特表 2022-533801 合成による高速フォワードシークエンシング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-25

(54)【発明の名称】合成による高速フォワードシークエンシング

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20220715BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220715BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022512704

(86)(22)【出願日】2020-05-01

(85)【翻訳文提出日】2021-12-28

(86)【国際出願番号】 US2020031163

(87)【国際公開番号】W WO2020227143

(87)【国際公開日】2020-11-12

(31)【優先権主張番号】62/842,534

(32)【優先日】2019-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/904,274

(32)【優先日】2019-09-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/971,530

(32)【優先日】2020-02-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521480341

【氏名又は名称】ウルティマ ジェノミクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】プラット， マーク

(72)【発明者】

【氏名】アルモジー， ギラッド

(72)【発明者】

【氏名】ブリンザ， ドミトル

(72)【発明者】

【氏名】トレパグニア， エリアン

(72)【発明者】

【氏名】バラド， オマー

(72)【発明者】

【氏名】エツィオーニ， ヨアヴ

(72)【発明者】

【氏名】オーバーストラス， フロリアン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

(57)【要約】

ポリヌクレオチドについてのカップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法、およびカップリングされたシークエンシングリードペアを解析する方法が、本明細書に記載される。カップリングされたシークエンシングリードペアを解析して、カップリングされたシークエンシングリードペアの中の直接シークエンシングされない遺伝子座にあるものを含むポリヌクレオチドバリアントを検出することができる。他の解析方法は、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用してコンセンサス配列を構築または検証するステップを含むことができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用して前記プライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で伸長された前記プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、（ｉ）前記プライマーが、前記伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、前記第２の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、前記第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）前記第２の領域を通した前記プライマーの伸長が、ステップ（ｂ）における前記プライマーの伸長よりも速く進行する、ステップ；および
（ｄ）前記ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ
を含む方法。

【請求項2】

前記第２の領域を通した前記プライマーの伸長が、前記第１の領域を通した前記プライマーの伸長より速く進行する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１の領域の前記シークエンシングデータを前記第３の前記シークエンシングデータと関連付けるステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法であって、
（ａ）プライマーを前記ポリヌクレオチドの第１の領域とハイブリダイズしてハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｂ）前記プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通して伸長するステップであって、（ｉ）前記プライマーが、前記伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、前記第２の領域を通して伸長される、または（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、前記第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される、ステップ；および
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｂ）で伸長された前記プライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ
を含む方法。

【請求項5】

前記第１の領域が、前記プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記プライマーが、前記伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、前記第２の領域を通して伸長される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第２の領域を通して前記プライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドの少なくとも一部分が、非標識ヌクレオチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第２の領域を通して前記プライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、前記第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第２の領域のフロー順序が、５つまたはそれより多くのヌクレオチドフローを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ヌクレオチドフローの各々が、単一のヌクレオチド塩基を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第２の領域のフロー順序が、２カ所より多くのフロー位置において、ランダムシークエンシング開始位置の５％またはそれより多くにおける可能なＳＮＰパーミュテーションの５０％またはそれより多くについてのシグナル変化を誘導する、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２の領域のフロー順序が、１フロー当り０．６のまたはそれを超える塩基組込みの効率を有する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

参照配列および前記第２の領域のフロー順序を使用して前記第２の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して前記第３の領域を通して伸長され、前記方法が、前記第２の領域についての参照配列、前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、および前記第３の領域についての参照配列を使用して、前記第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記第３の領域のフロー順序が、５つまたはそれより多くのヌクレオチドフローを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ヌクレオチドフローの各々が、単一のヌクレオチド塩基を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記第３の領域のフロー順序が、２カ所より多くのフロー位置において、ランダムシークエンシング開始位置の５％またはそれより多くにおける可能なＳＮＰパーミュテーションの５０％またはそれより多くについてのシグナル変化を誘導する、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

前記第３の領域のフロー順序が、１フロー当り０．６のまたはそれを超える塩基組込みの効率を有する、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して前記第３の領域を通して伸長され、前記方法が、前記第２の領域についての参照配列、前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、および前記第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して、前記第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、前記第３の領域の配列に関連する前記シークエンシングデータが、前記第３の領域について生成される同じまたは異なるシークエンシングデータである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記第２の領域または前記第３の領域についての前記予想参照データが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記第２の領域のフロー順序、および前記第２の領域についての第２の参照配列を使用して、前記第２の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、前記第２の参照配列が、前記試験バリアントを含む、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して前記第３の領域を通して伸長され、前記方法が、前記第２の領域についての第２の参照配列、前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、および前記第３の領域についての参照配列を使用して、前記第３の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して前記第３の領域を通して伸長され、前記方法が、前記第２の領域についての第２の参照配列、前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、および前記第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して、前記第３の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、前記第３の領域の配列に関連する前記シークエンシングデータが、前記第３の領域について生成される同じまたは異なるシークエンシングデータである、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記第２の領域または前記第３の領域についての予想参照シークエンシングデータが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；および
マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分、またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分を、前記第２の領域の長さを示す距離情報を使用して、前記参照配列にマッピングするステップ
を含む、方法。

【請求項27】

構造バリアントを検出する方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；
マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分についての参照配列内の予想遺伝子座を、前記第２の領域の長さを示す距離情報を使用して決定するステップ；
前記参照配列に基づいて前記予想遺伝子座における配列についての予想シークエンシングデータを決定するステップ；および
前記マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分または前記マッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分を前記予想シークエンシングデータと比較することにより構造バリアントを検出するステップであって、前記マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分または前記マッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分と前記予想シークエンシングデータとの差が、前記構造バリアントを示す、ステップ
を含む方法。

【請求項28】

構造バリアントを検出する方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップを含み、マッピングされなかった第１の領域、またはマッピングされなかった第３の領域が、前記参照配列内にマッピング不可能である、方法。

【請求項29】

構造バリアントを検出する方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分および第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；
マッピングされた第１の領域とマッピングされた第３の領域の間のマッピング距離情報を決定するステップ；および
前記マッピング距離情報を前記第２の領域の予想距離情報と比較することにより前記構造バリアントを検出するステップであって、前記マッピング距離情報と前記予想距離情報との差が前記構造バリアントを示す、ステップ
を含む方法。

【請求項30】

前記構造バリアントが、染色体融合、逆位、挿入、または欠失である、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記バリアントが、前記第２の領域内の挿入または欠失である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分および第３の領域もしくはその一部分を、参照配列の第１の位置および第２の位置を含む２つまたはそれより多くの異なる位置ペアにマッピングするステップ；および
前記第２の領域の長さを示す第１の距離情報、および前記２つまたはそれより多くの位置ペアについての前記第１の位置と前記第２の位置の間の距離を示す第２の距離情報を使用して、正しい位置を選択するステップ
を含む方法。

【請求項33】

伸長された前記プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して前記第３の領域を通して伸長される、請求項１から２５のいずれか一項に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアントを検出する方法であって、
前記第１の領域またはその一部分を参照配列にマッピングするステップ；
（１）前記第２の領域についての参照配列、前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、および前記第３の領域についての参照配列、または（２）前記第２の領域についての参照配列、前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、および前記第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータを使用して、前記第３の領域またはその一部分についての予想シークエンシングデータを決定するステップであって、前記第３の領域の配列に関連する生成配列データが、前記第３の領域について生成された同じまたは異なる配列データである、ステップ；および
前記第３の領域についての前記予想シークエンシングデータを前記第３の領域の配列に関連する前記生成シークエンシングデータと比較することによりバリアントの存在を検出するステップ
を含む方法。

【請求項34】

前記バリアントが、構造バリアントである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記構造バリアントが、染色体融合、逆位、挿入、または欠失である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

試験バリアントを検出するために使用され、前記参照配列が前記試験バリアントを含む、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記試験バリアントが、第２のポリヌクレオチド中の試験バリアント４を同定することにより選択される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

検出された試験バリアントと前記ポリヌクレオチドの前記第１の領域または第３の領域におけるシークエンシングされた対立遺伝子とを関連付けるステップを含む、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

ポリヌクレオチドのシークエンシングされなかった領域における塩基トランスバージョンの存在を検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法であって、
（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）において伸長された前記プライマーを、第２の領域を通して、（１）シトシンおよびチミンと（２）アデニンおよびグアニンとの交互ヌクレオチドペアを含むフロー順序を使用してさらに伸長するステップ；および
（ｄ）前記ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長された前記プライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ
を含む方法。

【請求項41】

カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法であって、
（ａ）プライマーを前記ポリヌクレオチドの第１の領域とハイブリダイズしてハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｂ）前記プライマーを、第２の領域を通して、（１）シトシンおよびチミンと（２）アデニンおよびグアニンとの交互ヌクレオチドペアを含むフロー順序を使用して伸長するステップ；および
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｂ）で伸長された前記プライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ
を含む方法。

【請求項42】

前記第１の領域が、前記プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記プライマーが、前記伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、前記第２の領域を通して伸長される、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

ポリヌクレオチドのシークエンシングされなかった領域における塩基トランスバージョンの存在を検出する方法であって、
前記プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して前記第３の領域を通して伸長される、請求項４１から４３のいずれか一項に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域またはその一部分および第３の領域またはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；
第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、および前記参照配列を使用して、前記第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップ；および
前記第３の領域についての予想シークエンシングデータと前記第３の領域についての生成シークエンシングデータとの差に基づいて前記塩基トランスバージョンの存在を検出するステップ
を含む方法。

【請求項45】

前記第３の領域についての前記予想シークエンシングデータが、前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、前記第２の領域についての参照配列、および前記第３の領域についての参照配列を使用して決定される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記第３の領域についての前記予想シークエンシングデータが、前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、前記第２の領域についての参照配列、および前記第３の領域の配列に関連する生成配列データを使用して決定され、前記第３の領域の配列に関連する前記生成配列データが、前記第３の領域について生成された同じまたは異なる配列データである、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記第３の領域についての前記予想シークエンシングデータが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

１つまたは複数のコンセンサス配列を生成する方法であって、請求項１から２５のいずれか一項に従って生成された複数のカップリングされたシークエンシングリードペアをアセンブルするステップを含む、方法。

【請求項49】

１つまたは複数のコンセンサス配列から選択されたコンセンサス配列の一部分を、前記選択されたコンセンサス配列の一部分に関連する、選択された、カップリングされたシークエンシングリードを使用して検証するステップをさらに含み、前記選択された、カップリングされたシークエンシングリードを生成する際に前記第３の領域を通して伸長されるプライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長され、前記検証するステップが、
前記第２の領域のフロー順序、前記第３の領域のフロー順序、および前記選択されたコンセンサス配列の一部分を使用して、前記選択された、カップリングされたシークエンシングリードの第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定すること；および
前記選択された、カップリングされたシークエンシングリードの前記第３の領域についての前記予想シークエンシングデータを前記第３の領域の前記生成シークエンシングデータと比較することにより、前記選択されたコンセンサス配列の一部分を検証すること
を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

試験バリアントのステータスを検証する方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に従って生成された複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードペアに亘る前記バリアントのステータスを比較するステップであって、前記複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードペアが、前記試験バリアントの遺伝子座に対応する遺伝子座を含む、ステップ；
前記比較に基づいて前記バリアントのステータスを検証するステップ
を含む方法。

【請求項51】

試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出するための方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載のカップリングされたシークエンシングリードペアを生成するステップ；
前記ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連する前記シークエンシングデータを前記ポリヌクレオチドの前記第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；および
前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在または非存在をコールするステップ
を含む方法。

【請求項52】

前記第１の領域の前記配列に関連する前記シークエンシングデータ、または前記第３の領域の前記配列に関連する前記シークエンシングデータが、複数のフロー位置の中の各フロー位置に取り込まれた塩基の数を示す塩基カウントを表すフローシグナルを含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記フローサイクル順序が、同じ順序で反復される４つの別々のフローを含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記フローサイクル順序が、５つまたはそれより多くの別々のフローを含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

カップリングされたシークエンシングリードペアを生成するステップが、
前記プライマーを、第４の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第４の領域を通して伸長すること、ここで、（ｉ）前記プライマーが、前記伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、前記第４の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、前記第４の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）前記第４の領域を通した前記プライマーの伸長が、前記第１の領域または前記第３の領域を通した前記プライマーの伸長よりも速く進行する；および
前記ポリヌクレオチドの第５の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用する第４を通して伸長された前記プライマーのさらなる伸長、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在の検出により、生成すること
を含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記第５の領域の前記シークエンシングデータを前記第１の領域の前記シークエンシングデータまたは前記第３の領域の前記シークエンシングデータと関連付けるステップをさらに含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記ポリヌクレオチドが、ローリングサークル増幅を使用して増幅される、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出する方法であって、
（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用してポリヌクレオチドを増幅させて、前記ポリヌクレオチドの第１のコピーと前記ポリヌクレオチドの第２のコピーとを少なくとも含むＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドを生成するステップ；
（ｂ）前記ＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用して前記プライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｄ）前記プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、（ｉ）前記プライマーが、前記伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、前記第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域を通した前記プライマーの伸長が、前記第１の領域を通した前記プライマーの伸長よりも速く進行する、ステップ；
（ｅ）前記ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｆ）前記ポリヌクレオチドの前記第３の領域について生成された前記シークエンシングデータを前記ポリヌクレオチドの前記第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；
（ｇ）前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域における前記短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップ；
（ｈ）前記ポリヌクレオチドの前記第２のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用して前記プライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；および
（ｉ）前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域における前記短い遺伝子バリアントのアイデンティティーをコールするステップ
を含む方法。

【請求項59】

前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域を通した前記プライマーの伸長が、前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第１の領域を通した前記プライマーの伸長よりも速く進行する、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出する方法であって、
（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用してポリヌクレオチドを増幅させて、前記ポリヌクレオチドの第１のコピーと前記ポリヌクレオチドの第２のコピーとを少なくとも含むＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドを生成するステップ；
（ｂ）プライマーを前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの第１の領域にハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｃ）前記プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長するステップであって、（ｉ）前記プライマーが、前記伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域を通して伸長される、ステップ；
（ｄ）前記ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｅ）前記ポリヌクレオチドの前記第３の領域について生成された前記シークエンシングデータを前記ポリヌクレオチドの前記第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；
（ｆ）前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域における前記短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップ；
（ｇ）前記ポリヌクレオチドの前記第２のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用して前記プライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；および
（ｈ）前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域における前記短い遺伝子バリアントのアイデンティティーをコールするステップ
を含む方法。

【請求項61】

前記第１の領域が、前記プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記ポリヌクレオチドの前記第２のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域の前記配列に関連する前記シークエンシングデータが、前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域における前記短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップに基づいて動的に生成される、請求項５８から６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記プライマーが、前記伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域を通して伸長される、請求項５８から６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域を通して前記プライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドの少なくとも一部分が、非標識ヌクレオチドである、請求項５８から６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記ポリヌクレオチドの前記第１のコピーの中の前記ポリヌクレオチドの前記第２の領域を通して前記プライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドである、請求項５８から６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

シークエンシングクラスター内のシークエンシングプライマーを同期化する方法であって、
（ａ）プライマーをシークエンシングクラスター内のポリヌクレオチドコピーとハイブリダイズするステップ；
（ｂ）前記プライマーを、第１の領域のフローサイクルに従って標識ヌクレオチドを使用して前記ポリヌクレオチドコピーの第１の領域を通して伸長するステップ；
（ｃ）前記プライマーを、１つまたは複数の再位相化フローを使用して前記ポリヌクレオチドコピーの第２の領域を通して伸長するステップであって、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドの混合物が、前記１つまたは複数の再位相化フローの各々において使用される、ステップ；および
（ｄ）前記プライマーを、第３の領域のフローサイクルに従って標識ヌクレオチドを使用して前記ポリヌクレオチドコピーの第３の領域を通して伸長するステップ
を含む方法。

【請求項67】

３つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、前記１つまたは複数の再位相化フローのうちの少なくとも１つにおいて使用される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記１つまたは複数の再位相化フローが、４つまたはそれより多くのフローステップを含む、請求項６６または６７に記載の方法。

【請求項69】

前記１つまたは複数の再位相フローが、任意の順序で：
（ｉ）Ａ、ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＴヌクレオチドを含まない混合物を含む第１のフロー；
（ｉｉ）Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＡヌクレオチドを含まない混合物を含む第２のフロー；
（ｉｉｉ）Ｔ、ＡおよびＧヌクレオチドを含むがＣヌクレオチドを含まない混合物を含む第３のフロー；および
（ｉｖ）Ｔ、ＡおよびＣヌクレオチドを含むがＧヌクレオチドを含まない混合物を含む第４のフロー
を含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、前記プライマーを前記第１の領域を通して伸長しながら取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより生成するステップを含む、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、前記プライマーを前記第３の領域を通して伸長しながら取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより生成するステップを含む、請求項６６から７０のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１９年３月３日に出願した米国特許仮出願第６２／８４２，５３４号、２０１９年９月２３日に出願した米国特許仮出願第６２／９０４，２７４号および２０２０年２月７日に出願した米国特許仮出願第６２／９７１，５３０号に基づく優先権の利益を主張しており、前記仮出願の各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１６５２７２０００４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年４月２７日、サイズ：５ＫＢ）。

【0003】

発明の分野
カップリングされたシークエンシングリードペアを生成するための方法、およびシークエンシング法から得られたシークエンシングデータを解析する方法を含む、ポリヌクレオチドをシークエンシングする方法が、本明細書で開示される。

【背景技術】

【0004】

背景
ペアエンドシークエンシング法は、ポリヌクレオチド分子の３’および５’末端についてのシークエンシングデータを得るために使用されている。一般に、シークエンシングプライマーが、シークエンシングすべきＤＮＡポリヌクレオチドとハイブリダイズされ、いくつかの塩基がシークエンシングされて、ポリヌクレオチドの第１の末端についてのシークエンシングデータが得られる。次いで、第２のシークエンシングプライマーが、ポリヌクレオチドの他端付近の相補鎖とハイブリダイズされ、シークエンシングされて、ポリヌクレオチドの他端のシークエンシングデータが決定される。ポリヌクレオチドの３’および５’末端についてのシークエンシングデータは、シークエンシングデータが同じシークエンシングクラスターから得られたという事実に基づいて、カップリングされる。ペアエンドシークエンシング法は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プロトコルで使用されることが多い。

【0005】

しかし、旧来のペアエンドシークエンシングを使用しても、ポリヌクレオチドの３’末端と５’末端の間の領域に関する情報は得られない（またはほとんど得られない）。ある特定の解析を目的としてペアエンドシークエンシングデータを使用することができるが、ポリヌクレオチドのシークエンシングされなかった領域における特定のバリアントを検出するためにペアエンドシークエンシングデータを使用することはできない。旧来のペアエンドシークエンシング法を使用して一般に見逃されるポリヌクレオチドの領域をシークエンシングするために、ある特定のロングレンジシークエンシング技法が開発された。しかし、ロングレンジシークエンシングは、比較的遅く、かなりのシークエンシングエラーを起こしやすい。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の簡単な要旨
カップリングされたシークエンシングリードペアを生成するための方法、およびシークエンシング法から得られたシークエンシングデータを解析する方法を含む、ポリヌクレオチドをシークエンシングする方法が、本明細書で開示される。

【0007】

カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成するための方法は、（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で伸長されたプライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、（ｉ）プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）第２の領域を通したプライマーの伸長が、ステップ（ｂ）におけるプライマーの伸長よりも速く進行する、ステップ；および（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップを含む。一部の実施形態では、第２の領域を通したプライマーの伸長が、ステップ（ｂ）におけるプライマーの伸長より速く進行する。一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法は、第１の領域のシークエンシングデータを第３のシークエンシングデータと関連付けるステップを含む。

【0008】

一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法は、（ａ）プライマーをポリヌクレオチドの第１の領域とハイブリダイズしてハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通して伸長するステップであって、（ｉ）プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される、または（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される、ステップ；および（ｃ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｂ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップを含む。一部の実施形態では、第１の領域が、プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む。

【0009】

一部の実施形態では、プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される。一部の実施形態では、第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドの少なくとも一部分は、非標識ヌクレオチドである。一部の実施形態では、第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドである。

【0010】

一部の実施形態では、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される。

【0011】

カップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法の一部の実施形態では、第２の領域のフロー順序は、５つまたはそれより多くのヌクレオチドフローを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドフローの各々は、単一のヌクレオチド塩基を含む。一部の実施形態では、第２の領域のフロー順序は、２カ所より多くのフロー位置において、ランダムシークエンシング開始位置の５％またはそれより多くにおける可能なＳＮＰパーミュテーションの５０％またはそれより多くについてのシグナル変化を誘導する。一部の実施形態では、誘導されるシグナル変化は、シグナル強度の変化、または新しい実質的にゼロ（もしくは新しいゼロ）もしくは新しい実質的に非ゼロ（もしくは新しい非ゼロ）シグナルである。一部の実施形態では、誘導されるシグナル変化は、新しい実質的にゼロ（もしくは新しいゼロ）または新しい実質的に非ゼロ（もしくは新しい非ゼロ）シグナルである。一部の実施形態では、第２の領域のフロー順序は、１フロー当り０．６のまたはそれを超える塩基取り込みの効率を有する。

【0012】

一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法は、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して第２の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップを含む。一部の実施形態では、プライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長され、方法は、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列を使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第３の領域のフロー順序は、５つまたはそれより多くのヌクレオチドフローを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドフローの各々は、単一のヌクレオチド塩基を含む。一部の実施形態では、第３の領域のフロー順序は、２カ所より多くのフロー位置において、ランダムシークエンシング開始位置の５％またはそれより多くにおける可能なＳＮＰパーミュテーションの５０％またはそれより多くについてのシグナル変化を誘導する。一部の実施形態では、誘導されるシグナル変化は、シグナル強度の変化、または新しい実質的にゼロ（もしくは新しいゼロ）もしくは新しい実質的に非ゼロ（もしくは新しい非ゼロ）シグナルである。一部の実施形態では、誘導されるシグナル変化は、新しい実質的にゼロ（もしくは新しいゼロ）または新しい実質的に非ゼロ（もしくは新しい非ゼロ）シグナルである。一部の実施形態では、第３の領域のフロー順序は、１フロー当り０．６のまたはそれを超える塩基組込みの効率を有する。

【0013】

カップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法の一部の実施形態では、プライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長され、方法は、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、第３の領域について生成される同じまたは異なるシークエンシングデータである。一部の実施形態では、第２の領域または第３の領域についての予想参照データは、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む。一部の実施形態では、方法は、第２の領域のフロー順序、および第２の領域についての第２の参照配列を使用して、第２の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、第２の参照配列は、試験バリアントを含む。一部の実施形態では、プライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長され、方法は、第２の領域についての第２の参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列を使用して、第３の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、プライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長され、方法は、第２の領域についての第２の参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して、第３の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、第３の領域について生成される同じまたは異なるシークエンシングデータである。一部の実施形態では、第２の領域または第３の領域についての予想参照シークエンシングデータは、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む。

【0014】

一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法は、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して第２の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で伸長されるプライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長され、方法は、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列を使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で伸長されるプライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長され、方法は、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、ステップ（ｄ）で生成される同じまたは異なるシークエンシングデータである。一部の実施形態では、第２の領域または第３の領域についての予想参照データは、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む。一部の実施形態では、方法は、第２の領域のフロー順序、および第２の領域についての第２の参照配列を使用して、第２の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップを含み、第２の参照配列は、試験バリアントを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で伸長されるプライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長され、方法は、第２の領域についての第２の参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列を使用して、第３の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で伸長されるプライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長され、方法は、第２の領域についての第２の参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して、第３の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、ステップ（ｄ）で生成される同じまたは異なるシークエンシングデータである。一部の実施形態では、第２の領域または第３の領域についての予想参照シークエンシングデータは、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む。

【0015】

実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成するステップは、（ｅ）ステップ（ｄ）で伸張したプライマーを、第４の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第４の領域を通して伸長すること、ここで、（ｉ）プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、第４の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第４の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）第４の領域を通したプライマーの伸長は、ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）においてプライマーの伸長よりも速く進行する；および（ｆ）ポリヌクレオチドの第５の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用する（ｅ）において伸長されたプライマーのさらなる伸長、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在の検出により、生成することを含む。一部の実施形態では、方法は、第５の領域のシークエンシングデータを第１の領域のシークエンシングデータまたは第３の領域のシークエンシングデータと関連付けるステップをさらに含む。

【0016】

カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法であって、カップリングされたシークエンシングリードの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；およびマッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分、またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分を、第２の領域の長さを示す距離情報を使用して、参照配列にマッピングするステップを含む、方法も本明細書に記載される。

【0017】

さらに、構造バリアントを検出する方法であって、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分についての参照配列内の予想遺伝子座を、第２の領域の長さを示す距離情報を使用して決定するステップ；参照配列に基づいて予想遺伝子座における配列についての予想シークエンシングデータを決定するステップ；およびマッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分を予想シークエンシングデータと比較することにより構造バリアントを検出するステップであって、マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分と予想シークエンシングデータとの差は、構造バリアントを示す、ステップを含む方法が提供される。

【0018】

また、構造バリアントを検出する方法であって、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップを含み、マッピングされなかった第１の領域、またはマッピングされなかった第３の領域は、参照配列内にマッピング不可能である、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、第２の領域の長さを示す予想距離情報に基づいて参照配列内の構造バリアントの遺伝子座を決定するステップをさらに含む。

【0019】

一部の実施形態では、マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分、またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分は、参照配列と比較して挿入の中に存在する。一部の実施形態では、マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分、またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分は、参照配列と比較して挿入の始点または終点にまたがる。

【0020】

さらに、構造バリアントを検出する方法であって、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分および第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；マッピングされた第１の領域とマッピングされた第３の領域の間のマッピング距離情報を決定するステップ；およびマッピング距離情報を第２の領域の予想距離情報と比較することにより構造バリアントを検出するステップであって、マッピング距離情報と予想距離情報との差が構造バリアントを示す、ステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、構造バリアントは、染色体融合、逆位、挿入、または欠失である。一部の実施形態では、バリアントは、第２の領域内の挿入または欠失である。

【0021】

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、距離情報は、第２の領域のフロー順序に関連する情報および第２の領域における塩基の確率分布を使用して決定される。一部の実施形態では、第２の領域のフロー順序に関連する情報は、ステップ（ｃ）においてプライマーを伸長するために同時に使用されるヌクレオチド塩基の異なるタイプの数であるる。一部の実施形態では、第２の領域における塩基の確率分布は、ゲノム内の塩基の分布から決定される。

【0022】

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、距離情報は、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して決定された第２の領域についての予想シークエンシングデータから導出される。一部の実施形態では、予想シークエンシングデータは、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む。

【0023】

さらに、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法であって、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分および第３の領域もしくはその一部分を、参照配列の第１の位置および第２の位置を含む２つまたはそれより多くの異なる位置ペアにマッピングするステップ；および第２の領域の長さを示す第１の距離情報、および２つまたはそれより多くの位置ペアについての第１の位置と第２の位置の間の距離を示す第２の距離情報を使用して、正しい位置を選択するステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、距離情報は、第２の領域のフロー順序に関連する情報および第２の領域における塩基の確率分布を使用して決定される。一部の実施形態では、第２の領域のフロー順序に関連する情報は、ステップ（ｃ）においてプライマーを伸長するために同時に使用されるヌクレオチド塩基の異なるタイプの数である。一部の実施形態では、第２の領域における塩基の確率分布は、ゲノム内の塩基の分布から決定される。一部の実施形態では、距離情報は、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して決定された第２の領域についての予想シークエンシングデータから導出される。一部の実施形態では、予想参照シークエンシングデータは、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む。

【0024】

また、ステップ（ｄ）において伸長されたプライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長される、上記方法のいずれかに従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアントを検出する方法であって、第１の領域またはその一部分を参照配列にマッピングするステップ；（１）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列、または（２）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータを使用して、第３の領域またはその一部分についての予想シークエンシングデータを決定するステップであって、第３の領域の配列に関連する生成配列データが、ステップ（ｄ）において生成された同じまたは異なる配列データである、ステップ；および第３の領域についての予想シークエンシングデータを第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータと比較することによりバリアントの存在を検出するステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、バリアントは、構造バリアントである。一部の実施形態では、構造バリアントは、染色体融合、逆位、挿入、または欠失である。一部の実施形態では、バリアントは、一塩基多型（ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、試験バリアントを検出するために使用され、参照配列が試験バリアントを含む。一部の実施形態では、試験バリアントは、第２のポリヌクレオチド中の試験バリアントを同定することにより選択される。一部の実施形態では、方法は、検出された試験バリアントとポリヌクレオチドの第１の領域または第３の領域におけるシークエンシングされた対立遺伝子とを関連付けるステップをさらに含む。

【0025】

また、第３の領域を通して伸長されたプライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長される、上記の方法のいずれかに従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアントを検出する方法であって、第１の領域またはその一部分を参照配列にマッピングするステップ；（１）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列、または（２）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータを使用して、第３の領域またはその一部分についての予想シークエンシングデータを決定するステップであって、第３の領域の配列に関連する生成配列データが、第３の領域について生成された同じまたは異なる配列データである、ステップ；および第３の領域についての予想シークエンシングデータを第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータと比較することによりバリアントの存在を検出するステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、バリアントは、構造バリアントである。一部の実施形態では、構造バリアントは、染色体融合、逆位、挿入、または欠失である。一部の実施形態では、バリアントは、一塩基多型（ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、試験バリアントを検出するために使用され、参照配列が試験バリアントを含む。一部の実施形態では、試験バリアントは、第２のポリヌクレオチド中の試験バリアントを同定することにより選択される。一部の実施形態では、方法は、検出された試験バリアントとポリヌクレオチドの第１の領域または第３の領域におけるシークエンシングされた対立遺伝子とを関連付けるステップを含む。

【0026】

さらに、ポリヌクレオチドのシークエンシングされなかった領域における塩基トランスバージョンの存在を検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法であって、（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）において伸長されたプライマーを、第２の領域を通して、（１）シトシンおよびチミンと（２）アデニンおよびグアニンとの交互ヌクレオチドペアを含むフロー順序を使用してさらに伸長するステップ；および（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される。

【0027】

また、カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法であって、（ａ）プライマーをポリヌクレオチドの第１の領域とハイブリダイズしてハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）プライマーを、第２の領域を通して、（１）シトシンおよびチミンと（２）アデニンおよびグアニンとの交互ヌクレオチドペアを含むフロー順序を使用して伸長するステップ；および（ｃ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｂ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、第１の領域は、プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される。

【0028】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのシークエンシングされなかった領域における塩基トランスバージョンの存在を検出する方法は、ステップ（ｄ）で伸長されたプライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長される、上記の方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域またはその一部分および第３の領域またはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および参照配列を使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップ；および第３の領域についての予想シークエンシングデータと第３の領域についての生成シークエンシングデータとの差に基づいて塩基トランスバージョンの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、第３の領域についての予想シークエンシングデータは、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、第２の領域についての参照配列、および第３の領域についての参照配列を使用して決定される。一部の実施形態では、第３の領域についての予想シークエンシングデータは、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、第２の領域についての参照配列、および第３の領域の配列に関連する生成配列データを使用して決定され、第３の領域の配列に関連する生成配列データは、ステップ（ｄ）で生成された同じまたは異なる配列データである。一部の実施形態では、第３の領域についての予想シークエンシングデータは、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む。

【0029】

さらに、１つまたは複数のコンセンサス配列を生成する方法であって、複数のカップリングされたシークエンシングリードペアをアセンブルするステップを含む、方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、１つまたは複数のコンセンサス配列は、複数のカップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す距離情報を使用してアセンブルされる。一部の実施形態では、距離情報は、第２の領域のフロー順序に関連する情報および第２の領域における塩基の確率分布を使用して決定される。一部の実施形態では、第２の領域のフロー順序に関連する情報は、ステップ（ｃ）においてプライマーを伸長するために同時に使用されるヌクレオチド塩基の異なるタイプの数である。一部の実施形態では、第２の領域における塩基の確率分布は、ゲノム内の塩基の分布から決定される。一部の実施形態では、距離情報は、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して決定された第２の領域についての予想参照シークエンシングデータから導出される。一部の実施形態では、予想参照シークエンシングデータは、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む。

【0030】

一部の実施形態では、１つまたは複数のコンセンサス配列を生成する方法は、１つまたは複数のコンセンサス配列から選択されたコンセンサス配列の一部分を、選択されたコンセンサス配列の一部分に関連する、選択された、カップリングされたシークエンシングリードを使用して検証するステップをさらに含み、選択された、カップリングされたシークエンシングリードを生成する際にステップ（ｄ）で伸長されるプライマーは、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長され、検証するステップは、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および選択されたコンセンサス配列の一部分を使用して、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定すること；および選択された、カップリングされたシークエンシングリードの第３の領域についての予想シークエンシングデータを第３の領域の生成シークエンシングデータと比較することにより、選択されたコンセンサス配列の一部分を検証することを含む。

【0031】

また、試験バリアントのステータスを検証する方法であって、複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードペアに亘るバリアントのステータスを比較するステップであって、複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードペアは、試験バリアントの遺伝子座に対応する遺伝子座を含む、ステップ；比較に基づいてバリアントのステータスを検証するステップ含む方法が記載される。一部の実施形態では、選択された、カップリングされたシークエンシングリードペアの、第１の領域または第３の領域は、複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードのうちの他のカップリングされたシークエンシングリードの少なくとも一部分の第２の領域と重複する。一部の実施形態では、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、バリアントステータスは、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、第１の領域または第３の領域におけるバリアントを示す。一部の実施形態では、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、第２の領域は、複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードのうちの他のカップリングされたシークエンシングリードの少なくとも一部分の第２の領域と重複する。一部の実施形態では、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、バリアントステータスは、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、第２の領域におけるバリアントを示す。

【0032】

さらに、試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出するための方法であって、上記方法のいずれかに従ってのカップリングされたシークエンシングリードペアを生成するステップ；ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；およびポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在または非存在をコールするステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域についての予想シークエンシングデータと比較するステップは、ポリヌクレオチドの第３の領域について生成されたシークエンシングデータがポリヌクレオチドの第３の領域についての予想シークエンシングデータにマッチする尤度を示すマッチスコアを決定すること；および決定されたマッチスコアを使用してポリヌクレオチドの第２の領域における短い標的遺伝子バリアントの存在または非存在をコールすることを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第３の領域についての予想シークエンシングデータは、ポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでシークエンシングすることにより得られる、。一部の実施形態では、第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータ、または第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、複数のフロー位置の中の各フロー位置に取り込まれた塩基の数を示す塩基カウントを表すフローシグナルを含む。一部の実施形態では、フローシグナルは、各フロー位置における少なくとも１つの塩基カウントについての塩基カウント尤度を示す統計パラメーターを含む。一部の実施形態では、フローシグナルは、各フロー位置における複数の塩基カウントについての塩基カウント尤度を示す統計パラメーターを含む。一部の実施形態では、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、複数のフロー位置の中の各フロー位置に取り込まれた塩基の数を示す塩基カウントを表すフローシグナルを含み、フローシグナルは、複数の塩基カウントについての塩基カウント尤度を示す統計パラメーターを含み；方法は、シークエンシングデータ中の各フロー位置における統計パラメーターであって、そのフロー位置における予想配列の塩基カウントと一致する統計パラメーターを選択するステップ、およびシークエンシングデータセットが予想配列にマッチする尤度を示すマッチスコアを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、マッチスコアは、シークエンシングデータ内のフロー位置にわたっての選択された統計パラメーターの組み合わされた値である。

【0033】

上記方法の一部の実施形態では、フローサイクル順序は、同じ順序で反復される４つの別々のフローを含む。

【0034】

上記方法の一部の実施形態では、フローサイクル順序は、５つまたはそれより多くの別々のフローを含む。

【0035】

上記方法の一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成するステップは、プライマーを、第４の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第４の領域を通して伸長すること、ここで、（ｉ）プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、第４の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第４の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）第４の領域を通したプライマーの伸長は、第１の領域または第３の領域を通したプライマーの伸長よりも速く進行する；およびポリヌクレオチドの第５の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用する第４を通して伸長されたプライマーのさらなる伸長、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在の検出により、生成することを含む。一部の実施形態では、方法は、第５の領域のシークエンシングデータを第１の領域のシークエンシングデータまたは第３の領域のシークエンシングデータと関連付けるステップをさらに含む。

【0036】

上記方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ローリングサークル増幅を使用して増幅される。

【0037】

また、試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出する方法であって、（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用してポリヌクレオチドを増幅させて、ポリヌクレオチドの第１のコピーとポリヌクレオチドの第２のコピーとを少なくとも含むＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドを生成するステップ；（ｂ）ＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｃ）ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｄ）プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、（ｉ）プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通したプライマーの伸長は、第１の領域を通したプライマーの伸長よりも速く進行する、ステップ；（ｅ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｆ）ポリヌクレオチドの第３の領域について生成されたシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；（ｇ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップ；（ｈ）ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；および（ｉ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントのアイデンティティーをコールするステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通したプライマーの伸長は、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第１の領域を通したプライマーの伸長よりも速く進行する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップに基づいて動的に生成される。一部の実施形態では、プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドの少なくとも一部分は、非標識ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドである。一部の実施形態では、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される。一部の実施形態では、３つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される。

【0038】

さらに、試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出する方法であって、（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用してポリヌクレオチドを増幅させて、ポリヌクレオチドの第１のコピーとポリヌクレオチドの第２のコピーとを少なくとも含むＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドを生成するステップ；（ｂ）プライマーをポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第１の領域にハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｃ）プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長するステップであって、（ｉ）プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長される、ステップ；（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｅ）ポリヌクレオチドの第３の領域について生成されたシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；（ｆ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップ；（ｇ）ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；および（ｈ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントのアイデンティティーをコールするステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、第１の領域は、プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップに基づいて動的に生成される。一部の実施形態では、プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドである。一部の実施形態では、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される。一部の実施形態では、３つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される。

【0039】

また、シークエンシングクラスター内のシークエンシングプライマーを同期化する方法であって、（ａ）プライマーをシークエンシングクラスター内のポリヌクレオチドコピーとハイブリダイズするステップ；（ｂ）プライマーを、第１の領域のフローサイクルに従って標識ヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドコピーの第１の領域を通して伸長するステップ；（ｃ）プライマーを、１つまたは複数の再位相化フローを使用してポリヌクレオチドコピーの第２の領域を通して伸長するステップであって、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドの混合物は、１つまたは複数の再位相化フローの少なくとも１つにおいて使用される、ステップ；および（ｄ）プライマーを、第３の領域のフローサイクルに従って標識ヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドコピーの第３の領域を通して伸長するステップを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、３つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、１つまたは複数の再位相化フローのうちの少なくとも１つにおいて使用される。一部の実施形態では、１つまたは複数の再位相化フローは、４つまたはそれより多くのフローステップを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の再位相フローは、任意の順序で：（ｉ）Ａ、ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＴヌクレオチドを含まない混合物を含む第１のフロー；（ｉｉ）Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＡヌクレオチドを含まない混合物を含む第２のフロー；（ｉｉｉ）Ｔ、ＡおよびＧヌクレオチドを含むがＣヌクレオチドを含まない混合物を含む第３のフロー；および（ｉｖ）Ｔ、ＡおよびＣヌクレオチドを含むがＧヌクレオチドを含まない混合物を含む第４のフローを含む。一部の実施形態では、方法は、第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、プライマーを第１の領域を通して伸長しながら取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより生成するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、プライマーを第３の領域を通して伸長しながら取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより生成するステップを含む。

【0040】

また、１または複数台のプロセッサーと、非一過性記憶媒体であって、１つまたは複数のカップリングされたシークエンシングリードに関する情報を受信する、および上記方法のいずれかの１つまたは複数を遂行するための、１または複数台のプロセッサーにより実行可能な１つまたは複数のプログラムを含む非一過性記憶媒体とを含むシステムが本明細書に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１は、カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成するための例示的方法の概略図を示す。

【0042】

【図2】図２は、参照配列を使用して予想シークエンシングデータを生成するための例示的方法の概略図を示す。

【0043】

【図3】図３は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第３の領域が２つの異なる遺伝子座に位置する場合、カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す距離情報を使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法を示す。

【0044】

【図4】図４は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第３の領域が反復領域に位置する場合、カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す距離情報を使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法を示す。

【0045】

【図5】図５は、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して対象のゲノム内への挿入を検出する方法についての概略図を示す。

【0046】

【図6】図６は、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して構造バリアントを検出するための例示的方法を示す。

【0047】

【図7】図７は、対象のゲノムにおける構造バリアントを検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの使用についての概略図を示し、この場合の構造バリアントは挿入である。

【0048】

【図8】図８は、対象のゲノムにおける構造バリアントを検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの使用についての概略図を示し、この場合の構造バリアントは欠失である。

【0049】

【図9】図９は、対象のゲノムにおける構造バリアントを検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの使用についての概略図を示し、この場合の構造バリアントは逆位である。

【0050】

【図10】図１０は、対象のゲノムにおける構造バリアントを検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの使用についての概略図を示し、この場合の構造バリアントは染色体融合である。

【0051】

【図11】図１１は、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して構造バリアントを検出する例示的方法を示す。

【0052】

【図12】図１２は、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す距離情報を使用して構造バリアントを検出することができる方法の一例を実証する概略図を示す。

【0053】

【図13】図１３は、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアントを検出する例示的方法を示す。

【0054】

【図14A】図１４Ａは、Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇの反復フローサイクル順序を使用して５’－ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ－３’（配列番号１５）の配列でプライマーを伸長させることにより得られたシークエンシングデータを示す。このシークエンシングデータは、伸長されたプライマー鎖を代表しており、容易に決定され得る相補鋳型鎖のシークエンシング情報は、実効的に等価である。

【図14B】図１４Ｂは、各フロー位置における最高尤度に基づいて選択された、最も可能性が高い配列であって、シークエンシングデータが得られた配列（星印により示されている通り）を伴う、図１４Ａに示されているシークエンシングデータを示す。

【図14C】図１４Ｃは、２つの異なる候補配列（それらの相補配列により各々表される）：ＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号１６）（黒塗りの丸印）およびＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）（白抜きの丸印）を表すトレースを伴う、図１４Ａに示されているシークエンシングデータを示す。シークエンシングデータが所与の配列にマッチする尤度は、各フロー位置が候補配列にマッチする尤度の積として決定することができる。

【0055】

【図15-1】図１５Ａは、２つの候補配列Ｈ１（配列番号１９）およびＨ２（配列番号２０）（それらの相補配列により各々表されている）とアラインされた、シークエンシングリードＲ１（配列番号１５）、Ｒ２（配列番号１７）およびＲ３（配列番号１８）（伸長されたプライマーの配列により各々表されている）のアラインメントを示す。図１５Ｂは、Ｈ１（黒塗りの丸印）およびＨ２（白抜きの丸印）を表すトレースを伴う、Ｒ１に対応するシークエンシングデータを示す。図１５Ｃは、Ｈ１（黒塗りの丸印）およびＨ２（白抜きの丸印）を表すトレースを伴う、Ｒ２に対応するシークエンシングデータを示す。図１５Ｄは、Ｈ１（黒塗りの丸印）およびＨ２（白抜きの丸印）を表すトレースを伴う、Ｒ３に対応するシークエンシングデータを示す。

【図15-2】図１５Ａは、２つの候補配列Ｈ１（配列番号１９）およびＨ２（配列番号２０）（それらの相補配列により各々表されている）とアラインされた、シークエンシングリードＲ１（配列番号１５）、Ｒ２（配列番号１７）およびＲ３（配列番号１８）（伸長されたプライマーの配列により各々表されている）のアラインメントを示す。図１５Ｂは、Ｈ１（黒塗りの丸印）およびＨ２（白抜きの丸印）を表すトレースを伴う、Ｒ１に対応するシークエンシングデータを示す。図１５Ｃは、Ｈ１（黒塗りの丸印）およびＨ２（白抜きの丸印）を表すトレースを伴う、Ｒ２に対応するシークエンシングデータを示す。図１５Ｄは、Ｈ１（黒塗りの丸印）およびＨ２（白抜きの丸印）を表すトレースを伴う、Ｒ３に対応するシークエンシングデータを示す。

【0056】

【図16】図１６は、Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃフローサイクル順序を使用してシークエンシングされた仮想核酸分子からのシークエンシングデータを示す。可能性のあるハプロタイプ配列（それらの相補配列により各々表される）ＴＡＴＧＧＴＣＧ－ＴＣＧＡ（配列番号２１）（Ｈ１）およびＴＡＴＧＧＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号２２）（Ｈ２）を使用して、トレースを生成することができ、Ｈ１は、Ｈ２と比較して１塩基欠失を有する。シークエンシングデータは、Ｈ２候補配列とのより良いマッチを有し、インデルは、この配列ではコールされない。

【0057】

【図17】図１７は、試験バリアントのステータスを決定するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの比較についての例示的概略図を示す。

【0058】

【図18】図１８は、本明細書に記載の方法を実行するために使用することができる、一実施形態によるコンピュータデバイスの例を示す。

【0059】

【図19A】図１９Ａは、ポリヌクレオチドを通したシークエンシングプライマーの伸長時に第１および第３の領域において各々のフローシークエンシングサイクル後に取り込まれた塩基から生じるシグナルを示す。第２の領域内のデータは、この領域を通してプライマー伸長が加速され、塩基組込みが検出されないため、収集されなかった。

【0060】

【図19B】図１９Ｂは、ポリヌクレオチドを通したシークエンシングプライマーの伸長時に第１および第３の領域において各々のフローシークエンシングサイクル後に取り込まれた塩基から生じるシグナルを示す。第２の領域を通してデータは収集されたが、図のサイズを縮小するために示されていない。

【0061】

【図20-1】図２０Ａ～２０Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２０Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フロー順序は、ヌクレオチドフロー１０１（図２０Ｂ）、フロー１０２（図２０Ｃ）、フロー１０３（図２０Ｄ）およびフロー１０４（図２０Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【図20-2】図２０Ａ～２０Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２０Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フロー順序は、ヌクレオチドフロー１０１（図２０Ｂ）、フロー１０２（図２０Ｃ）、フロー１０３（図２０Ｄ）およびフロー１０４（図２０Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【図20-3】図２０Ａ～２０Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２０Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フロー順序は、ヌクレオチドフロー１０１（図２０Ｂ）、フロー１０２（図２０Ｃ）、フロー１０３（図２０Ｄ）およびフロー１０４（図２０Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【0062】

【図21-1】図２１Ａ～２１Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２１Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、別の例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フロー順序は、ヌクレオチドフロー１０１（図２１Ｂ）、フロー１０２（図２１Ｃ）、フロー１０３（図２１Ｄ）およびフロー１０４（図２１Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【図21-2】図２１Ａ～２１Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２１Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、別の例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フロー順序は、ヌクレオチドフロー１０１（図２１Ｂ）、フロー１０２（図２１Ｃ）、フロー１０３（図２１Ｄ）およびフロー１０４（図２１Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【図21-3】図２１Ａ～２１Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２１Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、別の例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フロー順序は、ヌクレオチドフロー１０１（図２１Ｂ）、フロー１０２（図２１Ｃ）、フロー１０３（図２１Ｄ）およびフロー１０４（図２１Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【0063】

【図22-1】図２２Ａ～２２Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２２Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、別の例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フローサイクルは、ヌクレオチドフロー１０１（図２２Ｂ）、フロー１０２（図２２Ｃ）、フロー１０３（図２２Ｄ）およびフロー１０４（図２２Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【図22-2】図２２Ａ～２２Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２２Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、別の例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フローサイクルは、ヌクレオチドフロー１０１（図２２Ｂ）、フロー１０２（図２２Ｃ）、フロー１０３（図２２Ｄ）およびフロー１０４（図２２Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【図22-3】図２２Ａ～２２Ｅは、１００ヌクレオチドフロー（図２２Ａ）およびシークエンシングクラスター内のプライマーを同期化するように設計された再位相化フロー後の、別の例示的な模擬シークエンシングプロトコルで同一のポリヌクレオチド鋳型に対して伸長されたプライマーの数を示す。示されている再位相化フローサイクルは、ヌクレオチドフロー１０１（図２２Ｂ）、フロー１０２（図２２Ｃ）、フロー１０３（図２２Ｄ）およびフロー１０４（図２２Ｅ）を含む、４ステップ順序である。

【0064】

【図23】図２３は、４つの例示的フローサイクル順序（これらのうちの、延長フローサイクル順序である、３つを含む）について、ランダムシークエンシング開始位置が得られるＳＮＰパーミュテーションの検出の感度を示す。図２３中、ｘ軸は、フロー相（または断片化開始位置）の分率を示し、ｙ軸は、２カ所より多くのフロー位置においてシグナル変化（すなわち、新しいゼロまたは新しい非ゼロシグナル）を誘導したＳＮＰパーミュテーションの分率を示す。

【0065】

【図24】図２４は、各フローが、単一のヌクレオチド塩基を各々が有する、反復４ステップフローサイクルを使用して合成ポリヌクレオチドの第２の領域がシークエンシングされる、模擬高速フォワードシークエンシングプロトコルを使用して検出された様々なＳＮＰについての塩基検出感度を示す行列を示す。

【0066】

【図25-1】図２５Ａは、各フローが３つの異なるヌクレオチド塩基の混合物を含む、反復４ステップフローサイクルを使用する模擬高速フォワードシークエンシングプロトコルについての、第１、第２および第３の領域におけるフローにわたっての平均塩基組込みを示す。参照塩基検出感度に対するバリアント塩基の行列が、図２５Ｂに示されている。図２５Ｃは、合成リードにわたっての塩基カバレッジの分布を示す。

【図25-2】図２５Ａは、各フローが３つの異なるヌクレオチド塩基の混合物を含む、反復４ステップフローサイクルを使用する模擬高速フォワードシークエンシングプロトコルについての、第１、第２および第３の領域におけるフローにわたっての平均塩基組込みを示す。参照塩基検出感度に対するバリアント塩基の行列が、図２５Ｂに示されている。図２５Ｃは、合成リードにわたっての塩基カバレッジの分布を示す。

【図25-3】図２５Ａは、各フローが３つの異なるヌクレオチド塩基の混合物を含む、反復４ステップフローサイクルを使用する模擬高速フォワードシークエンシングプロトコルについての、第１、第２および第３の領域におけるフローにわたっての平均塩基組込みを示す。参照塩基検出感度に対するバリアント塩基の行列が、図２５Ｂに示されている。図２５Ｃは、合成リードにわたっての塩基カバレッジの分布を示す。

【0067】

【図26A】図２６Ａは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローが、２４フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0068】

【図26B】図２６Ｂは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローが、４８フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0069】

【図26C】図２６Ｃは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローが、９６フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0070】

【図26D】図２６Ｄは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローが、１９２フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0071】

【図26E】図２６Ｅは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を含有する再位相化フローが、４８フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0072】

【図26F】図２６Ｆは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を含有する再位相化フローが、９６フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0073】

【図26G】図２６Ｇは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を含有する第１の再位相化フローおよびＡ、ＣおよびＧの混合物を含有する第２の再位相化フローが、９６フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0074】

【図26H】図２６Ｈは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を含有する第１の再位相化フローおよびＡ、ＣおよびＧの混合物を含有する第２の再位相化フローが、１９２フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0075】

【図26I】図２６Ｉは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を含有する第１の再位相化フロー、Ａ、ＣおよびＴの混合物を含有する第２の再位相化フロー、Ａ、ＧおよびＴの混合物を含有する第３の再位相化フロー、ならびにＡ、ＣおよびＧの混合物を含有する第４の再位相化フローが、９６フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【0076】

【図26J】図２６Ｊは、対照プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル）または再位相化プロトコル（１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル、この場合、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を含有する第１の再位相化フロー、Ａ、ＣおよびＴの混合物を含有する第２の再位相化フロー、Ａ、ＧおよびＴの混合物を含有する第３の再位相化フロー、ならびにＡ、ＣおよびＧの混合物を含有する第４の再位相化フローが、１９２フローを終えるたびに使用された）について１０，０００模擬フローグラムにわたって累積した全位相誤差（遅れ位相誤差＋進み位相誤差）の和の分布を示す。平均および標準偏差が凡例に示されている。対照および再位相化プロトコルについての分布の積分も示されている。

【発明を実施するための形態】

【0077】

カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法、およびそのようなカップリングされたシークエンシングリードペアを解析する方法が、本明細書に記載される。カップリングされたシークエンシングリードペアを解析して、例えば、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングすること、構造バリアントを検出すること、ポリヌクレオチドのカップリングされたペアエンド間の領域におけるバリアント（例えば、ＳＮＰ）を検出すること、トランスバージョンを検出すること、またはコンセンサス配列を決定もしくは検証することができる。

【0078】

ポリヌクレオチドをシークエンシングプライマーとハイブリダイズすることができ、このプライマーが、ポリヌクレオチドの第１の領域（すなわち、３’末端）を通して伸長されて、第１の領域がシークエンシングされる。次いで、プライマーは、ポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長され、この伸長は、第１の領域によるプライマーの伸長よりも速い速度で起こり得る。第２の領域を通した加速プライマー伸長は、「高速フォワードシークエンシング」と呼ばれることがある。本明細書中でさらに論じられるように、プライマーは、第２の領域を通して伸長される（より旧来のペアエンドシークエンシングで起こるもののように、プライマーが第２の領域を完全にスキップするのではなく）ため、たとえ第２の領域が第１の領域と同様にシークエンシングされなかったとしても、何らかの情報（一部のシークエンシングデータを含む可能性がある）を第２の領域について得ることができる。例えば、プライマーを、非標識ヌクレオチドのみを使用してプライマーを第２の領域を通して伸長することができる。シークエンシングプライマーが第２の領域を通して伸長されると、プライマーは、ポリヌクレオチドの第３の領域（すなわち、５’末端）へと伸長されて、第３の領域がシークエンシングされる。領域および第３の領域のシークエンシングデータをカップリングし、その結果、ポリヌクレオチドのカップリングされたシークエンシングリードペアを得ることができ、本明細書中でさらに説明されるように、追加のシークエンシングデータを第２の領域から導出することができる。

【0079】

一例において、カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドは、（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で伸長されたプライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、第２の領域を通したプライマーの伸長が、ステップ（ｂ）におけるプライマーの伸長よりも速く進行する、ステップ；および（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップによって生成され得る。第１の領域のシークエンシングデータを第３の領域のシークエンシングデータと関連付けることができ、これが、カップリングされたシークエンシングリードペアを示す。第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されたヌクレオチドは、非標識であり得る。

【0080】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドからのカップリングされたシークエンシングリードペアを、（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で伸長されたプライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して、第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される、ステップ；および（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長された前記プライマーをさらに伸長することおよび取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより生成するステップにより、生成することができる。第１の領域のシークエンシングデータを第３の領域のシークエンシングデータと関連付けることができ、これが、カップリングされたシークエンシングリードペアを示す。第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されたヌクレオチドは、非標識であり得る。

【0081】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドからのカップリングされたシークエンシングリードペアを、（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で伸長されたプライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されたヌクレオチドを使用して、第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、フロー順序の少なくとも１ステップで使用される、ステップ；および（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長された前記プライマーをさらに伸長することおよび取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより生成するステップにより、生成することができる。第１の領域のシークエンシングデータを第３の領域のシークエンシングデータと関連付けることができ、これが、カップリングされたシークエンシングリードペアを示す。第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されたヌクレオチドは、非標識であり得る。

【0082】

一部の実施形態では、プライマーは、シークエンシングクラスター内の複数のシークエンシング反応を再位相化する（すなわち、同期化する）ために第２の領域を通して伸長される。伸長プライマーにヌクレオチドを組み込む化学的プロセスは、不完全であることが多く、そのためシークエンシングクラスター内の鎖間の非同期化が生じる。非同期化の結果として、リード長が増加するにつれて伸長プライマーへのヌクレオチド組込みの存在または非存在を検出する際に、シグナルの劣化、したがって、精度の低下が生じ得る。再同期化は、シグナル損失の相殺をもたらすことができ、それによって、より長い有効リード長が可能になる。シークエンシング反応を再位相化するために、少なくとも２つ（例えば、２つまたは３つ）の異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の複数のステップで使用される、再位相化サイクルを使用して、プライマーが第二の領域を通して伸長される。再位相化サイクル中に組み込まれるヌクレオチドを一部の実施形態では検出することができず、その結果、得られるリードにギャップが生じることになる。しかし、配列が参照または他の配列にアラインメントされる場合、このリードギャップを管理することができる。

【0083】

たとえ第２の領域を直接または完全にシークエンシングすることができなかったとしても、参照配列を使用して第２の領域についてのシークエンシングデータを抽出することができる。例えば、シークエンシングデータを、ポリヌクレオチドの第１の領域および／または第３の領域から、伸長プライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより得ることができる。しかし、非標識ヌクレオチドを使用して、または取り込まれたヌクレオチドの存在もしくは非存在を検出せずに、プライマーを第２の領域を通して伸長することができる。非標識ヌクレオチドを使用することにより（または取り込まれた標識を検出するための時間をシークエンシングシステムに与えないことにより）、第２の領域を通したより迅速なプライマー伸長が可能になるが、シークエンシングデータの直接決定は可能にならない。しかし、プライマーは、所定のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通して伸長されるため、第２の領域におけるバリアントは、第３の領域内で決定されるシークエンシングデータに影響を与え得る。参照配列を使用して予想シークエンシングデータ（例えば、予想フローグラム）を決定することができ、このデータが生成シークエンシングデータ（例えば、検出フローグラム）と比較されて、第２の領域内のバリアントを含む、バリアントが検出される。予想シークエンシング情報（例えば、予想フローグラム）と生成シークエンシングデータ（例えば、生成フローグラム）の比較を第３の領域において（第２の領域におけるバリアントを検出するために）行なうことができる。この方法論は、旧来のペアエンドシークエンシング法に勝る有意な利点を提供し、この利点のため、ポリヌクレオチドの３’末端または５’末端についてのシークエンシングデータは、ポリヌクレオチドの３’末端と５’末端の間のポリヌクレオチドにおけるバリアントによる影響を受けない。
定義

【0084】

本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明白な指示がない限り、複数形の言及対象を含む。

【0085】

本明細書での「約」ある値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に関する変動を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

【0086】

「予想シークエンシングデータ」は、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成するために使用されるポリヌクレオチドの配列、または前記ポリヌクレオチドの領域の配列が、参照配列にマッチするかどうかを予想する、シークエンシングデータを指す。

【0087】

「フロー順序」は、非終結ヌクレオチドを使用して核酸分子をシークエンシングするために使用される別々のヌクレオチドフローの順序を指す。フロー順序を反復単位のサイクルに分けることができ、反復単位のフロー順序は、「フローサイクル順序」と呼ばれる。「フロー位置」は、シークエンシングプロセス中の所与の別々のヌクレオチドフローの逐次的位置を指す。

【0088】

用語「個体」、「患者」および「対象」は、同義語として使用され、ヒトを含む動物を指す。

【0089】

用語「標識」は、本明細書で使用される場合、別の部分、例えばヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、とカップリングされる、またはカップリングされ得る、検出可能な部分を指す。標識は、標識に送達されたシグナルを放出することまたはシグナルを変更することができ、したがって、標識の存在または非存在を検出することができる。一部のケースでは、カップリングは、リンカーを介してのカップリングであり得、リンカーは、切断可能、例えば、光切断可能（例えば、紫外線下で切断可能）、化学的に切断可能（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの、還元剤によって）、または酵素的に切断可能（例えば、エステラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼもしくはプロテアーゼによって）であり得る。一部の実施形態では、標識は、フルオロフォアである。

【0090】

「非終結ヌクレオチド」は、ポリメラーゼまたはトランスクリプターゼを使用してポリヌクレオチドの３’末端に結合させることができる、およびポリメラーゼまたはトランスクリプターゼを使用してそれに結合された別の非終結核酸を有することができ、そのヌクレオチドから保護基または可逆的ターミネーターを除去する必要がない、核酸部分である。天然に存在する核酸は、非終結核酸の一種である。非終結核酸は、標識されていることがあり、または未標識であることもある。

【0091】

「短い遺伝子バリアント」は、長さが連続する１０塩基またはそれ未満（すなわち、長さが１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１塩基）である遺伝的多型（すなわち、突然変異）を指す。この用語は、長さが連続する１０塩基またはそれ未満である、一塩基多型（ＳＮＰ）、多塩基多型（ＭＮＰ）およびインデルを含む。

【0092】

本明細書に記載される本発明の態様および変形形態が、態様および変形形態「からなること」および／または「から本質的になること」を含むことは理解されよう。

【0093】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間に介在する各々の値、およびその述べられている範囲内の、任意の他の述べられているまたは介在する値が、本開示の範囲内に包含されることは、理解されるはずである。述べられている範囲が上限値または下限値を含む場合、これらの含まれる限界値のどちらかを含まない範囲もまた、本開示に含まれる。

【0094】

本明細書に記載される解析方法の一部は、配列を参照配列にマッピングすること、配列情報を判定すること、および／または配列情報を解析することを含む。相補配列を容易に決定および／または解析することができること、ならびに本明細書で提供される説明が、相補配列に関して遂行される解析方法を包含することは、当技術分野では十分に理解されよう。

【0095】

本明細書で使用される節の見出しは、単に構成のためのものであり、記載される主題を限定するものと解釈すべきでない。この説明は、当業者による本発明の実施および使用を可能にするために提供され、特許出願およびその要件に関連して提供される。記載される実施形態の様々な修飾形態が当業者には容易に分かることになり、本明細書における一般原理を他の実施形態に応用することができる。したがって、本発明は、示される実施形態に限定されるように意図されたものではなく、本発明には、本明細書に記載される原理および特徴に対応する最も広い範囲が与えられる。

【0096】

図は、様々な実施形態によるプロセスを例証する。これらの例示的プロセスでは、一部のブロックは、必要に応じて組み合わせられ、一部のブロックの順序は、必要に応じて変更され、一部のブロックは、必要に応じて割愛される。一部の例では、追加のステップが例示的プロセスと組み合わせて遂行され得る。したがって、例証される（および下記でより詳細に説明される）ような操作は、本質的に例示的なものであり、したがって、限定と見なすべきではない。

【0097】

本明細書で言及されるすべての公表文献、特許および特許出願の開示は、これにより各々その全体が参照により本明細書に取り込まれる。参照により取り込まれるいずれかの参考文献が本開示と矛盾する場合には、本開示が優先されるものとする。
フローシークエンシング法

【0098】

任意の所与のフロー位置において単一のタイプのヌクレオチドが伸長プライマーに到達できる所定のフローサイクルに従って鋳型ポリヌクレオチド分子に結合されたプライマーを伸長するステップを含む、フローシークエンシング法を使用して、シークエンシングデータを生成することができる。一部の実施形態では、特定のタイプのヌクレオチドの少なくとも一部は、標識を含み、標識されたヌクレオチドが伸長プライマーに取り込まれると、この標識が検出可能なシグナルをもたらす。そのようなヌクレオチドが伸長されたプライマーに取り込まれることにより得られる配列は、鋳型ポリヌクレオチド分子の配列の逆相補配列であるはずである。一部の実施形態では、例えば、シークエンシングデータは、標識されたヌクレオチドを使用してプライマーを伸長するステップ、および伸長プライマーに取り込まれた標識されたヌクレオチドの存在または非存在を検出するステップを含むフローシークエンシング法を使用して生成される。フローシークエンシング法は、「自然な合成によるシークエンシング」または「非終結型の合成によるシークエンシング」方法と呼ばれることもある。例示的な方法は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第８，７７２，４７３号に記載されている。以下の説明は、フローシークエンシング法に関して提供されるが、シークエンシングされる領域のすべてまたは一部分をシークエンシングするために他のシークエンシング法が使用され得ることは、理解されよう。

【0099】

フローシークエンシングは、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーを伸長するためのヌクレオチドの使用を含む。所与の塩基タイプのヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕなど）をハイブリダイズされた鋳型と混合して、相補的塩基が鋳型鎖内に存在する場合には、プライマーを伸長することができる。ヌクレオチドは、例えば、非終結ヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドであるとき、１つより多くの連続する相補的塩基が鋳型鎖内に存在する場合には、１つより多くの連続する塩基を伸長プライマー鎖に取り込むことができる。非終結ヌクレオチドは、３’可逆的ターミネーターを有するヌクレオチドと対照をなし、一般に、連続ヌクレオチドが結合される前にブロッキング基は除去される。相補的塩基が鋳型鎖内に存在しない場合、鋳型鎖内の次の塩基と相補的であるヌクレオチドが導入されるまで、プライマー伸長は停止する。ヌクレオチドの少なくとも一部分に標識することができ、その結果、取り込みを検出することができる。最も一般的には、単一のヌクレオチドタイプのみが一度に導入される（すなわち、個々に付加される）が、ある特定の実施形態では、２つまたは３つの異なるタイプのヌクレオチドが同時に導入されることもある。この方法論は、あらゆる単一塩基の伸長後、ターミネーターが反転されて次に続く塩基の取り込みが可能になるまで、プライマー伸長が停止される、可逆的ターミネーターを使用するシークエンシング法と対比され得る。

【0100】

プライマー伸長の過程でヌクレオチドを決定された順序で導入することができ、この過程をフローサイクルにさらに分けることができる。ヌクレオチドが段階的に付加され、これにより、付加されたヌクレオチドを鋳型鎖内に存在する相補的塩基のシークエンシングプライマーの末端に組み込むことが可能になる。サイクルは、ヌクレオチドの同じ順序および異なる塩基タイプの数、またはヌクレオチドの異なる順序、および／または異なる数の異なる塩基タイプを有し得る。しかし、所与のフローステップに対応する塩基のセット（すなわち、単一フローステップで同時に使用される１つまたは複数の異なる塩基）は、この用語が本明細書で使用される場合、同じサイクルで反復されず、異なるサイクルを区別するためのマーカーとなることができる。単に例として、第１のサイクルの順序は、Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃであり得、第２のサイクルの順序は、Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇであり得る。さらに、１つまたは複数のサイクルが、１つまたは複数のヌクレオチドを含まないこともある。単に例として、第１のサイクルの順序は、Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃであり得、第２のサイクルの順序は、Ａ－Ｔ－Ｃであり得る。代替順序を当業者は容易に企図することができる。異なるヌクレオチドの導入と導入の間に、例えば洗浄液でシークエンシングプラットフォームを洗浄することにより、取り込まれていないヌクレオチドを除去することができる。

【0101】

ポリメラーゼを使用して、１つまたは複数のヌクレオチドをプライマーの末端に鋳型依存的に取り込むことによりシークエンシングプライマーを伸長させることができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼであることもあり、または合成（例えば、突然変異型）ポリメラーゼであることもある。ポリメラーゼをプライマー伸長の最初のステップで付加させることができるが、補足ポリメラーゼを、必要に応じて、シークエンシング中に、例えば、ヌクレオチドの段階的付加を用いて、またはいくつかのフローサイクル後に、付加させることができる。例示的なポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ３．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ Φ２９（ファイ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、およびＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼが、挙げられる。

【0102】

導入されるヌクレオチドは、鋳型鎖の配列を決定する場合、標識ヌクレオチドを含むことができ、取り込まれた標識核酸の存在または非存在を検出して配列を決定することができる。標識は、例えば、光学活性標識（例えば、蛍光標識）または放射性標識であることがあり、標識により放出または変更されたシグナルを、検出器を使用して検出することができる。鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することができ、このことによって配列の決定が（例えば、フローグラムを生成することにより）可能になる。一部の実施形態では、標識ヌクレオチドは、蛍光部分、発光部分、または他の光出射部分で標識される。一部の実施形態では、標識は、リンカーを介してヌクレオチドに結合される。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、光化学的または化学的切断反応によって、切断可能である。例えば、標識を、検出後かつ連続ヌクレオチドの取り込み前に切断することができる。一部の実施形態では、標識（またはリンカー）は、ヌクレオチド塩基に結合されるか、または新生ＤＮＡ鎖の延長に干渉しないヌクレオチド上の別の部位に結合される。一部の実施形態では、リンカーは、ジスルフィドまたはＰＥＧ含有部分を含む。

【0103】

一部の実施形態では、導入されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドのみを含み、一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドの混合物を含む。例えば、一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約９０％もしくはそれ未満、約８０％もしくはそれ未満、約７０％もしくはそれ未満、約６０％もしくはそれ未満、約５０％もしくはそれ未満、約４０％もしくはそれ未満、約３０％もしくはそれ未満、約２０％もしくはそれ未満、約１０％もしくはそれ未満、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２．５％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０２５％もしくはそれ未満、または約０．０１％もしくはそれ未満である。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約１００％であり、約９５％であるかもしくはそれより多く、約９０％であるかもしくはそれより多く、約８０％であるかもしくはそれより多く、約７０％であるかもしくはそれより多く、約６０％であるかもしくはそれより多く、約５０％であるかもしくはそれより多く、約４０％であるかもしくはそれより多く、約３０％であるかもしくはそれより多く、約２０％であるかもしくはそれより多く、約１０％であるかもしくはそれより多く、約５％であるかもしくはそれより多く、約４％であるかもしくはそれより多く、約３％であるかもしくはそれより多く、約２．５％であるかもしくはそれより多く、約２％であるかもしくはそれより多く、約１．５％であるかもしくはそれより多く、約１％であるかもしくはそれより多く、約０．５％であるかもしくはそれより多く、約０．２５％であるかもしくはそれより多く、約０．１％であるかもしくはそれより多く、約０．０５％であるかもしくはそれより多く、約０．０２５％であるかもしくはそれより多く、または約０．０１％であるかまたはそれより多い。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約０．０１％～約１００％、例えば、約０．０１％～約０．０２５％、約０．０２５％～約０．０５％、約０．０５％～約０．１％、約０．１％～約０．２５％、約０．２５％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約１．５％、約１．５％～約２％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約３％～約４％、約４％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、約９０％～１００％未満、または約９０％～約１００％である。

【0104】

フローグラムなどのシークエンシングデータを、取り込まれたヌクレオチドの検出およびヌクレオチド導入の順序に基づいて生成することができる。以下の鋳型配列：ＣＴＧおよびＣＡＧ、ならびにＴ－Ａ－Ｃ－Ｇの反復フローサイクル（つまり、相補的塩基が鋳型ポリヌクレオチドに存在する場合にのみプライマーに組み込まれることになる、Ｔ、Ａ、ＣおよびＧヌクレオチドの逐次的付加）を例にとる。結果として生じるフローグラムが表１に示され、この表中の１は、導入されたヌクレオチドが組み込まれること示し、０は、導入されたヌクレオチドが組み込まれないことを示す。フローグラムを使用して、鋳型鎖の配列を決定することができる。

【表1】

【0105】

フローグラムは、バイナリであることもあり、ノンバイナリであることもある。バイナリフローグラムは、取り込まれたヌクレオチドの存在（１）または非存在（０）を検出する。ノンバイナリフローグラムは、各々の段階的導入から取り込まれたヌクレオチドの数をより定量的に決定することができる。例えば、ＣＣＧの配列は、２つのＧ塩基を組み込むことになり、標識塩基により放出されるいずれのシグナルも、単一塩基組込みの場合よりも高い強度を有することになる。このことが表１に示されている。ノンバイナリフローグラムはまた、塩基の存在または非存在を示すが、所与のステップで組み込まれる塩基の数を含む追加情報を提供することができる。

【0106】

シークエンシングデータを生成する前に、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイズされた鋳型を生成するためにシークエンシングプライマーとハイブリダイズされる。ポリヌクレオチドをシークエンシングライブラリー調製中にアダプターにライゲーションすることができる。アダプターは、シークエンシングプライマーとハイブリダイズするハイブリダイゼーション配列を含むことができる。例えば、アダプターのハイブリダイゼーション配列は、複数の異なるポリヌクレオチドにわたって一様な配列であることがあり、シークエンシングプライマーは、一様なシークエンシングプライマーであることがある。これは、シークエンシングライブラリー内の異なるポリヌクレオチドの多重シークエンシングを可能にする。

【0107】

ポリヌクレオチドをシークエンシングのために表面（例えば、固体支持体）に結合させることができる。ポリヌクレオチドを（例えば、ブリッジ増幅または他の増幅技法により）増幅させて、ポリヌクレオチドシークエンシングコロニーを生成することができる。クラスター内の増幅されたポリヌクレオチドは、実質的に同一または相補的である（増幅プロセス中に多少のエラーが導入されることがあり、その結果、ポリヌクレオチドの一部分は、元のポリヌクレオチドと必ずしも同一でないことがある）。コロニー形成により、検出器が標識ヌクレオチド取り込みをコロニーごとに正確に検出することができるようなシグナル増幅が可能になる。一部のケースでは、コロニーは、エマルジョンＰＣＲを使用してビーズ上に形成され、ビーズがシークエンシング面全体に分配される。シークエンシングのためのシステムおよび方法の例は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許出願第１０，３４４，３２８号において見つけることができる。

【0108】

ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーは、ポリヌクレオチドの第１の領域、第２の領域、および第３の領域を通して伸長される。第１の領域および／または第３の領域内の配列に関連するシークエンシングデータを、上記で論じられたように生成することができる。しかし、プライマーは、加速された「高速フォワード」プロセスを使用する第２の領域（これは、第１の領域と第３の領域の間にある）を通して伸長される。つまり、ポリヌクレオチドの第１の領域と第３の領域の間の第２の領域を通したプライマーの伸長は、第１の領域および／または第３の領域を通したプライマーの伸長よりも速く進行し得る。例えば、第２の領域を通したプライマーの伸長は、伸長プライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出せずに、伸長プライマーを伸張させることによって進行し得る。フローシークエンシング中に、上記で論じられたように、標識ヌクレオチドが伸長プライマーに組み込まれ、ハイブリダイズされた鋳型が洗浄され、検出器が使用されてヌクレオチドの標識からのシグナルが検出され、このシグナルが、伸長されたプライマーにヌクレオチドが取り込まれたかどうかを示す。しかし、この検出プロセスは時間がかかるため、この検出プロセスをスキップすることにより第２の領域を通したプライマーの伸長は加速され得る。一部の実施形態では、プライマーは、非標識ヌクレオチドを使用して（または非標識ヌクレオチドのみを使用して）第２の領域を通して伸長され、このことによりプライマー伸長速度はさらに加速され得る。

【0109】

代替的に、または加えて、第２の領域を通したプライマーの伸長は、第２の領域を通したプライマーの伸長中に使用されるフロー順序の少なくとも１ステップで少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドの混合物を使用することにより加速され得る。例えば、ＧおよびＣなどの２つの異なる塩基を同じステップで、同時に使用してもよく、このステップは、相補的ＣまたはＧ塩基が存在する場合にプライマーを伸長する。これは、たとえこれらの塩基が異なる塩基タイプであったとしてもプライマーへの連続塩基組込みにより、プライマーの伸長を加速させる。一部の実施形態では、フロー順序の少なくとも１ステップは、２つの異なる塩基を含む。一部の実施形態では、フロー順序の少なくとも１ステップは、３つの異なる塩基を含む。例として、表２に示されている配列番号１ならびに対応するフロー順序およびフローグラムを考える。配列番号１を含有するポリヌクレオチドとハイブリダイズされたシークエンシングプライマーを伸長するためのフロー順序プロセスは、５サイクルを含み、サイクル１、４および５は、互いに同じであり、サイクル２および３は、互いに同じである（サイクル１、４および５は、サイクル２および３とは異なる）。この例では、各サイクルは、４ステップを有し、サイクル１、４および５は、単一塩基タイプが各サイクルステップで付加される、Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇヌクレオチドの逐次的な独立した付加を含む。サイクル２および３は、４つのサイクルステップを含み、ステップ１は、Ａヌクレオチドを含まず（すなわち、Ｃ、ＴおよびＧを含み）、ステップ２は、Ｃヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＴおよびＧを含み）、ステップ３は、Ｔヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＣおよびＧを含み）、ステップ４は、Ｇヌクレオチドを含まない（すなわち、Ａ、ＣおよびＴを含む）。サイクル２および３は、プライマー伸長中に同時に複数の異なるヌクレオチド塩基タイプを含むため、プライマーは、いずれかの所与のステップで単一の塩基タイプしか使用されなかった場合よりも速く伸長される。このフロー順序を使用する配列番号１鋳型に対するプライマーの伸長については、表２に示されているフローグラムから、６以下の塩基がプライマー伸長の高速フォワード部分の間に付加されることになる（サイクル３、ステップ３）。対照的に、表３は、単一ヌクレオチドが各ステップで使用される（表２のサイクル１、４および５と同様の）Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇサイクルを使用する同じ配列番号１のフローグラムを示す。表３に示されているプライマーを伸長するために使用されたフロー順序は、ポリヌクレオチドを通してプライマーを伸長するために１０サイクルの４ステップサイクルを必要とし、これは、表２で提供されるフロー順序を使用してポリヌクレオチドを通してプライマーを伸長するために使用される５サイクルの４ステップサイクルよりもかなり遅い。

【表2】

【表3】

【0110】

高速フォワード法は、直接シークエンシングされない領域を通したプライマー伸長を加速させるのに特に有用である。例えば、表２を参照して、サイクル１、４および５は、標識ヌクレオチドを段階的に使用して、第１の領域（サイクル１）および第３の領域（サイクル４および５）に関連するシークエンシングデータを生成したが、プライマーは、第１の領域と第３の領域の間の第２の領域（サイクル２およびサイクル３）を通して急速に伸長された。

【0111】

フローシークエンシングを使用するプライマー伸長は、長さが数百またはさらには数千ほどもの塩基のロングレンジシークエンシングを可能にする。フローステップまたはサイクルの数を増加または減少させて、所望のシークエンシング長を得ることができる。第１の領域または第３の領域におけるプライマーの伸長は、１つまたは複数の異なる塩基タイプを有するヌクレオチドを使用するプライマーの段階的伸長のための１つまたは複数のフローステップを含むことができる。一部の実施形態では、第１の領域におけるプライマー伸長または第３の領域におけるプライマー伸長は、１～約１０００ステップの間のフローステップ、例えば、１～約１０ステップの間のフローステップ、約１０～約２０ステップの間のフローステップ、約２０～約５０ステップの間のフローステップ、約５０～約１００ステップの間のフローステップ、約１００～約２５０ステップの間のフローステップ、約２５０～約５００ステップの間のフローステップ、または約５００～約１０００ステップの間のフローステップを含む。フローステップを同一のまたは異なるフローサイクルに分割することができる。第１の領域または第３の領域においてプライマーに取り込まれる塩基の数は、第１の領域または第３の領域の配列、およびプライマーを伸長するために使用される第１の領域または第３の領域におけるフロー順序に依存する。一部の実施形態では、第１のまたは第３の領域は、長さ約１塩基～約４０００塩基、例えば、長さ約１塩基～約１０塩基、長さ約１０塩基～約２０塩基、長さ約２０塩基～約５０塩基、長さ約５０塩基～約１００塩基、長さ約１００塩基～約２５０塩基、長さ約２５０塩基～約５００塩基、長さ約５００塩基～約１０００塩基、長さ約１０００塩基～約２０００塩基、または長さ約２０００塩基～約４０００塩基である。

【0112】

第２の領域を通したプライマー伸長は、任意の数のフローステップを通して進行し得る。一部の実施形態では、第２の領域を通したプライマーの伸長は、標識ヌクレオチドを含まず、このことにより、ポリメラーゼが失速せずにプライマーの実行可能な伸長距離がさらに増加される。一部の実施形態では、第２の領域によるプライマー伸長は、１～約１０，０００ステップの間のフローステップ、例えば、１～約１０ステップの間のフローステップ、約１０～約２０ステップの間のフローステップ、約２０～約５０ステップの間のフローステップ、約５０～約１００ステップの間のフローステップ、約１００～約２５０ステップの間のフローステップ、約２５０～約５００ステップの間のフローステップ、約５００～約１０００ステップの間のフローステップ、約１０００フローステップ～約２５００フローステップの間、約２５００フローステップ～約５０００フローステップの間、または約５０００フローステップ～約１０，０００フローテップの間のフローステップを含む。一部の実施形態では、第２の領域を通したプライマーの伸長は、約１０，０００ステップより多くのフローステップを含む。第２の領域においてプライマーに組み込まれる塩基の数は、第２の領域の配列、および第２の領域においてプライマーを伸長するために使用されるフロー順序に依存する。一部の実施形態では、第２の領域は、長さ約１塩基～約５０，０００塩基、例えば、長さ約１塩基～約１０塩基、長さ約１０塩基～約２０塩基、長さ約２０塩基～約５０塩基、長さ約５０塩基～約１００塩基、長さ約１００塩基～約２５０塩基、長さ約２５０塩基～約５００塩基、長さ約５００塩基～約１０００塩基、長さ約１０００塩基～約２０００塩基、長さ約２０００塩基～約２５００塩基、長さ約２５００～約５０００塩基、長さ約５０００～約１０，０００塩基、長さ約１０，０００～約２５，０００塩基、または長さ約２５，０００～約５０，０００塩基である。一部の実施形態では、第２の領域の長さは、長さ約５０，０００塩基を超える。

【0113】

プライマーの伸長は、第１の領域、第２の領域、および第３の領域を通して進行し、プライマーは、標識ヌクレオチドを使用して第１の領域および第３の領域を通して伸長される。伸長プライマーに組み込まれるヌクレオチドを検出してシークエンシングデータを生成することができる。第２の領域を通したプライマーの伸長は、例えば、伸長プライマーに組み込まれるヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、またはプライマーを伸長するために少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物を含むことにより（第１および／または第３を通したプライマーの伸長のほうが少ない異なるタイプのヌクレオチド塩基に頼る）、第１および／または第３の領域を通したプライマーの伸長よりも速い速度で起こり得る。プライマーの伸長は、交互パターンでさらに延長され得る。例えば、プライマーは、第３の領域を通して伸長された後、第４の領域へとさらに伸長され得る。第４の領域を通したプライマーの伸長は、例えば、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、またはプライマーを伸長するために少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物を含むことにより、第１および／または第３の領域を通したプライマーの伸長よりも速い速度で起こり得る。次いで、プライマーは、標識ヌクレオチドを使用して第５の領域へと伸長され得、伸長されたプライマーに取り込まれたヌクレオチドを検出することにより第５の領域についてのシークエンシングデータを生成することができる。このプロセスを何交互サイクルでも好きなだけ反復することができる。任意の２領域からのシークエンシングデータを関連付けてカップリングされたシークエンシングリードペアを生成することができ、カップリングされたシークエンシングリードペアを、本明細書中で説明されるように（例えば、選択領域間の領域を、本明細書で提供される解析方法について説明されるような「第２の領域」である考えることにより）解析することができる。

【0114】

図１は、カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）から生成するための例示的方法の概略図を示す。１０２で、ポリヌクレオチド１０４がプライマー１０６とハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた鋳型が形成される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、シークエンシングライブラリー調製中に標的ポリヌクレオチドの３’にライゲーションされ得るアダプター領域１０８を含む。アダプター領域１０８は、ハイブリダイゼーション領域を含むことができ、プライマー１０６は、アダプター領域１０８のハイブリダイゼーション領域とハイブリダイズすることができる。ステップ１１０で、ポリヌクレオチド１０４の第１の領域１１２についてのシークエンシングデータが、標識ヌクレオチドを使用してプライマー１０６を伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成される。プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドをさらに含むことがあるが、シークエンシングデータを生成するために、ヌクレオチド組込みを検出するために標識ヌクレオチドが使用される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、第１の領域１１２を通してプライマー１０６を伸長するために第１の領域のフロー順序に従って１または複数のサイクルで段階的に付加され、ハイブリダイズされた鋳型をサイクルステップに従って洗浄して、組み込まれなかったヌクレオチドを、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在の検出の前に除去することができる。ステップ１１４で、プライマー１０６は、第２の領域のフロー順序に従ってポリヌクレオチド１０４の第２の領域１１６を通して伸長される。プライマー１０６は、第２の領域１１６を通して、ステップ１１０でのプライマーの伸長よりも速い速度で伸長され得る。この加速されたプライマー伸長は、この方法の「高速フォワード」部分と呼ばれることがある。ヌクレオチド（これらは、一部の実施形態では、非標識である）は、ハイブリダイズされた鋳型に第２の領域のフロー順序に従って１または複数のサイクルで段階的に付加される。一部の実施形態では、１つより多くの（例えば、２つまたは３つの）異なる塩基タイプが所与のサイクルステップで同時に使用され、このことによりプライマー伸長が加速される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは非標識であり、このことにより、標識ヌクレオチドよりも速いプライマー伸長が可能になる。一部の実施形態では、プライマーは、ヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、伸長される。ステップ１１８で、ポリヌクレオチド１０４の第３の領域１１８についてのシークエンシングデータが、標識ヌクレオチドを使用してプライマー１０６を伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成される。第３の領域１１８についてのシークエンシングデータの生成は、第１の領域１１２についてのシークエンシングデータの生成について説明したのと同様の方法で進行し得る。ステップ１２２で、第１の領域１１２について生成されたシークエンシングデータは、第３の領域１２０について生成されたシークエンシングデータと関連付けられ、その結果、ポリヌクレオチド１０４についてのカップリングされたシークエンシングリードペア１２４が得られる。第１の領域と第３の領域とを関連付けたシークエンシングデータは、第１および第３の領域の配列を含み得る。カップリングされたシークエンシングリードペア１２４は、第１の領域１１２および第３の領域１２０についてのシークエンシングデータを含み、これらの領域は、必ずしもシークエンシングデータが分かるとは限らない第２の領域１１６により隔てられている。

【0115】

ポリヌクレオチドの第１の領域についてのシークエンシングデータの生成は、本明細書に記載される実施形態の一部に従って生成されなくてもよい。例えば、シークエンシングプライマーを、標的領域とハイブリダイズすることにより、標的シークエンシングに使用することができる。標的シークエンシングでは、ポリヌクレオチドの第１の領域は既知であり、プライマーは、第１の領域に特異的に結合するように設計される。次いで、プライマーを、説明されたように第２の領域および第３の領域を通して伸長することができ、第３の領域についてのシークエンシングデータが生成されることになる。一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法は、（ａ）プライマーをポリヌクレオチドの第１の領域とハイブリダイズしてハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通して伸長するステップであって、（ｉ）プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される、または（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される、ステップ；および（ｃ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｂ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップを含む。

【0116】

参照配列を使用して、第１の領域、第２の領域および／または第３の領域についての予想シークエンシングデータ（例えば、フローグラム）を決定することができる。第１および第３の領域についての配列を、それらの領域について生成されたシークエンシングデータから決定することができる。例えば、表２を参照して、サイクル１は、第１の領域に関連付けられ、この配列は、塩基に対する相補配列として容易に決定され（すなわち、塩基フローＡ－Ｃ－Ｔ－Ｇは、ＴＧＡＣの配列に対応する）、サイクル４および５は、第３の領域に関連付けられ、この配列は、ＣＴＧＡＣ（すなわち、Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇの相補配列）として決定される。したがって、第１の領域および／または第３の領域から生成されたシークエンシングデータを使用して、第１の領域および／または第３の領域（または第１の領域および／もしく第３の領域の少なくとも一部分）を参照配列にマッピングすることができる。参照配列にマッピングされると、第２の領域および参照配列を通してプライマーを伸長するために使用されたフロー順序を使用して、第２の領域についての予想シークエンシングデータを生成することができる。

【0117】

第２の領域についての参照配列、第２の領域についてのフロー順序、第３の領域についてのフロー順序、および第３の領域の配列についての情報を使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定することもできる。同様に、第２の領域についての参照配列、第２の領域についてのフロー順序、第１の領域についてのフロー順序、および第１の領域の配列についての情報を使用して、第１の領域についての予想シークエンシングデータを決定することができる。第３の領域（または第１の領域）の配列についての情報を、例えば、参照配列（もしくは異なる参照配列）、または生成されたシークエンシングデータ、例えば、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長し、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在もしくは非存在を検出することにより生成されたシークエンシングデータ、または他の方法（例えば、ポリヌクレオチドの第３の領域の第３の領域を独立してシークエンシングすること）により得られたシークエンシングデータから、得ることができる。

【0118】

例として、第３の領域についての予想シークエンシングデータを、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列を使用して決定することができる。第１の領域（またはその一部分）を参照配列にマッピングすることができ、第２の領域に対応する参照配列、および第２の領域のフロー順序を使用して、第２の領域についての予想参照シークエンシングデータを決定することができる。同様に、第３の領域についての参照配列を、第３の領域のフロー順序とともに使用して、第３の領域についての予想参照シークエンシングデータを決定することができる。同様の方法を使用して、第１の領域についての予想シークエンシングデータを決定することができる。例えば、第１の領域についての予想シークエンシングデータを、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第１の領域のフロー順序、および第１の領域についての参照配列を使用して決定することができる。第３の領域（またはその一部分）を参照配列にマッピングすることができ、第２の領域に対応する参照配列、および第２の領域のフロー順序を使用して、第２の領域についての予想参照シークエンシングデータを決定することができる。同様に、第１の領域についての参照配列を、第１の領域のフロー順序とともに使用して、第１の領域についての予想参照シークエンシングデータを決定することができる。

【0119】

別の例では、第３の領域についての予想シークエンシングデータを、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および前述の通り生成されたシークエンシングデータと同じこともあり、または異なることもある、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して決定することができる。第１の領域（またはその一部分）を参照配列にマッピングすることができ、第２の領域に対応する参照配列、および第２の領域のフロー順序を使用して、第２の領域についての予想参照シークエンシングデータを決定することができる。第３の領域についてのシークエンシングデータを使用して、第３の領域の配列を決定することができる。さらに、第３の領域の配列を、第３の領域のフロー順序とともに使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定することができる。

【0120】

図２は、予想シークエンシングデータを生成するための例示的方法の概略図を示す。ステップ２０２で、カップリングされたシークエンシングリードペアが参照配列にマッピングされる。カップリングされたシークエンシングリードペアのマッピングは、カップリングされたシークエンシングリードペア（もしくはその一部分）の第１の領域（もしくはその一部分）の参照配列へのマッピング、カップリングされたシークエンシングリードペアの第３の領域（もしくはその一部分）の参照配列への、または第１の領域（もしくはその一部分）と第３の領域（もしくはその一部分）両方の参照配列へのマッピングを含み得る。ステップ２０４で、第２の領域についての予想シークエンシングデータ（例えば、予想フローグラム）が、第２の領域のフロー順序および参照配列を使用して決定される。既知のフロー順序および参照シークエンシングを用いて、予想シークエンシングデータ（つまり、ポリヌクレオチドの第２の領域が参照配列にマッチするかどうかを予想されるシークエンシングデータ）の決定を容易に達成することができる。さらに、第２の領域についての予想シークエンシングデータを使用して、第２の領域の予想５’末端を決定することができる。第２の領域の５’末端は、その領域についてのフロー順序、および第２の領域の配列によって変わり得る。したがって、第３の領域の３’末端も、第２の領域のフロー順序、および第２の領域の配列に基づいて変わり得る。なぜなら、第３の領域の３’末端は、第２の領域の５’末端に隣接しているからである。第３の領域の３’末端が（例えば、第２の領域についての予想シークエンシングデータを使用して決定して）確立されると、ステップ２０６に示されているように、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定することができる。本明細書中でさらに説明されるように、第３の領域についての予想シークエンシングデータを使用して、ポリヌクレオチドの第２の領域内のバリアントなどの、バリアントを決定することができる。

【0121】

ポリヌクレオチドが第２の領域内にバリアントを含む場合、第３の領域に関連する生成シークエンシングデータ（例えば、フローグラム）と第３の領域に関連する予想シークエンシングデータとは（配列コンテキスト、およびバリアントのサイズに依存して）異なり得る。したがって、一部の実施形態では、バリアントは、予想シークエンシングデータと生成シークエンシングデータとの差に基づいて検出される。

【0122】

参照配列は、ポリヌクレオチドと同じ種の任意の好適な配列であり得、参照配列とポリヌクレオチドの配列の間には多少の差があり得る。本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、これらの差、すなわちバリアント、を検出することができる。一部の実施形態では、試験バリアント（すなわち、目的のバリアント）は、参照配列に含まれており、他の実施形態では、試験バリアントは、参照配列には含まれていない。一部の実施形態では、一方が、試験バリアントを含む参照配列であり、他方が、試験バリアントを含まない参照配列である、２つの異なる参照配列を用いて、解析を遂行することができる。一部の実施形態では、２つの参照配列間の唯一の差は、試験バリアントの存在または非存在である。

【0123】

本明細書に記載されるバリアント検出方法の感度は、第１、第２および／または第３の領域においてプライマーを伸長するために使用されるバリアントのコンテキストおよび／またはフロー順序に依存し得る。所与のフロー順序で見逃されるバリアントは、第１、第２および／または第３の領域において異なるフロー順序を使用することにより検出可能になり得る。したがって、本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１、第２および／または第３の領域のうちの１つまたは複数を通してプライマーを伸長するために、１つより多くのカップリングされたシークエンシングリードペアが異なるフロー順序を使用して生成される。

【0124】

本明細書に記載される方法で使用されるポリヌクレオチドは、任意の好適な生物源、例えば、組織試料、血液試料、血漿試料、唾液試料、糞便試料、または尿試料から得ることができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドであることもあり、またはＲＮＡポリヌクレオチドであることもある。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをシークエンシングプライマーとハイブリダイズする前にＤＮＡポリヌクレオチドに逆転写される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）または胎児無細胞ＤＮＡである。

【0125】

ポリヌクレオチドのライブラリーを公知の方法によって調製することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドをアダプター配列にライゲーションすることができる。アダプター配列は、カップリングされたシークエンシングリードペアの生成中に伸長されたプライマーとハイブリダイズしたハイブリダイゼーション配列を含み得る。

【0126】

一部の実施形態では、シークエンシングデータは、シークエンシングコロニー（シークエンシングクラスターとも呼ばれる）を確立する前に核酸分子を増幅することなく得られる。シークエンシングコロニーを生成するための方法としては、ブリッジ増幅またはエマルジョンＰＣＲが挙げられる。ショットガンシークエンシング、およびコンセンサス配列のコーリングに頼る方法は、一般に、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用して核酸分子を標識し、その核酸分子を増幅させて、独立してシークエンシングされる同じ核酸分子の非常に多数のコピーを生成する。次いで、増幅された核酸分子を表面に結合させ、ブリッジ増幅させて、独立してシークエンシングされるシークエンシングクラスターを生成し得る。次いで、ＵＭＩを使用して、独立してシークエンシングされた核酸分子を関連付けることができる。しかし、増幅プロセスは、例えばＤＮＡポリメラーゼの限られた忠実度に起因して、核酸分子にエラーを導入し得る。一部の実施形態では、核酸分子は、シークエンシングデータを得るためのコロニーを生成するための増幅の前に増幅されない。一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用せずに得られる。

【0127】

一部の実施形態では、フローシークエンシング法は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）シークエンシングとともに使用される。ＲＣＡは、線状配列で共有結合された核酸分子の複数のコピーの形成を可能にする。例えば、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ Ｐｈａｇｅ ＤＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈｉ２９ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ－Ｐｒｉｍｅｄ Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． １１， ｐｐ． １０９５－１０９９ （２０００１）；および米国特許第５，７１４，３２０号を参照されたく、これら参考文献の各々についての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子の複数のコピーを直線的にシークエンシングすることができるため、所与の領域は、シークエンシングが進行するにつれて「暗」モードまたは「明」モードで交互にシークエンシングされ得る。一部の実施形態では、シークエンシングモード切り替えを、動的に（および必要に応じて、自動的に）決定することができる。例えば、バリアントは、「暗」領域内で検出され得るが、わずかな情報しか生成されないため、特定のバリアントのコーリングが阻まれる。それ故、シークエンシングフローを動的に調整して、明モードでバリアントを含有する核酸の領域をシークエンシングすることができる。例えば、試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出する方法は、（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用してポリヌクレオチドを増幅させて、ポリヌクレオチドの第１のコピーとポリヌクレオチドの第２のコピーとを少なくとも含むＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドを生成するステップ；（ｂ）ＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｃ）ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｄ）プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、（ｉ）プライマーは、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物は、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通したプライマーの伸長は、第１の領域を通したプライマーの伸長よりも速く進行する、ステップ；（ｅ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｆ）ポリヌクレオチドの第３の領域について生成されたシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；（ｇ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップ；（ｈ）ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；および（ｉ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントのアイデンティティーをコールするステップを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータは、ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップに基づいて動的に生成される。
伸張されたフローサイクル

【0128】

フローサイクル順序は、必ずしも４塩基フローサイクル（例えば、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴを１つずつ、任意の反復順序で）に限定される必要はなく、サイクル内の塩基タイプが４タイプより多い延長フローサイクルであってもよい。延長サイクル順序を所望のサイクル数、反復して、シークエンシングプライマーを伸長することができる。例として、一部の実施形態では、延長フロー順序は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの別々のヌクレオチドフローをフローサイクル順序で含む。サイクルは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴを少なくとも１つずつ含むことができるが、サイクルが反復される前にサイクル内の１または複数の塩基タイプを反復する。伸張されたフローサイクルは、例えば、本明細書に記載の方法に従い第２の領域を通してプライマーを伸張するために使用され得る。

【0129】

延長フローサイクル順序は、４塩基が反復されるフローサイクル順序よりも小さいゲノムバリアント（例えばＳＮＰ）のより大きな割合を検出するのに有用であり得る。例えば、形式ＸＹＺ→ＸＱＺ［ここで、Ｑ≠Ｙ（およびＱ、Ｘ、ＹおよびＺは、各々、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのいずれかを１つである）］の置換ＳＮＰについて１９２の有効な配置がある。これらの中で、１６８は、シークエンシングデータセット（例えば、フローグラム）において新しいシグナル（すなわち、新しい非ゼロシグナルまたは新しいゼロシグナル）を生じさせることができる。感度の良いフロー順序と組み合わせられた新しいゼロまたは非ゼロシグナルは、複数のフロー位置にわたって伝播されるシグナル（例えば、サイクルの長さよりも長く延長することができる、フローシフト）を生じさせることができ、このことにより、バリアントにおいて参照と比較して同一の末尾の配列が得られる。ホモポリマー長変化ではなく、ホモポリマーの挿入または欠失が、シグナルの相違の伝播を生じさせる結果となり得ることは注目される。残りの２４のバリアントは、影響を受けたフロー位置においてホモポリマー長変化を引き起こすが、そのような変化は、シグナル変化の伝播を引き起こさない。したがって、ＳＮＰの理論上最大８７．５％は、２カ所より多くのフロー位置について参照（または候補）配列とは異なる新しいシグナルを生じさせる結果となり得る。上記で論じられたように、シグナルの相違の伝播は、試験シークエンシングデータセットと誤ってマッチした候補配列との尤度差を増加させる。さらに、シグナル変化の伝播は、バリアントに及ぶフロー順序に依存する。

【0130】

ランダムに断片化された試験試料中の核酸分子のシークエンシングは、シークエンシングプライマーがフロー順序を使用して伸長された場合、バリアントのフロー順序コンテキストのランダムシフトを生じさせる結果となる。つまり、バリアントのフロー位置は、シークエンシングされる核酸分子の開始位置によって変わり得る。たとえ核酸分子配列中のすべてのシークエンシング開始位置が用いられたとしても、ＳＮＰの８７．５％すべてについて、すべてのフローサイクルの組合せが２カ所より多くのフロー位置においてシグナル変化を検出できるとは限らない。例えば、４塩基フローサイクル順序Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇは、ＳＮＰの４１．７％について２カ所より多くのフロー位置において参照シークエンシングデータセットと異なる試験シークエンシングデータセットを生じさせる結果となり得る。本明細書中でさらに論じられるように、延長フローサイクル順序は、ＳＮＰの理論上最大量（すなわち、可能なＳＮＰの８７．５％、またはホモポリマー長の変化を生じさせる結果となるもの以外のすべてのＳＮＰ）のすべてが、２カ所より多くの位置において試験シークエンシングデータセットと参照シークエンシングデータセットとの差を生じさせることができるように設計されており、このことにより十分な高さのシークエンシング深度（すなわち、十分多い数の出発位置のサンプリング）が得られる。

【0131】

延長シークエンシングフロー順序は、異なる効率（すなわち、ヒト参照ゲノム配列に使用された場合のフローごとの平均取り込み数）を有し得る。一部の実施形態では、フロー順序は、約０．６のまたはそれを超える（例えば、約０．６２もしくはそれを超える、約０．６４もしくはそれを超える、約０．６５もしくはそれを超える、約０．６６もしくはそれを超える、または約０．６７もしくはそれを超える）効率を有する。一部の実施形態では、フロー順序は、約０．６～約０．７の効率を有する。フローサイクル順序および対応する推定効率の例は、表４に示されている。

【0132】

一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも５％についてのＳＮＰパーミュテーションの約５０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置（すなわち、「フロー相」）の少なくとも５％についてのＳＮＰパーミュテーションの約６０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも５％についてのＳＮＰパーミュテーションの約７０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所またはそれより多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも５％についてのＳＮＰパーミュテーションの約８０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。

【0133】

一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも１０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約５０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも１０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約６０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも１０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約７０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所またはそれより多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも１０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約８０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。

【0134】

一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも２０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約５０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも２０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約６０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも２０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約７０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所またはそれより多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも２０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約８０％～８７．５％がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。

【0135】

一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも３０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約５０％～８７．５％（または約５０％～約８０％）がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも３０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約６０％～８７．５％（または約６０％～約８０％）がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所より多くのフロー位置において生じさせるように選択される。一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、ランダムシークエンシング開始位置の少なくとも３０％についてのＳＮＰパーミュテーションの約７０％～８７．５％（または約７０％～約８０％）がＳＮＰによって異なる、核酸分子に関連する２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を、２カ所またはそれより多くのフロー位置において生じさせるように選択される。

【0136】

一部の実施形態では、延長シークエンシングフロー順序は、表４における延長シークエンシングフロー順序のうちのいずれか１つである。「シフト感度」は、すべての可能なＳＮＰパーミュテーションにわたって２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間のシグナルの相違を２カ所より多くのフロー位置において生じさせる最大感度を指す。「最大シフト感度」は、その感度が維持されるフロー相の最高分率ですべての可能なＳＮＰパーミュテーションにわたって２つのシークエンシングデータセット（例えば、試験または標的シークエンシングデータセットと候補または参照シークエンシングデータセット）間でシグナルの相違を２カ所より多くのフロー位置において生じさせる最大感度を指す。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【0137】

一部の実施形態では、フローサイクル順序は、２カ所より多くのフロー位置において、ランダムシークエンシング開始位置の５％における可能なＳＮＰパーミュテーションの５０％またはそれより多くについてのシグナル変化を誘導する。一部の実施形態では、誘導されるシグナル変化は、シグナル強度の変化、または新しい実質的にゼロ（もしくは新しいゼロ）もしくは新しい実質的に非ゼロ（もしくは新しい非ゼロ）シグナルである。一部の実施形態では、誘導されるシグナル変化は、新しい実質的にゼロ（もしくは新しいゼロ）または新しい実質的に非ゼロ（もしくは新しい非ゼロ）シグナルである。一部の実施形態では、前記フローサイクル順序は、１フロー当り０．６のまたはそれを超える塩基取り込みの効率を有する。一部の実施形態では、フローサイクルは、表４に収載されているフローサイクル順序のうちのいずれか１つである。
再位相化フロー

【0138】

１つまたは複数の再位相化フローを第２の領域としてまたは第２の領域内で使用して、シークエンシングクラスター内の並列シークエンシング反応を再位相化する（すなわち、同期化する）ことができる。シークエンシングクラスターは、共通の表面（例えば、ビーズまたはフローセル）にしっかりと結合された複数のポリヌクレオチドコピーを含む。クラスターは、例えば、ポリヌクレオチドを表面に結合させること、および結合されたポリヌクレオチドを（例えば、ブリッジ増幅により）増幅させることにより、形成することができる。ポリヌクレオチドの各々とハイブリダイズされたプライマーが、同一の鋳型に基づいてヌクレオチドを組み込むことにより同時に伸長されるので、シークエンシングデータをシークエンシングクラスターからまとめて収集することができる。しかし、伸長プライマーにヌクレオチドを組み込む化学的プロセスは、不完全であることが多く、そのためシークエンシングクラスター内の鎖間の非同期化が生じる。つまり、ある特定のプライマーは、クラスター内の他の伸長されたプライマーと比較して進行が遅いことがある。非同期化の結果として、リード長が増加するにつれて伸長プライマーへのヌクレオチド組込みの存在または非存在を検出する際に、シグナルの劣化、したがって、精度の低下が生じ得る。再同期化は、シグナル損失の相殺をもたらすことができ、それによって、より長い有効リード長が可能になる。シークエンシング反応を再位相化するために、少なくとも２つ（例えば、２つまたは３つ）の異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の複数のステップで使用される、１つまたは複数の再位相化フローを使用して、プライマーが第二の領域を通して伸長される。再位相化フロー中に組み込まれるヌクレオチドを一部の実施形態では検出することができず、その結果、得られるリードにギャップが生じることになる。しかし、配列が参照または他の配列にアラインメントされる場合、このリードギャップを管理することができる。そのような「キャッチアップフロー」を含むことにより、遅れプライマーは、クラスター内の他の伸長されたプライマーに対する遅れを取り戻すことができる。

【0139】

複数のポリヌクレオチドコピーを含むシークエンシングクラスターを（例えば、シークエンシングクラスター内で）再同期化する方法は、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、再位相化フロー順序の少なくとも１ステップで使用される、再位相化フロー順序を使用して、ポリヌクレオチドコピーとハイブリダイズされたプライマーを伸長するステップを含み得る。一部の実施形態では、シークエンシングクラスター内のシークエンシングプライマーを同期化する方法は、（ａ）プライマーをシークエンシングクラスター内のポリヌクレオチドコピーとハイブリダイズするステップ；（ｂ）プライマーを、第１の領域のフローサイクルに従って標識ヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドコピーの第１の領域を通して伸長するステップ；（ｃ）プライマーを、１つまたは複数の再位相化フローを使用してポリヌクレオチドコピーの第２の領域を通して伸長するステップであって、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドの混合物は、１つまたは複数の再位相化フローの各々において使用される、ステップ；および（ｄ）プライマーを、第３の領域のフローサイクルに従って標識ヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドコピーの第３の領域を通して伸長するステップを含む。

【0140】

複数のポリヌクレオチドコピー（例えば、シークエンシングクラスター内の）からシークエンシングリードを生成する方法は、再同期化方法を含み得る。例えば、シークエンシングリードペアを複数のポリヌクレオチドコピーから生成するための方法は、（ａ）ポリヌクレオチドコピーをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション鋳型を形成するステップ；（ｂ）ポリヌクレオチドコピーの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で伸長されたプライマーを、１つまたは複数の再位相化フローで提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が１つまたは複数の再位相化フローの各々で使用される、ステップ；および（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップを含む。

【0141】

再位相化フロー順序（または再位相化フローサイクル）は、シークエンシングクラスターにおいて遅れプライマーが先導プライマーに対する遅れを取り戻すことを可能にする１つまたは複数のステップを含む。再位相化フロー順序でのステップのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多く）は、２つまたはそれより多く（例えば３つ）の異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物を含む。一部の実施形態では、再位相化フロー順序は、２つまたは３つの異なるタイプのヌクレオチド塩基を各々が含む、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くのフローを含む。

【0142】

再位相化フロー順序は、再位相化フロー順序後の同期化された伸長プライマーの部分を増加させるように構成される。一部の実施形態では、再位相化フロー順序は、任意の順序で、（ｉ）Ａ、ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＴ（および／またはＵ）ヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ（「非Ｔ」（および／または「非Ｕ」）ステップとも呼ばれる］；（ｉｉ）Ｔ（および／またはＵ）、ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＡヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ（「非Ａ」ステップとも呼ばれる）；（ｉｉｉ）Ｔ（および／またはＵ）、ＡおよびＧヌクレオチドを含むがＣヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ（「非Ｃ」ステップとも呼ばれる）；および（ｉｖ）Ｔ（および／またはＵ）、ＡおよびＣヌクレオチドを含むがＧヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ（「非Ｇ」ステップとも呼ばれる）を含む。

【0143】

他の再位相化フローを決定することができる。例として、一部の実施形態では、再位相化フロー（再位相化フロー順序での）は、任意の順序で、（ｉ）ＡおよびＣヌクレオチドを含むがＧおよびＴ（および／またはＵ）ヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ；（ｉｉ）Ｔ（および／またはＵ）およびＧヌクレオチドを含むがＡおよびＣヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ；（ｉｉｉ）ＡおよびＧヌクレオチドを含むがＴ（および／またはＵ）およびＣヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ；（ｉｖ）Ｔ（および／またはＵ）およびＣヌクレオチドを含むがＡおよびＧヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ；（ｖ）ＡおよびＴ（および／またはＵ）を含むがＧおよびＣヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ；（ｖｉ）ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＡおよびＴ（および／またはＵ）を含まない混合物を含むフローステップ；（ｖｉｉ）Ａ、ＧおよびＣヌクレオチドを含むがＴヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ；（ｖｉｉｉ）Ｔ（および／またはＵ）、ＡおよびＧヌクレオチドを含むがＣヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ；（ｉｘ）Ｃ、Ｔ（および／またはＵ）およびＡヌクレオチドを含むがＧヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ；および／または（ｘ）Ｇ、ＣおよびＴ（および／またはＵ）ヌクレオチドを含むがＡヌクレオチドを含まない混合物を含むフローステップ、のうちの１つまたは複数を含む。

【0144】

４つすべてのタイプの非終結ヌクレオチドの混合物（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ（および／またはＵ）を含む混合物）を含むことは、無制御プライマー伸長を生じさせる結果となり得る。しかし、３つの塩基タイプが非終結ヌクレオチドであり、１つの塩基タイプが可逆的ターミネーターを含む、４つすべてのタイプのヌクレオチドの混合物を、再位相化フロー順序で使用することができる。例えば、一部の実施形態では、再位相化フロー順序は、（ｉ）非終結Ａヌクレオチドと、非終結Ｃヌクレオチドと、非終結Ｇヌクレオチドと、可逆的ターミネーターを含むＴ（および／またはＵ）ヌクレオチドとを含む（またはそれらからなる）混合物を含むフローステップ；または（ｉｉ）非終結Ｔ（および／またはＵ）ヌクレオチドと、非終結Ａヌクレオチドと、非終結Ｃヌクレオチドと、可逆的ターミネーターを含むＧヌクレオチドとを含む（またはそれらからなる）混合物を含むフローステップ；または（ｉｉｉ）非終結Ｇヌクレオチドと、非終結Ｔ（および／またはＵ）ヌクレオチドと、非終結Ａヌクレオチドと、可逆的ターミネーターを含むＣヌクレオチドとを含む（またはそれらからなる）混合物を含むフローステップ；または（ｉｖ）非終結Ｃヌクレオチドと、非終結Ｇヌクレオチドと、非終結Ｔ（および／または）ヌクレオチドと、可逆的ターミネーターを含むＡヌクレオチドとを含む（またはそれらからなる）混合物を含むフローステップを含む。プライマーは、可逆的ターミネーターを含むヌクレオチドが組み込まれるまで、鋳型鎖に基づいてヌクレオチドを組み込むことにより伸長され、これにより、シークエンシングクラスター内の可逆的ターミネーターを有する塩基の位置で伸長プライマーが同期化される。次いで、可逆的ターミネーターを除去することができ、次いで、シークエンシングプロセスは、同期化されたプライマーを用いて進行することができる。

【0145】

一部の実施形態では、再位相化フロー順序は、（ｉ）Ｃ、ＧおよびＴ（および／またはＵ）塩基（Ａ塩基を含まない）の混合物を含む第１の再位相化フロー、ならびにＡ、ＣおよびＧ塩基（Ｔおよび／またはＵ塩基を含まない）の混合物を含む第２の再位相化フローを、任意の順序で含む。

【0146】

シークエンシングクラスター内の伸長プライマーを同期化するための本明細書に記載される方法を、プライマーを伸長するために非終結ヌクレオチドを使用する、合成によるシークエンシングで使用することができる。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載される他の方法、例えば、本明細書に記載される高速フォワードシークエンシング法（例えば、「暗」領域を生成するシークエンシング法）と組み合わせて使用される。
カップリングされたシークエンシングリードペアの参照配列へのマッピング

【0147】

カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングすることができ、この参照配列は、目的の試験バリアントを含むこともあり、または含まないこともある。第１の領域または第３の領域についてのシークエンシングデータを使用して、第１の領域または第３の領域の配列をそれぞれ導出することができる。第１の領域、もしくは第１の領域の一部分、または第３の領域、もしくは第３の領域の一部分を、参照配列にマッピングすることができる。第１の領域と第３の領域の間の距離（すなわち、第２の領域の長さ）を決定または推定することができ、それによって、マッピングされなかった第３または第１の領域についてのおおよその遺伝子座を得ることができる。すると、このおおよその遺伝子座を使用して、マッピングされなかった第１または第３の領域を参照配列に容易にマッピングすることができる。

【0148】

マッピングされた配列は、ある配列（例えば、領域の配列またはその一部分）の別の配列（例えば、参照配列）へのアラインメントを指す。マッピング可能な配列は、選択されたマッピング閾値（すなわち、マッピングスコア）に従って、別の配列（例えば、参照配列）にマッピングすることができる配列（例えば、領域の配列またはその一部分）である。したがって、マッピング不可能な配列は、選択されたマッピング閾値（マッピングスコア）に従って他の配列にマッピング可能でない配列である。スコアを、エラーリスク許容度に基づいて事前に決定する（すなわち、マッピングの前に選択する）ことができる。例えば、ある配列を別の配列にマッピングする際にスミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用することができ、マッピング閾値を、「マッピング可能な」配列と「マッピング不可能な」配列を区別するように選択することができる。例として、マッピングスコアが＋１であり、ミスマッチスコアが－１であり、ギャップ開始スコアが－２であり、ギャップ伸長スコアが－２である場合、マッピングスコア閾値は、＋５であるかもしくはそれより大きく、＋６であるかもしくはそれより大きく、＋８であるかもしくはそれより大きく、＋１０であるかもしくはそれより大きく、＋１２であるかもしくはそれより大きく、＋１４であるかもしくはそれより大きく、＋１６であるかもしくはそれより大きく、＋１８であるかもしくはそれより大きく、または＋２０であるかもしくはそれより大きい。他のスコアまたはペナルティスコアが当業者により選択されることもある。

【0149】

カップリングされたシークエンシングリードペアの１つまたは複数の領域などの、配列を、任意の好適なマッピングソフトウェア、例えば、ＧＡＴＫ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｂｏｗｔｉｅ２、ＢＷＡ、ＢＷＡ－ＭＥＭ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ、ＳＯＡＰ２、ＳＯＡＰ３、およびその他、例えば、バローズ・ホイーラー変換（ＢＷＴ）に基づくアライナーなどを用いてマッピングすることができる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ｖｏｌ． ９５， ｐｐ． ３１５－３２７ （２０１０）；Ｃｈａｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅ ｎｏｖｏ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ｍａｔｅ－ｐａｉｒｅｄ ｒｅａｄｓ： Ｄｏｅｓ ｔｈｅ ｒｅａｄ ｌｅｎｇｔｈ ｍａｔｔｅｒ？ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． １９， ｐｐ． ３３６－３４６ （２００９）；Ｍｉｅｌｃｚａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ＳＮＰ ｃａｌｌｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｖｏｌ． ５７， ｐｐ． ７１－７９ （２０１６）；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ＳＮＰ ｃａｌｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｖｏｌ． ２， ｐｐ． ４４３－４５１ （２０１１）；およびＨｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｅｘｏｍｅ ｖａｒｉａｎｔｓ， Ｓｃｉ Ｒｅｐ．， ｖｏｌ． ５， １７８７５ （２０１５）を参照されたく、これらの参考文献の各々は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0150】

参照配列に対するポリヌクレオチドの領域の遺伝子座を概算するための距離情報の使用は、ポリヌクレオチドの第２の領域内の構造バリアント（例えば、挿入または欠失）の検出に、またはゲノム内の複数のマッピング可能な遺伝子座の分解（例えば、第１の領域もしくは第３の領域が、反復領域もしくは他の非固有配列を含む場合）に、有用である。距離情報は、本明細書で論じられる場合、２点（例えば、領域の始点と終点）間の空間の量に関し、種々の基準枠で考慮され得る。例えば、物理的空間の距離情報は、塩基数または物理的距離（例えば、ポリヌクレオチドが線状に配置された場合、一次元空間でのマイクロメートル数）を指すことがある。シークエンシングデータ空間（例えば、フローグラム空間）の距離情報は、所与のフロー順序を用いて空間内のプライマーを伸長するために使用されたフローステップの数を指すこともある。物理的空間の距離情報およびシークエンシングデータ空間の距離情報は、配列（または参照配列）およびフロー順序が既知である場合、分析的に代替可能である。

【0151】

距離情報は、第２の領域の長さを示すが、必ずしも第２の領域の正確な長さではない。なぜなら、マッピングされなかった領域が距離情報により概算された位置内に最終的にマッピングされるからである。一例では、距離情報は、第２の領域のフロー順序（または第２の領域のフロー順序に関連する情報）および第２の領域における塩基の確率分布を使用して決定される。第２の領域における塩基の確率分布は、例えば、ゲノム全体にわたっての塩基の仮定分布であることがあり、または第１の領域もしくは第３の領域のマッピングされた遺伝子座に基づく、より局所的な確率であることもある。第２の領域のフロー順序に関連する情報は、例えば、第２の領域を通してプライマーを伸長するために同時に使用されるヌクレオチド塩基の異なるタイプの数であり得る。例として、第２の領域内のプライマーを伸長するために反復サイクルで３塩基フローステップを使用して（例えば、各サイクルステップが３つの他の塩基を含む、（非Ａ）－（非Ｃ）－（非Ｔ）－（非Ｇ）のサイクルステップを使用して）、および第２の領域における塩基の分布を全体としてゲノムとほぼ同じと仮定して、プライマーは、サイクルにおけるステップごとにおおよそ４．７塩基ずつ伸長されると予想される。したがって、第２の領域の長さは、第２の領域のフロー順序でのステップの数の４．７倍と概算することができる。

【0152】

一部の実施形態では、距離情報は、第２の領域についての予想参照シークエンシングデータから導出される。本明細書中で論じられるように、第２の領域についての予想参照シークエンシングデータを、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して決定することができる。ポリヌクレオチドの第１または第３の領域が参照配列にマッピングされると、予想配列長を含む、予想配列情報が決定され、これにより、ポリヌクレオチドの第１の領域と第３の領域の間の長さが得られる。

【0153】

１つより多くのマッピング可能な位置が参照配列内で入手可能な場合、距離情報を使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングすることができる。例えば、一部の実施形態では、第１の領域を高い信頼度で参照配列にマッピングすることができるが、第３の領域は、参照配列内の複数の異なる位置に位置し得る。一部の実施形態では、第３の領域を高い信頼度で参照配列にマッピングすることができるが、第１の領域は、参照配列内の複数の異なる位置に位置し得る。一部の実施形態では、第１の領域と第３の領域両方を、参照配列内の複数の異なる位置にマッピングすることができる。参照配列にマッピングされた第１の領域および第２の領域についての正確な位置のペアを、第２の領域についての距離情報を使用して選択することができる。例えば、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域（またはその一部分）および第３の領域（またはその一部分）を、参照配列の第１の位置および第２の位置を含む２つまたはそれより多くの異なる位置ペアにマッピングするステップを含み得る。次いで、ポリヌクレオチドの第２の領域の長さを示す距離情報を、第１の位置と第２の位置の間の長さを示す位置情報と比較することができる。比較された距離情報が、互いに近似しているかまたはマッチする場合には、正しい位置ペアが選択され得る。しかし、第２の領域の長さが、第１の位置と第２の位置の間の距離と有意に異なる場合、その位置ペアは、却下され得る。

【0154】

図３は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す距離情報を使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法を示す。カップリングされたシークエンシングリードペア３０４は、第１の領域３０６、第２の領域３０８および第３の領域３１０を含む。第１の領域３０６は、参照配列３０２の第１の参照領域３１２に位置し得るが、第３の領域３１０は、第３の参照領域、選択肢Ａ、３１４と、第３の参照領域、選択肢Ｂ、３１６の両方に位置し得る。第１の参照領域３１２の終点と、第３の参照領域、選択肢Ａ、３１４の始点との間の距離は、長さｎ塩基であり（参照配列に基づいて）、第１の参照領域３１２の終点と、第３の参照領域、選択肢Ｂ、３１６の始点との間の距離は、長さｍ塩基である（参照配列に基づいて）。第２の領域についての距離情報は、第２の領域の長さが、長さおおよそｎ塩基であることを示す。したがって、第３の領域３１０は、第３の参照領域、選択肢Ａ、３１４に正確に位置すると、結論付けることができる。たとえ、第１の領域について複数のマッピング可能な遺伝子座および／または第３の領域についての複数のマッピング可能な遺伝子座があったとしても、同様の解析を遂行することができる。

【0155】

さらに、第１の領域または第３の領域の遺伝子座における反復領域のため、第１の領域または第３の領域を正確な位置に最終的にマッピングすることができない場合、距離情報を使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングすることができる。図４は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第３の領域が反復領域に位置する場合、カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す距離情報を使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法を示す。図４は、参照配列４０２、およびカップリングされたシークエンシングリードペア４０４を示す。カップリングされたシークエンシングリードペアは、第１の領域４０６、第２の領域４０８および第３の領域４１０を含む。第１の領域４０６は、第１の参照領域４１２内の特定の遺伝子座に位置し得るが、第３の領域４１０は、反復領域４１４内のどこかに位置し得る。第２の領域４０８の長さを知ることにより、第３の領域４１０をより正確に反復領域４１４内にマッピングすることができる。例えば、第１の領域４０６がマッピングされてしまえば、第２の領域４０８の長さが、長さおおよそｎ塩基である場合、この距離情報を使用して、第３の領域４１０の位置を決めることができる。同様に、第３の領域を正確にマッピングすることができるが、第１の領域が反復領域内に位置する場合、この方法を使用することができる。
構造バリアントの検出

【0156】

ゲノムに由来するポリヌクレオチドから生成された、カップリングされたシークエンシングシークエンシングリードペアを使用して、ゲノム内の構造バリアントなどの、バリアントを検出することができる。構造バリアントとしては、挿入、欠失、逆位および染色体融合バリアントを挙げることができ、これらは、ポリヌクレオチドの第１、第２もしくは第３の領域内にあることもあり、またはポリヌクレオチドの第１、第２もしくは第３の領域にまたがる位置にあることもある。

【0157】

ゲノム内への挿入は、任意のサイズ、例えば、長さ１塩基から長さ数百もしくは数千キロ塩基またはそれを超える塩基数の間のものであり得る。さらに、挿入は、内因性挿入（つまり、対象のゲノム内の他の場所が起源である、遺伝子座に挿入された配列）であることもあり、外来性挿入（例えば、対象のゲノムに挿入されたウイルスゲノムなどの、対象ゲノム以外の供給源が起源である、遺伝子座に挿入された配列）であることもある。外来性挿入は、参照配列内に存在しない核酸配列であり、したがって、対象のゲノム内の外来性挿入バリアントの検出または位置決めについてのさらなる課題をもたらす。本明細書に記載される方法を使用して、数ある構造バリアントの中でも特に、外来性挿入を検出および／または位置決めすることができる。

【0158】

一例では、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用してゲノム内の構造バリアント（例えば、外来性挿入）を検出する方法は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域（またはその一部分）を参照配列にマッピングするステップ、および第３の領域（またはその一部分）を参照配列にマッピングすることを試みるステップを含む。第３の領域（またはその一部分）がマッピング不可能であった場合には、外来性挿入の存在を同定することができる。これは、参照配列が、第３の領域に対応する配列を含まないからである。同様に、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用してゲノム内の外来性挿入を検出する方法は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第３の領域（またはその一部分）を参照配列にマッピングするステップ、および第１の領域（またはその一部分）を参照配列にマッピングすることを試みるステップを含むこともある。第１の領域（またはその一部分）がマッピング不可能であった場合には、外来性挿入の存在を同定することができる。これは、参照配列が、第１の領域に対応する配列を含まないからである。さらに（およびどちらの例でも）、参照配列内の外来性挿入の遺伝子座を、第２の領域の長さを示す予想距離情報に基づいて決定することができる。図５は、外来性挿入を検出する例示的方法についての概略図を示す。カップリングされたシークエンシングリードペア５０２は、第１の領域５０４、第２の領域５０６、および第３の領域５０８を含み、第２の領域５０６は、第１の領域５０４と第３の領域５０８の間にある。第３の領域５０８は、対象のゲノム５１２に存在する外来性挿入エレメント５１０を含むが、参照配列５１４には存在しない。参照エレメント５１６は、対象のゲノム５１２と参照配列５１４の両方に存在するが、第１の参照領域５１８からの間隔が異なる。第１の領域５０４は、参照配列内の第１の参照領域５１８に位置する。しかし、第３の領域５０８には、それが位置する対応する領域が参照配列５１４内にない（すなわち、それはマッピング不可能である）。これは、第３の領域５０８の配列が、対象のゲノム内への外来性挿入の結果であることを示す。第２の領域５０６についての距離情報を使用して、第１の参照領域５１８に対する外来性ゲノムの遺伝子座を決定することもできる。つまり、第２の領域５０６が、長さおおよそｎ塩基である場合、外来性挿入物は、第１の領域５０４の末端からおおよそｎ塩基に位置する。

【0159】

別の例では、カップリングされたシークエンシングリードペアは、予想シークエンシングデータを使用して、および生成シークエンシングデータを予想シークエンシングデータと比較して、構造バリアント（例えば、挿入、欠失、逆位、または染色体融合）を検出するために、使用することができる。例えば、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域（もしくはその一部分）または第３の領域（もしくはその一部分）のうちの一方を参照配列にマッピングすることができる。マッピングされなかった第１の領域（もしくはその一部分）またはマッピングされなかった第３の領域（もしくはその一部分）についての参照配列内の遺伝子座を、第２の領域の長さを示す距離情報を使用して決定することができる。この距離情報は、例えば、本明細書で説明されるように、決定することができる。マッピングされなかった第１の領域（もしくはその一部分）またはマッピングされなかった第３の領域（もしくはその一部分）の遺伝子座が決定されると、その遺伝子座における予想シークエンシングデータ参照配列を決定することができる。例えば、予想配列データを、第２の領域の配列、第２の領域のフロー順序、マッピングされなかった領域の配列に関する情報、およびマッピングされなかった領域のフロー順序に基づいて決定することができる。次いで、予想シークエンシングデータを、マッピングされなかった領域の生成シークエンシングデータと比較することができる。マッピングされなかった領域のシークエンシングデータと予想シークエンシングデータとの間の距離は、その遺伝子座における構造バリアントを示す。

【0160】

図６は、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して構造バリアントを検出するための例示的方法を示す。ステップ６０２で、第１の領域またはその一部分（または第３の領域もしくはその一部分）のうちの一方が参照配列にマッピングされる。ステップ６０４で、参照配列内の予想遺伝子座が、第３の領域またはその一部分（または第１の領域もしくはその一部分）について決定される。つまり、第１の領域またはその一部分がステップ６０２中にマッピングされた場合、第３の領域またはその一部分についての予想遺伝子座は、ステップ６０４で決定され、第３の領域またはその一部分がステップ６０２中にマッピングされた場合、第１の領域またはその一部分についての予想遺伝子座は、ステップ６０４で決定される。ステップ６０６で、第３の領域またはその一部分（または第１の領域もしくはその一部分）についての決定された予想遺伝子座における予想シークエンシングデータが決定される。ステップ６０８で、第３の領域またはその一部分（または第１の領域もしくはその一部分）についての予想シークエンシングデータが、第３の領域またはその一部分（または第１の領域もしくはその一部分）についての決定シークエンシングデータと比較され、決定シークエンシングデータと予想シークエンシングデータとの差が、構造バリアントを示す。

【0161】

図７は、対象のゲノムにおける構造バリアントを検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの使用についての概略図を示し、この場合の構造バリアントは挿入である。対象のゲノム７０２は、第１の領域７０４を含み、かつ第１の参照領域７０８と第２の参照領域７１０の間に挿入７０６を含む。参照配列７１２は、第１の領域７０４、第１の参照領域７０８、および第２の参照領域７１０を含むが、第１の参照領域７０８と第２の参照領域７１０の間に挿入７０６を含まない（挿入は、参照領域の別の部分に見られる領域に対応することもあり、または完全に外来性の配列であることもある）。カップリングされたシークエンシングリードペア７１４は、第１の領域７１６（第１の領域７０４に対応する）および第３の領域７１８（挿入７０６に対応する）を含み、これらの領域が第２の領域７２０を隔てている。カップリングされたシークエンシングリードペア７１４の第１の領域７１６は、参照配列７１２の第１の領域７０４に位置する。距離情報は、カップリングされたシークエンシングリードペア７１４の第２の領域７２０の長さを、長さおおよそｎ塩基と示す。したがって、第３の領域７１８についての予想遺伝子座７２２の始点は、第１の領域７０４の終点からおおよそｎ塩基の位置において開始するように決定される。次いで、予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータを、本明細書で説明されるように決定することができる。例えば、参照配列７１２（例えば、第１の領域７０４から予想遺伝子座の間の、および／または予想遺伝子座を含む、参照配列）、第２の領域についてのフロー順序、および第３の領域についてのフロー順序を使用して、予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータを決定することできる。図７に示されている例では、予想シークエンシングデータは、第３の領域７１８が第２の参照領域７１０であったなら、第２の参照領域７１０が予想遺伝子座にあるので得られたであろうシークエンシングデータに対応する。予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータが、カップリングされたシークエンシングリードペア７１４の第３の領域７１８についての生成シークエンシングデータと異なる場合（これは図７に示されている例の状況である）、構造バリアントが検出される。

【0162】

図８は、対象のゲノムにおける構造バリアントを検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの使用についての概略図を示し、この場合の構造バリアントは欠失である。対象のゲノム８０２は、第１の領域８０４、第１の参照領域８０６および第２の参照領域８０８を含む。参照配列８１０は、第１の領域８０４、第１の参照領域８０６、および第２の参照領域８０８を第１の参照領域８０６と第２の参照領域８０８の間に位置づけられる追加領域８１２とともに含む。追加領域８１２は参照配列８１０中に存在するが、追加領域８１２は対象のゲノム８０２から欠失している。カップリングされたシークエンシングリードペア８１４は、第１の領域８１６（第１の領域８０４に対応する）および第３の領域８１８（第２の参照領域８０８に対応する）を含み、これらの領域が第２の領域８２０を隔てている。カップリングされたシークエンシングリードペア８１４の第１の領域８１６は、参照配列８１０の第１の領域８０４に位置する。距離情報は、カップリングされたシークエンシングリードペア８１４の第２の領域８２０の長さを、長さおおよそｎ塩基と示す。したがって、第３の領域８１８についての予想遺伝子座８２２の始点は、第１の領域８０４の終点からおおよそｎ塩基の位置において開始するように決定される。次いで、予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータを、本明細書で説明されるように決定することができる。例えば、参照配列８１２（例えば、第１の領域８０４から予想遺伝子座の間の、および／または予想遺伝子座を含む、参照配列）、第２の領域についてのフロー順序、および第３の領域についてのフロー順序を使用して、予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータを決定することできる。図８に示されている例では、予想シークエンシングデータは、第３の領域８１８が追加領域８１２（対象のゲノムにおいて欠失されている）であったなら、追加領域８１２が予想遺伝子座にあるので得られたであろうシークエンシングデータに対応する。予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータが、カップリングされたシークエンシングリードペア８１４の第３の領域８１８についての生成シークエンシングデータと異なる場合（これは図８に示されている例の状況である）、構造バリアントが検出される。

【0163】

図９は、対象のゲノム内の構造バリアントを検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの使用についての概略図を示し、この場合の構造バリアントは逆位である。対象のゲノム９０２は、第１のセグメント９０４、第２のセグメント９０６、および第３のセグメント９０８を含む。参照配列９１０も、第１のセグメント９０４、第２のセグメント９０６、および第３のセグメント９０８を含む。しかし、参照配列９１０では、第２のセグメント９０６は、第３のセグメント９０８と比較して５’末端の近位にあるが、対象のゲノム９０２では、第２のセグメント９０６は、第３のセグメント９０８と比較して３’末端の近位にある。したがって、対象のゲノム９０２における第２のセグメント９０６および第３のセグメント９０８は、参照配列９１０と比較して逆である。カップリングされたシークエンシングリードペア９１２は、第１の領域９１４（第１のセグメント９０４に対応する）および第３の領域９１６（第３のセグメント９０８に対応する）を含み、これらの領域が第２の領域９１８を隔てている。カップリングされたシークエンシングリードペア９１２の第１の領域９１４は、参照配列９１０の第１のセグメント９０４に位置する。距離情報は、カップリングされたシークエンシングリードペア９１２の第２の領域９１８の長さを、長さおおよそｎ塩基と示す。したがって、第３のセグメント９０８についての予想遺伝子座９２０の始点は、第１のセグメント９０４の終点からおおよそｎ塩基の位置において開始するように決定される。次いで、予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータを、本明細書で説明されるように決定することができる。例えば、参照配列９１０（例えば、第１のセグメント９０４から予想遺伝子座の間の、および／または予想遺伝子座を含む、参照配列）、第２の領域についてのフロー順序、および第３の領域についてのフロー順序を使用して、予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータを決定することできる。図９に示されている例では、予想シークエンシングデータは、第３の領域９１６が第２のセグメント９０６と一致したなら、第２のセグメント９０６が参照配列９１０における予想遺伝子座にある（第３のセグメント９０８は、そこにない）ので得られたであろうシークエンシングデータに対応する。予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータが、カップリングされたシークエンシングリードペア９１２の第３の領域９１６についての生成シークエンシングデータと異なる場合（これは図９に示されている例の状況である）、構造バリアントが検出される。

【0164】

図１０は、対象のゲノムにおける構造バリアントを検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの使用についての概略図を示し、この場合の構造バリアントは染色体融合である。染色体融合は、染色体の一部分が染色体（同じ染色体または異なる染色体のどちらか）の別の部分に融合する、染色体再編成事象の結果として生じる。参照配列１００２は、第１のセグメント１００４および第２のセグメント１００６を含む染色体Ａと、第３のセグメント１００８を含む染色体Ｂとを含む。対象のゲノム１０１０は、参照ゲノム１００２の地点１０１２および１０１４に染色体Ａと染色体Ｂの染色体融合を含む。この融合により、染色体Ａの３’末端と染色体Ｂの５’末端とを含む染色体Ａ／Ｂ、および染色体Ｂの３’末端と染色体Ａの５’末端とを含む染色体Ｂ／Ａが生じることになる。したがって、染色体Ａ／Ｂは、第１のセグメント１００４および第３のセグメント１００８を含み、染色体Ｂ／Ａは、第２のセグメント１００６を含む。カップリングされたシークエンシングリードペア１０１６は、対象のゲノム１０１０の染色体Ａ／Ｂから導入され、第１の領域１０１８（第１のセグメント１００４に対応する）および第３の領域１０２０（第３のセグメント１００８に対応する）を含み、これらの領域が第２の領域１０２２を隔てている。カップリングされたシークエンシングリードペア１０１６の第１の領域１０１８は、参照配列１００２の第１のセグメント１００４に位置する。距離情報は、カップリングされたシークエンシングリードペア１０１６の第２の領域１０２２の長さを、長さおおよそｎ塩基と示す。したがって、第３のセグメント１０２０についての予想遺伝子座１０２４の始点は、第１のセグメント１００４の終点からおおよそｎ塩基の位置において開始するように決定される。次いで、予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータを、本明細書で説明されるように決定することができる。例えば、参照配列１００２（例えば、第１のセグメント１００４から予想遺伝子座、第２のセグメント１００６の間の、および／または予想遺伝子座、第２のセグメント１００６を含む、参照配列）の染色体Ａ、第２の領域１０２２についてのフロー順序、および第３の領域１０２０についてのフロー順序を使用して、予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータを決定することできる。図１０に示されている例では、予想シークエンシングデータは、第３の領域１０２０が第２のセグメント１００６と一致したなら、第２のセグメント１００６が参照配列１００２における予想遺伝子座にある（第３のセグメント１００８は、そこにない）ので得られたであろうシークエンシングデータに対応する。予想遺伝子座についての予想シークエンシングデータが、カップリングされたシークエンシングリードペア１０１６の第３の１０２０についての生成シークエンシングデータとは異なる場合（これは図１０に示されている例の状況である）、構造バリアントが検出される。

【0165】

参照配列に対して構造バリアント（例えば、挿入、欠失、染色体融合、または逆位）の接合箇所は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域または第３の領域全体に必ずしも渡らない。一部の実施形態では、構造バリアントの少なくとも一部分は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域または第３の領域内で終わる。それでもやはり、予想シークエンシングデータは、第１または第３の領域についての決定シークエンシングデータと異なることになる。
第２の領域内のバリアントの欠失

【0166】

一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアは、たとえ第２の領域を通して伸長されたプライマーへのヌクレオチドの組込みを検出する必要がなかったとしても、第２の領域内のバリアントを検出するために使用される。検出可能なバリアントには、構造バリアント（例えば、挿入、欠失、逆位、もしくは染色体融合）または一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれる。

【0167】

構造バリアント（例えば、染色体融合、逆位、挿入、または欠失）を検出する方法は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域（またはその一部分）と第３の領域（またはその一部分）の両方を参照配列にマッピングするステップを含み得る。完全に第２の領域内で起こる逆位についての距離情報は、一般に、第２の領域のフロー順序（例えば、フローグラム空間における）に関して考慮されるが、完全に第２の領域では（例えば、少なくとも一部は第１の領域でも第３の領域でも）起こらない染色体融合、挿入または欠失についての距離情報は、物理的空間または第２の領域のフロー順序に関して考慮され得る。参照配列にマッピングされた第１の領域と参照配列にマッピングされた第３の領域との間の距離情報（すなわち、マッピング距離情報）を決定することができる。マッピング距離情報は、参照配列にマッピングされた第１の領域のマッピング位置と、参照配列にマッピングされた第３の領域のマッピング位置との間の距離、例えば、第１のマッピング領域と第３のマッピング領域の間の塩基の数を示す。カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す予想距離情報も（例えば、第２の領域についてフロー順序および参照配列を使用して、または本明細書に別様に記載されるように）決定することができる。予想距離情報とマッピング距離情報との比較を使用して構造バリアントを検出することができる。例えば、予想距離がマッピング距離よりも短い場合には、対象のゲノム内の挿入または染色体融合バリアントなどの構造バリアントが示される。予想距離がマッピング距離よりも長い場合には、対象のゲノム内の欠失バリアントが示される。

【0168】

図１１は、構造バリアントを検出する例示的な方法であって、ステップ１１０２で、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域（またはその一部分）および第３の領域（またはその一部分）を参照配列にマッピングすることを含む、方法を示す。ステップ１１０４：参照領域にマッピングされた第１の領域と参照領域にマッピングされた第３の領域の間の距離を示す、マッピング配列距離情報が、決定される。ステップ１１０６で、第２の領域の予想距離情報が、第２の領域の配列（例えば、参照配列からの第２の領域の配列）についての配列領域のフロー順序および情報に基づいて決定される。ステップ１１０８で、構造バリアントは、予想距離情報をマッピング距離情報と比較することにより同定され、マッピング距離情報と予想距離情報との差が構造バリアントを示す。

【0169】

図１２は、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して構造バリアントを検出することができる方法の一例を実証する概略図を示す。示されている例は、対象のゲノムにおける挿入を示すが、この方法論は、他の構造バリアント（例えば、欠失または染色体融合）に同様に応用される。参照配列１２０２は、第１のセグメント１２０４および第２のセグメント１２０６を含む。対象のゲノム１２０８も、第１のセグメント１２０４および第２のセグメント１２０６を含むが、第１のセグメント１２０４と第２のセグメント１２０６の間に挿入物１２１０をさらに含む。対象のゲノム１２０８から生成された、カップリングされたシークエンシングリードペア１２１２は、第１のセグメント１２０４に対応する第１の領域１２１４、および第２のセグメント１２０６に対応する第３の領域１２１６を含む。第２の領域１２１８が第１の領域１２１４と第３の領域１２１６を隔てている。第１の領域１２１４および第３の領域１２１６の配列を、参照配列１２０２の第１のセグメント１２０４および第２のセグメント１２０６にそれぞれマッピングすることができる。マッピングされると、参照配列１２０２にマッピングされた第１の領域１２１４と第３の領域１２１６の間の距離（すなわち、参照配列１２０２の第１のセグメント１２０４と第２のセグメント１２０６の間の距離）を示すマッピング距離情報が、距離ｎとして決定される。第２の領域１２１８の長さについての予想距離情報も、ｍとして決定することができる。次いで、マッピング距離情報ｎを予想距離情報ｍと比較することにより、構造バリアントを決定することができる。

【0170】

第２の領域内のバリアント（例えば、構造バリアントまたはＳＮＰ）を検出する別の方法では、予想シークエンシングデータが決定シークエンシングデータと比較される。例えば、一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアントを検出する方法（第１の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第１の領域を通して伸長されたプライマー、および／または第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長されたプライマーを用いる）は、第１の領域（もしくはその一部分）および／または第３の領域（もしくはその一部分）を参照配列にマッピングするステップを含む。次いで、他の領域またはその一部分についての予想参照シークエンシングデータ（すなわち、第１の領域またはその一部分がマッピングされる場合、他の領域は、第３の領域またはその一部分を指し、第３の領域またはその一部分がマッピングされる場合、他の領域は、第１の領域またはその一部分を指す）が、決定される。予想シークエンシングデータは、例えば、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、他の領域またはその一部分（例えば、第１の領域またはその一部分がマッピングされる領域である場合、第３の領域またはその一部分、および第３の領域またはその一部分がマッピングされる領域である場合、第１の領域またはその一部分）についての参照配列、および他の領域またはその一部分についてのフロー順序を使用して、決定することができる。別の例では、予想シークエンシングデータは、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、他の領域についてのフロー順序、および他の領域の配列に関連するシークエンシングデータ（これは、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成する際に生成された同じシークエンシングデータであることもあり、または他の手段により生成されたシークエンシングデータであることもある）を使用して、決定される。他の領域についての決定された予想シークエンシングデータを、他の領域についての生成シークエンシングデータと比較することができる。予想シークエンシングデータと生成シークエンシングデータとの差は、バリアントの存在を示す。

【0171】

一部の実施形態では、プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長される、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアント（例えば、構造バリアント（例えば、染色体融合、逆位、挿入、もしくは欠失）またはＳＮＰ）を検出する方法は、第１の領域またはその一部分を参照配列にマッピングするステップ；（１）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列、または（２）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータを使用して、第３の領域またはその一部分についての予想シークエンシングデータを決定するステップ；および第３の領域についての予想シークエンシングデータを第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータと比較することによりバリアントの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、プライマーが、第１の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長される、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアント（例えば、構造バリアント（例えば、染色体融合、逆位、挿入、もしくは欠失）またはＳＮＰ）を検出する方法は、第３の領域またはその一部分を参照配列にマッピングするステップ；（１）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第１の領域のフロー順序、および第１の領域についての参照配列、または（２）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第１の領域のフロー順序、および第１の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータを使用して、第１の領域またはその一部分についての予想シークエンシングデータを決定するステップ；および第１の領域についての予想シークエンシングデータを第１の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータと比較することによりバリアントの存在を検出するステップを含む。

【0172】

図１３は、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアントを検出する例示的方法を示す。ステップ１３０２で、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分が参照配列にマッピングされる。ステップ１３０４で、第３の領域もしくはその一部分、または第１の領域もしくはその一部分についての予想シークエンシングデータが決定される。ステップ１３０６で、第１の領域または第３の領域についての予想シークエンシングデータを第１の領域または第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータと比較することにより、バリアントの存在が検出される。例示的なバリアント検出方法は、実施例で提供される。

【0173】

バリアントを検出する方法は、参照配列を使用することができ、この参照配列は、試験バリアントを含むこともあり、または含まないこともある。試験バリアントを、例えば、第２のポリヌクレオチド内のまたはバイオマーカーパネルからの試験バリアントを同定することによって、選択することができる。例として、試験バリアントを使用して、ポリヌクレオチドのハプロタイプを決定することができる。対立遺伝子またはバリアントをポリヌクレオチドにおいて同定することができ、本明細書に記載される方法を使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアを生じさせたポリヌクレオチドが、同定された対立遺伝子またはバリアントを有するポリヌクレオチドと同じハプロタイプのものであるのか、異なるハプロタイプのものであるのかを判定することができる。カップリングされたシークエンシングリードペアにおいて検出された試験バリアントを、ポリヌクレオチドの第１の領域または第３の領域内のシークエンシングされた対立遺伝子と関連付けることができる。

【0174】

試験バリアントの存在を検出する場合、参照配列は、試験バリアントを含むことができ、対象のゲノム内の試験バリアントの存在を、第３の領域またはその一部分についての予想試験バリアントシークエンシングデータを第３の領域またはその一部分についての決定シークエンシングデータと比較することにより決定することができる。予想試験バリアントシークエンシングデータが決定シークエンシングデータにマッチする場合には、試験バリアントは、参照配列内で検出される。例えば、一部の実施形態では、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間の試験バリアントを検出する方法（第１の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第１の領域を通して伸長されたプライマー、および／または第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長されたプライマーを用いる）は、第１の領域またはその一部分を、試験バリアントを含む参照配列にマッピングするステップを含む。次いで、他の領域またはその一部分（すなわち、第１の領域またはその一部分がマッピングされる場合、他の領域は、第３の領域またはその一部分を指す）についての試験バリアント予想参照シークエンシングデータが決定される。試験バリアント予想シークエンシングデータは、例えば、第２の領域についての試験バリアントを含む参照配列、第２の領域のフロー順序、他の領域またはその一部分についての参照配列、および他の領域またはその一部分についてのフロー順序を使用して、決定することができる。別の例では、予想シークエンシングデータは、第２の領域についての試験バリアントを有する参照配列、第２の領域のフロー順序、他の領域のフロー順序、および他の領域の配列に関連するシークエンシングデータ（これは、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成する際に生成された同じシークエンシングデータであることもあり、または他の手段により生成されたシークエンシングデータであることもある）を使用して、決定される。他の領域についての決定された試験バリアント予想シークエンシングデータを、他の領域についての生成シークエンシングデータと比較することができる。予想シークエンシングデータと生成シークエンシングデータとのマッチが試験バリアントの存在を示す。
短い遺伝子バリアントの検出

【0175】

本明細書に記載される方法を使用して、第２の領域内の短い遺伝子バリアント（例えば、ＳＮＰまたは短いインデル（長さが、連続する１０塩基未満）を（例えば、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、またはプライマーを伸長するために少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物を含むことにより、プライマーが第２の領域を通して伸長されると）検出することができる。第２の領域内の短い遺伝子バリアントを、下流の（例えば、第３の）領域内へのヌクレオチドの組込みを検出する際に得られるシグナルを解析することにより、検出することができる。短い遺伝子バリアントは、例えば、個体の亜集団内に見られるバリアントもしくは突然変異であることもあり、または単一もしくは特異的個体に固有のバリアントもしくは突然変異であることもある。短い遺伝子バリアントは、生殖細胞系列バリアントであることもあり、または体細胞バリアントであることもある。

【0176】

シークエンシングデータを、取り込まれたヌクレオチドの検出およびヌクレオチド導入の順序に基づいて生成することができる。以下の伸長される配列（すなわち、対応する鋳型配列の各逆相補配列）：ＣＴＧ、ＣＡＧ、ＣＣＧ、ＣＧＴ、およびＣＡＴ（先行する配列も後続の配列もシークエンシング法に供されないと仮定して）、ならびにＴ－Ａ－Ｃ－Ｇの反復フローサイクル（つまり、反復サイクル中のＴ、Ａ、ＣおよびＧヌクレオチドの逐次的付加）を例にとる。所与のフロー位置における特定のタイプのヌクレオチドは、相補的塩基が鋳型ポリヌクレオチド中に存在する場合にのみプライマーに取り込まれることになる。結果として生じる例示的なフローグラムが表５に示され、この表中の１は、導入されたヌクレオチドが取り込まれること示し、０は、導入されたヌクレオチドが取り込まれないことを示す。フローグラムを使用して、鋳型鎖の配列を導出することができる。例えば、論じられるシークエンシングデータ（例えば、フローグラム）は、伸長されたプライマー鎖およびその逆相補鎖を表し、この逆相補鎖は、鋳型鎖の配列を表すために容易に決定され得る。表５中のアスタリスク（＊）は、伸長されたシークエンシング鎖（例えば、より長い鋳型鎖）に追加のヌクレオチドが取り込まれた場合にシグナルがシークエンシングデータ中に存在し得ることを示す。

【表5】

【0177】

フローグラムは、バイナリであることもあり、ノンバイナリであることもある。バイナリフローグラムは、取り込まれたヌクレオチドの存在（１）または非存在（０）を検出する。ノンバイナリフローグラムは、各々の段階的導入から取り込まれたヌクレオチドの数をより定量的に決定することができる。例えば、ＣＣＧの伸長された配列は、同じＣフローの中の（例えば、フロー位置３における）伸長プライマー内への２つのＣ塩基の取り込みを含むことになり、標識された塩基により放出されるシグナルは、単一塩基取り込みに相当する強度レベルより高い強度を有することになる。このことが表５に示されている。ノンバイナリフローグラムはまた、塩基の存在または非存在を示し、所与のフロー位置における各伸長に取り込まれる可能性が高い塩基の数を含む追加情報を提供することができる。値が整数である必要はない。一部のケースでは、値は、所与のフロー位置に取り込まれる塩基の数の不確実性および／または確率を反映していることもある。

【0178】

一部の実施形態では、シークエンシングデータセットは、各フロー位置に取り込まれているシークエンシングされた核酸分子中の塩基の数を示す塩基カウントを表すフローシグナルを含む。例えば、表５に示されているように、Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇフローサイクル順序を使用してＣＴＧ配列で伸長されたプライマーは、位置３に１の値を有し、これは、その位置における１の塩基カウントを示す（この１塩基は、シークエンシングされた鋳型鎖内のＧと相補的であるＣである）。また表５において、Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇフローサイクル順序を使用してＣＣＧ配列で伸長されたプライマーは、位置３に２の値を有し、これは、このフロー位置にある間の伸長プライマーのその位置における２の塩基カウントを示す。ここで、２塩基は、伸長プライマー配列内のＣＣＧ配列の最初のＣ－Ｃ配列を指し、この配列は、鋳型鎖内のＧ－Ｇ配列と相補的である。

【0179】

シークエンシングデータセット内のフローシグナルは、各フロー位置における１または複数の塩基カウントについての尤度または信頼区間を示す１つまたは複数の統計パラメーターを含み得る。一部の実施形態では、フローシグナルは、シークエンシング中にシークエンシングプライマーに取り込まれる１つまたは複数の塩基の蛍光シグナルなどの、シークエンシングプロセス中に検出されるアナログシグナルから決定される。一部のケースでは、アナログシグナルを処理して統計パラメーターを生成することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に取り込まれる公開国際特許出願ＷＯ２０１９０８４１５８Ａ１に記載されているように、機械学習アルゴリズムを使用してアナログシークエンシングシグナルのコンテキスト効果について補正することができる。ゼロまたはそれを超える整数の塩基がいずれかの所与のフロー位置に取り込まれるが、所与のアナログシグナルは、そのアナログシグナルと完全にマッチしないことがある。したがって、検出されたシグナルを考えれば、フロー位置に取り込まれる塩基の数の尤度を示す統計パラメーターを決定することができる。単に例として、表５のＣＣＧ配列について、フローシグナルがフロー位置３に取り込まれた２塩基を示す尤度は、０．９９９であり得、フローシグナルがフロー位置３に取り込まれた１塩基を示す尤度は、０．００１であり得る。フローシグナルが、各フロー位置における複数の塩基カウントについての尤度を示す統計パラメーターを含む場合、シークエンシングデータセットを疎行列としてフォーマットすることができる。単に例として、Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇの反復フローサイクル順序を使用してＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）の配列で伸長されたプライマーは、図１４Ａに示されているシークエンシングデータセットを生じさせる結果となり得る。統計パラメーターまたは尤度値は、例えば、シークエンシング中のアナログシグナルの検出中に存在するノイズまたは他のアーチファクトによって、異なり得る。一部の実施形態では、統計パラメーターまたは尤度が所定の閾値よりも下であった場合、実質的にゼロである所定の非ゼロ値（すなわち、何らかの非常に小さい値または無視できる値）にパラメーターを設定して、真のゼロ値を用いると計算誤差が生じるか、または可能性の低さのレベル同士、例えば、非常に可能性の低いレベル（０．０００１）とあり得ないレベル（０）とが十分に区別されなくなる可能性がある、本明細書でさらに論じられる統計解析を補助することができる。

【0180】

所与の配列についてのシークエンシングデータセットの尤度を示す値を、配列アラインメントなしにシークエンシングデータセットから決定することができる。例えば、データが得られる可能性の最も高い配列を、図１４Ｂに（図１４Ａに示されているのと同じデータを使用して）星印により示されているように、各フロー位置において最高尤度を有する塩基カウントを選択することにより決定することができる。したがって、プライマー伸長の配列を、各フロー位置において可能性の最も高い塩基カウントに従って決定することができる：ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）。このことから、逆相補配列（すなわち、鋳型鎖）を容易に決定することができる。さらに、ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）配列（または逆相補配列）が得られる、このシークエンシングデータセットの尤度を、各フロー位置における選択尤度の積として決定することができる。

【0181】

核酸分子に関連するシークエンシングデータセットを１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６もしくはそれより多くの）可能性のある候補配列と比較することができる。シークエンシングデータセットと候補配列との（下記で論じられるような、マッチスコアに基づく）近似マッチは、そのシークエンシングデータセットが、近似マッチする候補配列と同じ配列を有する核酸分子から生じた可能性が高いことを示す。一部の実施形態では、シークエンシングされた核酸分子の配列を、参照配列に（例えば、バローズ・ホイーラーアラインメント（ＢＷＡ）アルゴリズムまたは他の好適なアラインメントアルゴリズムを使用して）マッピングして、その配列についての遺伝子座（または１つもしくは複数の遺伝子座）を決定することができる。上記で論じられたように、フロー空間におけるシークエンシングデータセットを塩基空間に（またはフロー順序が既知である場合には、その逆に）容易に変換することができ、マッピングをフロー空間または塩基空間において行なうことができる。マッピングされた配列に対応する遺伝子座（単数）［または遺伝子座（複数）］を、本明細書に記載される解析方法のための候補配列（またはハプロタイプ配列）として動作することができる１つまたは複数のバリアント配列と、関連付けることができる。本明細書に記載される方法の１つの利点は、一部のケースではアラインメントアルゴリズムを使用するシークエンシングされた核酸分子の配列と各候補配列との一般に計算コストの高いアラインメントを必要としない点である。その代わりに、フロー空間におけるシークエンシングデータを使用して候補配列の各々についてマッチスコアを決定することができ、この操作のほうが、計算効率が良い。

【0182】

マッチスコアは、シークエンシングデータセットがいかに良く候補配列を支持するかを示す。例えば、シークエンシングデータセットが候補配列にマッチする尤度を示すマッチスコアは、各フロー位置における統計パラメーター（例えば、尤度）であって、候補配列についての予想シークエンシングデータが得られたそのフロー位置における塩基カウントに対応する統計パラメーターを選択することにより、決定することができる。選択された統計パラメーターの積によりマッチスコアを得ることができる。例えば、伸長されたプライマーについて図１４Ａに示されているシークエンシングデータセット、およびＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号１６）の候補プライマー伸長配列を仮定する。図１４Ｃ（図１４Ａにおける同じシークエンシングデータセットを示す）は、候補配列（塗りつぶした丸印）についてのトレースを示す。比較として、ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）配列のトレース（図１４Ｂを参照されたい）が、図１４Ｃに白抜きの丸印を使用して示されている。シークエンシングデータが第１の候補配列ＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号１６）に対応する尤度を示すマッチスコアと、シークエンシングデータが第２の候補配列ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）にマッチする尤度を示すマッチスコアとには、たとえこれらの配列が単一塩基変動分しか変わらなかったとしても、大きな差がある。図１４Ｃで見られるように、トレース間の差は、フロー位置１２に見られ、少なくとも９フロー位置（およびシークエンシングデータがさらなるフロー位置にわたって伸長する場合にはより長い可能性がある）にわたって伝播する。１または複数のフローサイクルにわたって継続するこの伝播は、「フローシフト」または「サイクルシフト」と呼ばれることがあり、シークエンシングデータセットが候補配列にマッチする場合、一般に、非常に可能性の低い事象である。

【0183】

したがって、各シークエンシングデータセットと候補配列（または各候補配列）とのマッチスコアを決定することができる。例えば、シークエンシングデータセットが、所与の候補配列に一致する尤度Ｌ（Ｒ_ｊ｜Ｈ_ｉ）は、所与の候補配列についての各フロー位置における選択された塩基カウントの尤度（例えば、その積）を使用して、決定することができる。

【0184】

マッチスコアを使用して、試験シークエンシングデータ、および／または試験シークエンシングデータに関連する核酸分子を分類することができる。分類子は、核酸分子がバリアント（例えば、候補配列に含まれるバリアント）を含むことを示すこともあり、核酸分子が、バリアントを含まないこと示すこともあり、またはヌルコールを示すこともある。ヌルコールは、試験シークエンシングデータに関連する核酸分子におけるバリアントの存在も非存在も示さず、それどころか、マッチスコアを使用して所望の統計的信頼度でコールを行なうことができないことを示す。試験シークエンシングデータまたは核酸分子は、例えば、マッチスコアが所望の信頼度閾値よりも上であった場合、バリアントを有するものとして分類され得る。逆に、試験シークエンシングデータまたは核酸分子は、例えば、マッチスコアが所望の信頼度閾値よりも下であった場合、バリアントを有さないものとして分類され得る。

【0185】

上記の解析を応用して、２つまたはそれより多くの異なる候補配列から候補配列を選択することができる。シークエンシングデータセットが各候補配列にマッチする尤度を示すマッチスコアを決定することができる。例えば、シークエンシングデータセット内の各フロー位置における統計パラメーターであって、そのフロー位置における候補配列の塩基カウントに対応する統計パラメーターを、候補配列ごとに選択することができる。一部の実施形態では、この解析は、シークエンシングされた試験核酸分子についてのシークエンシングデータセットを生成するために使用されたのと同じフロー順序を使用して候補配列がシークエンシングされることを仮定して、候補シークエンシングについての予測シークエンシングデータを生成することを含む。このデータは、候補配列を有する核酸分子をシークエンシングすることにより、または候補配列およびフロー順序に基づいて候補シークエンシングデータセットをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成することにより、生成することができる。例示的な候補シークエンシングデータセットは、図１４Ｃの試験データシークエンシングデータセットの下に示されており、第１の候補配列［ＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号１６）］は塗りつぶした丸印トレースに対応し、第２の候補配列［ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）］は白抜きの丸印トレースに対応する。一部の実施形態では、例えば、マッチスコアが２つまたはそれより多くの異なる候補配列について決定される場合、試験シークエンシングデータまたは核酸分子は、２つもしくはそれより多くの候補配列のうちの１つについてのバリアントを有するもの、２つもしくはそれより多くの候補配列のうちの１つについてのバリアントを有さないものとして分類されることがあり、またはヌルコールが２つもしくはそれより多くの候補配列間で得られることもある（例えば、候補配列のいずれについてのコールも得ることができなかった場合、もしくはマッチスコアが、同じ遺伝子座で２つもしくはそれより多くの異なるバリアントを示した場合）。

【0186】

シークエンシングデータセットのマッチスコアが、候補配列について決定されると、マッチスコアに基づいて短い遺伝子バリアントを有する候補配列（例えば、２つまたはそれより多くの候補配列の中から最高尤度マッチを有するマッチスコアをもたらす候補配列）を選択することができる。短い遺伝子バリアントを有する核酸分子の配列から生じるシークエンシングデータは、短い遺伝子バリアントを有する候補配列にマッチすることになり、その候補配列を選択することができるが、棄却された（または非選択）候補配列は、より小さい尤度マッチ（これらの候補配列について決定されたマッチスコアに基づいて）により示されるように、短い遺伝子バリアントを含まない。非選択候補配列と、選択候補配列（シークエンシングされた核酸分子シークエンシングデータセットに最も良くマッチする）とは、２カ所またはそれより多くのフロー位置において異なることがあり、これらの位置は、２カ所もしくはそれより多くの連続するフロー位置であることもあり、または２カ所もしくはそれより多くの非連続のフロー位置であることもある。一部の実施形態では、非選択候補配列と、選択候補配列とは、３カ所もしくはそれより多くの、４カ所もしくはそれより多くの、５カ所もしくはそれより多くの、６カ所もしくはそれより多くの、７カ所もしくはそれより多くの、８カ所もしくはそれより多くの、９カ所もしくはそれより多くの、または１０カ所もしくはそれより多くのフロー位置において異なる。一部の実施形態では、非選択候補配列と、選択候補配列とは、１もしくは複数の、２もしくはそれより多くの、３もしくはそれより多くの、４もしくはそれより多くの、または５もしくはそれより多くのフローサイクルにわたって異なる。一部の実施形態では、非選択候補配列と選択候補配列とは、Ｘカ所の塩基位置において異なり、この場合、核酸分子の配列に関連するシークエンシングデータセットと、非選択候補配列とは、（Ｘ＋２）カ所またはそれより多くのフロー位置において異なる。シークエンシングされた核酸分子シークエンシングデータセットが選択候補配列に最も良くマッチする、選択候補配列と非選択候補配列とで異なるフロー位置の数の増加は、シークエンシングされた核酸分子シークエンシングデータセットが、非選択候補配列を有する核酸分子のシークエンシングから得られた尤度を低下させる。

【0187】

シークエンシングされた核酸分子のシークエンシングデータセットが非選択候補配列にマッチする尤度は、好ましくは低く、例えば、０．０５未満、０．０４未満、０．０３未満、０．０２未満、０．０１未満、０．００５未満、０．００１未満、０．０００５未満、または０．０００１未満である。シークエンシングされた核酸分子のシークエンシングデータセットが選択候補配列にマッチする尤度は、好ましくは高く、例えば、０．９５より高く、０．９６より高く、０．９７より高く、０．９８より高く、０．９９より高く、０．９９５より高く、または０．９９９より高い。

【0188】

試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出するための方法は、一部の実施形態では、各試験シークエンシングデータセットが試験試料中の別々の試験核酸分子に関連している、複数の試験シークエンシングデータセットを解析するステップを含み得る。核酸分子は、例えば、核酸分子の配列が参照配列とアラインメントされた場合、ある遺伝子座において少なくとも部分的に重複する。核酸分子の少なくとも一部分は、異なるシークエンシング開始位置（ある遺伝子座に対して）を有することができ、その結果、配列内の所与の塩基について異なるフロー位置、および／または異なるフロー順序コンテキストが生じることになる。このようにして、同じ候補配列を使用して、上記複数のうちの試験シークエンシングデータセットを解析することができる。候補配列ごとに、複数の試験シークエンシングデータセットが候補配列にマッチする尤度を示すマッチスコアを決定することができ、最高尤度マッチを有する（したがって、短い遺伝子バリアントを含む）候補配列を選択することができる。複数の試験シークエンシングデータセットを使用して短い遺伝子バリアントを検出するための例示的解析が、図１５Ａ～１５Ｄに示されている。図１５Ａでは、３つのシークエンシングされた試験核酸分子に対応する配列（伸長されたプライマーの配列により各々表されている、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３）が、２つの候補配列（Ｈ１およびＨ２）に関連する重複遺伝子座において参照配列とアラインメントされている。図１５Ｂ、図１５Ｃおよび図１５Ｄは、それぞれ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３についての例示的シークエンシングデータセットを、Ｈ１の塩基（黒塗りの丸印）またはＨ２の塩基（白抜きの丸印）に対応するシークエンシングデータセット内の各フロー位置における選択統計パラメーターとともに示す。

【0189】

１つまたは複数の決定されたマッチスコアを使用して、試験試料についての短い遺伝子バリアントの存在（もしくはアイデンティティー）または非存在をコールすることができる。一部の実施形態では、例えば、バリアントを有するものとして分類される単一核酸分子（または関連試験シークエンシングデータセット）は、例えば、マッチスコアが、所望の信頼度または事前設定された信頼度で候補配列とのマッチを示す場合、バリアントの存在、アイデンティティーまたは非存在をコールするのに十分なものであり得る。一部の実施形態では、所定数の（例えば、１つまたは複数の、２つまたはそれより多くの、３つまたはそれより多くの、４つまたはそれより多くの、５つまたはそれより多くの、などの）核酸分子（または核酸分子に関連する試験シークエンシングデータセット）は、バリアントが試験試料についてコールされる前にバリアントを有するものとして分類される。一部の実施形態では、核酸分子（または核酸分子に関連する試験シークエンシングデータセット）の数は、マッチスコアに依存して動的に選択され、例えば、高い信頼度マッチスコアでバリアントを有するものとして分類された単一核酸分子を使用してバリアントをコールすることもあり、またはより低い信頼度マッチスコアでバリアントを有するものとして分類された２つまたはそれより多くの核酸分子を使用してバリアントをコールすることもある。

【0190】

必要に応じて、シークエンシングデータセットについての別々のマッチスコアは、複数の試験シークエンシングデータセットのマッチスコアを決定するためにまとめて解析される。例えば、候補配列ごとに各試験シークエンシングデータセットについてのマッチスコアが、本明細書に記載される方法を使用して決定されると、公知のベイズ法を使用して、例えば、ゲノム解析ツールキット（ＧＡＴＫ）に含まれているＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒアルゴリズムを使用して、複数の試験シークエンシングデータセットが候補配列にマッチする尤度を示すマッチスコアを決定することができ、最高尤度マッチを有する候補配列を選択することができる。例えば、ＤｅＰｒｉｓｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３， ４９１－４９８ （２０１１）；およびＰｏｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｌｉｎｇ ａｃｃｕｒａｔｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏ ｔｅｎｓ ｏｆ ｔｈｏｕｓａｎｄｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ， ｂｉｏＲｘｉｖ， ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０１１７８ｖ３ （Ｊｕｌｙ ２４， ２０１８）； Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｅｘｏｍｅ ｖａｒｉａｎｔｓ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ｖｏｌ． ５， ｎｏ． １７８７５ （２０１５）を参照されたく、これらの各々の内容は、本明細書に取り込まれる。

【0191】

仮想実施例１－ＳＮＰ検出
フローサイクル順序Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃに従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用して仮想核酸分子をシークエンシングし、その結果、図１４Ａに示す試験シークエンシングデータセットを得た。シークエンシングデータセットにおける各値は、各フロー位置における示されている塩基カウントが正しい尤度を示す。シークエンシングデータセットに基づいて、予備配列をＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）として決定し、これを参照ゲノムの遺伝子座にマッピングする。参照ゲノムに遺伝子座を、可能性のあるハプロタイプ配列ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１５）（Ｈ１）およびＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号１６）（Ｈ２）と関連付ける。各フロー位置についてのハプロタイプ配列の塩基カウントに関連する尤度値を、ハプロタイプごとに選択する。各ハプロタイプに付与されるシークエンシングデータセットの尤度を、各フロー位置についてのハプロタイプ配列の塩基カウントに関連する尤度値を乗じることにより決定する。Ｈ１が正しい配列である場合のシークエンシングデータセットのｌｏｇ尤度は、－０．０１５であり、Ｈ２が正しい配列である場合のシークエンシングデータセットのｌｏｇ尤度は、－２７．００８である。したがって、Ｈ１の配列をこの核酸分子に選択する。

【0192】

仮想実施例２－インデル検出
フローサイクル順序Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃに従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用して仮想核酸分子をシークエンシングし、その結果、図１６に示す試験シークエンシングデータセットを得た。シークエンシングデータセットにおける各値は、各フロー位置における示されている塩基カウントが正しい尤度を示す。シークエンシングデータセットに基づいて（すなわち、各フロー位置において最も可能性の高い塩基カウントを選択することにより）、予備配列をＴＡＴＧＧＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号２２）として決定し、これを参照ゲノムの遺伝子座にマッピングする。参照ゲノムの遺伝子座を、可能性のあるハプロタイプ配列ＴＡＴＧＧＴＣＧ－ＴＣＧＡ（配列番号２１）（Ｈ１）およびＴＡＴＧＧＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号２２）（Ｈ２）と関連付ける。各フロー位置についてのハプロタイプ配列の塩基カウントに関連する尤度値を、ハプロタイプごとに選択する。各ハプロタイプに付与されるシークエンシングデータセットの尤度を、各フロー位置についてのハプロタイプ配列の塩基カウントに関連する尤度値を乗じることにより決定する。Ｈ１が正しい配列である場合のシークエンシングデータセットのｌｏｇ尤度は、－２４．００９であり、Ｈ２が正しい配列である場合のシークエンシングデータセットのｌｏｇ尤度は、－０．０１５である。したがって、Ｈ２の配列をこの核酸分子に選択する。

【0193】

第２の（すなわち、「暗」）領域におけるバリアントに起因するシグナルの相違が、第３の領域（すなわち、ヌクレオチドの組込みが検出される領域）に伝播した場合、第２の領域におけるバリアントの結果として生じるフローシフトを、第３の領域において検出することができる。上記で論じられた仮想例では、例えば、サイクル３を「暗」または第２の領域（これは、任意のサイクル数であり得る）と考えることができ、サイクル４およびサイクル５を第３の領域（これもまた、任意のサイクル数であり得る）と考えることができるだろう。
トランスバージョンの検出

【0194】

トランスバージョンは、プリンをピリミジンと交換する、または逆にピリミジンをプリント交換する、ＳＮＰである。本明細書に記載される方法を、カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域内のトランスバージョンの検出に対して特に感度が良いように、実行することができる。例えば、ピリミジン（Ｃ＋Ｔ）とプリン（Ａ＋Ｇ）の交互ヌクレオチドペアを含む第２の領域のフロー順序を使用する第２の領域を通したプライマー伸長は、トランスバージョンに対して高感度であろう。

【0195】

例えば、ポリヌクレオチドにおける塩基トランスバージョンの存在を検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアは、（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；（ｂ）ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）において伸長されたプライマーを、第２の領域を通して、（１）シトシンおよびチミンと（２）アデニンおよびグアニンとの交互ヌクレオチドペアを含むフロー順序を使用してさらに伸長するステップ；および（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップによって生成され得る。トランスバージョンは、第２の領域を通して伸長されたプライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出せずとも検出することができる。

【0196】

トランスバージョン検出のために生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して、カップリングされたシークエンシンリードペアの第１の領域またはその一部分（または第３の領域もしくはその一部分）をマッピングすること；第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および参照配列を使用して第３の領域またはその一部分（または第１の領域もしくはその一部分）についての予想シークエンシングデータを決定すること；および第３の領域についての予想参照シークエンシングデータと第３の領域につての生成シークエンシングデータの差に基づいて塩基トランスバージョンの存在を検出することにより、トランスバージョンを検出することができる。

【0197】

第３の領域またはその一部分（または第１の領域もしくはその一部分）についての予想参照シークエンシングデータは、例えば、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、第２の領域についての参照配列、および第３の領域についての参照配列を使用することにより、決定することができる。一部の実施形態では、第３の領域についての予想参照シークエンシングデータは、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、第２の領域についての参照配列、および第３の領域の配列に関連する生成配列データを使用して決定され、第３の領域の配列に関連する生成配列データは、カップリングされたシークエンシングリードペアを生成した際に生成された同じまたは異なる配列データである。
バリアント検証

【0198】

複数の少なくとも部分的に重複するカップリングされたシークエンシングリードを使用して、バリアントステータスを検証することができる。シークエンシングエラーは、伸長プライマーへのヌクレオチド組込みの通常の過程で（例えば、ポリメラーゼエラーまたはリードエラーに起因して）起こることがたまにあるので、バリアント検証は、偽陽性または偽陰性の報告を最小限に抑えるのに有用であり得る。加えて、本明細書に記載される方法の感度は、第２の領域を通してプライマーを伸長する際に使用されるバリアントのコンテキストおよびフロー順序によって変わり得る。したがって、偽陽性または偽陰性エラーを最小限に抑えるために、重複するまたは少なくとも部分的に重複するカップリングされたシークエンシングリードペアを比較して、バリアントを検証することができる。バリアントを検証するために使用される複数のカップリングされたシークエンシングリードペアは、異なる始点（例えば、異なる第１の領域の始点、異なる第２の領域の始点、および／もしくは異なる第３の領域の始点）を含むことができ、または異なる第２の領域のフロー順序を使用して生成されることもある。

【0199】

目的の試験バリアントを選択することができ、複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードペアが解析されて、カップリングされたシークエンシングリードペアの中の試験バリアントのステータス（例えば、バリアントが存在するのか、または非存在であるのか）が判定される。重複するカップリングされたシークエンシングリードペアは、試験バリアントの遺伝子座に対応する遺伝子座を含む。一部の実施形態では、試験バリアントは、カップリングされたシークエンシングリードペアの少なくとも一部分の第１の領域内にある。一部の実施形態では、試験バリアントは、カップリングされたシークエンシングリードペアの少なくとも一部分の第２の領域内にある。一部の実施形態では、試験バリアントは、カップリングされたシークエンシングリードペアの少なくとも一部分の第３の領域内にある。

【0200】

試験バリアントが遺伝子座に存在するのかまたは非存在であるのかに関するコールを行なうための許容度閾値を選択することができる。例えば、所定の閾値が試験バリアントを同定するよりも、上記複数におけるカップリングされたシークエンシングリードペアが試験バリアントを陽性同定する場合、試験バリアントが陽性コールされる。この閾値は、リスク許容度により所望通りに設定することができる。例えば、許容度閾値は、試験バリアントを同定するカップリングされたシークエンシングリードペアの６０％であるかもしくはそれより高い、７０％であるかもしくはそれより高い、８０％であるかもしくはそれより高い、９０％であるかもしくはそれより高い、または９５％であるかもしくはそれより高いことがある。

【0201】

図１７は、試験バリアントのステータスを決定するためのカップリングされたシークエンシングリードペアの比較についての例示的概略図を示す。複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードペア１４０２が参照配列１４０４とアラインメントされている。遺伝子座１４０６において、５つの重複するカップリングされたシークエンシングリードペアのうちの４つにより、これらのカップリングされたシークエンシングリードペアの１つでは同定されないバリアントの同定が可能であった。具体的には、カップリングされたシークエンシングリードペア１４０８、１４１０、１４１４および１４１６は、それぞれ、遺伝子座１４１８、１４２０、１４２４および１４２６において同定されたバリアントを含む。各々のカップリングされたシークエンシングリードペアにおけるバリアントの遺伝子座は、参照配列１４０４と遺伝子座１４０６でアラインする。カップリングされたシークエンシングリードペア１４１２は、遺伝子座１４２２では（例えば、シークエンシングリードエラーに起因して、またはカップリングされたシークエンシングリードペア１４１２を生成するために使用された、第２の領域に伴うバリアントのコンテキスト、およびフロー順序のため）バリアントを同定しなかった。
コンセンサス配列の構築または検証

【0202】

本明細書に記載される方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して、カップリングされたシークエンシングリードペアをアセンブルすることにより１つまたは複数のコンセンサス配列を生成することができる。コンセンサス配列をアセンブルするためにペアエンドシークエンシングがこれまで使用されてきたが、ポリヌクレオチドのシークエンシングされた末端間の領域について入手可能な情報が限られていることから、誤ってアラインメントされる配列を頻繁に伴う、より低い品質のコンセンサス配列が生じることになる。例えば、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、＿およびＺｅｒｂｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｌｖｅｔ： Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｕｓｉｎｇ ｄｅ Ｂｒｕｉｎｎ ｇｒａｐｈｓ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． １８， ｐｐ． ８２１－８２０ （２００８）を参照されたい。本明細書に記載される方法は、シークエンシングされた第１の領域とシークエンシングされた第３の領域の間のシークエンシングされなかった第２の領域から、実質的により多くの情報を抽出することを可能にする。この追加情報がより堅牢かつ正確なコンセンサス配列を可能にする。

【0203】

一例では、１つまたは複数のコンセンサス配列は、カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す距離情報を使用してアセンブルされる。この距離情報は、本明細書で説明されるように決定することができる。一例では、距離情報は、第２の領域のフロー順序（または第２の領域のフロー順序に関連する情報）および第２の領域における塩基の確率分布を使用して決定される。第２の領域における塩基の確率分布は、例えば、ゲノム全体にわたっての塩基の仮定分布であることがあり、または第１の領域もしくは第３の領域のマッピングされた遺伝子座に基づく、より局所的な確率であることもある。第２の領域のフロー順序に関連する情報は、例えば、第２の領域を通してプライマーを伸長するために同時に使用されるヌクレオチド塩基の異なるタイプの数であり得る。例として、第２の領域内のプライマーを伸長するために反復サイクルで３塩基フローステップを使用して（例えば、各サイクルステップが３つの他の塩基を含む、（非Ａ）－（非Ｃ）－（非Ｔ）－（非Ｇ）のサイクルステップを使用して）、および第２の領域における塩基の分布を全体としてゲノムとほぼ同じと仮定して、プライマーは、サイクルにおけるステップごとにおおよそ４．７塩基ずつ伸長されると予想される。したがって、第２の領域の長さは、第２の領域のフロー順序でのステップの数の４．７倍と概算することができる。

【0204】

一部の実施形態では、距離情報は、第２の領域についての予想参照シークエンシングデータから導出される。本明細書中で論じられるように、第２の領域についての予想参照シークエンシングデータを、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して決定することができる。ポリヌクレオチドの第１または第３の領域が参照配列にマッピングされると、予想配列長を含む、予想配列情報が決定され、これにより、ポリヌクレオチドの第１の領域と第３の領域の間の長さが得られる。

【0205】

カップリングされたシークエンシングリードペアを使用して、１つもしくは複数のコンセンサス配列、または１つもしくは複数のコンセンサス配列の一部分を検証することができる。コンセンサス配列アセンブリーの結果として、利用可能なデータが得られる可能性のある複数の配列アセンブリーを得ることができるが、旧来のペアエンドシークエンシングデータを使用してこれらの可能な配列のどれが正しいコンセンサス配列であるのかを選択することは、困難であり得る。カップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域から追加情報を抽出できるため、本明細書に記載される方法を使用するとコンセンサス配列検証がより頑強になる。コンセンサス配列を検証するために、第１の領域またはその一部分（または第３の領域もしくはその一部分）を選択された参照配列にマッピングすることができる。他の領域またはその一部分についての予想シークエンシングデータ（すなわち、第１の領域もしくはその一部分がマッピングされる場合、第３の領域もしくはその一部分、または第３の領域もしくはその一部分がマッピングされる場合、第１の領域もしくはその一部分）。予想シークエンシンは、例えば、本明細書で説明されるように、決定することができる。一例では、予想シークエンシングデータは、第２の領域のフロー順序、選択されたコンセンサス配列、および第１の領域のフロー順序（予想シークエンシングデータが第１の領域もしくはその一部分についてのものである場合）または第３の領域のフロー順序（予想シークエンシングデータが第３の領域もしくはその一部分についてのものである場合）を使用して、決定される。次いで、予想シークエンシングデータを、対応する領域におけるカップリングされたシークエンシングリードペアについての生成シークエンシングデータと比較して、コンセンサス配列部分を検証することができる。生成シークエンシングデータにマッチする予想シークエンシングデータは、コンセンサス配列部分が正しくアセンブルされることを示す。生成シークエンシングデータにマッチしない予想シークエンシングデータは、コンセンサス配列部分が誤ってアセンブルされることを示す。

【0206】

一部の実施形態では、１つより多くのコンセンサス配列が構築または検証される。例えば、ある特定の生物は、倍数体生物（例えば、健常なヒトは、二倍体生物であり、各染色体（ヒト男性における性染色体を除く）の２コピーを有する。１つまたは複数の染色体コピーに対応するコンセンサス配列をアセンブルすることができる（例えば、ヒト配列における染色体ペアごとにコンセンサス配列をアセンブルしてもよい）。カップリングされたシークエンシングリードペアを倍数体生物の対応する染色体に割り当てるプロセスは、ハプロタイプ判定と呼ばれることがある。本明細書に記載される方法を使用して、ハプロタイプ判定の精度または効率を向上させることができる。例えば、本明細書に記載されるカップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域からの情報を使用して、試験バリアントを第１の染色体または第２の染色体（または倍数体生物からの他のさらなる染色体）と関連付けることができる。
システム、デバイスおよびレポート

【0207】

図１～１７に関連して説明されたものを含む、上記で説明された操作は、図１８に描かれている構成要素により、必要に応じて実行される。どのようにすれば他のプロセス、例えば、上記で説明された操作のすべてまたは一部の組合せまたは部分的組合せを図１８に描かれている構成要素に基づいて実行することができるのかは、当業者には明らかであろう。どのようにすれば本明細書に記載される方法、技法、システムおよびデバイスを互いに、全体として、または部分的に組み合わせることができるのかもまた、それらの方法、技法、システムおよび／またはデバイスが、図１８に描かれている構成要素により実行されるか否か、および／または提供されるか否かを問わず、当業者には明らかであろう。

【0208】

図１８は、一実施形態に従ってコンピュータデバイスの例を説明する。デバイス１８００は、ネットワークに接続されたホストコンピュータであることがある。デバイス１８００は、クライアントコンピュータまたはサーバーであることもある。図１８に示されているように、デバイス１８００は、任意の好適なタイプのマイクロプロセッサーベースのデバイス、例えば、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバー、またはハンドヘルドコンピュータデバイス（携帯用電子デバイス）、例えば電話機もしくはタブレットであり得る。デバイスは、例えば、プロセッサー１８１０、入力デバイス１８２０、出力デバイス１８３０、記憶装置１８４０、および通信デバイス１８６０のうちの１つまたは複数を含み得る。入力デバイス１８２０および出力デバイス１８３０は、一般に、上記のものに対応することができ、コンピュータと接続可能または一体型のどちらかであり得る。

【0209】

入力デバイス１８２０は、入力を行なう任意の好適なデバイス、例えば、タッチスクリーン、キーボードもしくはキーパッド、マウス、または音声認識デバイスであり得る。出力デバイス１８３０は、出力を行なう任意の好適なデバイス、例えば、タッチパネル、触覚デバイス、またはスピーカーであり得る。

【0210】

記憶装置１８４０は、ＲＡＭ、キャッシュメモリー、ハードドライブまたは脱着式保存ディスクを含む、電子、磁気または光メモリーなどの、記憶域を提供する任意の好適なデバイスであり得る。通信デバイス１８６０は、ネットワークを用いてシグナルを送信および受信することができる任意の好適なデバイス、例えば、ネットワークインターフェースチップまたはデバイスを含み得る。コンピュータの構成要素を、任意の好適な方法で、例えば物理的バスを介してまたは無線で、接続することができる。

【0211】

記憶装置１８４０に記憶され、プロセッサー１８１０により実行され得る、ソフトウェア１８５０は、例えば、本開示の機能性を具現化する（例えば、上記のデバイスで具現化されるような）プログラミングを含むことができる。

【0212】

上記のものなどの命令実行システム、装置もしくはデバイスで使用するための、またはそれと接続している、任意の非一過性コンピュータ可読記憶媒体であって、ソフトウェアに関連する命令を命令実行システム、装置またはデバイスから取り出し、命令を実行することができる可読記憶媒体の中に、ソフトウェア１８５０を記憶および／またはトランスポートすることもできる。本開示に関して、コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行システム、装置もしくはデバイスで使用するための、またはそれと接続している、プログラミングを収容または記憶することができる任意の媒体、例えば、記憶装置１８４０であり得る。

【0213】

上記のものなどの命令実行システム、装置もしくはデバイスで使用するための、またはそれと接続している、任意のトランスポート媒体であって、ソフトウェアに関連する命令を命令実行システム、装置またはデバイスから取り出し、命令を実行することができるトランスポート媒体の中に、ソフトウェア１８５０を伝播することもできる。本開示に関して、トランスポート媒体は、命令実行システム、装置もしくはデバイスで使用するための、またはそれと接続している、プログラミングを伝える、伝播するまたはトランスポートすることができる、任意の媒体であり得る。トランスポート可読媒体としては、電子、磁気、光、電磁または赤外有線もしくは無線伝播媒体を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0214】

デバイス１８００をネットワークに接続することができ、これは任意の好適なタイプの相互接続通信システムであり得る。ネットワークは、任意の好適な通信プロトコルを実行することができ、ネットワークを任意の好適なセキュリティープロトコルにより保護することができる。ネットワークは、ネットワークシグナルの通信および受信を実行することができる任意の好適な構成のネットワークリンク、例えば、無線ネットワーク接続、Ｔ１もしくはＴ３ライン、ケーブルネットワーク、ＤＳＬ、または電話線を含むことができる。

【0215】

デバイス１８００は、ネットワークでの操作に好適な任意の操作システムを実装することができる。ソフトウェア１８５０を任意の好適なプログラミング言語、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）またはＰｙｔｈｏｎで書くことができる。様々な実施形態では、本開示の機能性を具現化するアプリケーションソフトウェアを、例えば、異なる配置で、例えばクライアント／サーバー構成で、またはウェブベースのアプリケーションもしくはウェブサービスのようなウェブブラウザによって、展開することができる。

【0216】

本明細書に記載される方法は、解析方法を使用して決定された情報を報告するステップ、および／または解析方法を使用して決定された情報を含むレポートを生成するステップを、必要に応じてさらに含む。例えば、一部の実施形態では、方法は、対象に由来する（例えば、対象のゲノム内の）ポリヌクレオチドにおけるバリアントの同定に関する＿＿を報告するステップまたはそれを含むレポートを生成するステップをさらに含む。報告される情報、またはレポートの中の情報は、例えば、参照配列にマッピングされたカップリングされたシークエンシングリードペアの遺伝子座、検出されたバリアント（例えば、検出された構造バリアントまたは検出されたＳＮＰ）、１つもしくは複数のアセンブルされたコンセンサス配列、および／または１つもしくは複数のアセンブルされたコンセンサス配列についての検証統計量に関連し得る。受信者、例えば、臨床医、対象または研究者に、レポートを配布することができ、または情報を報告することができる。
例示的実施形態

【0217】

以下の実施形態は、例示的なものであり、請求項記載の本発明の範囲を限定するように意図されたものではない。

【0218】

実施形態１．カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法であって、
（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｂ）ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で伸長されたプライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、（ｉ）プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）第２の領域を通したプライマーの伸長が、ステップ（ｂ）におけるプライマーの伸長よりも速く進行する、ステップ；および
（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ
を含む方法。

【0219】

実施形態２．第２の領域を通したプライマーの伸長が、第１の領域を通したプライマーの伸長より速く進行する、実施形態１の方法。

【0220】

実施形態３．第１の領域のシークエンシングデータを第３のシークエンシングデータと関連付けるステップをさらに含む、実施形態１または２の方法。

【0221】

実施形態４．カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法であって、
（ａ）プライマーをポリヌクレオチドの第１の領域とハイブリダイズしてハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｂ）プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第２の領域を通して伸長するステップであって、（ｉ）プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される、または（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される、ステップ；および
（ｃ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｂ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ
を含む方法。

【0222】

実施形態５．第１の領域が、プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む、実施形態４の方法。

【0223】

実施形態６．プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される、実施形態１から５のいずれか１つの方法。

【0224】

実施形態７．第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドの少なくとも一部分が、非標識ヌクレオチドである、実施形態１から６のいずれか１つの方法。

【0225】

実施形態８．第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドである、実施形態１から６のいずれか１つの方法。

【0226】

実施形態９．少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される、実施形態１から８のいずれか１つの方法。

【0227】

実施形態１０．第２の領域のフロー順序が、５つまたはそれより多くのヌクレオチドフローを含む、実施形態１から９のいずれか１つの方法。

【0228】

実施形態１１．ヌクレオチドフローの各々が、単一のヌクレオチド塩基を含む、実施形態１０の方法。

【0229】

実施形態１２．第２の領域のフロー順序が、２カ所より多くのフロー位置において、ランダムシークエンシング開始位置の５％またはそれより多くにおける可能なＳＮＰパーミュテーションの５０％またはそれより多くについてのシグナル変化を誘導する、実施形態１０または１１の方法。

【0230】

実施形態１３．第２の領域のフロー順序が、１フロー当り０．６のまたはそれを超える塩基組込みの効率を有する、実施形態１０から１２のいずれか１つの方法。

【0231】

実施形態１４．参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して第２の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含む、実施形態１から１３のいずれか１つの方法。

【0232】

実施形態１５．プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長され、方法が、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列を使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含む、実施形態１から１４のいずれか１つの方法。

【0233】

実施形態１６．第３の領域のフロー順序が、５つまたはそれより多くのヌクレオチドフローを含む、実施形態１５の方法。

【0234】

実施形態１７．ヌクレオチドフローの各々が、単一のヌクレオチド塩基を含む、実施形態１６の方法。

【0235】

実施形態１８．第３の領域のフロー順序が、２カ所より多くのフロー位置において、ランダムシークエンシング開始位置の５％またはそれより多くにおける可能なＳＮＰパーミュテーションの５０％またはそれより多くについてのシグナル変化を誘導する、実施形態１６または１７の方法。

【0236】

実施形態１９．第３の領域のフロー順序が、１フロー当り０．６のまたはそれを超える塩基組込みの効率を有する、実施形態１６から１８のいずれか１つの方法。

【0237】

実施形態２０．プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長され、方法が、第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータが、第３の領域について生成される同じまたは異なるシークエンシングデータである、実施形態１から１９のいずれか１つの方法。

【0238】

実施形態２１．第２の領域または第３の領域についての予想参照データが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、実施形態１４から２０のいずれか１つの方法。

【0239】

実施形態２２．第２の領域のフロー順序、および第２の領域についての第２の参照配列を使用して、第２の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、第２の参照配列が、試験バリアントを含む、実施形態１４から２１のいずれか１つの方法。

【0240】

実施形態２３．プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長され、方法が、第２の領域についての第２の参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列を使用して、第３の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含む、実施形態２２の方法。

【0241】

実施形態２４．プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長され、方法が、第２の領域についての第２の参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを使用して、第３の領域についての予想試験バリアントシークエンシングデータを決定するステップをさらに含み、第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータが、第３の領域について生成される同じまたは異なるシークエンシングデータである、実施形態２２の方法。

【0242】

実施形態２５．第２の領域または第３の領域についての予想参照シークエンシングデータが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、実施形態２２から２４のいずれか１つの方法。

【0243】

実施形態２６．カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法であって、
実施形態１から２５のいずれか１つの方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；および
マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分、またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分を、第２の領域の長さを示す距離情報を使用して、参照配列にマッピングするステップ
を含む、方法。

【0244】

実施形態２７．構造バリアントを検出する方法であって、
実施形態１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；
マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分についての参照配列内の予想遺伝子座を、第２の領域の長さを示す距離情報を使用して決定するステップ；
参照配列に基づいて予想遺伝子座における配列についての予想シークエンシングデータを決定するステップ；および
マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分を予想シークエンシングデータと比較することにより構造バリアントを検出するステップであって、マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分と予想シークエンシングデータとの差が、構造バリアントを示す、ステップ
を含む方法。

【0245】

実施形態２８．構造バリアントを検出する方法であって、
実施形態１から２５のいずれか１つの方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分または第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップを含み、マッピングされなかった第１の領域、またはマッピングされなかった第３の領域が、参照配列内にマッピング不可能である、方法。

【0246】

実施形態２９．第２の領域の長さを示す予想距離情報に基づいて参照配列内の構造バリアントの遺伝子座を決定するステップをさらに含む、実施形態２８の方法。

【0247】

実施形態３０．マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分、またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分が、参照配列と比較して挿入の中に存在する、実施形態２７から２９のいずれか１つの方法。

【0248】

実施形態３１．マッピングされなかった第１の領域もしくはその一部分、またはマッピングされなかった第３の領域もしくはその一部分が、参照配列と比較して挿入の始点または終点にまたがる、実施形態２７から２９のいずれか１つの方法。

【0249】

実施形態３２．構造バリアントを検出する方法であって、
実施形態１から２５のいずれか１つの方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分および第３の領域もしくはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；
マッピングされた第１の領域とマッピングされた第３の領域の間のマッピング距離情報を決定するステップ；および
マッピング距離情報を第２の領域の予想距離情報と比較することにより構造バリアントを検出するステップであって、マッピング距離情報と予想距離情報との差が構造バリアントを示す、ステップ
を含む方法。

【0250】

実施形態３３．構造バリアントが、染色体融合、逆位、挿入、または欠失である、実施形態２７から３２のいずれか１つの方法。

【0251】

実施形態３４．バリアントが、第２の領域内の挿入または欠失である、実施形態２７から３２のいずれか１つの方法。

【0252】

実施形態３５．距離情報が、第２の領域のフロー順序に関連する情報および第２の領域における塩基の確率分布を使用して決定される、実施形態２６から３２のいずれか１つの方法。

【0253】

実施形態３６．第２の領域のフロー順序に関連する情報が、第２の領域を通してプライマーを伸長するために同時に使用されるヌクレオチド塩基の異なるタイプの数である、実施形態３５の方法。

【0254】

実施形態３７．第２の領域における塩基の確率分布が、ゲノム内の塩基の分布から決定される、実施形態３５または３６の方法。

【0255】

実施形態３８．距離情報が、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して決定された第２の領域についての予想シークエンシングデータから導出される、実施形態２６～３５のいずれか１つの方法。

【0256】

実施形態３９．予想シークエンシングデータが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、実施形態３８の方法。

【0257】

実施形態４０．カップリングされたシークエンシングリードペアを参照配列にマッピングする方法であって、
実施形態１から２５のいずれか１つの方法に従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域もしくはその一部分および第３の領域もしくはその一部分を、参照配列の第１の位置および第２の位置を含む２つまたはそれより多くの異なる位置ペアにマッピングするステップ；および
第２の領域の長さを示す第１の距離情報、および２つまたはそれより多くの位置ペアについての第１の位置と第２の位置の間の距離を示す第２の距離情報を使用して、正しい位置を選択するステップ
を含む方法。

【0258】

実施形態４１．距離情報が、第２の領域のフロー順序に関連する情報および第２の領域における塩基の確率分布を使用して決定される、実施形態４０の方法。

【0259】

実施形態４２．第２の領域のフロー順序に関連する情報が、第２の領域を通してプライマーを伸長するために同時に使用されるヌクレオチド塩基の異なるタイプの数である、実施形態４１の方法。

【0260】

実施形態４３．第２の領域における塩基の確率分布が、ゲノム内の塩基の分布から決定される、実施形態４１または４２の方法。

【0261】

実施形態４４．距離情報が、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して決定された第２の領域についての予想シークエンシングデータから導出される、実施形態４０の方法。

【0262】

実施形態４５．予想参照シークエンシングデータが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、実施形態４４の方法。

【0263】

実施形態４６．伸長されたプライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長される、実施形態１から２５のいずれか１つに従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの２つのシークエンシングされた領域間のバリアントを検出する方法であって、
第１の領域またはその一部分を参照配列にマッピングするステップ；
（１）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域についての参照配列、または（２）第２の領域についての参照配列、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータを使用して、第３の領域またはその一部分についての予想シークエンシングデータを決定するステップであって、第３の領域の配列に関連する生成配列データが、第３の領域について生成された同じまたは異なる配列データである、ステップ；および
第３の領域についての予想シークエンシングデータを第３の領域の配列に関連する生成シークエンシングデータと比較することによりバリアントの存在を検出するステップ
を含む方法。

【0264】

実施形態４７．バリアントが、構造バリアントである、実施形態４６の方法。

【0265】

実施形態４８．構造バリアントが、染色体融合、逆位、挿入、または欠失である、実施形態４７の方法。

【0266】

実施形態４９．バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）である、実施形態４６の方法。

【0267】

実施形態５０．試験バリアントを検出するために使用され、参照配列が試験バリアントを含む、実施形態４６から４９のいずれか１つの方法。

【0268】

実施形態５１．試験バリアントが、第２のポリヌクレオチド中の試験バリアントを同定することにより選択される、実施形態５０の方法。

【0269】

実施形態５２．検出された試験バリアントとポリヌクレオチドの第１の領域または第３の領域におけるシークエンシングされた対立遺伝子とを関連付けるステップを含む、実施形態５０または５１の方法。

【0270】

実施形態５３．ポリヌクレオチドのシークエンシングされなかった領域における塩基トランスバージョンの存在を検出するためのカップリングされたシークエンシングリードペアを生成する方法であって、
（ａ）ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｂ）ポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）において伸長されたプライマーを、第２の領域を通して、（１）シトシンおよびチミンと（２）アデニンおよびグアニンとの交互ヌクレオチドペアを含むフロー順序を使用してさらに伸長するステップ；および
（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ
を含む方法。

【0271】

実施形態５４．カップリングされたシークエンシングリードペアをポリヌクレオチドから生成する方法であって、
（ａ）プライマーをポリヌクレオチドの第１の領域とハイブリダイズしてハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｂ）プライマーを、第２の領域を通して、（１）シトシンおよびチミンと（２）アデニンおよびグアニンとの交互ヌクレオチドペアを含むフロー順序を使用して伸長するステップ；および
（ｃ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してステップ（ｂ）で伸長されたプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ
を含む方法。

【0272】

実施形態５５．第１の領域が、プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む、実施形態５４の方法。

【0273】

実施形態５６．プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、第２の領域を通して伸長される、実施形態５４または５５の方法。

【0274】

実施形態５７．ポリヌクレオチドのシークエンシングされなかった領域における塩基トランスバージョンの存在を検出する方法であって、
プライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第３の領域を通して伸長される、実施形態５４から５６のいずれか１つに従って生成された、カップリングされたシークエンシングリードペアの第１の領域またはその一部分および第３の領域またはその一部分を、参照配列にマッピングするステップ；
第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および参照配列を使用して、第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定するステップ；および
第３の領域についての予想シークエンシングデータと第３の領域についての生成シークエンシングデータとの差に基づいて塩基トランスバージョンの存在を検出するステップ
を含む方法。

【0275】

実施形態５８．第３の領域についての予想シークエンシングデータが、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、第２の領域についての参照配列、および第３の領域についての参照配列を使用して決定される、実施形態５７の方法。

【0276】

実施形態５９．第３の領域についての予想シークエンシングデータが、第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、第２の領域についての参照配列、および第３の領域の配列に関連する生成配列データを使用して決定され、第３の領域の配列に関連する生成配列データが、第３の領域について生成された同じまたは異なる配列データである、実施形態５７の方法。

【0277】

実施形態６０．第３の領域についての予想シークエンシングデータが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、実施形態５７から５９のいずれか１つの方法。

【0278】

実施形態６１．１つまたは複数のコンセンサス配列を生成する方法であって、実施形態１から２５のいずれか１つに従って生成された複数のカップリングされたシークエンシングリードペアをアセンブルするステップを含む、方法。

【0279】

実施形態６２．１つまたは複数のコンセンサス配列が、複数のカップリングされたシークエンシングリードペアの第２の領域の長さを示す距離情報を使用してアセンブルされる、実施形態６１の方法。

【0280】

実施形態６３．距離情報が、第２の領域のフロー順序に関連する情報および第２の領域における塩基の確率分布を使用して決定される、実施形態６１の方法。

【0281】

実施形態６４．第２の領域のフロー順序に関連する情報が、第３の領域を通してプライマーを伸長するために同時に使用されるヌクレオチド塩基の異なるタイプの数である、実施形態６３の方法。

【0282】

実施形態６５．第２の領域における塩基の確率分布が、ゲノム内の塩基の分布から決定される、実施形態６３または６４の方法。

【0283】

実施形態６６．距離情報が、参照配列および第２の領域のフロー順序を使用して決定された第２の領域についての予想参照シークエンシングデータから導出される、実施形態６２の方法。

【0284】

実施形態６７．予想参照シークエンシングデータが、バイナリまたは非バイナリフローグラムを含む、実施形態６６の方法。

【0285】

実施形態６８．１つまたは複数のコンセンサス配列から選択されたコンセンサス配列の一部分を、選択されたコンセンサス配列の一部分に関連する、選択された、カップリングされたシークエンシングリードを使用して検証するステップをさらに含み、選択された、カップリングされたシークエンシングリードを生成する際に第３の領域を通して伸長されるプライマーが、第３の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して伸長され、検証するステップが、
第２の領域のフロー順序、第３の領域のフロー順序、および選択されたコンセンサス配列の一部分を使用して、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの第３の領域についての予想シークエンシングデータを決定すること；および
選択された、カップリングされたシークエンシングリードの第３の領域についての予想シークエンシングデータを第３の領域の生成シークエンシングデータと比較することにより、選択されたコンセンサス配列の一部分を検証すること
を含む、実施形態６１から６７のいずれか１つの方法。

【0286】

実施形態６９．試験バリアントのステータスを検証する方法であって、
実施形態１から２５のいずれか１つに従って生成された複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードペアに亘るバリアントのステータスを比較するステップであって、複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードペアが、試験バリアントの遺伝子座に対応する遺伝子座を含む、ステップ；
比較に基づいてバリアントのステータスを検証するステップ
を含む方法。

【0287】

実施形態７０．選択された、カップリングされたシークエンシングリードペアの、第１の領域または第３の領域が、複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードのうちの他のカップリングされたシークエンシングリードの少なくとも一部分の第２の領域と重複する、実施形態６９の方法。

【0288】

実施形態７１．選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、バリアントステータスが、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、第１の領域または第３の領域におけるバリアントを示す、実施形態６９または７０の方法。

【0289】

実施形態７２．選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、第２の領域が、複数の重複するカップリングされたシークエンシングリードのうちの他のカップリングされたシークエンシングリードの少なくとも一部分の第２の領域と重複する、実施形態７１の方法。

【0290】

実施形態７３．選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、バリアントステータスが、選択された、カップリングされたシークエンシングリードの、第２の領域におけるバリアントを示す、実施形態７１または７２の方法。

【0291】

実施形態７４．試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出するための方法であって、
実施形態１から２５のいずれか１つのカップリングされたシークエンシングリードペアを生成するステップ；
ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；および
ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在または非存在をコールするステップ
を含む方法。

【0292】

実施形態７５．
ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域についての予想シークエンシングデータと比較するステップが、ポリヌクレオチドの第３の領域について生成されたシークエンシングデータがポリヌクレオチドの第３の領域についての予想シークエンシングデータにマッチする尤度を示すマッチスコアを決定すること；および
決定されたマッチスコアを使用してポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在または非存在をコールすること
を含む、実施形態７４の方法。

【0293】

実施形態７６．ポリヌクレオチドの第３の領域についての予想シークエンシングデータが、ポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでシークエンシングすることにより得られる、実施形態７４または７５の方法。

【0294】

実施形態７７．第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータ、または第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータが、複数のフロー位置の中の各フロー位置に取り込まれた塩基の数を示す塩基カウントを表すフローシグナルを含む、実施形態１から７６のいずれか１つの方法。

【0295】

実施形態７８．フローシグナルが、各フロー位置における少なくとも１つの塩基カウントについての塩基カウント尤度を示す統計パラメーターを含む、実施形態７７の方法。

【0296】

実施形態７９．フローシグナルが、各フロー位置における複数の塩基カウントについての塩基カウント尤度を示す統計パラメーターを含む、実施形態７８の方法。

【0297】

実施形態８０．
第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータが、複数のフロー位置の中の各フロー位置に取り込まれた塩基の数を示す塩基カウントを表すフローシグナルを含み、フローシグナルが、複数の塩基カウントについての塩基カウント尤度を示す統計パラメーターを含み；
方法が、シークエンシングデータ中の各フロー位置における統計パラメーターであって、そのフロー位置における予想配列の塩基カウントと一致する統計パラメーターを選択するステップ、およびシークエンシングデータセットが予想配列にマッチする尤度を示すマッチスコアを決定するステップをさらに含む、
実施形態７５または７６の方法。

【0298】

実施形態８１．マッチスコアが、シークエンシングデータ内のフロー位置にわたっての選択された統計パラメーターの組み合わされた値である、実施形態８０の方法。

【0299】

実施形態８２．フローサイクル順序が、同じ順序で反復される４つの別々のフローを含む、実施形態１から８１のいずれか１つの方法。

【0300】

実施形態８３．フローサイクル順序が、５つまたはそれより多くの別々のフローを含む、実施形態１から８１のいずれか１つの方法。

【0301】

実施形態８４．カップリングされたシークエンシングリードペアを生成するステップが、
プライマーを、第４の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用して第４の領域を通して伸長すること、ここで、（ｉ）プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、第４の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第４の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）第４の領域を通したプライマーの伸長が、第１の領域または第３の領域を通したプライマーの伸長よりも速く進行する；および
ポリヌクレオチドの第５の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用する第４を通して伸長されたプライマーのさらなる伸長、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在の検出により、生成すること
を含む、実施形態１から８３のいずれか１つの方法。

【0302】

実施形態８５．第５の領域のシークエンシングデータを第１の領域のシークエンシングデータまたは第３の領域のシークエンシングデータと関連付けるステップをさらに含む、実施形態８４の方法。

【0303】

実施形態８６．ポリヌクレオチドが、ローリングサークル増幅を使用して増幅される、実施形態１から８５のいずれか１つの方法。

【0304】

実施形態８７．試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出する方法であって、
（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用してポリヌクレオチドを増幅させて、ポリヌクレオチドの第１のコピーとポリヌクレオチドの第２のコピーとを少なくとも含むＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドを生成するステップ；
（ｂ）ＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｃ）ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｄ）プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してさらに伸長するステップであって、（ｉ）プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長されるか、（ｉｉ）少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用されるか、または（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通したプライマーの伸長が、第１の領域を通したプライマーの伸長よりも速く進行する、ステップ；
（ｅ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｆ）ポリヌクレオチドの第３の領域について生成されたシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；
（ｇ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップ；
（ｈ）ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；および
（ｉ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントのアイデンティティーをコールするステップ
を含む方法。

【0305】

実施形態８８．ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通したプライマーの伸長が、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第１の領域を通したプライマーの伸長よりも速く進行する、実施形態８７の方法。

【0306】

実施形態８９．試験試料中の短い遺伝子バリアントを検出する方法であって、
（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用してポリヌクレオチドを増幅させて、ポリヌクレオチドの第１のコピーとポリヌクレオチドの第２のコピーとを少なくとも含むＲＣＡ増幅ポリヌクレオチドを生成するステップ；
（ｂ）プライマーをポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第１の領域にハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成するステップ；
（ｃ）プライマーを、第２の領域のフロー順序で提供されるヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長するステップであって、（ｉ）プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在もしくは非存在を検出することなく、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長される、ステップ；
（ｄ）ポリヌクレオチドの第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーをさらに伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；
（ｅ）ポリヌクレオチドの第３の領域について生成されたシークエンシングデータをポリヌクレオチドの第３の領域の予想配列についての予想シークエンシングデータと比較するステップ；
（ｆ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップ；
（ｇ）ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長すること、および取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより、生成するステップ；および
（ｈ）ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントのアイデンティティーをコールするステップ
を含む方法。

【0307】

実施形態９０．第１の領域が、プライマーの標的にされる天然に存在する配列を含む、実施形態８９の方法。

【0308】

実施形態９１．ポリヌクレオチドの第２のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域の配列に関連するシークエンシングデータが、ポリヌクレオチドの第２の領域における短い遺伝子バリアントの存在をコールするステップに基づいて動的に生成される、実施形態８７から９０のいずれか１つの方法。

【0309】

実施形態９２．プライマーが、伸長プライマーに取り込まれたヌクレオチドの標識の存在または非存在を検出することなく、ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通して伸長される、実施形態８７から９１のいずれか１つの方法。

【0310】

実施形態９３．ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドの少なくとも一部分が、非標識ヌクレオチドである、実施形態８７から９２のいずれか１つの方法。

【0311】

実施形態９４．ポリヌクレオチドの第１のコピーの中のポリヌクレオチドの第２の領域を通してプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドである、実施形態８７から９２のいずれか１つの方法。

【0312】

実施形態９５．少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される、実施形態８７から９４のいずれか１つの方法。

【0313】

実施形態９６．３つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、第２の領域のフロー順序の少なくとも１ステップで使用される、実施形態８７から９５のいずれか１つの方法。

【0314】

実施形態９７．シークエンシングクラスター内のシークエンシングプライマーを同期化する方法であって、
（ａ）プライマーをシークエンシングクラスター内のポリヌクレオチドコピーとハイブリダイズするステップ；
（ｂ）プライマーを、第１の領域のフローサイクルに従って標識ヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドコピーの第１の領域を通して伸長するステップ；
（ｃ）プライマーを、１つまたは複数の再位相化フローを使用してポリヌクレオチドコピーの第２の領域を通して伸長するステップであって、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドの混合物が、１つまたは複数の再位相化フローの少なくとも１つにおいて使用される、ステップ；および
（ｄ）プライマーを、第３の領域のフローサイクルに従って標識ヌクレオチドを使用してポリヌクレオチドコピーの第３の領域を通して伸長するステップ
を含む方法。

【0315】

実施形態９８．３つの異なるタイプのヌクレオチド塩基の混合物が、１つまたは複数の再位相化フローのうちの少なくとも１つにおいて使用される、実施形態９７の方法。

【0316】

実施形態９９．１つまたは複数の再位相化フローが、４つまたはそれより多くのフローステップを含む、実施形態９７または９８の方法。

【0317】

実施形態１００．１つまたは複数の再位相フローが、任意の順序で：
（ｉ）Ａ、ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＴヌクレオチドを含まない混合物を含む第１のフロー；
（ｉｉ）Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドを含むがＡヌクレオチドを含まない混合物を含む第２のフロー；
（ｉｉｉ）Ｔ、ＡおよびＧヌクレオチドを含むがＣヌクレオチドを含まない混合物を含む第３のフロー；および
（ｉｖ）Ｔ、ＡおよびＣヌクレオチドを含むがＧヌクレオチドを含まない混合物を含む第４のフロー
を含む、実施形態９９の方法。

【0318】

実施形態１０１．第１の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、プライマーを第１の領域を通して伸長しながら取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより生成するステップを含む、実施形態９７から１００のいずれか１つの方法。

【0319】

実施形態１０２．第３の領域の配列に関連するシークエンシングデータを、プライマーを第３の領域を通して伸長しながら取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することにより生成するステップを含む、実施形態９７から１０１のいずれか１つの方法。

【0320】

実施形態１０３．
１または複数台のプロセッサーと、
非一過性記憶媒体であって、
１つまたは複数のカップリングされたシークエンシングリードに関する情報を受信する、および
実施形態２６～５２および５７～８６のいずれか１つの方法を遂行する
ための、１または複数台のプロセッサーにより実行可能な１つまたは複数のプログラムを含む非一過性記憶媒体と
を含むシステム。

【0321】

実施形態１０４．１つまたは複数のカップリングされたシークエンシングリードが、実施形態１～２５、５３～５６、および８７～９６のいずれか１つの方法に従って生成される、実施形態１０３のシステム。

【実施例】

【0322】

本願の例示的実施形態として提供する以下の非限定的実施例を参照することにより、本願をよりよく理解することができる。以下の実施例を、実施形態をより十分に説明するために提示するが、いかなる点においても本願の広い範囲を限定するものと解釈すべきでない。本願のある特定の実施形態を本明細書で示し、説明したが、このような実施形態を単なる例として提供することは明らかであろう。本発明の趣旨および範囲から逸脱しない非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態に当業者なら想到するであろう。本明細書に記載する実施形態の様々な代替形態を、本明細書に記載する方法を実施する際に利用することができることは、理解されるはずである。
（実施例１）

【0323】

高速フォワード領域を含むフローシークエンシング法を使用して、および標準フローシークエンシング法（すなわち、高速フォワード領域を含まないフローシークエンシング法）をさらに使用して、２６２塩基を有する核酸構築物をシークエンシングした。ポリヌクレオチドをアダプター配列にライゲーションしビーズに繋留し、これを増幅しシークエンシング表面と会合させた。シークエンシングプライマーをアダプター配列内のハイブリダイゼーション領域とハイブリダイズし、フローシークエンシング法の開始を可能にした。第１の方法では、単一タイプの蛍光標識された非終結ヌクレオチドの交互フローを使用してシークエンシングプライマーを伸長することにより６２塩基をシークエンシングし、各ステップ後のヌクレオチド組込みを、蛍光検出器を使用して判定した。次の１７７塩基を、各フローが、存在する４つのヌクレオチドのうちの３つを有する、未標識の非終結ヌクレオチドの交互フロー（すなわち「高速フォワード」モード）に曝露して、プライマーを第２の領域を通して伸長させた。「暗」（すなわち、取り込まれたヌクレオチドの検出なし）の第２の領域を通したプライマーの伸長後、別の２３塩基は、単一タイプの蛍光標識された非終結ヌクレオチドのシークエンシングされた交互フローであり、各ステップ後のヌクレオチド組込みを、蛍光検出器を使用して判定した。結果を図１９Ａに示し、この図は、横アクセス上にフローステップ数、および縦アクセス上にシークエンシングシグナル（すなわち、正規化蛍光シグナル）の測度を示す。この方法は、高速フォワードレジメンに従って高品質シークエンシングデータをもたらす。

【0324】

同じ２６２塩基構築物を、介在高速フォワードレジメンを用いずに全面的に標準フローシークエンシング法でシークエンシングした。つまり、全２６２塩基は、単一タイプの蛍光標識された非終結ヌクレオチドのシークエンシングされた交互フローであり、各ステップ後のヌクレオチド組込みを、蛍光検出器を使用して判定した。結果を図１９Ｂに示し、この図は、図を圧縮するために、対応する１７７塩基領域からのデータを含まない。

【0325】

シークエンシング構築物は、高速フォワードフローシークエンシング法を使用すると、標準フローシークエンシング法よりも迅速に前進する。ポリヌクレオチドの両端からのシークエンシングデータを関連付けてカップリングされたシークエンシングリードペアを生成し、解析することができる。
（実施例２）

【0326】

配列番号４内のバリアント（配列番号１の参照配列と比較して塩基位置１５にＣ→Ｇ単一ヌクレオチド多型バリアントがある）の検出をこの実施例で説明する。プライマーを配列番号４の５’末端のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすること、およびフローシークエンシング法を使用してプライマーを伸長することにより、配列番号４についてのカップリングされたシークエンシングリードペアを生成することができる。この実施例では、５サイクルを使用し、サイクル１を使用して、第１の領域を通してプライマーを伸長し、サイクル２およびサイクル３を使用して、第２の領域を通してプライマーを伸長し、サイクル４およびサイクル５を使用して、第３の領域を通してプライマーを伸長する。サイクル１、サイクル４およびサイクル５は、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長し、プライマーへのヌクレオチドの組込みを、サイクルステップを終えるたびに検出する。対照的に、サイクル２およびサイクル３中のプライマーへのヌクレオチドの組込みをスキップすることができる。各サイクルは、４つのステップを有し、サイクル１、４および５が、Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇ標識ヌクレオチドの逐次的な独立した付加を含み、単一塩基タイプを各サイクルステップで付加し、標識ヌクレオチドの組込みを各ステップ後に検出する。サイクル２およびサイクル３を「高速フォワード」モードで実行し、これらのサイクルは、４つのサイクルステップを含み、ステップ１は、Ａヌクレオチドを含まず（すなわち、Ｃ、ＴおよびＧを含み）、ステップ２は、Ｃヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＴおよびＧを含み）、ステップ３は、Ｔヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＣおよびＧを含み）、ステップ４は、Ｇヌクレオチドを含まない（すなわち、Ａ、ＣおよびＴを含む）。ヌクレオチド組込みをサイクル２およびサイクル３の高速フォワードモード中に検出しない。サイクル２および３は、プライマー伸長中に同時に複数の異なるヌクレオチド塩基タイプを含むため、いずれかの所与のステップで単一の塩基タイプしか使用されなかった場合よりも速くプライマーを伸長する。配列番号１（参照配列）および配列番号４（ＳＮＰ配列）についてのフローグラムを表６に示す。シークエンシングデータは、配列番号１の第３の領域（サイクル４およびサイクル５）が３’－ＣＴＧＡＣ－５’（配列番号５）であること、および配列番号４の第３の領域（サイクル４およびサイクル５）が３’－ＣＣＴＧＣ－５’（配列番号７）であることを示す。配列番号１と配列番号４の間のシークエンシングデータ間の差は、第２の領域内のバリアントの存在を示す。

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

（実施例３）

【0327】

配列番号８内のバリアント（これは、配列番号１の参照配列と比較して塩基位置２３の後にＡＴＣ挿入物を含む）の検出をこの実施例で説明する。第２の領域を通しての高速フォワード部分を含むフローシークエンシング法を使用して、配列番号１および配列番号８についてのカップリングされたシークエンシングリードを生成することができる。この実施例では、５サイクルを使用し、サイクル１を使用して、第１の領域を通してプライマーを伸長し、サイクル２およびサイクル３を使用して、第２の領域を通してプライマーを伸長し、サイクル４およびサイクル５を使用して、第３の領域を通してプライマーを伸長する。サイクル１、サイクル４およびサイクル５は、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長し、プライマーへのヌクレオチドの組込みを、サイクルステップを終えるたびに検出する。対照的に、サイクル２およびサイクル３中のプライマーへのヌクレオチドの組込みをスキップすることができる。各サイクルは、４つのステップを有し、サイクル１、４および５は、Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇ標識ヌクレオチドの逐次的な独立した付加を含み、単一塩基タイプを各サイクルステップで付加し、標識ヌクレオチドの組込みを各ステップ後に検出する。サイクル２およびサイクル３を「高速フォワード」モードで実行し、これらのサイクルは、４つのサイクルステップを含み、ステップ１は、Ａヌクレオチドを含まず（すなわち、Ｃ、ＴおよびＧを含み）、ステップ２は、Ｃヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＴおよびＧを含み）、ステップ３は、Ｔヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＣおよびＧを含み）、ステップ４は、Ｇヌクレオチドを含まない（すなわち、Ａ、ＣおよびＴを含む）。ヌクレオチド組込みをサイクル２およびサイクル３の高速フォワードモード中に検出しない。サイクル２および３は、プライマー伸長中に同時に複数の異なるヌクレオチド塩基タイプを含むため、いずれかの所与のステップで単一の塩基タイプしか使用されなかった場合よりも速くプライマーを伸長する。配列番号１（参照配列）および配列番号８についてのフローグラムを表７に示す。シークエンシングデータは、配列番号１の第３の領域（サイクル４およびサイクル５）が３’－ＣＴＧＡＣ－５’（配列番号５）であること、および配列番号８の第３の領域（サイクル４およびサイクル５）が３’－ＡＣ－５’であることを示す。配列番号１と配列番号８の間のシークエンシングデータ間の差は、第２の領域内のバリアントの存在を示す。
（実施例４）

【0328】

配列番号９内のバリアント（これは、配列番号１の参照配列と比較して塩基位置１７の後にＧＣＣＴＧＣＡ（配列番号１３）塩基の欠失を含む）の検出をこの実施例で説明する。第２の領域を通しての高速フォワード部分を含むフローシークエンシング法を使用して、配列番号１および配列番号９についてのカップリングされたシークエンシングリードを生成することができる。この実施例では、５サイクルを使用し、サイクル１を使用して、第１の領域を通してプライマーを伸長し、サイクル２およびサイクル３を使用して、第２の領域を通してプライマーを伸長し、サイクル４およびサイクル５を使用して、第３の領域を通してプライマーを伸長する。サイクル１、サイクル４およびサイクル５は、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長し、プライマーへのヌクレオチドの組込みを、サイクルステップを終えるたびに検出する。対照的に、サイクル２およびサイクル３中のプライマーへのヌクレオチドの組込みをスキップすることができる。各サイクルは、４つのステップを有し、サイクル１、４および５は、Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇ標識ヌクレオチドの逐次的な独立した付加を含み、単一塩基タイプを各サイクルステップで付加し、標識ヌクレオチドの組込みを各ステップ後に検出する。サイクル２およびサイクル３を「高速フォワード」モードで実行し、これらのサイクルは、４つのサイクルステップを含み、ステップ１は、Ａヌクレオチドを含まず（すなわち、Ｃ、ＴおよびＧを含み）、ステップ２は、Ｃヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＴおよびＧを含み）、ステップ３は、Ｔヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＣおよびＧを含み）、ステップ４は、Ｇヌクレオチドを含まない（すなわち、Ａ、ＣおよびＴを含む）。ヌクレオチド組込みをサイクル２およびサイクル３の高速フォワードモード中に検出しない。サイクル２および３は、プライマー伸長中に同時に複数の異なるヌクレオチド塩基タイプを含むため、いずれかの所与のステップで単一の塩基タイプしか使用されなかった場合よりも速くプライマーを伸長する。配列番号１（参照配列）および配列番号９についてのフローグラムを表８に示す。シークエンシングデータは、配列番号１の第３の領域（サイクル４およびサイクル５）が３’－ＣＴＧＡＣ－５’（配列番号５）であること、および配列番号９の第３の領域（サイクル４およびサイクル５）が３’－ＡＣ－５’であることを示す。配列番号１と配列番号８の間のシークエンシングデータ間の差は、第２の領域内のバリアントの存在を示す。
（実施例５）

【0329】

配列番号１２内のバリアント（これは、配列番号１の参照配列と比較して塩基位置１７の後にＧＣＣＴＧＣＡ（配列番号１３）塩基の逆位を含む）の検出をこの実施例で説明する。第２の領域を通しての高速フォワード部分を含むフローシークエンシング法を使用して、配列番号１および配列番号１２についてのカップリングされたシークエンシングリードを生成することができる。この実施例では、５サイクルを使用し、サイクル１を使用して、第１の領域を通してプライマーを伸長し、サイクル２およびサイクル３を使用して、第２の領域を通してプライマーを伸長し、サイクル４およびサイクル５を使用して、第３の領域を通してプライマーを伸長する。サイクル１、サイクル４およびサイクル５は、標識ヌクレオチドを使用してプライマーを伸長し、プライマーへのヌクレオチドの組込みを、サイクルステップを終えるたびに検出する。対照的に、サイクル２およびサイクル３中のプライマーへのヌクレオチドの組込みをスキップすることができる。各サイクルは、４つのステップを有し、サイクル１、４および５は、Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇ標識ヌクレオチドの逐次的な独立した付加を含み、単一塩基タイプを各サイクルステップで付加し、標識ヌクレオチドの組込みを各ステップ後に検出する。サイクル２およびサイクル３を「高速フォワード」モードで実行し、これらのサイクルは、４つのサイクルステップを含み、ステップ１は、Ａヌクレオチドを含まず（すなわち、Ｃ、ＴおよびＧを含み）、ステップ２は、Ｃヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＴおよびＧを含み）、ステップ３は、Ｔヌクレオチドを含まず（すなわち、Ａ、ＣおよびＧを含み）、ステップ４は、Ｇヌクレオチドを含まない（すなわち、Ａ、ＣおよびＴを含む）。ヌクレオチド組込みをサイクル２およびサイクル３の高速フォワードモード中に検出しない。サイクル２および３は、プライマー伸長中に同時に複数の異なるヌクレオチド塩基タイプを含むため、いずれかの所与のステップで単一の塩基タイプしか使用されなかった場合よりも速くプライマーを伸長する。配列番号１（参照配列）および配列番号１２についてのフローグラムを表９に示す。シークエンシングデータは、配列番号１の第３の領域（サイクル４およびサイクル５）が３’－ＣＴＧＡＣ－５’（配列番号５）であること、および配列番号１２の第３の領域（サイクル４およびサイクル５）が３’－Ｇ－５’であることを示す。配列番号１と配列番号１２の間のシークエンシングデータ間の差は、第２の領域内のバリアントの存在を示す。
（実施例６）

【0330】

合成によるシークエンシングは、一般に、ヌクレオチドの伸長プライマーへの不完全な組込みを有する。経時的に、シークエンシングクラスター内で、プライマーは非同期化されることがあり、その結果、シグナルが分解され、塩基組込みコールを行なう信頼度が低下することになる。シークエンシングクラスター内のプライマー非同期化を、１０，０００の同一の鋳型鎖を有するシークエンシングクラスターを仮定すること、および各フローが単一のヌクレオチドを有する、Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇのフロー順序を仮定して、非終結ヌクレオチドを使用して鋳型鎖をシークエンシングすることにより模擬した。組込み失敗（すなわち、ヌクレオチドが組み込まれているはずであることを鋳型が示したときにヌクレオチドが伸長プライマー鎖に組み込まれなかった）の確率を０．５％に設定した。図２０Ａは、１００番目のフローがＧ非終結ヌクレオチドを有する１００フロー後に各リード塩基において伸長されたプライマー（鎖）の数を示す。シークエンシングクラスターは、次に予想される組み込まれるヌクレオチドがＡであるようなＧヌクレオチドが伸長プライマーに取り込まれた先導シークエンシングプライマーとハイブリダイズされた鋳型、次に予想される組み込まれるヌクレオチドがＣであるようなＧヌクレオチドが伸長プライマーに取り込まれた第１の遅れプライマーとハイブリダイズされた鋳型、およびヌクレオチドが１００番目のフローからの伸長プライマーに組み込まれなかった第２の遅れプライマーとハイブリダイズされた鋳型を含む。第１の遅れプライマーおよび第２の遅れプライマーは、伸長プライマーへの予想ヌクレオチドの組込みがシークエンシングプロセス中のある地点で失敗した、プライマーを表す。再位相化フロー順序を使用する伸長プライマーの同期化を、同期化フロー順序を使用して模擬した。フロー１０１で、Ｇ、ＣおよびＡ非終結ヌクレオチドの混合物を使用してプライマーを伸長し（図２０Ｂ）、先導プライマーと同期化されるまで第１および第２の遅れプライマーを伸長した。フロー１０１は、Ｔヌクレオチドを含まなかったため、さらに伸長されなかった。模擬同期化フロー順序は、Ｇ、ＣおよびＴ非終結ヌクレオチドの混合物を有するフロー１０２（図２０Ｃ）、Ｇ、ＴおよびＡ非終結ヌクレオチドの混合物を有するフロー１０３（図２０Ｄ）、およびＴ、ＡおよびＣ非終結ヌクレオチドの混合物を有するフロー１０４（図２０Ｅ）に継続した。

【0331】

図２１Ａ～２１Ｅおよび図２２Ａ～２２Ｅに見られるように追加の配列を使用して模擬同期化フロー順序を試験した。同期化フロー順序および異なる鋳型配列を使用して、他の良好な模擬実験を行なった。
（実施例７）

【0332】

１００万を超える延長シークエンシングフロー順序を、すべての可能なＳＮＰのセットにわたって２カ所より多くのフロー位置においてシグナル変化［ＸＹＺ→ＸＱＺ、ここで、Ｑ≠Ｙ（およびＱ、Ｘ、ＹおよびＺは、各々、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのいずれかを１つである）］を誘導するそれらの尤度について、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検定した。すべての有効な２塩基フローパーミュテーションで最低１２塩基の配列を有するように延長フロー順序を設計し、逐次的塩基反復を有するフロー順序を除去した。フロー順序のすべての可能な開始位置を検定して、２カ所より多くのフロー位置においてシグナル変化を誘導する延長フロー順序の感度を評定した。図２３および表４は、この解析の例示的結果を示す。図２３中のｘ軸は、フロー相（または断片化開始位置）の分率を示し、ｙ軸は、２カ所より多くのフロー位置においてシグナル変化を誘導したＳＮＰパーミュテーションの分率を示す。いくつかのフロー順序は、リード（またはフロー開始位置）のおおよそ１０％についてすべての可能な（８７．５％）ＳＮＰパーミュテーションで２つまたはそれより多くのシグナルの相違を誘導する。４塩基周期的フローは、可能なＳＮＰのたった４２％でサイクルシフトを誘導するだけであるが、すべてのリードまたはフロー相でこれを行なう。効率の最終評価をヒト参照ゲノムの１００万リードサブセットに対して遂行して、実行可能性を確立した。これは、現実の生物にはパターンおよび偏りがある配列をフロー順序がいかに効率的に伸長するかの実際的な評価基準である。
（実施例８）

【0333】

ＳＮＰを検出するための高速フォワードシークエンシングの感度を試験するために、シークエンシング法をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで模擬して、ｈｇ３８参照ゲノム内のおおよそ１，１４０，０００の合成核酸分子をシークエンシングし、各々の合成核酸分子は、２キロ塩基セグメントであり、参照ゲノム内にランダムに始点があった。各々の合成シークエンシングリードから５０２ｂｐセグメントを生成し、この約５０２ｂｐセグメントの中の各塩基に対してクエリが実行される３つ可能な単一塩基突然変異（すなわち、合計５００×約１．１４Ｍ×３の可能なバリアント（すなわち、ＡＢＣ→ＡＤＣ、ここでＢ≠Ｄ））すべてに対してＳＮＰ検出についてのクエリを実行した。各ＳＮＰバリアントＡＢＣ→ＡＤＣについて、（Ａ＝ＢかつＤ＝Ｃ）または（Ａ＝ＤかつＢ＝Ｃ）の場合、いずれのＳＮＰもフローグラムにおいて新しいゼロシグナルも新しい非ゼロシグナルも生成しないことになるので、ＳＮＰを検出不能と考えた。参照塩基検出感度に対するバリアント塩基の行列が、図２４に示されている。

【0334】

次いで、各フローが、中央（第２の）領域に３つのヌクレオチドの混合物を含む、４ステップフローサイクルを使用して、合成核酸分子をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでシークエンシングした。各ステップが単一のヌクレオチド塩基タイプを含む、４ステップフローサイクルに従って、８０のヌクレオチドフローを使用して、合成核酸分子の第１の領域をシークエンシングした。シークエンシングプライマーは、第１の領域において８０フローで５４±７塩基（１フロー当り約０．６７５塩基）にわたって伸長した。各ステップが３つのヌクレオチド塩基タイプを含み１つのヌクレオチド塩基タイプを含まない（すなわち、（ｉ）Ａ、Ｃ、Ｔ、および非Ｇ；（ｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｃ、および非Ｔ；（ｉｉｉ）Ｔ、Ｇ、Ａ、および非Ｃ；および（ｉｖ）Ｃ、Ｔ、Ｇ、および非Ａ）、４ステップフローサイクルに従って、２００ヌクレオチドを使用して、合成核酸分子の第２の領域をシークエンシングした。シークエンシングプライマーは、第２の領域において２００フローで９１５±８９塩基（１フロー当り約４．５７５塩基）にわたって伸長した。各ステップが単一のヌクレオチド塩基タイプを含む、４ステップフローサイクルに従って、８０のヌクレオチドフローを使用して、合成核酸分子の第３の領域をシークエンシングした。シークエンシングプライマーは、第３の領域において８０フローで５４±７塩基（１フロー当り約０．６７５塩基）にわたって伸長した。各々の合成バリアント核酸分子についての第３の（下流の）領域のフローグラムを、対応する合成野生型核酸分子についての第３の領域のフローグラムと比較した。対応する合成野生型核酸分子と比較して、合成バリアント核酸分子の第３の領域における新しい非ゼロフローグラムエントリーおよび／または新しいゼロフローグラムエントリーは、第２の領域に導入されたＳＮＰの検出を示した。図２５Ａは、第１、第２および第３の領域におけるフローにわたっての平均塩基組込みを示す。参照塩基検出感度に対するバリアント塩基の行列を図２５Ｂに示す。図２５Ｃは、合成リードにわたっての塩基カバレッジの分布を示す。
（実施例９）

【0335】

２つまたは３つの異なるヌクレオチド塩基の混合物を有する再位相化フローステップを使用する再位相化の効果を、模擬シークエンシング方法論を使用して研究した。各々が長さ６００ｂｐのおおよそ１０，０００の合成シークエンシングリードを、ヒトゲノムからランダム開始部位選択により合成した。対照群では、模擬フローグラムを、１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル（合計４２０フロー）を使用する合成シークエンシングリードのｉｎ ｓｉｌｉｃｏシークエンシングにより生成した。遅れ位相の確率（すなわち、鋳型が、ヌクレオチドが組み込まれているはずであることを示すときに伸長プライマー鎖に組み込まれなかったヌクレオチドの、正しく取り込まれたヌクレオチドに対する分率）を０．２％に設定し、進み位相の確率（すなわち、追加のヌクレオチドが各フロー後に伸長プライマーに取り込まれた、シークエンシングリードの分率）を０．５％に設定した。対照群についての平均リード長は、３２２ｂｐ±１８ｂｐであった。

【0336】

一連の試験群では、模擬フローグラムを、以下の条件のうちの１つを除いて、１０５ラウンドのＴ－Ｇ－Ｃ－Ａフローサイクル（合計４２０フロー）を使用する合成シークエンシングリードのｉｎ ｓｉｌｉｃｏシークエンシングにより生成した：（１）２４フローを終えるたびに、ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローを挿入した（図２６Ａ）；（２）４８フローを終えるたびに、ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローを挿入した（図２６Ｂ）；（３）９６フローを終えるたびに、ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローを挿入した（図２６Ｃ）；（４）１９２フローを終えるたびに、ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローを挿入した（図２６Ｄ）；（５）４８フローを終えるたびに、ＣとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、単一のＡフローを（冗長フローを回避するために）挿入した後、対照プロトコルによるＴ－Ｇ－Ｃ－Ａサイクルに戻った（図２６Ｅ）；（６）９６フローを終えるたびに、ＣとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、単一のＡフローを（冗長フローを回避するために）挿入した後、対照プロトコルによるＴ－Ｇ－Ｃ－Ａサイクルに戻った（図２６Ｆ）；（７）９６フローを終えるたびに、ＣとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、ＡとＣとＧの混合物を含有する再位相化フローを挿入した（図２６Ｇ）；（８）１９２フローを終えるたびに、ＣとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、ＡとＣとＧの混合物を含有する再位相化フローを挿入した（図２６Ｈ）；（９）９６フローを終えるたびに、ＣとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、ＡとＣとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、ＡとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、ＡとＣとＧの混合物を含有する再位相化フローを挿入した（図２６Ｉ）；または（１０）１９２フローを終えるたびに、ＣとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、ＡとＣとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、ＡとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローを挿入し、その後、ＡとＣとＧの混合物を含有する再位相化フローを挿入した（図２６Ｊ）。

【0337】

試験した再位相化フローのいずれについての使用も、最小限のシークエンシングデータ損失で、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏシークエンシングの全ラウンド後に対照と比較して全位相誤差（すなわち、遅れ誤差も進み誤差も導入されていない名目上シークエンシングされた鎖に対する、遅れ位相誤差を有する鎖の分率と進み位相誤差を有する鎖の分率の合計）の実質的減少をもたらした。図２６Ａ～２６Ｊは、対照プロトコルおよびそれぞれの再位相化フロープロトコル各々についての全位相誤差の和の分布を示す。ＣとＧの混合物を含有する再位相化フローの使用は、再位相化フローごとに約１ｂｐの平均プライマー伸長（すなわち、シークエンシングギャップ）しか生成せずに、２４フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を３１．２±９．６％に低減させ（５１．５±１．３％対照と比較して）（図２６Ａ）、４８フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を３６．９±９．７％に低減させ（図２６Ｂ）、９６フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を４０．２±１０．１％に低減させ（図２６Ｃ）、１９２フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を４２．８±１０．４％に低減させた（図２６Ｄ）。ＣとＧとＴの混合物を含有する再位相化フローの使用は、再位相化フローごとに約５ｂｐの平均プライマー伸長しか生成せずに、４８フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を２８．５±１０．６％に低減させ（図２６Ｅ）、９６フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を３１．１±１２．２％に低減させた（図２６Ｆ）。ＣとＧとＴの混合物を含有する第１の再位相化フロー、およびＡとＣとＧの混合物を含有する第２の再位相化フローの使用は、再位相化二重フローごとに約９ｂｐの平均プライマー伸長しか生成せずに、９６フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を２５．３±１０．６％に低減させ（図２６Ｇ）、１９２フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を２６．６±１２．６％に低減させた（図２６Ｈ）。ＣとＧとＴの混合物を含有する第１の再位相化フロー、ＡとＣとＴの混合物を含有する第２の再位相化フロー、およびＡとＧとＴの混合物を含有する第３の再位相化フロー、およびＡとＣとＧの混合物を含有する第４の再位相化フローの使用は、再位相化四重フローごとに約１８ｂｐの平均プライマー伸長しか生成せずに、９６フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を２０．６±９．４％に低減させ（図２６Ｉ）、および１９２フローを終えるたびに、平均総累計位相誤差を２０．９±１１．２％に低減させた（図２６Ｊ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図22-1】

【図22-2】

【図22-3】

【図23】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図25-3】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図26G】

【図26H】

【図26I】

【図26J】

【配列表】

2022533801000001.app

【国際調査報告】