＰＳ、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓであり、そこから抗ＬＰＳ ｓｃＦｖが容易にクローニングされる。

【0036】

フラジェリンは、重合して細菌べん毛のフィラメントを形成するサブユニットタンパク質であり、ほぼすべてのべん毛細菌に大量に存在する。それはＴＬＲ５のリガンドであり、したがって特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ５結合ドメイン、その誘導体又はフラグメント、好ましくはヒトＴＬＲ５結合ドメイン、その誘導体又はフラグメントである。あるいは、細胞外結合ドメインは、フラジェリンの特異的結合が可能な抗体、その誘導体又はフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）である。そのような抗体の１つは、抗フラジェリンｍＡｂ、クローンＦＬＩＣ－１、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓであり、そこから抗フラジェリンｓｃＦｖが容易にクローニングされる。

【0037】

本明細書で使用される「ＣｐＧ含有ＤＮＡ」という用語は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、すなわちシトシン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｃ」）とそれに続くグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｇ」）を含む短い一本鎖合成ＤＮＡ分子を指す。それはＴＬＲ９及び１０のリガンドであり、したがって、特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ９又は１０結合ドメイン、その誘導体又はフラグメント、好ましくはヒトＴＬＲ９又は１０結合ドメイン、その誘導体又はフラグメントである。あるいは、細胞外結合ドメインは、ＣｐＧ含有ＤＮＡの特異的結合が可能な抗体、その誘導体又はフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）である。

【0038】

特定の実施形態において、ａＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０、あるいはそれらの誘導体又はフラグメントの細胞外ドメイン；及び前記抗原に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から選択される。

【0039】

特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、様々なグラム陰性菌及びグラム陽性菌由来のペプチドグリカンに結合する。
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、ペプチドグリカンに特異的に結合するｓｃＦｖであり、限定するものではないが、例えば、３Ｃ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８５１１（商標））、ＩｇＧ１（κ）及び３Ｆ６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８５１２（商標））、ＩｇＭ（κ））などの、様々なグラム陰性及びグラム陽性細菌由来のＰＧＮに結合するモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖなどである。

【0040】

特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体３Ｃ１１に由来し、配列番号７の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）（例えば、配列番号８に示される核酸分子によってコードされる）に、任意選択で第１のフレキシブルリンカー、例えば、配列番号６に示される核酸分子によってコードされる、例えば、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号５）のリンカーを介して連結された、配列番号３に示される軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）（リーダーペプチドも含み、例えば、配列番号４に示される核酸分子によってコードされる）を含む。

【0041】

特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体３Ｆ６に由来し、配列番号１８の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）（例えば、配列番号１９に示される核酸分子によってコードされる）に、任意選択で第１のフレキシブルリンカー、例えば、配列番号６に示される核酸分子によってコードされる、例えば、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号５）のリンカーを介して連結された、配列番号１６の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）（リーダーペプチドも含み、例えば、配列番号１７に示される核酸分子によってコードされる）を含む。

【0042】

特定の実施形態において、ペプチドグリカンに結合する細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ２結合ドメイン、好ましくは、配列番号２０に示される配列のヒトＴＬＲ２結合ドメイン（例えば、配列番号２１のＤＮＡ配列によってコードされる）である。

【0043】

ａＣＡＲの細胞内ドメインの役割は、結合ドメインがその特異的抗原に結合したときに、Ｔ細胞活性化シグナルを提供することである。本発明によれば、これらの抗原は、病因に関連するＴ細胞抗原であり、ａＣＡＲは、これらの抗原を提示する組織にＴｒｅｇをリダイレクトし、Ｔｒｅｇを活性化し、過剰なＴｅｆｆ活性を抑制するように設計されている。したがって、細胞内ドメインは、Ｔｒ１ Ｔ細胞などのＴｒｅｇを活性化するように設計されており、今日知られているか、まだ発見されていないかにかかわらず、総じてＴ細胞を、特にＴｒｅｇを活性化する任意のシグナル伝達要素（活性化又は共刺激）又はシグナル伝達要素の組み合わせを使用できる。同様に、任意のリンカー、フレキシブルヒンジ又はストーク、及び膜貫通ドメイン又は配列を、それが効率的に発現され機能するａＣＡＲに寄与する限り、本発明に従って使用することができる。本発明のａＣＡＲに容易に適用可能である、ａＣＡＲで一般的に使用される様々な構成要素の包括的なレビューは、例えば、Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１８）及びＧｕｅｄａｎ ｅｔ ａｌ．（１９）に見られる。

【0044】

特定の実施形態において、ａＣＡＲの細胞内ドメインは、その結合ドメインの性質に関係なく、例えば、ＣＤ３ζ（ゼータ）、ＣＤ３η（イータ）鎖、又はＦｃＲγ鎖の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に；例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０のトル／インターロイキン－１受容体（ＴＩＲ）ドメインに；あるいは、例えば、Ｂ細胞受容体ポリペプチド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０の共刺激シグナル伝達要素に；又はそれらの組み合わせに相同である少なくとも１つのドメインを含む。追加の細胞内ドメインは当業者には明らかであり、本発明の代替の実施形態に関連して使用することができる。

【0045】

特定の実施形態において、ａＣＡＲの細胞内ドメインは、その結合ドメインの性質に関係なく、ＴＩＲ、ＣＤ２８及びＦｃＲγのＩＴＡＭの共刺激シグナル伝達エレメント（本明細書では、ＴＩＲ－ＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素とも呼ばれる）であって、ＴＩＲは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０に由来する共刺激シグナル伝達エレメント；及びＣＤ２８及びＦｃＲγのＩＴＡＭの共刺激シグナル伝達エレメントのタンデム配置（本明細書ではＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素とも呼ばれる）から選択されるシグナル伝達要素のタンデム配置を含む。

【0046】

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、その結合及び細胞内ドメインの性質に関係なく、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の膜貫通タンパク質のいずれかを含む膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質由来の膜貫通配列、又は人工的な疎水性配列を含み得る。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択され得る。追加の膜貫通ドメインは当業者には明らかであり、本発明の代替の実施形態に関連して使用することができる。

【0047】

特定の実施形態において、ａＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン（例えば配列番号４５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、例えば配列番号４４に示されるようなヒトＣＤ２８）、ＣＤ３－ゼータ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０及びＦｃ受容体から選択される。

【0048】

特定の実施形態において、ａＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインを連結するストーク領域を含み、これは、抗体のＦｃフラグメント又はそのフラグメント又は誘導体、抗体のヒンジ領域又はそのフラグメント又は誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工的スペーサー配列又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、ストークは、Ｇｌｙ_３又はヒトＩｇＧ４などのＩｇＧのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインなどのペプチドスペーサーを含み得る。

【0049】

特定の実施形態では、その結合ドメイン及び膜貫通ドメインの性質に関係なく、ストーク領域は、ＣＤ２８（配列番号２４；例えば、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）、ＣＤ８α（例えば、配列番号９に示され；例えば、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）、ＣＤ８β（例えば、配列番号２６に示され；例えば、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）及びＩｇＧの重鎖（例えば、配列番号２８に示され；例えば、配列番号２９に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）又はＩｇＤ（例えば、配列番号２９に記載の）又はＩｇＤの重鎖（例えば、配列番号３０に示され；例えば、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）のストーク又はヒンジから選択される。

【0050】

特定の実施形態では、抗原は、共生腸内細菌叢のＴＬＲ－リガンド抗原である。前記細胞内ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η鎖、又はＦｃＲγ鎖のＩＴＡＭに；例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０のＴＩＲに；又は、例えば、Ｂ細胞受容体ポリペプチド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、又はそれらの組み合わせの共刺激シグナル伝達要素に相同である少なくとも１つのドメインを含み；前記膜貫通ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０の膜貫通ドメイン、及びＦｃ受容体から選択され；ａＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインを連結するストーク領域を含み、前記ストーク領域は、ＣＤ２８、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ならびにＩｇＧ又はＩｇＤの重鎖のストーク又はヒンジから選択される。

【0051】

特定の実施形態では、ＴＬＲ－リガンド抗原は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０のリガンドから選択され；前記細胞内ドメインは、ＴＩＲ－ＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素（ここで、ＴＩＲは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０に由来する）；及びＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素から選択されるシグナル伝達要素のタンデム配置を含む。

【0052】

特定の実施形態において、ＴＬＲ－リガンド抗原は、ペプチドグリカン；トリアシルリポペプチドなどのリポペプチド；リポテイコ酸；リポ多糖；フラジェリン；細菌ＣｐＧ含有ＤＮＡ及びウイルスＣｐＧ含有ＤＮＡから選択される。

【0053】

特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１０、あるいはそれらの誘導体又はフラグメントの細胞外ドメイン；及び前記ＴＬＲリガンド抗原に特異的に結合するｓｃＦｖから選択される。

【0054】

特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ペプチドグリカン又はＴＬＲ２の細胞外ドメインに特異的に結合するｓｃＦｖである。
特定の実施形態において、ａＣＡＲは、ＰＧＮに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８αのヒンジを含むストーク領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素のタンデム配置を含む細胞内ドメインを含む。

【0055】

特定の実施形態において、ａＣＡＲは、完全なＴＬＲ２などの完全なＴＬＲを含み、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ、及び野生型ＴＩＲの、又は不活性化突然変異（ヒトＴＬＲ２におけるＰｒｏ６８１Ｈｉｓ突然変異（２０）又は他の種のＴＬＲ２におけるそれに対応するもの）により無能力化されたＴＩＲの、ＴＬＲ２の細胞内ドメインを含む。あるいは、ａＣＡＲは、ＴＬＲ２などのＴＬＲの細胞外結合ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達要素、例えば、ＣＤ３ζの完全な細胞内ドメインの形態のものを含む。

【0056】

特定の実施形態では、ａＣＡＲは、ＴＬＲ２などのＴＬＲを含み、細胞内ドメインは、任意選択で不活性化突然変異を含む、前記ＴＬＲのＴＩＲドメインに連結されたＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素のタンデム配置を含む。

【0057】

特定の実施形態において、ホモ二量体ＩＬ－１０は、第１のＩＬ－１０単量体のＣ末端が第１のフレキシブルリンカーを介して第２のＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されるように一本鎖構成で連結された第１及び第２のＩＬ－１０単量体を含む。

【0058】

フレキシブルペプチドリンカーは当技術分野でよく知られている。研究者によって設計された経験的リンカーは、一般に、その構造に応じてフレキシブルリンカー、リジッドリンカー、及びｉｎ ｖｉｖｏで切断可能なリンカーの３つのカテゴリに分類される。これらは（２１～２３）に定義されており、これらのそれぞれは、本明細書に完全に開示されているかのように参照により組み込まれる。

【0059】

上記のように、第１のリンカーはフレキシブルリンカーであり、その構造は、（２１～２３）に開示されているリンカーのいずれか１つから選択される。原則として、柔軟性を提供するために、リンカーは総じて小分子量、非極性（例えばＧｌｙ）又は極性（例えばＳｅｒ又はＴｈｒ）のアミノ酸で構成されている（交互のＧｌｙ及びＳｅｒ残基を基礎配列とするなど）。リンカー及び付随するホモ二量体ＩＬ－１０の溶解性は、荷電残基、例えば２つの正に帯電した残基（Ｌｙｓ）及び１つの負に帯電した残留物（Ｇｌｕ）を含めることによって高めることができる。リンカーは２～３１アミノ酸まで変化させることができ、例えば１２～１８残基の長さで、連結されるパートナーのコンフォメーション又は相互作用に制約を課しないように各条件に最適化させることができる。

【0060】

特定の実施形態において、第１のフレキシブルリンカーは、配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされるように、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ［配列番号５］を有する。

【0061】

特定の実施形態において、ホモ二量体ＩＬ－１０は、フレキシブルヒンジを介して膜貫通－細胞内ストレッチに連結され、フレキシブルヒンジは、ＣＤ８α（例えば、配列番号９に示され；例えば、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）のヒンジ領域、例えば配列番号２４に示されるＣＤ２８（例えば、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）のヒンジ領域、例えば、配列番号２６に示されるＣＤ８β（例えば、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）のヒンジ領域、ＩｇＧの重鎖（例えば、配列番号２８に示され；例えば、配列番号２９に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）のヒンジ領域、ＩｇＤの重鎖（例えば、配列番号３０に示され；例えば、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）のヒンジ領域；ＩＬ－１０Ｒβ鎖の細胞外ストレッチ（配列番号３２に示され；例えば、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列によってコードされている）；及び、例えば、１つのＧｌｙ_４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）配列（配列番号３４；例えば、配列番号３５に記載のヌクレオチド配列によってコードされる）、又は２つのＧｌｙ_４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）配列とそれらの間に挿入された１つ又は２つのＳｅｒ残基とを含む最大２８アミノ酸のアミノ酸スペーサーを含む第２のフレキシブルリンカーから選択されるポリペプチドを含む。

【0062】

特定の実施形態では、第２のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（本明細書では「短リンカー」と呼ばれる；配列番号３６；例えば、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）を含む２１アミノ酸配列を含む。

【0063】

特定の実施形態では、第２のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２Ｓｅｒ_２（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（本明細書では「長リンカー」と呼ばれる；配列番号３８；例えば、配列番号３９に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）を含む２８アミノ酸のスペーサーと、例えば、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる配列番号４０の連結ペプチドとからなる。

【0064】

特定の実施形態では、上記の実施形態のいずれか１つの第２のフレキシブルリンカーは、ＨＬＡ－Ａ２の連結ペプチドの膜近位部分に由来する配列ＳＳＱＰＴＩＰＩ（本明細書では「連結ペプチド」と呼ばれる；配列番号４０；例えば、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）の８アミノ酸ブリッジをさらに含む。

【0065】

特定の実施形態において、ｍｅｍ－ＩＬ－１０の膜貫通－細胞内ストレッチは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ分子、好ましくは、ＨＬＡ－Ａ２（配列番号４２に示され；例えば、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）；ヒトＣＤ２８（配列番号４４に示され；例えば、配列番号４５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）；又はヒトＩＬ－１０Ｒβ鎖（配列番号４６に示され；例えば、配列番号４７に記載されているヌクレオチド配列によってコードされる）から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子の重鎖に由来する。

【0066】

特定の実施形態において、完全なｍｅｍ－ＩＬ－１０のアミノ酸配列は、例えば配列番号５５に示されるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号５４に示されるように、短い第２のフレキシブルリンカー及び連結ペプチドを介してＨＬＡ－Ａ２の膜貫通－細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ－１０を含むか、又は本質的にそれからなる。

【0067】

特定の実施形態において、完全なｍｅｍ－ＩＬ－１０のアミノ酸配列は、例えば配列番号５７に示されるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号５６に示されるように、長い第２のフレキシブルリンカー及び連結ペプチドを介してＨＬＡ－Ａ２の膜貫通－細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ－１０を含むか、又は本質的にそれからなる。

【0068】

特定の実施形態において、ｍｅｍ－ＩＬ－１０は、第２のフレキシブルリンカーを介して（例えば、配列番号３２に示されるように）ＩＬ－１０Ｒβ細胞外ドメインに、そして任意選択でさらに、例えば、配列番号４７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる（例えば、配列番号４６に示されるように）ＩＬ－１０Ｒβ膜貫通及び細胞質ゾルドメインに融合される。

【0069】

特定の実施形態において、ｍｅｍ－ＩＬ－１０は、（配列番号４６に示され；例えば、配列番号４７に示されるヌクレオチド配列によってコードされるように）短リンカーを介して本質的に完全なＩＬ－１０Ｒβ鎖のＮ末端に融合される。

【0070】

特定の実施形態では、ホモ二量体ＩＬ－１０は、第１のＩＬ－１０単量体のＣ末端が第２のＩＬ－１０単量体のＮ末端に、第１のフレキシブルリンカーを介して連結され；前記ホモ二量体ＩＬ－１０が、フレキシブルヒンジを介して膜貫通－細胞内ストレッチに連結されるように一本鎖構成で連結された第１及び第２のＩＬ－１０単量体を含み、前記フレキシブルヒンジは、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域、ＩｇＤの重鎖のヒンジ領域；；ＩＬ－１０Ｒβ鎖の細胞外ストレッチ；及び１つのＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２配列［配列番号３６］及び配列ＳＳＱＰＴＩＰＩ［配列番号４０］の追加の８アミノ酸ブリッジからなる２１アミノ酸スペーサーなどの、最大２８アミノ酸のアミノ酸スペーサーを含む第２のフレキシブルリンカーから選択されるポリペプチドを含み；前記ホモ二量体ＩＬ－１０の前記膜貫通－細胞内ストレッチは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ２；又はＩＬ－１０Ｒβ鎖から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子の重鎖に由来する。

【0071】

【表3-1】

【0072】

【表3-2】

【0073】

特定の実施形態では、第１のフレキシブルリンカーはアミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ［配列番号５］を有する
特定の実施形態では、ホモ二量体ＩＬ－１０は、本質的に完全なＩＬ－１０Ｒβ鎖のＮ末端に連結されている。

【0074】

ａＣＡＲ及びｍｅｍ－ＩＬ－１０構築物の非限定的な例は、実施例のセクションに開示されている。これらの構築物のドメインのアミノ酸配列の配列番号（ＳＩＮ）及びそれらをコードする核酸配列を表３に開示する。

【0075】

本発明の核酸分子によってコードされる本発明のａＣＡＲ又はｍｅｍ－ＩＬ－１０を構成するポリペプチドは、本明細書で定義される特定のアミノ酸配列に限定されず、これらのオリゴペプチドの変異体又は相同体であり得るか、又は上記に開示されたものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有し得る。本明細書で使用される「実質的に同一の」アミノ酸配列は、１つ以上の保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失、又は挿入により参照配列と異なるが、特にそのような置換が分子の活性部位ではない部位に生じ、ポリペプチドが本質的にその機能的特性を保持している場合の配列を指す。保存的アミノ酸置換は、例えば、あるアミノ酸を同じクラスの別のものに置換すること、例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に、極性アミノ酸を別の極性アミノ酸に、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置換することである。ペプチドから１つ以上のアミノ酸を欠失させて、その生物学的活性を大幅に変えることなくそのフラグメントを得ることができる。

【0076】

特定の実施形態において、完全な膜結合ＩＬ－１０のアミノ酸配列、又は上記に開示された膜結合ＩＬ－１０の様々なサブ領域のそれぞれ、すなわち、第１及び第２のＩＬ－１０の単量体が第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ－１０；第１のフレキシブルリンカー自体、フレキシブルヒンジ；及び膜貫通－細胞内ストレッチは、表３における配列番号の１つに示される関連配列、例えば配列番号５、９、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５４、５６及び５８と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一である。

【0077】

特定の実施形態において、完全な膜結合ＩＬ－１０のアミノ酸配列、又は上記に開示された膜結合ＩＬ－１０の様々なサブ領域のそれぞれ、すなわち、第１及び第２のＩＬ－１０の単量体が第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ－１０；第１のフレキシブルリンカー自体；フレキシブルヒンジ；及び膜貫通－細胞内ストレッチ、ならびに構築物全体は、表３における配列番号の１つに示される関連配列、例えば配列番号５、９、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５４、５６及び５８と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、又は９９％同一である。

【0078】

特定の実施形態において、単離された核酸分子は、完全な膜結合ＩＬ－１０又は上記に開示された膜結合ＩＬ－１０の様々なサブ領域のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列、すなわち、第１及び第２のＩＬ－１０単量体が第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ－１０；第１のフレキシブルリンカー自体；フレキシブルヒンジ；及び膜貫通－細胞内ストレッチ、ならびに構築物全体であって、表３における配列番号の１つに示される関連配列、例えば配列番号６、１０、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５５、５７及び５９と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一であるものを含む。

【0079】

特定の実施形態において、単離された核酸分子は、完全な膜結合ＩＬ－１０又は上記に開示された膜結合ＩＬ－１０の様々なサブ領域のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列、すなわち、第１及び第２のＩＬ－１０単量体が第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ－１０；第１のフレキシブルリンカー自体；フレキシブルヒンジ；及び膜貫通－細胞内ストレッチ、ならびに構築物全体であって、表３における配列番号の１つに示される関連配列、例えば配列番号６、１０、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５５、５７及び５９と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、又は９９％同一であるものを含む。

【0080】

特定の実施形態において、単離された核酸分子は、完全な膜結合ＩＬ－１０又は上記に開示された膜結合ＩＬ－１０の様々なサブ領域のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列、すなわち、第１及び第２のＩＬ－１０単量体が第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ－１０；第１のフレキシブルリンカー自体；フレキシブルヒンジ；及び膜貫通－細胞内ストレッチ、ならびに構築物全体であって、配列番号６、１０、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５５、５７及び５９のいずれかに示されるものを含む。

【0081】

特定の実施形態において、完全なＣＡＲのアミノ酸配列又はその様々なサブ領域又はそれらの組み合わせのそれぞれ、すなわち、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインが第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されている、抗ＰＧＮｓｃＦｖ（３Ｃ１１又は３Ｌ６に由来する）のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメイン；フレキシブルリンカー自体；ヒトＴＬＲ２結合ドメイン又は完全なヒトＴＬＲ２分子、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ＴＩＲ、ＣＤ２８、ＦｃＲγ又はＣＤ３ζの少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインであって、ＴＩＲがＴＬＲ２に由来するか、又は不活性化されている細胞内ドメインは、表３における配列番号の１つに示される関連配列、例えば配列番号３、５、７、９、１１、１３、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、６０、６２、６４及び６６と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一である。

【0082】

特定の実施形態において、完全なＣＡＲのアミノ酸配列又はその様々なサブ領域又はそれらの組み合わせのそれぞれ、すなわち、ＶＬ及びＶＨドメインが第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されている、抗ＰＧＮｓｃＦｖ（３Ｃ１１又は３Ｌ６に由来する）のＶＬ及びＶＨドメイン；フレキシブルリンカー自体；ヒトＴＬＲ２結合ドメイン又は完全なヒトＴＬＲ２分子、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ＴＩＲ、－ＣＤ２８、－ＦｃＲγ又はＣＤ３ζの少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインであって、ＴＩＲがＴＬＲ２に由来するか、又は不活性化されている細胞内ドメイン、又はＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素は、表３における配列番号の１つに示される関連配列、例えば配列番号３、５、７、９、１１、１３、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、６０、６２、６４及び６６と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、又は９９％同一である。

【0083】

特定の実施形態において、単離された核酸分子は、完全なＣＡＲのアミノ酸配列又はその様々なサブ領域又はそれらの組み合わせのそれぞれ、すなわち、ＶＬ及びＶＨドメインが第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されている、抗ＰＧＮｓｃＦｖ（３Ｃ１１又は３Ｌ６に由来する）のＶＬ及びＶＨドメイン；フレキシブルリンカー自体；ヒトＴＬＲ２結合ドメイン又は完全なヒトＴＬＲ２分子、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ＴＩＲ、－ＣＤ２８、－ＦｃＲγ又はＣＤ３ζの少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＴＩＲはＴＬＲ２に由来するか、又は不活性化されているか、又はＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素は、表３における配列番号の１つに示される関連配列、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、６１、６３、６５及び６７と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一である。

【0084】

特定の実施形態において、単離された核酸分子は、完全なＣＡＲのアミノ酸配列又はその様々なサブ領域又はそれらの組み合わせのそれぞれ、すなわち、ＶＬ及びＶＨドメインが第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されている、抗ＰＧＮｓｃＦｖ（３Ｃ１１又は３Ｌ６に由来する）のＶＬ及びＶＨドメイン；フレキシブルリンカー自体；ヒトＴＬＲ２結合ドメイン又は完全なヒトＴＬＲ２分子、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ＴＩＲ、－ＣＤ２８、－ＦｃＲγ又はＣＤ３ζの少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＴＩＲはＴＬＲ２に由来するか、又は不活性化されているか、又はＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素は、表３における配列番号の１つに示される関連配列、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、６１、６３、６５及び６７と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、又は９９％同一である。

【0085】

特定の実施形態において、単離された核酸分子は、完全なＣＡＲのアミノ酸配列又はその様々なサブ領域又はそれらの組み合わせのそれぞれ、すなわち、ＶＬ及びＶＨドメインが第１のフレキシブルリンカーを介して一本鎖構成で連結されている、抗ＰＧＮｓｃＦｖ（３Ｃ１１又は３Ｌ６に由来する）のＶＬ及びＶＨドメイン；フレキシブルリンカー自体；ヒトＴＬＲ２結合ドメイン又は完全なヒトＴＬＲ２分子、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ＴＩＲ、－ＣＤ２８、－ＦｃＲγ又はＣＤ３ζの少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＴＩＲはＴＬＲ２に由来するか、又は不活性化されているか、又はＣＤ２８－ＦｃＲγのシグナル伝達要素は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、６１、６３、６５、６７の１つに示される。

【0086】

追加の態様では、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つによるａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むが、ホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を欠く核酸分子を含む組成物を提供する。

【0087】

別の態様では、組成物は、上記の実施形態のいずれか１つによるａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と、膜貫通－細胞内ストレッチに、任意選択で上記の実施形態のいずれか１つによるフレキシブルヒンジを介して連結されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列とを含む核酸分子を含む。

【0088】

さらなる態様において、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つによるａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子と、膜貫通－細胞内ストレッチに、任意選択で上記の実施形態のいずれか１つによるフレキシブルヒンジを介して連結されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含む第２の物理的に別個の核酸分子とを含む組成物を提供する。

【0089】

本発明の核酸分子は、この分野で周知の方法を使用してＴ細胞に送達される。例えば、ＭａｔｕｓｋｏｖａとＤｕｒｉｎｉｋｏｖａ（２４）は、導入遺伝子を細胞に送達するための２つのシステム（ウイルス性及び非ウイルス性）があることを教示している。非ウイルス性のアプローチは、ポリマーナノ粒子、脂質、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション／ヌクレオフェクション、又はＤＮＡコーティングされた微粒子の微粒子銃による送達によって表される。

【0090】

ＤＮＡが宿主細胞のクロマチンに組み込まれているか否かに応じて、本発明に従って使用することができるベクターには、２つの主要なタイプがある。ガンマレトロウイルス又はレンチウイルスに由来するものなどのレトロウイルスベクターは、統合されたプロウイルスとして核内に存続し、細胞分裂とともに複製する。他のタイプのベクター（例えば、ヘルペスウイルス又はアデノウイルスに由来するもの）は、エピソームの形で細胞内に残る。

【0091】

したがって、さらに追加の態様では、本発明は、上記の核酸分子のいずれか１つを含むウイルスベクターなどのベクターを提供する。
ベクターの例には、限定するものではないが、レンチウイルスベクター（例えば、自己不活化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター）、レトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ポックスウイルス、アルファウイルス、及びヘルペスウイルスなどのウイルスベクター、ハイブリッドベクター又はプラスミドトランスポゾン（例えば、眠り姫トランスポゾンシステム）又はインテグラーゼベースのベクターシステムが挙げられる。本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る他のベクターは、当業者には明らかであろう。

【0092】

レトロウイルス科又はレトロウイルスファミリーのウイルスは、マウス幹細胞ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ルース肉腫ウイルス、及びスプマウイルスなどのガンマレトロウイルス及びレンチウイルス属を含み、宿主ゲノムに永久に統合することにより長期的に安定した遺伝子発現を可能にするという独自の能力を有する。実際、（２５）に記載されている固形腫瘍のＣＡＲ－Ｔ細胞を評価する５２件の臨床試験のうち、２４件はレトロウイルスベクターを使用し、９件はレンチウイルスベクターを使用している。また、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のためにＦＤＡが承認した２つのＣＡＲ製品は、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）（レンチウイルスベクター）及びＹｅｓｃａｒｔａ（商標）（ガンマレトロウイルスベクター）である。したがって、本発明のウイルスベクターの好ましい候補は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びガンマレトロウイルスベクターであり得る。例えば、レトロウイルスは、モロニーネズミ白血病ウイルス又はネズミ幹細胞ウイルス配列（ガンマレトロウイルスベクター）に由来し得る。

【0093】

レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子と導入遺伝子が複数のプラスミドにわたって分離されている「スプリットベクターシステム」として提供されることが多い。最も一般的に使用されるウイルスベクターシステムは、個別のエンベローププラスミドとパッケージングプラスミド、及びトランスファープラスミドで構成されている。この概念により、これらのベクターの安全な取り扱いと発現が保証される。したがって、本明細書で使用される「ウイルスベクター」という用語は、単一のベクターならびに２つ以上のベクターを指す。

【0094】

特定の実施形態において、核酸分子は、本発明のａＣＡＲをコードする単一のポリペプチドコーディングヌクレオチド配列、又は２つのポリペプチドコーディングヌクレオチド配列であって、一方が本発明のａＣＡＲをコードし、２つ目が上記で定義されたようなｍｅｍ－ＩＬ－１０をコードするものを含む。すなわち、ウイルスベクターの核酸分子は、追加の異なるタンパク質をコードしないが、プロモーターやターミネーターなどの追加の制御要素を含む場合がある。

【0095】

特定の実施形態において、ヌクレオチド配列それ自体又はベクターの核酸分子は、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列との間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

【0096】

特定の実施形態において、ヌクレオチド配列それ自体又はベクターの核酸分子は、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列との間にウイルス自己切断２Ａペプチドを含む。特に、ウイルスの自己切断２Ａペプチドは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）のＴ２Ａ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＦ２Ａ、馬鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）のＥ２Ａ、及び豚テシオウイルス－１（ＰＴＶ１）のＰ２Ａからなる群から選択され得る。

【0097】

別の態様では、本発明は、ウイルスベクターなどの少なくとも１つのベクターを含む組成物を提供し、ここで、組成物は、上記で定義された１つのベクターを含むか；又は、前記組成物は、少なくとも２つのベクターを含み、ベクターの１つは、上記で定義されたａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、別のベクターは、上記で定義されるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

【0098】

選択したＴｒｅｇ細胞の種類は、臨床実施を成功させるために重要である。Ｔｒ１細胞はＣＤ４（＋）ＦｏｘＰ３（＋／－）Ｔｒｅｇのサブセットであり、ＩＬ－１０の存在下で樹状細胞上の抗原に慢性的に曝露されると、末梢においてＴＣＲ特異的及び抗原特異的に誘導される（２６、２７）。これらの細胞は、非増殖性（アネルギー）状態、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βの高産生、しかしＩＬ－２は最小限の産生、ＩＬ－４もＩＬ－１７も産生せず、細胞－細胞間接触に依存しない方式でＴｅｆｆを抑制する能力があることによって特徴づけられる。最近の研究では、レンチウイルス形質導入によって達成された、ヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の強制発現が、これらの細胞にオートクリン様式で安定したＴｒ１表現型を与えるのに十分であることが示された（１）。この研究はまた、これらの細胞をＩＬ－２に曝露すると、これらのＩＬ－１０に誘導されたＴｒ１細胞のアネルギー状態が一時的に逆転する可能性があることも示した。重要なことに、２つの細胞表面マーカーであるＣＤ４９ｂとＬＡＧ－３が同定されており、これらはヒト（及びマウス）Ｔｒ１細胞上で安定的かつ選択的に共発現し、細胞集団の純度に関する分離とフローサイトメトリー分析を可能にする（２８）。

【0099】

本発明では、ＩＬ－１０のメンブレンアンカー誘導体（ｍｅｍ－ＩＬ－１０）をコードする遺伝子を使用する。このメンブレンＩＬ－１０構築物は、抗原刺激がない場合のＩＬ－１０分泌を回避しながら、Ｔｒ１表現型の永続的な保存を保証するＩＬ－１０駆動のセーフロックとして機能する（国際公開第２０１９／１８０７２４号）。安全面では、ＩＬ－１０はＴ細胞の増殖をシグナル伝達しないため、ＩＬ－１０シグナル伝達経路の自律的活性化は、制御されていない細胞増殖のリスクとは関連しない。

【0100】

したがって、さらなる態様において、本発明は、上記で定義された核酸分子のいずれか１つ、又はレンチウイルスベクター及び任意選択で上記のように細胞のゲノムに組み込まれたレトロウイルスベクターなどのベクターを含む哺乳類制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。

【0101】

特定の実施形態において、哺乳類Ｔｒｅｇは、上記の実施形態のいずれか１つによるａＣＡＲをその表面上に発現し、任意選択で、哺乳類Ｔｒｅｇは、膜貫通－細胞内ストレッチに、任意選択で上記の実施形態のいずれか１つによるフレキシブルヒンジを介して連結されたホモ二量体ＩＬ－１０を、その表面上にさらに発現する。

【0102】

特定の実施形態では、哺乳類細胞上に発現されるａＣＡＲの細胞外ドメインは、ＰＧＮに特異的に結合するｓｃＦｖ又はＴＬＲ２結合ドメインなどのＴＬＲ結合ドメインである。

【0103】

本発明はさらに、様々なＴＬＲ結合ドメインを有する２つ以上のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列及びベクター、上記２つ以上のａＣＡＲを含む組成物、及び上記２つ以上のａＣＡＲを発現するＴｒｅｇを企図する。例えば、ＴＬＲ２結合ドメインを有するａＣＡＲ及びＴＬＲ１又はＴＬＲ６結合ドメインを有する別のａＣＡＲの発現は、ＴＬＲ１又はＴＬＲ６－ａＣＡＲとのＴＬＲ２－ａＣＡＲのヘテロ二量体の形成を促進し、それによってリガンドレパートリーを拡張する。これらのａＣＡＲは、ＴＩＲ－ゼータ細胞内ドメインを有することが好ましい。

【0104】

特に、本発明のａＣＡＲを発現する哺乳類Ｔｒｅｇは、膜貫通－細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されたホモ二量体ＩＬ－１０も表面上に発現する。

【0105】

特定の実施形態において、哺乳類Ｔｒｅｇは、細胞表面マーカーＣＤ４９ｂ及びＬＡＧ－３を提示する安定なＴｒ１表現型を有する。特に、本明細書で定義される膜結合ホモ二量体ＩＬ－１０を発現するＴｒｅｇは、細胞表面マーカーＣＤ４９ｂ及びＬＡＧ－３を提示する安定したＴｒ１表現型を有する。本発明のＣＡＲのみを発現し、本明細書で定義される膜結合ホモ二量体ＩＬ－１０を発現しないＴｒｅｇは、本発明の目的には有用であるが安定性が低く変更される可能性のある「従来のＴｒｅｇ」の表現型を有する傾向がある。

【0106】

特定の実施形態において、哺乳類ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
特定の実施形態において、哺乳類Ｔｒｅｇは、同種異系又は自家Ｔｒｅｇである。
さらに追加の態様では、本発明は、同種異系又は自家Ｔｒｅｇを調製する方法を提供し、この方法は、ＣＤ４Ｔ細胞を、上記の実施形態のいずれか１つによるａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を単独で、又は、上記の実施形態のいずれか１つによるホモ二量体ＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列と組み合わせて含む核酸分子、それを含むベクター、又は上記の実施形態のいずれか１つによる組成物と接触させることにより、ｍｅｍ－ＩＬ－１０を伴うか否かにかかわらず、表面にａＣＡＲを発現する同種異系又は自家Ｔｒｅｇを調製することを含む。上記のように、本明細書で定義される膜結合ホモ二量体ＩＬ－１０を発現する本発明の方法によって調製されたＴｒｅｇは、細胞表面マーカーＣＤ４９ｂ及びＬＡＧ－３を提示する安定なＴｒ１表現型を有する。本発明のＣＡＲのみを発現し、本明細書で定義される膜結合ホモ二量体ＩＬ－１０を発現しないＴｒｅｇは、本発明の目的には有用であるが安定性が低く変更される可能性のある「従来のＴｒｅｇ」の表現型を有する傾向がある。

【0107】

ＣＤ４Ｔ細胞などのＴ細胞を分離及び調製する方法は、当技術分野でよく知られており（１）、この分野の大手企業からの市販のキット及びプロトコルに依存することが多い：
１．ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの手付かずのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の分離：
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｉｌ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｉｓｏｌａｔｉｏｎ－ａｎｄ－ａｎａｌｙｓｉｓ／ｃｅｌｌ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｍｅｔｈｏｄｓ／ｈｕｍａｎ－ｃｅｌｌ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｉｓｏｌａｔｉｏｎ－ｏｆ－ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ－ｈｕｍａｎ－ｃｄ４－ｔ－ｃｅｌｌｓ．ｈｔｍｌ；
２．Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ：ＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット、ヒト；
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ＣＡ－ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｃｓ－ｃｅｌｌ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ／ｃｅｌｌ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ－ａｎｄ－ｉｓｏｌａｔｉｏｎ－ｋｉｔｓ／ｔ－ｃｅｌｌｓ／ｃｄ４－ｔ－ｃｅｌｌ－ｉｓｏｌａｔｉｏｎ－ｋｉｔ－ｈｕｍａｎ．ｈｔｍｌ
３．ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット；
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｅａｓｙｓｅｐ－ｈｕｍａｎ－ｃｄ４－ｔ－ｃｅｌｌ－ｉｓｏｌａｔｉｏｎ－ｋｉｔ．ｈｔｍｌ
４．ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：ヒトナイーブＣＤ４Ｔ細胞濃縮セット
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｅｕ／ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｍａｇｎｅｔｉｃ－ｃｅｌｌ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ－ｃｅｌｌ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｈｕｍａｎ－ｎａｉｖｅ－ｃｄ４－ｔ－ｃｅｌｌ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ－ｓｅｔ－－－ｄｍ／ｐ／５５８５２１
免疫細胞は、例えば、本明細書に記載の適切な核酸分子で、例えば、ＲＮＡトランスフェクション、又は真核細胞又は上記のウイルスベクターなどのベクターでの複製及び／又は転写に適したプラスミドへの組み込みによってトランスフェクションされ得る。特定の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターから選択される。

【0108】

レトロウイルスベクターと、カプシドタンパク質がヒト細胞の感染に機能する適切なパッケージングラインとの組み合わせも使用できる。ＰＡ１２（２９）、ＰＡ３１７（３０）、及びＣＲＩＰ（３１）などの、いくつかの両種性ウイルス産生細胞株が知られている。あるいは、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４、又はＧＡＬＶエンベロープでシュードタイピングされた粒子などの非両種性粒子を使用することもできる。細胞は、例えば、Ｂｒｅｇｎｉらの方法（３２）、又はウイルス上清のみ又は濃縮ベクターストックとの培養、例えば、Ｘｕら（３３）及びＨｕｇｈｅｓら（３４）の方法により、プロデューサー細胞との直接共培養によってさらに形質導入することができる。

【0109】

組換えレトロウイルス及びレンチウイルスベクターを作成し、それらをＴ細胞の形質導入に使用する方法は、通常、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＳＢＩ、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、及びその他の多くの企業が提供するパッケージング細胞、プラスミド、トランスフェクション試薬などを含む市販キットを使用して行われる。したがって、これらの方法は、市販のキットに付属のガイドラインに従って行われる。

【0110】

要するに、Ａｄｄｇｅｎｅのウェブサイトのγ－レトロウイルスガイドに教示される非限定的な例によれば、以下の要素が必要である：（ａ）目的の導入遺伝子をコードするγ－レトロウイルストランスファープラスミド：導入遺伝子配列は長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列によってフランキングされ、これは、トランスファープラスミド配列の宿主ゲノムへの組み込みを容易にする。典型的には、ウイルス形質導入時に宿主ゲノムに組み込まれるのは、ＬＴＲの間の、かつＬＴＲを含む配列である；（ｂ）パッケージング遺伝子（ウイルスＧａｇ－Ｐｏｌ）：Ｇａｇは構造前駆体タンパク質であり、Ｐｏｌはポリメラーゼである；及び（ｃ）エンベロープ遺伝子（感染性を変えるために偽型化されてもよい）。

【0111】

非限定的な例として、上記の３つの要素（エンベロープ、パッケージング、及びトランスファー）は、２９３Ｔパッケージング細胞株にコトランスフェクションされる３種類のプラスミドによって提供される。このシステムは、トロピズムを変更するために様々なエンベロープを使用して、偽型γ－レトロウイルスに最大のフレキシビリティを提供する。簡潔に述べると、様々なエンベローププラスミドは様々なトロピズムを持つウイルスの生成をもたらすことができる。組換えレトロウイルス株の調製方法及びヒトＣＤ４Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入のための方法の詳細な非限定的な例は、以下の実施例の欄に述べる。

【0112】

別の態様では、本発明は、対象の疾患、障害又は状態を治療又は予防する方法であって、前記対象に、ａＣＡＲを単独で、又は上記の実施形態のいずれか１つのホモ二量体ＩＬ－１０と組み合わせて表面に発現する哺乳類Ｔｒｅｇを投与することを含む方法を提供する。ここで、前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、ならびに臓器及び骨髄移植などの免疫系の過剰な活性として現れる。

【0113】

同様の態様において、本発明は、対象の疾患、障害又は状態の治療又は予防に使用するための哺乳類Ｔｒｅｇであって、ａＣＡＲを単独で、又は上記の実施形態のいずれか１つのホモ二量体ＩＬ－１０と組み合わせて表面に発現する哺乳類Ｔｒｅｇを提供する。ここで、前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、ならびに臓器及び骨髄移植などの免疫系の過剰な活性として現れる。

【0114】

同様の態様において、本発明は、対象の疾患、障害又は状態の治療又は予防用の医薬の製造における、ａＣＡＲを単独で、又は上記の実施形態のいずれか１つのホモ二量体ＩＬ－１０と組み合わせて表面に発現する哺乳類Ｔｒｅｇの使用を提供する。ここで、前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、ならびに臓器及び骨髄移植などの免疫系の過剰な活性として現れる。

【0115】

自己免疫疾患として定義される特定の疾患は、当技術分野でよく知られている。例えば、自己免疫疾患の百科事典（Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、Ｄａｎａ Ｋ．Ｃａｓｓｅｌｌ、Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｒｏｓｅ、Ｉｎｆｏｂａｓｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０１４年５月１４日に開示されており、参照により本明細書に完全に開示されるかのように組み込まれる。

【0116】

以下は、腸の疾患を引き起こす、又はそれに関連する自己免疫疾患及び炎症性疾患の非限定的な例である。
全身性自己免疫疾患には、コラーゲン血管疾患、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、及びチャーグ－ストラウス症候群が含まれる。これらの障害は、胃腸管、肝胆道系、膵臓のあらゆる部分に関係し得る。これらは、根底にある疾患過程の病態生理学的特徴によって影響を受ける様々な胃腸症状を引き起こし得る。これらの自己免疫疾患に由来する胃腸症状には様々な種類があり、限定するものではないが、口腔潰瘍、嚥下障害、胃食道逆流症、腹痛、便秘、下痢、便失禁、偽閉塞、穿孔、胃腸出血などが挙げられる。

【0117】

全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、病因が不明な自己免疫疾患であり、組織学的検査では、組織や細胞に損傷を与える自己抗体や免疫複合体の沈着により特徴づけられる。症状は通常全身性であり、疲労、倦怠感、食欲不振、発熱、体重減少が含まれる。この疾患は主に２０～５０歳の女性（女性：男性、１０：１）に発症する。ＳＬＥの胃腸症状は一般的である。消化管症状はＳＬＥの患者によく見られ、原発性胃腸障害、治療の合併症、又はＳＬＥ自体が原因である可能性がある。消化管のどの部分もＳＬＥに関与し得る。

【0118】

関節リウマチは、病因が不明な自己免疫疾患であり、人口の１％に影響を及ぼし、２０～５０歳の女性では３：１の発症傾向がある。古典的な臨床症状は、持続性の炎症性滑膜炎による慢性対称性多発性関節炎である。胃腸に症状が現れることが一般的である。

【0119】

シェーグレン症候群は、広範な臓器特異的及び全身性の症状によって裏付けられる一般的な自己免疫疾患である。シェーグレン症候群の患者では一貫してＢ細胞の活性化が見られ、Ｂ細胞とＴ細胞は標的臓器に侵入してそれを破壊する。シェーグレン症候群は通常、４０歳から５０歳の女性（女性：男性、９：１）に発症する。シェーグレン症候群は成人人口の約２％に発症するが、半分以上では診断されないままである。その結果、シェーグレン症候群の発症からその診断までの期間は、ある推定によれば、平均して１０年もの長さになることがよくある。シェーグレン症候群の患者は、消化管全体に障害を受ける可能性がある。

【0120】

ベーチェット病は、若い患者に発生する原因不明の広範な血管炎であるが、すべての年齢の人々がこの病気を発症する可能性がある。ベーチェット病は、全身の血管、特に静脈の損傷に起因する自己免疫疾患である。ベーチェット病の正確な原因は不明である。この病気のほとんどの症状は血管炎によって引き起こされる。これは、初めはブドウ膜炎と口腔及び陰部潰瘍との関連として定義された。しかし、現在、臨床スペクトルには、血管、神経、関節、腎臓、胃腸の症状も含まれている。胃腸ベーチェット病は、広範囲の病変部位及び病変の種類を示す。

【0121】

進行性全身性硬化症（強皮症）は、病因が不明な結合組織病であり、３０～５０歳の女性が男性の４倍の頻度で発症する。このタイプの硬化症は、内臓器官の線維化につながるコラーゲンの過剰産生を特徴としている。コラーゲンの過剰産生は、免疫系が染色体の動原体を攻撃し始める自己免疫機能障害に起因すると考えられている。これは近くの遺伝子の遺伝的奇形につながる。胃腸管のどの部分も強皮症に関与し得る（Ｃｏｊｏｃａｒｕ Ｍ，Ｃｏｊｏｃａｒｕ ＩＭ，Ｓｉｌｏｓｉ Ｉ，Ｖｒａｂｉｅ ＣＤ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｍａｅｄｉｃａ （Ｂｕｃｈａｒ）．２０１１；６（１）：４５－５１．）。

【0122】

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、結腸と小腸の炎症状態のグループである。クローン病と潰瘍性大腸炎は、炎症性腸疾患の主な種類である。クローン病は小腸と大腸、ならびに口、食道、胃、肛門に影響を及ぼし、潰瘍性大腸炎は主に結腸と直腸に影響を及ぼす。ＩＢＤは環境的要因と遺伝的要因の相互作用の結果として発生する複雑な疾患であり、腸の免疫応答と炎症につながる。

【0123】

セリアック病又はシリアック病は、主に小腸に影響を与える長期的な免疫障害である。古典的な症状には、慢性下痢、腹部膨満、吸収不良、食欲不振などの胃腸の問題や、小児の間では正常に成長できないことが含まれる。

【0124】

特定の実施形態において、自己免疫疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；セリアック病；１型糖尿病；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；シェーグレン症候群；ベーチェット病；強皮症；コラーゲン血管疾患；全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症；チャーグ－ストラウス症候群；乾癬；乾癬性関節炎；多発性硬化症；アディソン病；バセドウ病；橋本甲状腺炎；重症筋無力症；血管炎；悪性貧血；及びアテローム性動脈硬化症から選択される。

【0125】

特定の実施形態において、自己免疫疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；１型糖尿病；及びセリアック病から選択される。
特定の実施形態において、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患である。

【0126】

特定の実施形態において、対象はヒトであり、前記哺乳類Ｔｒｅｇはヒトのものである。
いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇは、同種異系Ｔｒｅｇである。

【0127】

上記で定義された疾患を治療する方法で使用されるＴｒｅｇは、リプログラミングされたＴｒ１細胞に腸管ホーミング能力を備えさせ、炎症性環境においてＩＬ－６の存在下でＴｒｅｇの安定性及び機能を維持するために、対象に投与する前にレチノイン酸と接触させることができる。

【0128】

定義：
本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。
タンパク質に関して本明細書で使用される「細胞外ドメイン」という用語は、タンパク質の領域を意味し、これは、細胞内で正常に発現される場合、細胞の外側に位置する。

【0129】

抗原又はエピトープに特異的に結合する、ｓｃＦｖなどの細胞外結合ドメインの文脈で本明細書で使用される「特異的結合」、「特異的に結合する」又は「特異的結合が可能」という用語は、異なる無関係な抗原又はエピトープへのｓｃＦｖの相対的結合と比較した、意図されたリガンド又は抗原へのｓｃＦｖの相対的結合を指す。これはアビディティ（Ｔ細胞上のＣＡＲコピーの数、標的細胞の表面上の抗原分子の数、及び使用される特定のＣＡＲの親和性）に依存するため、機能的な定義は、特定のｓｃＦｖが目的の特異的抗原又はエピトープに対してＥＬＩＳＡで有意なシグナルを提供するか、又は、ｓｃＦｖを提示するＣＡＲでトランスフェクトされた細胞がＦＡＣＳアッセイにおいて目的の抗原又はエピトープで明確に標識されるが、異なる無関係な抗原又はエピトープを使用した同じアッセイでは検出可能なシグナルは得られないことである。

【0130】

選択的結合には、例えば、結合親和性、結合特異性、及び結合アビディティなどの結合特性が含まれる。結合親和性とは、結合ドメインがそのエピトープ結合部位に存在する時間の長さを指し、結合ドメインがそのエピトープに結合する強度と見なすことができる。結合親和性は、結合ドメインの平衡解離定数（ＫＤ）として説明できる。これは、平衡状態でのＫｄ／Ｋａ比として定義される。ここで、Ｋａは結合ドメインの結合速度定数であり、ｋｄは結合ドメインの解離速度定数である。結合親和性は、会合と解離の両方によって決定され、高い会合も低い解離も、単独では高い親和性を確認することはできない。会合速度定数（Ｋａ）又はオンレート定数（Ｋｏｎ）により、単位時間あたりの結合イベントの数、又は抗体と抗原がその抗体－抗原複合体に可逆的に会合する傾向を測定できる。会合速度定数はＭ－１ ｓ－１で表され、次の記号で表される：［Ａｂ］×［Ａｇ］×Ｋｏｎ。会合速度定数が大きいほど、抗体がその抗原に結合する速度が速くなるか、抗体と抗原の間の結合親和性が高くなる。解離速度定数（Ｋｄ）又はオフレート定数（Ｋｏｆｆ）により、単位時間あたりの解離イベントの数 結合ドメイン－抗原複合体がその構成分子、すなわち結合ドメインと抗原に可逆的に分離（解離）する傾向を測定できる。解離速度定数はｓ－１で表され、次の記号で表される：［Ａｂ＋Ａｇ］×Ｋｏｆｆ。解離速度定数が小さいほど、抗体はその抗原に強く結合するか、抗体と抗原の間の結合親和性が高くなる。平衡解離定数（ＫＤ）により、平衡状態で結合ドメイン－抗原複合体が解離する速度と等しい新しい結合ドメイン－抗原複合体が形成される速度を測定できる。平衡解離定数はＭで表され、抗体の場合はＫｏｆｆ／Ｋｏｎ＝［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ＋Ａｇ］として定義される。ここで、［Ａｂ］は抗体のモル濃度、［Ａｇ］は抗原のモル濃度、［Ａｂ＋Ａｇ］は抗体－抗原複合体のモル濃度であり、系が平衡状態にあるとき、すべての濃度がそのような構成要素のものになる。平衡解離定数が小さいほど、抗体はその抗原に強く結合するか、抗体と抗原の間の結合親和性が高くなる。

【0131】

本明細書に開示されるような結合ドメイン又はそれを含むａＣＡＲの結合特異性はまた、そのような結合ドメイン／ａＣＡＲが、無関係のエピトープと比較してそのエピトープを識別できる比率として特徴付けられ得る。例えば、本明細書に開示される結合ドメイン／ａＣＡＲは、無関係なエピトープと比較して、そのエピトープに対し、例えば、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６４：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、又は少なくとも４０：１の結合特異性比を有し得る。

【0132】

抗原又はエピトープに特異的に結合するものとして本明細書に記載されるａＣＡＲの結合ドメインは、抗原又はエピトープに特異的に結合することができることを意味し、必ずしもいつでもそれに結合するわけではないことは明らかである。

【0133】

ＳｃＦｖはモノクローナル抗体に由来し、モノクローナル抗体は、特定の抗原に結合できる抗体の１つの種のみを含む抗体分子の実質的に均質な集団である。つまり、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する可能性のある自然発生の変異を除いて同一である。定義上、モノクローナル抗体は単一のエピトープ又は抗原部位に結合するため、その抗原構造によって定義される。ＳｃＦｖは、ＣＡＲの結合ドメインとして一般的に使用される。

【0134】

モノクローナル抗体をコードする既知の配列を使用してｓｃＦｖをクローニング及び生成する方法、ならびにｓｃＦｖ配列をＣＡＲのフレームワークに組み込む方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、文献（２１、３５、４４－５０、３６－４３）に記載されているように、特定の抗原に特異的なｓｃＦｖをコードする配列を、ストーク－膜貫通－細胞内ドメインの上流（すなわち、Ｎ末端）にクローニングすることができる。

【0135】

本願で使用する「治療する」という用語は、所望の生理学的効果を得る手段を指す。効果は、疾患及び／又は疾患に起因する症状を部分的に又は完全に治癒するという観点で治療的であり得る。この用語は、疾患を抑制すること、すなわちその発症を阻止すること、又は疾患を改善すること、すなわち疾患の退行を引き起こすことを指す。

【0136】

本願で使用する場合、「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳類」という用語は、診断、予後診断、又は治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類の対象を指し、例えばヒトである。

【0137】

本発明に従って使用するための医薬組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容される担体又は賦形剤を使用して従来の方法で製剤化することができる。担体は、組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。

【0138】

担体、投与方法、剤形などの以下の例示は既知の可能性として列挙されており、この中から本発明で使用するための担体、投与方法、剤形などを選択することができる。しかしながら当業者は、まずは選択された任意の所与の製剤及び投与方法を試験して、それが所望の結果を達成するか判断すべきであることを理解するであろう。

【0139】

投与方法には、限定するものではないが、非経口、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経粘膜（例えば、経口、鼻腔内、口腔、膣、直腸、眼内）、くも膜下腔内、局所及び皮内経路が含まれる。投与は全身的又は局所的であり得る。

【0140】

「担体」という用語は、活性剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。医薬組成物中の担体は、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドン又はポビドン）、トラガカントガム、ゼラチン、デンプン、ラクトース又はラクトース一水和物などの結合剤；アルギン酸、トウモロコシ澱粉などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、又はラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤又は界面活性剤；及びコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤を含み得る。

【0141】

組成物は、注射、例えば、ボーラス注射又は持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、防腐剤を添加した単位剤形、例えばアンプル又は複数回投与容器で提供することができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液などの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの配合剤を含むことができる。

【0142】

本明細書で使用される「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」という用語は、リンパ球、単球又はマクロファージなどの、丸い核を有する任意の血球を指す。血液からＰＢＭＣを単離する方法は、当業者には容易に明らかである。非限定的な例は、血液の層を分離する親水性多糖類であるフィコールを使用して血漿の層の下に単球及びリンパ球のバフィーコートを形成させて全血からこれらの細胞を抽出するか、又は、赤血球と白血球の少ない血漿をドナーに戻して白血球濃縮物を調製する白血球アフェレーシスによるものである。

【0143】

明確にするために、そして教示の範囲を制限することなく、特に明記しない限り、本明細書に記載の量、パーセンテージ又は比率、及び他の数値を表すすべての数は、すべての場合において「約」が付されたものとして解釈されるべきである。したがって、本明細書に記載されている数値パラメータは、所望の結果に応じて変化し得る近似値である。例えば、各数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって解釈できる。

【0144】

本明細書で使用される「約」という用語は、示された値より上又は下の１０％以内の値も含まれることを意味する。
実施例
実施例１．フレキシブルリンカーによって直列に連結され、かつ短いヒンジ領域を介して膜貫通－細胞内ストレッチに連結された２つのＩＬ－１０単量体。

【0145】

ここで使用されている特定の構築体では、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧのフレキシブルリンカーによって２つのＩＬ－１０単量体が直列に連結されてホモ二量体を作成し、これをＨＬＡ－Ａ２重鎖に由来する膜貫通－細胞内ストレッチに、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２及びＨＬＡ－Ａ２の連結ペプチドの膜近位部分に由来する配列ＳＳＱＰＴＩＰＩの追加の８アミノ酸のブリッジフレキシブルリンカーを含む２１アミノ酸のスペーサーを有するフレキシブルヒンジ領域によって連結させた（図１）。次に、ヒト及びマウスＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ－１０及びＩＬ－１０Ｒの表面発現を確認した（図２）。

【0146】

ＣＤ４９ｂインテグリンの上昇は（Ａ）に見ることができ、ＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒ）の上方制御は組換えＩＬ－１０（ｒＩＬ－１０、（Ｂ））によって誘導されたものと同様であった。マウスｍｅｍＩＬ－１０は、トランスフェクションの４８時間後に明確に発現され（Ｄ、左）、予想通り、ｍｅｍｌＬ－１０は、使用した抗マウスＩＬ－１０Ｒ ｍＡｂの結合をブロックした。これは、シス結合を示唆している（５１）。

【0147】

実施例２．フレキシブルリンカーによって直列に連結され、かつ長いヒンジ領域又はＩＬ－１０Ｒβ鎖を介して膜貫通－細胞内ストレッチに連結された２つのＩＬ－１０単量体。

【0148】

我々の元のｍｅｍＩＬ－１０構築体は、ヒト及びマウスの両方とも、（８アミノ酸長の剛性スペーサーに加えて）２１アミノ酸のフレキシブルリンカーを含むヒンジを組み込んでいた（ここではＳｍｅｍＩＬ－１０（Ｓは短いリンカー、下記参照）。

【0149】

ｍｅｍＩＬ－１０を最適化するために、この膜サイトカインの２つの新しいバージョンを設計しクローニングした。最初にクローニングした１つ目では、ＩＬ－１０Ｒとの最適な結合を促進するため、ｍｅｍＩＬ－１０に長いリンカーペプチド（３０アミノ酸であり、長いことからＬｍｅｍＩＬ－１０と呼ぶ）を提供した。（図３、左下）。別の誘導体を作成するために、ＩＬ－１０Ｒα鎖にあるＩＬ－１０結合部位に直接アクセスできるように設計された新しい足場として、ＩＬ－１０Ｒβ鎖のＮ末端に二量体ＩＬ－１０を融合させ、これをｍｅｍＩＬ－ｌ０ＲＢ（図３、右下）と呼ぶ。実際、図４から、ヒトジャーカット細胞における３つの産物の表面発現が確認される。注目すべきことに、ｍｅｍＩＬ－１０ＲＢ融合タンパク質の表面発現のレベルはＩＬ－１０Ｒα鎖の利用可能性に依存すると予想される。３つの異なるｍｅｍＩＬ－１０構成の発現及び機能を評価するために、マウスＣＤ４Ｔ細胞に３つの構築体をコードするｍＲＮＡをトランスフェクションし、表面発現（図５Ａ）、表面ＩＬ－１０Ｒの下方制御（図５Ｂ）及びＳＴＡＴ３の自発的リン酸化（図５Ｃ）についてアッセイした。実際、ジャーカット細胞で得られた結果と一致して、短いリンカー及び長いリンカーを持つ構築体は、ｍｅｍＩＬＬ－１０Ｒβよりもはるかに高いレベルで発現され、優れた機能を発揮する。これは、表面ＩＬ－１０Ｒの大幅な減少及びｐＳＴＡＴ３のより強い誘導から明白である。短いリンカー構築体（ｓＬｍｅｍＩＬ－１０）は、長いリンカー構築体（ｌＬｍｅｍＩＬ－１０）よりも、ｐＳＴＡＴ３を誘導する能力が繰り返し実験（図示略）においても優れていたため、さらなる実験用に選択した。

【0150】

実施例３．レトロウイルス形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ－１０の発現及び特徴解析。
レトロウイルス形質導入Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ－１０の発現及び機能を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスから磁気ビーズで精製された脾臓ＣＤ４Ｔ細胞を最初に使用した。ｍｅｍＩＬ－１０形質導入細胞に対する陰性対照として、偽形質導入細胞（Ｍｏｃｋ）を使用した。これらの実験では、可溶性ＩＬ－１０（ｓＩＬ－１０）を陽性対照として使用した。図６は、３つのＴｒ１関連マーカーＬＡＧ－３、ＣＤ４９ｂ、及びＰＤ－１の発現について、同じ培養で増殖させた形質導入細胞及び非形質導入細胞と偽形質導入細胞を、トランスフェクション後４８時間及び６日にフローサイトメトリー分析した結果を示す。３つのマーカーの明確な上昇は、実際に２日目で既に観察され、６日目も持続し、予想された表現型を示している。形質導入されたＴ細胞がＴＣＲを介した活性化によりＩＬ－１０を分泌する能力により、Ｔｒ１のような機能的特性の獲得が確認された（図７）。

【0151】

実施例４．ｍｅｍＩＬ－１０の長期発現と表現型の特徴
ｍｅｍＩＬ－１０の長期発現は、レトロウイルス形質導入によって達成される。対照の非Ｔｒ１ＣＤ４Ｔ細胞として、ＣＤ４Ｔ細胞にＥＧＦＰ遺伝子をマーカーとして形質導入する。我々は最初に、いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ疾患モデルに関連するＮＯＤ及びＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスのＣＤ４Ｔ細胞をＴｒ１細胞に分化させるための効果的なプロトコル（マウスの場合は（５２、５３）、ヒトのＣＤ４Ｔ細胞の場合は（１）に記載されている詳細なガイドラインに従って、照射されたＡＰＣ、ＴＣＲ刺激、サイトカイン、その他の培養条件の必要性を調べる）を確立することを試みた。この目的のために、フローサイトメトリー分析を使用して、ＬＡＧ－３及びＣＤ４９ｂの獲得をｍｅｍＩＬ－１０の発現と相関させる。追加の表現型分析（すべてＥＧＦＰ＋非Ｔｒ１細胞と比較）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖速度、分化の状態（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ６２Ｌ）、活性化マーカー（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＣＤ１６１、及びＣＤ１３７）及びＩＬ－１０に関連するマーカー（ＰＤ－１、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ及びＩＬ－１０Ｒ）のレベルを決定する。ｍｅｍＩＬ－１０誘導Ｔｒ１細胞の機能を、それらがＴＣＲを介した活性化に応答して分泌するＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＴＮＦ－αなどのサイトカインのパターンを介して最初に評価する。アネルギー状態を評価するために、ＣＦＳＥ希釈アッセイを使用して、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８Ａｂの存在下、及び可溶性ＩＬ－２及びＩＬ－１５の非存在下又は存在下での増殖能を分析する。

【0152】

実施例５．Ｔエフェクター細胞に対する形質導入細胞の阻害効果の評価。
形質導入細胞がその阻害効果を隣接するＴｅｆｆ細胞に対して発揮する能力を調べるために、１つのＴ細胞集団のみを選択的に活性化し、他のＴ細胞集団を活性化できないようにする共培養設定を設計する（明らかに、抗ＴＣＲ／ＣＤ３ Ａｂは共培養中のすべてのＴ細胞を活性化する）。この目的のため、キメラＨ－２Ｋ^ｂ－ＣＤ３ζ（Ｋ^ｂ－ＣＤ３ζ）及びＨ－２Ｋ^ｄ－ＣＤ３ζ（Ｋ^ｄ－ＣＤ３ζ）ＭＨＣ－Ｉ重鎖をコードする、我々が作成した２つの遺伝子を利用する。我々は既に、両遺伝子が、ＴＣＲクロスリンクに匹敵する規模のＡｂを介したクロスリンク後にＴ細胞を選択的に活性化することを示している。次の一連の機能実験では、これらのツールを使用して、ｍＲＮＡをトランスフェクションしたＴｒ１細胞とＴｅｆｆ細胞を様々な比率で３～４日間混合し、ＣＦＳＥ希釈及び細胞内ＩＦＮ－γ染色を使用して、（非活性化又はＲＦＰ＋非Ｔｒ１細胞に対する）活性化Ｔｒ１細胞の、活性化Ｔｅｆｆの増殖及びエフェクター機能の両方を抑制する能力を評価する。

【0153】

実施例６．ＩＬ－１０形質導入細胞のｉｎ ｖｉｖｏ持続性及びヒト疾患のマウスモデルにおける抑制機能の評価。
シンジェニック野生型マウスにおけるＩＬ－１０形質導入ＮＯＤ又はＢ６ ＣＤ４Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ持続性及びその表現型の維持を評価するために、Ｔ１Ｄ実験系において我々が最近確立したプロトコル（５４）を使用する。簡潔に述べると、１０×１０^６個の細胞を尾静脈に注射する。注射の１、７、及び１４日後に脾臓及び末梢リンパ節を採取し、ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＬＡＧ－３＋ＣＤ４９ｂ＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーで識別する（注射していないマウスのバックグラウンド染色レベルと比較する）。

【0154】

次に、Ｔ１ＤやＩＢＤなどのヒト疾患のマウスモデルを使用して、生体内の生理学的条件下でのｍｅｍＩＬ－１０形質導入Ｔ細胞の実際の抑制機能を試験する。
実施例７．レトロウイルス形質導入ヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ－１０の発現及び特徴解析。

【0155】

ヒトＣＤ４Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入の表現型及び機能の結果を評価するために、イスラエルのマーゲン・ダビド公社の血液サービスセンターを通じて健康なドナーから得た血液試料からＣＤ４Ｔ細胞を単離した。２つの独立したｅｘ－ｖｉｖｏ実験の１回目が図８に示されている。この実験では、細胞を形質導入後１８日間培養し、形質導入後１、５、及び１８日目に、マーカーＬＡＧ－３、ＣＤ４９ｂ、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、ＣＤ２５及びＩＬ－１０Ｒαの表現型分析をフローサイトメトリーで行った。我々の結果から、予想されるＴｒ１表現型に関連するこれらすべての細胞表面マーカーが、実験の全期間にわたって同じ培養皿で増殖させたｍｅｍＩＬ－１０陰性細胞と比較して、ｍｅｍＩＬ－１０発現細胞で有意に増加したことが確認される。

【0156】

２回目の実験は別の血液試料に対して行われ、ＬＡＧ－３、ＣＤ４９ｂ、及びＰＤ－１（図９）について行われたフローサイトメトリーは、１回目の実験で得られた結果と一致している。これらの２つの実験から、レトロウイルス形質導入を介したヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ－１０の長期発現は、これらの細胞にＴＲ－１のような表現型を与えると結論付けることができる。

【0157】

実施例８．炎症性腸疾患（ＩＢＤ）治療用途
本発明は、炎症を起こした腸での免疫寛容を回復するために、ＩＢＤ関連抗原にＣＡＲ－Ｔｒｅｇをリダイレクトするための適切な抗原を同定する必要性に対する解決策を提供する。

【0158】

このアプローチは、次の概念に基づいている。
・Ｔｒｅｇは、腸上皮を通過可能な共生微生物叢又は食物のいずれかに由来する一般的な腸抗原に対して遺伝的にリダイレクトされる。

【0159】

・最初の選択肢として、Ｔｒｅｇのリターゲティングは、ＴＬＲ２の細胞外部分を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を介して実行される。これは、一般的な細菌成分であるペプチドグリカンと追加の腸内微生物抗原に自然に結合する。あるいは、ＰＧＮに対する従来のｓｃＦｖベースのＣＡＲが生成される。

【0160】

・選択したＴｒｅｇは１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１）であり、これは、ＴＣＲを介した抗原との関与に続いて、主に大量のＩＬ－１０及びＴＧＦ－βの分泌を通じて、細胞間非依存的に炎症性Ｔ細胞を抑制できる。

【0161】

・ヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の強制発現は、Ｔｒ１表現型の誘導と維持の両方に十分であるため、膜結合型ＩＬ－１０の発現は、オートクリン方式でこの特性を利用するための新しいデバイスとして機能する。

【0162】

・最近同定された２つの表面マーカーであるＣＤ４９ｂとＬＡＧ－３は、Ｔｒ１細胞上で選択的かつ安定して発現され、精製及びその後のＴｒ１表現型の保存についての分析を可能にする。

【0163】

・（任意に、適切な候補抗原の特定を条件とする：同じＴｒ１細胞で共発現する食餌性抗原に特異的な抑制性ＣＡＲは、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇの抑制機能を一時的に遮断する独自の手段として機能する（例えば感染の場合））。

【0164】

・リダイレクトされたＴｒ１細胞の腸管ホーミングは、注入前にオールトランスレチノイン酸とインキュベートすることで強化できる。
実施例９．免疫標的デバイス
この例では、ＴｒｅｇをＰＧＮにリダイレクトするためのＴＬＲ２ベースのＣＡＲの遺伝子工学について説明する。フラジェリン又は他のＴＬＲ－ＣＡＲに対するＴＬＲ５ベースのＣＡＲは、同じガイドラインに従って構築される。２つのクローニング戦略を図１０に示す。１つ目（図１０Ａ、左）は全長ＴＬＲ２を利用する。この例ではＣＤ３を含むＴ細胞シグナル伝達部分は、ＴＬＲ２トルＩＬ－１受容体ドメイン（ＴＩＲ）のＣ末端に遺伝的に継ぎ足されている。ＰＧＮへの結合は、ＴＬＲ２とＣＤ３ζを介して、又はよく研究されたＰｒｏ６８１Ｈｉｓ変異をヒトＴＬＲ２ＴＩＲに組み込んだ場合にのみ（２０）ＣＤ３ζを介して（ここでは＊の印をつける）、２つのシグナルを同時に送達すると予想される。２つ目の戦略では、ＴＬＲ２細胞外ドメイン（エクトドメイン）を従来のヒンジ－ＣＤ３ζＣＡＲスキャフォールドに継ぎ足す（図１０Ａ、中央）。ヒンジ領域はヒトＩｇＧ又はＩｇＤ重鎖に由来する。図１０Ａ、右は、抗体単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントに基づく「古典的な」ＣＡＲを示す。本発明の文脈において、この構成は、例えば、選択した抗ＰＧＮ／フラジェリンｍＡｂのｓｃＦｖ部分を使用した抗ＰＧＮ又は抗フラジェリンＣＡＲの生成に利用することができる。

【0165】

我々の知る限り、ＴＬＲベースのＣＡＲはこれまでに説明されたことはない。それらは、ＴＬＲ認識及びシグナル伝達とＴ細胞活性化シグナル伝達とのカップリング（図１０Ａ、左、＊なしのように）又はＴＬＲ認識（ただしシグナル伝達なし）とＴ細胞活性化シグナル伝達とのカップリング（図１０Ａ、左、＊あり及び図１０Ａ中央）のいずれかを可能にすることができる。これらのＴＬＲ－ＣＡＲによるＴＬＲを介した認識は、異なるＴＬＲによる複数の天然リガンドの生理学的認識を再現することが期待される。

【0166】

実施例１０．抗ＰＧＮ ａＣＡＲの構築と特性評価。
材料と方法
抗ＰＧＮｍＡｂを産生する２つのＢ細胞ハイブリドーマからのｓｃＦｖ遺伝子セグメントの構築
抗ＰＧＮ ＣＡＲを生成するために、ＡＴＣＣから、様々なグラム－及びグラム＋細菌のＰＧＮと特異的に反応するｍＡｂを産生する２つのマウスＢ細胞ハイブリドーマを取得した。これらは：
１．３Ｃ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８５１１（商標））、ＩｇＧ１（κ）
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／ＨＢ－８５１１．ａｓｐｘ＃ｇｅｎｅｒａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
２．３Ｆ６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８５１２（商標））、ＩｇＭ（κ）
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｌｌ／ＨＢ－８５１２．ａｓｐｘ＃ｇｅｎｅｒａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
である。これら両方のハイブリドーマのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子の完全なＤＮＡ配列が決定されており（アウトソーシング、Ｈｙｌａｂｓ、レホボト、イスラエル）、それらのｓｃＦｖｓ誘導体のクローニングに役立てた。次に、これらの遺伝子セグメントを、我々が研究室で以前に構築した第２世代のＣＡＲバックボーンに組み込んだ（図１１を参照：Ｌｅａｄ、リーダーペプチド；Ｌｉ、リンカー；Ｔ、Ｍｙｃタグ；ヒンジ、ＣＤ８α由来；Ｔｍ、ＣＤ２８膜貫通型）。ＣＡＲの調製方法の詳細については、参照により本明細書に完全に開示されているかのように組み込まれる（２１）（４６）（４７）（４８）（４９）（５０）を参照されたい。

【0167】

抗ＰＧＮ ＣＡＲ１５６４（３Ｃ１１）：ｓｃＦＶ－ＣＤ２８－γのＤＮＡ配列
５’非翻訳配列（配列番号２）－リーダーペプチド＋Ｖ_Ｌ（配列番号４）－リンカー（配列番号６）－Ｖ_Ｈ（配列番号８）－Ｍｙｃタグ（配列番号６９）－ＣＤ８αヒンジ（配列番号１０）－ＣＤ２８膜貫通及び細胞内ドメイン配列（配列番号１２）－ＦｃＲγ細胞内ドメイン（配列番号１４）－３’非翻訳配列（配列番号１５）。

【0168】

１５６４（３Ｃ１１）：ｓｃＦＶ－ＣＤ２８－γ、タンパク質のアミノ酸配列
リーダーペプチド＋Ｖ_Ｌ（配列番号３）－リンカー（配列番号５）－Ｖ_Ｈ（配列番号７）－Ｍｙｃタグ（配列番号６８）－ＣＤ８αヒンジ（配列番号９）－ＣＤ２８膜貫通及び細胞内ドメイン配列（配列番号１１）－ＦｃＲγ細胞内ドメイン（配列番号１３）
１５６５（３Ｆ６）：ｓｃＦＶ－ＣＤ２８－γのＤＮＡ配列：
５’非翻訳配列（配列番号２）－リーダーペプチド＋Ｖ_Ｌ（配列番号１７）－リンカー（配列番号６）－Ｖ_Ｈ（配列番号１９）－Ｍｙｃタグ（配列番号６９）－ＣＤ８αヒンジ（配列番号１０）－ＣＤ２８膜貫通及び細胞内ドメイン配列（配列番号１２）－ＦｃＲγ細胞内ドメイン（配列番号１４）－３’非翻訳配列（配列番号１５）。

【0169】

１５６５（３Ｆ６）：ｓｃＦＶ－ＣＤ２８－γのアミノ酸配列
リーダーペプチド＋Ｖ_Ｌ（配列番号１６）－リンカー（配列番号５）－Ｖ_Ｈ（配列番号１８）－Ｍｙｃタグ（配列番号６８）－ＣＤ８αヒンジ（配列番号９）－ＣＤ２８膜貫通及び細胞内ドメイン配列（配列番号１１）－ＦｃＲγ細胞内ドメイン（配列番号１３）
結果：
２つの抗ＰＧＮｍＡｂ、３Ｃ１１（マウスＩｇＧ、ハイブリドーマから精製）及び３Ｆ６（マウスＩｇＭ、ハイブリドーマ上清）を、「エッペンドルフＥＬＩＳＡ」を使用して黄色ブドウ球菌からのＰＧＮの結合についてアッセイし、ＰＧＮに特異的に結合することが分かった（図１２）。

【0170】

抗ＰＧＮ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化。Ｔ細胞活性化のための活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）－ＬａｃＺレポーター遺伝子を担持するＢ３Ｚ Ｔ細胞（Ｈ－２Ｋｂの状況下でＯＶＡ（２５７～２６４）（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を特異的に認識するＴＣＲを発現するＴ細胞ハイブリドーマ）を、２つの抗ＰＧＮ ＣＡＲ（ＣＡＲ－３Ｃ１１及びＣＡＲ－３Ｆ６）又は対照としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のそれぞれをコードするｍＲＮＡでトランスフェクションした。次に、黄色ブドウ球菌由来のＰＧＮの存在下又は非存在下で細胞を一晩インキュベートした。結果は、β－Ｇａｌ活性の比色クロロフェノールレッド－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）アッセイのＯＤとして示されている（図１３）。

【0171】

次の実験では、同じＢ３ＺレポーターＴ細胞に２つの抗ＰＧＮ ＣＡＲ及び対照をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、今回はグラム陰性菌（大腸菌）又はグラム陽性菌（黄色ブドウ球菌）の両方に由来するＰＧＮの存在下で培養した。２４時間後、細胞をＴ細胞活性化のための比色ＣＰＲＧレポーターアッセイに供した（図１４）。

【0172】

図１３及び１４から、両方の抗ＰＧＮ ＣＡＲがＰＧＮ依存的にＴ細胞を活性化することを示していることが明らかである。グラム陰性菌及びグラム陽性菌からのＰＧＮは、Ｔ細胞の活性化に同等に効果的であった。

【0173】

実施例１１．ＴＬＲ２－ａＣＡＲの構築と特性評価。
ＴＬＲ２－ＴＩＲ（＊）－ゼータＣＡＲの構築
ＴＬＲ２－ＴＩＲ（＊）－ゼータＣＡＲの一般構造を図１０Ａの左側に示す。このシリーズの２つのＣＡＲをコードする遺伝子は、モジュラー制限部位支援クローニングを使用して構築されている。ＴＬＲ－２－ＴＩＲ－ゼータＣＡＲの遺伝子は、リーダーペプチド、エクトドメイン、膜貫通型及び野生型ＴＩＲエンドドメインをコードするヒトＴＬＲ－２ｃＤＮＡと、それに続くヒトＣＤ３ζの完全な細胞内部分を含む。６８１番目のコドンのＣがＡに置換してＰｒｏがＨｉｓコドンに変化していることを除いて、同じ構成要素がＴＬＲ－２－ＴＩＲ（＊）－ゼータＣＡＲをコードする遺伝子に含まれており、ヒトＴＬＲ２ ＴＩＲでよく研究されているＰｒｏ６８１Ｈｉｓ変異が生成される（２０）。

【0174】

ＴＬＲ２－ＩｇＤ－ゼータＣＡＲの構築
ＴＬＲ－２－ＴＩＲ（＊）－ゼータＣＡＲと同様に、ＴＬＲ－２－ＩｇＤ－ゼータＣＡＲは、認識部分としてＴＬＲ２エクトドメインを保持する。これは、ヒトＩｇＤヒンジとＣＤ３ζの膜貫通及び細胞内部分とを含む従来の第１世代ＣＡＲバックボーンに継ぎ足される（図１０Ａ、中央）。

【0175】

ＴＬＲ－２ａＣＡＲの発現
ＴＬＲ－２ベースのＣＡＲの完全性と細胞表面発現は、これらのＣＡＲをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後のフローサイトメトリー分析によって確認された（図１０Ｂ）。

【0176】

実施例１３．抗ＰＧＮ ａＣＡＲにリダイレクトされたＴｒ１ Ｔ細胞の抗ＰＧＮエフェクターＴ細胞を阻害する能力。
一連の２者間及び３者間共培養実験では、抗ＰＧＮ ＣＡＲ又はＴＬＲ２－ＣＡＲでトランスフェクトされたＴｒ１細胞（培養中のＰＧＮによって活性化され、任意選択でｍｅｍＩＬ－１０コーディングベクターでトランスフェクトされたもの）が、ＧＦＰ標識活性化Ｔｅｆｆ及びスタンバイＣＤ４Ｔｅｆｆ（Ｋ^ｄ－ＣＤ３ζを発現し、抗Ｋ^ｄＡｂによって活性化されるもの）を抑制する能力を様々な細胞比で調べる。読み出しには、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－βの細胞内染色、それぞれのマーカーを発現する細胞のゲーティングが含まれる。

【0177】

実施例１４．腸管ホーミング
ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇは、上記のようにレチノイン酸と接触させることにより、腸管ホーミング能力を備えてもよい。

【0178】

ＴＬＲ２又はｓｃＦｖ抗ＰＧＮベースのＣＡＲ（我々のＣＤ２８－ＦＣＲγシグナル伝達ドメインはヒトとマウスの両方のＴ細胞で作用する）及びメンブレンＩＬ－１０（ヒトＩＬ－１０はマウス受容体に結合して活性化する）をコードするレトロウイルスベクターは、２つの別々のレトロウイルスベクターとして、又は一緒に双方向ベクターとして構築される。インタクトな可溶性ＩＬ－１０も対照としてクローニングされる（（１）に基づく）。表面発現を検証する。ヒトＴ細胞をＰＧＮに特異的にリダイレクトするＴＦＲ２ＣＡＲの能力、及び構成的シグナル伝達をトリガーするメンブレンＩＬ－１０の能力を評価する（後者には、我々が既に生成したＩＬ－１０レポーター遺伝子を用いる）。

【0179】

ＴＦＲ２／ｓｃＦｖ抗ＰＧＮベースのＣＡＲは、遺伝子改変Ｔｒ１細胞によって抑制されるヒト及びマウスＰＧＮ特異的Ｔｅｆｆ細胞の容易に利用可能なソースの生成にも役立つ。

【0180】

このアプローチのｉｎ ｖｉｖｏ評価は、以下の理論的根拠を利用している：トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）及びオキサゾロン誘発性大腸炎は、直腸内投与によってエタノールに溶解したこれらのハプテン物質を使用するＩＢＤの２つの広く研究されているマウスモデルシステムである（５５）。これらのシステムは、以前はＢＡＬＢ／ｃマウスで確立されており、養子移入されたトリニトロフェニル（ＴＮＰ）リダイレクトＴｒｅｇの研究に利用されていた。これらは、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドで抗ＴＮＰ ＣＡＲを発現するトランスジェニックマウス（５６）、又は野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離されたＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）Ｔｒｅｇのレトロウイルス形質導入（５７）のいずれかに由来する。ＴＮＰリダイレクトＴｒｅｇは、ＴＮＢＳ誘発性大腸炎を抑制することができたが、オキサゾロン誘発性疾患に対しては効果がなかく、影響を受けたマウスがＴＮＢＳにも曝露された場合にのみ、この大腸炎を抑制することができた（５６）。この抗原特異的抑制は、Ｅｓｈｈａｒの研究室で実践されているプロトコルを実験的に適用して対処される次の推測を提唱する：ＢＡＬＢ／ｃ由来ＴＬＲ２－ＣＡＲ Ｔｒ１細胞は、腸内に遍在するＰＧＮの存在により、ＴＮＢＳ及びオキサゾロン誘発性大腸炎の両方を抑制すると予想されるのに対し、ＴＮＰ－ＣＡＲ Ｔｒ１細胞は、ＴＮＢＳ誘発性疾患のみを抑制すると予想される。さらに、健康なＢＡＬＢ／ｃマウスへの養子移入後、ＰＧＮリダイレクトＴｒ１細胞は抗原によって絶えず活性化され、その結果持続するが、抗原がない場合、ＴＮＰによりリダイレクトされた対応物は短命で消失すると予想される。（これらのＴｒ１細胞は、ＣＤ４Ｔｅｆｆ細胞のプールから誘導され、内因性ＴＣＲを介して同族の自己抗原によって一定の刺激を受けることができる天然のＴｒｅｇに由来しないことに注意されたい）。

【0181】

したがって、ＰＧＮ特異的であるがＴＮＰ特異的ではないＴｒ１細胞は、疾患誘発のずっと前に投与されたとしても、ＴＮＢＳ（及びオキサゾロン）によって誘発された大腸炎からの保護を提供できると予想される。この推測の検証は、予測された安定したＴｒ１表現型とリプログラミングされたＴ細胞の長期的な機能を強力にサポートするであろう。

【0182】

参考文献

【0183】

【表4-1】

【0184】

【表4-2】

【0185】

【表4-3】

【0186】

【表4-4】

【0187】

【表4-5】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

2022527162000001.app

【国際調査報告】