特表2022-537960哺乳動物細胞における非天然アミノ酸の組み込みのための強化されたプラットフォーム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-31
(54)【発明の名称】哺乳動物細胞における非天然アミノ酸の組み込みのための強化されたプラットフォーム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220824BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220824BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220824BHJP
C40B 40/02 20060101ALI20220824BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220824BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220824BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20220824BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/86 Z
C12N5/10
C40B40/02
C12P21/02 C
C12N15/31
C12N15/52 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021574260
(86)(22)【出願日】2020-06-19
(85)【翻訳文提出日】2022-02-10
(86)【国際出願番号】 US2020038766
(87)【国際公開番号】W WO2020257668
(87)【国際公開日】2020-12-24
(31)【優先権主張番号】62/864,570
(32)【優先日】2019-06-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503054225
【氏名又は名称】トラスティーズ オブ ボストン カレッジ
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】チャッタージー アブヒシェク
(72)【発明者】
【氏名】ケレメン レイチェル イー．
(72)【発明者】
【氏名】ジェウェル デリラ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064AG01
4B064CA19
4B064CA21
4B064CB30
4B064CC03
4B064CC06
4B064CC12
4B064CC24
4B064CD09
4B064CD21
4B064CE02
4B064DA20
4B065AA01Y
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA21
4B065BB15
4B065BB37
4B065BC03
4B065BC07
4B065BD01
4B065BD09
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA27
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、１）ウイルス支援指向性進化プラットフォームを使用して、哺乳動物細胞における操作されたナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの活性を有意に改善する能力、２）哺乳動物細胞において著しく改善されたＵａａ組み込み効率を示す古細菌ピロリジル及び大腸菌ロイシルｔＲＮＡの変異体を提供する能力、並びに３）これらのｔＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞において著しく向上した収率でＵａａを組み込む組み換えタンパク質を発現する能力に関与する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
バリアント古細菌サプレッサーｔＲＮＡ又はバリアント細菌サプレッサーｔＲＮＡを含む組成物であって、前記バリアントｔＲＮＡは、その野生型対応ｔＲＮＡと比較して、非天然アミノ酸を哺乳類タンパク質に組み込むための活性が増大している組成物。
【請求項2】
前記バリアントｔＲＮＡの活性が、前記野生型ｔＲＮＡに対して約２．５～８０倍増大している請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記バリアント古細菌ｔＲＮＡがメタノサルシナ又はデスルフィトバクテリウムのファミリーに由来する請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記バリアント古細菌ｔＲＮＡが、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｂ）、メタノサルシナ・アルバス（Ｍａ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｍ）又はデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｈ）からなる群から選択される請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記バリアントｔＲＮＡが、配列番号１に由来するピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）である請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記バリアントｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号２～２７からなる群から選択される配列、又は配列番号２～２７のいずれかの全長配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記バリアント細菌ｔＲＮＡが大腸菌ｔＲＮＡに由来する請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項8】
前記バリアントｔＲＮＡが配列番号２８に由来するロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）である請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記バリアントｔＲＮＡＬｅｕが、配列番号２９～４５からなる群から選択される配列番号、又は配列番号２９～４５のいずれかの全長配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記非天然アミノ酸が構造１～６のいずれかに従うものである請求項５又は請求項６に記載の組成物。
【請求項11】
前記非天然アミノ酸が構造７～１２のいずれかに従うものである請求項８又は請求項９に記載の組成物。
【請求項12】
バリアント古細菌サプレッサーｔＲＮＡ又はバリアント細菌サプレッサーｔＲＮＡを含むウイルスベクターであって、前記バリアントｔＲＮＡは、その野生型対応ｔＲＮＡと比較して、非天然アミノ酸を哺乳類タンパク質に組み込むための活性が増大しているウイルスベクター。
【請求項13】
前記バリアントｔＲＮＡの活性が、前記野生型ｔＲＮＡに対して約２．５～８０倍増大している請求項１２に記載のウイルスベクター。
【請求項14】
前記バリアント古細菌ｔＲＮＡがメタノサルシナ又はデスルフィトバクテリウムのファミリーに由来する請求項１３に記載のウイルスベクター。
【請求項15】
前記バリアント古細菌ｔＲＮＡが、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｂ）、メタノサルシナ・アルバス（Ｍａ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｍ）又はデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｈ）からなる群から選択される請求項１４に記載のウイルスベクター。
【請求項16】
前記バリアントｔＲＮＡが、配列番号１に由来するピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）である請求項１５に記載のウイルスベクター。
【請求項17】
前記バリアントｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号２～２７からなる群から選択される配列、又は配列番号２～２７の全長配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項１６に記載のウイルスベクター。
【請求項18】
前記バリアント細菌ｔＲＮＡが大腸菌ｔＲＮＡに由来する請求項１２に記載のウイルスベクター。
【請求項19】
前記バリアントｔＲＮＡが配列番号２８に由来するロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）である請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項20】
前記バリアントｔＲＮＡＬｅｕが、配列番号２９～４５からなる群から選択される配列、又は配列番号２９～４５の全長配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項１９に記載のウイルスベクター。
【請求項21】
前記非天然アミノ酸が構造１～６のいずれかに従うものである請求項１６又は請求項１７に記載のウイルスベクター。
【請求項22】
前記非天然アミノ酸が構造７～１２のいずれかに従うものである請求項１９又は請求項２０に記載のウイルスベクター。
【請求項23】
前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である請求項１２から請求項２２のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項24】
請求項１２から請求項２３のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む細胞。
【請求項25】
細胞が哺乳動物細胞である請求項２４に記載の細胞。
【請求項26】
前記細胞が、ａ）ウイルス複製に必須のタンパク質であって、ナンセンスコドンが前記タンパク質の配列に挿入されており、ウイルス複製が前記バリアントサプレッサーｔＲＮＡの活性に依存するようにされたタンパク質、
ｂ）同族のＵａａ ＲＮＡ合成酵素（ＵａａＲＳ）、及び
ｃ）ウイルス複製に必要な遺伝子成分
をコードするプラスミドをさらに含む請求項２４又は請求項２５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項27】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスであり、前記必須ウイルスタンパク質がＣａｐ（配列番号４６）のＴＡＧ変異体である請求項２６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項28】
前記同族のａａＲＳがＭｂＰｙｌＲＳであり、前記Ｕａａが構造１～６のいずれか１つである請求項２７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項29】
前記同族のａａＲＳが大腸菌ＬｅｕＲＳであり、前記Ｕａａが構造７～１２のいずれか１つである請求項２６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項30】
野生型サプレッサーｔＲＮＡと比較して増大した生物学的活性を有する目的の直交性サプレッサーｔＲＮＡバリアントのウイルス支援指向性進化方法であって、ａ）目的のサプレッサーｔＲＮＡバリアントのライブラリをウイルスゲノムにコードする工程と、
ｂ）哺乳動物宿主細胞の集団を低い感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターに感染させて、前記細胞集団を前記細胞におけるウイルス複製に適した条件下に維持する工程であって、哺乳動物細胞におけるウイルス複製は、目的のｔＲＮＡバリアントの活性に依存する必須タンパク質の発現を必要とする工程と、
ｃ）活性なｔＲＮＡバリアントをコードするウイルス子孫を採取し、選択的に増幅して、交差反応性があるｔＲＮＡ分子を除去する工程であって、これにより、増大した生物学的活性を有する直交性のサプレッサーｔＲＮＡバリアントが回収される工程と
を含む方法。
【請求項31】
野生型サプレッサーｔＲＮＡと比較して増大した生物学的活性を有する目的の直交性サプレッサーｔＲＮＡバリアントのウイルス支援指向性進化方法であって、哺乳動物細胞における前記ウイルスの複製は、目的のｔＲＮＡバリアントの活性に依存する必須タンパク質の発現を必要とし、前記方法は、ａ）サプレッサーｔＲＮＡバリアントのライブラリをウイルスゲノムにコードする工程と、
ｂ）哺乳動物宿主細胞の集団を低い感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターに感染させる工程と、
ｃ）その後に、哺乳動物宿主細胞の集団をプラスミドでトランスフェクトする工程であって、前記プラスミドは、
ｉ）ウイルス複製に必須のタンパク質であって、ナンセンスコドンが前記タンパク質の配列に挿入されており、ウイルス複製が前記バリアントサプレッサーｔＲＮＡの活性に依存するようにされたタンパク質、
ｉｉ）同族のＵａａ ＲＮＡ合成酵素（ＵａａＲＳ）、及び
ｉｉｉ）ウイルス複製に必要な遺伝子成分
を含む工程と、
ｄ）実質的に同時に、適切な非天然アミノ酸を培養培地に添加する工程と、
ｅ）感染した／トランスフェクトされた細胞を、前記ウイルスの複製に適した条件下で培地中に維持する工程と、
ｆ）前記細胞を採取し、ウイルス子孫を単離する工程と、
ｇ）工程ｆ）で単離されたウイルスを、光切断可能なリンカーを介して結合した精製ハンドルで標識する工程と、
ｈ）標識されたウイルスを濃縮により回収し、次いで適切な波長での照射を使用して放出する工程と、
ｉ）回収された前記ウイルスを溶解し、溶解液に含まれるｔＲＮＡバリアントを増幅する工程であって、それによって、増大した生物学的活性を有する直交性のサプレッサーｔＲＮＡバリアントが回収される工程と
を含む方法。
【請求項32】
前記ライブラリの前記サプレッサーｔＲＮＡバリアントが、ウイルスにコード化する前に配列決定される請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
増幅されたｔＲＮＡを配列決定して、目的の前記サプレッサーｔＲＮＡの核酸配列を得る工程をさらに含む請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
前記ウイルスがアデノ随伴ウイルスである請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項35】
前記ウイルス必須タンパク質が、アデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質（ＣＡＰ）（配列番号４６）であり、前記タンパク質の４５４位に終止コドンを含むよう変異している請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項36】
前記宿主哺乳動物細胞に単一のビリオンしか感染しない請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項37】
前記ｔＲＮＡライブラリがピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）ライブラリであり、前記ＵａａＲＳがＭｂＰｙｌＲＳであり、前記Ｕａａが構造１～６のいずれか１つである請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項38】
前記バリアントｔＲＮＡがロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）であり、前記ａａＲＳが大腸菌ＬｅｕＲＳであり、前記Ｕａａが構造７～１２のいずれか１つである請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項39】
哺乳動物細胞におけるタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質は、前記タンパク質中の特定の位置に１つ以上のアミノ酸アナログを有し、前記方法は、ａ．前記哺乳動物細胞を増殖に適した条件下で、培養培地中で培養する工程であって、前記細胞は、１つ以上のセレクターコドンを有するタンパク質をコードする核酸を含み、前記細胞は、前記セレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント古細菌由来ピロリジルｔＲＮＡ、及びその同族のアミノアシル－ＲＮＡ合成酵素をさらに含む工程と、
ｂ．前記セレクターコドンに応答して１つ以上のリジンアナログが前記タンパク質に組み込まれるのに適した条件下で、前記細胞培養培地を１つ以上のリジンアナログと接触させる工程であって、これにより、１つ以上のリジンアナログを有するタンパク質を製造する工程と
を含む方法。
【請求項40】
前記バリアントｔＲＮＡが、配列番号１に由来するピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）である請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記バリアントｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号２～２７からなる群から選択される配列、又は配列番号２～２７のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記リジンアナログが、構造１～６のいずれかである請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
哺乳動物細胞におけるタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質は、前記タンパク質中の特定の位置に１つ以上のアミノ酸アナログを有し、前記方法は、ａ．前記哺乳動物細胞を増殖に適した条件下で、培養培地中で培養する工程であって、前記細胞は、１つ以上のセレクターコドンを有するタンパク質をコードする核酸を含み、前記細胞は、前記セレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント大腸菌由来のロイシルｔＲＮＡ、及びその同族アミノアシル－ＲＮＡ合成酵素をさらに含む工程と、
ｂ．前記セレクターコドンに応答して１つ以上のロイシンアナログが前記タンパク質に組み込まれるのに適した条件下で、前記細胞培養培地を１つ以上のロイシンアナログと接触させる工程であって、これにより、１つ以上のロイシンアナログを有するタンパク質を製造する工程と
を含む方法。
【請求項44】
前記バリアントｔＲＮＡが、配列番号２８に由来するロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）である請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記バリアントｔＲＮＡＬｅｕが、配列番号２９～４５のいずれか１つ、又は配列番号２９～４５のいずれかの全長配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項４３又は請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記ロイシンアナログが、構造７～１２のいずれかである請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
１つ以上のピロリジル残基を細胞中のタンパク質又はペプチドに部位特異的に組み込む方法であって、ａ．前記細胞を増殖に適した条件下で培養培地中で培養する工程であって、前記細胞は、目的のタンパク質又はペプチド中の特定の部位に１つ以上のアンバー、オーカー又はオパールのセレクターコドンを有する目的のタンパク質又はペプチドをコードする核酸を含み、前記細胞は、前記セレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント古細菌由来ピロリジル－ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含み、かつ古細菌ＰｙｌＲＮＡ合成酵素をさらに含む工程と、
ｂ．前記細胞培養培地を、前記セレクターコドンの部位で１つ以上のピロリジル残基を前記タンパク質又はペプチドに組み込むのに適した条件下で、１つ以上のピロリジル残基と接触させる工程であって、これにより、１つ以上の部位特異的に組み込まれたピロリジル残基を有する目的のタンパク質又はペプチドを製造する工程と
を含む方法。
【請求項48】
前記バリアントピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）が配列番号１に由来する請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記バリアントｔＲＮＡＰｙｌが、配列番号２～２７からなる群から選択される配列、又は配列番号２～２７のいずれかの全長配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項４７又は請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記ピロリジル残基が構造１～６のいずれかである請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
１つ以上のロイシンアナログ残基を細胞中のタンパク質又はペプチドに部位特異的に組み込む方法であって、ａ．前記細胞を増殖に適した条件下で培養培地中で培養する工程であって、前記細胞は、目的のタンパク質又はペプチド中の特定の部位に１つ以上のアンバー、オーカー又はオパールのセレクターコドンを有する目的のタンパク質又はペプチドをコードする核酸を含み、前記細胞は、前記セレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント大腸菌由来ｔＲＮＡＬｅｕをさらに含み、かつ大腸菌ＬｅｕＲＮＡ合成酵素をさらに含む工程と、
ｂ．前記細胞培養培地を、前記セレクターコドンの部位で１つ以上のロイシンアナログ残基を前記タンパク質又はペプチドに組み込むのに適した条件下で、１つ以上のロイシンアナログ残基と接触させる工程であって、これにより、１つ以上の部位特異的に組み込まれたロイシン残基を有する目的のタンパク質又はペプチドを製造する工程と
を含む方法。
【請求項52】
前記バリアントｔＲＮＡが、配列番号２８に由来するロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）である請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記バリアントｔＲＮＡＬｅｕが、配列番号２９～４５からなる群から選択される配列、又は配列番号２９～４５のいずれかの全長配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項５１又は請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記ロイシンアナログが構造７～１２のいずれかである請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
細胞において目的のタンパク質又はペプチドを製造するためのキットであって、前記タンパク質又はペプチドは１つ以上のリジンアナログを含み、前記キットは、ａ．細胞中の目的の核酸の中のセレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント古細菌由来ｔＲＮＡＰｙｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器であって、前記バリアントｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号２～２７からなる群から選択される配列、又は配列番号２～２７のいずれかの全長配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む容器と、
ｂ．古細菌Ｐｙｌ－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む容器と
を含むキット。
【請求項56】
１つ以上のリジンアナログをさらに含む請求項５５に記載のキット。
【請求項57】
前記リジンアナログが構造１～７のいずれかによるアナログである請求項５６に記載のキット。
【請求項58】
前記目的のタンパク質又はペプチドを製造するための説明書をさらに含む請求項５７に記載のキット。
【請求項59】
細胞において目的のタンパク質又はペプチドを製造するためのキットであって、前記タンパク質又はペプチドは１つ以上のロイシンアナログを含み、前記キットは、ａ．細胞中の目的の核酸の中のセレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント大腸菌由来ｔＲＮＡＬｅｕをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器であって、前記バリアントｔＲＮＡＬｅｕは、配列番号２９～４５のいずれか１つ、又は配列番号２９～４５のいずれか１つの全長配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む容器と、
ｂ．大腸菌Ｌｅｕ－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む容器と
を含むキット。
【請求項60】
構造７～１２のいずれかによる１つ以上のロイシンアナログをさらに含む請求項５９に記載のキット。
【請求項61】
前記目的のタンパク質又はペプチドを製造するための説明書をさらに含む請求項６０に記載のキット。
【請求項62】
Ｕａａ組み込みのためのバリアントｔＲＮＡ－Ｐｙｌ又はバリアントｔＲＮＡ－Ｌｅｕを安定に組み込んだ哺乳動物細胞。
【請求項63】
前記バリアントｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－Ｌｅｕが配列番号２～２７からなる群から選択され、前記Ｕａａがピロリジル残基である請求項６２に記載の細胞。
【請求項64】
前記ピロリジル残基が構造１～７のいずれかである請求項６３に記載の細胞。
【請求項65】
前記バリアントｔＲＮＡ－Ｌｅｕが配列番号２９～４５からなる群から選択され、前記Ｕａａがロイシンアナログである請求項６２に記載の細胞。
【請求項66】
前記ロイシンアナログが構造７～１２のいずれかである請求項６５に記載の細胞。
【請求項67】
非天然アミノ酸を目的のタンパク質に組み込むことができるバリアントサプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子の２５０未満、２００未満、１５０未満、１００未満、７５未満、５０未満のコピーを含む操作された哺乳動物細胞。
【請求項68】
前記細胞が、前記サプレッサーｔＲＮＡをコードする前記遺伝子の２５～２５０コピー、２５～２００コピー、２５～１５０コピー、２５～１００コピー、２５～７５コピー、２５～５０コピー、５０～２５０コピー、５０～２００コピー、５０～１５０コピー、５０～１００コピー、５０～７５コピー、７５～２５０コピー、７５～２００コピー、７５～１５０コピー、７５～１００コピー、１００～２５０コピー、１００～２００コピー、１００～１５０コピーを含む請求項６７に記載の細胞。
【請求項69】
前記バリアントｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－Ｌｅｕが配列番号２～２７からなる群から選択され、前記Ｕａａがピロリジル残基である請求項６７又は請求項６８に記載の細胞。
【請求項70】
前記ピロリジル残基が構造１～７のいずれかである請求項６９に記載の細胞。
【請求項71】
前記バリアントｔＲＮＡ－Ｌｅｕが配列番号２９～４５からなる群から選択され、前記Ｕａａがロイシンアナログである請求項６７又は請求項６８に記載の細胞。
【請求項72】
前記ロイシンアナログが構造７～１２のいずれかである請求項７１に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０１９年６月２１日出願の米国仮出願第６２／８６４，５７０号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、米国仮出願第６２／８６４，５７０号の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１９年６月２１日出願の米国仮出願第６２／８６４，５７０号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、米国仮出願第６２／８６４，５７０号の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（米国国立衛生研究所）が授与するＲ０１ ＧＭ１３２４７１及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（米国国立科学財団）が授与するＣＨＥ１９００３７５の政府支援を受けて行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（米国国立衛生研究所）が授与するＲ０１ ＧＭ１３２４７１及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（米国国立科学財団）が授与するＣＨＥ１９００３７５の政府支援を受けて行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【0003】
参照によるＡＳＣＩＩテキストファイルの資料の組み込み
本願は、以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照することにより、これを組み込む。
本願は、以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照することにより、これを組み込む。
【0004】
ファイル名：０３４２＿０００８ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔ；２０２０年６月１９日作成、サイズ：１７，５７４バイト。
【0005】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に向けられており、非天然アミノ酸を部位特異的に組み込んだタンパク質を哺乳動物細胞で発現させるための効率的なプラットフォームの開発に焦点を当てたものである。
本発明は、バイオテクノロジーの分野に向けられており、非天然アミノ酸を部位特異的に組み込んだタンパク質を哺乳動物細胞で発現させるための効率的なプラットフォームの開発に焦点を当てたものである。
【背景技術】
【0006】
非天然アミノ酸（Ｕａａ）の部位特異的組み込みは、哺乳動物細胞の生物学を探索し、操作するための多くの可能性を持っている。この技術の中心は、ナンセンス抑制アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡペアであり、これは、その宿主対応物のいずれとも交差反応することなく目的のＵａａを導入するように操作されたものである。このような「直交」ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、通常、異なる生命ドメインから宿主細胞に持ち込まれる。異種のサプレッサーｔＲＮＡは、非天然の翻訳システムと直接相互作用しなければならないため、異種のサプレッサーｔＲＮＡの性能は新しい宿主では最適でないことがよくある。実際、いくつかの研究により、哺乳動物細胞におけるＵａａの組み込み効率は、異種サプレッサーｔＲＮＡの性能の低さによって制限され、許容できるＵａａの組み込み効率のためには、異種サプレッサーｔＲＮＡを大量に過剰発現させる必要があることが確認されている。このような高レベルのｔＲＮＡ発現は、高いトランスフェクション効率を示す特定の哺乳動物細胞株における一過性のトランスフェクションによって達成することができるが、トランスフェクションが困難な細胞（例えば、初代細胞、ニューロン、幹細胞等）においてそれを行うことは困難である。さらに、それは、安定したサプレッサー細胞株（ゲノムから操作されたａａＲＳ／ｔＲＮＡを発現する）の作製を非常に困難にする。というのも、十分なナンセンス抑制／Ｕａａ組み込み効率に達するためには、ｔＲＮＡ遺伝子の数百コピーをゲノムに挿入する必要があるからである。サプレッサーｔＲＮＡの最適でない性能を克服することができれば、Ｕａａ変異導入技術の頑健性が大幅に向上し、Ｕａａ組み込みが可能な安定したサプレッサー細胞株の簡便な作製や、同一タンパク質中の複数部位へのＵａａの同時組み込み等の高度な応用が容易になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
ｔＲＮＡの性能低下の起源は不明であることが多く、合理的な設計によって性能低下に対処することは困難である。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＵａａ組み込みのための指向性進化によって、改良された直交性サプレッサーｔＲＮＡが頻繁に生成されている。大規模な合成ライブラリから、活性でありながら直交性のサプレッサーｔＲＮＡ変異体を容易に濃縮できる、巧妙な選択システムが開発されてきている。哺乳動物細胞で同様のｔＲＮＡ進化を行うことができれば、改良された抑制系を作り出すことができる大きな可能性があるが、現在のところ利用できる適切なプラットフォームはない。哺乳動物細胞でこのような指向性進化実験を行うことは、哺乳類特有の翻訳システムとの改善された相互作用に基づいてｔＲＮＡ変異体が選択されることを保証するために重要である。
【0008】
哺乳動物細胞における既存の指向性進化戦略は、ほぼ独占的に、標的遺伝子を細胞株に安定的に組み込み、その後、非標的又は標的ランダム変異誘発によって配列多様性を創出することに依存している。関連する低い変異誘発頻度は、ｔＲＮＡの小さいサイズ（１００ｂｐ未満）のため、ｔＲＮＡ進化には適していない。さらには、ｔＲＮＡのステム領域は遺伝子操作のための最も頻出する標的であるが、このｔＲＮＡのステム領域をうまく進化させるためには、塩基対形成を維持するために、どのような変異も他方の側（相手側）でそれに見合った変異を伴わなければならない。低分子ｔＲＮＡ遺伝子内のこのような豊富な配列多様性を捉えることは、合成の部位飽和変異体ライブラリを使用することによってのみ実現可能である。このようなライブラリから、哺乳動物細胞内で直交し、活性を持つサプレッサーｔＲＮＡ変異体を濃縮するためには、以下のものを手にする必要がある：ｉ）各細胞が単一のバリアントを受け取るように、ライブラリの送達を制御すること、ｉｉ）活性ｔＲＮＡ変異体を濃縮し、交差反応性のものを除去する選択スキーム、ｉｉｉ）生き残った変異体を識別する能力。これらの基準を満たす選択システムは現在のところ存在しない。
【0009】
本明細書に記載されるのは、非天然アミノ酸（Ｕａａ又はＵＡＡ）を哺乳類タンパク質に組み込むための、対応する野生型サプレッサーｔＲＮＡ分子と比較して増大した生物学的活性を有するバリアント／変異体ナンセンス抑制ｔＲＮＡ分子（本明細書ではサプレッサーｔＲＮＡとも呼ばれる）を含む組成物；これらのバリアントｔＲＮＡをコードする発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）であって、哺乳動物細胞に感染するのに適している発現ベクター；本明細書に記載されるウイルス支援型指向性進化方法を用いて、増大した生物学的活性を有するサプレッサーｔＲＮＡを製造する方法；増大した活性を有するこれらのｔＲＮＡを用いて非天然アミノ酸が部位特異的に組み込まれたタンパク質を製造する方法；及び上記バリアントｔＲＮＡを含む試薬と、そのようなタンパク質の製造に必要な他の試薬とを含むキットである。
【0010】
特に、本発明の組成物は、例えば、バリアント古細菌ナンセンス抑制ｔＲＮＡ分子又はバリアント細菌ナンセンス抑制ｔＲＮＡ分子を含み、この直交性の活性なバリアントｔＲＮＡは、その「野生型」の対応サプレッサーｔＲＮＡと比較して、哺乳類タンパク質に種々の非天然アミノ酸（例えば、アミノ酸アナログ（類似体））を組み込む活性が増大している。本明細書で使用する用語「野生型」の対応ｔＲＮＡは、部位特異的に目的のタンパク質にＵａａを組み込むための増大した生物活性を有するサプレッサーｔＲＮＡ分子の集団を生成（選択及び濃縮）するための本明細書に記載するウイルス支援指向性進化方法に供されていないサプレッサーｔＲＮＡ分子を意味する。
【0011】
本発明に包含されるバリアントｔＲＮＡの活性は、野生型ｔＲＮＡよりも、例えば、約２．５～約２００倍、約２．５～約１５０倍、約２．５～約１００倍、約２．５～約８０倍、約２．５～約６０倍、約２．５～約４０倍、約２．５～約２０倍、約２．５～約１０倍、約２．５～約５倍、約５～約２００倍、約５～約１５０倍、約５～約１００倍、約５～約８０倍、約５～約６０倍、約５～約４０倍、約５～約２０倍、約５～約１０倍、約１０～約２００倍、約１０～約１５０倍、約１０～約１００倍、約１０～約８０倍、約１０～約６０倍、約１０～約４０倍、約１０～約２０倍、約２０～約２００倍、約２０～約１５０倍、約２０～約１００倍、約２０～約８０倍、約２０～約６０倍、約２０～約４０倍、約４０～約２００倍、約４０～約１５０倍、約４０～約１００倍、約４０～約８０倍、約４０～約６０倍、約６０～約２００倍、約６０～約１５０倍、約６０～約１００倍、約６０～約８０倍、約８０～約２００倍、約８０～約１５０倍、約８０～約１００倍、約１００～約２００倍、約１００～約１５０倍、又は約１５０～約２００倍増大している。
【0012】
バリアント古細菌ｔＲＮＡ分子は、例えば、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃａｅａ）又はデスルフィトバクテリウム（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ファミリー、特に、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｂ）、メタノサルシナ・アルバス（Ｍ．ａｌｖｕｓ、Ｍａ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ、Ｍｍ）又はデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄ．ｈａｆｎｉｓｅｎｓｅ、Ｄｈ）のファミリーのいずれかに由来する。具体的には請求項に係る発明は、配列番号１、又は表１に示されるバリアントｔＲＮＡ分子の全長配列番号２～２７のいずれかと少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列に由来するピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）であるバリアントｔＲＮＡを包含する。より具体的には、特定の実施形態では、バリアントｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号２～２７、又は全長配列番号２～２７と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される配列を含む。特定の実施形態では、ｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号１～２７のいずれか１つと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０を超える変異（例えば、置換）を含む。本明細書に記載されるバリアント古細菌由来ｔＲＮＡによる組み込みに適した非天然アミノ酸は、アジドリジン（ＡｚＫ）（図１８の構造１）又はＮε－アセチルリジン（ＡｃＫ）（図１８の構造２）、又は図１８に示す構造３～６等の任意の他のリジルアナログであることができる。加えて、本明細書に記載されるように（例えば、実施例９、（図１９）参照）、操作されたピロリジルｔＲＮＡ合成酵素を使用する任意の他のＵａａの組み込み効率も、これらの操作されたｔＲＮＡＰｙｌ変異体の使用により向上させることが可能である。
【0013】
本発明のバリアント細菌ｔＲＮＡ分子は、例えば、大腸菌ｔＲＮＡに由来する。具体的には請求項に係る発明は、配列番号２８に由来するロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）であるバリアントｔＲＮＡを包含する。具体的には、特定の実施形態では、バリアントｔＲＮＡＬｅｕは、配列番号２９～４５のいずれか１つ、又は全長配列番号２９～４５のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ｔＲＮＡＬｅｕは、配列番号２８～４５のいずれか１つと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０を超える変異（例えば、置換）を含む。任意の適切な非天然アミノ酸／アナログは、目的のタンパク質に組み込むための本明細書に記載される方法と共に使用することができる。特に、本明細書に記載されるバリアント細菌由来ｔＲＮＡによる組み込みに適した非天然アミノ酸は、図１８に示す構造７～１２、又は構造７～１２と構造的及び機能的に類似するＵａａであることができる。加えて、本明細書に記載されるように（例えば図１９参照）、操作された大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素を使用する、任意の他のＵａａの組み込み効率も、これらの操作されたｔＲＮＡＬｅｕ変異体の使用により向上させることが可能である。
【0014】
バリアント古細菌サプレッサーｔＲＮＡ又はバリアント細菌サプレッサーｔＲＮＡを含む発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）であって、このバリアントｔＲＮＡは、本明細書に記載されるように、その野生型対応ｔＲＮＡと比較して、非天然アミノ酸を哺乳類タンパク質に組み込むための活性が増大している発現ベクターも本発明に包含される。本発明に適したウイルスとしては、哺乳動物細胞ゲノムと統合される、又は統合されない、任意のウイルスが挙げられる。そのようなウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスが挙げられる。より具体的には、本明細書に記載されているように、アデノ随伴ウイルスの血清型のいずれも本発明に使用することができ、特にアデノ随伴ウイルス血清型２が挙げられる。本発明の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）は、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ若しくはＥＧＦＰ等のレポーター遺伝子、又は他の適切な検出体分子（ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）もコードすることができる。
【0015】
本明細書に記載される発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）を含む細胞（１種又は複数種）、及びこれらの細胞の安定細胞株も本発明に包含される。特定の実施形態では、当該細胞は哺乳動物細胞であり、安定な哺乳動物細胞はゲノム的に統合された（又はエピソーム的に維持された）操作されたｔＲＮＡを含む。
【0016】
本発明の細胞は、細胞におけるウイルスベクターのウイルス複製に必要な遺伝子をコードする１種又は複数種の追加の発現ベクター（例えば、プラスミド）をさらに含むことができる。より詳細には、本発明の細胞は、ウイルス複製に必須のすべての遺伝子成分をコードする発現ベクター（例えば、プラスミド）を含んでもよく、その発現ベクターにおいて、ナンセンスコドンがタンパク質配列に挿入されており、ウイルス複製をバリアントサプレッサーｔＲＮＡの活性に依存するようにされる。
【0017】
１つの実施形態では、必須ウイルスタンパク質は、アデノ随伴ウイルスＡＡＶ２配列番号４６等の非エンベロープ化ウイルスのＶＰ１カプシドタンパク質（Ｃａｐ）、又は配列番号４６と約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列であることができる。サプレッサーコドンは、カプシドタンパク質に（例えば、ＴＡＧ－アンバー（ａｍｂｅｒ）；ＴＡＡ－オーカー（ｏｃｈｒｅ）又はＴＧＡ－オパール（ｏｐａｌ））選択した部位に挿入することができる（Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２０１６、５５、１０６４５；Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２０１７、５６、４２３４）。本明細書に記載されるように、アデノ随伴ウイルス用の必須ウイルスタンパク質は、４５４位にＴＡＧコドンを有するＣａｐとすることができる。細胞は、同族の（コグネート）Ｕａａ ＲＮＡ合成酵素（ＵａａＲＳ）及びＵａａの存在下で培養することができる。１つの実施形態では、ＵａａＲＳは、例えば、ＭｂＰｙｌＲＳであり、Ｕａａは、例えば、ＡｚＫ又はＡｃＫである。別の実施形態では、バリアントｔＲＮＡは大腸菌ロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）であり、ａａＲＳは大腸菌ＬｅｕＲＳであり、Ｕａａは図１８に示すようなロイシンアナログである。
【0018】
野生型サプレッサーｔＲＮＡと比較して増大した生物学的活性を有するサプレッサーｔＲＮＡバリアントのウイルス支援指向性進化方法も本発明に包含される。哺乳動物細胞におけるウイルスの複製は、目的のｔＲＮＡバリアントの活性に依存する必須タンパク質の発現を必要とする。
【0019】
当該方法は、目的のサプレッサーｔＲＮＡバリアントのライブラリをウイルスゲノムにコードする工程と、哺乳動物宿主細胞の集団を低い感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターに感染させて、この細胞集団をその細胞におけるウイルス複製に適した条件下に維持する工程であって、哺乳動物細胞におけるウイルス複製が、目的のｔＲＮＡバリアントの活性に依存する必須タンパク質の発現を必要とする工程と、活性なｔＲＮＡバリアントをコードするウイルス子孫を採取し、選択的に増幅して、交差反応性があるｔＲＮＡ分子を除去する工程であって、これにより、増大した生物学的活性を有する直交性のサプレッサーｔＲＮＡバリアントが回収される工程とを含む。増幅されたｔＲＮＡバリアントは、その後、核酸配列を決定するために配列決定され、さらなる評価に付されることが可能である。選択前後のウイルスコード化ｔＲＮＡライブラリの次世代配列決定を行い、ライブラリ中の各可能な変異体の濃縮度を確認することができる。この濃縮係数は、ｔＲＮＡ活性の指標として使用することができ、最も濃縮されたｔＲＮＡ変異体を構築し、その活性を確認するために試験することができる。特定の実施形態では、開示された方法企図される方法は、不活性ｔＲＮＡを保有するウイルスに対して活性ｔＲＮＡをコードするウイルスの１０，０００～３０，０００倍又は２０，０００～３０，０００倍の濃縮をもたらす。
【0020】
より特定の実施形態では、本明細書に記載されるように、目的のナンセンス抑制ｔＲＮＡの配列は、ライブラリを作成するために無作為化され、適切な発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）中にコードされる。ｔＲＮＡバリアントライブラリは、不活性なｔＲＮＡ分子、活性で直交性のｔＲＮＡ分子、及び活性だが交差反応性があるｔＲＮＡ分子を含むことになる。
【0021】
特定の企図された方法は、形質転換受容性のある（コンピテントな）宿主細胞の集団の使用を含む。このような細胞は、典型的には、哺乳動物細胞、より具体的には不死化されたヒト細胞である。この適切な宿主細胞は、非常に低い～低い感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターに感染することができる。特定の実施形態では、ＭＯＩは、約０．１～約１５、約０．１～約１０、約０．１～約５、約０．１～約３、約０．１～１、約１～約１５、約１～約１０、約１～約５、約１～約３、約３～約１５、約３～約１０、約３～約５、約５～約１５、約５～約１０、又は約１０～約１５である。特定の実施形態では、ＭＯＩは０．１～５である。特定の実施形態では、ＭＯＩは、１５未満、１０未満、５未満、３未満、１未満、又は０．１未満である。特定の実施形態では、バリアントｔＲＮＡをコードする単一のウイルスベクターが、必須ウイルスタンパク質の発現及び細胞内のウイルス子孫の産生に必要なすべてである。より具体的には、各細胞は、単一のウイルスコード化ｔＲＮＡバリアントを受け取る。
【0022】
細胞は、その後（典型的にはウイルス感染から数時間以内）１種以上の発現ベクター（例えばプラスミド）でトランスフェクトされ、その際、発現ベクター（例えばプラスミド）はウイルス複製に必須のすべての遺伝子成分を含み、ナンセンスコドンがタンパク質配列に挿入されて、ウイルス複製がバリアントサプレッサーｔＲＮＡの活性に依存するようにされる。１つの実施形態では、必須ウイルスタンパク質は、４５４位にＴＡＧコドンを有するＣａｐ（配列番号４６）である。特定の実施形態では、発現ベクター（例えば、プラスミド）は、同族のＵａａ ＲＮＡ合成酵素（ＵａａＲＳ）もコードする。例えば、ｔＲＮＡライブラリがピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）ライブラリである場合、ＵａａＲＳは、ＭｂＰｙｌＲＳである。トランスフェクションの際に、Ｕａａを適切な濃度で培養培地に添加してもよい。特定の実施形態では、ＵａａはＡｚＫである。あるいは、バリアントｔＲＮＡはロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）であり、ａａＲＳは大腸菌ＬｅｕＲＳであり、ＵａａはＡｚＫであるか、又は図１８の構造７～１２のいずれか１つである。ウイルス複製に必要な遺伝子成分をコードする追加の発現ベクター（例えば、プラスミド）も、本明細書に記載されるように宿主細胞にトランスフェクトされてもよい。
【0023】
企図された方法において、感染／トランスフェクトされた細胞は、バリアントｔＲＮＡの発現、必須ウイルスタンパク質の発現及びウイルスの複製に適した条件下で、Ｕａａを含む培地で維持（すなわち、培養）される。特定の実施形態では、細胞は収穫され、ウイルスの子孫が単離され、交差反応性があるが活性なｔＲＮＡ分子を除去するためにさらなる濃縮にかけられ、増大した生物学的活性を有する直交性のサプレッサーｔＲＮＡバリアントが回収される。濃縮されたｔＲＮＡバリアントは、その核酸配列を得るために配列決定することができる。選択前後のウイルスコード化ｔＲＮＡライブラリの次世代ＤＮＡ配列決定（シークエンシング）を行い、各ｔＲＮＡ変異体の存在量及び選択による変化の様子を測定することができる。選択時に最も強い濃縮を受けるｔＲＮＡ変異体は、最も高い活性を有する可能性の高いものである。
【0024】
本発明の方法において、活性で直交性のｔＲＮＡバリアントのみが、必須ウイルス遺伝子タンパク質へのＵａａの組み込み及び細胞内でのウイルス複製を可能にする。しかしながら、特定の実施形態では、活性で交差反応性のｔＲＮＡを含むウイルスも複製することができるので、交差反応性のｔＲＮＡをコードするウイルス集団を除去し、所望のｔＲＮＡをコードするウイルス集団を濃縮するための追加の工程が必要である。単離されたウイルス子孫は、増大した生物学的活性を有するｔＲＮＡバリアントについて濃縮することができる。例えば、単離されたウイルス子孫は、光切断可能なリンカー等の光切断可能な部分を通して取り付けられた精製ハンドル／タグで化学選択的に標識することができる。１つの実施形態では、この部分は、光切断可能なＤＢＣＯ－スルホ－ビオチン結合体である。反応混合物は、Ｕａａタンパク質を組み込んだウイルス、Ｕａａタンパク質を含まないウイルス、光切断可能なビオチン標識、及びクエンチャーとしての過剰のＵａａを含む。ビオチン結合体で標識されたウイルスは、ストレプトアビジンコーティングビーズを用いて回収され、ウイルスは適切な波長（例えば、３６５ｎｍ）を用いてビーズから溶出される。回収されたウイルス粒子（ビリオン）は、野生型サプレッサーｔＲＮＡと比較して増大した生物学的活性を有する目的のサプレッサーｔＲＮＡを含む。
【0025】
回収されたウイルスを溶解し、ｔＲＮＡを増幅した後、配列決定してその核酸配列を得ることができる。あるいは、回収したウイルスを溶解し、ｔＲＮＡを増幅し、適切なベクターを用いて上記のようにクローニングすることができる。その後、コロニーを選択して配列決定し、目的のサプレッサーｔＲＮＡの核酸配列を得てもよい。加えて、選択前後のウイルスコード化ｔＲＮＡライブラリの次世代ＤＮＡ配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（イルミナ））を行い、各ｔＲＮＡ変異体の存在量及び選択による変化の様子を測定することができる。選択時に最も強い濃縮を受けるｔＲＮＡ変異体は、最も高い活性を有する可能性の高いものである。次に、特定された変異体を構築し、試験することができる。
【0026】
哺乳動物細胞における目的のタンパク質の製造方法（産生方法）であって、この目的のタンパク質はその目的のタンパク質中の特定の位置に１つ以上のアミノ酸アナログを有する方法が、さらに本発明に包含される。１つの実施形態では、この方法の工程は、上記哺乳動物細胞を増殖に適した条件下で、培養培地中で培養することを含み、この細胞は１つ以上のセレクターコドンを有するタンパク質をコードする核酸を含み、この細胞は、セレクターコドンを認識する、増大した生物活性を有するバリアント古細菌由来ピロリジルｔＲＮＡ、及びその同族のアミノアシルＲＮＡ合成酵素も含む。細胞培養培地は、セレクターコドンに応答して１つ以上のリジンアナログがタンパク質に組み込まれるのに適した条件下で、１つ以上のリジンアナログと接触（適切な濃度で添加）され、これにより１つ以上のリジンアナログを有する目的のタンパク質（所望のタンパク質）が製造（産生）されてもよい。
【0027】
１つの実施形態では、バリアントｔＲＮＡは、配列番号１、又は全長配列番号２～２７のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸塩基配列に由来するピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）である。特定の実施形態では、バリアントｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号２～２７、又は全長配列番号２～２７と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される配列を含む。リジンアナログは、任意のリジンアナログであることができ、特に、アジドリジン（ＡｚＫ）又はアセチルリジン（ＡｃＫ）又は図１８の構造３～６のいずれかである。加えて、実施例９（図１９）に記載されているように、操作されたピロリジルｔＲＮＡ合成酵素を使用する任意の他のＵａａの組み込み効率も、これらの操作されたｔＲＮＡＰｙｌ変異体の使用により向上させることが可能である。
【0028】
当該方法の別の実施形態では、バリアントサプレッサーｔＲＮＡは、上記セレクターコドンを認識する、増大した生物活性を有する大腸菌由来ロイシルｔＲＮＡであり、その同族アミノアシル－ＲＮＡ合成酵素は、そのセレクターコドンに応答して目的のタンパク質に１つ以上のロイシンアナログを組み込み、これにより１つ以上のロイシンアナログを有するタンパク質が産生される。１つの実施形態では、バリアントｔＲＮＡは、配列番号２８に由来するロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）である。特定の実施形態では、バリアントｔＲＮＡＬｅｕは、配列番号２９～４５のいずれか１つ、又は全長配列番号２９～４５のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。本明細書に記載されるバリアント細菌由来ｔＲＮＡによる組み込みに適した非天然アミノ酸は、図１８に示される構造７～１２であることができる。加えて、実施例９（図１９）に記載されているように、操作された大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素を使用する任意の他のＵａａの組み込み効率も、これらの操作されたｔＲＮＡＬｅｕ変異体の使用により向上させることが可能である。
【0029】
本発明の方法は、１つ以上のアジドリジン（ＡｚＫ）又はアセチルリジン（ＡｃＫ）残基を細胞中のタンパク質又はペプチドに部位特異的に組み込む方法であって、この細胞を増殖に適した条件下で培養培地中で培養する工程を含み、上記細胞は、目的のタンパク質又はペプチド中の特定の部位に１つ以上の、アンバー、オーカー若しくはオパールのセレクターコドンを有する目的のタンパク質又はペプチドをコードする核酸を含み、上記細胞は、上記セレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント古細菌由来ピロリジル－ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含み、古細菌Ｐｙｌ－ｔＲＮＡ合成酵素をさらに含む方法をさらに包含する。次に、細胞培養培地は、セレクターコドン（複数可）の１つ以上の部位で１つ以上のＡｚＫ又はＡｃＫ残基をタンパク質又はペプチドに組み込むのに適した条件下で、１つ以上のＡｚＫ又はＡｃＫ残基と接触させられてもよく、これにより１つ以上の部位特異的に組み込まれたＡｚＫ又はＡｃＫ残基を有する目的のタンパク質又はペプチドが製造されてもよい。
【0030】
１つの実施形態では、バリアントピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）は、配列番号１に由来する。例えば、バリアントｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号２～２７、又は全長配列番号２～２７のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される配列を含む。例えば、図１８、構造１～６も参照されたい。
【0031】
別の実施形態では、当該方法は、細胞中のタンパク質又はペプチドに１つ以上のロイシンアナログ残基を部位特異的に組み込み、この際、細胞は、セレクターコドンを認識する、増大した生物活性を有するバリアント大腸菌由来ｔＲＮＡＬｅｕを含み、大腸菌Ｌｅｕ－ｔＲＮＡ合成酵素をさらに含む。細胞培養培地は、１つ以上のロイシンアナログ残基をセレクターコドン（複数可）の部位でタンパク質又はペプチドに組み込むのに適した条件下で、１つ以上のロイシンアナログ残基と接触させられてもよく、これにより１つ以上の部位特異的に組み込まれたロイシンアナログ残基を有する目的のタンパク質又はペプチドが製造されてもよい。
【0032】
具体的には、特定の実施形態では、バリアントｔＲＮＡは、配列番号２８に由来するロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ）である。例えば、バリアントｔＲＮＡＬｅｕは、配列番号２９～４５のいずれか１つ、又は全長配列番号２９～４５のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。本明細書に記載されるバリアント細菌由来ｔＲＮＡによる組み込みに適した非天然アミノ酸は、図１８に示される構造７～１２であることができる。加えて、実施例９（図１９）に記載されているように、操作された大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素を使用する任意の他のＵａａの組み込み効率も、これらの操作されたｔＲＮＡＬｅｕ変異体の使用により向上させることが可能である。
【0033】
細胞において目的のタンパク質又はペプチドを製造するためのキットであって、このタンパク質又はペプチドは１つ以上のリジンアナログを含み、当該キットは、細胞中の目的の核酸の中のセレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント古細菌由来ｔＲＮＡＰｙｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器を含むキットも本発明に包含される。具体的には、特定の実施形態では、バリアントｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号２～２７（例えば、図１８、構造１～６参照）、又は全長配列番号２～２７のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される配列を含む。当該キットは、古細菌Ｐｙｌ－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む容器をさらに含むことができる。当該キットは、アジドリジン（ＡｚＫ）又はアセチルリジン（ＡｃＫ）等の１つ以上のリジンアナログをさらに含むことができる。当該キットは、目的のタンパク質又はペプチドを製造するための説明書も含むことができる。
【0034】
別の実施形態では、当該キットは、細胞において目的のタンパク質又はペプチドを製造することに向けられ、このタンパク質又はペプチドは、１つ以上のロイシンアナログを含み、当該キットは、細胞中の目的の核酸の中のセレクターコドンを認識する、増大した生物学的活性を有するバリアント大腸菌由来ｔＲＮＡＬｅｕをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器を含み、このバリアントｔＲＮＡＬｅｕは、配列番号２９～４５のいずれか１つ、又は全長配列番号２９～４５のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。当該キットは、大腸菌Ｌｅｕ－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド配列と、図１８の構造７～１２等の１つ以上のロイシンアナログとを含む容器も含むことができる。当該キットは、目的のタンパク質又はペプチドを製造するための説明書を含むことができる。
【0035】
Ｕａａ組み込みのためのバリアントｔＲＮＡ－Ｐｙｌ又はバリアントｔＲＮＡ－Ｌｅｕを安定的に組み込んだ哺乳動物細胞も本発明に包含される。１つの実施形態では、この哺乳動物細胞は、バリアントｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－Ｌｅｕを含み、バリアントｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－Ｌｅｕの配列は配列番号２～２７からなる群から選択され、Ｕａａは構造１～７のいずれかからなる群から選択されるピロリジル残基である。別の実施形態では、当該細胞は、配列番号２９～４５からなる群から選択されるバリアントｔＲＮＡ－Ｌｅｕを含み、Ｕａａは構造７～１２のいずれかからなる群から選択されるロイシンアナログである。
【0036】
より具体的には、細胞内で発現する予め選択されたタンパク質（例えば、未成熟終止コドンを含む遺伝子から発現するタンパク質）に非天然アミノ酸を組み込むことができるバリアントサプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子の２５０未満、２００未満、１５０未満、１００未満、７５未満、５０未満のコピーを含む操作された哺乳動物細胞が本発明に包含される。当該細胞は、サプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子の２５～２５０コピー、２５～２００コピー、２５～１５０コピー、２５～１００コピー、２５～７５コピー、２５～５０コピー、５０～２５０コピー、５０～２００コピー、５０～１５０コピー、５０～１００コピー、５０～７５コピー、７５～２５０コピー、７５～２００コピー、７５～１５０コピー、７５～１００コピー、１００～２５０コピー、１００～２００コピー、１００～１５０コピーを含んでもよいことが企図される。ＶＡＤＥＲアプローチを用いて開発されたバリアントｔＲＮＡを用いると、標的タンパク質へのアミノ酸の組み込み効率が向上するため、野生型ｔＲＮＡよりも少ないｔＲＮＡを細胞に導入するだけで所望のタンパク質発現レベルが得られる。細胞内に導入される外来性ｔＲＮＡの数が少ないほど、宿主細胞の構造、機能、又は生存率に対する破壊的な影響が少ないと予想される。
【0037】
本発明は、添付の詳細な説明を読めば当業者に明らかとなる特徴及び利点を実証する。
【0038】
構成の様々な新規な詳細及び部分の組み合わせを含む本発明の上記及び他の特徴、並びに他の利点は、次に、添付の図面を参照してより詳細に説明され、特許請求の範囲に指摘される。本発明を具体化する特定の方法及び装置は、説明のために示されており、本発明を限定するものではないことが理解されよう。本発明の原理及び特徴は、本発明の範囲から逸脱しない範囲で、様々な多数の実施形態で採用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0039】
添付の図面において、参照文字は異なる図にわたって同じ部分を指す。図面は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、代わりに、本発明の原理を説明することに重点が置かれている。特許ファイル又は出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開の写しは、請求と必要な手数料の納付によって、該当官庁から提供される。
【0040】
【図1】図１ａ～ｂは、ＶＡＤＥＲ選択スキームを示す。ａ、哺乳動物細胞は、低いＭＯＩでｔＲＮＡライブラリをコードするＡＡＶ２に感染する。ＣａｐのＴＡＧ変異体、ＡＡＶ複製に必要な他の遺伝子成分、及び同族ａａＲＳをコードするプラスミドが、適切なアジド－Ｕａａの存在下でトランスフェクションすることにより、トランスで提供される。活性で直交性のｔＲＮＡ変異体は、Ｕａａをそのカプシドに組み込んだパッケージ化された子孫ＡＡＶ２の生成を促進し、これは化学選択的ビオチン結合とその後のストレプトアビジンプルダウンによって単離される。ｂ、ｉ）大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒ及びＥＧＦＰ（Ｔｙｒ－ＥＧＦＰ）、並びにｉｉ）ｔＲＮＡＰｙｌ及びｍＣｈｅｒｒｙ（Ｐｙｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードする２種のＡＡＶ２ベクターを１０４：１の比で混合し、ＭｂＰｙｌＲＳ及びその基質ＡｚＫを用いてＶＡＤＥＲ選択スキームにかけた。生存集団のＦＡＣＳ解析は、ＰｙｌｍＣｈｅｒｒｙの累積濃縮度が３０，０００倍超であることを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝３つの独立した実験）。
【図2】図２ａ～ｂは、ｔＲＮＡＣＵＡＰｙｌの指向性進化を示す。ａ、ｔＲＮＡＣＵＡＰｙｌの４つの異なるライブラリ（Ａ１、Ａ２、Ｔ１、Ｔ２）を作成するために無作為化した配列は、４つの色で強調表示されている（図２ａは配列番号１を開示する）。ｂ、各ライブラリの選択から出現したｔＲＮＡ配列の分析。ｃ、ＥＧＦＰ－３９ＴＡＧレポーターを使用して測定した、固有の完全塩基対ｔＲＮＡＰｙｌセレクタント（ｓｅｌｅｃｔａｎｔ）のそれぞれに対するＴＡＧ抑制の効率。ｐＡＡＶプラスミド（野生型ｍＣｈｅｒｒｙレポーターも保有）にコードされたｔＲＮＡを、１ｍＭ ＡｚＫの存在下又は不存在下で、ＭｂＰｙｌＲＳ及びＥＧＦＰ－３９ＴＡＧとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。各ｔＲＮＡＰｙｌ変異体によって促進されたＥＧＦＰ－３９ＴＡＧの発現を無細胞抽出物中で測定し、野生型ｍＣｈｅｒｒｙ発現に対して正規化し、野生型ｔＲＮＡＰｙｌによって促進されたレポーター発現に対する百分率としてプロットした。データは平均値±ｓ．ｄ．として示した（ｎ＝３つの独立した実験）。
【図3】図３ａ～ｃは、Ａ２．１ ｔＲＮＡＣＵＡＰｙｌの効率の改善を示す。ａ、野生型（ＷＴ）及びＡ２．１の配列。ｂ、ＷＴ又はＡｃＫ選択的ＭｂＰｙｌＲＳを用い、適切なＵａａの存在（＋）と不存在（－）下でＷＴ又はＡ２．１のｔＲＮＡを用いたＥＧＦＰ－３９ＴＡＧの発現。ｃ、ＡｚＫの存在下又は不存在下で（ＷＴ及びＡ２．１変異体の両方について）それぞれｔＲＮＡＵＣＡＰｙｌ及びｔＲＮＡＵＵＡＰｙｌと、ＭｂＰｙｌＲＳとを使用したＥＧＦＰ－３９ＴＧＡ及びＥＧＦＰ－３９ＴＡＡの発現。ＥＧＦＰ－３９ＴＡＧの発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含まない抽出物中で測定し、その野生型対応物に対する相対値で報告する。データは平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝３つの独立した実験）。
【図4】図４ａ～ｂは、単一のＡＡＶ２コード化ｔＲＮＡ遺伝子が、ＴＡＧ不活性化カプシド遺伝子（Ｃａｐ）の発現及び子孫ウイルスの生成を促進できることを示す。ａ、実験のスキーム。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｔＲＮＡＣＵＡＰｙｌ及び野生型ＥＧＦＰ遺伝子をコードするＡＡＶ２に非常に低いＭＯＩで感染し、次に、ｉ）ＡＡＶ２ Ｒｅｐ及びＣａｐ－４５４－ＴＡＧ遺伝子、ｉｉ）ＭｂＰｙｌＲＳ、及びｉｉｉ）ＡｄＨｅｌｐｅｒをコードするプラスミドで、１ｍＭ ＡｚＫの存在下又は不存在下においてさらにトランスフェクトされる。Ｃａｐの４５４位にＡｚＫを組み込んだＡＡＶ２のパッケージングが可能であること、そしてそれがウイルスに影響を与えないことは、以前に実証されている。１ Ｃａｐの４５４位のＴＡＧコドンを抑制すると、ＡｚＫが３つの重複するカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３（合計６０コピー）すべてに、表面露出部位で組み込まれる。Ｃａｐ－４５４－ＴＡＧを野生型Ｃａｐに置き換えた同一の実験も行った。４８時間後、これらの細胞から子孫ウイルスを採取し、新たに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させ、その後、それらのＦＡＣＳ分析を行うことによりタイター化し（力価を決定し）た。ｂ、Ｃａｐ－４５４－ＴＡＧを用いた場合、ＡｚＫ依存性の子孫ウイルス産生が観察される（挿入図で拡大）。その効率は、代わりに野生型のＣａｐを用いた同一の実験よりも有意に低い。データは平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝３つの独立した実験）。
【図5】図５ａ～ｃは、ＡＡＶ２－４５４－ＡｚＫが、光切断可能なＤＢＣＯ－ビオチン結合体の生体直交型結合と、それに続くストレプトアビジン結合及び光放出によって単離できることを示す。ａ、光切断可能なＤＢＣＯ－ビオチン結合体の構造。ｂ、ＡＡＶ２－４５４－ＡｚＫは異なる濃度のＤＢＣＯ－ビオチンで１時間処理され、この反応は過剰のＡｚＫを用いてクエンチされ、この低分子は透析によって除去された。ビオチン標識されたウイルスはストレプトアビジン－アガロースを用いて捕捉され、３６５ｎｍの照射により放出された。ウイルスの感染価は、処理前、ビオチン修飾後、及び光放出後に測定され（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させ、その後ＦＡＣＳにより）、次いで体積変化について正規化された。未処理ウイルスに対する相対感染性（感染力）がプロットされた。低度のビオチン化（５μＭ試薬、各ウイルス粒子（ビリオン）は６０個のＡｚＫ残基を保有する）はＡＡＶ２感染性に影響しないが、（より高いＤＢＣＯ－ビオチン濃度における）カプシドの修飾の増加には影響することがわかった。また、５μＭのＤＢＣＯ－ビオチンを用いると、改変ウイルスはストレプトアビジン樹脂から効率よく（～３０％）回収されるが、高い試薬濃度を用いると収率が悪くなる。ｃ、この最適化した標識／捕捉戦略を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙレポーターをコードするＡＡＶ２－４５４－ＡｚＫは野生型カプシド（アジドなし）のＥＧＦＰコードＡＡＶ２との混合から濃縮することが可能である。選択前後の混合ウイルス集団に感染したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡像が示されている。
【図7】図７は、選択前、工程１後、及び工程２後の混合ウイルス集団（Ｔｙｒ－ＥＧＦＰ：Ｐｙｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ）に感染した細胞の代表的な顕微鏡像を示す。ＥＧＦＰチャンネル及びｍＣｈｅｒｒｙチャンネルからの統合された画像が、それぞれについて示されている。これらの実験について、ＦＡＣＳで測定した２種のウイルスの比率（Ｐｙｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ：Ｔｙｒ－ＥＧＦＰ）が下に示されている。
【図8】図８ａ～ｃは、野生型ｔＲＮＡＰｙｌ又はその最も効率的に進化した変異体、Ａ２．１を用いて抑制した、ナンセンス不活性化ＥＧＦＰレポーターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の代表的な蛍光顕微鏡像を示す。ａ、野生型、又は（野生型ｍＣｈｅｒｒｙレポーターもコードする）ｐＡＡＶプラスミドにコードされたＡ２．１ ｔＲＮＡＰｙｌとＭｂＰｙｌＲＳ及びＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧレポーターとによる１ｍＭ ＡｚＫの存在下又は不存在下での共トランスフェクション。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、各実験における対照として示されている。ｂ、（野生型及びＡ２．１変異体について）それぞれｔＲＮＡＵＣＡＰｙｌ及びｔＲＮＡＵＵＡＰｙｌを用いたＥＧＦＰ－３９ＴＧＡ及びＥＧＦＰ－３９ＴＡＡの発現。ｐＩＤＴｓｍａｒｔベクターにコードされたｔＲＮＡは、適切なＥＧＦＰ変異体及びＭｂＰｙｌＲＳと１ｍＭ ＡｚＫの存在下又は不存在下で共トランスフェクトされた。ｃ、野生型及びＡ２．１ ｔＲＮＡＣＵＡＰｙｌを用いたＥＧＦＰ－３９ＴＡＧへのＡｃＫの組み込み。ｐＩＤＴｓｍａｒｔベクターにコードされたｔＲＮＡは、５ｍＭ ＡｃＫの存在下又は不存在下で、ＥＧＦＰ－３９ＴＡＧ変異体及びＭｂＰｙｌＲＳ－ＡｃＫＲＳ３変異体と共トランスフェクトされた。
【図9】図９は、４つのライブラリのそれぞれから完全に塩基対になっている（Ｇ：Ｕゆらぎ対合を含む）選択されたｔＲＮＡの配列を示す。その活性の特徴付けについては、図２ｃを参照されたい。ｔＲＮＡの番号付けスキームが下に示されている。
【図10】図１０ａ～ｃは、ＶＡＤＥＲ選択スキームによって得られた変異体ロイシルｔＲＮＡの改善された活性を示す。ａは、野生型ＴＡＧ－サプレッサー大腸菌ロイシルｔＲＮＡ（ＥｃＬｔＲ）の配列（配列番号４７。これは配列番号２８と同一であるが、ＵではなくＴを有する）を示す。ｂは、本明細書に記載される方法によって特定されたＥｃＬｔＲの改良された変異体の１つ（ＥｃＬｔＲｈ１）の配列（配列番号４８。これは配列番号３０と同一であるが、ＵではなくＴを有する）を示す。ｃは、Ｕａａを選択的に導入する操作されたＥｃＬｅｕＲＳ変異体と共トランスフェクトした場合のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥｃＬｔＲ及びＥｃＬｔＲ－ｈ１の活性を示す。全長のＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧレポーターの発現を使用して、ｔＲＮＡの活性を測定した。ＥｃＬｔＲ－ｈ１は顕著に高い効率を示す。
【図12】図１２は、ＶＡＤＥＲ選択スキームにかけた場合の、次世代Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ配列決定（ＮＧＳ）を使用して、ｔＲＮＡライブラリにおける各変異体についての濃縮の程度を特徴付けた結果を示す。得られた濃縮係数は、対応するｔＲＮＡの効率を推定するために使用することができる。
【図13】図１３は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ－３９ＴＡＧレポーターの発現（上述の通り）を用いて実証され、野生型ｍＣｈｅｒｒｙ発現に対して正規化され、野生型ｔＲＮＡ－Ｐｙｌによって促進されたレポーター発現の割合（％）としてプロットされた、選択されたｔＲＮＡ－Ｐｙｌ変異体の改善された活性についての評価アッセイの結果を示す。
【図14】上パネル（１４ａ）は、１２０種の異なる細菌ロイシルｔＲＮＡのアクセプターステム領域のコンパイルされた配列をＷｅｂｌｏｇｏフォーマット（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／）で示す。このフォーマットでは、このｔＲＮＡ配列のセット内の特定の位置に見られる特定のヌクレオチドの相対的な存在量は、対応する文字コードの相対的な高さによって表される。下のパネル（１４ｂ）は、野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡ（配列番号４９／配列番号２８）の配列及び二次構造を示し、さらに配列アライメントによって導かれるアクセプターステムの各位置に狙いを定めたカスタムランダム化を示す。
【図15】図１５は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ－３９ＴＡＧレポーターの発現（上述の通り）を用いて実証され、野生型ｍＣｈｅｒｒｙ発現に対して正規化され、野生型ｔＲＮＡ－Ｌｅｕによって促進されるレポーター発現の割合（％）としてプロットされた、選択されたｔＲＮＡ－Ｌｅｕ変異体の改善された活性についての評価アッセイの結果を示す。
【図16A】図１６ａ～ｂは、バキュロウイルス送達による制御されたｔＲＮＡ発現の下で、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｐｙｌ及びｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－２（配列番号２）の活性を比較した結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、固定ＭＯＩ １のＭｂＰｙｌＲＳ及びＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧをコードするバキュロウイルスとともに、増加するＭＯＩ（０．３～３）のｍＣｈｅｒｒｙレポーター及びＷＴ又は操作された（配列番号２）ｔＲＮＡ－Ｐｙｌのいずれかをコードする第２のバキュロウイルスで形質導入された。ＡｚＫなし対照を除くすべての発現は、ＭｂＰｙｌＲＳのＵａａ基質である１ｍＭ ＡｚＫの存在下で行われる。ａのパネルは、同じＭＯＩで、野生型ＥＧＦＰをコードする同一のウイルスに対するＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧの発現を示す。操作されたｔＲＮＡ－Ｐｙｌは、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｐｙｌと比較して、はるかに低い発現レベル（より低いＭＯＩ）でＥＧＦ－３９－ＴＡＧの発現を促進する。
【図16B】図１６ａ～ｂは、バキュロウイルス送達による制御されたｔＲＮＡ発現の下で、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｐｙｌ及びｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－２（配列番号２）の活性を比較した結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、固定ＭＯＩ １のＭｂＰｙｌＲＳ及びＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧをコードするバキュロウイルスとともに、増加するＭＯＩ（０．３～３）のｍＣｈｅｒｒｙレポーター及びＷＴ又は操作された（配列番号２）ｔＲＮＡ－Ｐｙｌのいずれかをコードする第２のバキュロウイルスで形質導入された。ＡｚＫなし対照を除くすべての発現は、ＭｂＰｙｌＲＳのＵａａ基質である１ｍＭ ＡｚＫの存在下で行われる。ｍＣｈｅｒｒｙの発現はｂのパネルに示されており、ｔＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙウイルスのＭＯＩが増加すると直線的に増加し、同じＭＯＩでＷＴ及び操作されたｔＲＮＡ－Ｐｙｌウイルスについて同等である。
【図17A】図１７ａ～ｂは、バキュロウイルス送達による制御されたｔＲＮＡ発現の下で、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ及びｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－３０（配列番号３０）の活性を比較した結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、固定ＭＯＩ １のＥｃＬｅｕＲＳ及びＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧをコードするバキュロウイルスとともに、増加するＭＯＩ（３～１５）のｍＣｈｅｒｒｙレポーター及びＷＴ又は操作された（配列番号３０）ｔＲＮＡ－Ｌｅｕをコードする第２のバキュロウイルスで形質導入された。Ｕａａなし対照を除くすべての発現は、ＥｃＬｅｕＲＳのＵａａ基質である１ｍＭ Ｃａｐの存在下で行われる。ａのパネルは、同じＭＯＩで、野生型ＥＧＦＰをコードする同一のウイルスに対するＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧの発現を示す。操作されたｔＲＮＡ－Ｌｅｕは、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｌｅｕと比較して、はるかに低い発現レベル（より低いＭＯＩ）でＥＧＦ－３９－ＴＡＧの発現を促進する。
【図17B】図１７ａ～ｂは、バキュロウイルス送達による制御されたｔＲＮＡ発現の下で、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ及びｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－３０（配列番号３０）の活性を比較した結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、固定ＭＯＩ １のＥｃＬｅｕＲＳ及びＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧをコードするバキュロウイルスとともに、増加するＭＯＩ（３～１５）のｍＣｈｅｒｒｙレポーター及びＷＴ又は操作された（配列番号３０）ｔＲＮＡ－Ｌｅｕをコードする第２のバキュロウイルスで形質導入された。Ｕａａなし対照を除くすべての発現は、ＥｃＬｅｕＲＳのＵａａ基質である１ｍＭ Ｃａｐの存在下で行われる。ｍＣｈｅｒｒｙレポーターの発現はｂのパネルに示されており、ｔＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙウイルスのＭＯＩが増加すると直線的に増加し、同じＭＯＩでＷＴ及び操作されたｔＲＮＡ－Ｌｅｕウイルスについて同等である。
【図19A】図１９ａ～ｂは、改良されたｔＲＮＡ－Ｐｙｌ（配列番号２；ａのパネル）及びｔＲＮＡ－Ｌｅｕ（配列番号３０；ｂのパネル）が、図１８に示される様々なＵａａのより効率的な組み込みを促進すると評価したアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0041】
本発明は、高効率の活性な直交性のｔＲＮＡバリアント分子を得るための、哺乳動物細胞におけるｔＲＮＡのウイルス支援指向性進化（ＶＡＤＥＲ）という新規な戦略を説明する。本明細書に記載される方法によって製造される本明細書に記載されるｔＲＮＡバリアントは、ナンセンスコドン抑制の生物学的活性の増大（強化）及び目的のタンパク質における部位特異的方法での非天然アミノ酸の組み込みによって特徴づけられる。これらの高効率ｔＲＮＡバリアントを選択する方法は、サプレッサーｔＲＮＡの活性をヒトウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス、又はＡＡＶ）の複製に結合させるものである。特定の実施形態では、当該方法は、ｉ）哺乳動物細胞への制御された送達を可能にするために、ｔＲＮＡバリアントのライブラリをウイルスゲノムにコードすることと、ｉｉ）ウイルス複製をサプレッサーｔＲＮＡの活性に依存させるために必須ウイルスタンパク質にナンセンスコドンを挿入し、活性ｔＲＮＡバリアントをコードするウイルス粒子（ビリオン）の選択的増幅を促進することと、ｉｉｉ）新たに増幅したウイルスのゲノムを単離し配列決定することにより、濃縮されたｔＲＮＡ配列を容易に回収（ｒｅｔｒｉｅｖｅ）できることを含む。
【0042】
本発明の方法は、不活性ｔＲＮＡをコードするＡＡＶ集団と比較して活性サプレッサーｔＲＮＡをコードするＡＡＶ集団を、約１０，０００～５０，０００倍の範囲で、典型的には約３０，０００倍超濃縮する能力を特に示し、従ってナイーブｔＲＮＡライブラリから活性変異体を濃縮するための強力な選択スキームを提供する。特に、本明細書に記載される方法によって特定及び単離されたバリアントｔＲＮＡでは、活性が２．５倍～８０倍増大する。
【0043】
本明細書に記載されるＶＡＤＥＲ選択法の前後におけるウイルスコード化ｔＲＮＡライブラリの次世代配列決定（そのような技術は当業者に公知である。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａから市販されているキット／試薬を参照）を実施して、ライブラリ中の各可能な変異体／バリアントの濃縮を評価及び確認することができる。
【0044】
本発明の技術は、例えば、古細菌由来のピロリジルｔＲＮＡ、及び大腸菌由来のロイシルｔＲＮＡを含む、哺乳動物細胞におけるＵａａ組み込みに一般的に用いられる異なるサプレッサーｔＲＮＡを進化させるためにさらに適用することができる。両ｔＲＮＡの合成変異体ライブラリにかけることで、哺乳動物細胞におけるＵａａ組み込みの活性が著しく向上したバリアントの特定がもたらされる。この変異体は、低レベルで発現させた場合、その野生型対応物と比較して特に効率が向上しており、その本質的な効率の向上がさらに確認される。
【0045】
本発明の結果、哺乳動物細胞におけるＵａａ組み込みのための任意の操作されたサプレッサーｔＲＮＡの効率を進化させる一般的な戦略が現在利用可能である。ｔＲＮＡライブラリをウイルスゲノムにコードし、得られたライブラリをＶＡＤＥＲ選択スキームにかけると、活性ｔＲＮＡ変異体をコードするものを選択的に濃縮することが可能になる。
【0046】
本発明の結果、他の生物学的部分の活性をＡＡＶカプシドタンパク質の発現に結合させることができれば、哺乳動物細胞における当該他の生物学的部分の効率を進化させるために使用することができる方法も現在利用可能である。そのような生物学的部分としては、プロモーター配列（プロモーターエレメント）、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、新規転写因子、受容体タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）、遺伝子又はｍＲＮＡ編集タンパク質（例えば、Ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲ）、哺乳類ツーハイブリッドシステム（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0047】
本明細書に記載されるＶＡＤＥＲ選択スキームを通じて生成された変異体サプレッサーｔＲＮＡ（例えば、ピロリジル及びロイシル）は、哺乳動物細胞における高効率のＵａａ組み込みを可能にする。これらのｔＲＮＡ変異体は、哺乳動物細胞におけるＵａａ組み込みタンパク質（例えば、抗体及び他の治療関連タンパク質）の収率を向上させるために使用することができる。
【0048】
ＶＡＤＥＲ選択スキームを通じて生成された改良されたサプレッサーｔＲＮＡ（例えば、ピロリジル及びロイシル）は、哺乳動物の細胞及び組織へのＵａａ組み込みのための遺伝子機構を送達する改良された発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）を作成するために使用することができる。重要なことは、これらのｔＲＮＡがより効率的であるため、ゲノムあたりコード化するｔＲＮＡバリアントのコピー数が少なくて済むことである。現在、（ｔＲＮＡの十分な高発現を達成するために）複数のｔＲＮＡコピーを含むことは、発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）のゲノムの不安定性につながることが多い。
【0049】
ＶＡＤＥＲ選択スキームを通じて生成された改良されたサプレッサーｔＲＮＡ（例えば、ピロリジル及びロイシル）は、Ｕａａを組み込んだタンパク質発現のための安定な細胞株を作成するために使用することができる。現在、ゲノムあたり多数のｔＲＮＡコピーをコードすることが要求されているため、哺乳類ゲノムにＵａａ組み込み機構を安定的にコードすることは困難である。新しいｔＲＮＡの効率が上がれば、はるかに少ないコピー数の使用で済むようになる。
【0050】
本発明は、バイオテクノロジー応用のためにｔＲＮＡ及び他の生物学的部分の活性を向上させることができる哺乳動物細胞におけるユニークなウイルス支援指向性進化プラットフォームを確立する。哺乳動物細胞内で有意に改善された活性を示すサプレッサーｔＲＮＡバリアントも記載される。
【0051】
本発明を、その好ましい実施形態を参照して特に示し説明したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱しない範囲で、上記の好ましい実施形態に対して形態及び詳細における種々の変更が行われてもよいことは、当業者には理解されよう。
【0052】
これ以上詳しく説明しなくても、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。それゆえ、以下の特定の実施形態及び例は、単に例示として解釈され、本開示の残りの部分をいかなる形でも限定するものではないと解釈される。
【実施例】
【0053】
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明するために提供されるが、決してその範囲を限定することを意図するものではない。
【0054】
本明細書に記載された実施例は、当業者には例示的なプロトコルとして理解されるであろう。当業者であれば、以下の手順を適切かつ必要に応じて修正することができるであろう。
【0055】
材料及び方法
細胞培養。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ（ハイクローン）、最終濃度１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）並びに１０％ウシ胎仔血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング））を補充したＤＭＥＭ－高グルコース（ＨｙＣｌｏｎｅ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。以下のＤＭＥＭへのすべての言及は、ここに記載された完全な培地を指す。
細胞培養。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ（ハイクローン）、最終濃度１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）並びに１０％ウシ胎仔血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング））を補充したＤＭＥＭ－高グルコース（ＨｙＣｌｏｎｅ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。以下のＤＭＥＭへのすべての言及は、ここに記載された完全な培地を指す。
【0056】
一般的なクローニング。すべてのクローニングについて、大腸菌ＴＯＰ１０株を形質転換及びプラスミド増殖に使用し、細菌は固体及び液体培養のためにＬＢを使用して増殖させた。すべてのＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモ・サイエンティフィック））を用いて、製造者のプロトコルに従って実施した。制限酵素及びＴ４ ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ、ニュー・イングランド・バイオラボ）製であった。すべてのＤＮＡオリゴはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、インテグレーテッド・ディーエヌエー・テクノロジーズ）から購入した。サンガー配列決定は、Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（イートン・バイオサイエンス）によって行われた。
【0057】
非天然アミノ酸アジドリジン（ＡｚＫ）は、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧＭＢＨ（アイリス・バイオテック）（ドイツ）から購入した。）Ｎε－アセチルリジン（ＡｃＫ）は、Ｂａｃｈｅｍ（バッケム）から購入した。
【0058】
ＡＡＶ（野生型カプシド）へのモック及びライブラリｔＲＮＡのパッケージング及び滴定。ＡＡＶ－２に様々なカーゴをパッケージングするために、８００万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ組織培養皿に播種した。翌日、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｓｉｇｍａ（シグマ））を用いて、適切なカーゴプラスミド（ｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ｔＲＮＡ－蛍光タンパク質）、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びｐＡＡＶ－ＲＣ２の各８μｇで上記細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に新鮮なＤＭＥＭに培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を再懸濁し、ペレット化し、以前に記載したように凍結／解凍により溶解した。１ウイルスを濃縮し、ＰＥＧ沈殿により半精製し、１ＦＢＳを含む１ｍＬ ＤＭＥＭに再懸濁し、瞬間凍結した。
【0059】
実施例に記載した配列
実施例及び本願を通じて記載された野生型及び派生配列を表に示す。
実施例及び本願を通じて記載された野生型及び派生配列を表に示す。
【表1(1)】
【表1(2)】
【表1(3)】
【0060】
実施例１：ポジティブ選択
８００万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞それぞれを、３つの１０ｃｍ組織培養皿に播種した。翌日、この細胞を見かけのＭＯＩ ５（実際のＭＯＩはトランスフェクション試薬であるＰＥＩの存在下で大幅に減少する）でｔＲＮＡＰｙｌライブラリを含むウイルスに感染させた。感染から４時間後、ＰＥＩを用いて、１皿あたり２２μｇのｐＨｅｌｐｅｒ及び１０μｇのｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＲＣ２（Ｔ４５４ＴＡＧ）－ＰｙｌＲＳで細胞をトランスフェクトした。この時点で、１ｍＭのＡｚＫも添加した。トランスフェクションの１日後に、培養培地を１ｍＭ ＡｚＫを含む新鮮なＤＭＥＭと交換した。トランスフェクションの３日後に細胞を採取し、ウイルス単離と同様に溶解した。培養培地を保存し、清澄化したライセートと再合成し、この混合物を５００Ｕ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間処理した。ウイルスは、先に述べたように１、１１％ポリエチレングリコール（Ｆｉｓｈｅｒ（フィッシャー））を用いたＰＥＧ沈殿により回収し、３ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。小規模のモックポジティブ選択を１２ウェルプレートで実施した。ウェルあたり０．７百万個の細胞を播種し、翌日、ｔＲＮＡＰｙｌ－ｍＣｈｅｒｒｙカーゴを有するＡＡＶに感染させた。４時間後、細胞を上記の選択について記載したようにトランスフェクトしたが、トランスフェクションミックスとＡｚＫは１５分の１にスケールダウンした。ＰＥＩのみのウェルでは、細胞は同等の量のトランスフェクション試薬を受け取ったが、プラスミドは受け取らなかった。トランスフェクションの翌日、培地を、１ｍＭ ＡｚＫを含む新鮮なＤＭＥＭに交換した。トランスフェクション後３日目にウイルスを採取し、上記の選択と同様にＰＥＧ沈殿を行った。１２ウェルプレート中のコンフルエントな細胞を、１つのモック選択のウェルの全出力に感染させ、フローサイトメトリーによって分析した。
８００万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞それぞれを、３つの１０ｃｍ組織培養皿に播種した。翌日、この細胞を見かけのＭＯＩ ５（実際のＭＯＩはトランスフェクション試薬であるＰＥＩの存在下で大幅に減少する）でｔＲＮＡＰｙｌライブラリを含むウイルスに感染させた。感染から４時間後、ＰＥＩを用いて、１皿あたり２２μｇのｐＨｅｌｐｅｒ及び１０μｇのｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＲＣ２（Ｔ４５４ＴＡＧ）－ＰｙｌＲＳで細胞をトランスフェクトした。この時点で、１ｍＭのＡｚＫも添加した。トランスフェクションの１日後に、培養培地を１ｍＭ ＡｚＫを含む新鮮なＤＭＥＭと交換した。トランスフェクションの３日後に細胞を採取し、ウイルス単離と同様に溶解した。培養培地を保存し、清澄化したライセートと再合成し、この混合物を５００Ｕ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間処理した。ウイルスは、先に述べたように１、１１％ポリエチレングリコール（Ｆｉｓｈｅｒ（フィッシャー））を用いたＰＥＧ沈殿により回収し、３ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。小規模のモックポジティブ選択を１２ウェルプレートで実施した。ウェルあたり０．７百万個の細胞を播種し、翌日、ｔＲＮＡＰｙｌ－ｍＣｈｅｒｒｙカーゴを有するＡＡＶに感染させた。４時間後、細胞を上記の選択について記載したようにトランスフェクトしたが、トランスフェクションミックスとＡｚＫは１５分の１にスケールダウンした。ＰＥＩのみのウェルでは、細胞は同等の量のトランスフェクション試薬を受け取ったが、プラスミドは受け取らなかった。トランスフェクションの翌日、培地を、１ｍＭ ＡｚＫを含む新鮮なＤＭＥＭに交換した。トランスフェクション後３日目にウイルスを採取し、上記の選択と同様にＰＥＧ沈殿を行った。１２ウェルプレート中のコンフルエントな細胞を、１つのモック選択のウェルの全出力に感染させ、フローサイトメトリーによって分析した。
【0061】
実施例２：ネガティブ選択
ポジティブ選択からのウイルス（３ｍＬ）を、光切断可能なＤＢＣＯ－スルホ－ビオチン（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（イエナ・バイオサイエンス））で、５μＭの濃度で暗所で１時間、混合しながら標識した。標識後すぐに、過剰のＤＢＣＯ－ビオチンをＡｚＫ（最終濃度１ｍＭ）でクエンチし、反応物を４℃の１Ｌ ＰＢＳに対してＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて一晩透析した。透析したウイルス混合物を３本の２ｍＬチューブに分け、それぞれ４００μＬのストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４℃で一晩回転させた。翌日、ビーズの各チューブを、ＮａＣｌ（最終濃度３００ｍＭ）を追加した１ｍＬ ＰＢＳで、洗浄の合間に混合しながら８回洗浄した。最後に、洗浄したビーズを８ｍＬのＰＢＳ（３００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、３６５ｎｍのＵＶダイオードアレイ（Ｌａｒｓｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ（ラーソン・エレクトロニクス））を用いて３０秒間の照射を４回行い、照射の間に混合しながら、樹脂からウイルスを溶出させた。
ポジティブ選択からのウイルス（３ｍＬ）を、光切断可能なＤＢＣＯ－スルホ－ビオチン（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（イエナ・バイオサイエンス））で、５μＭの濃度で暗所で１時間、混合しながら標識した。標識後すぐに、過剰のＤＢＣＯ－ビオチンをＡｚＫ（最終濃度１ｍＭ）でクエンチし、反応物を４℃の１Ｌ ＰＢＳに対してＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて一晩透析した。透析したウイルス混合物を３本の２ｍＬチューブに分け、それぞれ４００μＬのストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４℃で一晩回転させた。翌日、ビーズの各チューブを、ＮａＣｌ（最終濃度３００ｍＭ）を追加した１ｍＬ ＰＢＳで、洗浄の合間に混合しながら８回洗浄した。最後に、洗浄したビーズを８ｍＬのＰＢＳ（３００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、３６５ｎｍのＵＶダイオードアレイ（Ｌａｒｓｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ（ラーソン・エレクトロニクス））を用いて３０秒間の照射を４回行い、照射の間に混合しながら、樹脂からウイルスを溶出させた。
【0062】
実施例３：ウイルスＤＮＡの回収、増幅、及びクローニング
溶出したウイルスを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア））を用いて３ｍＬから３００μＬに濃縮した。この混合物を１００℃で１０分間加熱して、ウイルスカプシドタンパク質を変性させ、ＤＮＡを露出させた。次に、ウイルスＤＮＡを、酵母ｔＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ（アンビオン））を用いたエタノール沈殿により洗浄及び濃縮し、最終体積５０μＬに再懸濁した。この混合物２０μＬを２００μＬのＰＣＲ反応物に加え、ｔＲＮＡＡｍｐ－ Ｆ及びＲプライマーを用いて増幅した。得られたＤＮＡをＫｐｎＩとＮｃｏＩで消化し、オリジナルライブラリ作製と同じプロトコルでライブラリクローニングベクターにクローニングした。
溶出したウイルスを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア））を用いて３ｍＬから３００μＬに濃縮した。この混合物を１００℃で１０分間加熱して、ウイルスカプシドタンパク質を変性させ、ＤＮＡを露出させた。次に、ウイルスＤＮＡを、酵母ｔＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ（アンビオン））を用いたエタノール沈殿により洗浄及び濃縮し、最終体積５０μＬに再懸濁した。この混合物２０μＬを２００μＬのＰＣＲ反応物に加え、ｔＲＮＡＡｍｐ－ Ｆ及びＲプライマーを用いて増幅した。得られたＤＮＡをＫｐｎＩとＮｃｏＩで消化し、オリジナルライブラリ作製と同じプロトコルでライブラリクローニングベクターにクローニングした。
【0063】
実施例４：Ｐｙｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＴｙｒ－ＧＦＰを用いたモック選択
図１に示すモック選択は、出発ライブラリウイルスがｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ＰｙｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙから作ったウイルスとｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ＥｃＹｔＲ－ＧＦＰから作ったウイルスの１：１０，０００混合物であることを除いて、上記と同じプロトコルに従った。モック選択の結果は、ウイルス滴定について記載したようにフローサイトメトリーで解析したが、ここでは１２ウェルプレートの細胞を、ポジティブ選択又はネガティブ選択のいずれかの後に上記ウイルスプールの２００μＬに感染させた。赤色及び緑色の蛍光細胞をカウントして、ウイルス比率を決定した。
図１に示すモック選択は、出発ライブラリウイルスがｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ＰｙｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙから作ったウイルスとｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ＥｃＹｔＲ－ＧＦＰから作ったウイルスの１：１０，０００混合物であることを除いて、上記と同じプロトコルに従った。モック選択の結果は、ウイルス滴定について記載したようにフローサイトメトリーで解析したが、ここでは１２ウェルプレートの細胞を、ポジティブ選択又はネガティブ選択のいずれかの後に上記ウイルスプールの２００μＬに感染させた。赤色及び緑色の蛍光細胞をカウントして、ウイルス比率を決定した。
【0064】
実施例５：ヒット配列決定及び特性解析
各ライブラリについて、上記で生成した形質転換プレートから３０～５０コロニーを選び、Ｓａｎｇｅｒ（サンガー）配列決定（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に回した。無作為化塩基がすべて対になっている配列はすべてヒット候補として扱い、これらのｔＲＮＡを、解析のためにｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ＰｙｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙにサブクローニングした。最初のヒット解析は、２４ウェルプレートのＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、１ｍＭ ＡｚＫの存在下及び不存在下で、潜在的ヒットｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ＰｙｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド、ｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ ＭｂＰｙｌＲＳ及びｐＡｃＢａｃ１－ＧＦＰ（３９ＴＡＧ）をそれぞれ０．５μｇ用いてトランスフェクトすることにより実施した。トランスフェクションの２日後、細胞をＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ バッファ（Ｓｉｇｍａ）で溶解し、ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光をａＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダーで測定した。トランスフェクトしていないウェルの値を差し引き、各ウェルについてＥＧＦＰ－蛍光をｍＣｈｅｒｒｙ蛍光に正規化した。最良のヒットであるＡｃ２．１（ＧＧＧ／ＣＣＵ）を、他の終止コドン及び異なる合成酵素、並びにＵａａ、ＡｃＫＲＳ３及びＡｃＫを用いたさらなる分析のために選択した。１２ウェルプレート内のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、野生型又は進化したｔＲＮＡを含む０．３７５μｇのｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＰｙｔＲ、適切な合成酵素を含む０．３７５μｇのｐＩＤＴＳｍａｒｔａａＲＳ、及び０．７５μｇの適切な終止コドンの１つ又は２つを含むｐＡｃＢａｃ１－ＥＧＦＰでトランスフェクションした。野生型ＥＧＦＰ対照ウェルは、ｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＰｙｔＲ（ＴＡＧ、野生型）、ｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＭｂＰｙｌＲＳ、及びｐＡｃＢａｃ１－ＥＧＦＰ（野生型）を同じ比率で使用した。トランスフェクションから２日後に細胞を溶解し、マイクロプレートリーダーでＥＧＦＰ蛍光を測定した。トランスフェクトしていないウェルからの値を差し引いた。
各ライブラリについて、上記で生成した形質転換プレートから３０～５０コロニーを選び、Ｓａｎｇｅｒ（サンガー）配列決定（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に回した。無作為化塩基がすべて対になっている配列はすべてヒット候補として扱い、これらのｔＲＮＡを、解析のためにｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ＰｙｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙにサブクローニングした。最初のヒット解析は、２４ウェルプレートのＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、１ｍＭ ＡｚＫの存在下及び不存在下で、潜在的ヒットｐＡＡＶ－ＩＴＲ－ＰｙｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド、ｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ ＭｂＰｙｌＲＳ及びｐＡｃＢａｃ１－ＧＦＰ（３９ＴＡＧ）をそれぞれ０．５μｇ用いてトランスフェクトすることにより実施した。トランスフェクションの２日後、細胞をＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ バッファ（Ｓｉｇｍａ）で溶解し、ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光をａＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダーで測定した。トランスフェクトしていないウェルの値を差し引き、各ウェルについてＥＧＦＰ－蛍光をｍＣｈｅｒｒｙ蛍光に正規化した。最良のヒットであるＡｃ２．１（ＧＧＧ／ＣＣＵ）を、他の終止コドン及び異なる合成酵素、並びにＵａａ、ＡｃＫＲＳ３及びＡｃＫを用いたさらなる分析のために選択した。１２ウェルプレート内のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、野生型又は進化したｔＲＮＡを含む０．３７５μｇのｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＰｙｔＲ、適切な合成酵素を含む０．３７５μｇのｐＩＤＴＳｍａｒｔａａＲＳ、及び０．７５μｇの適切な終止コドンの１つ又は２つを含むｐＡｃＢａｃ１－ＥＧＦＰでトランスフェクションした。野生型ＥＧＦＰ対照ウェルは、ｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＰｙｔＲ（ＴＡＧ、野生型）、ｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＭｂＰｙｌＲＳ、及びｐＡｃＢａｃ１－ＥＧＦＰ（野生型）を同じ比率で使用した。トランスフェクションから２日後に細胞を溶解し、マイクロプレートリーダーでＥＧＦＰ蛍光を測定した。トランスフェクトしていないウェルからの値を差し引いた。
【0065】
実施例６：カスタムランダム化変異体ライブラリを用いたピロリジルｔＲＮＡのさらなる進化
第一世代のＶＡＤＥＲ実験では、ｔＲＮＡの短いセグメント（一度に３塩基対）だけを一度にランダム化して小さな変異体ライブラリを作成し、これを選択にかけた。それは改良された変異体の特定につながったが、本発明者らは、より広い配列空間をランダム化して選択することができれば、さらにより効率的な変異体の特定につながるのではないかと推測した。しかしながら、ｔＲＮＡの大きなセグメントをランダム化すると、ライブラリのサイズが指数関数的に大きくなる。例えば、ステム領域で１つの追加的な塩基対をランダム化すると、ライブラリのメンバーの数は１６倍に増大する。技術的な制約から、現在、本発明者らのＶＡＤＥＲプラットフォームで１０５を超えるライブラリサイズを処理し、可能な限りの変異体を確実に完全に網羅することは困難である。このサイズ制限により、ｔＲＮＡの活性を操作するために、ｔＲＮＡのステム領域で４塩基対以下の完全なランダム化を行うことに制限されている。しかしながら、ｔＲＮＡ－ステム領域の塩基対を完全にランダム化した場合、得られる１６個の変異体のうち、ステム領域の安定性に不可欠な塩基対形成相互作用（Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃ又はＧ：Ｕのいずれか）を維持できるのは、わずか６個にとどまる。塩基対形成ができない変異体の大部分は、ｔＲＮＡステムの中央部に塩基対形成のない「バブル」を生じ、これは、一般にｔＲＮＡの性能を低下させる。各塩基対を望ましい塩基対配列にのみランダム化する、ｔＲＮＡライブラリを合成する別の方法を考案した。このアプローチでは、近年のＤＮＡ合成技術の進歩を利用し、かなりの長さ（最大３００ヌクレオチド）の異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドを大量に合成することが可能である。これにより、ｔＲＮＡ遺伝子全体をコードするＤＮＡライブラリを合成し、そこで各ライブラリメンバーの各位置を特定することができることで、塩基対を形成する変異体のみを含み、そうでない変異体を回避することが可能になる。
第一世代のＶＡＤＥＲ実験では、ｔＲＮＡの短いセグメント（一度に３塩基対）だけを一度にランダム化して小さな変異体ライブラリを作成し、これを選択にかけた。それは改良された変異体の特定につながったが、本発明者らは、より広い配列空間をランダム化して選択することができれば、さらにより効率的な変異体の特定につながるのではないかと推測した。しかしながら、ｔＲＮＡの大きなセグメントをランダム化すると、ライブラリのサイズが指数関数的に大きくなる。例えば、ステム領域で１つの追加的な塩基対をランダム化すると、ライブラリのメンバーの数は１６倍に増大する。技術的な制約から、現在、本発明者らのＶＡＤＥＲプラットフォームで１０５を超えるライブラリサイズを処理し、可能な限りの変異体を確実に完全に網羅することは困難である。このサイズ制限により、ｔＲＮＡの活性を操作するために、ｔＲＮＡのステム領域で４塩基対以下の完全なランダム化を行うことに制限されている。しかしながら、ｔＲＮＡ－ステム領域の塩基対を完全にランダム化した場合、得られる１６個の変異体のうち、ステム領域の安定性に不可欠な塩基対形成相互作用（Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃ又はＧ：Ｕのいずれか）を維持できるのは、わずか６個にとどまる。塩基対形成ができない変異体の大部分は、ｔＲＮＡステムの中央部に塩基対形成のない「バブル」を生じ、これは、一般にｔＲＮＡの性能を低下させる。各塩基対を望ましい塩基対配列にのみランダム化する、ｔＲＮＡライブラリを合成する別の方法を考案した。このアプローチでは、近年のＤＮＡ合成技術の進歩を利用し、かなりの長さ（最大３００ヌクレオチド）の異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドを大量に合成することが可能である。これにより、ｔＲＮＡ遺伝子全体をコードするＤＮＡライブラリを合成し、そこで各ライブラリメンバーの各位置を特定することができることで、塩基対を形成する変異体のみを含み、そうでない変異体を回避することが可能になる。
【0066】
ＤＮＡ合成サービスプロバイダーのＴＷＩＳＴ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ツイストバイオサイエンス）を使用して、アクセプターステムの６つの塩基対を塩基対配列の所望の組み合わせにランダム化した、図１１に描かれているようなピロリジル－ｔＲＮＡライブラリを作成した。得られたライブラリをＡＡＶ２にパッケージングし、上記のように二重にＶＡＤＥＲ選択スキームに供した。ＡＡＶ２にパッケージされたライブラリは、ＶＡＤＥＲ選択にかける前と後に、次世代配列決定のためのＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した（図１２）。各変異体の濃縮度は、選択工程の前後での存在量を用いて計算し、変異体を濃縮の程度に基づいてランク付けした。選択時に最も高い濃縮の程度を示した変異体を再合成し、上述したようにＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧ発現アッセイを用いてその活性をベンチマークした（図１３）。図１３に示すように、２６個のｔＲＮＡ－Ｐｙｌ変異体は、野生型ｔＲＮＡ－Ｐｙｌに対して少なくとも２５０％高い活性を示し、最も活性の高い変異体は、ＷＴ－ｔＲＮＡ－Ｐｙｌに対して５４０％の活性を示した。
【0067】
実施例７：哺乳動物細胞におけるナンセンス抑制活性を強化するための大腸菌ロイシルｔＲＮＡの進化
哺乳動物細胞におけるｔＲＮＡ活性を操作するためのＶＡＤＥＲ選択スキームの適用は、ピロリシルｔＲＮＡのみに限定されるものではない。それは、哺乳動物細胞におけるＵａａの組み込みに適した他のｔＲＮＡの活性を向上させるためにも使用することができる。本明細書に記載されるＶＡＤＥＲ方法の使用は、同族の大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＬｅｕＲＳ）とともに、哺乳動物細胞におけるＵａａ組み込みに以前に使用された（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２００４、１２６、１４３０６；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８、５７、４４１）大腸菌ロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ）の活性を向上させるためにも使用した。ｔＲＮＡ－Ｐｙｌに関する本明細書に記載される作業で示されるように、アクセプターステムは翻訳システムの多くの構成要素と関わっているため、この領域を操作することはしばしば非常に魅力的である。「スマート」ライブラリを設計するために、１２０の公知の細菌ｔＲＮＡ配列の配列のアラインメントを行い、アクセプターステムのコンセンサス配列を作成した（図１４）。このコンセンサス配列は、アクセプターステムのどの部分がｔＲＮＡ－ａａＲＳ相互作用に重要であるか（アイデンティティエレメント）、及びどの領域が改変の余地があるかを予測するためのガイドとして使用することができる。このアプローチに基づき、ｔＲＮＡ－Ｌｅｕアクセプターステムのカスタムランダム化ライブラリ（図１４）を設計した。このライブラリをＡＡＶ２にパッケージングし、上記のようにＶＡＤＥＲ選択スキームにかけた。アジド含有（アジド修飾）Ｕａａ ＡｚＫを導入できる、以前に開発された多重特異的ＥｃＬｅｕＲＳ変異体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８、５７、４４１）を、ｔＲＮＡ変異体を導入するためのＶＡＤＥＲスキームで使用した。次世代イルミナＤＮＡ配列決定を用いて、上記のように選択前後の各ライブラリメンバーの濃縮度を測定し、最大の濃縮度を示すものを再合成し、先に述べたＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧレポーター発現アッセイを用いて特性評価を行った。図１５に示すように、１７個のｔＲＮＡ－Ｌｅｕ変異体は、野生型ｔＲＮＡ－Ｌｅｕと比較して少なくとも１，０００％高い活性を実証し、最も活性の高い変異体は、ＷＴ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕと比較して約１３，０００％向上した活性を実証した。ＷＴ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕを含むこれらのｔＲＮＡ配列は、アンチコドンループの最初のヌクレオチドである３３位にＵを含んでいる。このＵをＣに変異させると、通常、ナンセンスサプレッサーのアンチコドンの文脈がよくなるため、ナンセンス抑制活性が増強される可能性がある。このことが当てはまるか否かを調べるために、変異体２９（配列番号２９）の３３－ＵをＣに変異させて、変異体３０（配列番号３０）を作成した。実際、この変異体は、２９と比較して有意に改善された抑制活性を示す（図１５）。この変異を他の特定されたｔＲＮＡ－Ｌｅｕ変異体（配列番号３１～４５）に導入することによっても、その活性のさらなる向上がもたらされるはずである。
哺乳動物細胞におけるｔＲＮＡ活性を操作するためのＶＡＤＥＲ選択スキームの適用は、ピロリシルｔＲＮＡのみに限定されるものではない。それは、哺乳動物細胞におけるＵａａの組み込みに適した他のｔＲＮＡの活性を向上させるためにも使用することができる。本明細書に記載されるＶＡＤＥＲ方法の使用は、同族の大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＬｅｕＲＳ）とともに、哺乳動物細胞におけるＵａａ組み込みに以前に使用された（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２００４、１２６、１４３０６；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８、５７、４４１）大腸菌ロイシルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ）の活性を向上させるためにも使用した。ｔＲＮＡ－Ｐｙｌに関する本明細書に記載される作業で示されるように、アクセプターステムは翻訳システムの多くの構成要素と関わっているため、この領域を操作することはしばしば非常に魅力的である。「スマート」ライブラリを設計するために、１２０の公知の細菌ｔＲＮＡ配列の配列のアラインメントを行い、アクセプターステムのコンセンサス配列を作成した（図１４）。このコンセンサス配列は、アクセプターステムのどの部分がｔＲＮＡ－ａａＲＳ相互作用に重要であるか（アイデンティティエレメント）、及びどの領域が改変の余地があるかを予測するためのガイドとして使用することができる。このアプローチに基づき、ｔＲＮＡ－Ｌｅｕアクセプターステムのカスタムランダム化ライブラリ（図１４）を設計した。このライブラリをＡＡＶ２にパッケージングし、上記のようにＶＡＤＥＲ選択スキームにかけた。アジド含有（アジド修飾）Ｕａａ ＡｚＫを導入できる、以前に開発された多重特異的ＥｃＬｅｕＲＳ変異体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８、５７、４４１）を、ｔＲＮＡ変異体を導入するためのＶＡＤＥＲスキームで使用した。次世代イルミナＤＮＡ配列決定を用いて、上記のように選択前後の各ライブラリメンバーの濃縮度を測定し、最大の濃縮度を示すものを再合成し、先に述べたＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧレポーター発現アッセイを用いて特性評価を行った。図１５に示すように、１７個のｔＲＮＡ－Ｌｅｕ変異体は、野生型ｔＲＮＡ－Ｌｅｕと比較して少なくとも１，０００％高い活性を実証し、最も活性の高い変異体は、ＷＴ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕと比較して約１３，０００％向上した活性を実証した。ＷＴ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕを含むこれらのｔＲＮＡ配列は、アンチコドンループの最初のヌクレオチドである３３位にＵを含んでいる。このＵをＣに変異させると、通常、ナンセンスサプレッサーのアンチコドンの文脈がよくなるため、ナンセンス抑制活性が増強される可能性がある。このことが当てはまるか否かを調べるために、変異体２９（配列番号２９）の３３－ＵをＣに変異させて、変異体３０（配列番号３０）を作成した。実際、この変異体は、２９と比較して有意に改善された抑制活性を示す（図１５）。この変異を他の特定されたｔＲＮＡ－Ｌｅｕ変異体（配列番号３１～４５）に導入することによっても、その活性のさらなる向上がもたらされるはずである。
【0068】
実施例８：操作されたｔＲＮＡ変異体は、その発現レベルが制限的に制御される場合、それらの野生型対応物と比較してさらなる改善を示す
これまで、すべてのｔＲＮＡ活性のすべての評価は、ｔＲＮＡ、ａａＲＳ、及びレポーターをコードするプラスミドを哺乳動物細胞に一過性にトランスフェクトすることによって行った。哺乳動物細胞培養物の一過性トランスフェクションでは、ある細胞は非常に高いレベルで関連プラスミドを取り込み過剰発現するが、他の細胞はそうでないというように、ＤＮＡ送達の非制御かつ不均一なレベルが生じることが十分に確立されている。その結果、コード化ｔＲＮＡ及びａａＲＳの過剰発現が、それらの貧弱な固有活性を補償し、それらの固有効率の推定値を膨らませる可能性があることが以前に示された（ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ． ２０１７、６、１３）。本明細書に記載されているように、結果として、一過性トランスフェクションによる２つの異なるＵａａ組み込みシステムを比較すると、より弱いシステムの効率が過大評価される、不正確な推定値が得られる場合があることがさらに実証されている。一過性トランスフェクションアッセイを用いて観察された効率の差は、野生型対応物に対する異なるｔＲＮＡ変異体の固有の効率の実際の改善度を過小評価している可能性があると推測された。
これまで、すべてのｔＲＮＡ活性のすべての評価は、ｔＲＮＡ、ａａＲＳ、及びレポーターをコードするプラスミドを哺乳動物細胞に一過性にトランスフェクトすることによって行った。哺乳動物細胞培養物の一過性トランスフェクションでは、ある細胞は非常に高いレベルで関連プラスミドを取り込み過剰発現するが、他の細胞はそうでないというように、ＤＮＡ送達の非制御かつ不均一なレベルが生じることが十分に確立されている。その結果、コード化ｔＲＮＡ及びａａＲＳの過剰発現が、それらの貧弱な固有活性を補償し、それらの固有効率の推定値を膨らませる可能性があることが以前に示された（ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ． ２０１７、６、１３）。本明細書に記載されているように、結果として、一過性トランスフェクションによる２つの異なるＵａａ組み込みシステムを比較すると、より弱いシステムの効率が過大評価される、不正確な推定値が得られる場合があることがさらに実証されている。一過性トランスフェクションアッセイを用いて観察された効率の差は、野生型対応物に対する異なるｔＲＮＡ変異体の固有の効率の実際の改善度を過小評価している可能性があると推測された。
【0069】
この課題を克服するために、哺乳動物細胞への導入遺伝子の制御されたより均質な送達を容易にする、以前に開発されたバキュロウイルスベクター（ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ． ２０１７、６、１３）を使用した。ウイルスと細胞の比率を系統的に変化させることで、導入遺伝子の発現レベルを簡易に制御することができる。この送達システムを用いることで、Ｕａａ組み込みのための２つの異なる遺伝子システムを、発現レベルの異なる大きなスペクトルで比較することが可能となり、これにより、より正確にその本質的な性能の違いが明らかになる。このアプローチを用いて、野生型と比較した操作されたｔＲＮＡ－Ｐｙｌ変異体及びｔＲＮＡ－Ｌｅｕ変異体の活性を比較するために、野生型のｍＣｈｅｒｒｙレポーターと、４つのｔＲＮＡ、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｐｙｌ、ＷＴ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ、ｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－２（配列番号２）、又はｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－３０（配列番号３０）のうちの１つとをコードするバキュロウイルスベクターを構築した。第２のバキュロウイルスは、ＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧレポーターと、必要なａａＲＳ（ｔＲＮＡ－ＰｙｌについてはＭｂＰｙｌＲＳ、又はｔＲＮＡ－ＬｅｕについてはＥｃＬｅｕＲＳ）を送達するように開発した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ａａＲＳ／ＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧバキュロウイルスを１の一定のＭＯＩ（感染多重度、又は細胞あたりに加えられた感染性ウイルス粒子の数）で、さらにＷＴ又は操作したｔＲＮＡウイルスのいずれかのＭＯＩ（０．３～１５）を増加させながら形質導入した。ｍＣｈｅｒｒｙ（所望のレベルのｔＲＮＡ－バキュロウイルスの送達を確認する）及びＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧ（ＴＡＧに応答したＵａａ組み込み効率を表す）の発現は、無細胞抽出物中のそれらの特徴的蛍光を用いてトランスフェクション後４８時間目に記録した。図１６に示すように、操作したｔＲＮＡ－Ｐｙｌは、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｐｙｌと比較して、はるかに低い発現レベル（低いＭＯＩ）でＥＧＦ－３９－ＴＡＧの発現を促進させる。例えば、ＷＴ ｔＲＮＡ－ＰｙｌウイルスがＭＯＩ １で使用される場合、ＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧの発現は、野生型ＥＧＦＰ対照に関してわずか０．５％であるが、操作したｔＲＮＡ－Ｐｙｌ（配列番号２）をコードするウイルスは、同じＭＯＩで９．３％のＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧ発現をもたらし、これは、この発現レベルで後者が１８倍超も効率的であることを示す。より高いＭＯＩ ３では、操作したｔＲＮＡは野生型と比較して約１４倍高い活性を示し、これは、より高い発現が固有活性の真の差をいかに過小評価しうるかを明らかにする。野生型ｔＲＮＡ－Ｌｅｕとその操作した対応物の１つ（配列番号３０）の活性も同じように比較した。図１７に示すように、操作したｔＲＮＡは、試験した最も高いＭＯＩ（１５）でほぼ２９倍改善されたＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧ発現を提供する。ｔＲＮＡがより低いレベルで発現されたとき、その差はさらに顕著であった。例えば、ＭＯＩ ５において、ＷＴ ｔＲＮＡ－Ｌｅｕは検出可能なＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧ発現を全く与えないが、ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－３０は野生型レポーターに対して１６％のレベルでその発現を可能にする。操作したｔＲＮＡが低い発現レベルで有意に高い効率を提供することは非常に重要である。というのも、このことは、ゲノム的に統合されたａａＲＳ／ｔＲＮＡを持ち、高いＵａａ組み込み効率を提供する安定した哺乳動物細胞株の生成を著しく容易にするからである。
【0070】
実施例９：多数のＵａａのより効率的な組み込みのための操作したｔＲＮＡ変異体
理論に束縛されることなく、操作したｔＲＮＡの向上した活性は完全には理解されていないが、これらは生命の異なるドメインから借用する野生型の対応物よりも、哺乳類の翻訳システムとはるかによく関わっている可能性が高い。その結果、これらのｔＲＮＡの活性が向上すれば、同族ａａＲＳの操作された変異体が取り込むことができるすべてのＵａａをより効率的に取り込むことができるはずである。この仮説を実証するために、操作したＭｂＰｙｌＲＳ（構造１～６；図１８）又はＥｃＬｅｕＲＳ（構造７～１２；図１８）を用いて組み込むことができるいくつかのＵａａを、上述のＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧ発現アッセイを用いてそれらの組み込み効率について評価した。実際、これらのＵａａの各々は、操作されたｔＲＮＡによって、２つの操作されたｔＲＮＡによって、それらの野生型対応物と比較して有意に高い効率でレポーターへ組み込まれた（図１９）。
理論に束縛されることなく、操作したｔＲＮＡの向上した活性は完全には理解されていないが、これらは生命の異なるドメインから借用する野生型の対応物よりも、哺乳類の翻訳システムとはるかによく関わっている可能性が高い。その結果、これらのｔＲＮＡの活性が向上すれば、同族ａａＲＳの操作された変異体が取り込むことができるすべてのＵａａをより効率的に取り込むことができるはずである。この仮説を実証するために、操作したＭｂＰｙｌＲＳ（構造１～６；図１８）又はＥｃＬｅｕＲＳ（構造７～１２；図１８）を用いて組み込むことができるいくつかのＵａａを、上述のＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧ発現アッセイを用いてそれらの組み込み効率について評価した。実際、これらのＵａａの各々は、操作されたｔＲＮＡによって、２つの操作されたｔＲＮＡによって、それらの野生型対応物と比較して有意に高い効率でレポーターへ組み込まれた（図１９）。
【0071】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して特に示し説明したが、添付の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱しない範囲で、上記の実施形態において、その形態及び詳細における種々の変更がなされてもよいことが当業者には理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】