特表 2022-534004 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの変異体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-27

(54)【発明の名称】末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの変異体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20220720BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20220720BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20220720BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20220720BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20220720BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20220720BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20220720BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALN20220720BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54

C12N9/10 ZNA

C12P19/34 A

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12Q1/6876 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021569118

(86)(22)【出願日】2020-05-26

(85)【翻訳文提出日】2021-11-19

(86)【国際出願番号】 EP2020064524

(87)【国際公開番号】W WO2020239737

(87)【国際公開日】2020-12-03

(31)【優先権主張番号】19177018.9

(32)【優先日】2019-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】16/423,972

(32)【優先日】2019-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516304610

【氏名又は名称】ディーエヌエー スクリプト

(71)【出願人】

【識別番号】593218462

【氏名又は名称】インスティチュート・パスツール

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ

(71)【出願人】

【識別番号】508242056

【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ ルシェルシュ サイエンティフィック

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】シャンピオン， エリーズ

(72)【発明者】

【氏名】ソスキヌ， ミカエル

(72)【発明者】

【氏名】イベール， トマス

(72)【発明者】

【氏名】ドュラリュ， マルク

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050KK07

4B050KK13

4B050LL05

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR06

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR62

4B063QS24

4B064AF27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA20

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065CA29

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体であって、その各々が、（ｉ）少なくとも残基Ｃ３０２（配列番号１を基準にして）又はそれぞれ配列番号_８１０～３５の機能的に等価な残基に対応する位置にアミノ酸置換を有して、配列番号_８１０～３５から選択されるアミノ酸配列又は機能的に等価な配列を有し、（ｉｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成可能であり、且つ（ｉｉｉ）３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを核酸断片に取込み可能である、ＴｄＴ変異体に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５から選択されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体であって、前記アミノ酸配列が、配列番号１１、１３、１７、１９、２１、２９、若しくは３１を基準にして位置１７３のシステイン残基の、又は配列番号１５を基準にして位置１７２のシステイン、若しくは配列番号２３を基準にして位置１７８のシステイン、若しくは配列番号２５を基準にして位置１７４のシステイン、若しくは配列番号２７を基準にして位置１７１のシステイン、若しくは配列番号３３を基準にして位置１８２のシステイン、若しくは配列番号３５を基準にして位置１７６のシステインから選択される機能的に等価なシステイン残基の、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、前記ＴｄＴ変異体が、（ｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成でき、且つ（ｉｉ）修飾ヌクレオチドを核酸断片に取込みできる、ＴｄＴ変異体。

【請求項2】

配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２９、若しくは３３を基準にして位置６３のメチオニン残基の、又は配列番号２３を基準にして位置７３のメチオニン、若しくは配列番号２３を基準にして位置７３のメチオニン、若しくは配列番号２５を基準にして位置６４のメチオニン、若しくは配列番号２７を基準にして位置６１のメチオニン、若しくは配列番号３５を基準にして位置６６のメチオニンから選択される機能的に等価なメチオニン残基の、さらなる置換を有する、請求項１に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項3】

配列番号１１、１３、１７、１９、２３、２９、又は３１を基準にして位置２０７のアルギニン残基の、或いは配列番号１５を基準にして位置２０６のアルギニン、又は配列番号２１若しくは２５を基準にして位置２０８のアルギニン、又は配列番号２７を基準にして位置２０５のアルギニン、又は配列番号３３を基準にして位置２１６のアルギニン、又は配列番号３５を基準にして位置２１０のアルギニンから選択される機能的に等価なアルギニン残基の、さらなる置換を有する、請求項１又は２に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項4】

配列番号１１又は１３を基準にして位置３２４のアルギニン残基の、或いは配列番号１５を基準にして位置３２０のアルギニン、又は配列番号１７を基準にして位置３３１のアルギニン、又は配列番号１９、２３、若しくは３１を基準にして位置３２５のアルギニン、又は配列番号２５を基準にして位置３２６のアルギニン、又は配列番号２７を基準にして位置３２３のアルギニン、又は配列番号２９を基準にして位置３２８のアルギニン、又は配列番号３３を基準にして位置３３８のアルギニン、又は配列番号３５を基準にして位置３２８のアルギニンから選択される機能的に等価なアルギニン残基の、さらなる置換を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項5】

配列番号１１又は１３を基準にして位置３２７のグルタミン酸残基の、或いは配列番号１７若しくは２１を基準にして位置３３４のグルタミン酸、又は配列番号２９若しくは３５を基準にして位置３３１のグルタミン酸、又は配列番号１９、２３、若しくは３１を基準にして位置３２８のグルタミン酸、又は配列番号２５を基準にして位置３２９のグルタミン酸、又は配列番号２７を基準にして位置３２６のグルタミン酸、又は配列番号３３を基準にして位置３４１のグルタミン酸から選択される機能的に等価なグルタミン酸残基の、さらなる置換を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項6】

前記システインの前記置換が、Ｇ、Ｒ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、又はＤ、好ましくはＧ又はＲである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項7】

前記メチオニンの前記置換が、Ｒ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、又はＥ、好ましくはＲ又はＱである、請求項２～６のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項8】

前記アルギニンの前記置換が、Ｎ、Ｌ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｄ、Ａ、又はＰ、好ましくはＮ又はＬである、請求項３～７のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項9】

前記グルタミン酸の前記置換が、Ｎ、Ｌ、Ｔ、又はＳである、請求項５～８のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項10】

前記ＴｄＴ変異体が、３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを、好ましくは３’－Ｏ－ＮＨ_２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、３’Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸、又は３’－Ｏ－プロパルギル－ヌクレオシド三リン酸から選択されるものを、より好ましくは３’－Ｏ－ＮＨ_２－ヌクレオシド三リン酸を、核酸断片に、好ましくは核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに取込みできる、請求項１～９のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項11】

前記ＴｄＴ変異体が、野生型ＴｄＴよりも大きい速度で前記３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを取り込む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に定義されたＴｄＴ変異体をコードする核酸。

【請求項13】

ＴｄＴ変異体を生成する方法であって、
（ａ）前記ＴｄＴ変異体をコードする核酸を発現するのに好適な条件下で請求項１２に記載の核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意に
（ｂ）前記細胞培養物から前記ＴｄＴ変異体を回収することと、
を含む方法。

【請求項13】

あらかじめ決められた配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、
ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有する開始剤を提供することと、
ｂ）前記ポリヌクレオチドが形成されるまで、（ｉ）前記開始剤又は伸長断片が３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の取込みにより伸長されて３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成するように、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記開始剤又は伸長断片と、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸及び請求項１～１１のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体と、を伸長条件下で接触させることと、（ｉｉ）前記伸長断片をデブロックして遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成することと、のサイクルを繰り返すことと、
を含む方法。

【請求項14】

前記３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸が、３’－Ｏ－ＮＨ_２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、又は３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

ヌクレオチド取込み反応を実施するためのキットであって、
－ 請求項１～１１のいずれか一項に記載のＴｄＴ変異体と、
－ １種以上のヌクレオチド、好ましくは１種以上の３’Ｏ－修飾ヌクレオチドと、
－ 任意に少なくとも１種の核酸プライマーと、
を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、鋳型を用いない核酸配列の酵素合成のための、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の変異体及びその使用に関する。より特定的には、本発明は、決定又は制御された配列を有する核酸分子の合成のための、修飾ヌクレオチドの取込みに好適なかかる変異体に関する。

【背景技術】

【0002】

過去４０年間にわたり、固相ホスホルアミダイト化学に基づく核酸のｄｅ ｎｏｖｏ化学合成法が主に使用及びリファインされてきた。この技術は、固形担体マトリックスに装着された成長オリゴヌクレオチド鎖に１サイクル毎に１塩基を付加する４工程の鎖伸長サイクルからなる。それは過去何十年にもわたり核酸を合成するのに最適な方法であったが、この技術はいくつかの注目すべき限界を有する。すなわち、それは複数の溶媒及び試薬の使用を必要とするとともに、化学反応の効率に限界があるため、合成オリゴヌクレオチドの長さは、典型的には１５０～２００塩基を超えない。そのうえ、所望のＤＮＡ配列を提供するためには、これらの短い断片をさらにアセンブルする必要がある。

【0003】

化学合成の一代替手段は、核酸の成長一本鎖に可逆ターミネーター修飾ヌクレオチドを付加する鋳型非依存ＤＮＡポリメラーゼの使用に依拠する。これにより１サイクル毎に１タイプのヌクレオチドの付加が制御方式で可能になる。

【0004】

いくつかの天然酵素は、鋳型の不在下で天然ヌクレオチドに作用可能であるので、核酸の合成を無制御方式で触媒可能である。しかしながら、それらは修飾ヌクレオチドより特定的には可逆ターミネーター修飾ヌクレオチドの取込みがとくに非効率的である。修飾ヌクレオチドに作用可能な新しいＤＮＡポリメラーゼを開発する努力がなされてきたが、得られた酵素は、いずれのタイプの核酸の合成性能に関しても十分に満足とはいえない。

【0005】

これまで、（鋳型を用いることなく）一本鎖ＤＮＡに効率的に作用可能なＤＮＡポリメラーゼは、ごくわずかしか同定されていない。かかる鋳型非依存活性を有する最も特徴付けられたポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である。ＴｄＴ酵素は、バイオ技術、バイオメディカル研究、及び合成生物学をはじめとする各種タイプの用途で一本鎖ＤＮＡを修飾するために広範に使用されてきた。しかしながら、天然ＴｄＴは、修飾ヌクレオチドを十分に使用できない。

【0006】

修飾ヌクレオチドの許容可能な取込み性能を有する修飾ＴｄＴのいくつかの開発の試みは引き継がれてきた。しかしながら、かかる修飾ヌクレオチドの取込み性能は依然として制約因子である。取込み効率は、全体の純度及び合成の収率を主導する主要パラメーターである。これらの２つの合成プロセス特性は、核酸産物の品質、ターンアラウンド時間、及びコストに有意な影響を及ぼす。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、効率的且つ費用効果的な核酸合成方法の開発のために、鋳型の不在下で修飾ヌクレオチドを使用できる改善されたＴｄＴを開発する必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

鋳型を用いることなく制御配列を有するポリヌクレオチドのｄｅ ｎｏｖｏ合成を行うためのＴｄＴに取り組むことにより、本発明者らは、ポリヌクレオチドを合成するためのかかる修飾ＴｄＴの能力を改善すべくＴｄＴの触媒ドメインのいくつかの標的アミノ酸残基を特異的に修飾しうることを発見した。より特定的には、本発明者らは、ポリヌクレオチドの酵素合成の改善及びポリヌクレオチド合成の全体コストの低減をもたらす標的アミノ酸置換を有する修飾ＴｄＴを開発した。本発明者らは、ネズミＴｄＴ変異体（配列番号１又は配列番号２）を以前開発した。ＴｄＴにさらに取り組むことにより、本発明者らは、新しいＴｄＴ変異体をこのたび開発した。

【0009】

いくつかの実施形態では、修飾ＴｄＴの各々は、野生型ＴｄＴ（たとえば、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、又は３４）及びＴｄＴ触媒ドメインを含むそのＮ末端トランケート体（たとえば、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５）と比較して１つ以上の標的アミノ酸置換を提示する。いくつかの実施形態では、本発明の修飾ＴｄＴの各々は、ＴｄＴ（たとえば、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５）の触媒ドメインに対して特定パーセント配列同一性を有し且つ１つ以上の特定アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する。本発明の鋳型非依存ポリメラーゼは、より速い速度、より少ない費用、及びより高い品質でポリヌクレオチドの酵素合成を可能にする。

【0010】

したがって、本発明の目的は、残基Ｃ１７３（配列番号１１のアミノ酸番号付けを基準にして）又は機能的に等価な残基に対応する位置に少なくともアミノ酸置換を有して、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５に示されるように、ＴｄＴ触媒ドメインのアミノ酸配列又はＴｄＴ触媒ドメインに対してあるパーセント配列同一性のアミノ酸配列を含み、鋳型を用いずに核酸断片を合成でき、且つ３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを核酸断片に取込みできる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の変異体を提供することである。特定的には、修飾ヌクレオチドは、核断片の遊離３’－ヒドロキシルに取り込まれる。

【0011】

より特定的には、本発明の目的は、配列番号１１、１３、１７、１９、２１、２９、若しくは３１を基準にして残基Ｃ１７３に対応する位置に、又は配列番号１５を基準にして残基Ｃ１７２に対応する位置に、又は配列番号２３を基準にして残基Ｃ１７８に対応する位置に、又は配列番号２５を基準にして残基Ｃ１７４に対応する位置に、又は配列番号２７を基準にして残基Ｃ１７１に対応する位置に、又は配列番号３３を基準にして残基Ｃ１８２に対応する位置に、又は配列番号３５を基準にして残基Ｃ１７６に対応する位置に置換を有する、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体であって、ＴｄＴ変異体が（ｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成でき、且つ（ｉｉ）３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを核酸断片に取込みできる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体を提供することである。いくつかの実施形態では、以上のパーセント同一性値は、指示配列番号に対して少なくとも９５％の同一性であり、いくつかの実施形態では、以上のパーセント同一性値は少なくとも９７％の同一性であり、いくつかの実施形態では、以上のパーセント同一性値は少なくとも９８％の同一性であり、いくつかの実施形態では、以上のパーセント同一性値は少なくとも９９％の同一性である。

【0012】

有利には、（ｉｉ）に関して、かかる修飾ヌクレオチドは、核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに取り込まれうる３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドである。３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－ＮＨ２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、３’Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸、又は３’－Ｏ－プロパルギル－ヌクレオシド三リン酸を含みうる。

【0013】

特定実施形態では、置換は、配列番号１０を基準にしてＣ３１３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１１を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１２を基準にしてＣ３０２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１３を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１４を基準にしてＣ３０２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１５を基準にしてＣ１７２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１６を基準にしてＣ３０４Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１７を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１８を基準にしてＣ３０４Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号１９を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２０を基準にしてＣ２９３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２１を基準にしてＣ１７４Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２２を基準にしてＣ２８２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２３を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２４を基準にしてＣ３０４Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２５を基準にしてＣ１７４Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２６を基準にしてＣ３００Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２７を基準にしてＣ１７１Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２８を基準にしてＣ３０５Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号２９を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号３０を基準にしてＣ３０２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号３１を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号３２を基準にしてＣ３１３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号３３を基準にしてＣ１８２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号３４を基準にしてＣ２７１Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、又は配列番号３５を基準にしてＣ１７６Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄから選択される。

【0014】

さらなる実施形態では、置換は、配列番号４を基準にしてＣ３０２Ｇ／Ｒ、又は配列番号９を基準にしてＣ３０２Ｇ／Ｒ、又は配列番号１０を基準にしてＣ３１３Ｇ／Ｒ、又は配列番号１１を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ、又は配列番号１２を基準にしてＣ３０２Ｇ／Ｒ、又は配列番号１３を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ、又は配列番号１４を基準にしてＣ３０２Ｇ／Ｒ、又は配列番号１５を基準にしてＣ１７２Ｇ／Ｒ、又は配列番号１６を基準にしてＣ３０４Ｇ／Ｒ、又は配列番号１７を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ、又は配列番号１８を基準にしてＣ３０４Ｇ／Ｒ、又は配列番号１９を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ、又は配列番号２０を基準にしてＣ２９３Ｇ／Ｒ、又は配列番号２１を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ、又は配列番号２２を基準にしてＣ２８２Ｇ／Ｒ、又は配列番号２３を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ、又は配列番号２４を基準にしてＣ３０４Ｇ／Ｒ、又は配列番号２５を基準にしてＣ１７４Ｇ／Ｒ、又は配列番号２６を基準にしてＣ３００Ｇ／Ｒ、又は配列番号２７を基準にしてＣ１７１Ｇ／Ｒ、又は配列番号２８を基準にしてＣ３０５Ｇ／Ｒ、又は配列番号２９を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ、又は配列番号３０を基準にしてＣ３０２Ｇ／Ｒ、又は配列番号３１を基準にしてＣ１７３Ｇ／Ｒ、又は配列番号３２を基準にしてＣ３１３Ｇ／Ｒ、又は配列番号３３を基準にしてＣ１８２Ｇ／Ｒ、又は配列番号３４を基準にしてＣ２７１Ｇ／Ｒ、又は配列番号３５を基準にしてＣ１７６Ｇ／Ｒから選択される。

【0015】

いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５からなる群から選択される参照又は野生型ＴｄＴ配列に対して少なくとも９０パーセントの同一性、又はいくつかの実施形態では少なくとも９５パーセントの同一性、少なくとも９７パーセントの同一性、又はいくつかの実施形態では少なくとも９８パーセントの同一性、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴｄＴ変異体を含む組成物であって、かかるＴｄＴ変異体が、Ｃ１７３Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、好ましくはＣ１７３Ｇ／Ｒ（ただし、アミノ酸残基番号は、配列番号１１を基準にするか、又は配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、若しくは３５の等価残基番号を基準にする）から選択される突然変異を有し、（ｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成でき、且つ（ｉｉ）かかるＴｄＴ変異体が参照又は野生型ＴｄＴよりも大きい効率又は高い速度で３’－Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸を取り込む、組成物に関する。

【0016】

いくつかの実施形態では、本発明の目的はまた、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）のトランケート変異体であって、その各々が、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５のいずれかに対して少なくとも９０パーセントの同一性を有するとともに、Ｍ６３Ｒ／Ｑ、Ｌ１３１Ｐ、Ｃ１７３Ｇ／Ｒ、Ｒ２０７Ｌ／Ｎ、Ｄ２５０Ｖ、Ｒ３２５Ｐ／Ｎ、及びＥ３２８Ｎ／Ｌ／Ｔ／Ｓから選択される少なくとも２つのアミノ酸置換、好ましくは少なくとも３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み（ただし、残基番号は、配列番号１１を基準にするか、又は配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５中のそれらの機能的に等価な残基番号を基準にする）、（ｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成可能であり、且つ（ｉｉ）修飾ヌクレオチドを核酸断片に、たとえば、３’－Ｏ－可逆ブロックデオキシヌクレオシド三リン酸を核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに取込み可能である、トランケート変異体を提供することである。

【0017】

さらなる実施形態では、以上のパーセント配列同一性値は、特定配列に対して少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性である。

【0018】

本発明の他の目的は、以上に定義されるＴｄＴ変異体をコードする核酸分子、及び／又はかかる核酸分子を含む発現ベクター、及び／又はかかる核酸分子若しくは発現ベクターを含む宿主細胞を提供することである。

【0019】

本発明のさらなる目的は、本発明に係るＴｄＴ変異体の生成プロセスであって、以上に定義される宿主細胞が、前記変異体をコードする核酸の発現を可能にする培養条件下で培養され、且つ変異体が任意に回収される、生成プロセスを提供することである。

【0020】

本発明はさらに、核酸断片への１種以上の３’Ｏ－修飾ヌクレオチドの逐次付加により鋳型を用いずに核酸分子を合成するためのＴｄＴ変異体の使用に関する。いくつかの実施形態では、かかる方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドを含む開始剤を提供する工程と、（ｂ）３’－Ｏ－可逆ブロックヌクレオシドの存在下で本発明のＴｄＴ変異体と開始剤又は伸長開始剤とを酵素伸長条件下で反応させる工程と、を含む。いくつかの実施形態では、かかる方法は、（ｃ）伸長開始剤をデブロックして遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長開始剤を形成する工程と、（ｄ）あらかじめ決められた配列の核酸分子が合成されるまで工程（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す工程と、をさらに含む。

【0021】

本発明の目的はまた、鋳型を用いない核酸分子の合成プロセスであって、核酸プライマーと、少なくとも１種のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１種の３’Ｏ－修飾ヌクレオチド及び本発明に係るＴｄＴ変異体の両方と、を接触させる工程を含む合成プロセスを提供することである。

【0022】

本発明はさらに、ヌクレオチド取込み反応を実施するためのキットであって、本発明に係るＴｄＴ変異体と、１種以上のヌクレオチド、好ましくは１種以上の３’Ｏ－修飾ヌクレオチドと、任意に少なくとも１種の核酸プライマーと、を含むキットを提供する。

【発明を実施するための形態】

【0023】

ＤＮＡポリメラーゼファミリーは、それらの配列相同性及び結晶構造に基づいて７つのファミリーに分けられる。それらのうち、ＰｏｌＸファミリーのポリメラーゼには、複製ポリメラーゼから末端トランスフェラーゼ酵素まで、多種多様なポリメラーゼが存在する。ＰｏｌＸファミリーのポリメラーゼは、非常に広範にわたる真核生物に存在する。ＰｏｌＸファミリーのポリメラーゼは、きわめて多様な生物学的プロセスとくにＤＮＡ損傷修復機序又はエラー訂正機序に関係する。ＰｏｌＸファミリーは、ポリメラーゼβ（Ｐｏｌ β）、μ（Ｐｏｌ μ）、λ（Ｐｏｌ λ）、酵母由来ＩＶ（Ｐｏｌ ＩＶ）、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）に再分類される。ＴｄＴは、ＤＮＡ修復及び維持機序に天然で関係する。とくに、ＴｄＴは、鋳型鎖の不在下でさえもヌクレオチド重合活性を保存するユニークな能力を有する。特定条件で天然ヌクレオチドを用いて、ＴｄＴは、いかなる相補鎖も存在させずに、数百ヌクレオチドを有するＤＮＡ断片を伸長可能である。しかしながら、野生型ＴｄＴは、糖修飾ヌクレオチドの効率的取込みが完全に不能である。

【0024】

そのため、本発明の目的は、前記ヌクレオチド断片の合成時に核断片への修飾ヌクレオチドの取込みを可能にする標的突然変異を有するＴｄＴ変異体を提供することである。より特定的には、本発明者らは、修飾ヌクレオチドを用いることによるものを含めて、あらかじめ決められた配列を有する各種長さの核酸断片を合成する酵素の能力を改善するように、単独又は組合せで有利に置換されうる特異的アミノ酸残基を同定した。

【0025】

定義
そこで用いられる場合、「突然変異体」及び「変異体」という用語は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５に関連するか又はそれらに由来し、且つ修飾又は改変、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を１つ以上（たとえば複数）の位置に含み、且つ鋳型を用いないポリメラーゼ活性及び核酸鎖への３’－Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸の取込み能力の両方を有するポリペプチドを意味するものとして同義的に用いられうる。変異体は、当技術分野で周知の各種技術により得られうる。特定的には、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列の改変技術の例としては、限定されるものではないが、部位指向突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、及び合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられる。突然変異誘発活性は、タンパク質配列中の１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失、挿入、若しくは置換又はポリメラーゼの本発明の場合に依拠する。標的アミノ酸は、ポリメラーゼの配列全体に沿って共存又は分布しうる。たとえば、特異的なモチーフ又は構造上の特徴が標的となりうる。

【0026】

位置又はアミノ酸との関連で本明細書で用いられる「修飾」又は「改変」という用語は、特定位置のアミノ酸が野生型タンパク質のアミノ酸と比較して修飾されていることを意味する。

【0027】

「置換」とは、アミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置き換えられることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基、稀に天然に存在するアミノ酸残基（たとえば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、６－Ｎ－メチルリシン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ａｌｌｏ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、及び天然に存在しないアミノ酸残基、多くの場合、合成的に作製されるもの（たとえば、シクロヘキシル－アラニン）から選択される他のものによりアミノ酸残基を置き換えることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基から選択される他のものによりアミノ酸残基を置き換えることを意味する。記号「＋」は、置換の組合せを表す。

【0028】

アミノ酸は、本明細書では、次の命名法：Ａ：アラニン（Ａｌａ）、Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）、Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）、Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｋ：リシン（Ｌｙｓ）、Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）、Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）、Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ：トレオニン（Ｔｈｒ）、Ｖ：バリン（Ｖａｌ）、Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）に従ってその１文字コード又は３文字コードにより表される。

【0029】

本文書では、置換を表すために次の用語が用いられる。すなわち、Ｌ２３８Ａとは、親配列の位置２３８のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更されることを意味する。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍとは、親配列の位置１３２のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が次のアミノ酸：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）Ｖ、又はメチオニン（Ｍ）により置き換えられることを意味する。置換は、保存的置換又は非保存的置換でありうる。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、及びトレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、並びに小アミノ酸（グリシン、アラニン、及びセリン）の群内にある。

【0030】

本明細書で用いられる場合、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列間のマッチ（同等アミノ酸残基）の数（又はパーセント％として表される分率）を意味する。配列同一性は、配列ギャップを最小限に抑えつつオーバーラップ及び同一性を最大化するようにアライメントしたときの配列を比較することにより決定される。特定的には、配列同一性は、２つの配列の長さに依存して、いくつかの数学的グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムのいずれかを用いて決定されうる。類似の長さの配列は、好ましくは、全長にわたり最適に配列をアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（たとえば、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いてアライメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（たとえば、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１）又はアルトシュルアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００５））を用いてアライメントされる。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のアライメントは、当該技術の範囲内の各種方法で、たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウェブサイトで入手可能な公表されたコンピューターソフトウェアを用いて達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大アライメントの達成に必要とされるいずれのアルゴリズムも含めて、アライメントの測定に適したパラメーターを決定可能である。本明細書の目的では、％アミノ酸配列同一性値とは、すべての検索パラメーターをデフォルト値に設定して、すなわち、スコアリング行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティー＝フォールス、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップ伸長＝０．５として、ニードルマン・ブンシュアルゴリズムを用いて２つの配列の最適グローバルアライメントを生成するペアワイズ配列アライメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いて発生される値を意味する。

【0031】

本明細書では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」という用語は、鎖を形成するアミノ酸の数にかかわらず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の鎖を意味する。

【0032】

とくに明記されていない限り、本願に開示される位置は、特定配列番号に示されるアミノ酸配列を参照して番号付けされる。

【0033】

ＴｄＴ変異体
本発明は、鋳型鎖を用いることなくＤＮＡやＲＮＡなどのあらかじめ決められた配列のポリヌクレオチドの合成に使用可能なＴｄＴ酵素変異体を提供する。本発明のＴｄＴ変異体は、Ｈｉａｔｔらの米国特許第５７６３５９４号明細書に記載されるように、酵素媒介ポリヌクレオチド合成法で修飾ヌクレオチド、より特定的には３’Ｏ－修飾ヌクレオチドの使用を可能にする。

【0034】

本発明のいくつかの実施形態では、「修飾末端デスオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ」、「修飾ＴｄＴ」、「末端デスオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ変異体」、及び「ＴｄＴ変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を除いて、配列番号２、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５に示されるアミノ酸配列の１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を共有するアミノ酸セグメントを含む酵素を意味する。いくつかの実施形態では、ＴｄＴ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を除いて、配列番号２、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５に対して少なくとも９０％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、ＴｄＴ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を除いて、配列番号２、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５に対して少なくとも９５％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、ＴｄＴ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を除いて、配列番号２、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５に対して少なくとも９７％、９８％、又は９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。

【0035】

いくつかの場合には、本発明の変異体は、特異的残基の突然変異に従って記述されうるとともに、その位置は、配列番号とのアライメント又はそれへの参照により決定される。

【0036】

「機能的に等価な残基」とは、機能的に等価な配列中の対応する残基と比較して同等の機能的役割を有する所与のＴｄＴ配列中の残基を意味する。本発明との関連では、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５から選択されるＴｄＴの各配列は、他の配列のいずれか１つの「機能的に等価な配列」とみなされうる。

【0037】

いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１１を基準にして残基Ｃ１７３の機能的に等価な残基に対応する位置に少なくともアミノ酸置換を有して、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成可能であり、且つ（ｉｉ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸などの３’－Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸を核断片に取込み可能である、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体を含む。

【0038】

実際には、本発明者らは、かかる置換が酵素の表面性及びヌクレオチドとの相互作用性の両方に大きな影響を及ぼして、核酸配列への３’Ｏ－修飾ヌクレオチドの取込みを可能にしうることを発見した。

【0039】

本発明のＴｄＴ変異体のさらなる実施形態は、表１Ａ～１Ｃ（単一置換）、表２Ａ～２Ｃ（２つの置換）、表３Ａ～３Ｃ（３つの置換）、及び表４Ａ～４Ｆ（４つの置換）のエントリーとして列挙されており、かかる各変異体ＴｄＴは、右側の列の指示配列番号により定義され、配列番号と同一の行の左側の列に列挙される置換により修飾される。「非野生型」置換とは、置換が野生型配列又は等価的に指示配列番号の配列の指示位置のアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸でありうることを意味する。

【0040】

【表1A】

【0041】

【表1B】

【0042】

【表1C】

【0043】

【表2A】

【0044】

【表2B】

【0045】

【表2C】

【0046】

【表3A】

【0047】

【表3B】

【0048】

【表3C】

【0049】

【表4A】

【0050】

【表4B】

【0051】

【表4C】

【0052】

【表4D】

【0053】

【表4E】

【0054】

【表4F】

【0055】

有利には、置換は、ＣｚｚｚＧ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ（ただし、Ｃｚｚｚは、それぞれ、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５における、配列番号１１のＣ１７３に機能的に等価なアミノ酸残基番号を表す）、好ましくはＣｚｚｚＧ／Ｒ（ただし、Ｃｚｚｚは、それぞれ、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５における、配列番号１１のＣ１７３に機能的に等価なアミノ酸残基番号を表す）から選択される。

【0056】

特定実施形態では、変異体は、配列番号１１のＭ６３、Ｒ２０７、Ｒ３２４、及びＥ３２７から選択される残基の機能的に等価な残基に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。

【0057】

本発明によれば、以上に開示されるＴｄＴ変異体はすべて、鋳型を用いない核酸断片の合成及び核酸断片への修飾ヌクレオチドの取込みの両方が可能である。有利には、前記変異体は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５のＴｄＴと比較して、核酸断片への修飾ヌクレオチド、好ましくは３’Ｏ－修飾ヌクレオチドの増加した取込み能力を有する。

【0058】

以上に記載の実施形態のいくつかでは、３’Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸を取り込む変異体ＴｄＴの効率は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５の配列の野生型ＴｄＴの少なくとも１１０パーセントであり、他の実施形態では、３’Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸を取り込む変異体ＴｄＴの効率は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５の配列の野生型ＴｄＴの少なくとも１５０パーセントであり、他の実施形態では、３’Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸を取り込む変異体ＴｄＴの効率は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５の配列の野生型ＴｄＴの少なくとも２００パーセントである。

【0059】

特定実施形態では、本発明の変異体は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５のアミノ酸配列と、任意にそのＣ末端又はＮ末端に追加のアミノ酸断片と、を含む。他の実施形態では、本発明の変異体は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５のアミノ酸配列のみに依拠する。

【0060】

本発明の他の態様によれば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体は、Ｍ６３Ｒ／Ｑ、Ｌ１３１Ｐ、Ｃ１７３Ｇ／Ｒ、Ｒ２０７Ｌ／Ｎ、Ｄ２５０Ｖ、Ｒ３２４Ｐ／Ｎ、及びＥ３２７Ｎ／Ｌ／Ｔ／Ｓから選択される少なくとも３つのアミノ酸置換又は機能的に等価な残基を有して、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、若しくは３５に示されるアミノ酸配列、又は上記の配列のいずれかに対して９０％の配列同一性、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み（ただし、位置は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を参照して番号付けされるか、又はそれらの個別配列番号に対して本明細書の他の箇所に直接示される通りである）、（ｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成可能であり、且つ（ｉｉ）３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを核断片に取込み可能である。

【0061】

たとえば、ＴｄＴ変異体は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５に対して特定パーセント配列同一性内のアミノ酸配列と、Ｍ６３Ｒ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｌ、Ｍ６３Ｒ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｎ、Ｍ６３Ｒ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｍ６３Ｒ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｒ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｒ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｒ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｒ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｒ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｑ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｌ、Ｍ６３Ｑ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｎ、Ｍ６３Ｑ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｍ６３Ｑ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｑ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｑ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｑ＋Ｌ１３１Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｑ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｑ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｑ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｑ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ａ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ａ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｎ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ａ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ａ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ａ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｎ、及びＲ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐから選択される置換の組合せ又は機能的に等価な残基と、を含む（ただし、以上の位置番号は配列番号１１を基準にする）。

【0062】

特定実施形態では、ＴｄＴ変異体は、配列番号１１に対して特定パーセント配列同一性内のアミノ酸配列又は機能的に等価な配列と、置換Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｌの組合せ又は機能的に等価な残基と、を含む。

【0063】

特定実施形態では、ＴｄＴ変異体は、配列番号１１に対して特定パーセント配列同一性内のアミノ酸配列又は機能的に等価な配列と、置換Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｎの組合せ又は機能的に等価な残基と、を含む。

【0064】

かかる変異体は、配列番号１１を基準にしてＬ５２、Ａ１０８、Ｌ１３１、Ｔ３４０、Ｇ２８４、Ｈ２８７、Ｅ２８９、Ｗ４５０、Ｒ３５４、及びＡ５１０から選択される残基、又は機能的に等価な配列中の機能的に等価な残基に対応する位置に、少なくとも１つの置換をさらに含みうる。

【0065】

以上に開示されるように、前記変異体はまた、配列番号１１を基準にして一定の突然変異Ｌ５２Ｆ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｒ３５４Ｋ及び／若しくはＧ２８４Ｌ／Ｓ＋Ｈ２８７Ｄ＋Ｅ２８９Ａの組合せ又は機能的に等価な配列中の機能的に等価な残基を含みうる。

【0066】

さらなる態様によれば、本発明は、Ｍ６３Ｒ、Ｍ６３Ｑ、Ｌ１３１Ｐ、Ｒ２０７Ｌ、Ｒ２０７Ｎ、Ｄ２５０Ｖ、Ｒ３２４Ｐ、Ｒ３２４Ａ、Ｅ３２７Ｌ、Ｅ３２７Ｎ、又は機能的に等価な残基から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有して、配列番号１１に対して特定パーセント配列同一性内のアミノ酸配列又は機能的に等価な配列を含み、（ｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成可能であり、且つ（ｉｉ）３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを核断片に取込み可能である、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体を提供する。

【0067】

他の態様では、本発明は、少なくともＭ６３Ｒ＋Ｌ１３１Ｐ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｌ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ２０７Ｎ、Ｍ６３Ｒ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｒ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｒ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｒ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｍ６３Ｑ＋Ｌ１３１Ｐ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ２０７Ｌ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ２０７Ｎ、Ｍ６３Ｑ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｍ６３Ｑ＋Ｒ３２４Ａ、Ｍ６３Ｑ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｍ６３Ｑ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｌ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ２０７Ｎ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｒ３２４Ａ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｌ１３１Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｒ３２４Ａ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ２０７Ｌ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｄ２５０Ｖ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｒ３２４Ａ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ２０７Ｎ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ｐ、Ｄ２５０Ｖ＋Ｒ３２４Ａ、Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｄ２５０Ｖ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｌ、Ｒ３２４Ｐ＋Ｅ３２７Ｎ、Ｒ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｌ、及びＲ３２４Ａ＋Ｅ３２７Ｎから選択される置換の組合せ又は機能的に等価な残基を有して（ただし、位置は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を参照して番号付けされる）、配列番号１１に対して特定パーセント配列同一性内のアミノ酸配列又は機能的に等価な配列を含み、（ｉ）鋳型を用いずに核酸断片を合成可能であり、且つ（ｉｉ）３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを核断片に取込み可能である、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体を提供する。

【0068】

いくつかの実施形態によれば、ＴｄＴ変異体は、以上に記載の置換又は置換の組合せと、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５に対して少なくとも８０％の同一性内のアミノ酸配列と、を有し、いくつかの実施形態では、かかるアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性内にある。

【0069】

追加の修飾
ある実施形態では、ＴｄＴ変異体は、そのＮ末端、Ｃ末端、又は両末端にＨｉｓタグ配列などのいずれかのタイプのタグ付けペプチドをさらに含む。前記タグ付けペプチドは、精製、同定、発現増加、分泌性、又は触媒活性増加のために使用可能である。かかるさまざまタグは、文献に広範に記載されているので、当業者に公知のタグはすべて、本発明によりカバーされることが、理解されよう。

【0070】

本発明の変異体はまた、組換えポリメラーゼの精製などに使用するために、タンパク質のＮ及び／又はＣ末端領域に１つ以上の外因性又は異種の特徴を含みうる。

【0071】

本発明の変異体は、位置Ｃ３７８～Ｌ４０６の残基（ただし、位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照して番号付けされる）又は機能的に等価な残基の置換、配列番号３の配列のＰｏｌμポリメラーゼの残基Ｈ３６３～Ｃ３９０（ただし、位置は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を参照して番号付けされる）又は機能的に等価な残基による置換をさらに含みうる。

【0072】

有利には、ＴｄＴ変異体は、本開示の置換及びパーセント配列同一性値を有して、少なくとも配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５のアミノ酸配列を含む。

【0073】

核酸、発現カセット、ベクター
また、本発明の変異体をコードする核酸分子を提供することも、本発明の目的である。本明細書で用いられる場合、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ヌクレオチド配列」という用語は、同義的に用いられて、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの配列を意味する。一実施形態では、核酸はＤＮＡである。代替実施形態では、核酸はＲＮＡである。代替実施形態では、核酸はＸＮＡである。

【0074】

核酸は、一本鎖形又は二本鎖形又は両者の混合形でありうる。それは組換え起源、人工起源、及び／又は合成起源でありうるとともに、それは修飾ヌクレオチドを含みうる。かかる修飾は、エピジェネティック修飾などの天然修飾、又は標識、修飾結合、修飾プリン若しくはピリミジン塩基、修飾糖などの非天然修飾でありうる。一実施形態では、核酸分子は、メチル化、ヒドロキシメチル化、ホルミル化、又は５－カルボキシル化などの天然に存在するエピジェネティック修飾を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＸＮＡである。一実施形態では、核酸分子は、蛍光タグ、蛍光標識、相互作用基などの天然に存在しない修飾を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＸＮＡである。

【0075】

本発明の核酸は、単離形又は精製形でありうるとともに、当技術分野でそれ自体公知の技術により、たとえば、ｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、増幅、酵素合成、又は組換え技術により、作製、単離、及び／又は操作が可能である。核酸はまた、たとえば、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３４４０－３４４４に記載のように、周知の化学合成技術によりｉｎ ｖｉｔｒｏで合成可能である。

【0076】

本発明はまた、以上に定義されるＴｄＴ変異体をコードする核酸にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を包含する。好ましくは、かかるストリンジェント条件は、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中における約２．５時間にわたる約４２℃でのハイブリダイゼーションフィルターのインキュベーション、続いて、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中における１５分間にわたる６５℃でのフィルターの４回の洗浄を含む。使用されるプロトコルは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．（１９８８））及びＡｕｓｕｂｅｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９））などの参照文献に記載されている。

【0077】

本発明はまた、本発明のＴｄＴ変異体をコードする核酸を包含するとともに、前記核酸の配列又は少なくとも前記配列の一部は、最適化コドン使用頻度を用いて工学操作されている。

【0078】

代替的に、本発明に係る核酸は、本発明に係るＴｄＴ変異体の配列から推測されうるとともに、コドン使用頻度は、核酸が転写される宿主細胞に応じて適合化されうる。これらの工程は、当業者に周知の方法に従って行われうるとともに、そのいくつかは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１）の参照マニュアルに記載されている。

【0079】

一実施形態では、核酸分子は、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、又は１０００００ヌクレオチド超の長さを有する高分子である。

【0080】

本発明の核酸は、追加のヌクレオチド配列、たとえば、レギュラトリー領域、すなわち、選択された宿主細胞又は系でポリペプチドの発現を誘発又はレギュレートするために使用可能なプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、シグナルペプチドなどをさらに含みうる。

【0081】

本発明はさらに、好適な宿主細胞内で前記核酸の発現を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結された本発明に係る核酸を含む発現カセットに関する。典型的には、発現カセットは、制御配列たとえば転写プロモーター及び／又は転写ターミネーターに作動可能に連結された本発明に係る核酸を含むか又はそれからなる。制御配列は、本発明のＴｄＴ変異体をコードする核酸の発現のために宿主細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系により認識されるプロモーターを含みうる。プロモーターは、酵素の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異型、トランケート型、及びハイブリッド型プロモーターを含めて、宿主細胞内で転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドでありうるとともに、宿主細胞に対して同種又は異種のどちらかの細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得られうる。制御配列はまた、転写を終了するように宿主細胞により認識される転写ターミネーターでありうる。ターミネーターは、エステラーゼをコードする核酸の３’末端に作動可能に連結される。宿主細胞内で機能するターミネーターはいずれも、本発明で使用されうる。典型的には、発現カセットは、転写プロモーター及び転写ターミネーターに作動可能に連結された本発明に係る核酸を含むか又はそれからなる。

【0082】

本発明はまた、以上に定義される核酸又は発現カセットを含むベクターに関する。

【0083】

「ベクター」という用語は、宿主細胞内に組換え遺伝物質を移入するために媒体として使用されるＤＮＡ分子を意味する。メジャータイプのベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド、及び人工染色体である。ベクター自体は、一般に、インサート（異種核酸配列、トランスジーン）と、ベクターの「骨格」として機能するより大きな配列と、からなるＤＮＡ配列である。宿主に遺伝情報を移入するベクターの目的は、典型的には、標的細胞内でインサートを単離、増殖、又は発現することである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞内で異種配列を発現するように特異的に適合化されるとともに、一般に、ポリペプチドをコードする異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。一般に、発現ベクター中に存在するレギュラトリーエレメントは、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び任意に存在するオペレーターを含む。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内での自律複製のための複製起点、選択可能マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、及び高コピー数の潜在能力を含有する。発現ベクターの例は、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特異的設計プラスミド及びウイルスである。さまざまな宿主内で好適なポリペプチド発現レベルを提供する発現ベクターは、当技術分野で周知である。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターが導入されるべき宿主細胞との適合性に依存するであろう。

【0084】

本発明の他の目的は、以上に記載の核酸、発現カセット、又はベクターを含む宿主細胞を提供することである。そのため、本発明は、宿主細胞をトランスフォーム、トランスフェクト、又はトランスデュースするための、本発明に係る核酸、発現カセット、又はベクターの使用に関する。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとそれが導入されなければならない宿主細胞との適合性に依存するであろう。

【0085】

本発明によれば、宿主細胞は、一過的又は安定的にトランスフォーム、トランスフェクト、又はトランスデュースされうる。本発明の発現カセット又はベクターは、カセット又はベクターが染色体インテグラント又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように宿主細胞内に導入される。「宿主細胞」という用語はまた、複製時に発生する突然変異に起因して親宿主細胞と同等でない親宿主細胞のいずれの後代も包含する。宿主細胞は、本発明の変異体の生成に有用ないずれかの細胞たとえば原核細胞又は真核細胞でありうる。原核宿主細胞は、いずれかのグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌でありうる。宿主細胞はまた、酵母、真菌、哺乳動物、虫、植物の細胞などの真核細胞でありうる。

【0086】

本発明に係る核酸、発現カセット、又は発現ベクターは、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、トランスダクション、コンピテント細胞トランスフォーメーション、プロトプラストトランスフォーメーション、プロトプラスト融合、バイオリスティック「遺伝子銃」トランスフォーメーション、ＰＥＧ媒介トランスフォーメーション、脂質支援トランスフォーメーション又はトランスフェクション、化学的媒介トランスフェクション、リチウムアセテート媒介トランスフォーメーション、リポソーム媒介トランスフォーメーションなどの当業者に公知のいずれかの方法により宿主細胞に導入されうる。

【0087】

任意に、変異体の生成を増加させるために、本発明の核酸、カセット又はベクターの２つ以上のコピーを宿主細胞内に挿入しうる。

【0088】

修飾ヌクレオチド
本発明によれば、ＴｄＴ変異体は、修飾ヌクレオチド、好ましくは修飾３’Ｏ－ヌクレオチド、より好ましくは３’Ｏ－ブロックヌクレオチドを取込み可能である。

【0089】

本発明との関連では、「修飾ヌクレオチド」という表現は、３つのリン酸基に結合されたヌクレオシド（すなわち、デオキシリボース又はリボース糖分子に装着された塩基）を含有する分子であって、その末端：２’、３’、５’、又は塩基の１つに少なくとも１つの追加の基を有する分子を意味する。前記追加の基は、いずれかのホスホジエステル結合の形成を防止することにより（３’Ｏ－修飾、２’若しくは２’Ｏ修飾）、又は３’末端にかかる修飾ヌクレオチドを含むいずれかの核酸断片へのポリメラーゼの装着を立体的に防止することにより（５’又は塩基修飾）、ヌクレオチドのさらなる付加をブロックする。さらに、前記追加の基は、有利には、特異的切断反応を介してその基の除去を可能にする可逆性を有する。

【0090】

ヌクレオシド又はヌクレオチド三リン酸は、デオキシリボースを含有するヌクレオチドの例として、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、又はデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）を含む。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、又はウリジン三リン酸（ＵＴＰ）は、リボースを含有するヌクレオチド三リン酸のさらなる例である。他のタイプのヌクレオシド、たとえば、天然に存在する修飾ヌクレオシド及び人工ヌクレオシドは、ヌクレオチド三リン酸を形成するように３つのリン酸に結合されうる。

【0091】

特定実施形態では、修飾ヌクレオチドは、さらなるヌクレオチド付加を防止するためにヌクレオチド三リン酸の３’末端に可逆的に装着された基を含む３’Ｏ－ブロックヌクレオチドである。前記基は、アジドメチル、アミノオキシ、アリルなど、さまざまな化学性を有しうる。

【0092】

有利には、修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－ＮＨ_２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、３’Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸、又は３’－Ｏ－プロパルギルヌクレオシド三リン酸から選択される。

【0093】

［００２２］いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、プリン又はピリミジン塩基と、３’炭素原子が構造：
－Ｏ－Ｚ
の基を装着するように共有結合で装着された除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボース又はデオキシリボース糖部分と、を含む修飾ヌクレオチド又はヌクレオシド分子を含む。上記式中、－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）２－０－Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’’）２、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆのいずれかであり、各Ｒ’’は、除去可能な保護基であるか又はその一部であり、各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリールアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環式基、アシル基、シアノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロアリールオキシ基、若しくはアミド基、又は連結基を介して装着された検出可能な標識であり、ただし、いくつかの実施形態では、かかる置換基は、１０個までの炭素原子及び／又は５個までの酸素若しくは窒素ヘテロ原子を有し、或いは（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、各Ｒ’’’は、同一であっても異なっていてもよく、水素原子及びハロゲン原子及びアルキル基を含む群から選択され、ただし、いくつかの実施形態では、各Ｒ’’’のアルキルは、１～３個の炭素原子を有し、且つ分子は、各Ｒ’’がＨと交換された中間体を生じるように反応しうるか、又はＺが－（Ｒ’）２－Ｆであるとき、ＦがＯＨ、ＳＨ、又はＮＨ２、好ましくはＯＨと交換されて、中間体が、水性条件下で解離して遊離３’－ＯＨを有する分子を与え、ただし、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’であるとき、Ｒ’基は両方ともＨではない。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドのＲ’は、アルキル又は置換アルキルであり、ただし、かかるアルキル又は置換アルキルは、１～１０個の炭素原子及び０～４個の酸素又は窒素ヘテロ原子を有する。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの－Ｚは、式－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｚはアジドメチル基である。

【0094】

［００２３］いくつかの実施形態では、Ｚは、２００以下の分子量を有するヘテロ原子を含む又は含まない切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、１００以下の分子量を有するヘテロ原子を含む又は含まない切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、５０以下の分子量を有するヘテロ原子を含む又は含まない切断可能な有機部分である。

【0095】

さらなる特定実施形態では、「３’Ｏ修飾ヌクレオチド」とは、３’－Ｏ－メチル基、３’－アジド基、３’－Ｏ－アジドメチル基、３’－Ｏ－アミノ基、３’－アミノオキシ基、又は３’－Ｏ－アリル基のどれかを３’末端に有するヌクレオチド三リン酸を意味する。さらなる実施形態では、３’－ブロックヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル基、３’－アミノオキシ基、又は３’－Ｏ－アリル基のどれかによりブロックされる。他の実施形態では、「３’Ｏ修飾ヌクレオチド」とは、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ヒドロキシルアミン、ボレート、ナイトレート、糖、ホスホルアミド、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート、サルフェート、スルホン、又はアミノ酸のどれかを３’末端に有するヌクレオチド三リン酸を意味する。いくつかの実施形態では、上記の３’－Ｏ－ブロッキング基は、１００以下の分子量を有する。

【0096】

他の実施形態では、本発明の３’－Ｏ－ブロッキング基は、メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、アリル、アミン、アジドメチル、ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、又はプロパルギルを含む。

【0097】

さらなる特定実施形態では、「３’Ｏ修飾ヌクレオチド」とは、国際公開第２０１６０３４８０７号パンフレットに記載されるようなターミネーターエフェクター修飾基を有するヌクレオチド三リン酸を意味する。

【0098】

興味深いことに、本発明の変異体は、野生型ＴｄＴと比較して修飾ヌクレオチドへの親和性の増加、ひいては核酸合成時に核酸配列へのかかる修飾ヌクレオチドの取込み能力の増加を呈する。より特定的には、本発明の変異体は、修飾３’Ｏ－ヌクレオチド（より特定的には３’Ｏ－ブロックヌクレオチド）の使用及び核酸配列への取込みが可能であり、これは野生型ＴｄＴでは可能でない（Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２０１１，１７：２９０３を参照されたい）。

【0099】

特定態様によれば、本発明は、核酸酵素合成プロセスで修飾ヌクレオチドを用いて、とくに３’Ｏ－修飾ヌクレオチド（たとえば３’Ｏ－ブロックヌクレオチド）を用いて作業可能であり、且つ長さの長い核酸分子又は核酸分子の誘導体を生成する能力を有する、ＴｄＴ変異体に関する。

【0100】

核酸の酵素合成
本発明の目的は、Ｙｂｅｒｔらの国際公開第２０１５／１５９０２３号パンフレット、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）、Ｈｉａｔｔらの米国特許第５８０８０４５号明細書に記載されるように、核酸の合成に使用しうるＴｄＴ変異体を提供することである。より特定的には、本発明の目的は、開始核酸鎖への修飾ヌクレオチドの付加に好適なＴｄＴ変異体を提供することである。その際、ブロッキング基は、修飾ヌクレオチドの新たな付加を可能にするために除去されうる。

【0101】

本発明によれば、本発明の変異体の使用により、付加及び脱保護を含む逐次サイクルを実現可能である。したがって、本プロセスは、可逆修飾ヌクレオチドの付加及びさらなるブロッキング基の除去の複数サイクルにより、開始核酸鎖を定義配列に制御伸長させることを可能にするであろう。

【0102】

本発明は、いずれかの酵素核酸合成プロセスにおける本発明に係る修飾ＴｄＴの使用を企図する。

【0103】

そのため、本発明の目的は、あらかじめ決められた配列を有するポリヌクレオチドの合成方法であって、
ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有する開始剤を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチドが形成されるまで、（ｉ）開始剤又は伸長断片が３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の取込みにより伸長されて３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成するように、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する開始剤又は伸長断片と、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸及び本発明のＴｄＴ変異体と、を伸長条件下で接触させることと、（ｉｉ）伸長断片をデブロックして遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成することと、のサイクルを繰り返すことと、
を含む合成方法を提供することである。

【0104】

また、本発明の目的は、鋳型を用いない核酸分子の合成プロセスであって、核酸プライマーと、少なくとも１種のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１種の３’Ｏ－修飾ヌクレオチド及び本発明の変異体の両方と、を接触させる工程を含む合成プロセスを提供することである。

【0105】

本発明は、酵素核酸合成プロセスの概念を企図する。かかるプロセスでは、核酸分子は、いかなる鋳型鎖も存在させずにｄｅ ｎｏｖｏ合成される。それゆえ、順序付けられたヌクレオチド配列は、本発明の変異体の助けを借りて開始剤核酸断片に結合される。成長核酸鎖への各ヌクレオチドの定量的結合、より一般的には高い結合効率がきわめて重要であることは、理解されよう。天然ヌクレオチドや永久標識ヌクレオチドなどの非ターミネーターヌクレオチドは、合成配列に対するいかなる制御も許容しないであろうこと、たとえば、無制御の望ましくないポリ付加をもたらすであろうこともまた、理解されよう。

【0106】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの合成方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤を提供する工程と、（ｂ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の存在下で遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤又は伸長中間体と本発明の変異体ＴｄＴとを伸長条件下で反応させて３’－Ｏ－ブロック伸長中間体を生成する工程と、（ｃ）伸長中間体をデブロックして遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を生成する工程と、（ｄ）ポリヌクレオチドが合成されるまで工程（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す工程と、を含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの合成方法は、（ａ）固形担体に装着された開始剤を提供する工程であって、開始剤が、遊離３’－ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドである、工程と、（ｂ）３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の存在下で遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤又は伸長中間体と本発明の変異体ＴｄＴとを伸長条件下で反応させて３’－Ｏ－ブロック伸長中間体を生成する工程と、（ｃ）固形担体を洗浄して取り込まれていない３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸を除去する工程と、（ｄ）固形担体をデブロッキング剤に暴露することにより伸長中間体をデブロックして遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を生成する工程と、（ｅ）ポリヌクレオチドが合成されるまで工程（ｂ）及び（ｄ）を反復する工程と、を含む。本方法は、固形担体から完成ポリヌクレオチドを切断するさらなる工程を含みうる。

【0108】

いくつかの実施形態では、ＴｄＴ触媒付加反応に対して、酵素条件は、３’－ヒドロキシルを保護する除去可能なブロッキング部分を有する約０．２０～約２００μＭのヌクレオチドと、開始基質に由来する約０．２０～２００μＭの遊離非修飾３’－ヒドロキシルと、を含有しうる。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、約１０～約５００ｍＭカコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５～７．５）及び約０．０１～約１０ｍＭ２価カチオン（たとえばＣｏＣｌ_２又はＭｎＣｌ_２）を含有する。他の緩衝液組成及び成分は、本発明の望ましい特定実施形態に好適でありうる。

【0109】

本発明との関連では、「切断反応」という表現は、可逆修飾ヌクレオチドに関して以上に記載された追加の基を切断可能な物質又は物理的条件のいずれかの作用を意味する。当業者であれば、先に列挙されたいずれの基に対しても切断反応を決定可能である。

【0110】

一実施形態では、切断剤は化学切断剤である。代替実施形態では、切断剤は酵素切断剤である。

【0111】

切断剤の選択は、使用される３’－ヌクレオチドブロッキング基のタイプに依存することが、当業者であれば理解されよう。たとえば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、３’Ｏ－アジドメチル基を切断するために使用可能であり、パラジウム錯体、３’Ｏ－アリル基を切断するために使用可能であり、又は亜硝酸ナトリウムは、３’Ｏ－アミノ基を切断するために使用可能である。特定実施形態では、切断反応は、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体、又は亜硝酸ナトリウムが関与する。

【0112】

特定実施形態では、切断反応は、変性剤（たとえば、ウレア、グアニジニウムクロライド、ホルムアミド、又はベタイン）などの追加成分の存在下で実施される。さらなる実施形態では、切断反応は、１種以上の緩衝液を用いて実施される。当業者であれば、緩衝液の選択は、反応の厳密な機序に依存することが理解されよう。

【0113】

本発明は、定量的方法で修飾ヌクレオチドを取り込む能力を有するＴｄＴ変異体に関する。「定量的方法」又は「定量的反応」とは、完了に至る反応、すなわち、反応体が完全に産物に変換される反応を意味する。定量的方法で可逆修飾ヌクレオチドを取り込むポリメラーゼは、核酸のあらゆる断片を伸長可能なポリメラーゼであり、すべての利用可能なヌクレオチドが長さｎのすべての開始断片から長さｎ＋１の断片への変換をもたらす。

【0114】

本明細書で用いられる場合、「開始断片」とは、さらに伸長可能な遊離３’末端を有する短いオリゴヌクレオチド配列を意味する。一実施形態では、開始断片はＤＮＡ開始断片である。代替実施形態では、開始断片はＲＮＡ開始断片である。

【0115】

一実施形態では、開始断片は、３～１００ヌクレオチド、とくに３～２０ヌクレオチドを有する。

【0116】

一実施形態では、開始断片は一本鎖である。代替実施形態では、開始断片は二本鎖である。

【0117】

一実施形態では、開始断片は固形担体に固定される。開始断片は、各種方法で固形担体に装着されて、断片が受ける各種酵素反応条件下又は合成反応条件下で安定状態をもたらしうる。

【0118】

一実施形態では、開始断片は、化学切断可能なリンカー、抗体／免疫原性エピトープ、ビオチン／ビオチン結合タンパク質、又はグルタチオン－ＧＳＴタグなどの可逆相互作用部分を介して固形担体に固定される。さらなる実施形態では、開始断片は、ジスルフィド、アリル、アジドマスクヘミアミナールエーテルリンカーなどの化学切断可能なリンカーを介して固形担体に固定される。

【0119】

開始断片中、固定部は、少なくとも１つの制限部位を含有する。特異的部位で核酸鎖を選択的に加水分解する制限酵素及び制限部位の使用は、文献に記載されている。当業者であれば、開始断片切断部位配列にマッチする適切な制限酵素を選ぶことができるであろう。

【0120】

代替実施形態では、開始断片は、少なくとも１つのウリジンを含有する。ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理は、脱塩基部位を発生する。脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）部位エンドヌクレアーゼによる適切な基質の処理は、核酸鎖を抽出するであろう。

【0121】

用途
本明細書には、核酸合成、オリゴヌクレオチド合成、プローブ合成、タグ付け、核酸増幅、アプタマー、治療用核酸分子、薬剤標的発見及び検証、疾患診断、代謝工学操作、データ記憶、作物改良、ライブラリー設計、シーケンシングプール、核酸標識若しくは装着又は核酸分子が関与するいずれかの他の用途に使用されるＴｄＴ変異体の使用が記載されている。

【0122】

変異体ＴｄＴの生成
本発明の変異体は、既知の参照又は野生型ＴｄＴコードポリヌクレオチドを突然変異させてから従来の分子生物学技術を用いてそれを発現させることにより生成されうる。たとえば、マウスＴｄＴ遺伝子（配列番号１）は、従来の分子生物学技術を用いて、たとえば、Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１６４：４９－５３（１９９５）、Ｋｏｄｕｍａｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：１５５７３－１５５７８（２００４）などに記載のプロトコルを用いて、合成断片からアセンブルされうるか、又はＢｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１９９－２０８（１９９８）、Ｂｅｎｔｏｌｉｌａ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４２２１－４２２９（１９９５）などに記載のプロトコルを用いて、マウス細胞から直接クローニングされうる。

【0123】

たとえば、単離されたＴｄＴ遺伝子は、ｐＥＴ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの発現ベクターに挿入してベクターｐＣＴｄＴを与えるとともに、これは、次いで、従来のプロトコルを用いて変異体ＴｄＴタンパク質を作製及び発現するために使用されうる。適正配列を有するベクターは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロデューサー株にトランスフォームされうる。

【0124】

トランスフォーム株は、従来の技術を用いてペレットに培養され、これからＴｄＴタンパク質が抽出される。たとえば、事前に調製されたペレットは、３０～３７℃の水浴中で解凍される。十分に解凍した後、ペレットは、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５％グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）、及び１００ｍＬプロテアーゼカクテル阻害剤用錠剤１錠（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で構成されるライシス緩衝液中に再懸濁される。早期ライシス及びアグリゲート残留を回避するために、注意深い再懸濁を行う。再懸濁細胞は、フレンチプレスに何サイクルか通して十分な色均一性が得られるまでライシスされる。使用される通常の圧力は１４，０００ｐｓｉである。次いで、ライセートは、１ｈ～１ｈ３０にわたり１０，０００ｒｐｍで遠心分離される。遠心分離物は、０．２μｍフィルターに通してデブリを除去してからカラム精製にかけられる。

【0125】

ＴｄＴタンパク質は、１工程アフィニティー手順で遠心分離物から精製されうる。たとえば、ポリメラーゼを結合するためにＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が使用される。最初に、カラムを洗浄して、１５カラム体積の５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で平衡化させた。平衡化後、ポリメラーゼをカラムに結合させる。次いで、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で構成される洗浄緩衝液を１５カラム体積でカラムに適用する。洗浄後、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び０．５Ｍイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）を用いてポリメラーゼを溶出させる。最高濃度の対象ポリメラーゼに対応する画分を捕集して、単一サンプルにプールする。透析緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ６．８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、１００ｍＭ［ＮＨ４］２ＳＯ４）に対してプール画分を透析する。続いて、濃縮フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３０、Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の助けを借りて透析液を濃縮する。濃縮酵素を少量のアリコートに分配し、最終５０％グリセロールを添加し、次いでそれらのアリコートを－２０℃でフリーズして長期にわたり貯蔵する。精製酵素の各種画分５μＬをＳＤＳＰＡＧＥゲルで分析する。

【0126】

キット、酵素、及びヌクレオチド組成物
本発明の特定態様は、本発明に係るＴｄＴの変異体と、本発明のいずれかの特定態様では任意に開始断片、１種以上の可逆ターミネーターヌクレオチド、切断反応に使用される追加の酵素及び試薬から選択される１種以上の成分のいずれかの組合せと、を含む組成物及びキットの使用に関する。前記キットは、酵素核酸合成法に使用可能である。

【0127】

本発明は、本発明に係る、又は本発明のいずれかの特定態様に係るＴｄＴ変異体と、適切な緩衝液及び比濃度を有する混合物中の可逆修飾ヌクレオチドと、を含む物質組成物をカバーする。

【実施例】

【0128】

実施例１－本発明に係るＴｄＴ変異体の生成、発現、及び精製
発現株の生成
ＴｄＴマウス遺伝子は、［Ｂｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，１９９－２０８］に記載のｐＥＴ２８プラスミドから生成された。配列番号４の配列（タグＴｄＴ）は、下記のプライマー：
・Ｔ７－ｐｒｏ：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号５）
・Ｔ７－ｔｅｒ：ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ（配列番号６）
を用いて標準的分子生物学技術により増幅された。次いで、配列をプラスミドｐＥＴ３２骨格中にクローニングして新たなｐＣＴｄＴプラスミドを与える。

【0129】

シーケンシング後、ｐＣＴｄＴを市販のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ製のＤＥ３）にトランスフォームする。カナマイシンを用いてプレート上の成長コロニーを単離してＥｃ－ＣＴｄＴと命名する。

【0130】

ポリメラーゼ変異体の生成
出発ベクターとしてｐＣＴｄＴベクターを使用する。１つ又は複数の点突然変異を含む特異的プライマーは、Ａｇｉｌｅｎｔオンラインソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ：８０／ｐｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎＰｒｏｇｒａｍ．ｊｓｐ）から生成された。標的突然変異を含む所望の修飾ポリメラーゼを生成するために、市販のキットＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。実験手順は供給元のプロトコルに従った。さまざまなベクターの生成後、それらの各々をシーケンスした。以上に記載したように、適正配列を有するベクターをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロデューサー株にトランスフォームした。カナマイシンＬＢ寒天プレート上で成長可能なクローンを単離する。

【0131】

発現
適切量のカナマイシンが補足された５０ｍＬのＬＢ培地が入った２５０ｍＬエルレンに接種すべくＥｃ－ＣＴｄＴ株及びＥｃクローン株を使用する。３７℃で一晩成長させた後、カナマイシンを有する２Ｌ ＬＢ培地が入った５Ｌエルレンに接種すべく適切量のこれらのプレ培養物を使用する。５Ｌ培養物の初期ＯＤは、０．０１になるように選ばれる。強いアジテーション下でエルレンを３７℃に設定してさまざまな培養物のＯＤを定期的にチェックする。０．６～０．９のＯＤに達した後、１ｍＬの１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド、Ｓｉｇｍａ）の添加により各エルレンを補足する。３７℃の制御温度下でエルレンをアジテーション状態に戻す。一晩発現後、いくつかのペレットで細胞を採取する。同一の変異体を発現するペレットをプールして最終的には数ヶ月間にわたり－２０℃で貯蔵する。

【0132】

抽出
事前に調製されたペレットは、３０～３７℃の水浴中で解凍される。十分に解凍した後、ペレットは、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５％グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）、及び１００ｍＬプロテアーゼカクテル阻害剤用錠剤１錠（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で構成されるライシス緩衝液中に再懸濁される。早期ライシス及びアグリゲート残留を回避するために、注意深い再懸濁を行う。再懸濁細胞は、フレンチプレスに何サイクルか通して十分な色均一性が得られるまでライシスされる。使用される通常の圧力は１４，０００ｐｓｉである。次いで、ライセートは、１ｈ～１ｈ３０にわたり１０，０００ｒｐｍで遠心分離される。遠心分離物は、０．２μｍフィルターに通してデブリを除去してからカラム精製にかけられる。

【0133】

精製
生成及び抽出されたポリメラーゼ酵素を精製するために、１工程アフィニティー手順を使用する。ポリメラーゼを結合するためにＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が使用される。最初に、カラムを洗浄して、１５カラム体積の５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で平衡化させた。平衡化後、ポリメラーゼをカラムに結合させる。次いで、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で構成される洗浄緩衝液を１５カラム体積でカラムに適用する。洗浄後、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び０．５Ｍイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）を用いてポリメラーゼを溶出させる。最高濃度の対象ポリメラーゼに対応する画分を捕集して、単一サンプルにプールする。透析緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ６．８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、１００ｍＭ［ＮＨ_４］_２ＳＯ_４）に対してプール画分を透析する。続いて、濃縮フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３０、Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の助けを借りて透析液を濃縮する。濃縮酵素を少量のアリコートに分配し、最終５０％グリセロールを添加し、次いでそれらのアリコートを－２０℃でフリーズして長期にわたり貯蔵する。精製酵素の各種画分５μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析する。

【0134】

実施例２－蛍光プライマーを用いたＴｄＴ変異体の活性の評価
活性試験
実施例１に従って生成、発現、及び精製されたＴｄＴ変異体の伸長性能は、下記のアッセイにより評価される。結果はすべて、互いに及び野生型ＴｄＴ酵素と及びいずれのポリメラーゼ酵素も欠如している対照チューブと比較される。

【0135】

【表5】

【0136】

活性緩衝液は、たとえば、ＣｏＣｌ_２が補足されたＴｄＴ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）を含む。使用されるプライマーは下記の通りである：
５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ－３’（配列番号７）。

【0137】

プライマーは、５’末端にＡＴＴＯ蛍光色素も有する。

【0138】

使用されたヌクレオチド（表５にｄＮＴＰと記される）は、３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ＯＮＨ_２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、たとえば、３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシアデノシン－５’－三リン酸などである。

【0139】

試験されたさまざまな各変異体に対して、１つのチューブをその反応に使用する。水から始めて次いで表５の順に、試薬をチューブに添加する。３７℃で３０分後、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加により反応を停止させる。

【0140】

分析
分析は、ポリアクリルアミドゲル分析が関与する。活性試験のサンプルは、ポリアクリルアミド１６％（ｂｉｏｒａｄ）変性ゲルに通して分析される。ゲルは、分析直前にガラスプレート内にポリアクリルアミドを注加して重合させることにより作製される。ガラスプレート内のゲルは、電気泳動工程のためにＴＢＥ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で満たされた適合タンクに実装される。分析サンプルはゲルのトップにロードされる。ゲルのトップとボトムとの間に３～６ｈにわたり室温で５００～２，０００Ｖの電圧が印加される。サンプル標的サイズに従って泳動させた後、システムを取り出してＴｙｐｈｏｏｎ機器（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてゲル蛍光をスキャンする。画像取得後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて修飾ヌクレオチドの取込みパーセントを分析する。

【0141】

実施例３－非標識プライマーを用いたＴｄＴ変異体の活性の評価
活性試験
実施例１に従って生成、発現、及び精製された変異体５の伸長性能は、下記のアッセイにより評価される。結果はすべて、前の研究から得られた参照変異体（配列番号９）及びいずれのポリメラーゼ酵素も欠如している対照チューブと比較される。

【0142】

【表6】

【0143】

使用されるプライマーは下記の通りである：
５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧ－３’（配列番号８）。

【0144】

使用されたヌクレオチド（表６にｄＮＴＰと記される）は、３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、たとえば、３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシアデノシン－５’－三リン酸などである。

【0145】

試験された各変異体に対して、１つのチューブをその反応に使用した。水から始めて次いで表６の順に、試薬をチューブに添加する。３７℃で３０分後、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加により反応を停止させた。

【0146】

分析
分析では、液体クロマトグラフィー及び質量分析計の検出及び定量（ＬＣ／ＭＳ）が使用された。活性試験のサンプルはＬＣ／ＭＳにより分析される。サンプルはＬＣ／ＭＳ機器にロードされ、標準的オリゴヌクレオチド分離法が実施される。データ獲得に続いて、デコンボリューション及びスペクトル計算が行われた。

【配列表】

2022534004000001.app

【国際調査報告】